CN115611976B - 一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位肽及其应用。该抗原表位肽包括如SEQ ID NO:1所示或与其同源性在83%以上的氨基酸序列。本发明的抗原表位肽广谱存在于高度同源的MICA/Bα3区的水解酶作用位点，可作为优势抗原表位制备出针对该表位的特异性抗人MICA/Bα3区抗体。该表位与其特异性抗体结合后能够阻断MICA/Bα3区水解，抑制细胞膜表面MICA/B脱落，从而增强NK细胞NKG2D受体介导的ADCC杀伤作用，在预防和治疗MICA/B+癌症或MICA/B相关的免疫性疾病中具有应用价值。

Description

一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位及其应用。
背景技术
NK细胞作为先天免疫的重要一员，在机体的抗肿瘤免疫反应中发挥第一道防线的关键作用，其可通过胚系编码模式识别肿瘤细胞，分泌穿孔素、颗粒酶B从而引起细胞杀伤效应。NKG2D受体是NK细胞的主要激活性受体，在几乎所有的NK细胞上都有表达，无需致敏即可直接与相应配体(NKG2DLs)结合而发挥作用。在基因组损伤的应激状态下，肿瘤细胞表面NKG2DLs表达上调，其中主要组织相容性复合体I类链相关蛋白(MIC)是一类重要的活化配体。
MIC基因座共有MICA-MICG七个成员，仅MICA和MICB基因可编码功能蛋白，且编码的蛋白MICA和MICB具有90％同源性，结构与HLA-I类分子相似，包括三个胞外区(α1、α2、α3)、一段跨膜区和短胞质尾区。位于膜远端的MICA/Bα1和α2区通过与NKG2D形成的同源二聚体高亲和力结合(亲和力约为0.5-1nM)，激活NK细胞，发挥免疫监视和杀伤肿瘤等一系列抗肿瘤免疫功能。而研究发现随着肿瘤生长增殖，MMPs家族中的MMP2、MMP9、MMP14和ADAMs家族中的ADAM9、ADAM10、ADAM15、ADAM17等多种金属蛋白酶均可切割MICA/Bα3区的水解位点，形成的可溶性MICA/B(sMICA/B)会封闭膜型MICA/B与NKG2D的结合位点并介导受体内吞来逃避免疫细胞的杀伤。因此上调肿瘤细胞表面MICA/B分子的表达，有效增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性，从而逆转肿瘤免疫逃逸反应是当前开发肿瘤免疫治疗的一个重要策略。
由于作用于MICA/Bα3区的水解酶众多，影响水解酶活性的因素多种多样，且这些酶也参与了正常细胞的生理功能，因此应用小分子酶特异性抑制剂来抑制MICA/B的脱落在临床上并不可取。尽管MICA/B基因具有高度多态性，仅MICA的等位基因目前就已发现100余个，但MICA/B的α3区高度同源，对此，开发出靶向MICA/Bα3区的特异性抗体、阻碍多种水解酶的作用位点是一种有效可行的治疗手段。
在此基础上，鉴定出MICA/Bα3区水解相关的抗原表位是当前的首要任务，获得的该表位序列可用于制备多肽-载体蛋白偶联物，进而作为优势抗原开发表位特异性抗体，由此简化了功能性抗体的筛选流程，节约了制备成本，为今后高通量、规模化生产治疗性抗人MICA/Bα3抗体药物提供了技术平台。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位肽及其应用。本发明的抗原表位广谱存在于高度同源的MICA/Bα3区的水解酶作用位点，可作为优势抗原表位制备出针对该表位的特异性抗人MICA/Bα3区抗体；该表位与其特异性抗体结合后能够阻断MICA/Bα3区水解，抑制细胞膜表面MICA/B脱落，进而增强NK细胞NKG2D受体介导的ADCC杀伤作用，在预防和治疗MICA/B+癌症或MICA/B相关的免疫性疾病中具有应用价值。
本发明的具体技术方案为：
第一，本发明提供了一种人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位，包括如SEQ ID NO:1所示或与其同源性在83％以上的氨基酸序列。
本发明的抗原表位存在于人MICA/B蛋白的α3区，与其特异性抗体结合后，能够阻断MICA/Bα3区水解，从而抑制MICA/B从肿瘤细胞膜表面脱落，使膜型MICA/B能与NKG2D(NK细胞的一个主要激活性受体)结合，同时减少可溶性MICA/B对NKG2D结合位点的封闭，进而增强NK细胞NKG2D受体介导的ADCC杀伤作用，防止肿瘤细胞实现“免疫逃逸”，有效抑制体内肿瘤的生长和转移。
作为优选，该表位通过氨基酸突变法和重叠多肽合成法鉴定。
进一步地，所述氨基酸突变法包括以下步骤：(1)设计PCR引物，构建编码氨基酸截短突变体或缺失突变体的表达质粒；(2)重组表达氨基酸截短或氨基酸缺失的MICA/Bα3蛋白并复性；(3)将步骤(2)中的蛋白稀释包被反应微孔，间接法ELISA检测抗体的结合情况。
进一步地，所述重叠多肽合成法包括以下步骤：(1)合成不同的一端逐渐缩短的重叠多肽；(2)利用步骤(1)中的多肽分别竞争性阻断抗体与MICA/Bα3蛋白的结合，ELISA检测多肽的阻断情况。
为提高鉴定效率，本发明设计的重叠多肽均在一端逐渐缩短两个氨基酸，因而抗原表位鉴定结果中C端氨基酸Q的必要性并不明确，其同源性可为83％以上(5/6)。
第二，本发明提供了一种多肽-载体蛋白偶联物，所述多肽包括所述抗原表位的氨基酸序列。
作为优选，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、鸡卵白蛋白或猪甲状腺球蛋白。
第三，本发明提供了一种利用所述多肽-载体蛋白偶联物制备针对人MICA/Bα3区水解相关抗原表位的特异性抗体的方法。
作为优选，所述方法包括以下步骤：利用所述多肽-载体蛋白偶联物免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清，进行筛选、鉴定与纯化。
第四，本发明提供了一种通过所述方法制得的针对人MICA/Bα3区水解相关抗原表位的特异性抗体。
采用上述方法制得的特异性抗体能通过结合本发明的抗原表位，抑制MICA/B从细胞膜表面脱落，减少可溶性MICA/B的产生，从而发挥抗肿瘤作用。
作为优选，所述特异性抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。
作为优选，所述细胞膜表面MICA/B脱落情况由流式细胞术(FCM)测得。
作为优选，所述可溶性MICA/B的水平由酶联免疫吸附试验(ELISA)测得。
第五，本发明提供了一种组合物，包含所述特异性抗体和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
第六，本发明提供了一种所述特异性抗体或所述组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防或治疗MICA/B+癌症或MICA/B相关的免疫性疾病。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位的氨基酸序列不同于已有文献或专利报道的抗人MICA/Bα3区单抗识别的抗原表位的氨基酸序列；
(2)本发明提供的人MICA/Bα3区水解相关的抗原表位为线性表位，易于制备多肽-载体蛋白偶联物，可作为优势抗原开发表位特异性抗体，为今后高通量、规模化生产治疗性抗人MICA/Bα3区抗体药物提供了技术平台；
(3)尽管MICA基因具有高度多态性，但MICA/B的α3区高度同源，本发明提供的抗原表位序列广谱存在于MICA/Bα3区的水解酶作用位点，因此获得的该表位特异性抗体具有更广泛的临床选择性；
(4)本发明提供的特异性识别并结合上述表位的针对人MICA/Bα3区的抗体能有效抑制MICA/B从细胞膜表面脱落，减少可溶性MICA/B的产生，增强NK细胞NKG2D受体介导的ADCC杀伤作用，在预防和治疗MICA/B+癌症或MICA/B相关的免疫性疾病中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为流式细胞术鉴定MIA-2抗体与抗原表位45SHDTQQ50的特异性结合，其中图A为FCM检测MIA-2抗体与HEK293T细胞表面MICA和MICAdel结合情况的散点图；图B为MIA-2抗体与MICA和MICAdel的结合率统计图；
图2为ELISA检测MIA-2抗体效价的OD450吸光度曲线；
图3为重组表达的MICAα3截短突变体的SDS-PAGE电泳验证，其中，Pro1、Pro2、Pro3和Pro4中，从左至右依次为：复性前上清、洗涤后上清和复性后上清；
图4为ELISA检测4个MICAα3截短突变体与MIA-2抗体结合情况的吸光值统计图；
图5为重组表达的MICAα3缺失突变体复性后上清的SDS-PAGE电泳验证；
图6为ELISA检测8个MICAα3缺失突变体与MIA-2抗体结合情况的吸光值统计图；
图7为ELISA检测Pep1-8重叠多肽阻断MICAα3蛋白与MIA-2抗体结合后的吸光值统计图，其中，多肽阻断浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml；
图8为ELISA检测MICAα3、SHDTQQWC-KLH及BSA-SHDTQQW蛋白与MIA-2抗体结合情况的吸光值统计图，其中，MIA-2抗体分别进行1:50、1:100和1:200倍稀释；
图9为ELISA检测1-4号小鼠血清效价；
图10为流式细胞术检测MIA-SQ抗体对肿瘤细胞膜表面MICA/B脱落的抑制能力，其中，图A为MIA-SQ抗体(右)、MIA-2抗体(左)及同型对照抗体分别作用于A375细胞(上)和HCT116细胞(下)后FCM检测得到不同抗体浓度下的峰叠加直方图；图B、C分别为FCM检测得到不同抗体浓度下A375细胞和HCT116细胞表面的MICA/B平均荧光强度；
图11为ELISA检测MIA-SQ抗体对肿瘤细胞膜表面MICA/B脱落的抑制能力，其中，图A为不同MIA-SQ抗体、MIA-2抗体及同型对照抗体浓度下A375细胞培养上清中脱落的sMICA/B含量；图B为不同MIA-SQ抗体、MIA-2抗体及同型对照抗体浓度下HCT116细胞培养上清中脱落的sMICA/B含量；
图12为MIA-SQ抗体治疗组、MIA-2抗体治疗组和同型抗体对照组的Balb/c裸鼠皮下移植瘤生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：抗MICAα3单克隆抗体效价检测
我们对抗人MICAα3区的单克隆抗体MIA-2(编码其重链和轻链的DNA序列分别如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示)进行ELISA效价检测。用包被缓冲液(CBS,pH9.6)将真核细胞表达的MICA重组蛋白稀释至20μg/ml，包被96孔板(JET BIOFIL)后4℃过夜，次日弃去孔内液体，1×TBST缓冲液洗涤4次，拍干。然后每孔加满1％ BSA进行封闭，37℃孵育1h后拍干。将1μg/ml的纯化抗体MIA-2进行10倍倍比稀释后每孔加入100μl，37℃孵育1h后洗涤4次并拍干。随后每孔加入100μl稀释(1:3000)的羊抗鼠二抗-HRP，37℃孵育30min后洗涤4次并拍干。于各反应孔中加入50μl TMB溶液A和50μl TMB溶液B，室温反应5min左右，加入50μl2M终止液终止反应。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处吸光值。结果如图2所示，MIA-2抗体的抗体效价达到1:250万。
实施例2：MICAα3截短突变体鉴定MIA-2抗体识别的抗原表位
(1)制备MICAα3截短突变体
我们以MICAα3-pUC57质粒(Origene公司)为模板，设计出4对如表1所示的引物序列，经PCR扩增、BamHI和HindIII双酶切后，将基因片段与pET42a载体连接，转化至BL21-DE3大肠杆菌中，再经IPTG诱导表达、包涵体复性和蛋白纯化，制备出4个C端融合His标签的MICAα3(全长氨基酸序列为SEQ IQ NO:4)截短突变体，分别为Pro1(AA22-112，SEQ IQ NO:5)、Pro2(AA42-112，SEQ IQ NO:6)、Pro3(AA59-112，SEQ IQ NO:7)和Pro4(AA81-112，SEQIQ NO:8)，经SDS-PAGE电泳验证，结果如图3所示。
表1编码MICAα3截短突变体Pro1-4的基因片段引物设计
(2)ELISA检测MIA-2抗体与截短突变体的结合情况
我们用包被缓冲液稀释Pro1-4蛋白至浓度为25μg/ml，包被96孔板(JET BIOFIL)后4℃封膜过夜，次日弃去板内液体，1×TBST缓冲液洗涤4次，拍干。然后每孔加满1％ BSA进行封闭，37℃孵育1h后拍干。将4mg/ml的MIA-2抗体进行1:100倍稀释后每孔加入100μl，37℃孵育1h后洗涤4次并拍干。随后每孔加入100μl稀释(1:3000)的羊抗鼠二抗-HRP，37℃孵育30min后洗涤4次并拍干。于各反应孔中加入50μl TMB溶液A和50μl TMB溶液B，室温反应5min左右，加入50μl 2M终止液终止反应。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处吸光值。
吸光值检测结果如图4所示，MIA-2抗体与Pro1、Pro2明显结合而与Pro3、Pro4的结合均较低，提示MIA-2抗体的识别位点位于MICAα3的第42-58位氨基酸中。
实施例3：MICAα3缺失突变体鉴定MIA-2抗体识别的抗原表位
(1)制备MICAα3缺失突变体
我们以MICAα3-pET32a质粒为模板，设计出8对如表2所示的引物序列，经PCR扩增、EcoRI和DpnI二次酶切后，将线性质粒重新连接成环，转化至BL21-DE3大肠杆菌中，再经IPTG诱导表达、包涵体复性和蛋白纯化，制备了8个MICAα3缺失突变体，分别为Prodel22-80(SEQ IQ NO:9)、Prodel31-51(SEQ IQ NO:10)、Prodel37-55(SEQ IQ NO:11)、Prodel37-51(SEQ IQNO:12)、Prodel39-48(SEQ IQ NO:13)、Prodel40-48(SEQ IQ NO:14)、Prodel40-46(SEQ IQ NO:15)和Prodel40-44(SEQ IQ NO:16)，经SDS-PAGE电泳验证，结果如图5所示。
表2编码MICAα3缺失突变体Prodel的基因片段引物设计
(2)ELISA检测MIA-2抗体与缺失突变体的结合情况
我们采用与实施例2步骤(2)相同的方法进行ELISA检测MIA-2抗体与缺失突变体的结合情况，结果如图6所示，Prodel22-80、Prodel31-51、Prodel37-55和Prodel37-51几乎不与MIA-2抗体结合，提示MIA-2抗体的识别位点位于MICAα3的37-51位氨基酸中。同时，相较于Prodel37-51而言，缺失片段N端逐渐缩短的Prodel39-48及Prodel40-48与MIA-2抗体的结合力有所增加但两者之间无明显差异，而缺失片段C端逐渐缩短的Prodel40-48、Prodel40-46及Prodel40-44的结合力逐渐增高，提示MIA-2抗体的识别位点位于上述推断氨基酸序列的C端，即45SHDTQQW51。
实施例4：重叠多肽法鉴定MIA-2抗体识别的抗原表位
我们合成了如表3所示的8段重叠多肽Pep 1-8，进行竞争性阻断ELISA，用包被缓冲液稀释MICAα3蛋白至浓度为25μg/ml，包被96孔板(JET BIOFIL)后4℃封膜过夜，次日弃去板内液体，1×TBST缓冲液洗涤4次，拍干。然后每孔加满1％ BSA进行封闭，37℃孵育1h后拍干。同时将各多肽分别配制为2mg/ml、1.5mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml，取60μl与等体积20μg/ml的MIA-2抗体混合，37℃反应1h，向封闭后的96孔板中各加100μl，37℃孵育1h后洗涤4次并拍干。随后每孔加入100μl稀释(1:3000)的羊抗鼠二抗-HRP，37℃孵育30min后洗涤4次并拍干。于各反应孔中加入50μl TMB溶液A和50μl TMB溶液B，室温反应5min左右，加入50μl2M终止液终止反应。使用酶标仪(美国Molecular Device公司)读取450nm处吸光值。
表3重叠多肽Pep 1-8的氨基酸序列
Pep 1 SHDTQQWGDVLPDGNGTYQTW
Pep 2 DTQQWGDVLPDGNGTYQTW
Pep 3 QQWGDVLPDGNGTYQTW
Pep 4 WGDVLPDGNGTYQTW
Pep 5 VSLSHDTQQWGDVLPDGNG
Pep 6 VSLSHDTQQWGDVLPDG
Pep 7 VSLSHDTQQWGDVLP
Pep 8 VSLSHDTQQWGDV
吸光值检测结果如图7所示，在重叠多肽Pep 1-8中仅Pep 4不能发挥阻断MIA-2抗体与MICAα3蛋白结合的作用，提示C端第51位W氨基酸不是MIA-2抗体识别MICAα3所必须的，进而将MIA-2抗体的识别位点精确至MICAα3的45SHDTQQ50(即SEQ ID NO:1)。
实施例5：流式细胞术鉴定MIA-2抗体与抗原表位45SHDTQQ50的特异性结合(1)构建MICAdel-pCMV6质粒
我们以MICA-pCMV6质粒(Origene公司)为模板，设计上游和下游引物分别为：
AATACTTAGGATCCTGGGGGGATGTCCTGCCT和ACTACTCAGGATCCCAAAGATACCCCATCCTG，经PCR扩增、BamHI和DpnI二次酶切后，将线性质粒重新连接成环，构建出编码SHDTQQ基因缺失的MICAdel-pCMV6质粒。
(2)质粒转染
①将HEK293T细胞铺至6孔板中，待细胞密度达90％时转染，转染时使用无血清DMEM培养基，每孔2ml；
②稀释质粒：取2个1.5ml离心管，均加入375μl的无血清DMEM培养基，再分别加入2.5μg的MICA-pCMV6质粒和MICAdel-pCMV6质粒，随后各加入15μl P3000试剂，用枪头充分混匀；
③稀释Lipo3000试剂：向750μl的无血清DMEM培养基中加入22.5μl的Lipo3000试剂，用枪头轻轻充分混匀；
④分别将375μl稀释后的Lipo3000试剂缓慢加入2管稀释后的质粒溶液中，加入后立即轻轻混匀，室温反应15min；
⑤按250μl/孔将质粒-Lipo3000复合物逐滴加入6孔板中，置于37℃CO2孵箱中过夜；
⑥转染24h后，将6孔板中的无血清培养基更换为DMEM完全培养基；48h后收集细胞用于后续实验。
(3)流式细胞术
①消化：选择转染48h后的HEK293T-MICA和HEK293T-MICAdel细胞，倒掉原有培养基，PBS洗涤1遍，各孔加入1ml 0.02％ EDTA溶液，37℃孵育4min后各孔加入1ml培养基吹打转移至15ml离心管，1,000rpm离心4min，弃去上清，PBS洗涤1遍；
②设组：向2种细胞中分别加入3.5ml PBS，重悬后各分装至7个1.5ml离心管中，500μl/管，3,500rpm离心4min，弃去上清，每种细胞分别设置空白组、阴性对照组、同型对照组、阳性对照组和实验组；
③孵育一抗：同型对照组中加入25μg/ml的鼠IgG2b同型抗体100μl，实验组分别加入25μg/ml、2.5μg/ml和0.25μg/ml的MIA-2抗体100μl，重悬后室温孵育30min；
④洗涤：孵育结束后，每管加入1ml PBS，3,500rpm离心4min，弃去上清，PBS洗涤2次；
⑤孵育二抗：用PBS按1:100配制PE-羊抗鼠流式二抗，向每管阴性对照组、同型对照组和实验组中加入100μl，用PBS按1:20配制PE-anti human MICA/MICB流式抗体，向阳性对照组管中加入100μl，重悬后避光4℃孵育30min；
⑥洗涤：同步骤④；
⑦上机检测：向各离心管中加入200-300μl PBS，重悬细胞沉淀后转移至流式管中，使用流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特公司)进行检测。
结果如图1所示，MIA-2抗体能够与天然构象的MICA全长蛋白高度结合而不能与45SHDTQQ50缺失的MICAdel蛋白结合，证实MIA-2抗体能够与抗原表位45SHDTQQ50特异性结合。
实施例6：制备针对人MICA/Bα3区水解相关抗原表位的单克隆抗体(1)合成多肽-载体蛋白偶联物
我们使用EDC偶联法合成了BSA-SHDTQQW多肽载体蛋白(N端偶联)和SHDTQQWC-KLH多肽载体蛋白(C端偶联)，通过间接法ELISA分别检测MIA-2抗体与两者的结合情况，具体方法与实施例2步骤(2)相同，结果如图8所示，MIA-2抗体可与SHDTQQWC-KLH结合而与BSA-SHDTQQW结合较弱，提示只有完整暴露抗原表位(SHDTQQ)的多肽载体蛋白偶联物才具有制备功能性表位特异性抗体的能力。鉴于BSA的稳定性，我们合成了SHDTQQWC-BSA偶联物用于后续小鼠免疫。
(2)多肽-BSA偶联物免疫小鼠
挑选4只6周龄的Balb/c小鼠，在屏障内适应1周后，以上述SHDTQQWC-BSA偶联物为抗原，首次免疫浓度为1mg/ml，小鼠免疫剂量为0.1ml/只，与弗氏完全佐剂1:1混匀后抽入注射器内；二免至五免抗原浓度为0.5mg/ml，免疫剂量为0.1ml/只，与弗氏不完全佐剂1:1混匀后抽入注射器内。在小鼠颈背部皮下多点注射完全乳化的抗原-佐剂混合物，首免21天后进行二免，以后免疫均相隔14天。
小鼠在经第5次免疫后用苦味酸标记，颌下静脉采血50μl，10,000g离心5min，取上清自1:10000倍比稀释至1:640000后，进行ELISA效价测定，结果如图9所示，我们选择抗体效价较高的1号小鼠，腹腔注射100ug抗原进行激发。
(3)杂交瘤细胞融合
脱颈法处死小鼠，在无菌条件下暴露脾脏，用镊子将脾细胞挤压出来，吹散并收集至15ml离心管中，洗涤后加入5ml IMEM培养液重悬细胞沉淀，得到脾细胞悬液；随后将IMEM培养液重悬的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞按1:10的比例混合，1,500rpm离心5min，倒掉上清，沿离心管管壁加入50％的PEG(MW4000)1ml，放置37℃水浴1min。吸取IMEM培养液40ml小心加入到细胞上，1,500rpm离心5min，弃去上清，加入DMEM培养液，重悬后将杂交瘤细胞悬液铺至96孔板中，6小时后每孔加入2×HAT培养液100μl，完成细胞融合，8-10天后取细胞培养上清筛选。
(4)ELISA克隆筛选
用包被缓冲液(CBS,pH9.6)将SHDTQQWC-KLH偶联物稀释至20μg/ml，包被96孔板(JET BIOFIL)后4℃过夜，次日弃去孔内液体，1×TBST缓冲液洗涤4次，拍干。然后每孔加满1％BSA进行封闭，37℃孵育1h后拍干。加入杂交瘤细胞培养上清100μl，37℃孵育1h后洗涤4次并拍干。随后每孔加入100μl稀释(1:3000)的羊抗鼠二抗-HRP，37℃孵育30min后洗涤4次并拍干。于各反应孔中加入TMB显色液，肉眼观察结果，挑选阳性克隆。通过3次有限稀释法与ELISA筛选得到了产生高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞，建株后扩大培养，并将收集的细胞上清液进行纯化，最终获得一株针对人MICA/Bα3区水解相关抗原表位的单克隆抗体：MIA-SQ。
实施例7：验证MIA-SQ抗体抑制肿瘤细胞膜MICA/B脱落功能的普遍性(1)流式细胞术检测MIA-SQ抗体对肿瘤细胞膜表面MICA/B脱落的抑制能力取对数生长期的A375细胞和HCT116细胞，消化计数，按1×105个/孔铺于24孔板中，每孔加DMEM培养液至500μl；待2h细胞贴壁后，分别加入0.1nM、1nM、10nM、100nM和1μM的MIA-SQ抗体和MIA-2抗体(以小鼠同型IgG抗体作为对照)；37℃CO2培养箱中孵育24h后，使用0.02％ EDTA溶液消化孔中细胞，留取培养上清用于后续实验；将消化得到的细胞移至1.5ml离心管中，3,500rpm离心5min，弃去上清，沉淀用PBS重悬，吹打混匀后再次3,500rpm离心5min；细胞沉淀用100μl FACSBuffer重悬，样品管每管加入PE anti-human MICA/B流式抗体5μl，避光4℃孵育30min，使用FACS Buffer 3,500rpm离心5min洗涤细胞沉淀3次，最后加入FACS Buffer 200μl重悬，流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特公司)检测。运用FlowJo V10.0软件分析流式数据，结果如图10所示，与MIA-2抗体一致，随MIA-SQ抗体浓度增高，A375细胞和HCT116细胞表面的MICA/B表达越高。
(2)ELISA检测MIA-SQ抗体对肿瘤细胞膜表面MICA/B脱落的抑制能力将上述经不同浓度MIA-SQ抗体和MIA-2抗体处理后的A375细胞和HCT116细胞培养上清进行ELISA检测sMICA/B，具体步骤均按照Human sMICA/B ELISA测定试剂盒(美国赛默飞公司)说明书操作。结果如图11所示，与MIA-2抗体一致，随MIA-SQ抗体浓度增高，A375细胞和HCT116细胞培养上清中脱落的MICA/B越少。
由于我们所用的黑色素瘤细胞系A375的基因分型为MICA*002等位基因，而结直肠癌细胞系HCT116为MICA*001等位基因，MIA-SQ抗体均可抑制两者细胞膜MICA/B的脱落，该功能具有普遍性。
实施例8：体内验证MIA-SQ抗体的抗肿瘤能力
将稳定表达MICA的HCT116细胞株复苏后常规培养，传至第3代时消化计数，PBS清洗2次，得到的细胞沉淀根据所需细胞量用适量无血清培养液重悬，吹打混匀后置于冰上；用1ml注射器接种细胞，按照每只200μl的体积接种于5周龄Balb/c裸鼠的左侧腋下脂肪垫处(约为4×106个细胞/只)；设置MIA-SQ抗体治疗组、MIA-2抗体治疗组和同型抗体对照组，在皮下接种细胞前一天，每只小鼠腹腔注射250μg/200μl的MIA-SQ抗体、MIA-2抗体或同型对照抗体，接种后第4、7、10天按照相同方式和剂量给药；每周监测肿瘤生长2次，用电子游标卡尺测量肿瘤长径及短径，体积＝长径×长径×短径/2。
结果如图12所示，MIA-SQ抗体明显抑制了HCT116-MICA细胞在Balb/c裸鼠肿瘤接种模型中的生长，且抑制效果与MIA-2抗体接近，具有良好的抗肿瘤能力。
本发明提供了在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实验例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种人MICA/B α3区水解相关的抗原表位、针对该表位的抗体及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ser His Asp Thr Gln Gln
1 5
<210> 2
<211> 1347
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
caggtgcagc tgaaagagtc tggacctgga ctggtggccc cttctcagtc cctgtctatc 60
acctgtaccg tgtccggctt ctccttcacc ggctatggcg tgaactgggt ccgacagcct 120
cctggcaaag gactggaatg gctgggaatg atctggggcg acggcaacac cgactacaac 180
tctgccctga agtcccggct gtccatctcc aaggacaact ccaagagcca ggtgttcctg 240
aagatgaact ccctgcagac cgacgacacc gctcggtact actgcgccag acggaacggc 300
aacttcagat acgctatgga ctactggggc cagggcacct ctgtgacagt ctcttctgct 360
tccaccaagg gcccctccgt gttccccctg gctccctctt ccaagagcac cagcggcggc 420
accgctgctc tgggatgtct ggtgaaggac tacttccctg agcctgtgac cgtgtcctgg 480
aattccggcg ccctgacctc cggcgtgcac acattccctg ctgtgctgca gtcctccggc 540
ctgtatagcc tgtcctccgt ggtgacagtg cctagctcca gcctgggcac ccagacctat 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcctagcaat accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgtcctcca tgtcctgctc cagaactgct cggcggacct 720
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag gacaccctga tgatcagcag aacccctgaa 780
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggatcccg aagtgaagtt caattggtac 840
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaacagc 900
acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 960
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgctccta tcgagaaaac catcagcaag 1020
gccaagggcc agcctaggga accccaggtt tacacactgc ctccaagcag ggacgagctg 1080
accaagaatc aggtgtccct gacctgcctg gtcaagggct tctacccttc cgatatcgcc 1140
gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg 1200
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagag cagatggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagtccctga gcctgtctcc tggcaaa 1347
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 3
gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtccgctt ctctcggcga gcgcgtgaca 60
atgacctgta ccgcctcttc cagcgtgtcc tcctcttacc tgcactggta tcagcagaag 120
cccggcagct ctcccaagct gtggatctac tccacctcca acctggcctc tggcgtgcca 180
gctagatttt ccggctctgg ctctggcacc tcctacagcc tgaccatctc cagcatggaa 240
gccgaggatg ccgccaccta ctactgccac cagtaccaca gaagcccctt caccttcggc 300
tccggcacca agctggaaat caagaggacc gtggctgccc ccagcgtgtt catcttccct 360
cctagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gctagcgtgg tgtgtctgct gaataacttc 420
tatcccaggg aggccaaggt gcagtggaag gtggataacg ccctgcagag cggcaactcc 480
caggagtccg tgaccgagca ggactccaag gacagcacct actccctgag ctccaccctg 540
accctgtcca aggctgatta tgagaagcac aaggtgtatg cttgcgaggt gacacaccag 600
ggcctgtcca gccctgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr
35 40 45
Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr
50 55 60
Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys
65 70 75 80
Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala
100 105 110
Val Ala Ala Ala
115
<210> 5
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp
1 5 10 15
Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp
20 25 30
Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg
35 40 45
Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser
50 55 60
Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu
65 70 75 80
Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala
85 90
<210> 6
<211> 71
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp
1 5 10 15
Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly
20 25 30
Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser
35 40 45
Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp
50 55 60
Gln Thr Phe His Val Ser Ala
65 70
<210> 7
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu
1 5 10 15
Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr
20 25 30
His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln
35 40 45
Thr Phe His Val Ser Ala
50
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly
1 5 10 15
Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala
20 25 30
<210> 9
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Glu Phe Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser
20 25 30
Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp
35 40 45
Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala
50 55
<210> 10
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Glu Phe
20 25 30
Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala
35 40 45
Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu
50 55 60
His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu
65 70 75 80
Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala
85 90 95
Ala
<210> 11
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Glu Phe Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp
35 40 45
Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr
50 55 60
Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys
65 70 75 80
Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val
85 90 95
Ala Ala Ala
<210> 12
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Glu Phe Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr
35 40 45
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50 55 60
Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val
65 70 75 80
Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His
85 90 95
Val Ser Ala Val Ala Ala Ala
100
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Trp Arg Glu Phe Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro
35 40 45
Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln
50 55 60
Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His
65 70 75 80
Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His
85 90 95
Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala
100 105
<210> 14
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Glu Phe Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu
35 40 45
Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys
50 55 60
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65 70 75 80
His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser
85 90 95
His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala
100 105
<210> 15
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Glu Phe Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp
35 40 45
Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg
50 55 60
Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser
65 70 75 80
Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu
85 90 95
Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala Ala
100 105 110
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu
1 5 10 15
Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn
20 25 30
Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Glu Phe Ser His Asp Thr Gln Gln Trp
35 40 45
Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala
50 55 60
Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu
65 70 75 80
His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu
85 90 95
Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His Val Ser Ala Val Ala Ala
100 105 110
Ala

Claims (6)

1. 一种人MICA/B α3区水解相关的抗原表位肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种多肽-载体蛋白偶联物，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SHDTQQWC。
3.如权利要求2所述的多肽-载体蛋白偶联物，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、鸡卵白蛋白或猪甲状腺球蛋白。
4.如权利要求2或3所述多肽-载体蛋白偶联物在制备针对人MICA/B α3区水解相关抗原表位的特异性抗体中的应用。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：利用所述多肽-载体蛋白偶联物免疫动物，获得杂交瘤细胞，收集培养上清，进行筛选、鉴定与纯化，得到针对人MICA/Bα3区水解相关抗原表位的特异性抗体。
6.如权利要求2或3所述多肽-载体蛋白偶联物在制备用于预防或治疗结直肠癌的药物中的应用。
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WO2018081648A2 (en) * 2016-10-29 2018-05-03 Genentech, Inc. Anti-mic antibidies and methods of use
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