CN116333169A - 一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。解决了现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物工艺复杂，成本高等技术问题。本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1。该血管内皮生长因子抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和，且制备成本低，易于临床推广使用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用，尤其涉及该抑制蛋白在制备用于治疗由于大量新生血管生成所引发的视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。
背景技术
多种视网膜疾病与新生血管有关，该类疾病的共同病理改变是视网膜由于缺血、缺氧而产生新生血管，进而血管发生渗漏、增殖、牵拉，导致反复玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离及新生血管性青光眼，病程进展迅速，如不及时治疗，最终会导致失明。
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。VEGFR主要包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，其中VEGFR2是血管新生和有丝分裂过程主要的VEGF信号转导受体。VEGF/VEGFR2所介导的信号级联通路可以调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，引起血管通透性的改变，控制血管的新生。
现有技术中，治疗与新生血管有关的视网膜疾病，主要采用内皮生长因子单克隆抗体药物。其治疗原理为：由于VEGF和VEGF抗体能够特异的结合，因此能够与细胞表面VEGF受体竞争性结合VEGF。当VEGF与抗体形成复合物后就不会再激活细胞表面的VEGFR。这样VEGF介导的新血管生成的细胞信号通路就会被阻断，从而达到治疗的目的。但由于VEGF单克隆抗体整个制备工艺复杂，导致这类药物成本很高，最终导致药品价格昂贵，会极大的增加患者的负担。
有鉴于此，有必要研究一种基于降低VEGF的促进血管生成的活性的药物，解决现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物存在的技术问题。
发明内容
本发明为解决现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物工艺复杂，成本高等技术问题，提供一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1。
本发明还提供上述血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法为：
将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。
优选的是，使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中。
优选的是，所述诱导表达的温度为37℃。
优选的是，所述诱导表达采用的诱导剂为IPTG，更优选的是，诱导剂的浓度为0.2mM。
优选的是，所述离心收集菌体的离心转速为4000rpm。
优选的是，所述菌体破碎采用的设备为超声波破碎仪。
优选的是，所述离心获得上清蛋白的离心转速为13000rpm。
优选的是，亲和层析采用Ni-NTA亲和层析柱，使用Wash Buffer洗涤杂蛋白，然后使用Elution Buffer洗脱蛋白。
优选的是，过G25脱盐柱进行脱盐层析。
优选的是，分子筛柱纯化使用Superdex75分子筛柱子对蛋白进行纯化，流速为0.5ml/min。
本发明还提供上述血管内皮生长因子抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。
优选的是，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
本发明还提供含有上述血管内皮生长因子抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。
优选的是，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
本发明的原理为：本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白包括VEGFR1和VE GFR2的部分细胞外序列，因此根据受体和配体能够特异结合的原理，本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白能够和VEGF特异性的结合从而降低VEGF与细胞表面VEGFR1和VEGFR2结合的几率，从而降低VEGF所介导的眼底心血管生成。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和。
本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，使用原核表达系统制备，方法更简单，成本与VEGF单克隆抗体相比大大的降低，因此价格便宜，易于临床推广使用，具有重大的社会效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白的氨基酸序列来源示意图。
图2为本发明实施例1中在不同诱导温度(16-37℃)和不同IPTG浓度(0.1-0.3mM)下，在大肠杆菌中进行诱导表达制备血管内皮生长因子抑制蛋白的结果，图中，M表示蛋白质Marker。
图3为本发明实施例1中Ni-NTA亲和层析纯化血管内皮生长因子抑制蛋白电泳图，图中，M代表蛋白Marker，前代表诱导前，8h代表诱导后8h的全菌，上代表上清蛋白，沉代表沉淀蛋白，FL代表过Ni柱的流穿液，W1代表洗涤液，E1代表VEGFR洗脱液。
图4为本发明实施例1中使用Superdex75分子筛柱对蛋白进行精细纯化后的电泳图。
图5为本发明实施例1中的血管内皮生长因子抑制蛋白的抑制VEGF介导的HUVEC增殖效果图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
如图1所示，本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括三个VEGFR的细胞外功能结构域，即D1、D2和D3。其中，1个结构域(D1)来自于VEGFR1蛋白，2个(D2和D3)来自于VEGFR2蛋白。具体的，本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白包括以下氨基酸序列：PEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIP DGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRGGGGSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGTVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPIS，记作SEQ ID NO：1。
受体是一种蛋白质，多居于靶器官的质膜上或核内/胞液中，与之结合的相应的信息分子叫配体。不同的配体只能与其相应的受体结合，启动细胞内的信息传递体系，导致细胞功能的改变，VEGF即为配体，VEGFR1和VEGFR2即为受体，属于一种跨膜蛋白，包括胞内和胞外部分，胞外部分负责与游离的配体VEGF结合从而激活细胞内的信号传导通路，实现新血管的生成。本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白，使用基因重组表达技术，在大肠杆菌中表达了含有VEGF R1和VEGFR2部分胞外序列的新的蛋白质，这种VEGFR抑制蛋白能够和VEGF配体结合，但是不会激发细胞内信号传导，因此阻碍了VEGF介导的新生血管，从而降低了由于新生血管而导致的多种视网膜疾病的发生几率。
本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法为：
将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达(融合表达)，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。
上述技术方案中，优选使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中。
上述技术方案中，诱导表达的温度优选为25℃；诱导表达优选采用的是0.2mM的IPTG。
上述技术方案中，离心收集菌体的离心转速优选为4000rpm；菌体破碎采用的设备优选为超声波破碎仪；离心获得上清蛋白的离心转速优选为13000rpm。
上述技术方案中，亲和层析优选采用Ni-NTA亲和层析柱，使用Wash Buffer洗涤杂蛋白，然后使用Elution Buffer洗脱蛋白；优选过G25脱盐柱进行脱盐层析；优选分子筛柱纯化使用Superdex75分子筛柱子对上清蛋白进行纯化，流速为0.5ml/min。
大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速、产量高、IPTG诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。
本发明的血管内皮生长因子抑制蛋白能够在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。
上述技术方案中，血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
本发明还提供含有上述血管内皮生长因子抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。
上述技术方案中，血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
(1)使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中，然后将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中。
(2)诱导剂IPTG的使用量为0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.3mM，诱导温度为16℃、20℃、25℃、37℃，使用上面的诱导条件对血管内皮生长因子抑制蛋白进行诱导表达。
(3)诱导表达结束后，4000rpm离心收集菌体，然后使用超声波破碎仪对细菌进行破碎处理，然后13000rpm离心获得上清蛋白。
(4)上清蛋白过Ni-NTA亲和层析柱子，使用Wash Buffer洗涤杂蛋白，然后使用Elution Buffer洗脱蛋白，获得的蛋白在过G25脱盐柱进行脱盐处理。
(5)使用Superdex75分子筛柱子对蛋白进行精细纯化，流速为0.5ml/min，得到血管内皮生长因子抑制蛋白。
使用SDS-PAGE电泳对纯化过程中各组分和蛋白进行检测。其中，以IPTG浓度分别为0mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.3mM，温度25℃制备血管内皮生长因子抑制蛋白，纯化结果如图2所示，从图2可以看出，当IPTG浓度为0.2mM时，制备的血管内皮生长因子抑制蛋白效果最好。再以IPTG浓度为0.2mM，温度分别为16℃、20℃、25℃、37℃制备血管内皮生长因子抑制蛋白，结果如图2所示，从图2可以看出，当温度为25℃时，制备的血管内皮生长因子抑制蛋白效果最好。
使用SDS-PAGE电泳对纯化过程中各组分和蛋白进行检测。以IPTG浓度为0.2mM，温度为25℃制备的血管内皮生长因子抑制蛋白，粗提得到的蛋白如图3所示，使用Superdex75分子筛进行精细纯化，得到的蛋白如图4所示，可以看出，得到高纯度的血管内皮生长因子抑制蛋白。
获得的血管内皮生长因子抑制蛋白使用紫外分光光度计进行定量分析，使用0.22μm的滤头进行无菌处理以备后续活性检测。使用人血管内皮细胞(HU VEC)作为研究细胞，细胞以5×104/ml密度种植于24孔板中，次日更换维持培养基DMEM(包含0.05％血清)，培养基中加入1ng/ml的VEGF，然后再分别加入25pM、50pM、75pM、100pM、150pM、200pM的VEGFR抑制蛋白，次日使用CCK-8检测VEGFR抑制蛋白抑制VEGF介导的HUVEC增殖的效果，结果如图5所示。从图5可以看出，当VEGFR抑制蛋白浓度大于100pM时，抑制VEGF介导的HUVEC增殖的效果最为明显。
显然，上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有实施例予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.血管内皮生长因子抑制蛋白，其特征在于，包括以下氨基酸序列：SEQ I D NO：1。
2.权利要求1所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：
将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。
3.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中。
4.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：
所述诱导表达的温度为25℃；
所述诱导表达采用的诱导剂为IPTG，浓度为0.2mM。
5.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：
所述离心收集菌体的离心转速为4000rpm；
所述菌体破碎采用的设备为超声波破碎仪；
所述离心获得上清蛋白的离心转速为13000rpm。
6.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：
亲和层析采用Ni-NTA亲和层析柱，使用Wash Buffer洗涤杂蛋白，然后使用ElutionBuffer洗脱蛋白；
过G25脱盐柱进行脱盐层析；
分子筛柱纯化使用Superdex75分子筛柱子对蛋白进行纯化，流速为0.5ml/min。
7.权利要求1所述的血管内皮生长因子抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法制备的血管内皮生长因子抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的血管内皮生长因子抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法制备的血管内皮生长因子抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用，其特征在于，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
9.含有权利要求1所述的血管内皮生长因子抑制蛋白或者权利要求2-6任何一项血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法制备的血管内皮生长因子抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。
10.权利要求9所述的治疗视网膜新生血管性疾病的药物，其特征在于，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
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