JP2023543440A - 二重特異性組換えタンパク質及びその使用 - Google Patents

二重特異性組換えタンパク質及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023543440A
JP2023543440A JP2023518428A JP2023518428A JP2023543440A JP 2023543440 A JP2023543440 A JP 2023543440A JP 2023518428 A JP2023518428 A JP 2023518428A JP 2023518428 A JP2023518428 A JP 2023518428A JP 2023543440 A JP2023543440 A JP 2023543440A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding fragment
recombinant protein
functional
cells
functional binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023518428A
Other languages
English (en)
Inventor
宋利平
王素琴
Original Assignee
上海霖羲致企業管理有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 上海霖羲致企業管理有限公司 filed Critical 上海霖羲致企業管理有限公司
Publication of JP2023543440A publication Critical patent/JP2023543440A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5403—IL-3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5421—IL-8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

二重特異性組換えタンパク質であり、第１機能結合フラグメント、第２機能結合フラグメント及びＦｃ領域を含み、前記二重特異性組換えタンパク質は標的抗原をターゲットとする第１機能結合フラグメントは、抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗原結合フラグメントのＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫調節及び／又は代謝調節及び／又は内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントと直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。また、腫瘍、自己免疫性疾病、感染疾病、敗血症、移植片対宿主病、代謝障害、内分泌障害を治療するための医薬の製造における、二重特異性組換えタンパク質の使用を開示する。前記組換えタンパク質は二重特異性組換えタンパク質の第２機能結合フラグメントの標的ターゲティングを上げ、また、製造過程で生成された第２機能結合フラグメントを含む非標的タンパク質が非標的臓器、組織、細胞をターゲットとすることによって引き起こされる毒性副作用を有意に減少させることができる。

Description

発明の詳細な説明
本出願は出願日が２０２０年９月１７日である中国特許出願２０２０１０９７７７１６．２、出願日が２０２１年８月１２日である中国特許出願２０２１１０９３３１０５．２の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。
〔技術分野〕
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、二重特異性組換えタンパク質及びその使用に関する。
〔背景技術〕
免疫は、生体の生理機能であり、この機能によって「自己」と「非自己」の成分を識別することで、人体に侵入する抗原物質（ばい菌など）、又は生体自身が作り出した障害細胞と腫瘍細胞などを破壊及び拒絶し、腫瘍の発生・発展を防ぎ、生体の健康を維持する。しかし、変異細胞は、場合によっては様々な機序を介して体の免疫監視を回避し、体内で急速に増殖して腫瘍を形成させることができる。人体も免疫阻害を介して調節して、免疫機能異常又は継続的な活性化を避け、免疫炎症、サイトカインストーム、同種移植片の免疫拒絶によって自己免疫疾患、敗血症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの臓器損傷を引き起こす。
腫瘍免疫治療は、腫瘍免疫サイクルを再起動及び維持し、身体の正常な抗腫瘍免疫応答を回復させることにより、腫瘍を制御及び排除する治療方法である。これらの免疫回避機序をブロックするか、又は免疫調節及び免疫活性化機序を調節及び制御することによって免疫活性化を「促進」することは、抗ＰＤ－１抗体（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂなど）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂなど）、抗ＣＤ４７抗体／融合タンパク質（ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、ＴＴＩ－６２１など）など、現在の通常の腫瘍免疫治療手段である。
自己免疫疾患とは、自己抗原に対する体の免疫応答によって、自己の組織が障害を受ける疾患を指し、臓器特異的自己免疫疾患と全身性自己免疫疾患を含み、その中で、臓器特異的自己免疫疾患には主に、慢性リンパ球性甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、潰瘍性大腸炎、慢性萎縮性胃炎を伴う悪性貧血、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、多発性硬化症、急性特発性多発神経炎などが含まれ、全身性自己免疫疾患には一般に、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、全身性血管炎、強皮症、天疱瘡、皮膚筋炎、混合性結合組織病、自己免疫性溶血性貧血、甲状腺自己免疫疾患、潰瘍性大腸炎などが含まれる。
敗血症とは、様々な病原菌が血液循環に侵入し、血液中で成長・増殖し、毒素を産生することによって起こされる急性全身感染症を指し、一般的に、急性発症、悪寒、高熱、息切れ、頻脈、発疹、関節の腫れや痛み、肝脾腫及び精神、意識変化などの臨床症状があり、重症者には急性の臓器障害が現れ、更に悪化すると敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）及び多臓器不全に至ることもある。敗血症は、集中治療室における最も一般的な死因の１つである。一方では、病原菌又は日和見病原菌が血液中で急速に増殖し、免疫系が時間内に除去できず、急性全身感染を引き起こす。もう一方では、これらの病原体が分泌するリポ多糖（ＬＰＳ）などの毒素は、マクロファージを活性化してＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＨＭＧＢ１などの炎症因子を放出を引き起こし、全身性炎症反応を生じさせ、敗血症を更に悪化させて生命の脅かす。
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、移植後の同種ドーナ移植片のＴリンパ球が、レシピエントによって開始された一連の「サイトカインストーム」刺激によって、レシピエントの抗原に対する免疫反応を大幅に増強し、レシピエントの標的細胞をターゲットとして細胞毒性攻撃を開始し、急性移植片対宿主病の発生率は３０％～４５％である。
多数の研究により、免疫チェックポイント又はそのリガンド、サイトカインなどが疾患の予防と治療において非常に重要な役割を果たすことが示されている。
免疫チェックポイント（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）とは、免疫活性化の程度を調節できる免疫細胞上に発現する一連の分子を指し、免疫チェックポイントとそのリガンドは、自己免疫の調節において重要な役割を果たしている。免疫チェックポイント分子の発現及び機能の異常は、多くの疾患発生の重要な原因の一つであり、例えば、阻害性免疫チェックポイント分子の過剰発現又は過度の機能により、免疫機能が阻害され、体の免疫力が低下し、人は感染症、腫瘍などの疾患にかかりやすくなり、逆に阻害型免疫チェックポイント分子の免疫阻害機能が弱すぎると、体の免疫機能が異常に活発になる。腫瘍細胞はまた、いくつかの物質を発現して阻害性免疫チェックポイントを活性化し、後者が活性化されると、「ブレーキ」を踏むように、抗原がＴ細胞に提示されず、腫瘍免疫環においての抗原提示プロセスをブロックし、Ｔ細胞の免疫機能を阻害し、腫瘍細胞が監視を逃れて生き残ることを可能にする。通常の免疫チェックポイント及びそのリガンドは、例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３／ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１又はＢ７－２、ＴＩＭ－３／Ｇａｌｅｃｔｉｎ－９、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７、ＴＩＧＩＴ／Ｎｅｃｔｉｎ２又はＮｅｃｔｉｎ３、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭである。
ＰＤ－１（プログラム死受容体１）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する重要な免疫阻害分子であり、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合はＴ細胞のプログラム死を開始させ、腫瘍細胞に免疫回避をもたらす。従って、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用による免疫調節効果をブロックすることは、抗腫瘍、抗感染、抗自己免疫疾患及び臓器移植の生存においていずれも非常に重要であることが、大量の臨床研究結果によって証明された。
ＬＡＧ－３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域の３つの部分で構成されている。ＬＡＧ－３を阻害すると、Ｔ細胞が細胞毒性を回復し、腫瘍に対する殺傷効果を高めることができ、同時に、ＬＡＧ－３を阻害することで、Ｔ細胞の免疫反応を阻害する機能を低下させることができる。
ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４、ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ－４）は、ＣＤ１５２と称され、白血球分化抗原であり、Ｔ細胞上の膜貫通受容体であり、ＣＤ２８とＢ７分子リガンドを共有し、ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも高い親和性と結合力でＣＤ８０とＣＤ８６（Ｂ７－１及びＢ７－２とも称される）に結合し、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達し、免疫応答の負の調節に関与する。
ＴＩＭ－３は、ＨＡＶＣＲ２とも称され、ＴＩＭ遺伝子ファミリーに属する。ＴＩＭ－３は、負の調節免疫チェックポイントとして、Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及びマスト細胞など、様々な種類の免疫細胞に存在する。ＴＩＭ－３は、Ｉ型膜タンパク質であり、２８１個のアミノ酸で構成される。これは、細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質テールから構成される。ＴＩＭ－３とそのリガンドＧａｌ－９は、Ｔ細胞免疫を負に調節することで腫瘍免疫を阻害する。ＴＩＭ－３ＩｇＶ構造ドメインとＧａｌ－９へのライゲーションはＴｈ１免疫応答を終了させことができる。ＴＩＭ－３は、免疫寛容を誘導することができ、喘息、食物アレルギー及び多発性硬化症及び関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連している。ＴＩＭ－３はＴ細胞の免疫応答も阻害し、慢性的なウイルス感染につながる免疫疲労に関与している。
ＣＤ４７は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質であり、赤血球を含むほぼすべての細胞の表面に発現する。ＣＤ４７のリガンドには、接着因子（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、トロンボスポンジン－１（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ－１）、及びシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）が含まれる。ＣＤ４７は、細胞移動、Ｔ細胞、樹状細胞の活性化、軸索の発達などを含む様々生物学的機能を有する。更に、ＣＤ４７はＳＩＲＰαと相互作用することによりマクロファージの食作用を阻害する。ＣＤ４７は、このような方法でいわゆる「食べないでください」（「Ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」）信号を送信し、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの正常細胞をマクロファージによる食作用から保護する。
ＳＩＲＰ－ａｌｐｈａ（ＳＩＲＰα）は、ＳＩＲＰファミリーの典型的な阻害性免疫受容体であり、体内に遍在する膜貫通糖タンパク質ＣＤ４７と相互作用して阻害シグナルを伝達する。ＳＩＲＰα融合タンパク質は、競合を通じてマクロファージの表面でＣＤ４７とＳＩＲＰ－ａｌｐｈａの結合をブロックし、マクロファージ上の腫瘍細胞に対するＣＤ４７の阻害作用を緩和し、マクロファージの免疫機能を回復させ、抗腫瘍効果を発揮することができる。
ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭ接合ドメインを含むＴ細胞免疫受容体、ＶＳｌＧ９、ＶＳＴＭ３又はＷＵＣＡＭとも称される）は、免疫グロブリンポリオウイルス受容体ファミリーＣＤ２８ファミリー様受容体のメンバーであり、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞サブセットに発現する。通常、その発現レベルは低いが、これらの細胞が活性化されると、そのタンパク質レベルがアップレギュレートされる。例えば、腫瘍微小環境では、腫瘍浸潤リンパ球のＴＩＧＩＴが高発現レベルであることが多く、ＴＩＧＩＴは免疫細胞、非免疫細胞及び腫瘍細胞中の受容体ＣＤ１５５（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＰＶＲ）、ＣＤ１１２（ＰＶＲＬ２、ｎｅｃｔｉｎ－２）、ＣＤ１１３（Ｎｅｃｔｉｎ－３）に結合することができ、結合後Ｔ細胞の不活性化につながり、Ｔ細胞とナチュラルキラー細胞の細胞毒性が阻害される。
ＢＴＬＡは、活性化されたＴ及びＢリンパ球で発現する重要な免疫チェックポイント分子であり、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４（単一の免疫グロブリン可変領域ＩｇＶ細胞外構造ドメイン）などの他の免疫チェックポイント分子と同様の構造と同様の細胞内シグナル伝達メカニズム（細胞質内の二つのＩＴＩＭ構造ドメインが、ＳＨＰ－１とＳＨＰ－２のリン酸化酵素を活性化してリンパ球機能を阻害）を持っている。ＴＮＦ受容体ファミリーのＨＶＥＭ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ、ヘルペスウイルスエントリメディエーター）は、ＢＴＬＡのリガンドとして同定され、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞及び様々な腫瘍細胞（非小細胞肺癌、黒色腫、結腸直腸癌及びリンパ腫を含む）などのヒト免疫細胞で広く発現している。通常の生理学的条件下では、ＢＴＬＡはそのリガンドであるＨＶＥＭと結合した後、体内のリンパ球の過剰な活性化を阻害し、免疫システムによる自体の損傷を防ぐことができる。しかし、肺癌、黒色腫、結腸直腸癌及びリンパ腫などの腫瘍細胞は、ＨＶＥＭを高発現させて腫瘍特異的なキラーリンパ球が発現するＢＴＬＡと結合することで、リンパ球の免疫機能を阻害することができる。ＨＶＥＭの腫瘍の高発現は、予後不良と関連している。
サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ＣＫ）は、様々な組織細胞（主に免疫細胞）によって合成及び分泌される低分子ポリペプチド又は糖タンパク質である。サイトカインは細胞間の相互作用を媒介することができ、細胞増殖、分化・成熟の調節、機能の維持、免疫応答の調節、炎症反応への関与、創傷治癒及び腫瘍の消長など、様々な生物学的機能を有している。サイトカインの構造と機能に応じて、サイトカインをインターロイキンスーパーファミリー、インターフェロンファミリー、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、ＴＧＦ－βスーパーファミリー、ケモカインファミリー、コロニー刺激因子ファミリー、成長因子ファミリーなどに分けることができる。
インターロイキンは、様々な細胞によって産生され、様々な細胞に作用するサイトカインである。最初は白血球から産生され、白血球の間で役割を果たしたことからその名がつき、現在も使われている。分子構造と生体機能が基本的に解明され、重要な調節的役割を担っており、統一的に命名されているサイトカインの一種であり、血球増殖因子と同じサイトカインに属する。両者は互いに協調して相互作用し、造血及び免疫調節機能を完成させる。インターロイキンは、情報伝達、免疫細胞の活性化と調節、Ｔ、Ｂ細胞の活性化、増殖と分化の媒介及び炎症反応において重要な役割を果たしている。
ＩＬ－２は、多細胞で由来（主に活性化Ｔ細胞によって産生される）し、多面的な効果を持つサイトカインであり、リンパ球の成長、増殖、分化を促進し、体の免疫応答及び抗ウイルス感染において重要な役割を果たしている。ＩＬ－２は、Ｔ細胞を活性化し、サイトカイン産生を促進することができ、ＮＫ細胞の増殖を刺激し、ＮＫ殺傷活性を増強させ、サイトカインを産生し、ＬＡＫ細胞の産生の誘導し、Ｂ細胞の増殖と抗体の分泌を促進し、マクロファージを活性化することができる。
ＩＬ－１０は、サイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）とも称され、双方向の免疫調節効果を有し、ＩＬ－１０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介して免疫阻害を発揮し、Ｔ細胞を介して負の調節効果を発揮し、腫瘍環境における免疫応答に対して負の調節効果を有し、更に、ＩＬ－１０は、Ｔ、Ｂリンパ球に対して刺激効果を有し、また腫瘍環境においてＩＬ－１０は刺激効果も発揮し、ＩＬ－１０の双方向調節は発現以来からずっと注目されており、免疫系に影響を与えるだけではなく、成長因子、サイトカインを調節することにより、血管新生、腫瘍形成及び感染などを含む多くの病態生理学的プロセスにも影響を与える可能性があり、制御性Ｔ細胞を誘導することにより末梢寛容における役割を確立することができ、ＩＬ－１０は、クローン病、関節リウマチ、乾癬、ＨＣＶ感染、ＨＩＶ感染などに重要な役割を果たしている。自然状態では、ＩＬ－１０は、ホモ二量体を形成し、その受容体と結合して複合体を形成することにより、下流のシグナル伝達経路を活性化し、その生理的効果を発揮する。２０００年、Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎらはモノマーの状況でＩＬ－１０受容体に結合し、下流のシグナル伝達経路を活性化する（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ， Ｋ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｍｏｎｏｍｅｒ．［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ２７５（１８）：１３５５２－７．）ＩＬ－１０突然変異体を研究・設計した。
インターフェロンは、主に単球及びリンパ球で産生されるサイトカインであり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３種類に分けられる、多機能な活性タンパク質群である。Ｉ型インターフェロンは主に自然免疫細胞から分泌され、主にＩＦＮ－αとＩＦＮ－βであり、ＩＩ型インターフェロンは主に活性化Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ－γであり、ＩＩＩ型インターフェロンは数種類のＩＦＮ－λである。インターフェロンは、広範囲の抗ウイルス、細胞の増殖、及び分化、免疫機能の調節などの様々な生物活性を有し、具体的な機能は下記に示された通りである：
（１）抗ウイルス効果：Ｉ型インターフェロンは、免疫系における主要な抗ウイルス防御及び調節因子である。体は初期のウイルス感染の間、Ｉ型インターフェロンはウイルスの成長と増殖を制御することができる。それは、一方では免疫細胞を直接活性化し、もう一方ではウイルスの複製プロセスを間接的に阻害することができる。
（２）抗菌効果：インターフェロンは、トランスフェリン受容体をダウンレギュレートすることによって細菌の鉄供給を減少させるか又は内因性ＮＯの産生を誘導して細胞内細菌を直接阻害することができ、また単球マクロファージの貪食小体であるリソソームの細菌を溶解させる作用を増加させ、上記の経路を通じて細菌を除去することができる。
（３）抗寄生虫効果：インターフェロンはマクロファージ（Ｍφ）を活性化することができ、活性化されたＭφは、高いレベルの誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を発現してＬ－アルギニンからのＮＯの産生をを触媒しすることができ、ＮＯは接種した病原体に対して阻害及び殺傷効果を有する。また、ＩＦＮ－γはＭφを活性化してＮＯを産生し、ＮＯ合成を促進する効果は用量依存性があり、投与量が高いほど効果が有意であることが報告されている。Ｄａｕｂｅｎｅｒら（２００１）は、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）をＩＦＮ－γで刺激することにより、トキソプラズマ症に対するその耐性を誘導できることを発現した。ＩＦＮ－γによって刺激されたＨＢＭＥＣは、トキソプラズマの成長を阻害し、ＩＤＯの活性に関連するＴＮＦ－αの出現を増加させることができる。更に、ＨＢＭＥＣ培養に過剰なトリプトファンを加えることによりＩＦＮ－γ－ＴＮＦ－αを介した抗トキソプラズマ症を完全に阻害することができ、ＩＤＯがその保護性を媒介できることが示され、またＩＦＮ－γがＩＤＯの発現に依存して機能することが報告された。
（４）免疫調節に関与：免疫調節に関与するのは主にＩＦＮ－γであり、免疫調節インターフェロンとも称される。免疫調節性インターフェロンはＩｇＧのＦｃ受容体で発現することができ、マクロファージによる抗原の貪食作用、Ｋ、ＮＫ細胞による標的細胞の殺傷及びＴ、Ｂリンパ球の活性化に有益であり、体の免疫応答を高める。ＩＦＮ－γは、マクロファージの表面でＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を増加させ、その抗原提示能力を高めることができる。更に、マクロファージの表面上のＦｃ受容体の発現を増強することにより、マクロファージによる免疫複合体、抗体でコーティングされた病原体及び腫瘍細胞の貪食作用を促進することができる。同時に、好中球を刺激し、その貪食作用を高め、ＮＫ細胞を活性化し、その細胞毒性を高めて免疫調節に関与することもできる。
（５）抗腫瘍効果：ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βは幅広い抗腫瘍効果を有し、ＩＦＮ－γは体の免疫応答に対して多方面の調節作用があり、エフェクター細胞を活性化し、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ及び腫瘍浸潤リンパ球の活性を増加させることができ、単球の循環を促進し、免疫細胞表面の抗原及び抗体の発現を高め、ＩＬ－２、腫瘍壊死因子、ＩＦＮ－αなどのサイトカインの産生を刺激し、腫瘍細胞分裂を阻害し、完全抗ウイルスタンパク質への遺伝子合成を誘導する。
腫瘍壊死因子スーパーファミリー、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、マウスの癌細胞を死滅させることができる血清中で発現されたサイトカインである。主なメンバーには、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、リンホトキシン－β、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７Ｌ及びＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ受容体活性剤（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血管内皮細胞増殖阻害剤（ＶＥＧＩ）、サイトプラスミンＡ（ＥＤＡ－Ａ１、ＥＤＡ－Ａ２）及びグルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子受容体関連リガンド（ＧＩＴＲＬ）が含まれる。腫瘍壊死因子ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、数十個の受容体と特異的に認識し、リガンド－受容体作用機序を形成する。ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）は主に、宿主防御、炎症、アポトーシス、自己免疫、及び免疫、外胚葉及び神経系の発達及び器官形成などの生理学的プロセスに関与する膜貫通タンパク質である。ＴＮＦは、腫瘍細胞の壊死（細胞の膨張、オルガネラの破壊、細胞溶解）及びアポトーシス（細胞の収縮、凝集体の形成、ＤＮＡの断片化）を引き起こし、様々な免疫及び炎症過程において重要な役割を果たす。
コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、未熟骨髄細胞の分化と成熟を刺激し、体外でのコロニー形成を刺激するサイトカインである。サイトカインの刺激の違いによって異なる造血細胞株又は異なる分化段階の細胞は半固体培地で異なる細胞コロニーを形成し、それぞれ顆粒球ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球とマクロファージＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、マルチコロニー刺激因子（ｍｕｌｔｉ－ＣＳＦ、ＩＬ－３とも称される）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と名付けられる。それらは異なる発育段階の造血幹細胞に対して増殖、分化を促進する役割を果たし、造血に不可欠な刺激因子である。広義には、造血を刺激するすべてのサイトカインを総称してＣＳＦと称することができ、例えば、胚性幹細胞を刺激する白血病阻止因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）及び血小板を刺激するトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）などはいずれもコロニー刺激活性を有している。また、ＣＳＦは様々なの成熟した細胞にも作用し、その機能を促進することは多相性の効果がある。
ケモカインは、細胞から分泌される小さなサイトカイン又はシグナルタンパク質である。それらは近くの反応細胞の方向性ケモカインを誘導する能力があるため、ケモカインと名付けられる。ケモカインタンパク質の共通の構造特徴は、分子量が小さく（約８～１０ｋＤａ）、その三次構造を確保するために４つの位置保存のシステイン残基があることである。ケモカインは、ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ及びＸＣの４つの主要なサブファミリーに分けられる。これらのタンパク質はすべて、Ｇタンパク質に結合する膜貫通受容体（ケモカイン受容体と称される）と相互作用することにより、その生物学的効果を発揮し、これらのタンパク質は、ケモカイン受容体に結合して作用し、ケモカイン受容体は、標的細胞の表面で選択的に発現するＧタンパク質の共役膜貫通受容体である。
ケモカインの主な機能は炎症と恒常性維持の過程で白血球のそれぞれの位置への移動（ホーミング）を管理することである。基礎ホーミング：胸腺及びリンパ組織で産生される基本的な恒常性ケモカインである。ケモカインＣＣＬ１９とＣＣＬ２１（リンパ節とリンパ管内皮細胞に発現する）及びそれらの受容体ＣＣＲ７（細胞において、これらの臓器の細胞にホーミングされて発現するはずである）は、ホーミングの恒常性機能の最も良い実例である。これらのリガンドを利用することにより、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を適応免疫応答の過程でリンパ節に転移させることができる。他の恒常性ケモカイン受容体は、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０及びＣＸＣＲ５を含み、それらは、細胞アドレスの一部として組織特異的な白血球ホーミングに重要である。ＣＣＲ９は白血球の腸への移動をサポートし、ＣＣＲ１０は皮膚の移動をサポートし、ＣＸＣＲ５はＢ細胞のリンパ節濾胞への移動をサポートする。骨髄で産生されたＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ－１）は、骨髄微小環境におけるＢ前駆細胞の増殖を促進する。炎症性ホーミング：炎症性ケモカインは、感染又は損傷過程で高濃度で産生され、炎症性白血球の損傷部位への移動を決定する。典型的な炎症性ケモカインには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３及びＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＸＣＬ８が含まれる。
一部のケモカインは、免疫応答中に免疫系の細胞が感染部位に入るように誘導する炎症性サイトカインであると考えられている。一部のケモカインは、体の自己調節を維持し、正常な組織の維持又は発達過程で細胞の移動を制御すると考えられている。
ケモカインは、その走化性が作用する細胞タイプに応じて、以下のように分類される。
単球／マクロファージケモカイン：単球／マクロファージを炎症部位に誘引する主要なケモカインには、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２が含まれる。
Ｔリンパ球ケモカイン：炎症部位へのＴリンパ球の動員に関与する４つの重要なケモカインは、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ１７である。更に、Ｔ細胞は活性化された後ＣＸＣＲ３の発現を誘導し、活性化されたＴ細胞は炎症部位に引き付けられ、炎症部位でＩＦＮ－γ誘導ケモカインＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１を分泌する。
肥満細胞ケモカイン：表面にＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４の複数のケモカイン受容体を発現する。これらの受容体ＣＣＬ２及びＣＣＬ５のリガンドは、肺肥満細胞の動員と活性化に重要な役割を果たしている。また、ＣＸＣＬ８が肥満細胞を阻害する可能性があるという証拠もある。
好酸球ケモカイン：様々な組織への好酸球の移動は、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１３及びＣＣＬ３のＣＣファミリーのいくつかのケモカインが関与している。ケモカインＣＣＬ１１（ｅｏｔａｘｉｎ）及びＣＣＬ５（ｒａｎｔｅｓ）は、好酸球表面の特定の受容体ＣＣＲ３を介して作用し、好酸球は病変への最初の動員において重要な役割を果たす。
好中球ケモカイン：主にＣＸＣケモカインによって調節される。例えば、ＣＸＣＬ８（ＩＬ－８）は好中球のケモカインであり、好中球の代謝と脱顆粒を活性化する。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーは、細胞の増殖と分化を調節するサイトカイン群である。このファミリーには、ＴＧＦ－βの他に、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎｓ）、阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｎｓ）、ミュラー管阻害物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ、ＭＩＳ）及び骨形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏ－ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＢＭＰｓ）が含まれる。ＴＧＦ－βは、炎症、組織修復及び胚発生において役割を果たし、細胞増殖、分化及び免疫機能において重要な調節役割を果たし、具体的な機能は下記に示された通りである。
（１）免疫活性細胞の増殖を阻害：（ｉ）ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦによって誘導されるマウス造血前駆細胞とＬＴＢＭＣのコロニー形成を阻害し、ＩＬ－３ＴとＣＳＦに対する巨核細胞の反応性を低下させる。（ｉｉ）ＣｏｎＡによって誘導されるか又はＣｏｎＡとＩＬ－２、ＩＬ－６組み合わせによって誘導される胸腺細胞の増殖を阻害する。（ｉｉｉ）マイトジェン、同種異体抗原により刺激されたＴ細胞の増殖又はＩＬ－２依存性Ｔ細胞の増殖を阻害する。（ｉｖ）ＳＡＣ刺激後のＩＬ－２依存性Ｂ細胞の増殖を阻害する。
（２）細胞表現型の調節：（ｉ）ＩＬ－２によって誘導されるＴ細胞ＩＬ－２Ｒ、ＴｆＲ及びＴＬｉＳＡ１活性化抗原の発現を阻害し、ＣＤ３の発現には影響を与えない。（ｉｉ）ＩＦＮ－γによって誘導されるメラノーマ細胞ＭＨＣ ＩＩ類抗原の発現を阻害する。
（３）リンパ球の分化を阻害：（ｉ）ＩＬ－２とＢＣＤＦ依存的なＢ細胞からのＩｇＭの分泌を阻害し、Ｂ細胞から分泌されるＩｇ型のＩｇＡとＩｇＥへの変換を促進する。（ｉｉ）混合リンパ球培養（ＭＬＣ）におけるＣＴＬ、ＮＫとＬＡＫ機能を阻害し、この阻害効果は、ＴＮＦ－α（マウスＭＩＣ）又はＩＬ－２（ヒトＭＬＣ）によって逆転できる。（ｉｉｉ）ＰＢＭＣにおけるＮＫ活性を阻害する。（ｉｖ）ＣｏｎＡとＩＬ－２、ＩＬ－６が相乗的に誘導するマウス胸腺ＭＨＣ無制限キラー細胞の活性を阻害する。
（４）サイトカイン産生を阻害：例えば、ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ－γとＴＮＦ－αの産生を阻害する。
（５）その他の調節作用：（ｉ）線維芽細胞、骨芽細胞及びシュワン細胞の増殖を促進する。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２は、ヒト線維芽細胞におけるＩＬ－６の産生を促進し、その機序は、ＩＬ－６遺伝子転写の調節によるものである可能性がある。（ｉｉ）上皮細胞、破骨細胞、内皮細胞の増殖と脂肪、心筋、骨格筋の形成を阻害する。ＴＧＦ－βは、ＥＧＦのいくつかの生物学的機能を拮抗することができる。（ｉｉｉ）コラーゲン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の発現とＥＣＭの分解の阻害を促進し、細胞の形態形成、増殖及び分化の過程で重要な役割を果たし、胚発生と細胞修復に有益である。動物における体内実験は、ＴＧＦ－βの局所注射が創傷治癒と典型的な肉芽組織形成を促進することを示した。（ｉｖ）単球と線維芽細胞のケモカインであるが、コロイド粒子と酸化物の産生は起こさない。（ｖ）リンパ球と内皮細胞の接着を阻害する。（ｖｉ）好塩基球からのヒスタミンの放出を促進する。
（６）ＴＧＦ－β１と癌原遺伝子の発現：ＴＧＦ－β１はｃ－ｓｉｓの発現を誘導するが、ｃ－ｍｙｃの発現を阻害し、このような誘導又は阻害作用は作用する細胞の種類とＴＧＦ－βの異なる機能と関係している。例えば、ＴＧＦ－βが線維芽細胞中のｃ－ｓｉｓ遺伝子の発現を誘導することは、軟寒天中でのその増殖を促進することに関連し、上皮ケラチノサイトの増殖の阻害はｃ－ｍｙｃ遺伝子発現の阻害に関連している。ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２とＴＧＦ－β３は多くの生物学的効果において非常に類似しているが、血管内皮細胞と造血前駆細胞に対するＴＧＦ－β２のの増殖阻害効果はＴＧＦ－β１とＴＧＦ－β３の１％にすぎなく、いくつかの効果において大きな違いがあり得る。
ＴＧＦ－βは、創傷治癒の治療、軟骨と骨の修復の促進及び免疫阻害による自己免疫疾患と移植片拒絶の治療への使用が期待されている。
成長因子とは、様々な細胞から分泌され、特定の標的細胞に作用し、細胞分裂、マトリックス合成と組織分化を調節するサイトカインを指す。成長因子には、血小板様成長因子（血小板由来成長因子、ＰＤＧＦ；骨肉腫由来成長因子ＯＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（αＦＧＦ、βＦＧＦ）、インスリン成長因子（ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ）、神経成長因子（ＮＧＦ）など様々な種類がある。
しかし、免疫調節は全身性であることが多く、免疫の活性化は免疫系の過剰活性化を伴うことが多く、下記のような免疫関連の毒性反応を引き起こす。
皮膚：発疹・丘疹、かゆみ、疱疹状皮膚炎症候群などで現れ、
内分泌：甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、原発性副腎機能低下症、高血糖症などで現れ、
肝臓：主にトランスアミナーゼの上昇で現れ、
消化管：主に下痢／大腸炎で現れ、
肺：免疫関連肺炎で現れ、
その他、神経毒性、血液毒性、腎毒性、心臓毒性、眼毒性などの比較的まれな副作用がある。
免疫チェックポイント又はそのリガンド、サイトカイン又はその受容体をターゲットとする治療法は、すでに腫瘍、自己免疫疾患、敗血症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの疾患に対する治療効果を示しているが、薬物自体は潜在的な関連毒性により薬物投与量が制限され、薬効を低下させる。更に、免疫阻害は免疫系の過度の低下を伴うことが多く、細菌、ウイルス、真菌などの感染症につながり、炎症の再発を引き起こして、腫瘍の発生を誘発する。
従って、様々なサイトカイン、モノクローナル抗体、リガンド／受容体Ｆｃ融合タンパク質などの単一標的療法は、多くの場合、最適な安全性ウィンドウと治療効果を達成するには不十分であることが多く、２つ又は複数の標的の相乗効果という概念が現れた。このような場合、２つ以上の標的をターゲットとする二重特異性抗体／融合タンパク質（二重抗体分子）又は多重特異性抗体／融合タンパク質（多重抗体分子）は、モノクローナル抗体では実現が困難な新規な治療への使用を提供する可能性がある。その中には、それぞれ標的細胞表面の標的抗原（ＣＤ１９、ＨＥＲ２など）及び免疫調節標的（ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ４７など）をターゲットとするか又は免疫調節剤（ＩＬ－２、４－１ＢＢ、ＳＩＲＰα、ＣＤ８０など）を携帯する、二重／多重特異性抗体／融合タンパク質の設計思想と臨床応用（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、ブリナツモマブなど）が含まれる。
よく見られる対称構造の二重抗体分子／二重特異性融合タンパク質は、所定の標的凝集効果を有して、薬物分布を標的臓器にある程度蓄積させ、医薬品開発工程、特に精製工程は比較的制御できるが、その構造には依然として所定の制限があり、特に標的臓器と非標的臓器の薬物濃度の差はあまり有意ではなく、皮下又は静脈内投与などの非標的臓器を使用すると、血液中の薬物濃度は依然として免疫毒性を引き起こし、その安全な投与量を制約する主な問題である。従って、標的抗原をターゲットとする抗原結合断片／融合タンパク質と免疫チェックポイント／サイトカイン受容体をターゲットとする抗原結合断片／融合タンパク質の親和性の組み合わせは、二重特異性分子のその標的抗原をターゲットとする部分が標的細胞の最適濃度の濃縮効果を達成していない場合、免疫調節をターゲットとする部分がすでに免疫関連の毒性副作用を誘発しないように厳密にコントロールする必要がある。
対称構造の他、非対称構造を使用する二重特異性抗体／融合タンパク質もあり、左右のアーム間の親和性の違いに依存して、抗原陽性をターゲットとする細胞表面に薬物が豊富に存在することを更に高め、免疫調節部分をターゲットとすることで誘発される免疫関連毒副作用を更に低減することができる。しかし、非対称構造は薬学的工程の困難さの増加、収率の低下、製造コストの増加などの好ましくない要因に加えて、免疫調節アームのモノマー又はポリマー不純物は免疫関連の不良事件を引き起こす重要なリスク源となる。ＴＴＩ－６２１（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．が開発したＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質）を例にとると、ＴＴＩ－６２１の公開された臨床研究結果によると、非常に低い投与量（０．２ｍｇ／ｋｇ）で２０％以上の患者にグレードＩＩＩ以上の重度の血小板減少の副作用を引き起こした（ＴＴＩ－６２１が血小板で高度に発現するＣＤ４７に結合するため、血小板は免疫細胞によって除去される）。ＣＮ１０８８６４２９０Ａの図面３に示されている二重抗体構造のように、完成品には、製造過程で右アームのモノマー／ダイマー構造（即ち、ＴＴＩ－６２１類似物）の不純物が潜在的に存在し、５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの投与量の通常腫瘍標的治療系抗体薬物の投薬量は、極めて低い不純物濃度（１～４％）でＴＴＩ－６２１の深刻な毒副作用の投与量濃度に達するため、当該構造は完成品の不純物含有量を極めて厳しく制御して、生産コストが大幅に増加する。
更に、インターフェロンなどの一部の免疫調節融合タンパク質は、その製品の特性から、一般的に凍結融解安定性が低く、組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質（ｒＨＳＡ－ＩＦＮ－α ２ｂ）は凍結融解を繰り返すとポリマーが徐々に増加し、４回凍結融解するとポリマーの含有量が１７．９１％に達し、組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質は凍結融解に適さない（Ｘｉａ Ｙｉら、組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質の安定性に関する研究、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２５（００６）：３８－４０）ため、生産、輸送及び使用には比較的に多くの制限がある。
従って、標的抗原をターゲットとし、同時に免疫調節効果を発揮できる二重抗体又は二重特異性構造を発明することが急務であり、当該構造は標的細胞の高濃度濃縮を達成し、免疫調節作用をするだけではなく、血液中で高濃度に達しても標的抗原の非存在下で、単純に免疫調節端に依存して免疫調節機能を発揮しないため、標的臓器、組織、細胞の免疫調節をより正確に実現して免疫関連毒副作用のリスクを下げるとともに、製品の安定性（例えば、凍結融解安定性）を高めることができる。
〔発明の概要〕
本発明が解決しようとする第１の技術的課題は、標的抗原を含む標的ターゲット細胞に対して強力なターゲティングを有し、同時に、標的抗原を含まない非標的ターゲット細胞とは結合しないか、又は弱く結合する方向調節効果を有する二重特異性組換えタンパク質を提供して、組換えタンパク質の第２機能結合フラグメントの標的ターゲット細胞に対するターゲティングを有意に改善し、方向的に免疫効果を調節し、同時に製造過程で生じる第２機能結合フラグメントを含む潜在的リスク不純物が非標的ターゲット細胞を含む臓器、組織などをターゲットとして引き起こされる毒性副作用を大幅に減少させることである。
本発明が解決しようとする第２の技術的課題は、医薬の製造における前記方向調節効果を有する二重特異性組換えタンパク質の使用を提供することである。
本発明が解決しようとする第３の技術的課題は、製品の安定性（凍結融解安定性など）を改善することができる二重特異性組換えタンパク質を提供して、一部の免疫調節融合タンパク質（インターフェロンなど）がその製品自体の特性による製品の不安定性及びそれに伴う生産、輸送、及び使用の制限を解決することである。
一つの実施態様において、本発明は、二重特異性組換えタンパク質を提供し、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合フラグメント、第２機能結合フラグメント及びＦｃ領域を含み、前記二重特異性組換えタンパク質の標的抗原をターゲットとする第１機能結合フラグメントは、抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗原結合フラグメントのＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫調節機能及び／又は代謝調節機能及び／又は内分泌調節機能を有する、第２機能結合フラグメントと直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。
好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、前記第２機能結合フラグメントのＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第２機能結合フラグメントのＣ末端は、ＦｃのＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。
一つの実施形態において、前記免疫調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、免疫チェックポイント、免疫チェックポイントリガンド又はサイトカイン受容体をターゲットとする。任意選択で、前記免疫調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、ＰＤ－１又はそのリガンド、ＣＤ４７又はそのリガンド、ＣＤ２４又はそのリガンド、インターフェロン受容体（例えば、Ｉ型又はＩＩ型インターフェロン受容体）、インターロイキン受容体をターゲットとする。
一つの実施形態において、前記代謝調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、代謝調節因子、代謝調節因子受容体をターゲットとする。任意選択で、前記代謝調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、インスリン受容体、線維芽細胞成長因子受容体をターゲットとする。
一つの実施形態において、前記内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、内分泌調節因子、内分泌調節因子受容体をターゲットとする。任意選択で、前記内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、ホルモン受容体をターゲットとする。
一つの実施形態において、前記抗原結合フラグメントにおける可変領域（Ｖ領域）及び定常領域（Ｃ領域）が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は前記抗原結合フラグメントとＦｃ領域が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は上記の２つの方法を同時に使用して連結される。
一つの実施形態において、前記リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、又は（ＸＰ）ｎを含み、ｎは自然数である。好ましくは、前記ｎは０～５の自然数である。
一つの実施形態において、リンカー配列は（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝０、１、２、３、４、５である。
一つの実施形態において、前記第２機能結合フラグメントは、サイトカイン受容体又は免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンドに結合する。好ましくは、前記第２機能結合フラグメントが、サイトカイン又は免疫チェックポイントリガンド又は免疫チェックポイントリガンド結合タンパク質、又はその機能フラグメント若しくはその突然変異体であり、任意選択で、ヒトＳＩＲＰファミリー細胞外機能フラグメント、ヒトインターフェロンファミリー機能フラグメント、腫瘍壊死因子スーパーファミリー機能フラグメント、ＴＧＦ－βスーパーファミリー機能フラグメント、インターロイキン系機能フラグメント、ケモカインファミリー機能フラグメント、コロニー刺激因子ファミリー機能フラグメント、成長因子機能フラグメント又はその突然変異体である。
一つの実施形態において、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体である。好ましくは、当該突然変異体は低親和性突然変異体であり、即ち、当該突然変異体とヒトＣＤ４７タンパク質の結合親和性は、野生型タンパク質とヒトＣＤ４７タンパク質の結合親和性よりも高くない。
一つの実施形態において、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）又はヒトインターフェロンα（ＩＦＮ－α）又はヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ－β）、そのトランケーション又はその突然変異体である。
一つの実施形態において、前記第２機能結合フラグメントは、インターロイキン、そのトランケーション、又はその突然変異体である。
一つの実施形態において、前記インターロイキンが免疫調節因子又はケモカインであり、ＩＬ－１ファミリー、ＩＬ－２ファミリー、ＩＬ－３ファミリー、ＩＬ－６ファミリー、ＩＬ－８ファミリー、ＩＬ－１０ファミリー、ＩＬ－１２ファミリー及びＩＬ－１７ファミリーのいずれか１つから選択される。好ましくは、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＩＬ－１０単量体突然変異体（アミノ酸配列は、配列番号５２に示される通りであり）、ヒトＩＬ－１２Ａ又はその突然変異体（アミノ酸配列は、配列番号５１に示される通りであり）、ヒトＩＬ－１５（アミノ酸配列は、配列番号５３に示される通りであり）及びＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩ（アミノ酸配列は、配列番号５４に示される通りであり）で直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されて構成された融合タンパク質又はその突然変異体である。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ－３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＴＲＯＰ２、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＣＤ１５５及びＡＦＰから選択される１つ又は複数の標的をターゲットとする。
好ましくは、前記第２機能結合フラグメントが、ヒトＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体を含む場合、第１機能結合フラグメントは、腫瘍細胞又は免疫細胞をターゲットとする。
前記第２機能結合フラグメントが、ヒトインターフェロンα（ＩＦＮ－α）又はヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ－β）又はヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、そのトランケーション又はその突然変異体である場合、第１機能結合フラグメントは、腫瘍細胞又は免疫細胞をターゲットとする。
前記第２機能結合フラグメントが、インターロイキン、そのトランケーション又は突然変異体である場合、前記第１機能結合フラグメントは、腫瘍細胞又は免疫細胞をターゲットとする。
一つの実施形態において、前記二重特異性組換えタンパク質は、Ａ鎖及びＢ鎖から構成され、前記Ａ鎖及びＢ鎖は、分子間の作用力によって結合されるか、又は鎖間ジスルフィド結合などの共有結合によって結合されるか、又はイオン結合によって結合されるか、又は上記の結合方法の２つ又は３つの組み合わせによって結合される。前記Ａ鎖は順次にＶＨ、ＣＬ／ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインから構成されるタンパク質、又は順次にＶＬ、ＣＬ／ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインから構成されるタンパク質であり、ドメイン間は直接に連結されるか、又はリンカー配列（Ｌｉｎｋｅｒ）によって連結され、前記Ｂ鎖は順次にＶＬ、ＣＬ／ＣＨ１、第２機能結合フラグメント、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインから構成されるタンパク質、又は順次にＶＨ、ＣＬ／ＣＨ１、第２機能結合フラグメント、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインから構成されるタンパク質であり、ドメイン間は直接に連結されるか、又はリンカー配列（Ｌｉｎｋｅｒ）によって連結され、例えば、「Ａ鎖」がＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３である場合、「Ｂ鎖」は、ＶＬ－ＣＬ－第２機能結合フラグメント－ＣＨ２－ＣＨ３であり、「Ａ鎖」がＶＬ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３である場合、「Ｂ鎖」は、ＶＨ－ＣＨ１－第２機能結合フラグメント－ＣＨ２－ＣＨ３であり、「Ａ鎖」がＶＨ－ＣＬ－ＣＨ２－ＣＨ３である場合、「Ｂ鎖」は、ＶＬ－ＣＨ１－第２機能結合フラグメント－ＣＨ２－ＣＨ３であり、「Ａ鎖」がＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３である場合、「Ｂ鎖」は、ＶＨ－ＣＬ－第２機能結合フラグメント－ＣＨ２－ＣＨ３である。上記のＣＨ２のＮ末端は、更にヒンジ領域を含む。
一つの実施形態において、前記二重特異性組換えタンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列又はＦｃ非天然配列を含み、より好ましくは、前記Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域であり、更に好ましくは、ここで、Ａ鎖及びＢ鎖のＦｃ領域は、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓを介して結合されている。
一つの実施形態において、前記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧのＦｃ領域であり、好ましくは、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントのＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端又は第２機能結合フラグメントのＣ末端は、前記Ｆｃ領域と直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、抗原結合フラグメントであり、任意選択で、ヒトマウスキメラ抗原結合フラグメント、ヒト抗原結合フラグメント、完全ヒト抗原結合フラグメントであり、前記第１機能結合フラグメントは、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９８、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ－３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＴＲＯＰ２、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＣＤ１５５及びＡＦＰの標的抗体の抗原結合フラグメントのいずれか１つ又は複数から選択され、好ましくは、前記第１機能結合フラグメントは、ヒト化又は完全ヒト抗体の抗原結合フラグメントである。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントが、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ１３８、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、又はＴＲＯＰ２をターゲットとする場合、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体を含む。好ましくは、前記第２機能結合フラグメントは、配列番号５０に示される通りである。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントが、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２０６、ＣＣＲ５をターゲットとする場合、前記第２機能結合フラグメントは、ＩＦＮ－α又はＩＦＮ－β又はＩＦＮ－γ又はＩＬ－１０単量体突然変異体又はＩＬ－１２Ａ又はＩＬ－１５とＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩで形成される融合タンパク質又は上記サイトカインのトランケーション又はサイトカインの機能を維持する突然変異体を含む。好ましくは、対応サイトカイン受容体に対する当該突然変異体の活性は、野生型サイトカインと対応サイトカイン受容体との結合親和性より高くない。より好ましくは、前記第２機能結合フラグメントに含まれるサイトカインは、配列番号５１、又は配列番号５２、又は配列番号５３及び配列番号５４で形成される融合タンパク質である。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、抗ＣＤ２０抗体オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、又は抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、又は抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、又は抗ＣＤ２４抗体ＳＷＡ１１の抗原結合フラグメントであり、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン（配列番号５０に示される通りであり）である。
一つの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは抗α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂの抗原結合フラグメントを含み、前記第２機能結合フラグメントはヒトＩＦＮ－α ２ｂ又はヒトＩＦＮβ（配列番号５５）である。
一つの実施形態において、前記二重特異性組換えタンパク質のＡ鎖及びＢ鎖は、ＩｇＧ Ｆｃを介して結合され、好ましくは、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓを介して結合される。例えば、前記ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓは、Ｔ３６６Ｗ突然変異によって形成される突出された「ｋｎｏｂｓ」型と、一つのアミノ酸突然変異（Ｙ４０７Ｖ）によって形成される凹んだ「ｈｏｌｅｓ」型又は三つのアミノ酸突然変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ）によって形成される凹んだ「ｈｏｌｅｓ」型である。突然変異は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム［Ｅｕ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｏｆ Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１）］に従って、左から右に元のアミノ酸残基、突然変異部位及び置換アミノ酸残基としてそれぞれ表示され、例えば、Ｔ３６６Ｗにおいて、Ｔは、元のアミノ酸残基で、３６６は、突然変異部位で、Ｗは、Ｔを置換するアミノ酸残基である。
いくつかの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２４又はＥＧＦＲをターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体を含み、好ましくは、前記第２機能結合フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号５０に示される通りであり、より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２又は３に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６２に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２７に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２８に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２９に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３０に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５６に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５７に示される通りである。
いくつかの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ８０又はＰＤ－１をターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ－１０単量体突然変異体、ＩＬ１５とＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩ複合体を含み、そのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１、５２、５３～５４に示される通りであり、より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３６に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３７に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３９に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号４０又は４１に示される通りである。
いくつかの実施形態において、前記第１機能結合フラグメントは、ＣＤ３８又はＡＦＰをターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体、又はＩＦＮ－β又はその突然変異体を含み、好ましくは、前記第２機能結合フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号５０又は５５に示される通りであり、より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３２に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３３に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３４に示される通りであり、又は、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５８に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６０で示される。
他の実施態様において、本発明は、前記二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子を提供し、ここで、前記第１機能結合フラグメントをコードする核酸分子は、第２機能結合フラグメントをコードする核酸と同じＤＮＡ鎖にあるか、又は前記第１機能結合フラグメントをコードする核酸分子は、第２機能結合フラグメントをコードする核酸と異なるＤＮＡ鎖にある。
好ましくは、前記Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、前記第１機能結合フラグメント又は第２機能結合フラグメントをコードする核酸と同じＤＮＡ鎖にあり、前記Ｆｃ領域をコードする核酸分子は、前記第１機能結合フラグメント又は第２機能結合フラグメントをコードする核酸と異なるＤＮＡ鎖にある。
他の実施態様において、本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
他の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
他の実施態様において、本発明はまた、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を使用して、発現に適した条件で上記宿主細胞を培養し、発現させて前記二重特異性組換えタンパク質を得る、前記二重特異性組換えタンパク質の製造方法を提供する。
他の実施態様において、本発明は、腫瘍、自己免疫性疾病、感染疾病、敗血症、移植片対宿主病、代謝障害、内分泌障害を治療するための医薬の製造における、二重特異性組換えタンパク質の使用を提供する。
一の実施態様において、前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり、好ましくは、前記固形腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫又は骨髄異形成症候群などから選択され、前記血液腫瘍は、骨髄腫、リンパ腫又は白血病から選択され、好ましくは、前記自己免疫性疾病は、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群のいずれか１つから選択され、好ましくは、前記感染疾病は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、その他の病原性感染症のいずれか１つから選択される。
更に別の実施態様において、本発明はまた、本発明の二重特異性組換えタンパク質及び選択的にアジュバント、賦形剤又は薬学的に許容されるベクターを含む、医薬又は薬物組成物を提供する。前記医薬組成物は、薬学的に許容されるベクターを含むことができる。前記組成物は、注射剤、散剤、凍結乾燥散剤などを含むがこれに限定されない任意形態の薬物製剤として存在することができる。当該薬物製剤形態の薬物組成物は、医薬活性成分、本発明の二重特異性組換えタンパク質又は融合タンパク質を薬物ベクターと融合して、製剤の従来の技術に従って製造するなどの、従来の製剤技術に従って所望の剤形に製造される。
一実施形態において、本発明はまた、本発明の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子の発現ベクターと任意の薬学的に許容されるベクターを含む、医薬組成物を提供する。
他の実施態様において、本発明はまた、患者又は対象者に治療有効量の本発明に記載の薬物組成物を投与するステップを含む腫瘍の治療方法を提供する。前記腫瘍は、追加の標的分子を発現し、前記標的は、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９８、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ－３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＴＲＯＰ２、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＣＤ１５５又はＡＦＰを含むが、これに限定されない。
更に別の実施態様において、本発明はまた、患者又は実験対象者に治療有効量の本発明の組換えタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子又はその誘導体を導入するステップを含む体内遺伝子治療方法を提供する。
本明細書で使用される用語「組換えタンパク質」とは、天然に存在するタンパク質ではなく、人工的に設計／構築されたタンパク質を指す。本発明の「組換えタンパク質」における「組換え」は、その製造方法を表すものではなく、「組換えタンパク質」が天然に存在しないことを示すためにのみ使用される。本発明の組換えタンパク質は、発現されたタンパク質又は組み立てられたタンパク質であってもよい。
本明細書で使用される用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる、同一の構造特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合で重鎖に連結され、重鎖間のジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。各重鎖及び軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合を持つ。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域がある。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）、他端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域の間に界面を形成する。
本明細書で使用される用語「抗原結合フラグメント」又は「ｆａｂフラグメント」又は「ｆａｂ」は、軽鎖の可変領域（ＶＬ）、軽鎖の定常領域（ＣＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ）、重鎖の定常領域１（ＣＬ１）ドメインから構成され、抗原に結合できる。前記抗原結合フラグメント中の可変領域と定常領域が直接に連結されるか、又はリンカー配列Ｌｉｎｋｅｒを介して連結することを言及する場合、前記定常領域は、軽鎖の定常領域（ＣＬ）又は重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を指す。
本明細書で使用される用語「第１機能抗原」又は「標的抗原」は、第１機能結合フラグメントに結合した抗原を指す。
本明細書で使用される用語「第２機能抗原」」は、第２機能結合フラグメントに結合したタンパク質を指す。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）は、ＩｇＧ定常領域ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域で構成される。
本明細書で使用される場合、用語「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ技術」又は「杵臼」技術又は「突起－入り－空洞」技術又は「ボタン」技術は、遺伝子工学技術を使用して、重鎖の二つのＣＨ３ドメインに異なる突然変異を導入して、重鎖のヘテロ二量体化を引き起こし、一つの重鎖に一つのノブ（ｋｎｏｂ）を作り、他方の重鎖にホール（ｈｏｌｅ）を作り、その後二つが優先的に咬合して、非対称抗体を形成する（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．’Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６，９（７）：６１７－６２１）。当業者に知られているように、一つの重鎖に複数のノブ（ｋｎｏｂ）及び／又はホール（ｈｏｌｅ）を作りことができ、対応的に、他方の重鎖に複数のホール（ｈｏｌｅ）及び／又はノブ（ｋｎｏｂ）を作ることができる。
本明細書で使用される用語「突然変異体」は、野生型機能タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する機能性タンパク質又は機能フラグメントを指し、例えば、機能性タンパク質又は機能フラグメントに１つ又は複数のアミノ酸の挿入、欠落又は置換することによって形成される新規な機能タンパク質又は機能フラグメントである。本明細書に記載の二重特異性組換えタンパク質における前記第２機能結合フラグメントの突然変異体は、対応する第２機能抗原に対する結合親和性が、当該二重特異性組換えタンパク質の第１機能結合フラグメントと第１機能抗原結合の結合親和性よりも低い突然変異体を指す。
本明細書で使用される用語「置換」とは、アミノ酸残基に使用される場合、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質において、１つ又は複数の天然に存在する又は導入されたアミノ酸が別のアミノ酸で置換されて、新規なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を形成することを指す。ポリペプチド又はタンパク質における置換は、ポリペプチド又はタンパク質の機能の増強、低下又は不変をもたらす可能性がある。置換は「保存的置換」であってもよく、アミノ酸配列に対しては、１つのアミノ酸残基を類似の物理化学的特性を持つ側鎖の異なる他のアミノ酸残基で置換されることを指し、又はポリペプチドの活性に重要ではないアミノ酸に置換されることを指す。例えば、非極性側鎖アミノ酸残基間（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、非荷電極性側鎖残基間（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＧｌｎ）、酸性側鎖残基間（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖アミノ酸間（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、β分岐側鎖アミノ酸間（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）、硫黄含有側鎖アミノ酸間（例えば、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）又は芳香族側鎖残基間（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＰｈｅ）で保存的置換を実行することができる。いくつかの実施形態において、置換、削除又は添加も「保存的置換」と見なすことができる。挿入又は削除されるアミノ酸の数は、約１～５の範囲であってもよい。保存的置換は一般に、タンパク質のコンホメーション構造に大きな変化を引き起こさず、タンパク質の生物学的活性を維持することができる。
本明細書で使用される用語「二重陽性発現細胞」又は「標的細胞」又は「標的ターゲット細胞」とは、第１機能結合フラグメント及び第２機能結合フラグメントと同時に相互作用することができる細胞を指す。
本明細書で使用される用語「第２機能抗原単陽細胞」又は「非標的細胞」又は「非標的ターゲット細胞」とは、第１機能結合フラグメントと相互作用せず、第２機能結合フラグメントとのみ相互作用する細胞を指す。
本明細書で使用される用語「ＳＩＲＰα」は、シグナル調節タンパク質α（Ｓｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ α）であり、ＣＤ１７２ａとも称される。シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）は、三つのファミリーメンバ、ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）、ＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）を含む膜貫通糖タンパク質である。これらの三つのメンバーは、外膜の端が似ているが、内膜の領域が異なる。膜の外端には三つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様領域が含まれ、その第１領域はＩｇＶ領域に属し、第２と第３領域はＩｇＣ領域に属する。ＳＩＲＰα（ＣＤ１７２ａ）の膜内領域には、阻害シグナルを伝達し、細胞の対応する機能を阻害する二つの阻害シグナルドメインが含まれる。ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）及びＳＩＲＰγ（ＣＤ１７２ｇ）の細胞内領域は短く、シグナル伝達領域はないが、ＳＩＲＰβ（ＣＤ１７２ｂ）はアダプタータンパク質（Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＡＰ１２など）を介して活性化シグナルを伝達することができる。ＳＩＲＰタンパク質は、主にマクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及び神経細胞で発現する。本明細書は、特に、ヒトＳＩＲＰα野生型とそのＣＤ４７非高親和性変異体を指す。
本明細書で使用される用語「Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３」とは、タンパク質のアミノ基端から順次に、Ｄ１ドメイン（Ｉｇ可変領域様ドメイン、ＩｇＶ領域）、Ｄ２ドメイン（Ｉｇ定常領域様ドメイン、ＩｇＣ領域）及びＤ３ドメイン（Ｉｇ定常領域様ドメイン、ＩｇＣ領域）であるＳＩＲＰα細胞外の三つのＩｇ様ドメインを指す（Ｌｅｅ ＷＹ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｉｓ Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆＳｉｇｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎα（ＳＩＲＰα）ｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ４７．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，２８５（４９）：３７９５３－３７９６３）。
本明細書で使用される用語「ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質」は、ＳＩＲＰα細胞外トランケーション、リンカー配列及びＦｃ領域を含む融合タンパク質を指す。前記配列に含まれるリンカー配列及び／又はＦｃ領域は、当業者に周知の方法又は従来のリンカー配列及び／又はＦｃ領域に従って任意に置換することができる。
本明細書で使用される用語“「ＩＦＮα」又は「ＩＦＮ－α」、即ち「α型インターフェロン（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）」又は「インターフェロンα」は、すべての天然又は組み換えα型インターフェロンを含み、Ｉ型インターフェロンのメンバーであり、ＩＦＮ－α１ａ、ＩＦＮ－α１ｂ、ＩＦＮ－α ２ａ、ＩＦＮ－α ２ｂ、ＩＦＮ－α４ａ、ＩＦＮ－α４ｂ、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７及びＩＦＮ－α２１などの１３個のサブタイプを含む。本発明において、用語「ＩＦＮα」はまた、ＩＦＮαのＰＥＧ誘導体（ＰＥＧ－ＩＦＮα）などの突然変異又は修飾されたＩＦＮαなど、ＩＦＮαの生物学的活性を有する任意の物質を含む。本発明において、用語「ＩＦＮα」は、いかなる特定の取得源にも限定されず、市販により取得するか又は当業者に公知の通常の技術によって製造されることができ、当該製造方法は、生物源抽出法及び遺伝子工学的抽出法などを含むが、これらに限定されず、その詳しい記載はＰｅｓｔｋａ Ｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８３ Ｆｅｂ １５；２２１（１）：１－３７などである。いくつかの実施形態において、ＩＦＮαは、ヒト、ウマ、ウシ、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ラット、ヤギ、ヒツジ及び非ヒト霊長類から選択される。特に好ましくは、ヒトα型インターフェロンである。
本明細書で使用される用語「ＩＦＮα ２ｂ」又は「ＩＦＮ－α ２ｂ」又は「ＩＦＮα ２ｂ」又は「インターフェロンα ２ｂ」又は「インターフェロン－α ２ｂ」は、ＩＦＮ－αのサブタイプであり、いずれもインターフェロン－α ２ｂに対する表現である。
本明細書で使用する用語「ＩＦＮ－γ」即ちγ－インターフェロン（インターフェロン－γ）は、水溶性二量体サイトカインであり、ＩＩ型インターフェロンの唯一のメンバーであり、６つのαヘリックスからなる一つのコアとC末端領域に拡張断片配列を構成し、常に二つの逆平行に互いにロックされた単体でホモ二量体を形成して生物活性を発揮する。
本明細書で使用される用語「ＩＦＮ－β」又は「ＩＦＮβ」、即ちβ－インターフェロン（β－インターフェロン、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－β）は、ヒト線維芽細胞インターフェロンに属し、Ｉ型インターフェロンの一種でもあり、線維芽細胞などの多くの細胞が、ウイルス、核酸など誘導された後に産生され、ＩＦＮαと同じインターフェロン受容体に結合し、同様の生物学的効果を有する。
本明細書で使用される用語「ＩＦＮ－γ融合タンパク質」は、ＩＦＮ－γトランケーション又はＩＦＮ－γ突然変異体、リンカー配列及びＦｃ領域を含む融合タンパク質を指す。前記配列に含まれるリンカー配列及び／又はＦｃ領域は、当業者に周知の方法又は従来のリンカー配列及び／又はＦｃ領域に従って任意に置換されることができる。
本明細書で使用される用語「ＩＬ－１０」又は「ＩＬ１０」は、インターロイキン１０を指し、「ＩＬ－１０Ｍ」又は「ＩＬ１０Ｍ」は、ホモ二量体を形成せずに下流シグナル伝達経路を活性化するＩＬ１０単量体突然変異体を指す（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ， Ｋ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｍｏｎｏｍｅｒ．［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ２７５（１８）：１３５５２－７．）。
本明細書で使用される用語「ＩＬ－１２」又は「ＩＬ１２」は、インターロイキン１２、α鎖（ｐ３５サブユニット、ＩＬ－１２ｐ３５）及びβ鎖（ｐ４０サブユニット、ＩＬ－１２ｐ４０）から構成されるヘテロ二量体分子を指し、前記鎖はジスルフィド結合によって共有結合されて、生物学的に活性な７４ｋＤａのヘテロ二量体を形成する。本明細書で使用される用語「ＩＬ１２Ａ」又は「ＩＬ－１２Ａ」は、ＩＬ－１２のα鎖を指す。
本明細書で使用される用語「ＩＬ－１５」又は「ＩＬ１５」は、インターロイキン１５を指し、ＮＫ、ＮＫＴ細胞及びＣＤ８メモリーＴリンパ球の活性における重要なサイトカインであり、α、β及びγと称される３つのサブユニットからなる受容体を介して作用し、その中でαサブユニットはＩＬ１５受容体に特有である。本明細書で使用される用語「ＩＬ－１５Ｒα ＳＵＳＨＩ」又は「ＩＬ１５Ｒα ＳＵＳＨＩ」は、ＩＬ－１５受容体のα鎖上のＳＵＳＨＩ構造ドメインを指し、当技術分野の通常の意味を有する。前記ＳＵＳＨＩ構造ドメインは、ＩＬ１５の下流シグナル伝達経路の活性化に影響を与える。
本明細書で使用される用語「ＩＬ－１５及びＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩで形成される複合体」は、ＩＬ１５とＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩで形成される融合タンパク質、又はＩＬ１５とＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩがイオン結合、共有結合、ファンデルワールス力などの様々な物理的又は化学的方法により結合したタンパク質の組み合わせを含む。
本明細書で使用される用語「リンカー配列」又は「Ｌｉｎｋｅｒ」は、異なる機能結合フラグメント（例えば、第１機能結合フラグメント及び２機能結合フラグメント、第１機能結合フラグメント又は第２機能結合フラグメント及びＦｃ領域）を連結すること、又は同じ機能結合フラグメント内の異なる構造ドメインのアミノ酸配列を連結する。
本明細書で使用される用語「Ｏｆａ」、「Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ」、「Ａｎｔｉ－ＣＤ２０（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）」は、本発明において交換的に使用することができ、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂを表す。
本明細書で使用される用語「ＧＣ３３」、「Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ」は、本発明において交換的に使用することができ、抗ＧＰＣ３抗体Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂを表す。
本明細書で使用される用語「アテゾリズマブ」、「Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ」は、本発明において交換的に使用することができ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを表す。
本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、一般に、対象からのプラスミド又はベクターのレシピエントであってもよいか、又はある単細胞、細胞株又は細胞培養物を含み、それは本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むか、又は本願のタンパク質ヘテロ二量体を発現する（例えば、ヘテロ二量体のタンパク質）。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むことができる。自然、偶発的又は意図的な突然変異により、子孫は必ずしも元の親細胞と同一（形態的又はゲノムの全ＤＮＡ相補体において）であるとは限らない。宿主細胞は、本明細書に開示されるベクターで体外でトランスフェクトされた細胞を含むことができる。宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞又はＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞又は骨髄腫細胞などの他の真核細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、一般に、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び／又は宿主細胞間で伝達する、適切な宿主内で自己複製できる核酸分子を指す。当該用語は、主に細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入に使用されるベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に使用されるベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に使用される発現ベクターを含むことができる。また、上記機能の複数を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると、ポリペプチドに転写及び翻訳されてもよいポリヌクレオチドである。「発現系」は、一般に、所望の発現量を生成することができる発現ベクターを含む、適切な宿主細胞を意味する。
本明細書で使用される用語「細胞増殖」又は「増殖」は、一般に、分裂によって細胞の数が変化する現象を指す。例えば、細胞増殖は、細胞数の増加をもたらす可能性がある。当該用語には、増殖シグナルと一致する、細胞形態が変化した（例えば、サイズの増加）細胞増殖も含まれる。
本明細書で使用される用語「増殖阻害」又は「細胞増殖の阻害」は、一般に、癌細胞の増殖速度及び／又は増殖速度の低下を指す。例えば、これは癌細胞の死（例えば、アポトーシスによる）を含むことができる。いくつかの実施形態において、当該用語は、固形腫瘍の成長及び／又は増殖を阻害すること、及び／又は腫瘍のサイズの縮小又は除去を誘導することも指してもよい。
本明細書で使用される用語「治療」、「治療方法」及び「治癒」は、交換的に使用することができる。用語「治療」は、疾患、病症、病状及び関連する症状の進行を制御すること、好ましくは、疾患、病症、病状を低減し又は疾患、病症、病状の一つ又は複数の症状の影響を緩和することを含む。この用語は、疾患の治癒又は症状の完全な除去を含む。この用語は、症状の緩和を含む。この用語は、非治癒の緩和治療も含むが、これに限定されない。用語「治療する」は、疾患、病症、病状の進行、又は疾患、病症、病状の一つ又は複数の症状の影響を予防又は遅延、低減又は緩和するために、本発明の組換えタンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者に投与することを含む。
本明細書で使用される用語「投与」は、本発明の組換えタンパク質又は融合タンパク質を含む医薬組成物の治療有効量を実験対象者へ送達することを指す。投与は、全身的投与又は局所的投与であってもよい。投与は、注射器などの投与装置によることができる。投与方法は、埋め込み、経鼻吸入、噴霧、注射などを含むが、これらに限定されない。投与経路は、吸入、鼻腔内、経口、静脈内、皮下又は筋肉内投与などを含む。
従来技術と比較して、本発明は下記に示されるような有益な効果を有する：
本発明は、二重特異的組換えタンパクの標的抗原をターゲットとする第一機能結合フラグメントの抗原結合フラグメント（ｆａｂセグメント）におけるＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端を免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンド又はサイトカイン受容体をターゲットとする第２機能結合フラグメントに直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されるとともに、第２機能結合フラグメントのＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、二重特異的組換えタンパクを製造する際に非標的細胞免疫チェックポイント、又は免疫チェックポイントリガンド、又はサイトカイン受容体をターゲットとすることができる第２機能結合フラグメント単体又はホモ二量体又はホモ多量体構造を産生する不純物を減らして、発酵産物中の製品関連組換えタンパク質混合物の不純物（潜在的なリスクのある不純物）による潜在的な関連安全性リスクを意外に低減させ、組換えタンパク質の製造の利便性を高める。
本発明は、二重特異的組換えタンパクの標的抗原をターゲットとする第一機能結合フラグメントの抗原結合フラグメント（ｆａｂセグメント）におけるＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端を免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンド又はサイトカイン受容体をターゲットとする第２機能結合フラグメントに直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されるとともに、第２機能結合フラグメントのＣ末端をＦｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、予想外に、２つの標的の安全性と有効性のバランスを取り、調節し、空間コンフォメーション制限等のメカニズムにより、二重特有組み換えタンパク質と免疫チェックポイント、又は免疫チェックポイントリガンド、又はサイトカイン受容体の単一陽性を高発現する非標的ターゲット細胞又はサイトカイン受容体（第二機能抗原）との結合を著しく減少させ、二重特異的組換えタンパク質のターゲティングを高め、一般的な対称又は非対称の二重抗構造非標的ターゲット細胞のターゲティング結合による潜在的サイトカインストームなどの免疫関連毒副作用を低下させ、薬物の安全性を高める。予想外に、二重特異性組換えタンパク質の第１機能結合フラグメントが標的ターゲット細胞（二重陽性発現細胞）において効果的又は優れているように維持しながら、二重特異性組換えタンパク質は、第２機能結合フラグメント／ホモ二量体／ホモ多量体を含むモノマーに比べて、第２機能抗原単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞）との結合が有意に減少するか又は結合しないが、同時に、二重特異的組換えタンパク質と二重陽性発現細胞（即ち、標的ターゲット細胞）上の第二機能抗原との相互作用は、意外的に第二機能結合フラグメント単体／ホモ二量体／多量体よりも弱くはないか、又は有意に強く、即ち、本発明の二重特異的組換えタンパク質技術は、第２機能結合フラグメントと非標的ターゲット細胞の第２機能抗原を結合することによる毒性副作用を有意に低減させると同時に、第２機能結合フラグメントと標的ターゲット細胞の第２機能抗原の結合効果を強化させて、標的細胞に対する第２機能結合フラグメントの効果を有意に高めることができる。例えば、第２機能結合フラグメントとしてＳＩＲＰα細胞外トランケーション又は非高親和性突然変異体を選択する場合、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、ＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＴＴＩ－６２１）と比較して、それと赤血球又は血小板などのＣＤ４７単一陽性非標的ターゲット細胞の効果を有意に減少させるが、同時に、本発明の二重特異性組換えタンパク質はＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＴＴＩ－６２１）と比較して、二重陽性発現細胞（標的ターゲット細胞）との相互作用を有意に改善することができ、標的細胞に対する免疫細胞（例えば、マクロファージ）の殺傷効果を有意に改善し、同時に、標的ターゲット細胞の競合結合能力はＳＩＲＰα－Ｆｃ融合タンパク質よりも有意に強い。
また、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、一部の免疫調節機能を有する融合タンパク質の凍結融解安定性を改善することもでき、例えば、第２機能結合フラグメントがＩＦＮ－α ２ｂ又はその突然変異体である場合、凍結融解を５回繰り返した後、純度はいずれも９５％以上であり、外観は透明で、凍結融解安定性はＩＦＮ－α ２ｂモノマー又はＰＥＧ化ＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に優れている。
本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造は高い拡張性を有し、スクリーニング設計が簡単であり、その第１機能結合フラグメントは様々な抗体配列から選択することができ、第２機能結合フラグメントは、サイトカイン、免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンドタンパク質及びそのトランケーション又は突然変異体から選択され、通常の抗体薬物スクリーニングにかかる時間を有意に低減させ、薬物スクリーニング効率を高め、スクリーニングコストを低減させる。任意選択で、第２機能結合フラグメントは、サイトカイン及び／又は免疫チェックポイント結合タンパク質及び／又は免疫チェックポイントリガンド結合タンパク質又はそのトランケーションから選択されることができ、好ましくは、第２機能結合フラグメントは、内因性サイトカイン及び／又は免疫チェックポイント結合タンパク質及び／又は免疫チェックポイントリガンド結合タンパク質又はそのトランケーションにより、潜在的な免疫原性が低下させさせることができる。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
〔図２〕本発明の実施例２のプロテインＡによる精製後の二重特異性組換えタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
〔図３〕本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャ後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
〔図４〕本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャ後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
〔図５〕本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質の精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
〔図６〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の二重特異性組換えタンパク質とＣＤ２０単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０）の結合曲線である。
〔図７Ａ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ４７単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＨＥＫ２９３細胞）の結合曲線である。
〔図７Ｂ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ４７単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）の結合曲線である。
〔図８〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２０であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ２０／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）の結合曲線である。
〔図９Ａ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２０であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質、対応する潜在リスク不純物タンパク質及び対照試料のＣＤ２０／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）における競合的結合曲線である。
〔図９Ｂ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＥｐＣＡＭであり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＥｐＣＡＭ／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、ＣＡＰＡＮ－２細胞）における競合的結合曲線である。
〔図９Ｃ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２４であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＣＤ２４／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、ＭＣＦ－７細胞）における競合的結合曲線である。
〔図９Ｄ〕本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ３８であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＣＤ３８／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）における競合的結合曲線である。
〔図１０〕フローサイトメトリーによって決定された本発明の実施例４の第１機能抗原がＧＰＣ３であり、且つ第２機能結合タンパク質がＩＦＮ－α ２ｂである二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の標的ターゲット細胞ＨｅｐＧ２肝癌細胞における結合活性曲線である。
〔図１１〕フローサイトメトリーによって決定された本発明の実施例４の第１機能抗原がＧＰＣ３であり、且つ第２機能結合タンパク質がＩＦＮ－α ２ｂである二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７における結合活性ヒストグラムである。
〔図１２〕ＬＤＨ法によって決定された本発明の実施例５の標的細胞ＨｅｐＧ２における二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性曲線である。
〔図１３〕本発明の実施例６における標的細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１４〕ＧＰＣ３陽性標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する本発明の実施例６のＧＰＣ３抗原標的機能を有する二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の阻害活性曲線である。
〔図１５〕ＰＤ－Ｌ１陽性の標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例７の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１６〕抗ＰＤ－Ｌ１抗体閉鎖後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例７の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１７Ａ〕ＣＤ３８陽性の標的ターゲット細胞Ｄａｕｄｉの増殖に対する本発明の実施例８の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１７Ｂ〕ＣＤ３８陰性の非標的ターゲット細胞ＳＫ－ＢＲ３の増殖に対する本発明の実施例８の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１８〕ＧＰＣ３陽性の標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図１９〕ＧＰＣ３陰性の標的ターゲット細胞ＳＷ４８０の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図２０〕ＧＰＣ３陰性の標的ターゲット細胞Ｕ２６６の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。
〔図２１〕ＧＰＣ３陰性の非標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例１０の二重特異性組換えタンパク質潜在的リスク不純物の阻害活性曲線である。
〔図２２〕抗ＴＩＧＩＴ抗体閉鎖後のＴＩＧＩＴ陽性標的ターゲット細胞Ｈ＿ＩＬ１２ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２９３に対する本発明の実施例１１の二重特異性組換えタンパク質の結合活性曲線である。
〔図２３〕ＴＨＰ１細胞Ｐ－ＳＴＡＴ３活性化レベルに対する本発明の実施例１２の二重特異性組換えタンパク質の検出結果である。
〔図２４〕ＯＫＴ３で４８時間刺激した後のＰＤ－１陽性のｈＰＢＭＣに対する本発明の実施例１３の二重特異性組換えタンパク質の増殖活性検出結果である。
〔図２５〕ＰＤ－１陰性の非標的ターゲット細胞Ｍ－０７ｅに対する本発明の実施例１３の二重特異性組換えタンパク質の増殖活性検出結果である。
〔発明を実施するための形態〕
実施例１ 発現ベクターの構築
二重特異性組換えタンパク質は、ＧＥＮＥＷＩＺ社によってタンパク質配列に従ってコドン最適化を行った後、直接合成され、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに挿入され、配列決定によって確認された。上記の異なる発現プラスミドを混合し、対にして発現細胞をトランスフェクトし、二重特異性組換えタンパク質又は対照試料（表１を参照）を得た。その後の実験材料は、この一連のプラスミドでトランスフェクトされた発現細胞から抽出して得た。
上記の表１において、二重特異性組換えタンパク質の第１機能結合フラグメントは、それがターゲットとする標的抗原、即ち第１機能抗原によって特徴付けられ、（Ｈ）は重鎖ＶＨ及びＣＨ１からなる構造ドメインを指し、（Ｌ）は軽鎖ＶＬ及びＣＬからなる構造ドメインを指し、Ｄ１はヒトＳＩＲＰα野生型及びその突然変異体の細胞外Ｄ１ドメインを表し、Ｆｃは野生型Ｆｃ領域を表し、Ｆｃ１はｈｏｌｅ又はｈｏｌｅｓ突然変異を有するＦｃ領域を表し、Ｆｃ２はｋｎｏｂ又はｋｎｏｂｓ突然変異を有するＦｃ領域を表す。前記配列名称に対応する配列番号は表２に示された通りである。ここで、シグナルペプチドの配列は配列番号４９に示される通りである。Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂのアミノ酸配列は特許ＵＳ７９１９０８６から引用され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号１９に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２０に示される通りである。Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのアミノ酸配列は特許ＵＳ２０１００２０３０５６から引用され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２に示される通りである。Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂのアミノ酸配列の重鎖のアミノ酸配列は配列番号６１に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号６２に示される通りである。Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は特許ＷＯ１９９４０１７１５から引用される。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂ１１７９０１）は、Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ社から購入したものである。組換え発現ＩＦＮ－α ２ｂタンパク質（Ｚ０３００３）は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ社から購入したものである。ＩＬ１０Ｍ－ＦｃのＩＬ１０は、単量体突然変異体を使用し、対応する配列は下記の文献を参照する（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ， Ｋ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ｍｏｎｏｍｅｒ．［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ２７５（１８）：１３５５２－７．）。ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩ－Ｆｃ（Ｃ１５Ｙ）は、ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎから購入したものである。
表１において、ＩＦＮα ２ｂは、本発明の二重特異性組換えタンパク質におけるＩＦＮαに対する第２機能結合フラグメントの設計を説明するために、ヒトＩＦＮ－α ２ｂ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＡＡＰ２００９９．１）を使用した。ＩＦＮαファミリーには１５個のサブタイプがあり、異なるサブタイプの構造は似ており、配列の相同性が高く（８０～９９％）、同じＩＦＮ受容体に結合し、いずれも抗ウイルス、増殖阻害、抗腫瘍及び免疫調節の機能を有している。ＩＦＮ－α ２ｂによって得られる技術的効果に関しては、ＩＦＮ－αの他のサブタイプが同じ技術的効果を達成することができ（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（２０１３） １６８ １０４８－１０５８）、本発明ではここで繰り返さないこととする。ＩＦＮ－βとＩＦＮ－α ２ｂは同じインターフェロン受容体を有し、且ついずれもＩ型インターフェロンであり、類似的な生物学的効果を有するため、同じ技術的効果を達成することもできる。
本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造は図１に示された通りであり、前記二重特異性組換えタンパク質の標的抗原をターゲットとする第１機能結合フラグメントは、抗原結合フラグメントを含み、その中で、抗原結合フラグメントのＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンド又はサイトカイン受容体をターゲットとする第２機能結合フラグメントと直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結さた。第１機能結合フラグメントの抗原結合フラグメントにおける可変領域（Ｖ領域）及び定常領域（Ｃ領域）が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は前記抗原結合フラグメントとＦｃ領域が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は上記の２つの方法を同時に使用して連結された。第１機能結合フラグメントの軽鎖ＶＬ又は重鎖ＶＨは、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓによって第２機能結合フラグメントと結合された。前記第１機能結合フラグメントの軽鎖ＶＬ又は重鎖ＶＨ又は第２機能結合フラグメントは、前記Ｆｃ領域に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結された。例えば、図１において、ａ、ｅは、第１機能結合フラグメントの抗原結合フラグメントのＣＬ構造ドメインのＣ末端と第２機能結合フラグメントが直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されることを表し、ｂ、ｆは、第１機能結合フラグメントの抗原結合フラグメントのＣＨ１構造ドメインのＣ末端と第２機能結合フラグメントが直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されることを表し、ｃ、ｇ、ｊ、ｋは、第１機能結合フラグメントの抗原結合フラグメントのＣＬ構造ドメインのＣ末端と第２機能結合フラグメントが直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、且つＦｃ領域がｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓを介して結合されることを表し、ｄ、ｈ、ｉ、ｌは、第１機能結合フラグメントの抗原結合フラグメントのＣＨ１構造ドメインのＣ末端と第２機能結合フラグメントが直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、且つＦｃ領域がｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓを介して結合していることを表す。
実施例２ 発現プラスミドの製造、細胞トランスフェクション及び標的タンパク質の発現、精製
１．発現プラスミドの製造
発現プラスミドを含むグリセロール細菌（発現プラスミドを含む１ｍＬの大腸菌液に０．５ｍＬの６０％滅菌グリセロール溶液を加え、十分に混ぜる）を、液体ＬＢ培地に１：１０００の比率で接種した。３７℃、２２０ｒｐｍのシェーカーで１６時間振とうした後、遠心分離してバクテリアを収集した。発現プラスミドは、エンドトキシンを含まないプラスミドキット（ＤＰ１１７、Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して、キットの説明書に提供された標準手順に従って、抽出することにより得た。
２．細胞トランスフェクション、タンパク質の発現
下記の方法は、ＬＣＢ－００１を例として、第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質に適用できる。
得られた発現プラスミドを０．２２μｍのフィルターで濾過した後、３ｍｇのプラスミド（ここで、二重特異性組換えタンパク質、そのＡ鎖及びＢ鎖発現プラスミドの比率は１：１（モル比））を吸引し、５０ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）に加えて均一に混合した。６ｍｇのトランスフェクション試薬ポリエーテルイミド（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｉｍｉｄｅ、ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、１ｍｇ／ｍＬの濃度で滅菌超純水に溶解）を吸引し、５０ｍＬのＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに加え、均一に混合した。得られたＰＥＩ溶液をプラスミドを含むＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ溶液に加え、均一に混合した。室温で１５分間放置した後、プラスミドとＰＥＩの混合物を、１Ｌの体積と３×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞ＣＨＯ－Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の懸濁液にゆっくりと均一に加え、３７℃に置き、５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。４時間後、初期容量の７％に相当するフィード培地（当該フィード培地は、水１リットルあたりに８０ｇのＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ｃ ＡＧＴ（Ｇｉｂｃｏから購入）、７５ｇの５×００４８３（Ｋｅｒｒｙ）を溶解させた）を加えた。培養温度を３３℃に下げ、６日間の培養後に収穫した。細胞懸濁液を１０℃で１００００ｇで３０分間遠心分離し、遠心分離によって得られた上清、即ち細胞培養回収溶液を標的タンパク質の精製に使用した。
下記の方法は、ＬＣＢ－００９を例として、第２機能抗原のＣＤ４７以外の二重特異性組換えタンパク質に適用できる。
得られた発現プラスミドを０．２２μｍのフィルターで濾過した後、５０μｇのプラスミド（ここで、Ａ鎖及びＢ鎖発現プラスミドの質量比は２：１又は３：１）を吸引し、２ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ）に加えて均一に混合した。１６０μＬのトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔを吸引し、２ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ Ｍｅｄｉｕｍに加えて均一に混合した。得られたトランスフェクション試薬混合溶液をプラスミドを含む混合溶液に加えて均一に混合した。プラスミドとトランスフェクション試薬の混合物を５０ｍＬの体積と６×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の懸濁液にゆっくりと均一に加え、３７℃、８％のＣＯ２インキュベーターでで培養した。１日目（１８～２２時間後）３００μＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒと８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを加え、培養温度を３２℃に冷却させ、５日目に、８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄ２回目のフィードを加え、１２日間培養した後収穫した。細胞懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、遠心分離によって得られた上清、即ち細胞培養回収溶液を標的タンパク質の精製に使用した。
３．タンパク質の精製
１）試料キャプチャー（タンパク質Ａアフィニティーキャプチャー）
下記の方法では、ＬＣＢ－００１を例とし、当該方法は本発明のすべての二重特異性組換えタンパク質に適用できる。
前記ＬＣＢ－００１細胞培養回収液を１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、細胞とその断片を除去した後、プロテインＡアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、溶出によって標的タンパク質を回収した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
プロテインＡ精製方法は、当業者に周知の従来のタンパク質精製方法であり、具体的な試験方法は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅプロテインＡ製品取扱説明書及びＧＥ抗体精製マニュアルを参照することができる。
２）試料の精製
下記の方法では、ＬＣＢ－００９を例として、二重特異性組換えタンパク質の精製ステップを説明しているが、タンパク質Ａアフィニティーキャプチャー後大量の凝集体を含む二重特異性組換えタンパク質に適している。
二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００９の発現上清は、ＳＵＬＦＡＴＥ ６５０Ｆパッキング（ＴＯＳＯＨ）を使用して、試料内の凝集体及びその他の不純物を除去し、実験プロセスは下記の通りである。
ａ）平衡化：平衡溶液（５０ｍＭのＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ５．５）を使用し、ＵＶ検出ラインが安定するまでクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
ｂ）試料ローディング：試料ポンプで試料をローディングし、保持時間は５分、負荷量≦５０ｍｇ／ｍＬであり、
ｃ）再平衡化：平衡溶液（５０ｍＭのＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ５．５）を使用し、５カラム体積でクロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（５０ｍＭのＮａＡＣ－ＨＡＣ、２５０Ｍｍ、ｐＨ５．５）を使用して、標的タンパク質を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
表１の対照試料の精製工程は、１）試料キャプチャー（タンパク質Ａアフィニティーキャプチャー）の操作ステップを参照して得た。
精製された二重特異性組換えタンパク質、対照試料及び潜在的なリスク不純物のＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は、図２～図５に示された通りである。
ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、ＬＣＢ－００１－Ｒ、ＬＣＢ－００２－Ｒ四種類のタンパク質の理論分子量は、それぞれ１１１ｋＤ、１１４ｋＤ、１２３ｋＤ及び１２９ｋＤである。図２に示されるように、各レーンの標的タンパク質の発現はいずれも正常であったが、ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２（図２のレーン１及びレーン２）は、異なる程度の左アーム二量体、右アーム二量体（ＬＣＢ－００１－Ｒ、ＬＣＢ－００２－Ｒ）及び／又は多量体を示した。
ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１、ＬＣＢ－０１２、ＬＣＢ－０１３、ＬＣＢ－０１４、ＬＣＢ－０１５、ＬＣＢ－０１０－Ｍ１、ＬＣＢ－０１０－Ｍ２、ＬＣＢ－０１０－Ｍ３、ＬＣＢ－０１０－Ｍ４、ＬＣＢ－０１０－Ｍ５、ＬＣＢ－０１１－Ｍ３、ＬＣＢ－０１１－Ｍ４の理論分子量は、いずれも約１２０ｋＤであり、表１に示される対照抗体Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂの分子量は、１５０ｋＤであり、ＩＦＮα ２ｂ－Ｆｃの分子量は、８８ｋＤであり、ＩＦＮα ２ｂ単体の分子量は、１９．２ｋＤであった。アフィニティーキャプチャー（即ち、タンパク質Ａで精製した後）の試料の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質の電気泳動検出結果は、図３に示された通りであり、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質の電気泳動検出結果は、図４に示された通りであり、電気泳動の結果は当該構造によって発現される抗体がより多くの凝集体を含むことを示し、精製した後（即ち、ＳＵＬＦＡＴＥ ６５０Ｆによって精製した後）の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は図５に示された通りであり、陽イオン交換クロマトグラフィーパッキングで大部分の凝集体を除去することができることが分かる。
表１に示される他の二重特異性組換えタンパク質は、アフィニティーキャプチャー及び精製した後、試料の還元及び非還元のＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動の検出結果は、理論分子量と一致したため、ここでは説明を省略する。
実施例３ 第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質の標的親和性、標的競合結合活性の検出
１、ＣＤ４７及び／又はＣＤ２０標的親和性の検出方法
フローサイトメトリーで標的ＣＤ２０に対する二重特異性組換えタンパク質の親和性の検出：
標的ＣＤ２０に対する二重特異性組換えタンパク質の結合親和性はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００１又はＬＣＢ－００２を例とし、第１機能抗原がＣＤ２０である組換えタンパク質の検出に適用される。
ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０（ｈＣＤ２０を過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣上皮細胞）を培養し、成長が良好な細胞を収集してカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏから購入）で３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心分離して上清を吸引し、８つの希釈度のＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、陽性対照Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、陽性対照Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ又は陰性対照ＩｇＧ（Ｉｓｏｔｙｐｅ）（１００ｎＭから開始、３倍で勾配希釈、合計８濃度）をそれぞれ加え、９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２－２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄及び再懸濁した後、フローサイトメーター（ＢＤ）で蛍光値を検出した。
ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＣＤ４７抗原を発現しないため、細胞レベルでＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０細胞を用いて、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、陽性対照試料Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、陰性対照ＩｇＧ及びＣＤ２０の結合親和性を評価することができる。
試験結果は、陰性対照ＩｇＧがＣＨＯ－Ｋ１に結合できないこと以外に、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、陽性対照試料Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂが、いずれもＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合でき、ＣＤ２０に対するＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２の結合親和性は、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ又はＲｉｔｕｘｉｍａｂの結合親和性と似ていることを示した。
以上の試験データは、本発明の組換えタンパク質が細胞レベルで腫瘍細胞ＣＤ２０抗原を特異的にターゲットとすることができ、ＣＤ２０への結合親和性は、ＣＤ２０に対する同じ標的を有するモノクローナル抗体の結合親和性より低くなく、本発明の組換えタンパク質は、標的ターゲット細胞を高親和性でターゲティングすることができる。
例えば、図６に示されるように、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、陽性対照試料Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、いずれもＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０細胞に結合することができた。具体的に、ＣＤ２０に対するＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２の結合親和性は、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ又はＲｉｔｕｘｉｍａｂの結合親和性と似ていた。
フローサイトメトリーで標的ＣＤ４７に対する二重特異性組換えタンパク質の親和性の検出：
標的ＣＤ４７に対する二重特異性組換えタンパク質の結合親和性はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２又はＬＣＢ－０１７を例とし、第１機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞２９３）（ＣＤ２０－／ＣＤ４７＋、非標的ターゲット細胞）を培養し、成長が良好な細胞を収集してカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心分離して上清を吸引し、７つの希釈度のＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１又はＩｇＧ１（Ｉｓｏｔｙｐｅ）（１００ｎＭから開始、４倍で勾配希釈、合計７濃度）をそれぞれ加え、９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２－２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄及び再懸濁した後、フローサイトメーター（ＢＤ）で蛍光値を検出した。
ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＤ２０抗原を発現しないため、細胞レベルでＨＥＫ２９３細胞を用いて、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、陽性対照抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、及び陰性対照ＩｇＧ及びＣＤ４７の結合親和性を評価することができる。
試験結果は、陰性対照ＩｇＧがＨＥＫ２９３に結合できないこと以外に、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ７融合タンパク質）、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２が、いずれもＨＥＫ２９３細胞に結合でき、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２とＨＥＫ２９３の結合は抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂよりも有意に弱く、同時に抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも明らかに弱いことを示した。
例えば、図７Ａに示されるように、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２は、いずれもＨＥＫ２９３細胞に結合することができた。具体的に、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２の親和性は、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂよりも有意に弱く、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ融合タンパク質）よりも有意に弱い。
ＣＤ４７をトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）（ＣＤ３８－／ＣＤ４７＋、非標的ターゲット細胞）を洗浄・消化後、成長が良好な細胞を収集してカウントし、遠心分離し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、少なくとも１５分間放置し、遠心して上清を吸引し、７つの希釈度のＬＣＢ－０１７、Ｆｅｌｚａｒｔａｍａｂ、ＴＴＩ－６２１、又はＳＩＲＰα－Ｄ１ｍ－Ｆｃ（２００ｎＭから開始、３倍で勾配希釈、合計１１濃度）をそれぞれ加え、９６ウェルプレートを４℃の冷蔵庫で１時間培養し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２－２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間培養し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄及び再懸濁させた後、フローサイトメーター（ＢＤ）で蛍光値を検出した。
ＣＤ４７をトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＣＤ３８抗原を発現しないため、細胞レベルで当該ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いて、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７、陰性対照抗ＣＤ３８抗体Ｆｅｌｚａｒｔａｍａｂ、陽性対照抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１及びその高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ及びＣＤ４７の結合親和性を評価することができる。
試験結果は、陰性対照抗ＣＤ３８抗体ＦｅｌｚａｒｔａｍａｂがＣＨＯ－Ｋ１に結合できないこと以外に、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ融合タンパク質）、高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ融合タンパク質、組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７は、いずれもＨＥＫ２９３細胞に結合することができ、組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７と非標的ターゲット細胞ＣＨＯ－Ｋ１の結合は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも有意に弱いことを示した。
例えば、図７Ｂに示されるように、高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ融合タンパク質、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７は、いずれも非標的ターゲット細胞ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合することができる。具体的に、組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７の親和性は、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ融合タンパク質）よりも有意に弱い。
第２機能抗原がＣＤ４７である、本発明の他の二重特異性組換えタンパク質も非標的ターゲット細胞似対して低い結合親和性又は結合しないことが観察された。
以上の試験データは、本発明の組換えタンパク質が細胞レベルで腫瘍細胞のＣＤ４７抗原を特異的にターゲットとすることができ、またＣＤ４７への結合親和性は、ＣＤ４７に対するＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性よりも有意に弱く、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、意外に、抗ＣＤ４７抗体又はＳＩＲＰα Ｄ１－Ｆｃ融合タンパク質の治療による赤血球凝集、貧血、血小板減少症などの非腫瘍標的細胞死滅を含む副作用を有意に低減又は回避することもできることを証明した。
表面プラズモン共鳴分析（「ＳＰＲ分析」と称される）による標的ＣＤ２０又はＣＤ４７に対する二重特異性組換えタンパク質の親和性：
下記の方法では、ＬＣＢ－００２を例とし、第１機能抗原がＣＤ２０であり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
ＳＰＲ分析には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用された。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５センサーチップに固定した。ＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で希釈した５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２０－Ｆｃ又はヒトＣＤ４７－Ｆｃキメラタンパク質でそれぞれ固定してもよく、捕捉量を測定した。その後、完全組換えタンパク質ＬＣＢ－００２、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１をＨＢＳ－ＥＰで５０ｎＭに希釈し、それとヒトＣＤ２０－Ｆｃキメラタンパク質又はヒトＣＤ４７－Ｆｃキメラタンパク質との結合量をそれぞれ測定した。続いて、５０μＬ／分の流速でＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液を５分間加え、組換えタンパク質ＬＣＢ－００２、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１及びヒトＣＤ２０－Ｆｃキメラタンパク質又はヒトＣＤ４７－Ｆｃキメラタンパク質の解離を測定した。Ｆｉｔ ｌｏｃａｌで二価検体モデル、Ｒｍａｘを分析し、結合速度定数（ｋａ）及び解離速度定数（ｋｄ）を計算し、ｋｄでｋａを割って結合解離定数（ＫＤ）を計算した。組換えタンパク質ＬＣＢ－００２、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１とヒトＣＤ２０－Ｆｃキメラタンパク質又はヒトＣＤ４７－Ｆｃキメラタンパク質のＫｄ値は表３に示された通りである。
ＯｆａｔｕｍｕｍａｂがヒトＣＤ２０タンパク質を特異的にターゲットとするため、ヒトＣＤ４７－Ｆｃキメラタンパク質と結合されないが、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１は、ＣＤ４７タンパク質を特異的にターゲットとするため、ヒトＣＤ２０－Ｆｃキメラタンパク質と結合されない。
試験結果は、タンパク質レベルで、組換えタンパク質ＬＣＢ－００２は、ヒトＣＤ４７タンパク質又はヒトＣＤ２０タンパク質とそれぞれ結合することができ、その親和性は抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ又は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１と比べて有意な変化がないことを示した。
以上の試験データは、本発明の組換えタンパク質がタンパク質レベルで腫瘍細胞ＣＤ２０抗原及びＣＤ４７抗原を特異的にターゲットとすることができ、且つＣＤ４７又はＣＤ２０への結合親和性は、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ又は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１に相当することを証明した。
フローサイトメトリーによる標的ＣＤ２０及びＣＤ４７の二重特異性結合状況を検出：
標的ＣＤ２０及びＣＤ４７に対する二重特異性組換えタンパク質の結合親和性はフローサイトメトリーによって測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００１又はＬＣＢ－００２を例とし、第１機能抗原がＣＤ２０であり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
成長が良好なＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）（ＣＤ２０＋／ＣＤ４７＋、標的ターゲット細胞）を収集してカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、８つの希釈度のＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２、Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ＩｇＧ（１００ｎＭから開始、３倍勾配希釈、合計８濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ（Ｆ９５１２－２ＭＬ、Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃で１時間培養し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄及び再懸濁させた後、フローサイトメーター（ＢＤ）で蛍光値を検出した。
図８に示されるように、ＣＤ２０及びＣＤ４７抗原が同時にＲａｊｉ細胞表面に発現されるため、抗ＣＤ２０抗体Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、いずれもＲａｊｉ細胞に特異的に結合することができるが、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２もＲａｊｉ細胞に結合することができ、結合力はＯｆａｔｕｍｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと同程度であった。
２、標的に対する競合結合活性の検出
下記の方法では、ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００５、ＬＣＢ－００６、ＬＣＢ－０１７を例とし、第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質に適用される。
フローサイトメトリーによるＬＣＢ－００１の競合結合活性の検出：
細胞表面ＣＤ４７に競合結合する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００１、ＬＣＢ－００２及び潜在的な不純物対照試料ＬＣＢ－００１－Ｒ、ＬＣＢ－００２－ＲとＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣの競合結合活性は、フローサイトメトリーによって測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００１又はＬＣＢ－００２を例とし、第１機能抗原がＣＤ２０であり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
成長が良好なＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ）を収集してカウントし、遠心分離し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、勾配希釈したＬＣＢ－００１（開始濃度：２０００００ｎｇ／ｍＬ、５倍希釈、合計８濃度）。ＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の最終濃度は４ｎＭであった。ＬＣＢ－００１、ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ及びＲａｊｉ細胞を１時間共培養し、遠心分離して上清を捨て、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を再懸濁させ、次に、フローサイトメーターにより検出した。
試験結果は、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２は、いずれも異なる程度で、ＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－ＦｃとＲａｊｉ細胞上のＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、潜在的な不純物ＬＣＢ－００１－Ｒ、ＬＣＢ－００２－Ｒは、ＣＤ４７抗原への結合についてＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃと競合できず、競合結合活性を発揮できないことを示した。
例えば、図９Ａに示されるように、抗ＣＤ４７抗体Ｍａｇｒｏｌｉｍａｂ、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１及びＬＣＢ－００２は、いずれも異なる程度で、ＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－ＦｃとＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、組換えタンパク質ＬＣＢ－００２競合結合活性は、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１非自明に有意に優れており、組換えタンパク質ＬＣＢ－００１の競合結合活性は、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１に相当する。この結果は、適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント及び第２機能構造フラグメントを連結した組換えタンパク質が第２機能構造フラグメントと第２機能抗原の競合結合能力を非自明に有意に改善できることを示した。同時に、潜在的なリスク不純物タンパク質のＬＣＢ－００１－Ｒ、ＬＣＢ－００２－Ｒは、いずれもＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃと競合してＣＤ４７抗原に結合することができなかった。この結果は、組換えタンパク質の製造プロセスで発生した完全に除去できない潜在的なリスク不純物は、第２機能抗原に対する競合結合活性を有意に低下させ、非標的ターゲット細胞上の第２機能抗原への当該潜在的なリスク不純物の結合は非常に弱く、免疫関連の毒性副作用を大幅に減少し、極めて良好な安全性を有すると推測できる。
フローサイトメトリーによるＬＣＢ－００５の競合結合活性の検出：
細胞表面ＣＤ４７に競合結合する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００５とＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の競合結合活性は、フローサイトメトリーによって測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００５を例とし、第１機能抗原がＥｐＣＡＭであり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
成長が良好な標的ターゲット細胞ＣＡＰＡＮ－２細胞（ヒト膵臓癌細胞）（ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４７＋）（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉから購入）を洗浄・消化後、計数し、遠心分離し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６个細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、ＬＣＢ－００５で勾配希釈（開始濃度：２００ｎＭ、３倍希釈、合計８濃度点）した。ＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の最終濃度は４ｎＭであり、ＬＣＢ－００６、ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ、ＴＴＩ－６２１、ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ及びＣＡＰＡＮ－２細胞を１時間共培養し、遠心分離して上清を捨て、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を再懸濁し、次に、フローサイトメーターで検出した。
試験結果は、ＣＡＰＡＮ－２細胞で明らかな競合結合活性を有しない抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１に比べて、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００５、高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）とＣＡＰＡＮ－２細胞のＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、ＣＡＰＡＮ－２に対する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００５の競合結合活性は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも有意に優れていることを示した。
例えば、図９Ｂに示されるように、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００５と高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）とＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮しているが、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１では競合結合活性が見られず、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００５競合結合活性は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも非自明に有意に優れていることが分かる。この結果は、本発明の二重特異性組換えタンパク質が、適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント及び第２機能構造フラグメントを連結した組換えタンパク質が第２機能構造フラグメントと第２機能抗原の競合結合能力を非自明に有意に改善できることを示した。
フローサイトメトリーによるＬＣＢ－００６の競合結合活性の検出：
細胞表面ＣＤ４７に競合結合する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００６のＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の競合結合活性は、フローサイトメトリーによって測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００６を例とし、第１機能抗原がＣＤ２４であり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
成長が良好な標的ターゲット細胞ＭＣＦ－７細胞（ヒト乳癌細胞）（ＣＤ２４＋／ＣＤ４７＋）（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉから購入）を洗浄・消化後、計数し、遠心分離し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６个細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、ＬＣＢ－００６で勾配希釈（開始濃度：２００ｎＭ、３０倍希釈、合計８濃度点）した。ＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の最終濃度は４ｎＭであり、ＬＣＢ－００６、ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ、ＴＴＩ－６２１、ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ及びＭＣＦ－７細胞を１時間共培養し、遠心分離して上清を捨て、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を再懸濁させ、次に、フローサイトメーターで検出した。
試験結果は、ＭＣＦ－７細胞で明らかな競合結合活性を有しない抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１に比べて、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００６、高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）とＭＣＦ－７細胞のＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、ＭＣＦ－７に対する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００６の競合結合活性は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも有意に優れていることを示した。
例えば、図９Ｃにされるように、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００６と高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）とＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮しているが、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１では競合結合活性が見られず、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００６競合結合活性は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも非自明に有意に優れていることが分かる。この結果は、適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント及び第２機能構造フラグメントを連結する本発明の二重特異性組換えタンパク質が、第２機能構造フラグメントと第２機能抗原の競合結合能力を非自明に有意に改善できることを示した。
フローサイトメトリーによるＬＣＢ－０１７の競合結合活性の検出：
細胞表面ＣＤ４７に競合結合する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７とＦＩＴＣ標識高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の競合結合活性は、フローサイトメトリーによって測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０１７を例とし、第１機能抗原がＣＤ３８であり、第２機能抗原がＣＤ４７である組換えタンパク質の検出に適用される。
成長が良好なＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞リンパ腫）（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｈａｉ）（ＣＤ３８＋／ＣＤ４７＋）を収集してカウントし、遠心分離し、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、ＬＣＢ－０１７で勾配希釈（開始濃度：２００ｎＭ、３倍希釈、合計７濃度点）した。ＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ（ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ）の最終濃度は４ｎＭであった。ＬＣＢ－０１７、ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃ、ＴＴＩ－６２１、ＳＩＲＰα（ＣＶ１）－Ｆｃ－ＦＩＴＣ及びＲａｊｉ細胞を１時間共培養し、遠心分離して上清を捨て、ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳで細胞を再懸濁させ、次に、フローサイトメーターにより検出した。
試験結果は、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７及び高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－ＦｃとＲａｊｉ細胞のＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、ＭＣＦ－７に対する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７の競合結合活性は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１よりも有意に優れていることを示した。
例えば、図９Ｄに示されるように、抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７と高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－Ｆｃは、いずれも異なる程度でＦＩＴＣで標識された高親和性ＳＩＲＰα Ｄ１ｍ－ＦｃとＲａｊｉ細胞のＣＤ４７抗原に競合結合して、競合結合活性を発揮し、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１７競合結合活性（ＩＣ５０＝２７．９８）は抗ＣＤ４７融合タンパク質ＴＴＩ－６２１（ＩＣ５０＝１０６７）よりも非自明に有意に優れていることが分かる。この結果は、適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント及び第２機能構造フラグメントを連結する本発明の二重特異性組換えタンパク質が、第２機能構造フラグメントと第２機能抗原の競合結合能力を有意に改善できることを示した。
要するに（図９Ａ～図９Ｄ）、適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント及び第２機能構造フラグメントを連結する本発明の二重特異性組換えタンパク質が、第２機能構造フラグメントと第２機能抗原の競合結合能力を非自明に有意に改善できることを示した。第２の機能的抗原がＣＤ４７である他の二重特異性組換えタンパク質もまた、標的抗原陽性の標的ターゲット細胞で上記のデータと一致する結果が観察された。
実施例４ ＧＰＣ３高発現肝癌細胞株（二重陽性発現細胞、標的ターゲット細胞）に対するＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の結合活性の検出
標的ＧＰＣ３高発現肝癌細胞株に対するＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の結合親和性はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１を例とし、第１機能結合フラグメントがＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合フラグメントがＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用される。
検出細胞はＨｅｐＧ２細胞（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）及びＨｕＨ－７（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｈａｉ）であり、成長が良好な細胞を収集してカウントし、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で１×１０６個細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（商品番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、７つの希釈度の二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（１００ｎＭから開始、３倍勾配希釈、合計７濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、４℃で１時間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄及び再懸濁させた後、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光値を検出した。
実験結果は、図１０及び図１１に示されるように、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１は、いずれもＧＰＣ３及びＩＦＮα受容体を同時に発現される標的ターゲット細胞ＨｅｐＧ２及びＨｕＨ－７細胞と所定の結合活性を有し、二重特異性組換えタンパク質とＨｅｐＧ２及びＨｕＨ－７細胞の結合は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）と比べてより高い最大平均蛍光強度を有することを示した。同時に、図１０及び図１１に示されるように、リンカー配列の長さは、二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞の結合活性に与える影響が弱く、リンカー配列が短い（例えば、リンカー配列が１つのＧＧＧＧＳである）場合、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９）と標的ターゲット細胞の結合活性（ＥＣ５０）は、比較的に低かった。
実施例５ 抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）に対するＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の活性の検出
標的ＧＰＣ３を高発現する肝癌細胞株に対する二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性は乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）法により測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１を例とし、第１機能結合フラグメントがＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合フラグメントがＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性検出に適用される。
エフェクター細胞はヒト末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）であり、標的細胞は、ＧＰＣ３を高発現するＨｅｐＧ２肝癌細胞株であり、ＬＤＨ検出キットは、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥＴＭ－Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７８９２であった。標的細胞及びエフェクター細胞は、１：２０の条件でプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（１５０ｎＭから開示、５倍勾配希釈、合計８濃度）を加え、３７℃で４時間共培養した。３７℃で３．５時間培養した後、対照群に溶解試薬を加え、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、細胞が完全に溶解した後１００００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）に移し、反応基質と３７℃で３０分間培養し、停止溶液を加え、３～５分間光を避けて振とうし、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２）で信号値を検出し、詳しいステップはＬＤＨ検出キット説明書を参考できる。
図１２に示されるように、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）は、ＡＤＣＣ活性を保持しており、二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性は抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）と相当する（ＥＣ５０＝０．５３）。
実施例６ ＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
異なる腫瘍細胞株に対するＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１を例とし、第１機能結合フラグメントがＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合フラグメントがＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用される。
ＧＰＣ３陽性細胞株ＨｕＨ－７又はＧＰＣ３陰性腫瘍細胞株Ｕ２６６（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）及びＧＰＣ３陰性腫瘍細胞株ＳＷ４８０（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（５２ｎＭから開始、１０倍勾配希釈、合計６ポイント、又は１０ｎＭから開始、５倍勾配希釈、合計８ポイント）を加え、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）に入れて信号値を検出した。
その結果、ＧＰＣ３陽性（ＧＰＣ３＋）の標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７に対する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）の増殖阻害活性（ＩＣ５０）は、いずれも対照ＩＦＮ－α ２ｂ（図１３に示される）よりも高く、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（ａｎｔｉ－ＧＰＣ３ ｍＡｂ、即ち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂであり、当該抗体のＨｕＨ－７に対する増殖阻害作用が見られなかった）よりも高かった。図１４に示されるように、ＨｕＨ－７（ＧＰＣ３陽性の標的ターゲット細胞）に対するＧＰＣ３をターゲットとする機能が欠乏する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１２及びＩＦＮ－α ２ｂのＦｃ融合タンパク質（ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃ）の増殖阻害活性は、いずれもＧＰＣ３をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１０よりも有意に低く、ＧＰＣ３をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞のＧＰＣ３との結合は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増強させるが、標的ターゲット細胞をターゲットとする効果を有しない二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂは増殖阻害活性が低いことを示し、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を有する標的ターゲット細胞のみに対して強い増殖阻害効果を有し、標的抗原を有しない非標的ターゲット細胞には効果が弱い、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
更に、表４の結果に示されるように、ＧＰＣ３陽性（ＧＰＣ３＋）の標的ターゲット細胞（ＨｕＨ－７を例とする）に対する異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）は、いずれもＩＦＮ－α ２ｂよりも強い増殖阻害活性を有し、異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性はわずかに異なり、リンカー配列として、１つのＧＧＧＧＳを含む二重特異性組換えタンパク質（即ち、短いリンカー配列で連結された二重特異性組換えタンパク質）（例えば、ＬＣＢ－００９）は、比較的に低い活性を有し（図１３、表４に示される）、当該結果は図１１に示されるように、異なるリンカー配列の組換えタンパク質の結合活性の結果と一致する。しかし、ＧＰＣ３陰性（ＧＰＣ３－）の非標的ターゲット細胞Ｕ２６６及びＳＷ４８０細胞株において、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）の増殖阻害活性は、ＩＦＮ－α ２ｂ（即ち、二重特異性組換えタンパク質の相対活性は１よりはるかに小さい）よりも有意に低く、当該結果はＧＰＣ３を発現しない細胞（即ち、標的抗原を発現しない非標的ターゲット細胞）において、二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は極めて低く、その安全性は比較的に高いことを示した。同時に、表４に示されるように、標的ターゲット細胞に対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、非標的ターゲット細胞に対する当該二重特異性組換えタンパク質の少なくとも７００倍であった。
実施例７ ＰＤ－Ｌ１をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
異なる腫瘍細胞株に対するＰＤ－Ｌ１をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０１３、ＬＣＢ－０１４、ＬＣＢ－０１５を例とし、第１機能結合フラグメントがＰＤ－Ｌ１抗原に結合し、第２機能結合フラグメントがＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質に適用される。
ＰＤ－Ｌ１陽性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９０４）にプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（５２ｎＭから開始、１０倍勾配希釈、合計６ポイント）を加え、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）に入れて信号値を検出した。
図１５に示されるように、ＰＤ－Ｌ１陽性（ＰＤ－Ｌ１＋）の標的ターゲット細胞の場合、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＰＤ－Ｌ１をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質（ＬＣＢ－０１３、ＬＣＢ－０１４、ＬＣＢ－０１５）は、いずれも増殖阻害活性を有し、また活性は、ＰＤ－Ｌ１をターゲットとする機能を有しない対照二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１２及びＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に高く、ＰＤ－Ｌ１をターゲットとすることは、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増加できることを示した。ＰＤ－Ｌ１をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１でのＰＤ－Ｌ１との結合は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増強させるが、標的ターゲット細胞をターゲットとする効果を有しない二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂとの増殖阻害活性が低いことを示し、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を有する標的ターゲット細胞のみに対して強い増殖阻害効果を有し、標的抗原を発現しない非標的ターゲット細胞には効果が弱い、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
ＰＤ－Ｌ１陽性の標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ又はアイソタイプ対照２００ｎＭを加え、３７℃で３０分間培養した。二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（開始濃度２０ｎＭ、６倍勾配希釈、合計６ポイント）を加え、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）に入れて信号値を検出した。
図１６に示されるように、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを加えてＰＤ－Ｌ１抗原と抗体の結合部位を閉鎖した後、ＬＣＢ－０１５の増殖阻害活性は有意に低下し、当該結果は、試験細胞上の標的抗原の結合機能を閉鎖することにより、試験細胞に対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性が有意に低下し、別の観点から、標的抗原結合機能を有しない非標的ターゲット細胞に対して本発明二重特異性組換えタンパク質は効果が弱い、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
実施例８ ＣＤ３８をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
異なる腫瘍細胞株に対するＣＤ３８をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０１６を例とし、第１機能結合フラグメントがＣＤ３８抗原に結合し、第２機能結合フラグメントがＩＦＮα２ｂである二重特異性組換えタンパク質の検出に適用される。
ＣＤ３８陽性細胞株Ｄａｕｄｉ又はＣＤ３８陰性腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（２ｎＭから開始、５倍勾配希釈、合計９ポイント）を加え、３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）に入れて信号値を検出した。
結果は、ＣＤ３８陽性（ＣＤ３８＋）の標的ターゲット細胞Ｄａｕｄｉに対する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－０１６）の増殖阻害活性（ＩＣ５０）は対照ＩＦＮ－α ２ｂ（図１７Ａに示される）より非自明に強く、相対的に、ＣＤ３８陰性（ＣＤ３８－）の非標的ターゲット細胞ＳＫ－ＢＲ３に対する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－０１６）の増殖阻害活性（ＩＣ５０）は、対照ＩＦＮ－α ２ｂ（図１７Ｂに示される）より非自明に弱いことを示した。即ち、第２機能結合フラグメントがＩＦＮα ２ｂである二重特異性組換えタンパク質での標的抗原を有する標的ターゲット細胞に対するＩＦＮα ２ｂの増殖阻害活性を増加すると同時に、二重特異性組換えタンパク質での標的抗原を有しない非標的ターゲット細胞に対するＩＦＮα ２ｂの増殖阻害作用を有意に低下させた。本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を有する標的ターゲット細胞のみに対して強い増殖阻害効果を有し、標的抗原を有しない非標的ターゲット細胞には効果が弱い、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
図１７Ａに示されるように、ＣＤ３８陽性（ＣＤ３８＋）の標的ターゲット細胞Ｄａｕｄｉの場合、ＣＤ３８をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質（ＬＣＢ－０１６）は増殖阻害活性を有し、また活性は、ＣＤ３８をターゲットとする機能を有しないＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に高く、ＣＤ３８をターゲットとすることは、ＩＦＮ－α ２ｂ増殖阻害活性を有意に増加できることを示した。ＣＤ３８をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞ＤａｕｄｉでのＰＤ－Ｌ１との結合は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増強できることを示した。図１７Ｂに示されるように、ＳＫ－ＢＲ３（ＣＤ３８陰性の非標的ターゲット細胞）に対するＣＤ３８をターゲットとする機能が欠乏するＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性は、いずれもＣＤ３８をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１６よりも有意に強いことより、標的抗原を有しない非標的ターゲット細胞のＩＦＮ－α ２ｂに対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性が比較的に低いことを示した。ＬＣＢ－０１６が標的ターゲット細胞ＤａｕｄｉでＩＦＮ－α ２ｂに対する相対活性は、それが非標的ターゲット細胞ＳＫ－ＢＲ３での相対活性の少なくとも２００倍であった。
実施例９ ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
ＩＦＮ－α ２ｂの人体許容量と通常の抗体有効投与量に差があることを考慮し、標的抗原をターゲットとする抗原結合フラグメントとＩＦＮ－α ２ｂの効果をより一致させ、高効率・低毒性の效果を実現するために、本発明はまたＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む一連の二重特異性組換えタンパク質を設計した。本実施例では、ＬＣＢ－０１０に基づく突然変異設計を例とし、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質を設計して、異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を検出し、実験方法は実施例７と同様である。
図１８～２０に示されるように、結果は、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を有する二重特異性組換えタンパク質が、ＧＰＣ３陽性の標的ターゲット細胞（ＨｕＨ－７）又はＧＰＣ３陰性の非標的ターゲット細胞（Ｕ２６６、ＳＷ４８０）、ＬＣＢ－０１０－Ｍ２、ＬＣＢ－０１０－Ｍ３及びＬＣＢ－０１０－Ｍ４の増殖阻害活性がいずれもＬＣＢ－０１０と比較して低下したことを示した。例えば、ＨｕＨ－７（ＧＰＣ３陽性細胞株、標的ターゲット細胞）におけるＬＣＢ－０１０－Ｍ３（Ａ１４５Ｇ突然変異）の増殖阻害活性ＩＣ５０は、ＩＦＮ－α ２ｂと相当するが（ＩＣ５０ＩＦＮ－α ２ｂ＝０．１７９３、ＩＣ５０ＬＣＢ－０１０－Ｍ３＝０．１７９）、ＧＰＣ３陰性の非標的ターゲット細胞（Ｕ２６６）におけるＬＣＢ－０１０－Ｍ３の相対増殖阻害活性（ＩＣ５０ ＩＦＮ－α ２ｂ／二重特異性組換えタンパク質）はより弱く、例えば、Ｕ２６６におけるＬＣＢ－０１０－Ｍ３の相対増殖阻害活性（ＩＣ５０ ＩＦＮ－α ２ｂ／二重特異性組換えタンパク質）は、０．０００６１５であり、ＩＦＮ－α ２ｂより有意に弱く、ＬＣＢ－０１０より弱く、ＬＣＢ－０１０－Ｍ４（Ｒ１４９Ａ突然変異）も同様の結果を示した。
上記の結果及び図１９～図２１は、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含むＧＰＣ３をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質が標的抗原陽性の標的ターゲット細胞株での活性はＩＦＮ－α ２ｂに相当するが、標的抗原を発現しない非標的ターゲット細胞株での活性は低下することを示し、本発明のＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質は、より高い安全性を有することを示した。
要するに、標的抗原陰性の非標的ターゲット細胞に対するＩＦＮ－α ２ｂの低親和性突然変異体を含む本発明二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、標的抗原陰性の非標的ターゲット細胞に対するＩＦＮ－α ２ｂ野生型を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の低下程度に比べて、標的抗原陽性の標的ターゲット細胞におけるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の低下程度に比べて、相当するか、又は有意である。
実施例１０ 非標的ターゲット細胞に対する、二重特異性組換えタンパク質の潜在的なリスク不純物の増殖阻害活性の検出
二重特異性組換えタンパク質の将来の製造工程における不純物の潜在的な安全性リスクを低減させるために、本発明は、ＬＣＢ－０１０を例とし、非標的ターゲット細胞に対するその潜在的なリスク不純物（Ｂ鎖ホモ二量体）の増殖阻害を分析した。
ＬＣＢ－０１０の精製工程（実施例２に記載の通りである）において、ＬＣＢ－０１０のＢ鎖ホモ二量体（図３、ホモ二量体の分子量は約１４０ｋＤ）を分離し、当該潜在的なリスク不純物とＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃ（ＣＮ１０８８６４２９０Ａの図３Ａに示される二重抗体構造の潜在的なリスク不純物、Ｄ１をＩＦＮ－α ２ｂに変えた後の右アームホモ二量体）が、非標的ターゲット細胞（ＧＰＣ３陰性細胞）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における増殖阻害活性を検出した。結果は図２１に示されるように、１６．７ｎＭの濃度で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性細胞、非標的ターゲット細胞）に対するＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害率は９１．３％であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性細胞、非標的ターゲット細胞）に対するＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃの増殖阻害率は６６．８％（ＩＦＮ－α ２ｂと比べて約２４．５％減少）であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性細胞、非標的ターゲット細胞）に対するＬＣＢ－０１０のＢ鎖ホモ二量体の増殖阻害率はわずかの１６．２％（ＩＦＮ－α ２ｂと比べて約７５．１％減少し、ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃと比べて約５０％減少）であった。要するに、潜在的なリスク不純物は非標的ターゲット細胞に対して、極めて弱い効果を有し、即ち、潜在的な安全性リスク又は潜在的な毒性副作用は極めて低い。
実施例１１ 第２機能結合フラグメントがＩＬ１２である二重特異性組換えタンパク質の標的親和性の検出
標的ＴＩＧＩＴ及びＩＬ１２受容体に対する二重特異性組換えタンパク質の結合親和性はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０１８を例とし、第１機能抗原がＴＩＧＩＴであり、第２機能結合フラグメントがＩＬ１２Ａである組換えタンパク質の検出に適用される。
Ｈ＿ＩＬ１２ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２９３細胞（ＴＩＧＩＴ＋、標的ターゲット細胞）を９６ウェル白クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０３）にプレイティングし、一晩壁に接着させた後、培地を捨て、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ又はアイソタイプ対照抗体（Ｉｓｏｔｙｐｅ）２００ｎＭを加え、３７℃で３０分間培養した後培地を捨て、２００ｎＭの二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１８及び２μｇ／ｍＬのＩＬ１２Ｂを同じ体積で均一に混合した後、３倍下向け希釈し、合計１０ポイントであり、次に、１５０μＬ／ｗｅｌｌを９６ウェルプレートに加え、それを３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて６時間培養し、Ｏｎｅ－Ｇｌｏを加え、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）で信号値を検出した。
結果は（図２２に示される）、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂを加えて閉鎖させると、二重特異性組換えタンパク質と試験細胞の結合曲線は、有意に右にシフトし、本発明の二重特異性組換えタンパク質は適切なリンカー配列を使用して第１機能構造フラグメント（ＴＩＧＩＴ標的部分）及び第２機能構造フラグメント（ＩＬ１２）を連結する組換えタンパク質を通じて二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞の結合能力を非自明に改善できることを示した。更に、標的抗原陽性の標的ターゲット細胞に対して、本発明の二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－０１８）が当該標的ターゲット細胞（例えば、Ｈ＿ＩＬ１２ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２９３細胞）に対する結合親和性は、同じ濃度でＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂ複合体が同じ細胞に対する結合親和性より約５００倍弱く（ＥＣ５０ＬＣＢ－０１８＝３０ｎＭ、ＥＣ５０ＩＬ１２Ａ／ＩＬ１２Ｂ＝０．０６ｎＭ）、これはまた、本発明の二重特異性組換えタンパク質のターゲティング効果はＩＬ１２と細胞の結合活性を有意に低下させ、ＩＬ１２の潜在的な毒性副作用を低下させ、特にＩＬ１２と非標的ターゲット細胞が結合して産生する毒性副作用を低下させることを実証した。。
実施例１２ ＴＨＰ１細胞Ｐ－ＳＴＡＴ３に対する第２機能結合フラグメントがＩＬ１０Ｍである二重特異性組換えタンパク質の活性化レベルの検出
ＴＨＰ１細胞Ｐ－ＳＴＡＴ３に対する二重特異性組換えタンパク質の活性化レベルの検出はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０１９を例とし、第１機能抗原がＣＤ８０であり、第２機能結合フラグメントがＩＬ１０Ｍである組換えタンパク質の検出に適用される。
基礎培地（１６４０）を使用し、ＬＣＢ－０１９、ＬＣＢ－０２２（ＣＤ８０をターゲットとする効果がない対照の二重特異性組換えタンパク質）、Ｉｓｏｔｙｐｅ、ＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質を使用のために１０６ｎＭの等モル濃度に希釈した。
ＬＰＳ（ｓｉｇｍａ、Ｌ５４１８－２ＭＬ）がＴｈｐ１細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）表面のＣＤ８０抗原の発現を刺激できることを考慮して、本実施例は、ＬＰＳによって２４時間刺激された後のＴｈｐ１細胞を使用して、標的ＣＤ８０陽性の二重陽性細胞（標的ターゲット細胞）をシミュレーションした。
１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（ｓｉｇｍａ、Ｌ５４１８－２ＭＬ）で２４時間刺激した後のＴｈｐ１細胞（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を１×１０６の密度で基礎培地（１６４０）に再懸濁させた。ＬＰＳで刺激した後の再懸濁させた細胞し、ＬＰＳで刺激されていないＴｈｐ１細胞を１００ｕｌの体積で９６ウェルプレートにプレイティングし、また、同じ体積の希釈したＬＣＢ－０１９、ＬＣＢ－０２２（対照の二重特異性組換えタンパク質）、Ｉｓｏｔｙｐｅ、ＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質をそれぞれ加え、３７℃、５％の二酸化炭素インキュベーターで２０分間培養した。培養完了後、遠心分離して上清を除去し、細胞に対して固定及び膜透過処理を実行した。次に、細胞を１００μＬの０．５μのＬＰＥ－Ｐ－ＳＴＡＴ３抗体（ＢＤ、５６２０７２）を含むＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）に再懸濁し、光を避けて４℃で１時間培養した。ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）で２回洗浄した後、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて再懸濁し、ＦＡＣＳでＰ－ＳＴＡＴ３レベル検出した。
結果は、図２３に示されるように、ＬＰＳによって刺激した後の標的抗原ＣＤ８０を高発現するＴｈｐ１細胞において、標的抗原（ＣＤ８０）をターゲットとする効果を有する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０１９のＰ－ＳＴＡＴ３レベルは、ＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質とほぼ同様であり、標的抗原をターゲットとする機能を有しない対照二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２２よりも有意に高い一方、ＬＰＳによって刺激されていないＴｈｐ１細胞において、ＬＣＢ－０１９及び対照二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２２のＰ－ＳＴＡＴ３レベルはほぼ同様であり、ＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質より有意に弱かった。
このことから、標的抗原を弱く発現するか又は発現しない標的抗原の非標的ターゲット細胞に対して、二重特異性組換えタンパク質が非標的ターゲット細胞に対する効果はＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質よりも有意に弱く、比較的高い安全性を示したが、標的抗原を高発現する標的ターゲット細胞に対して、標的抗原ターゲットを有する二重特異性組換えタンパク質は、ＩＬ１０Ｍ－Ｆｃ融合タンパク質と同様なＳＴＡＴ３レベルを示すことができ、二重特異性組換えタンパク質におけるＩＬ１０Ｍの効果と作用を十分に発揮及び向上させ、相対的に、標的抗原をターゲットとする機能を有さない二重特異性組換えタンパク質は、当該細胞（非標的ターゲット細胞）との効果が相対的に弱く、優れた安全性を表した。
実施例１３ 第２機能結合フラグメントがＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩである、二重特異性組換えタンパク質の増殖活性の検出
ＯＫＴ３によって４８時間刺激した後のＰＤ－１陽性のｈＰＢＭＣに対する二重特異性組換えタンパク質の増殖活性検出はフローサイトメトリーにより測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１、ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４を例とし、第１機能抗原がＰＤ－１であり、第２機能結合フラグメントがＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩである組換えタンパク質の検出に適用される。
ｈＰＢＭＣ細胞を蘇生させた後、１００ｎｇ／ｍＬのａｎｔｉ－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃１６－００３７－８５）のでプレコートされた６ウェルプレートに入れ、４８時間培養した。活性化されたＰＢＭＣを遠心分離して収集し、ＰＢＳで１回洗浄した。次に、培地で細胞を再懸濁し、１．５Ｅ５／１００μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレイティングし、１．６ｎＭの陽性対照Ｃ１５Ｙ、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１、ＬＣＢ－０２３及びＬＣＢ－０２４を加えた。９６ウェルプレートを３７℃の二酸化炭素インキュベーターに置いて９６時間培養した。培養完了後、細胞分けのために、まずａｎｔｉ－ＣＤ４－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃１７－００４９－４２）及びａｎｔｉ－ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．＃ＭＨＣＤ０８０１）抗体を使用して細胞膜に第１回目の染色を実行した。染色完了後、細胞を固定透過化試薬で処理して、細胞を透過化した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ． Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．＃００－５５２３－００）。透過完了後、ａｎｔｉ－Ｋｉ－６７－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．＃３５０５０４）抗体を使用して細胞を４０分間染色した。染色完了後ＦＡＣＳを使用してＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞群でのＫｉ－６７の発現を分析した。
図２４に示されるように、５つの試料は、１．６ｎＭの濃度でＰＤ－１高発現のｈＰＢＭＣに対していずれも所定の増殖促進効果を示し、その中で、陽性対照Ｃ１５Ｙの活性が最も強く、ＰＤ－１をターゲットとする効果を有する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１及びＰＤ－１をターゲットとする効果を有しない対照の二重特異性組換えタンパク質ＲＳＶ×ＩＬ－１５Ｒ抗体（ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４）の増殖促進効果は陽性対照Ｃ１５Ｙより弱く、またＰＤ－１をターゲットとする効果を有する二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１の増殖促進効果は、ＰＤ－１をターゲットとする効果を有しない対照の二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４よりも明らかに強く、同時に、ＰＤ－１をターゲットとする効果を有しない対照の二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４の増殖促進効果は比較的に弱かった。結果は、標的抗原をターゲットとする機能を有する二重特異性組換えタンパク質は、ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩが標的ターゲット細胞に対する増殖促進効果を有意に増強し、当該増殖促進効果は、ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩ－Ｆｃ融合タンパク質（Ｃ１５Ｙ）より弱く、対照の二重特異性組換えタンパク質（ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４）は、ＯＫＴ３によって２４時間刺激した後のＰＤ－１陽性のｈＰＢＭＣに対して弱い増殖促進効果を示し、別の側面から、本発明の二重特異性組換えタンパク質が標的抗原を発現しない非標的ターゲット細胞に対して効果が比較的に弱く、その安全性が比較的に高いことを証明した。
ＰＤ－１をターゲットとする二重特異性組換えタンパク質のＭ－０７ｅに対する増殖活性は、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を介して測定された。下記の方法では、ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１、ＬＣＢ－０２３、ＬＣＢ－０２４を例とし、第１機能抗原がＰＤ－１であり、第２機能結合フラグメントがＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩである組換えタンパク質の検出に適用される。
サイトカイン依存細胞Ｍ－０７ｅを集め、ＰＢＳで１回洗浄した。ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ．＃２１５－ＧＭ－０５０）成長因子を含まない培地で、細胞を２Ｅ４／５０μＬの密度に希釈し、９６ウェルプレートにプレイティングし、サイトカイン飢餓のために４時間培養した。４時間飢餓処理後、勾配希釈したＣ１５Ｙ（１０ｎＭの開始濃度、３倍希釈）、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１、ＬＣＢ－０２３及びＬＣＢ－０２４（３３３ｎＭの開始濃度、３倍希釈）を加え、３７℃の二酸化炭素インキュベーターで７２時間共培養した。７２時間後、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃Ｇ７５７３）で生細胞の数を検出した。
図２５に示されるように、陽性対照Ｃ１５Ｙは極めて低い濃度で極めて強い増殖促進効果（ＥＣ５０＝０．０５２６７ｎＭ）発揮するが、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、比較的に高い濃度でのみ増殖促進効果（ＥＣ５０は、約２１～３７ｎＭ）を発揮でき、ＥＣ５０には有意な差がなく、試験細胞Ｍ－０７ｅがＬＣＢ－０２０、ＬＣＢ－０２１、ＬＣＢ－０２３及びＬＣＢ－０２４に対応する標的抗原を発現しないため、Ｍ－０７ｅは非標的ターゲット細胞と見なすことができ、第２機能結合フラグメントが、ＩＬ１５－ＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩである本発明の二重特異性組換えタンパク質は、非標的ターゲット細胞に対する増殖促進効果が、比較的に高い濃度でのみ効果を発揮し、ＥＣ５０は陽性対照と比べて４００倍以上であった。
以上のことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原陽性の標的ターゲット細胞に対して、ターゲティング機能を有する二重特異性組換えタンパク質に対する増殖促進効果は、ターゲティング機能を有しない二重特異性組換えタンパク質よりも有意に強いが、陽性対照Ｃ１５Ｙよりは弱く、逆に、本発明の組換えタンパク質は、標的抗原陰性の非標的ターゲット細胞に対してその増殖促進効果に有意な差がなく、増殖促進効果の開始濃度は陽性対照Ｃ１５Ｙよりも有意に高かった。このことから、本発明のターゲティング機能を有する二重特異性組換えタンパク質は、標的ターゲット細胞に対して比較的に低い濃度で増殖促進効果を発揮することができるが、非標的ターゲット細胞に対しては極めて高い濃度のみで増殖促進効果を発揮できる。
実施例１４ 二重特異性組換えタンパク質の凍結融解安定性に関する研究
既存の組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質は、凍結融解安定性が比較的に低く、凍結融解の繰り返しには適していなく、例えば、ＰＥＧ化された長時間作用型インターフェロンは凍結及び振とうができず、輸送及び保管条件に対する要求が高い。本発明の二重特異性組換えタンパク質の凍結融解安定性を研究するために、二重特異性組換えタンパク質に対して凍結融解安定性試験を繰り返し実行した。タンパク質を２０ｍＭのＮａＡｃ（ＰＨ＝５）緩衝液に置き、－４０℃の条件で凍結融解を５回繰り返した。凍結融解前後の試料に対して純度（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）及び外観分析を実行した。結果は表５に示される通りであり、ＬＣＢ－０１１の突然変異体の凍結融解安定性は良好であり、純度はいずれも９５％以上であり、凍結融解を５回繰り返した後、外観は透明であり、本発明の二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂタンパク質部分の凍結融解安定性は、ＩＦＮ－α ２ｂ単体又はＰＥＧ化されたＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に優れていることを示した。
本明細書で提供されるあらゆる実施例又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく説明するためであり、特に請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。明細書中の言語は、保護要求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書で引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の出版物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように、参照により本明細書に全体として組み込まれる。なお、本明細書に記載の理論、メカニズム、証拠、又は発見は、本発明の理解をさらに高めることを意図しており、いずれかの方法によって本発明をそのような理論、メカニズム、証拠、又は発見に限定されることを決して意図していない。本発明は、図面および前述の説明において詳細に示され説明されたが、本発明は例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。
本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。 本発明の実施例２のプロテインＡによる精製後の二重特異性組換えタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャ後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャ後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 本発明の実施例２の二重特異性組換えタンパク質の精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の二重特異性組換えタンパク質とＣＤ２０単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＣＤ２０）の結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ４７単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＨＥＫ２９３細胞）の結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ４７単一陽性細胞（非標的ターゲット細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）の結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２０であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料とＣＤ２０／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）の結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２０であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質、対応する潜在リスク不純物タンパク質及び対照試料のＣＤ２０／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）における競合的結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＥｐＣＡＭであり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７の二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＥｐＣＡＭ／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、ＣＡＰＡＮ－２細胞）における競合的結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ２４であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＣＤ２４／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、ＭＣＦ－７細胞）における競合的結合曲線である。 本発明の実施例３のフローサイトメトリーによって決定された本発明の第１機能抗原がＣＤ３８であり、且つ第２機能抗原がＣＤ４７である二重特異性組換えタンパク質及び対照試料のＣＤ３８／ＣＤ４７二重陽性細胞（標的ターゲット細胞、Ｒａｊｉ細胞）における競合的結合曲線である。 フローサイトメトリーによって決定された本発明の実施例４の第１機能抗原がＧＰＣ３であり、且つ第２機能結合タンパク質がＩＦＮ－α ２ｂである二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の標的ターゲット細胞ＨｅｐＧ２肝癌細胞における結合活性曲線である。 フローサイトメトリーによって決定された本発明の実施例４の第１機能抗原がＧＰＣ３であり、且つ第２機能結合タンパク質がＩＦＮ－α ２ｂである二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７における結合活性ヒストグラムである。 ＬＤＨ法によって決定された本発明の実施例５の標的細胞ＨｅｐＧ２における二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性曲線である。 本発明の実施例６における標的細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＧＰＣ３陽性標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する本発明の実施例６のＧＰＣ３抗原標的機能を有する二重特異性組換えタンパク質及び対照試料の阻害活性曲線である。 ＰＤ－Ｌ１陽性の標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例７の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 抗ＰＤ－Ｌ１抗体閉鎖後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例７の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＣＤ３８陽性の標的ターゲット細胞Ｄａｕｄｉの増殖に対する本発明の実施例８の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＣＤ３８陰性の非標的ターゲット細胞ＳＫ－ＢＲ３の増殖に対する本発明の実施例８の二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＧＰＣ３陽性の標的ターゲット細胞ＨｕＨ－７の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＧＰＣ３陰性の標的ターゲット細胞ＳＷ４８０の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＧＰＣ３陰性の標的ターゲット細胞Ｕ２６６の増殖に対する本発明の実施例９の異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の阻害活性曲線である。 ＧＰＣ３陰性の非標的ターゲット細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の増殖に対する本発明の実施例１０の二重特異性組換えタンパク質潜在的リスク不純物の阻害活性曲線である。 抗ＴＩＧＩＴ抗体閉鎖後のＴＩＧＩＴ陽性標的ターゲット細胞Ｈ＿ＩＬ１２ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ２９３に対する本発明の実施例１１の二重特異性組換えタンパク質の結合活性曲線である。 ＴＨＰ１細胞Ｐ－ＳＴＡＴ３活性化レベルに対する本発明の実施例１２の二重特異性組換えタンパク質の検出結果である。 ＯＫＴ３で４８時間刺激した後のＰＤ－１陽性のｈＰＢＭＣに対する本発明の実施例１３の二重特異性組換えタンパク質の増殖活性検出結果である。 ＰＤ－１陰性の非標的ターゲット細胞Ｍ－０７ｅに対する本発明の実施例１３の二重特異性組換えタンパク質の増殖活性検出結果である。
一つの実施形態において、前記リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６６）、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６７）、又は（ＸＰ）ｎを含み、ｎは自然数である。好ましくは、前記ｎは０～５の自然数である。
一つの実施形態において、リンカー配列は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６５）であり、ｎ＝０、１、２、３、４、５である。
実験結果は、図１０及び図１１に示されるように、二重特異性組換えタンパク質ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１は、いずれもＧＰＣ３及びＩＦＮα受容体を同時に発現される標的ターゲット細胞ＨｅｐＧ２及びＨｕＨ－７細胞と所定の結合活性を有し、二重特異性組換えタンパク質とＨｅｐＧ２及びＨｕＨ－７細胞の結合は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）と比べてより高い最大平均蛍光強度を有することを示した。同時に、図１０及び図１１に示されるように、リンカー配列の長さは、二重特異性組換えタンパク質と標的ターゲット細胞の結合活性に与える影響が弱く、リンカー配列が短い（例えば、リンカー配列が１つのＧＧＧＧＳ（配列番号６５）である）場合、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９）と標的ターゲット細胞の結合活性（ＥＣ５０）は、比較的に低かった。
更に、表４の結果に示されるように、ＧＰＣ３陽性（ＧＰＣ３＋）の標的ターゲット細胞（ＨｕＨ－７を例とする）に対する異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）は、いずれもＩＦＮ－α ２ｂよりも強い増殖阻害活性を有し、異なるリンカー配列の二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性はわずかに異なり、リンカー配列として、１つのＧＧＧＧＳ（配列番号６５）を含む二重特異性組換えタンパク質（即ち、短いリンカー配列で連結された二重特異性組換えタンパク質）（例えば、ＬＣＢ－００９）は、比較的に低い活性を有し（図１３、表４に示される）、当該結果は図１１に示されるように、異なるリンカー配列の組換えタンパク質の結合活性の結果と一致する。しかし、ＧＰＣ３陰性（ＧＰＣ３－）の非標的ターゲット細胞Ｕ２６６及びＳＷ４８０細胞株において、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＬＣＢ－００９、ＬＣＢ－０１０、ＬＣＢ－０１１）の増殖阻害活性は、ＩＦＮ－α ２ｂ（即ち、二重特異性組換えタンパク質の相対活性は１よりはるかに小さい）よりも有意に低く、当該結果はＧＰＣ３を発現しない細胞（即ち、標的抗原を発現しない非標的ターゲット細胞）において、二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は極めて低く、その安全性は比較的に高いことを示した。同時に、表４に示されるように、標的ターゲット細胞に対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、非標的ターゲット細胞に対する当該二重特異性組換えタンパク質の少なくとも７００倍であった。

Claims (28)

  1. 二重特異性組換えタンパク質であって、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合フラグメント、第２機能結合フラグメント及びＦｃ領域を含み、前記二重特異性組換えタンパク質が標的抗原をターゲットとする第１機能結合フラグメントは、抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗原結合フラグメントのＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端は、免疫調節機能及び／又は代謝調節機能及び／又は内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントと直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、
    好ましくは、前記抗原結合フラグメントは前記第２機能結合フラグメントのＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第２機能結合フラグメントのＣ末端は、ＦｃのＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されることを特徴とする、二重特異性組換えタンパク質。
  2. 前記免疫調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、免疫チェックポイント、免疫チェックポイントリガンド又はサイトカイン受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  3. 前記免疫調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、ＰＤ－１又はそのリガンド、ＣＤ４７又はそのリガンド、ＣＤ２４又はそのリガンド、インターフェロン受容体、インターロイキン受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項２に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  4. 前記代謝調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、代謝調節因子、代謝調節因子受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  5. 前記代謝調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、インスリン受容体、線維芽細胞成長因子受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項４に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  6. 前記内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、内分泌調節因子、内分泌調節因子受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  7. 前記内分泌調節機能を有する第２機能結合フラグメントが、ホルモン受容体をターゲットとすることを特徴とする、請求項６に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  8. 前記抗原結合フラグメントにおける可変領域及び定常領域が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は前記抗原結合フラグメントとＦｃ領域が、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、又は上記の２つの方法を同時に使用して連結されることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  9. 前記リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、又は（ＸＰ）ｎを含み、ｎは、自然数であり、
    好ましくは、前記ｎは、０～５の自然数であることを特徴とする、請求項１又は８に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  10. 前記第２機能結合フラグメントは、サイトカイン受容体又は免疫チェックポイント又は免疫チェックポイントリガンドに結合し、前記第２機能結合フラグメントは、サイトカイン又は免疫チェックポイントリガンド又は免疫チェックポイントリガンド結合タンパク質、又はその機能フラグメント若しくはその突然変異体であり、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＳＩＲＰファミリー細胞外機能フラグメント、ヒトインターフェロンファミリー機能フラグメント、腫瘍壊死因子スーパーファミリー機能フラグメント、ＴＧＦ－βスーパーファミリー機能フラグメント、インターロイキン系機能フラグメント、ケモカインファミリー機能フラグメント、コロニー刺激因子ファミリー機能フラグメント、成長因子機能フラグメント又はその突然変異体から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  11. 前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体であることを特徴とする、請求項１０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  12. 前記インターフェロン受容体は、Ｉ型又はＩＩ型ヒトインターフェロン受容体であり、好ましくは、ヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）又はヒトインターフェロンβ（ＩＦＮ－β）の受容体であることを特徴とする、請求項１０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  13. 前記第２機能結合フラグメントは、インターロイキン、そのトランケーション、又はその突然変異体であることを特徴とする、請求項１０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  14. 前記インターロイキンは、ＩＬ－１ファミリー、ＩＬ－２ファミリー、ＩＬ－３ファミリー、ＩＬ－６ファミリー、ＩＬ－８ファミリー、ＩＬ－１０ファミリー、ＩＬ－１２ファミリー及びＩＬ－１７ファミリーから選択されるいずれか１つである、免疫調節又はケモカインであることを特徴とする、請求項１３に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  15. 前記第１機能結合フラグメントは、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９８、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ－３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＴＲＯＰ２、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＣＤ１５５及びＡＦＰから選択されるいずれか１つ又は複数の標的をターゲットし、
    好ましくは、前記第２機能結合フラグメントは、ヒトＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体、ヒトインターフェロンβ又はヒトインターフェロンγ、インターロイキン、そのトランケーション又は突然変異体を含み、前記第１機能結合フラグメントは、腫瘍細胞又は免疫細胞をターゲットとすることを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  16. 前記二重特異性組換えタンパク質は、Ａ鎖及びＢ鎖から構成され、前記Ａ鎖及びＢ鎖は、分子間の作用力によって結合され、又は共有結合によって結合され、又はイオン結合によって結合され、又は上記の結合方法の２つ又は３つの組み合わせによって結合されることを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  17. 前記Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域天然配列又はＦｃ非天然配列を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  18. 前記Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域であり、
    好ましくは、前記Ａ鎖及びＢ鎖のＦｃ領域は、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓによって結合されたものであり、及び／又は、前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域であり、
    より好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ領域であることを特徴とする、請求項１７に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  19. 前記ＣＬドメインのＣ末端又はＣＨ１ドメインのＣ末端又は第２機能結合フラグメントのＣ末端は、前記Ｆｃ領域と直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  20. 前記第１機能結合フラグメントは、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９８、ＣＤ２０６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＣ－３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ １、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１３８、ＴＲＯＰ２、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＣＤ１５５及びＡＦＰから選択される標的をターゲットとする抗原結合フラグメントのいずれか１つ又は複数であり、前記抗原結合フラグメントは、ヒトマウスキメラ抗原結合フラグメント、ヒト化抗原結合フラグメント、又は完全ヒト抗原結合フラグメントであることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  21. 前記第１機能結合フラグメントが、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ１３８、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１、又はＴＲＯＰ２をターゲットとする場合、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体を含み、
    前記第１機能結合フラグメントが、ＴＩＧＩＴ、Ｓｉｇｌｅｃ１５、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２０６、ＣＣＲ５をターゲットとする場合、前記第２機能結合フラグメントは、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０Ｍ、ＩＬ－１２Ａ、又はＩＬ－１５及びＩＬ１５ＲαＳＵＳＨＩで形成される複合体、又はその突然変異体を含み、
    好ましくは、
    前記第１機能結合フラグメントは、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２４又はＥＧＦＲをターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体を含み、好ましくは、前記第２機能結合フラグメントのアミノ酸配は、配列番号５０に示される通りであり、より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２又は３に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６２に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２７に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２８に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２９に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３０に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５６に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５７に示される通りであり、
    前記第１機能結合フラグメントは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ８０又はＰＤ－１をターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ－１０単量体突然変異体、ＩＬ１５及びＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩ複合体を含み、前記ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ－１０単量体突然変異体、ＩＬ１５及びＩＬ－１５ＲαＳＵＳＨＩのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５１、５２、５３、５４に示される通りであり、又は上記第２機能結合フラグメントの突然変異体であり、好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３５に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３６に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３７に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３８に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３９に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号４０又は４１に示される通りであり、
    前記第１機能結合フラグメントは、ＣＤ３８又はＡＦＰをターゲットとし、前記第２機能結合フラグメントは、ＳＩＲＰα細胞外Ｄ１ドメイン又はその突然変異体、又はＩＦＮ－β又はその突然変異体を含み、好ましくは、前記第２機能結合フラグメントのアミノ酸配列は、配列番号５０又は５５に示される通りであり、より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３１に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３２に示される通りであり、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３３に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号３４に示される通りであり、又は、前記Ａ鎖のアミノ酸配列は、配列番号５８に示される通りであり、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、配列番号６０に示される通りでありことを特徴とする、請求項２０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
  22. 前記第１機能結合フラグメントをコードする核酸分子と第２機能結合フラグメントをコードする核酸は、同じＤＮＡ鎖に位置し、又は前記第１機能結合フラグメントをコードする核酸分子と第２機能結合フラグメントをコードする核酸は異なるＤＮＡ鎖に位置し、
    好ましくは、前記Ｆｃ領域をコードする核酸分子と前記第１機能結合フラグメント又は第２機能結合フラグメントをコードする核酸は、同じＤＮＡ鎖に位置し、前記Ｆｃ領域をコードする核酸分子と前記第１機能結合フラグメント又は第２機能結合フラグメントをコードする核酸は、異なるＤＮＡ鎖に位置することを特徴とする、請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子。
  23. 請求項２２に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  24. 請求項２３に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
  25. 請求項２３に記載の発現ベクターによって形質転換された請求項２４に記載の宿主細胞を使用して、発現に適した条件で上記宿主細胞を培養し、発現させて前記二重特異性組換えタンパク質を得る、請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質の製造方法。
  26. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質を含む、医薬又は医薬組成物。
  27. 腫瘍、自己免疫性疾病、感染疾病、敗血症、移植片対宿主病、代謝障害、内分泌障害を治療するための医薬の製造における、請求項１～２１のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質の使用。
  28. 前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり、好ましくは、前記固形腫瘍は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、鼻咽頭癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫又は骨髄異形成症候群から選択されるいずれか１つであり、前記血液腫瘍は、骨髄腫、リンパ腫又は白血病から選択され、
    前記自己免疫性疾病は、橋本甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群から選択されるいずれか１つであり、
    前記感染疾病は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症及びその他の病原性感染症から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項２７に記載の使用。
JP2023518428A 2020-09-17 2021-09-17 二重特異性組換えタンパク質及びその使用 Pending JP2023543440A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010977716 2020-09-17
CN202010977716.2 2020-09-17
CN202110933105.2 2021-08-12
CN202110933105 2021-08-12
PCT/CN2021/119169 WO2022057909A1 (zh) 2020-09-17 2021-09-17 双特异性重组蛋白及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023543440A true JP2023543440A (ja) 2023-10-16

Family

ID=80646124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023518428A Pending JP2023543440A (ja) 2020-09-17 2021-09-17 二重特異性組換えタンパク質及びその使用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230365703A1 (ja)
EP (1) EP4253423A1 (ja)
JP (1) JP2023543440A (ja)
KR (1) KR20230070256A (ja)
CN (2) CN114195901A (ja)
AU (1) AU2021343594A1 (ja)
CA (1) CA3193073A1 (ja)
WO (1) WO2022057909A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2022325383A1 (en) * 2021-08-12 2024-02-15 Shanghai Jmt-Bio Technology Co., Ltd. GPC3-TARGETED ANTIBODY INTERFERON α FUSION PROTEIN AND USE THEREOF
CN116298305B (zh) * 2023-01-03 2024-05-28 郑州大学 一种抗nt5c1a自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3660893A (en) 1993-01-29 1994-08-15 Med Immune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
EP2898897A3 (en) 2004-07-09 2015-10-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
AU2007211334A1 (en) * 2006-02-01 2007-08-09 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
CN101490085A (zh) * 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
TWI686405B (zh) 2008-12-09 2020-03-01 建南德克公司 抗ｐｄ-ｌ１抗體及其於增進ｔ細胞功能之用途
TW201333035A (zh) * 2011-12-30 2013-08-16 Abbvie Inc 針對ｉｌ－１３及／或ｉｌ－１７之雙特異性結合蛋白
CN105324396A (zh) * 2013-03-15 2016-02-10 艾伯维公司 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白
TWI759810B (zh) * 2014-08-08 2022-04-01 美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途
EP3064507A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
US11518810B2 (en) 2017-05-08 2022-12-06 Shanghai Jmt-Bio Technology Co., Ltd. Bispecific recombinant protein and use thereof
CN111635458A (zh) * 2020-03-20 2020-09-08 上海健信生物医药科技有限公司 靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3193073A1 (en) 2022-03-24
US20230365703A1 (en) 2023-11-16
WO2022057909A1 (zh) 2022-03-24
KR20230070256A (ko) 2023-05-22
AU2021343594A1 (en) 2023-05-11
CN114195901A (zh) 2022-03-18
EP4253423A1 (en) 2023-10-04
CN116406380A (zh) 2023-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11970537B2 (en) Fusion protein dimer using antibody Fc region as backbone and use thereof
JP7488854B2 (ja) ヘテロダイマーＦｃ融合サイトカインおよびそれを含む医薬組成物
CN111511764B (zh) Clec9a结合剂及其用途
US20210024631A1 (en) Bi-functional proteins and construction thereof
RU2753882C2 (ru) Трифункциональная антигенсвязывающая молекула
CN111328286A (zh) Pd-1和pd-l1结合剂
JP2023011661A (ja) 標的化キメラタンパク質及びその使用
EP3665201A1 (en) Cd8 binding agents
EP3156417A1 (en) Multivalent fv antibodies
CN108250303B (zh) 单域抗体融合蛋白及其应用
JP2019506869A (ja) 二重特異性シグナル伝達物質およびその使用
WO2020259536A1 (zh) 单克隆抗体-细胞因子融合蛋白二聚体及其应用
WO2022057909A1 (zh) 双特异性重组蛋白及其用途
JP2014124186A (ja) 多価抗体フラグメントおよびその三量体化複合体
CN113795276A (zh) 成纤维细胞激活蛋白结合剂及其用途
CN114585377A (zh) 表达嵌合蛋白的t细胞
US20240182571A1 (en) New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
WO2024114605A1 (zh) 一种融合多肽及其用途
CN111511763B (zh) Cd8结合剂
CN117580855A (zh) 基于il-2的构建体
KLEY et al. Patent 3095310 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230405