CN116023508A - 重组犬PD-1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及犬类肿瘤治疗领域，公开了重组犬PD‑1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用，其中，所述融合蛋白包含犬PD‑1蛋白胞外区突变体和犬SIRPα蛋白。本发明所述的融合蛋白无血液毒性，安全性好，且能够同时与肿瘤细胞上的PD‑L1和CD47结合，抑制肿瘤细胞与T细胞和巨噬细胞的结合，从而促进T细胞激活和巨噬细胞的吞噬活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
Description
技术领域
本发明涉及犬类肿瘤治疗领域，具体涉及一种融合蛋白、编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用。
背景技术
肿瘤是人类和动物的一种常见病、多发病，其中犬恶性肿瘤已经成为导致犬死亡的主要原因。国外研究报告数据显示：每4只犬中就有一只被诊断为肿瘤；10岁以上犬患肿瘤的比例更是高达50％以上。目前犬肿瘤的临床治疗手段主要包括手术、化学治疗和放射性治疗。常见的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等，这些均存在肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。目前国外已有一些小分子药物和蛋白药物被批准用于治疗犬肿瘤，但是在国内这方面尚处于市场空白。
程序性细胞死亡受体1(PD-1)，是一个大小约55kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于CD28超家族受体，主要在T细胞、B淋巴细胞和活化的巨噬细胞表面表达。PD-1蛋白有两个配体：PD-L1和PD-L2。在正常生理条件下，PD-1与PD-L1/PD-L2的结合会抑制T细胞的活化，进而保护机体免受自身免疫系统的攻击；但是，多种实体瘤以及一些血液瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、各种消化系统肿瘤、淋巴瘤、白血病等癌细胞也大量表达PD-L1。肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞的活化，从而成功逃避机体免疫系统的识别和攻击，实现肿瘤细胞的免疫逃逸。同时研究发现，肿瘤细胞上PD-L1的表达与多个肿瘤类型的不良预后相关。因此阻断PD-1和PD-L1相互作用成为治疗肿瘤的一条有效途径。
CD47-SIRPα(signal-regulatory proteinα)信号通路又被称为“别吃我”信号。SIRPα属于SIRP受体家族蛋白，主要表达于髓系细胞表面(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞以及髓系DC细胞等)，也在神经系统的神经元细胞中表达。CD47是SIRPα最主要的配体，是一种在正常细胞表面广泛表达的跨膜蛋白，分子量大约为50kDa，属于免疫球蛋白超家族。在正常生理条件下，细胞膜上的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα结合，进而抑制巨噬细胞的吞噬作用。这种功能可以用于标记“自我”和“非我”，避免引起“误伤”；但是CD47也在各类肿瘤细胞表面高表达，发出“别吃我”信号，从而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，实现免疫逃逸。因此该靶点也可以作为肿瘤治疗的有效靶点。
目前有一些关于人PD-(L)1和CD47双靶点的专利，但是尚未有犬的PD-(L)1和CD47双靶点的研究报道。
发明内容
本发明的目的是为了提供针对犬的PD-(L)1和CD47双靶点的融合蛋白，该融合蛋白适用于犬的过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的治疗，且无血液毒性，安全性好。本发明还提供了编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含犬PD-1蛋白胞外区突变体和犬SIRPα蛋白。优选地，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为犬PD-1蛋白胞外区T132L。
优选地，所述融合蛋白包括Fc片段。
本发明第二方面提供编码如上所述的融合蛋白的核酸。
本发明第三方面提供一种含有如上所述融合蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、载体或宿主细胞。
本发明第四方面提供一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，该方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养如上所述的宿主细胞，然后从培养基中回收表达的融合蛋白。
本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗剂。
本发明第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料。
本发明第七方面提供如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用。
本发明所述的融合蛋白无血液毒性，安全性好，且能够同时与肿瘤细胞上的PD-L1和CD47结合，抑制肿瘤细胞与T细胞和巨噬细胞的结合，从而促进T细胞激活和巨噬细胞的吞噬活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
附图说明
图1示出了本发明所述的融合蛋白的结构示意图；
图2示出了本发明所述的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，A：6％变性电泳图；B：8％非变性电泳图；其中，1为犬PD-1mu-SIRPα-Fc；2为犬SIRPα-PD-1mu-Fc；3为犬PD-1mu-Fc-SIRPα；4为犬SIRPα-Fc-PD-1mu；5为犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc；6为犬SIRPαmu-PD-1mu-Fc；7为犬PD-1mu-Fc-SIRPαmu；8为犬SIRPαmu-Fc-PD-1mu；
图3示出了融合蛋白的红细胞凝集试验结果；
图4示出了犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的SDS-PAGE电泳图，其中，A：8％变性电泳图；B：8％非变性电泳图；1为犬PD-1mu-SIRPα-Fc纯化后蛋白；2为犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc纯化后蛋白；
图5示出了犬PD-1mu-SIRPα-Fc与犬PD-L1和人CD47的结合活性检测结果；
图6示出了犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的生物学活性检测结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含犬PD-1蛋白胞外区突变体(记为犬PD-1mu)和犬SIRPα蛋白。
优选地，所述融合蛋白包括Fc片段。
本发明所述的融合蛋白包括两个对称的部分组成，通过二硫键(位于Fc片段上)连接。其中，每个部分包含犬PD-1蛋白胞外区突变体、犬SIRPα蛋白和Fc片段，犬PD-1蛋白胞外区突变体、犬SIRPα蛋白和Fc片段的连接顺序没有特别的限制，从氨基端至羧基端，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次可以为
1)犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段(对应A)；或
2)犬SIRPα蛋白、犬PD-1mu和Fc片段(对应B)；或
3)犬PD-1mu、Fc片段和犬SIRPα蛋白(对应C)；或
4)犬SIRPα蛋白、Fc片段和犬PD-1mu(对应D)。
具体可以为如图1所示的连接方式。
优选地，从氨基端至羧基端，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次为犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段，在这种优选的情况下，能够进一步改善融合蛋白的性能。
优选地，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段之间分别直接连接或间接地通过连接子连接。
优选地，所述连接子是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala和Thr中的至少一种；更优选地，所述连接子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为2-5之间的整数(比如可以为2、3、4或5)。
优选地，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为犬PD-1蛋白胞外区T132L，也即所述犬PD-1蛋白胞外区突变体来源于犬的PD-1蛋白胞外区蛋白，在其基础上经T132L突变得到，关于所述突变体的进一步说明参见CN110590959A，在此不再赘述。
优选地，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体具有
(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
在本发明中，所述犬SIRPα蛋白可以是具有犬SIRPα蛋白性能的蛋白，可以为犬SIRPα蛋白胞外区全长、截短体或其突变体。所述突变体可以是犬SIRPα蛋白胞外区全长的突变体，也可以是截短体的突变体。
优选地，所述截短体为犬SIRPαD1区截短体。
优选地，所述犬SIRPα蛋白具有
(a)如SEQ ID NO：2-4中任意一个所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：2-4中任意一个具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述Fc片段为IgG型，更优选为IgG1亚型。
优选地，所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区。
所述Fc片段的来源没有特别的限制，可以来源于哺乳动物，比如可以为人、猫、鼠和犬等，优选为犬。
优选地，所述Fc片段具有
(a)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：5具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO：6-17中任意一个所示的氨基酸序列；更优选为SEQ ID NO：6或10所示的氨基酸序列。
本发明第二方面提供编码如上所述的融合蛋白的核酸。
本领域技术人员可以根据融合蛋白的序列结合本领域的手段获得所述核酸。所述核酸包含编码所述融合蛋白的每个部分相应的核苷酸序列。
优选地，编码犬PD-1mu的核苷酸序列如SEQ ID：18所示。
优选地，编码犬SIRPα蛋白的核苷酸序列如SEQ ID：19-21中的任意一个所示。
优选地，编码Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID：22所示。
优选地，编码如上所述的融合蛋白的核酸包含SEQ ID：23-34中任意一个所示的核苷酸序列，或其同等功能的变体。在所述优选的情况下，更利于融合蛋白的表达。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-SIRPα-Fc融合蛋白包含如SEQ IDNO：6所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：23所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPα-PD-1mu-Fc融合蛋白包含如SEQ IDNO：7所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：24所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-Fc-SIRPα融合蛋白包含如SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：25所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPα-Fc-PD-1mu融合蛋白包含如SEQ IDNO：9所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：26所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc融合蛋白包含如SEQID NO：10所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：27所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPαmu-PD-1mu-Fc融合蛋白包含如SEQID NO：11所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：28所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-Fc-SIRPαmu融合蛋白包含如SEQID NO：12所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：29所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPαmu-Fc-PD-1mu融合蛋白包含如SEQID NO：13所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：30所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-SIRPαD1-Fc融合蛋白包含如SEQID NO：14所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：31所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPαD1-PD-1mu-Fc融合蛋白包含如SEQID NO：15所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：32所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬PD-1mu-Fc-SIRPαD1融合蛋白包含如SEQID NO：16所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：33所示的核苷酸序列。
在本发明的一种优选的实施方式中，犬SIRPαD1-Fc-PD-1mu融合蛋白包含如SEQID NO：17所示的氨基酸序列，编码所述融合蛋白的核酸包含SEQ ID：34所示的核苷酸序列。
本发明所述的核酸分子不限于本发明公开的序列，还包括变体及与其对应的其他核酸形式，如mRNA、cDNA以及其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术，核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。
本发明第三方面提供一种含有如上所述融合蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、载体或宿主细胞。
所述载体可以为质粒、噬菌体或病毒载体等，编码本发明的融合蛋白的核酸分子被插入所述载体中。应理解，载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
宿主细胞可以用所述载体进行转化或转染。宿主细胞可以为细菌(如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如293细胞、COS细胞或CHO细胞)等。
本领域技术人员可以通过本领域常规的方法制备所述生物材料。
本发明第四方面提供一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，该方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养如上所述的宿主细胞，然后从培养基中回收表达的融合蛋白。
优选地，所述宿主细胞为CHO细胞；更优选为CHOK1细胞。
本领域技术人员可以按照本领域常规的方法培养宿主细胞，适合于所述融合蛋白表达的条件优选包括：温度为28-37℃，转速为100-200rpm。
融合蛋白可通过公知方法从宿主细胞的培养物进行回收和纯化，所述公知方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝集素色谱法或高效液相色谱法。
本发明第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗剂，所述其他治疗剂可以包括但不限于帕拉定、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等。
应当理解的是，当所述药物组合物还与一种或多种其他治疗剂组合时，其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
本发明第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料。
优选地，所述试剂盒还包含给药装置。
本发明第七方面提供如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用，优选为在制备治疗犬恶性肿瘤的药物中的应用。
所述由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病可以为黑色素瘤、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肉瘤、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌和膀胱癌等。
优选地，所述融合蛋白的给药剂量为5-20mg/kg体重/次。所述融合蛋白可以通过比如静脉滴注的方式施用，给药周期没有特别的限制，比如可以为每周、每两周或者每月给药一次。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
如果没有特殊说明，以下实施例中，使用的方法均为本领域常规的方法，使用的试剂和材料均可通过商购获得。
实施例1
本实施例用于说明融合蛋白的表达及纯化。
在UniProt库和GenBank库中搜索犬PD-1蛋白(UniProtKB：A0A024FCJ9)、犬SIRPα蛋白(UniProtKB：F1PK00)和犬IgG1-Fc片段(GenBank：AF354264)的氨基酸序列。将犬PD-1第132位的Thr突变为Leu，形成犬PD-1mu(如SEQ ID NO：1所示)，并分别对犬SIRPα(如SEQID NO：2所示)截短D1区得到犬SIRPαD1(如SEQ ID NO：3所示)，对犬SIRPα(如SEQ ID NO：2所示)突变处理(第80位Asn突变为Ala)得到犬SIRPαmu(如SEQ ID NO：4所示)。
在犬PD-1蛋白胞外区突变体(犬PD-1mu)、犬SIRPα蛋白和Fc片段的基础上按照图1所示的顺序设计融合蛋白，人工合成设计的8个分子(具体的氨基酸序列和相应的核苷酸序列如表1所示)，人工合成核苷酸序列，并构建于pcDNA3.1载体中，瞬转至293细胞中，转染4-5天后收集细胞上清液，通过纯化得到蛋白，所述的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图如图2所示。
表1
| 编号 | 融合蛋白分子 | 氨基酸序列 | 核苷酸序列 |
| 1 | 犬PD-1mu-SIRPα-Fc | SEQ ID NO：6 | SEQ ID NO：23 |
| 2 | 犬SIRPα-PD-1mu-Fc | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：24 |
| 3 | 犬PD-1mu-Fc-SIRPα | SEQ ID NO：8 | SEQ ID NO：25 |
| 4 | 犬SIRPα-Fc-PD-1mu | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：26 |
| 5 | 犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc | SEQ ID NO：10 | SEQ ID NO：27 |
| 6 | 犬SIRPαmu-PD-1mu-Fc | SEQ ID NO：11 | SEQ ID NO：28 |
| 7 | 犬PD-1mu-Fc-SIRPαmu | SEQ ID NO：12 | SEQ ID NO：29 |
| 8 | 犬SIRPαmu-Fc-PD-1mu | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：30 |
注：PD-1mu：PD-1蛋白T132L突变体；SIRPαmu：SIRPα蛋白N80A突变体。
实施例2
本实施例用于说明融合蛋白与犬PD-L1和CD47的亲和力测定。
使用BIAcore 3000仪器进行亲和力分析。试验设置11个样品组：实施例1中的融合蛋白1-8、犬PD-1mu-Fc(记为D1)、犬SIRPα-Fc(记为D2)和犬PD-1-SIRPα-Fc(记为D3)。
(1)融合蛋白与犬PD-L1的亲和力测定
首先将融合蛋白1-8、D1和D3分别偶联到通道2，再对通道1进行封闭处理，作为对照通道。将分析物(犬PD-L1-His)梯度稀释(1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)后流入，测定对芯片表面偶联样品的结合曲线，使用软件Wizard程序记录信号Fc2-1。以1:1结合模型分析，测定亲和力常数KD，测定结果如下表2所示。
表2
(2)融合蛋白与犬CD47的亲和力测定
首先将融合蛋白1-8、D2和D3偶联到通道2，再对通道1进行封闭处理，作为对照通道。将分析物(犬CD47-His)梯度稀释(1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM)后流入，测定对芯片表面偶联样品的结合曲线，使用软件Wizard程序记录信号Fc2-1。以1:1结合模型分析，测定亲和力常数KD，测定结果如下表3所示。
表3
表2的结果显示，编号为1和5的融合蛋白，也即犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc，与犬PD-L1的亲和力显著高于D1、D3及其他六种组合的融合蛋白，说明按照犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序连接更有利于提高融合蛋白与犬PD-L1的亲和力。编号1和5的结果比较可看出，使用犬PD-1mu替代犬PD-1能够进一步增加融合蛋白与犬PD-L1的亲和力，均好于D3(犬PD-1-SIRPα-Fc)。
表3的结果显示，编号为1和5的融合蛋白，也即犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc，与犬CD47的亲和力显著高于D2、D3及其他六种组合的融合蛋白，说明按照犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序连接更有利于提高融合蛋白与犬CD47的亲和力。从编号1和5的结果比较可看出，使用犬SIRPαmu替代犬SIRPα能够进一步增加融合蛋白与犬CD47的亲和力。
实施例3
本实施例用于说明犬PD-1mu/SIRPα双融合蛋白的血液毒性检测。
由于红细胞表面有CD47的表达，因此CD47靶点药物需要考虑是否会引起红细胞凝集等副作用，进行体外红细胞凝集试验，具体步骤如下。
取健康犬外周血，经过离心、洗涤之后，配制成1％的红细胞悬液，将其加入U型底96孔板中，同时将融合蛋白1(犬PD-1mu-SIRPα-Fc)和5-7(犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc、犬SIRPαmu-PD1mu-Fc、犬PD-1mu-Fc-SIRPαmu)、阳性对照(植物凝集素PHA)和阴性对照(犬IgG1-Fc)按照500g/mL开始稀释，共6个浓度梯度(1.5-500μg/mL)，分别加入上述96孔板中，混匀后，放入37℃、5％二氧化碳培养箱孵育4小时，取出观察并在凝胶成像分析仪下拍照(图3)。
结果显示：PHA作为阳性对照，前三个浓度梯度有明显的红细胞凝集现象；犬PD-1mu-SIRPα-Fc、犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc、犬SIRPαmu-PD1mu-Fc和犬PD-1mu-Fc-SIRPαmu四种蛋白在各种浓度条件下都不会引起红细胞凝集。
按照上述相同的方法进行实验，发现融合蛋白2-4(犬SIRPα-PD-1mu-Fc、犬PD-1mu-Fc-SIRPα、犬SIRPα-Fc-PD-1mu)和8(犬SIRPαmu-Fc-PD-1mu)四种蛋白在上述浓度下也均不会引起红细胞凝集。
实施例4
本实施例用于说明犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc融合蛋白的表达及纯化。
将构建成功的犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的稳定表达质粒电转入CHOK1细胞中，通过两轮有限稀释筛选得到单克隆细胞株。通过流加培养得到细胞培养表达液，经深层过滤膜包过滤，除去细胞及细胞碎片得到细胞培养上清液。
细胞培养上清液经阴离子交换层析：先用平衡液(10mM Tris-HCl，40mM NaCl，pH7.2)平衡至基线，然后用洗脱液(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH7.2)洗脱，收集洗脱液；再经过疏水层析：先用平衡液(10mM Tris-HCl，1M(NH4)2SO4,pH7.2)平衡至基线，然后用冲洗缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1M(NH4)2SO4,pH7.2)进行冲洗，用洗脱液(10mM Tris-HCl，pH7.2)洗脱，收集洗脱液；再经过复合模式阴离子交换层析：先用平衡液(10mM Tris-HCl,30mM NaCl,pH7.2)平衡至基线，然后用洗脱液(10mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH7.2)洗脱，收集洗脱液；最后用超滤的方法先浓缩，再换液至制剂处方中便可得到符合要求的目的蛋白(图4)。
如图4所示，犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc融合蛋白的纯度可达95％以上。
实施例5
本实施例用于说明犬PD-1mu-SIRPα-Fc融合蛋白与犬PD-L1和人CD47的结合活性检测。
构建犬PD-L1全长，并转染CHOK1细胞，通过筛选得到高表达量的单克隆细胞株(以下简称犬PD-L1/CHOK1细胞)，通过流式细胞技术比较犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-Fc阻断犬PD-1与犬PD-L1/CHO细胞结合的能力。
将500nM犬PD-1-His-Biotin分别与梯度稀释的犬PD-1mu-SIRPα-Fc、犬PD-1mu-Fc混合，将混合物添加到含有犬PD-L1/CHOK1细胞的96孔板中。细胞于4℃孵育1小时，用冷的PBS清洗两遍，之后用结合DyLight 650的链霉亲和素蛋白(Invitrogen，84547)于4℃孵育30分钟。细胞用冷的PBS清洗两遍，并重悬浮于200mL PBS中。之后，用流式细胞仪(BeckmanCoulter，CytoFLEX)进行FACS分析。
为了检测犬PD-1mu-SIRPα-Fc是否可以与肿瘤细胞结合。前期亲和力测定结果显示，犬SIRPα能够与人CD47结合(数据未展示)，因此利用流式细胞技术检测犬PD-1mu-SIRPα-Fc与Jurkat(人T淋巴细胞白血病细胞)和Raji(人Burkitt's淋巴瘤细胞)细胞的结合能力。将犬PD-1-SIRPα-Fc添加到含有Jurkat或Raji细胞的1.5mL EP管中。细胞于4℃孵育1小时，用冷的PBS清洗两遍，之后用结合FITC的针对犬IgG的二抗(Southernbiotech，6070-02)于4℃孵育30分钟。细胞用冷的PBS清洗两遍，并重悬浮于200mL PBS中。之后，细胞用流式细胞仪进行FACS分析。
图5显示了犬PD-1mu-SIRPα-Fc与犬PD-L1和人CD47的结合活性检测的结果(*:p<0.05；**:p<0.01)，犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-Fc阻断犬PD-1与犬PD-L1/CHO细胞结合的FACS分析结果见图5A和5B，犬PD-1mu-SIRPα-Fc是否可以与肿瘤细胞结合的FACS分析结果见图5C和5D。
结果显示：犬PD1mu-SIRPα-Fc对犬PD-L1/CHOK1细胞的竞争结合活性显著高于犬PD-1mu-Fc；犬PD1mu-SIRPα-Fc可以与Jurkat和Raji细胞结合。
按照上述相同的方法进行实验，发现犬PD1mu-SIRPαmu-Fc对犬PD-L1/CHOK1细胞的竞争结合活性与犬PD1mu-SIRPα-Fc相当；犬PD1mu-SIRPαmu-Fc也可以与Jurkat和Raji细胞结合。
实施例6
本实施例用于说明犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的生物学活性检测。
由于犬PD-1可与人PD-L1结合(亲和力数据未展示)，因此利用人PD-1/PD-L1荧光报告基因细胞系法检测犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc双融合蛋白阻断PD-1/PD-L1信号通路的生物学活性。将人PD-1-NFAT/Jurkat细胞和人PD-L1/CHO APC细胞按5:1的比例加入黑色透明底96孔板中，犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc融合蛋白按一定的浓度梯度稀释后加入上述96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱孵育6h，加入50μL one-glo酶反应底物(Promega，E6120)，室温避光孵育15min后，上机检测荧光信号。利用Prism软件计算IC50。
为了测定犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc对巨噬细胞吞噬活性的影响，我们从人的全血中提取出外周血单个核细胞(PBMC)，通过磁珠分选得到CD14+单核细胞，加入M-CSF和IFN-γ，将其诱导成巨噬细胞，之后与荧光染料CFSE标记的Raji细胞共培养，同时加入犬PD-1mu-SIRPα-Fc、犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc、阴性对照(犬IgG1-Fc)和犬SIRPα-Fc，利用流式细胞技术检测巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。
其中，图6示出了犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的生物学活性检测结果，其中图6A显示了融合蛋白阻断PD-1/PD-L1信号通路的结果，图6B显示了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的结果。结果显示，犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc均可有效地阻断PD-1/PD-L1信号通路，IC50分别为1.86nM和1.54nM；犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc均能够促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，吞噬率均高于犬SIRPα-Fc，且犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的吞噬率高于犬PD-1mu-SIRPα-Fc。
实施例7
本实施例用于说明犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc对犬恶性肿瘤的治疗效果。
从北京某宠物医院筛选30只就诊的肿瘤犬(包括黑色素瘤犬15只、淋巴瘤犬15只)，进行犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc治疗恶性肿瘤患犬的疗效研究。试验犬品种包括：金毛猎犬、玩具贵宾犬、吉娃娃、雪纳瑞、腊肠犬、比熊犬、拉布拉多犬、杂交品种犬，平均年龄为13岁(11-16岁)，均为晚期恶性肿瘤患犬。
将所有患病犬分三组，分别为犬PD-1mu-Fc组、犬PD-1mu-SIRPα-Fc组和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc组，每组均包括黑色素瘤犬5只、淋巴瘤犬5只。每组均按照10mg/kg体重的剂量分别静脉滴注犬PD-1mu-Fc、犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc(注射用生理盐水稀释)，每两周给药一次，连续给药8次，末次给药一周后结束试验。试验中通过大体检查和计算机断层扫描评估肿瘤负荷，每两周测量一次肿瘤大小评估疗效，比较客观缓解率(ORR)，客观缓解率＝完全缓解和部分缓解的患病犬/总患病犬×100％；完全缓解(CR)：所有可检测肿瘤消失；部分缓解(PR)：靶病灶最大径之和至少减少30％。治疗效果如下表所示(表4)：
表4犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc的临床抗肿瘤疗效汇总
注：ORR：客观缓解率；CR：完全缓解率
初步临床治疗结果显示：犬PD-1mu-SIRPα-Fc和犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc较犬PD-1mu-Fc具有更好的抗肿瘤疗效，犬PD-1mu-SIRPαmu-Fc较犬PD-1mu-SIRPα-Fc具有更好的抗肿瘤疗效。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含犬PD-1蛋白胞外区突变体(PD-1mu)和犬SIRPα蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为犬PD-1蛋白胞外区T132L；
优选地，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体具有
(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述犬SIRPα蛋白为犬SIRPα蛋白胞外区全长、截短体或其突变体；
优选地，所述截短体为犬SIRPαD1区截短体；
优选地，所述犬SIRPα蛋白具有
(a)如SEQ ID NO：2-4中任意一个所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：2-4中任意一个具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包括Fc片段；
优选地，所述Fc片段为IgG型，更优选为IgG1亚型；
优选地，所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；
优选地，所述Fc片段具有
(a)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或
(b)与SEQ ID NO：5具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，从氨基端至羧基端，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次为
1)犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段；或
2)犬SIRPα蛋白、犬PD-1mu和Fc片段；或
3)犬PD-1mu、Fc片段和犬SIRPα蛋白；或
4)犬SIRPα蛋白、Fc片段和犬PD-1mu；
优选地，从氨基端至羧基端，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次为犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段；
优选地，犬PD-1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段之间分别直接连接或间接地通过连接子连接；
优选地，所述连接子是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala和Thr中的至少一种；更优选地，所述连接子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为2-5之间的整数。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含如SEQ IDNO：6-17中任意一个所示的氨基酸序列。
7.编码权利要求1-6中任意一项所述的融合蛋白的核酸；
优选地，所述核酸包含SEQ ID：23-34中任意一个所示的核苷酸序列，或其等功能的变体。
8.一种含有权利要求1-6中任意一项所述融合蛋白的编码基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、转座子、载体或宿主细胞。
9.一种用于生产权利要求1-6中任意一项所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养权利要求8中所述的宿主细胞，然后从培养基中回收表达的融合蛋白。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-6中任意一项所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗剂；
优选地，所述其他治疗剂选自帕拉定、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙中的至少一种。
11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6任意一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的生物材料；
优选地，所述试剂盒还包含给药装置。
12.权利要求1-6任意一项所述的融合蛋白、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用，优选为在制备治疗犬恶性肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病为黑色素瘤、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肉瘤、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌和膀胱癌；
优选地，所述融合蛋白的给药剂量为5-20mg/kg体重/次。
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