CN101052412A - 阿米巴病亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了溶组织内阿米巴LC3亚单位肽，以及编码这些亚单位肽的多核苷酸，其中存在的有效剂量的LC3亚单位肽在灵长类动物体内诱导粘膜抗凝集素IgA的生成以抵御溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。本发明也包括溶组织内阿米巴LC3亚单位肽疫苗及其使用方法。

Description

阿米巴病亚单位疫苗

                    优先权要求

本专利申请要求对美国专利申请No.60/581,248(申请于2004年6月18日)和美国专利申请No.60/581,577(申请于2004年6月21日)的优先权。这些申请通过引用结合到本文。

              关于联邦赞助研发的说明

本发明得到了美国敏感症及传染病研究中心(NIAID)的NIH基金PO 1-AB 6359-01和UO 1-AI35840项目的资助。政府对本发明也可拥有一定权利。

                     发明背景

阿米巴病是由肠道原生动物溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)所引起的疾病或感染。溶组织内阿米巴(E.histolytica)是原生动物裸根足虫(naked rhizopod)的一个大属的成员。溶组织内阿米巴是一种人体寄生阿米巴，它可在感染过程中引起身体组织发生衰弱。溶组织内阿米巴分布极广，世界范围内如印度、非洲、亚洲、墨西哥和南美的地方病区域中，每年的人群感染率可高达20％。在这些感染者中只有约10％最终表现出大肠炎或肝脓肿等症状。这种症状低发生率据信是由宿主的免疫监视和寄生虫品系的变异以及个体因素(如食物或菌群)之间的平衡所引起的。肠内阿米巴感染的“致病型”指溶组织内阿米巴，它可以侵入体内，并导致感染对象表现症状，同时引起系统性免疫反应。肠内阿米巴感染的“非致病型”指不等内阿米巴(Entamoeba dispar)。不等内阿米巴与溶组织内阿米巴形态相同，但二者分属不同的种。不等内阿米巴被感染者携带，但没有致病性。最终表现出症状的感染者携带溶组织内阿米巴，鉴别这种感染者首先根据其独特的己糖激酶和葡萄糖磷酸变位酶同工酶，随后根据ELISA中的抗原特异性或者PCR结果的遗传差异。已知溶组织内阿米巴的感染至少部分的由黏着凝集素“Gal/GalNAc”所介导。纯化的非还原凝集素在SDS-PAGE中分子量表现为260kDa；经β-巯基乙醇还原后得到两个亚单位，分子量分别为170kDa(重亚单位)和35kDa(轻亚单位)。抗170kDa亚单位的抗体能够阻碍对试验细胞的表面附着(Petri，1989)。因此相信170kDa亚单位在附着介导中起主要作用，它有时也被称作170kDa黏附素。编码重亚单位和轻亚单位的DNA分子都已被克隆。重亚单位和轻亚单位的编码mRNA截然不同(Mann，1991)，并且它们的氨基酸组成和N-末端序列也不同。

                     发明概述

本发明提供了基于溶组织内阿米巴凝集素的LC3亚单位肽疫苗，其中灵长类动物(如人类)体内有效剂量的LC3亚单位肽可引起粘膜上抗凝集素IgA的生成，以抵抗溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。某些实施方案中，用在疫苗中的LC3亚单位肽包括重组溶组织内阿米巴LC3蛋白的表位3或表位7部分，它是凝集素重亚单位(氨基酸758-1134，氨基酸编号方法与Tannich所述一致(Tannich，1991))的富含半胱氨酸的蛋白。例如，溶组织内阿米巴LC3亚单位肽疫苗由LC3的891-903或918-936位氨基酸构成(encode)，这是表位3部分(亚单位)，或者由1114-1128位氨基酸构成，这是表位7部分(亚单位)。疫苗可与生理学上可接受的无毒载体和佐剂联合使用。

某些实施方案中，使用纯化的LC3亚单位肽编码DNA表达LC3亚单位肽。某些实施方案中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约891到约903位残基的连续氨基酸序列，从约918到约936位残基的连续氨基酸序列，从约1114到约1128位残基的连续氨基酸序列，或者从约1128到约1150位残基的连续氨基酸序列。某些实施方案中所用的LC3亚单位肽是野生型LC3亚单位肽的变异体，其不同之处在于该野生型LC3亚单位肽的一个或多个氨基酸残基进行了修饰。这种修饰可以是例如一个或多个残基的替换(如保守性替换)。疫苗可进一步包含有效剂量的免疫佐剂或者其它免疫激发剂。某些实施方案中，至少一个亚单位肽与载体分子缀合或连接。例如将1个、2个、3个、4个、5个或6个肽连接到载体分子上。这些肽可以都属于同一类型，也可以为不同种类。例如，3个包含918-936位残基的亚单位肽和3个包含1128-1150位残基的亚单位肽可以同时连接到一个多赖氨酸骨架上。又例如将所有四种可用肽中的至少一种连接到载体分子上。例如，载体分子可以是多肽或者多糖。

本发明也提供了通过向灵长类动物导入有效剂量的疫苗来保护易感动物(如人类)免受溶组织内阿米巴或不等内阿米巴的感染或增殖的方法，其中的疫苗包含溶组织内阿米巴LC3亚单位肽；这里灵长类动物体内的有效剂量的LC3亚单位肽，可引起粘膜上抗凝集素IgA的生成，并且将LC3亚单位肽与生理学上可用的无毒载体联合使用。某些实施方案中通过皮下注射或者静脉注射导入疫苗。另一些实施方案中通过口腔摄取或鼻腔来导入疫苗。

另外本发明提供了分离纯化的溶组织内阿米巴LC3亚单位肽，这里LC3亚单位肽在灵长类动物体内引起粘膜上抗凝集素IgA的生成，以抵抗溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。某些实施方案中这种亚单位肽是溶组织内阿米巴表位3(868-944位氨基酸)或表位7(1114-1134位氨基酸)。例如由LC3的891-903，918-936，1114-1128或1128-1150位氨基酸构成亚单位肽。

本发明也提供了分离纯化的多核苷酸，它包含编码溶组织内阿米巴LC3亚单位肽的核酸序列，这里LC3亚单位肽在灵长类动物体内引起粘膜上抗凝集素IgA的生成，以抵抗溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。这种多核苷酸可以是DNA或RNA。

本发明也提供了特异性识别某LC3亚单位肽的纯化抗体，该LC3亚单位肽包含从约891到约903位残基的连续氨基酸序列，从约918到约936位残基的连续氨基酸序列，从约1114到约1128位残基的连续氨基酸序列，或者从约1128到约1150位残基的连续氨基酸序列。这种抗体可以是多克隆、单克隆和/或人源化抗体。另一方面，本发明也涉及到可根据这些肽进行生产的核酸和免疫试剂。这些试剂特异于每种编码肽的核酸，也特异于它们的RNA或蛋白产物。例如可按照一种本领域常规方法，通过使用一般核酸探针设计原则并比较这些肽的DNA序列，对特异于上文4个肽中任意之一的寡核苷酸进行识别。

本发明也提供了通过向试验对象导入有效剂量的疫苗(如上文所述)，来赋予试验对象抵抗溶组织内阿米巴或不等内阿米巴感染的免疫性的方法。接种这种疫苗将引起免疫反应，该反应阻碍了阿米巴的糖-结合活性，而这种活性是阿米巴增殖和杀死宿主细胞所需要的。

通过使用以下实施例中所述的技术，本发明也提供了鉴别其它亚单位肽的方法。

                     附图简述

图1.通过限制性酶消化LC3DNA生产的重组蛋白片段。标出了限制性酶位点，蛋白片段用氨基酸序号表示。共生产了7个重组LC3蛋白片段(A-G)。

图2.血清抗LC3IgA(图2A)和IgG抗体(图2B)的ELISA的OD结果，均使用纯化的LC3抗原(均值用水平线标出)。研究组包括血清反应阴性的未感染对照，无症状感染者，血清反应阳性的处于溶组织内阿米巴感染状态的对象(通过大便PCR确认)，新近从ALA痊愈对象(感染或未感染)以及从ALA痊愈后一年未被感染(通过培养标准确定)的对象。新近从ALA痊愈对象(感染或未感染)和无症状肠道感染的血清反应阳性对象的IgA和IgG抗体水平相比对照和从ALA痊愈一年的对象显著更高(所有p＜0.05)。

图3.人抗LC3IgA抗体和IgG抗体及抗-LC3鼠IgA单抗对LC3表位的识别。通过对血清IgA和IgG抗体识别LC3蛋白片段的分析，我们发现来自ALA对象(感染或未感染)和来自血清反应阳性的溶组织内阿米巴无症状感染对象的IgA抗体都识别表位3和表位7(椭圆形阴影)。只有抗LC3IgG抗体识别表位6(空心椭圆)，而从ALA痊愈一年对象的IgG抗体则不发生此识别。抗LC3鼠IgA单抗识别表位1、2、4、5和6(*)，而不识别表位3或7。

图4.混合人肠道和血清抗LC3IgA抗体对基于LC3表位3和7氨基酸序列的合成肽的识别。根据LC3表位3序列合成10个重叠肽，根据表位7合成两个肽。从以下对象获得肠道(三角形)和血清(圆圈)IgA抗体：从ALA痊愈且当前被感染的对象(黑色)；血清反应阴性，无症状PCR(+)对象(灰色)和血清反应阴性，PCR(-)对照对象(空心标志)。相比血清反应阴性对照建立的截值(cutoff)点，来自所有对象的肠道和血清IgA抗体都识别肽2、9、11、12。来自ALA对象的血清IgA抗体和来自血清反应阳性的无症状感染者的大便和血清IgA抗体识别肽2、9和11。

图5.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗LC3IgG抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接于多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。通过ELISA确认，鼻腔导入重组LC3疫苗和导入合成肽疫苗都引起针对重组LC3蛋白的血清IgG抗体的生成。

图6.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗凝集素IgG抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。重要的是，重组LC3蛋白和合成肽疫苗都引起血清IgG抗体的生成，该抗体识别来自溶组织内阿米巴滋养体的存在于寄生虫表面的天然Gal/GalNAC凝集素。

图7.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗肽IgG抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。通过使用纯化肽(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸)进行的ELISA确认，只有合成肽疫苗引起识别4个假定的保护性LC3表位的血清IgG抗体的生成。重组LC3疫苗引起识别其自身(图5)和天然凝集素(图5)的IgG抗体的生成，而该抗体不识别通过人IgA抗体作图所定义的4个假定的保护性LC3表位。

图8.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗LC3IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。只有重组LC3蛋白疫苗引起血清抗LC3IgA抗体反应，而没有观察到合成肽疫苗引发此反应。

图9.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗凝集素IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。如图8所示，重组LC3疫苗引发血清抗凝集素IgA抗体反应，而合成肽疫苗则不引发该反应。

图10.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的血清抗肽IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。与LC3重组疫苗引发血清IgG抗体的结果一致(图7)，重组LC3蛋白疫苗(图8和9)不引起识别4个肽表位的血清IgA抗体的生成；合成肽疫苗引起弱血清抗肽IgA抗体反应。

图11.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的大便抗LC3IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。显然只有合成肽疫苗引起大便(肠道)抗LC3IgA抗体反应；重组LC3蛋白疫苗引起血清抗LC3IgA抗体的生成(图8)，但不引起大便或粘膜抗LC3IgA抗体反应。

图12.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的大便抗凝集素IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。重要的是，合成肽疫苗引起肠道IgA抗体的生成，而该抗体识别存在于寄生虫表面的阿米巴天然Gal/Gal/NAC凝集素分子；而且，没有观察到LC3重组蛋白疫苗引发粘膜IgA抗体反应。

图13.此图说明了在实验的第7、14、21和28天时狒狒的大便抗肽IgA抗体反应，这些反应是在第1、7、14和21天通过鼻腔向狒狒导入疫苗(共四次，使用20μg霍乱毒素作为佐剂)后发生的，处理方法分别为只导入佐剂(黑色柱子)；基于LC3的肽疫苗(891-903、918-936、1114-1138、1128-1150位氨基酸，这些肽随机连接与多赖氨酸骨架上，每个骨架分子连接6个肽；处理量为200μg)(中间的浅色柱子)；纯化的52kDa LC3重组蛋白(200μg)+霍乱毒素(20μg)(阴影柱子)。如同预测的那样，只有合成肽疫苗引起识别4个假定的保护性LC3肽表位的粘膜IgA抗体的生成；而没有观察到LC3蛋白疫苗引发反应。

                      发明详述

对肠道阿米巴种感染的免疫力与肠道IgA抗体的存在相联系，该抗体抵抗寄生虫的半乳糖-抑制粘着凝集素。发明者使用凝集素重亚单位(称为LC3)重组蛋白的重叠片段，通过ELISA确定了血清和肠道(即粘膜)抗凝集素抗体的表位特异性。这些发现与表位-特异的鼠源抗凝集素IgA单抗(MoAbs)在体外对阿米巴半乳糖特异性粘着的作用效果相联系。LC3是富含半胱氨酸(AA 758-1134)的高抗原性和免疫原性蛋白，它包含凝集素糖结合结合域。研究对象来自南非的德班，他们最近从阿米巴肝脓肿(ALA)痊愈，其中有的被流行性肠道溶组织内阿米巴感染，有的则未感染，或者在治愈一年后未被感染。本发明人也研究了血清反应阳性的对象，他们被流行性溶组织内阿米巴感染，但没有表现为疾病和症状。来自所有研究组的血清抗LC3IgA抗体不论临床状况如何都专一识别LC3的表位3(AA 868-944)和表位7(AA 1114-1134)。表位6(AA1070-1114)也被血清抗LC3IgG抗体识别。但是IgG抗体对表位6的识别(不是对表位3或7的识别)在ALA治愈一年后消失。发明者生产了14个鼠源抗LC3IgA MoAbs，它们全部识别LC37个表位的5个。大多数鼠源MoAbs识别表位1(AA 758-826)，这个表位不被人IgA抗体识别。有趣的是，溶组织内阿米巴滋养体对CHO细胞的粘着作用被表位1、3、4(AA 994-987)和6(p＜0.01)的MoAbs所抑制。通过使用重叠合成肽来进一步鉴定人IgA抗体对LC3表位的识别(表位3和7)。发明者鉴别了4个肽(AA891-903，918-936，1114-1138，1128-1150)，这些肽的线性或环化形态被来自ALA和无症状、血清反应阳性感染对象的混合(pooled)肠道IgA抗体和血清IgG抗体所识别。这些凝集素表位可被用于阿米巴亚单位疫苗设计，以得到粘膜免疫活性，该免疫活性类似于从ALA痊愈后即对新阿米巴感染具有高度免疫力的人体的免疫活性(Ravdin et al.，2003)。

                    疫苗组成

使用170kDa肽的一个或多个亚单位作为疫苗组合物的活性成分。本发明提供的肽是LC3的变异体。LC3的“变异体”是LC3多肽或寡肽，它与天然LC3并不完全相同。LC3变异肽分子包括非全长LC2肽，即LC3的亚单位。也可通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸来改变氨基酸序列，从而得到LC3变异肽。修饰蛋白的氨基酸序列(如替换)，以得到性能与天然多肽基本相同或有所提高的多肽。可以进行保守性替换。“保守性替换”是用与原有氨基酸残基相比具有相似侧链的氨基酸进行替换。保守性替换应尽可能使氨基酸电荷或氨基酸侧链大小变化达到最小(另一选择是，使大小、电荷或侧链内的化学基团种类的变化达到最小)，从而使肽在整体上保持其空间构象但其生物活性有所改变。例如，一般的保守性替换可以是Asp替换为Glu、Asn或Gln；His替换为Lys、Arg或Phe；Asn替换为Gln(Gin)、Asp或Glu(Gli)；Ser替换为Cys、Thr或Gly。通常使用丙氨酸替换其它氨基酸。20种必需氨基酸可如下分组：具有非极性侧链的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有无电荷极性侧链的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；具有酸性侧链的天冬氨酸和谷氨酸；具有碱性侧链的赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

通过改变蛋白相应核酸序列的密码子来改变氨基酸。已知可通过替换肽结构中的某些氨基酸来得到这种多肽，以修饰或改善其抗原性或免疫原性。例如通过替换可变氨基酸，可稍微改变肽构象以提高活性或增强免疫反应。将某些多肽的氨基酸进行替换也可能会得到可连接到其它分子的残基，从而得到肽与其它分子形成的缀合物，而该缀合物充分保持了原始多肽的抗原性以用于其它用途。一个实施方案中可使用多赖氨酸骨架作为载体，连接本发明的一个或多个相同或不同的肽。例如将6个肽分子连接到同一个多赖氨酸骨架上。

LC3肽可缀合到或连接到其它肽或多糖分子上。例如可连接到本领域熟知的免疫原蛋白上，作为“载体”。可用的免疫原蛋白包括匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin(KLH))、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、人血清白蛋白、人丙种球蛋白、鸡免疫球蛋白G和牛丙种球蛋白。也可选用作为疫苗的其它病原体的多糖或蛋白(例如破伤风类毒素)与LC3肽缀合或连接，或者与LC3肽混合。

在赋予多肽相互作用的生物功能时，可使用氨基酸的亲水性指数。发现某些氨基酸可替换其它具有相似亲水性指数的氨基酸，而蛋白保持相似生物活性。也可根据亲水性进行相似氨基酸的替换，尤其是当所需新多肽的生物活性用于免疫学实施方案的时候。蛋白的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性决定)与其免疫原性有相关性。因此注意到可根据分配到每个氨基酸的亲水性来进行替换。在使用为每个氨基酸赋值的亲水指数或亲水性指数时，在值变化为±2，例如±1或者±0.5范围内进行氨基酸替换。

变异LC3肽与相应天然LC3具有至少50％，至少约80％，至少约90％或者甚至达100％的连续氨基酸序列同源性或同一性。

LC3肽本质上相应于天然LC3氨基酸序列的一部分。这里使用的“本质上相应”指多肽序列可引起保护性免疫反应。针对组合物或疫苗的免疫反应，是宿主体内由细胞和/或抗体介导的针对目的多肽或疫苗的免疫反应的发展。通常这种反应由试验对象特异性针对目的组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原而产生的抗体、B细胞、助T细胞、抑T细胞和/或胞毒T细胞所组成。

本发明的变异体可以是在相应天然LC3中添加了不存在的氨基酸残基，或者可以是在相应天然LC3中删除了部分残基。

可使用纯化的编码LC3肽的DNA序列表达疫苗的LC3肽。“重组体”定义为通过基因工程生产的肽或核酸。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文可互换使用。

编码构成LC3肽的氨基酸序列的核酸分子可通过本领域的多种方法制备。这些方法包括(但不仅限于)从天然来源分离(当存在天然变异氨基酸序列时)或者通过寡核苷酸介导(或定点突变)的突变，PCR突变和对先前制备的变异或非变异LC3肽进行盒式突变制备。可通过在固体支持物上进行直接化学合成并随后将产物从支持物上分离，来方便的制备变异肽。本领域中熟知这些方法。

170kDa亚单位的“化学衍生物”包含额外的化学组成部分，而这些部分并不是肽的正常成分。本发明也包括对肽的共价修饰。可使肽的靶氨基酸残基与有机衍生试剂(它可与选定的侧链或末端残基进行反应)进行反应，从而向分子内引入这些修饰。

             保护对象免受感染的方法

本发明的疫苗组合物用于预防易感受试者的溶组织内阿米巴感染。170-kDa亚单位蛋白可被用作免疫原。因为携带表位的(epitope-bearing)片段相对较短(如含有20个或更少的氨基酸)，所以用免疫原性载体与肽偶联以提高其免疫原性是有利的。这种偶联技术为本领域熟知，包括使用连接部分(例如从Pierce ChemicalCompany，Rockford，III获得)的标准化学偶联技术。合适的载体包括蛋白，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、大肠杆菌菌毛蛋白k99、BSA或者轮状病毒VP6蛋白。

可通过皮下注射或肌肉注射来导入LC3肽疫苗。也可通过口服摄取或鼻腔接种。为免疫对象，可通过非肠道途径导入LC肽，通常通过皮下或肌肉注射到合适载体内。但也可使用其它导入模式，例如口服或鼻腔运送。疫苗制剂在载体内含有有效剂量的活性成分。有效剂量足以预防、改善或降低溶组织内阿米巴在靶哺乳动物体内的发生率。本领域技术人员可方便的确定待导入疫苗的有效剂量。组合物中活性成分典型含量为从约1％到约95％(w/w)，或者如果合适则更高或更低。导入剂量依赖于待接种动物或人对象的年龄、体重和身体状况等因素。导入剂量也依赖于动物免疫系统产生抗体的能力，以及所需的保护程度。本领域技术人员可通过常规试验建立剂量反应曲线来方便的确定有效剂量。通过向对象导入一个或更多剂量的LC3肽来免疫对象。当要求维持对溶组织内阿米巴的免疫力时，可以导入多剂量LC3。

鼻腔制剂可包含的载体需既不引起的鼻粘膜的刺激，也不严重干扰鼻毛功能。可对本发明的对象使用稀释剂，如水、水成盐或其它已知物质。鼻腔制剂也可包含防腐剂，包括(但不仅限于)氯丁醇和氯化苄烷铵。可使用表面活性剂以提高鼻粘膜对试验蛋白的吸收。

用于口服的液体制剂可以为如水或油悬浮液、溶液、乳剂、糖浆、酏剂形式，或者制成干燥片剂或在使用前再与水或其它合适载体重新构建的制剂。这些液体制剂可包含常规添加剂例如悬浮剂、乳化剂、非水载体(可包括食用油)或防腐剂。

为制备疫苗可将LC3肽纯化、冻干并稳化。然后可将LC3肽调节到合适浓度，任意与合适佐剂组合，并包装待用。合适的佐剂包括(但不仅限于)表面活性剂，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基双十八烷基铵、N，N-双十八烷基-N′-N-双(2-羟乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和普卢兰尼克多羟基化合物；聚阴离子(polanions)例如吡喃、硫酸右旋糖苷、聚IC、聚丙烯酸、聚羧乙烯(carbopol)；肽例如胞壁酰二肽、MPL、aimethylglycine(二甲基甘氨酸)、吞噬刺激素(tuftsin)；油乳剂、明矾等，以及上述物质的混合物。其它可能适用的佐剂包括大肠杆菌不耐热肠毒素B肽亚单位或霍乱肠毒素。在一个实施例中，使用霍乱肠毒素CTA-a-DD的活性亚单位(Mowat，2001；Eriksson，2003；Lycke，2001)。其它可能适用的佐剂为本领域所熟知。最后可将免疫原产物包埋于脂质体内以用作疫苗制剂，或者将其与蛋白缀合，例如与匙孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)或其它聚合物缀合。

使用LC3肽接种哺乳动物作为防治阿米巴繁殖的疫苗，相对其它候选疫苗具有优势。通过接种预防繁殖或感染不仅降低了直接症状的发生率，也消除了后遗症。

对疫苗组合物中的活性成分或活性成分混合物，可使用熟知的蛋白或肽疫苗的制备方法方便的进行配制。疫苗组合物可包含免疫刺激剂或佐剂，例如完全或不完全弗氏佐剂、氢氧化铝、脂质体、珠子(例如橡胶珠或金珠)、ISCOMs等。脂质体微粒由粘着在一起的水相同心层和油相层组成，活性蛋白分散或以其它方式存在于其中，而内部包裹有活性蛋白的脂质体是药物组合物。活性蛋白优选存在于脂质体的水相层和油相层，内部或外部，或者也可存在于非均一系统，该系统通常称为脂质体悬浮液。疏水层或者油相层通常(但不是绝对)包含磷脂(例如卵磷脂和鞘磷脂)，类固醇(例如胆固醇)，或多或少的离子型表面活性物质(例如联十六烷基磷酸盐、十八酰胺或者磷脂酸)，和/或其它疏水性物质。

疫苗组合物优选包含(1)有效量的活性成分，即一或多种肽，以及(2)合适量的运输载体，如果需要还有(3)防腐剂、缓冲剂等。

可使用本领域常规方法导入疫苗。制成合适的制剂后，可以联合使用渗透剂(例如胆汁盐或梭链孢酸)和(通常)表面活性剂，将肽疫苗穿过粘膜导入。也已知可经皮导入疫苗。也可使用口服制剂。剂量水平依赖于导入模式，实验对象性质和载体/佐剂制剂性质。蛋白或肽的有效剂量优选为0.01μg/kg-1mg/kg体重。总体上按照本领域标准，使用标准免疫方案多重导入疫苗。

LC3-特异性抗体

术语“抗体”意义包括能够结合LC3亚单位肽的完整分子及其片段。可以使用多克隆抗体、单克隆抗体，人源化抗体或嵌合抗体，单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab)₂片段。多克隆抗体是异源抗体分子群，它们特异于特定抗原，而单克隆抗体是同源抗体分子，它们特异于包含于抗原的特定表位。

抗体可以是任何种类的免疫球蛋白(Ig)，包括IgM、IgA、IgD、IgE、IgG，以及其它们的任何亚组球蛋白。IgA类抗体尤其有效，因为一个抗体分子可以与其它LC3亚单位肽交联，并且也是粘膜抗体。包含多价交联Ig分子(例如交联的IgG)的免疫复合体也能够与较多的LC3亚单位肽分子发生交联，也可能特别有效。

这里所用的“表位”是抗原分子的一部分，抗体即结合于其上。抗原可同时呈现多于一个表位。对多肽抗原来说，一个表位的典型长度为4-6个氨基酸。如果它们结合到相同表位或相同表位组，那么两种不同免疫球蛋白可能具有同一表位特异性，

多克隆抗体存在于免疫后动物的血清中。可通过如标准杂交瘤方法来生产单克隆抗体。特别的，可按照本领域的任何通过连续细胞系培养生产抗体的方法来生产单抗。本发明生产单抗的杂交瘤可在体外或体内培养。

本发明的抗体也可从如个体血清中分离。合适的分离方法包括使用色谱技术等从哺乳动物血清中纯化抗体。

也可通过如使用LC3亚单位肽免疫宿主动物(如兔、鸡、小鼠、豚鼠或大鼠)的方法来生产结合于LC3亚单位肽的抗体。可通过重组技术、化学合成或从天然蛋白纯化等方法生产LC3肽或部分LC3肽，然后再通过注射多肽来免疫动物。根据宿主种类，可使用佐剂来增强免疫反应。合适的佐剂包括弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂)、普卢兰尼克多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白(KLH)和二硝基酚。可使用标准方法从宿主血清中分离由LC3免疫反应产生的抗体。

也可通过重组技术生产抗体。这里提供的抗体的氨基酸序列(如部分氨基酸序列)可通过标准方法确定，也可从试验对象血清中(如病人或免疫后的宿主动物，最初从中分离抗体)分离编码抗体(或部分抗体)的cDNA。可使用标准方法将这种cDNA克隆到表达载体上。然后将表达载体转移到合适的宿主细胞中(如中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞或杂交瘤细胞)，即可表达并纯化抗体。

也可使用下文所述方法生产具有与LC3亚单位肽特异性亲和力并保持交联功能的抗体片段。这种抗体片段包括(但不仅限于)F(ab’)₂片段(可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生)、Fab片段(通过还原F(ab’)₂的二硫键产生)。也可构建Fab表达文库。通过一个氨基酸桥(如15-18氨基酸)将Fv区域的重链和轻链片段相连形成一个单链多肽，即单链Fv抗体片段。可通过标准方法生产单链Fv抗体片段，例如美国专利No.4,946,778中所述方法。可通过如生物素酰化和交联的方法使这种抗体呈现出多价性，从而得到能够与较多LC3亚单位肽交联的抗体片段。

以下本文将通过实例(不用以限定本发明)来阐述本发明。

                       实施例1

             血清中抗凝集素IgG和IgA的出现

患阿米巴肝脓肿(ALA)后痊愈的病人具有对不等内阿米巴肠道感染的免疫力。患阿米巴大肠炎后痊愈的儿童具有对溶组织内阿米巴感染的免疫力，同时存在抗凝集素IgA抗体(Haque，2002)。发明者们对ALA痊愈病人或处于无症状感染对象血清中的抗凝集素IgA和IgG的表位特异性进行了研究。其结果相关于阿米巴与表位-特异性小鼠单抗(MoAb)间半乳糖-特异性粘着作用的抑制。从75个个体中获得样本：42例ALA病人，11例无症状溶组织内阿米巴肠道感染者，22例非感染对照。确定与LC3的7个重叠片段(半乳糖-抑制的凝集素重亚单位的富半胱氨酸部分(AA 758-1134))的反应(图1)。所有无症状感染者和42例ALA病人中的19例的溶组织内阿米巴感染粪便培养和排泄物PCR呈阳性，而对照和所有其余ALA病人则呈阴性。所有ALA病人和无症状溶组织内阿米巴感染者的血清抗LCX3(全长)IgG抗体呈阳性。40例ALA病人中的32例和11例无症状溶组织内阿米巴感染者中的10例的血清抗LC3(全长蛋白)IgA抗体也呈阳性。血清抗LC3IgG和IgA抗体专一识别LC3的表位3(868-944)和表位7(1114-1134)。表位6(1070-1114)被抗LC3IgG抗体鉴别，但不被IgA鉴别。小鼠抗LC3IgA MoAbs识别7个LC3片段中的5个。大部分鼠源MoAbs识别第一个LC3片段(758-826)，但不被人免疫血清所识别。有趣的是，体外溶组织内阿米巴对CHO细胞的粘着作用被识别第三片段的MoAb(61％)所抑制，而不被MoAb通过抑制第六片段(28％)而抑制。结论是，在ALA病人和无症状感染者体内，LC3的第三片段引起体液免疫反应(IgA和IgG)，并且这种作用无个体间差异。针对这个片段的MoAb在体外抑制了由凝集素介导的溶组织内阿米巴对哺乳动物细胞的粘着作用，这表明此片段可能是一个合格的候选疫苗，用于引起对溶组织内阿米巴感染的粘膜免疫力。

                       实施例2

肠道原生动物溶组织内阿米巴在内脏的繁殖作用，与其粘着到覆盖结肠粘膜的富糖粘蛋白层的粘着作用相关(Chadee，1987；Chadee，1988)，这个粘蛋白层形成了阻碍寄生虫入侵的非免疫性障碍。总体上，认为分泌的IgA抗体通过免疫清除作用参与了粘膜防御。IgA抗体通过凝集作用，将其陷于免疫复合体内，并在粘膜面(blanket)上进行清除，来防止肠道原生动物与肠道上皮表面接触(McGhee，1992)。

溶组织内阿米巴对结肠粘蛋白和上皮细胞的粘着作用，是通过寄生虫的半乳糖-抑制表面凝集素来介导的(Chadee，1987；Petri，1987)。该凝集素的170kDa重亚单位的糖-结合域(Petri，1990；Ravdin，1981)定位在氨基酸895-998之间(Dodson，1997；Mann，1993；Pillai，1999)。在体外，170kDa凝集素亚单位的鼠源IgG多克隆抗体完全阻碍了溶组织内阿米巴滋养体对结肠粘膜的半乳糖-特异性粘着作用(Chadee，1987；Chadee，1988)，这表明肠道抗凝集素IgA抗体可能在对溶组织内阿米巴的粘膜免疫力中具有重要作用。从流行病学研究中，不断有证据证明肠道抗凝集素IgA抗体介导了对溶组织内阿米巴(Haque，2001；Haque，2002)和不等内阿米巴(Ravdin，2003)肠道感染的免疫作用。不等内阿米巴与溶组织内阿米巴紧密相关但截然不同(Diamond，1978)，它在形态学上与溶组织内阿米巴相同，其功能性半乳糖-结合凝集素的氨基酸序列与溶组织内阿米巴的相应序列有85％以上的同源性。不等内阿米巴凝集素包含完整的糖结合域(Pillai，1997)，不等内阿米巴引起肠道(但不是体液)抗凝集素IgA抗体反应(Ravdin，2003)。

称为LC3的包含凝集素170kDa亚单位758-1134氨基酸的重组富半胱氨酸融合蛋白(Soong，1995)，包含凝集素的半乳糖-结合位点(Dodson，1997；Mann，1993；Pillai，1999)，并被粘着-抑制IgG单抗识别。LC3蛋白具有高度抗原性和免疫原性；在沙鼠肝脓肿模型中，纯化的LC3蛋白具有70％的疫苗功效(Soong，1995)。使用LC3蛋白并使用霍乱毒素作为佐剂口服免疫BALB/c小鼠，引起粘着-抑制肠道抗LC3IgA抗体反应(Beving，1996)。90％以上的入侵性阿米巴病(大肠炎和ALA)病人，和大多数无症状溶组织内阿米巴肠道感染试验对象的血清中存在抗LC3IgA和IgG抗体(Abd-Alla，2002；Ravdin，2003)。在一些包含大样本阿米巴大肠炎和肝脓肿病人的研究中，检测到对重组LC3抗原的粘膜IgA免疫反应(Abou-El-Magd，1996；Ravdin，2003)。

本发明的发明者们鉴别了被IgA抗体识别的特异性LC3表位，此抗体与出现于ALA痊愈后的假定保护性粘膜免疫反应相关(Ravdin，2003)。使用重组LC3蛋白的重叠片段，利用血清IgG抗体作为比较鉴别了IgA抗体表位。通过混合(pool)肠道IgA抗体证实了这些发现。发明者们生产了针对LC3蛋白的IgA单抗，以用作特异性探针将表位-识别与阿米巴的半乳糖-特异性粘着作用关联起来。为了进一步说明假定的LC3表位，利用活性LC3表位的氨基酸序列制备重叠肽，并使用混合(pool)的人血清和粪便IgA抗体筛选出识别作用。

                     对象和方法

对象

从无阿米巴感染的对照，血清反应阳性的被不等内阿米巴无症状感染的对象，新近(0-3个月)从ALA痊愈的对象(具有/没有持续的溶组织内阿米巴肠道感染)，以及从ALA痊愈一年仍未被感染的对象取得血清和大便样本，所有对象均来自南非德班，一个高阿米巴病发生率区域。在南非没有抗肠腔内阿米巴药例如糠酸安特酰胺或巴龙霉素供应；因此ALA病人可能在治疗后仍保持感染数月到数年之久(Ravdin，2003)。通过使用PCR扩增核糖体DNA和/或粪便培养物的酶谱型(zymodeme)分析来确认溶组织内阿米巴感染。

通过核糖体DNA PCR检测阿米巴感染

大便样本保存于-70℃，提取的DNA组成大便DNA银行保存于-20℃。使用QIAamp DNA Stool Mini Kit(Quiagen，Haldin，Germany)根据说明书提取人大便DNA。使用四个分开的区域进行PCR分析以尽可能降低污染的风险。在一个区域内从大便提取DNA，而PCR混合物制备和样本添加在另一区域进行，在第三个区域进行PCR操作，扩增的PCR材料(材料、玻璃容器和设备)的储存和分析在第四个区域进行。

PCR操作如下：使用dNTP各100Tl(Amersham Pharmacia Biotech，Catalog#27-2035-01，C、G、T、A，均为100mM水溶液，pH7.5)，10xPCR缓冲液到5ml，和4.6ml水(dNTP最终浓度为10μl/ml：A5.8μg/ml，C 5.6μg/ml，G 5.9μg/ml，T 5.7μg/ml)，混合后分装，每份1ml并保存于-20℃。每次使用前将Taq酶(Amersham PharmaciaBiotech，Catalog#270799)按1∶20比例稀释。引物使用浓度均为10Pmol/μl，溶组织内阿米巴正义引物：5′-GTA CAA AAT GGC CAATTC ATT CAA CG-3′(SEQ ID NO：1)，不等内阿米巴正义引物：5′-GTA CAA AGT GGC CAA TTT ATG TAA GCA-3′(SEQ ID NO：2)，溶组织内阿米巴/不等内阿米巴反义引物：5′-GAA TTG ATT TTACTC AAC TCT AGA G-3′(SEQ ID NO：3)(Blessman，2002)。使用等体积的水稀释牛血清白蛋白(BSA)(Pierce，200mg/ml，Catalog#23210)(500T1 BSA+500μl H₂O)，保存于4℃。将待测DNA(5μl)添加到95μl的PCR混合物中，总体积为100μl。每个DNA样本检测两次，一次使用溶组织内阿米巴正义引物，另一次使用不等内阿米巴正义引物。

使用常规的PCR温度循环条件，95℃ 2min，然后以下条件35个循环：94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 30s。最后一循环为72℃ 3min。

使用凝胶电泳对扩增的DNA进行特异性检测。消化的DNA在含有溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶上分开。

重组LC3片段在大肠杆菌中的表达

用限制性酶消化编码LC3的编码DNA(凝集素重亚单位基因的bp 2273-3397)(Soong，1995；Tannish，1991)(图1)，并将DNA片段连接进pREST载体中。转化细菌的培养和融合蛋白的表达已有文献进行了详细描述(Soong，1991)。使用T7标签的IgG单抗(它连接到融合蛋白的前导序列上)通过免疫印迹确认每种蛋白的表达。

针对LC3构成的蛋白片段的IgA单抗的生成

从Jackson Laboratory(Bar Harbor，Maine)获得BALB/c小鼠，此小鼠保持无病原体动物种系。将小鼠置于小隔离笼中，保持无仙台病毒和其它病原微生物的环境。

通过粘膜免疫方法生产IgA单抗。使用各200μg LC3蛋白在BALB/c小鼠的Peyer氏斑内免疫两次，并在第二天静脉推注2μg肾上腺素IP和50μg LC3蛋白加强免疫。三天后处死小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞杂交。

使用ELISA鉴别分泌针对LC3构成的蛋白的IgA单抗的杂交瘤克隆(Nedrud，1987)。用LC3蛋白包被Nunc免疫板，在pH 9.6并于4℃下过夜。在磷酸盐缓冲液(PBS)中用1％的BSA封闭免疫板。将每种融合体的组织培养上清液在室温下温育1h，或者在4℃下温育过夜。随后用含有1％BSA和0.5％吐温20的PBS缓冲液洗涤，再于每个孔中添加缀合有碱性磷酸酶的羊抗鼠IgA抗体100μl(溶于含有1％BSA的PBS-吐温液中，浓度为1-1000)。添加1mg/ml的对-硝基苯酚磷酸盐底物对酶促反应进行显色，并在波长410μm处测定光密度(OD)。OD值超过对照孔(没有LC3存在)0.05即认为为阳性。用IgA、IgG、IgM骨髓瘤蛋白确认抗鼠IgA缀合物的同型特异性。使用Iso-strip³小鼠单抗同型测试试剂盒也确认鼠源抗体的同型性。

被人血清IgA和IgG抗体识别的LC3片段表位作图

按先前文献(Abd-Alla，2000)所述进行ELISA实验和LC3蛋白片段纯化(Soong，1995)。简要来说，使用单独LC3蛋白片段包被的微滴平底聚苯乙烯ELISA板(每孔0.4Tg)，并用1％BSA封闭非反应位点。IgA实验血浆样品稀释比例为1∶100，IgG为1∶250，所有反应均在PBS-吐温-1％BSA中进行，室温下温育2h。在PBS-吐温-1％BSA中稀释缀合碱性磷酸酶的羊抗人IgA抗体(ICN Biomedicals(CostaMesa，California))或抗人IgG抗体(SIGMA，St.Louis，MO)(IgA为1∶2500，IgG为1∶5000)，在100μl孔中室温下温育2h。接下来显色，并按文献所述进行读板和非特异性背景结合校正操作(Ravdin，1990)。

被鼠IgA单抗识别的LC3片段表位作图

离心转化的细菌(Soong，19959)，在SDS中裂解并上样到10％Laemmli聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后将蛋白转移到硝基纤维素膜上，以进行抗LC3IgA单抗免疫印迹。使用缀合辣根过氧化物酶的抗鼠IgA(稀释比例1∶1000)作为二级抗体，并以4-氯-1-萘酚作为底物以对固定的二级抗体进行染色。

单抗对阿米巴与CHO细胞体外粘着作用的影响

使用TYI-S-33培养基按Diamond所述(Diamond，1993)对溶组织内阿米巴滋养体(HMI∶IMSS株)进行无菌培养，并按文献所述进行收集(Ravdin，1981)。从ATCC获得CHO细胞，并用添加有10％胎牛血清(GIBCO)、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)F-12培养基(GIBCO)，按照先前文献所述进行培养。

使用花结试验(Ravdin，1981)进行粘着作用研究。在4℃下将阿米巴(1×10⁵个/ml)与杂交瘤上清液(稀释)共温育，对照阿米巴则与RPMI+10％FBS进行温育，或者与含有抗仙台病毒IgA单抗的组织培养上清液进行温育。进行充分(Extensive)洗涤后，用1mlM199S悬浮滋养体(1×10⁴个)和CHO细胞(2×10⁵个)，250x g离心后，在4℃下温育2h。温育后除去0.8ml的上清液并重悬沉淀。用血球计数器确定与CHO细胞形成的花结(3个或更多粘着细胞)的阿米巴百分比。

根据LC3蛋白表位的氨基酸序列进行肽合成和纯化

根据表位3(868-944位氨基酸之间)的氨基酸序列制备10个重叠肽。根据表位7(1114-1150位氨基酸之间)的序列制备两个重叠程度更大的肽。

使用Perkin Elmer Pioneer Peptide肽合成装置，通过固相FMOC(芴甲氧羰基)化学合成法进行肽的合成。使用试剂R将肽从树脂上切下并去保护，然后冻干。使用制备反相HPLC(Beckman 126)在C4柱上通过VYDC纯化冻干的粗肽。溶剂A＝0.1％的TFA水溶液，溶剂B＝0.1％的TFA ACN溶液(乙腈)，梯度设置为30min溶剂B从0-60％。通过分析HPLC和质谱分析进行纯化和质量控制，使用HP1090的C18柱(VYDC)并使用相同的梯度，质谱分析使用HPMALDI_TOF(Atherton，1978；Cleland，1964)。

人IgA和IgG抗体对肽的识别

从ALA病人获得混合人血清和大便，1.0gm大便溶于1.0μl PMSF(2mM)和2.0ml含有1.0％胎牛血清白蛋白的PBS-吐温中，使用无症状溶组织内阿米巴感染者和对照进行ELISA以确定对反应活性肽的识别。除了将从研究对象获得的等体积血清或预制备大便混合，并按先前所述浓度添加到包被有各种肽的孔中以外，此ELISA方法与LC3片段ELISA方法相同。其它EILSA步骤与肽片段ELISA步骤相同。

数据统计处理

所得结果以阳性和阴性百分比的均值形式给出(+3SD)。使用Z检验(转化成P值)和非成对t检验确定差异的显著性(Sox 1986)。

-Z检验

          Z＝(P1-P2)÷√PQ(1/N-1/N2)

P1＝第1组中阳性的比例，P2＝第2组中阳性的比例，P＝混合比例估计值＝(X1+X2)/(N1+N2)，X1＝第1组中阳性数目，X2＝第2组中阳性数目，N1＝第1组总数目，N2＝第2组总数目，Q＝(1-P)。

在该研究中，使用两个样本的Z检验统计百分比值。零(null)设为两个组中的阳性检验相同(差异百分比＝0.0％)。其它结果则认为两个组中的阳性检验不同。使用第一类误差(α)，为0.05∶

-Z＞1.645＝显著变化

-Z＜1.645＝非显著变化

                          结果

LC3重组蛋白片段的生产

如图1所示，LC3蛋白包括凝集素重亚单位的758-1134位氨基酸。使用限制性酶将LC3DNA切开成两个片段(A和D)，其编码的蛋白分别为758-944和944-1134位氨基酸。将片段A进一步消化成片段B(编码758-868位氨基酸)和C(编码758-826位氨基酸)(图1)。片段D进一步消化成片段E、F和G，编码的蛋白分别为944-1114，944-1070，944-987位氨基酸。从这些重叠DNA片段均制得重组蛋白，IgA抗体对这些蛋白的识别模式使得可以对7个不同LC3表位进行鉴别。

通过人抗LC3IgA和IgG抗体进行LC3片段表位作图

通过ELISA确定每组中对纯化LC3蛋白的血清学反应。对5组不同的阿米巴病对象进行研究以确定IgA的表位特异性是否存在差异：(1)血清阳性的无症状溶组织内阿米巴感染者，(2)从ALA痊愈并保持持续肠道无症状感染或清除了感染的对象，(3)从ALA痊愈并在一年内不被感染的对象。如同预测的那样，新近从ALA痊愈对象(当前被感染或当前没有感染)的血清抗LC3 IgA和IgG抗体的OD值高于对照和从ALA痊愈并在一年内不被感染的对象(p＜0.05，图2A和2B)。血清阳性的无症状感染者的抗LC3IgA和IgG抗体水平与新近ALA痊愈对象相当(图2A和2B)。血清抗LC3IgG抗体ELISA OD值(相同稀释比)高于IgA抗体(p＜0.05)。在表位作图研究中，使用细胞培养上清液中的未纯化重组蛋白作为ELISA实验中的抗原。因此，在大肠杆菌培养上清液中的未纯化重组LC3蛋白在相同实验条件下用作重组LC3片段的阳性对照。在这些实验条件下，其血清抗LC3 IgA抗体发生ELISA反应的对象在阿米巴病对象中的比例为从56.3％(从ALA痊愈后一年的对象)到90.1％(成人无症状感染者)，在先前发现所有这些对象对高纯度LC3蛋白均为IgA血清阳性(表1)。

表1.血清IgA抗体对溶组织内阿米巴LC3重组蛋白片段的识别

LC3蛋白片段	血清反应阴性&PCR(-)对照(n＝22)	无症状血清反应阳性a&PCR(+)(n＝11)	ALA血清反应阳性/PCR(+)(n＝19)	ALA血清反应阳性/PCR(-)(n＝23)	ALA血清反应阳性/一年后培养(-)(n＝19)
						未纯化LC3	0	10(90.1％)	16(84.2％)	16(69.6％)	9(56.3％)
A(758-944)	0	6(54.5％)a	15(78.9％)b	14(60.8％)a	8(50％)b
						B(758-868)	0	0	1(5.3％)	0	0
C(758-826)	0	0	0	0	0
						D(944-1134)	0	6(54.5％)b	10(52.6％)c	10(43.4％)b	5(31.5％)c
E(944-1114)	0	1(9.1％)	3(15.8％)	1(4.3％)	0
						F(944-1070)	0	1(9.1％)	0	0	1(6.3％)
G(944-987)	0	0	0	0	0

a--通过ELISA确定的对纯化LC3蛋白血清反应阴性或阳性，未纯化LC3蛋白作为未纯化LC3蛋白片段的阳性对照。

b--相比LC3片段B、C、E、F和G，识别LC3片段A的P＜0.05。

c--相比LC3片段B、C、E、F和G，识别LC3片段D的P＜0.05。

从4组阿米巴病对象得到的血清IgA抗体仅识别LC3片段A(758-944位氨基酸)和D(944-1134位氨基酸)，如表1所示(相对其它所有片段和来自血清反应阴性的未感染对象的对照血清，p＜0.05)。抗LC3血清IgG抗体的ELISA实验说明它对大肠杆菌培养上清液中的未纯化LC3具有比IgA更高水平的反应活性(81％-100％)，这与血清IgG抗体对纯化LC3蛋白的OD读数更高(图2B)相一致。四个亚组的阿米巴对象中的三组(无症状感染，ALA感染，ALA未感染)的血清IgG抗体识别片段A(758-944位氨基酸)、D(944-1134位氨基酸)和E(944-1114位氨基酸)(p＜0.05，表2)。但是IgG抗体不识别来自ALA痊愈后仅一年的未感染对象血清的片段E(表2)。

表2.血清IgG抗体对溶组织内阿米巴LC3蛋白的识别

LC3蛋白片段	血清反应阴性&PCR(-)对照(n＝22)	无症状血清反应阳性a&PCR(+)(n＝11)	ALA血清反应阳性/PCR(+)(n＝19)	ALA血清反应阳性/PCR(-)(n＝23)	ALA血清反应阳性/一年后培养(-)(n＝16)
						未纯化LC3	0	11(100％)	18(94.7％)	22(95.7％)	13(81.3％)
A(758-944)	0	11(100％)b	16(84.2％)b	19(82.6％)a	10(62.5％)b
						B(758-868)	0	2(18.2％)	0	0	0
C(758-826)	0	1(9.1％)	0	0	0
						D(944-1134)	0	11(100％)c	15(78.9％)c	19(82.6％)b	10(62.5％)c
E(944-114)	0	9(81.2％)d	14(73.7％)c	15(65.2％)d	1(6.3％)c
						F(944-1070)	1(4.5％)	0	0	0	0
G(944-987)	0	0	0	0	1(6.3％)

a--通过ELISA确定的对纯化LC3蛋白血清反应阴性或阳性，未纯化LC3蛋白作为未纯化LC3蛋白片段的阳性对照。

b--与LC3片段B、C、F和G相比，识别LC3片段A的P＜0.05。

c--与LC3片段B、C、F和G相比，识别LC3片段D的P＜0.05。

d--与LC3片段B、C、F和G相比，识别LC3片段E的P＜0.05。

e--相比识别其它ALA对象和无症状血清反应阴性对照，识别片段E的P＜0.05

根据对LC3蛋白片段的识别模式，发明者们确认在所有研究对象组中，人血清抗LC3IgA抗体均专一识别LC3的表位3(864-944位氨基酸)和表位7(1114-1134位氨基酸)。抗LC3IgG抗体也识别表位6(1070-1114位氨基酸)，但如上所述此识别在从ALA痊愈12个月的对象亚组中不存在。

鼠抗LC3 IgA单抗的鉴定

发明者们为得到抗LC3 IgA抗体使用ELISA筛选了1300个杂交瘤克隆，发现了85个阳性分泌体。通过限制稀释发明者们发现这其中有14个为稳定单克隆。发明者们通过免疫印迹确认了这14个杂交瘤克隆是否产生抗LC3蛋白的IgA单抗(表3)。通过ELISA发现这14个杂交瘤克隆中除2个之外(244号和728号)，均识别天然溶组织内阿米巴凝集素。所有实验中均使用抗仙台病毒的IgA单抗作为阴性对照。

表3.14个抗LC3IgA鼠单抗的表位特异性与人血清IgA和IgG抗

    凝集素抗体表位特异性的比较

LC3表位(氨基酸)	IgA单抗(克隆序号)	人抗体IgA    IgG
			1.(758-826)	38、41、193、244、606、728、737、854	(-)    (-)
2.(826-868)	(-)	(-)    (-)
			3.(868-944)	875	(+)    (+)
4.(944-987)	580、1152	(-)    (-)
			5.(987-1070)	676、1059	(-)    (-)
6.(1070-1114)	867	(-)    (+)a
			7.(1114-1150)	(-)	(+)    (+)

a＝从ALA痊愈一年的表位识别丢失

通过表位作图进一步鉴定抗LC3IgA单抗，如表3所示。使用7个LC3蛋白片段(A-G)和所有14种IgA单抗进行免疫印迹；分别使用LC3蛋白和LC1(1-346位氨基酸)融合蛋白作为阳性和阴性对照。8种单抗(38、41、193、244、606、728、737和854号)识别片段A、B、和C。875号克隆仅与片段A反应，说明它识别表位3(868-944位氨基酸)。发明者们通过相似的分析确认了每种抗LC3 IgA单抗的表位特异性(总结于表3，图示于图3)。没有发现IgA单抗识别LC3表位2和7(826-868位氨基酸，1114-1134位氨基酸)(图2)。有趣的是，绝大多数鼠IgA单抗(14种的13种)识别那些不被人抗LC3IgA抗体所识别的LC3表位(表3和图3)

抗LC3 IgA单抗对阿米巴与CHO细胞间粘着作用的影响

除了1152号克隆(表位4)没有表现抑制作用外，所有抗LC3 IgA单抗无论表位特异性如何均抑制了阿米巴与CHO细胞间的半乳糖-特异性粘着作用，抑制水平从25％到87％，相比对照IgA单抗，P＜0.01(表4)。580号单抗也识别表位4，它抑制阿米巴粘着的水平为72％(P＜0.1，表4)。

表4.抗LC3 IgA鼠单抗对阿米巴与CHO细胞间粘着作用的抑制

IgA生产杂交瘤上清液(LC3表位)	对粘着作用的抑制a，b	IgA生产杂交瘤上清液(LC3表位)	对粘着作用的抑制a，b
				38(1)	73％	875(3)	61％
41(1)	25％	580(4)	72％
				193(1)	70％	1152(4)	3％
244(1)	29％	676(5)	79％
				606(1)	73％	1059(5)	68％
728(1)	36％	867(6)	28％
				737(1)	87％	抗仙台病毒IgA对照	1％
854(1)	76％

a-相比无抗体存在的试验培养基对照所定义的对粘着作用的抑制百分比。

b-所有抑制阿米巴粘着作用的抗LC3 IgA MoAb细胞上清液(除了MoAb 1152)，相比抗Sendia病毒IgA对照P＜0.01。

使用合成肽的精确LC3表位作图

研究混合人血清和大便与12个重叠肽间的反应，以进一步定义被人IgA抗体识别的LC3表位。从表位3氨基酸序列制备10个肽，并根据表位7序列合成两个肽。从当前被感染的ALA病人得到的大便抗LC3 IgA抗体识别相同的4种肽(图4)，其中3种也被血清IgA抗体识别。来自无症状的血清反应阳性感染对象的大便和血清IgA抗体也识别上述4种肽中的3种(2、9、12号；图4)。反应肽片段的氨基酸序列如下：

肽#2

#2，(AA 891-903)(TGT ACA TAC GAA ATA ACA ACAAGA GAA TGT AAA ACA TGT(SEQ ID NO：4)，CTYEITTRECKTC(SEQID NO：5))；

肽#9

#9，(AA 918-936)(TGT GCA GAA GAG ACT AAG AATGGA GGA GTT CCA TTC AAA TGT AAG AAT AAC AAT TGC(SEQ IDNO：6)，CAEETKNGGVPFKCKNNNC(SEQ ID NO：7)；

肽#11

#11，(AA 1114-1138)(TGT GAT CAA ACA ACT GGA GAAACT ATT TAC ACA AAG AAA ACA TGT ACT GTT TCA GAA GAA TTCCCA ACA ATC ACA(SEQ ID NO：8)，CDQTTGETIYTKKTCTVSEEFPTIT(SEQ ID NO：9))；

肽#12

#12，(AA 1128-1150)(TGT ACT GTT TCA GAA GAA TTCCCA ACA ATC ACA CCA AAT CAA GGA AGA TGT TTC TAT TGT CAATGT TCA(SEQ ID NO：10)，CTVSEEFPTITPNQGRCFYCQCS(SEQ IDNO：11)).

来自对照血清或大便的IgA抗体不与任何肽反应，而来自相同试验对象的混合血清抗LC3 IgG抗体也识别上文的4种反应肽(数据未显示)。因此无论治疗状态如何，被人血清和肠道IgA抗体所识别的LC3表位为表位3的891-903和918-936位氨基酸，以及表位7的全部(1114-1150位氨基酸)。LC3(和表位7)序列结束于1134位氨基酸，但12号肽则延续到1150位氨基酸。

                         讨论

人感染溶组织内阿米巴和不等内阿米巴后，会导致针对170kDa半乳糖-可抑制凝集素亚单位的肠道IgA抗体反应(Haque，2001；Haque，2002；Ravdin，2003)。在患入侵性溶组织内阿米巴感染(大肠炎或ALA)的病人和无症状溶组织内阿米巴感染对象的唾液和大便中都已经发现了抗凝集素IgA抗体(Abou-El-Magd，1996；Haque，2002)。从ALA痊愈直至36个月，仍可在对象的大便中识别出分泌的抗凝集素IgA抗体(Ravdin，2003)。在对孟加拉国儿童的研究中，已经发现了肠道抗阿米巴IgA抗体和抵御寄生感染之间的关系。据报道此免疫作用与个体大便中存在抗CRD(LC3 895-998位氨基酸)IgA抗体有关(Haque，2001)。有报道称具其它抗凝集素IgA抗体的那些没有免疫作用(Haque，2002)。但是发现这些IgA抗体会在儿童体内短期存在(1个月)(Haque，2001；Haque，2002)。在对南非德班人群的研究中发现，病人在从ALA痊愈后的至少3年间都会保持抵御溶组织内阿米巴感染的免疫力，并发现ALA病人会持续分泌高滴度肠道抗凝集素IgA抗体，时间长达36个月(Ravdin，2003)。但是即使大便中存在高滴度抗阿米巴IgA抗体，在没有抗肠腔内阿米巴病药时，仍有相当比例的ALA对象会被溶组织内阿米巴感染。这说明清除已存在感染的免疫作用与抵御新感染的免疫作用之间存在着差异。这种差异使得必须进行基因型分析以区别新感染和进行中的感染，以及区别已存在感染和瞬时感染(Soong，1995；Zaki，2003)。已经成功的将基因型分析应用在对分离自南非高发病率地区家庭的溶组织内阿米巴的区分中。大多数情况下，单个家庭中的成员都被同一基因型的溶组织内阿米巴或不等内阿米巴所感染，并且基因型在一段时期内保持恒定(Zaki，2003)。

通过使用重组LC3蛋白的7个重叠片段，发明者们确认来自无症状感染对象、血清反应阳性的ALA对象(当前被溶组织内阿米巴感染或未被感染)以及从ALA痊愈后一年仍未被感染对象的血清IgA抗体，都专一识别LC3的表位3(AA 868-944)和表位7(AA1114-1134)。新近从ALA痊愈对象的血清抗LC3 IgG抗体也识别表位6(1070-1114位氨基酸)，但从ALA痊愈后一年未被感染对象的IgG则不发生这种识别。被持续感染或未被感染的ALA对象的抗体对表位的识别没有差异。这提示针对新的无症状阿米巴感染的免疫作用(如同Haque等人(Haque，2002)和Ravdin等人(Ravdin，2003)的发现)，与清除已存在感染的免疫作用没有联系。与Haque等人(Haque，2002)的发现不同，本发明的发明者们没有发现表现出特殊凝集素表位识别模式的治疗或免疫学对象亚组。尽管发明者们不能排除由于实验敏感度不足而未鉴别出其它IgA凝集素表位的可能，但显然表位3和表位7具有突出的免疫原性。事实上以往的研究说明，大便中的抗凝集素IgA的滴度可能是预测成人粘膜免疫功能的最有力的工具(Ravdin，2003)。不等内阿米巴感染并不引起肠道抗凝集素IgA反应，但它的滴度很低并且在短时间内存在(Ravdin，2003)。因此虽然不等内阿米巴与溶组织内阿米巴的多个表位相同(Petri，1990)，但不等内阿米巴感染并不能引起抵御溶组织内阿米巴的种间保护作用(Ravdin，2003)，这一发现并不令人惊奇。

本发明的发明者们利用鼠抗LC3 IgA单抗作为表位特异性探针，以在体外将粘着抑制作用和人IgA表位特异性联系起来。有趣的是，BALB/c免疫小鼠产生的抗体主要识别那些不被人抗体所识别的表位(表位1、4和5，主要是表位1)。14个鼠抗LC3 IgA抗体中只有1个识别人IgA抗体识别的表位(表位3)。显然，由于MHC-限制性的对凝集素蛋白免疫识别的明显差异，必须谨慎的对通过使用凝集素来源蛋白在鼠模型上进行的疫苗研究加以解释。在没有对更多相关免疫模型(如灵长类动物)进行疫苗研究之前，直接从鼠模型研究跳到人模型研究是不明智的。

无论抗体识别哪个LC3表位，鼠IgA单抗都对天然阿米巴表面凝集素具有粘着抑制活性。有趣的是，没有发现任何所研究的IgA单抗具有粘着-增强活性(Petri，1990)。与对鼠IgG或IgM抗凝集素单抗的研究类似(Petri，1987)，这些IgA抗体的粘着抑制活性与对糖结合域(895-998位氨基酸)的直接识别无关(Dodson，1997；Mann，1993；Pillai，1999)，该结合域包含于表位4区域内并部分延伸到表位3和表位5区域。因此抗凝集素IgA抗体的肠内免疫力介导能力，可能与免疫复合体形成及对寄生虫结合到结肠粘膜或宿主细胞的抵御中的多个重要因素有关。

LC3蛋白不包含凝集素的假重复区域(436-624位氨基酸)，Lotter等人制得了针对该区域的粘着抑制抗体(Lotter，1997)。但是由于LC3蛋白包括寄生虫的糖结合域(Dodson，1997；Pillai，1999)，足以在沙鼠体内引起对ALA的免疫作用(Soong，1995)(这个糖结合域是一个较小的375个氨基酸的LC3片段(Dodson，1999))，所以发明者们选择这个富半胱氨酸重组蛋白进行进一步研究。针对假重复区域的IgA抗体可能也对宿主的粘膜免疫具有重要作用。但是，发现与发明者们研究的抗LC3IgA抗体相比，对假重复区域的免疫作用在一段时间内会更快的衰减(Dodson，1999)。

肽合成已被认为是一种制备包含有限数目氨基酸的短蛋白片段的有效工具。使用肽合成方法生产了每个表位的重叠亚片段(Atherton，1978；Fields，1989)，以更好的定义人IgA的表位特异性。无论是线状还是环化形式，血清IgA和IgG抗体都识别13个合成肽中的4个。因此，从南非德班人群获得的人抗LC3IgA抗体的完整表位特异性可定义为：891-903、918-936和1114-1150位氨基酸。可以多种形式制备这些肽(Fields，1989)，或者将它们连接到多赖氨酸骨架上(Tarn，1988)，进一步提高其免疫原性以用作亚单位疫苗。

概括来说，根据以往的流行病学研究(Haque，2001；Ravdin，2003)和当前的发现，发明者们定义了溶组织内阿米巴半乳糖-可抑制凝集素的表位，它在人类中是保护性的。通过IgA抗体对合成肽的识别鉴别了凝集素表位，这提供了用于预防人阿米巴肠道感染的亚单位疫苗。

                      实施例3

开发用于狒狒研究的基于凝集素的鼻腔用合成阿米巴亚单位疫苗

溶组织内阿米巴是世界范围内排名第三的致死性寄生虫。本领域内的新近研究说明，在从ALA痊愈后，针对阿米巴半乳糖-可抑制凝集素的肠道IgA抗体提供了抵御新溶组织内阿米巴和不等内阿米巴感染的免疫力。重组LC3蛋白是凝集素重亚单位的一个富半胱氨酸蛋白(758-1134位氨基酸)，它包含糖结合域并具有高度抗原性，并且是沙鼠模型上有效的阿米巴肝脓肿亚单位疫苗。通过使用限制性酶消化产生了重叠的LC3基因产物，以及对从ALA痊愈病人(当前感染或未感染)及无症状感染对象获得的血清和大便IgA抗体的ELISA实验，发明者们发现所有IgA抗体专一识别7个LC3表位中的两个：所有研究对象的表位3(AA 868-944)和表位7(AA 1114-1134)。通过使用合成重叠肽，发明者们对假定的保护性表位进行了精细作图，得到4个不连续肽序列：

AA891-903：TGT ACA TAC GAA ATA ACA ACA AGA GAA TGTAAA ACA TGT(SEQ ID NO：4)，CTYEITTRECKTC(SEQ ID NO：5)

AA918-936：TGT GCA GAA GAG ACT AAG AAT GGA GGA GTTCCA TTC AAA TGT AAG AAT AAC AAT TGC(SEQ ID NO：6)，CAEETKNGGVPFKCKNNNC(SEQ ID NO：7)

AA 1114-1138：(TGT GAT CAA ACA ACT GGA GAA ACT ATT TACACA AAG AAA ACA TGT ACT GTT TCA GAA GAA TTC CCA ACA ATCACA(SEQ ID NO：8)，CDQTTGETIYTKKTCTVSEEFPTIT(SEQ ID NO：9)

AA 1128-1150：TGT ACT GTT TCA GAA GAA TTC CCA ACA ATCACA CCA AAT CAA GGA AGA TGT TTC TAT TGT CAA TGT TCA(SEQ IDNO：10)，CTVSEEFPTITPNQGRCFYCQCS(SEQ ID NO：11)

模拟上述表位而产生的合成肽，被随机连接到多赖氨酸骨架上(每个分子6个肽)，并经(400μg×4)狒狒鼻腔，每隔7天给药，使用霍乱全毒素作为佐剂(20μg)，重组LC3蛋白作为阳性对照。发明者们发现操作开始后的第28天，基于凝集素的鼻腔用合成肽疫苗引起了抗肽、抗LC3和抗凝集素(纯化天然蛋白)的肠道IgA和血清IgG抗体的出现。

与此对比，重组LC3蛋白疫苗引起了血清抗LC3和抗凝集素IgA和IgG抗体反应，但不引起任何肠道抗凝集素IgA抗体反应。另外，LC3疫苗引起的血清IgA和IgG抗体，不识别任何通过IgA抗体和人血清及大便进行的ELISA所定义的4个假定的保护性LC3表位。概括的说，发明者们开发了鼻腔用合成肽阿米巴亚单位疫苗，它可在狒狒体内引起粘膜IgA抗体反应，这与从侵入性阿米巴病痊愈的人体的反应类似。

简短来说，选择9只血清反应和PCR均为阴性的狒狒并分成3组。通过鼻腔用肽和佐剂(霍乱全毒素，CT)对动物进行免疫攻击。在第1、7、14和21天免疫动物，共四次经鼻免疫。

第1组：3只狒狒，CT(100μl体积内20μg)+盐水(每个鼻孔100μl，共200μl)，作为阴性对照；

第2组：3只狒狒，CT(100μl体积内20μg)+400μg混合肽溶于100μl盐水的溶液，每个鼻孔使用100μl，共200μl；

第3组：3只狒狒，CT(100μl体积内20μg)+200μg LC3溶于100μl盐水的溶液，每个鼻孔使用100μl，共200μl，作为阳性对照。

所得结果列于图5-13。简短来说，鼻腔导入的重组LC3疫苗和合成肽疫苗都引起了针对重组LC3蛋白的血清IgG抗体的出现，这通过ELISA确认(图5)。重要的是，重组LC3疫苗和合成肽疫苗所引发的血清IgG抗体，都识别来自溶组织内阿米巴滋养体的天然Gal/GalNAC凝集素，该凝集素存在于寄生虫的表面上(图6)。

只有合成肽疫苗引发识别4个假定的保护性LC3表位的血清IgG抗体，这通过使用纯化肽(891-903、918-936、1114-1138和1128-1150位氨基酸)进行的ELISA确认。重组LC3疫苗引发针对其自身和天然凝集素的IgG抗体，分别见图5和图6，但是该抗体不针对通过人IgA抗体作图所定义的四个假定的保护性LC3表位(图7)。只有重组LC3蛋白疫苗引起血清抗LC3 IgA抗体反应；合成肽疫苗则没有发现此反应(图8)。如图8所示，是重组LC3疫苗而不是合成肽疫苗引起血清抗凝集素IgA抗体反应(图9)。与LC3重组疫苗引发的血清IgG抗体的结果(图7)一致，重组LC3蛋白疫苗(图8和9)不引发识别4个肽表位的血清IgA；合成肽疫苗引发弱血清抗肽IgA反应(图10)。显然只有合成肽疫苗引发引发大便(肠道)抗LC3IgA抗体反应；重组LC3蛋白疫苗引发血清抗LC3 IgA抗体(图8)，但是不引发大便或肠粘膜抗LC3 IgA抗体反应(图11)。重要的是，合成肽疫苗引发识别存在于寄生虫表面的阿米巴天然Gal/Gal/NAC凝集素分子的IgA抗体；而且在LC3重组蛋白疫苗研究中没有发现粘膜IgA抗体反应(图12)。如同所预测的那样，只有合成肽疫苗引发针对4个假定的保护性LC3肽表位的粘膜IgA抗体；而没有发现LC3蛋白疫苗引发该反应(图13)。

                      总结

粘膜抗凝集素IgA抗体提供了有效抵御溶组织内阿米巴和不等内阿米巴感染的免疫力。在阿米巴病流行区域，溶组织内阿米巴和不等内阿米巴的感染频率高于以往报道，引起肠道抗凝集素IgA抗体反应的缺失(amnestic)。无论临床表型如何，来自南非德班的研究对象的血清和肠道IgA抗体都识别4个不连续的LC3表位。根据LC3表位氨基酸序列生产的实验性合成肽疫苗，以霍乱全毒素作为佐剂通过鼻腔导入狒狒体内后，引发了肠道抗肽、抗LC3和抗凝集素IgA抗体反应。需要指出的是，只是肽疫苗而不是重组LC3疫苗，引发了针对4个假定的保护性表位的血清和肠道IgA抗体。

所有引用的出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文。虽然在上文详述中通过某些实施方案来描述本发明，并且给出了大量细节以对本发明进行说明，但本领域技术人员应明了本发明容许其它实施方案，同时在不脱离本发明原则的情况下，本文所述的某些细节可以进行变动。

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Claims (41)

1.一种包含溶组织内阿米巴LC3亚单位肽的疫苗，其中存在有效量的LC3亚单位肽以诱导灵长类动物体内产生粘膜抗凝集素IgA抗体从而抵御溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。

2.权利要求1的疫苗，其中LC3亚单位肽是表位3或表位7。

3.权利要求2的疫苗，其中LC3亚单位肽是表位3。

4.权利要求3的疫苗，其中LC3亚单位肽是由LC3的891-903位氨基酸构成。

5.权利要求3的疫苗，其中LC3亚单位肽是由LC3的918-936位氨基酸构成。

6.权利要求1的疫苗，其中LC3亚单位肽是表位7。

7.权利要求3的疫苗，其中LC3亚单位肽是由LC3的1114-1138位氨基酸构成。

8.权利要求3的疫苗，其中LC3亚单位肽是由LC3的1128-1150位氨基酸构成。

9.权利要求1的疫苗，其中将LC3亚单位肽与生理学上可接受的无毒载体联用。

10.权利要求1的疫苗，其中使用编码LC3亚单位肽的分离的DNA序列来表达LC3亚单位肽。

11.权利要求4的疫苗，其中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约891位残基到约903位残基，从约918位残基到约936位残基，从约1114位残基到约1138位残基，或者从约1128位残基到约1150位残基的连续氨基酸残基。

12.权利要求11的疫苗，其中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约891位残基到约903位残基的连续氨基酸残基。

12.权利要求11的疫苗，其中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约918位残基到约936位残基的连续氨基酸残基。

13.权利要求11的疫苗，其中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约1114位残基到约1138位残基的连续氨基酸残基。

14.权利要求11的疫苗，其中DNA编码的LC3亚单位肽包含从约1128位残基到约1150位残基的连续氨基酸残基。

15.权利要求11的疫苗，其中的LC3亚单位肽是野生型LC3亚单位肽的变异体，变异之处在于其一个或多个氨基酸残基上发生了修饰。

16.权利要求11的疫苗，其中的LC3亚单位肽是野生型LC3亚单位肽的变异体，变异之处在于其一个或多个氨基酸残基上发生了替换。

17.权利要求16的疫苗，其中的替换是保守性替换。

18.权利要求1的疫苗，它进一步包含有效量的免疫学佐剂或其它免疫刺激剂。

19.权利要求1的疫苗，其中至少有一个LC3亚单位肽缀合或连接到载体分子上。

20.权利要求19的疫苗，其中两个或多个不同LC3亚单位肽缀合或连接到同一载体分子上。

21.权利要求20的疫苗，其中的载体分子是多肽。

22.权利要求20的疫苗，其中的载体分子是多糖。

23.权利要求1的疫苗，其中的灵长类动物是人。

24.一种保护易感灵长类动物免受溶组织内阿米巴或不等内阿米巴繁殖或感染的方法，该方法包括向灵长类动物导入包含溶组织内阿米巴LC3亚单位肽的有效剂量的疫苗，疫苗中存在有效量的LC3亚单位肽以诱导灵长类动物体内产生粘膜抗凝集素IgA抗体，同时将LC3亚单位肽与生理学上可接受的无毒载体联用。

25.权利要求24的方法，其中疫苗通过皮下或肌内注射给药。

26.权利要求24的方法，其中疫苗通过口服给药。

27.权利要求24的方法，其中疫苗通过鼻腔给药。

28.权利要求27的方法，其中的灵长类动物是人。

29.一种分离纯化的溶组织内阿米巴LC3亚单位肽，其中LC3亚单位肽诱导灵长类动物体内产生粘膜抗凝集素IgA从而抵御溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。

30.权利要求29的LC3亚单位肽，其中LC3亚单位肽是溶组织内阿米巴表位3或表位7。

31.权利要求29的LC3亚单位肽，其中LC3亚单位肽是表位3。

32.权利要求31的亚单位肽，其中LC3亚单位肽是由LC3的891-903位氨基酸构成。

33.权利要求31的亚单位肽，其中LC3亚单位肽是由LC3的918-936位氨基酸构成。

34.权利要求29的亚单位肽，其中LC3亚单位肽是表位7。

35.权利要求34的亚单位肽，其中LC3亚单位肽是由LC3的1114-1138位氨基酸构成。

36.权利要求34的亚单位肽，其中LC3亚单位肽是由LC3的1128-1150位氨基酸构成。

37.一种包含编码溶组织内阿米巴LC3亚单位肽的核酸序列的分离纯化多核苷酸，其中LC3亚单位肽诱导灵长类动物体内产生粘膜抗凝集素IgA抗体从而抵御溶组织内阿米巴或不等内阿米巴。

38.权利要求37的多核苷酸序列，其中多核苷酸是DNA。

39.权利要求37的多核苷酸序列，其中多核苷酸是RNA。

40.一种特异性识别LC3亚单位肽的纯化抗体，该亚单位肽包含从约891位残基到约903位残基，从约918位残基到约936位残基，从约1114位残基到约1138位残基，或者从约1128位残基到约1150位残基的连续氨基酸残基。

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