ES2324320T3 - Variantes de herregulina. - Google Patents
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Abstract
Variante de herregulina-a1 humana, teniendo dicha variante una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza y la capacidad de unirse a un receptor ErbB con al menos un aumento de 5 veces en la afinidad por el receptor ErbB-3 con respecto a la herregulina de la que se obtiene la variante, donde dicha variante de herregulina comprende un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I; A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T138G, M226I; F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I; P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M; P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I; P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M; P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G; N223W, M226I; N223H, M226I; S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I; P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I; F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M; F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I; F197Y, M198R, D201T, M226I; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I; A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I; F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; y A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; donde los restos se numeran desde el extremo N de herregulina-beta1 humana nativa de 645 aminoácidos.
Description
Variantes de herregulina.
La presente invención se refiere a variantes de
herregulina, moléculas de ácido nucleico que codifican dichas
variantes y vectores, células huésped, composiciones farmacéuticas y
métodos relacionados.
En particular, la presente invención se refiere
a variantes de sustitución de aminoácidos de
herregulina-\beta1 humana que tienen una afinidad
aumentada por el receptor ErbB-3.
La transducción de señales que regulan el
crecimiento y la diferenciación celular está regulada en parte por
la fosforilación de diversas proteínas celulares. Las proteínas
tirosina quinasas son enzimas que catalizan este proceso. Se cree
que las proteínas tirosina quinasas receptoras dirigen el
crecimiento celular mediante fosforilación de tirosina estimulada
por ligando de proteínas intracelulares. Las proteínas tirosina
quinasas receptoras del factor de crecimiento de la subfamilia de la
clase I incluyen el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR) de 170 kilodalton (kDa) codificado por el gen erbB1.
erbB1 ha estado implicado en las causas del cáncer humano.
En particular, una mayor expresión de este gen se ha observado en
los carcinomas más agresivos de mama, vejiga, pulmón y estómago.
El segundo miembro de la subfamilia de clase I,
p185^{neu} (también llamado el receptor ErbB-2 o
p185^{HER2}), se identificó originalmente como el producto del gen
transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. El
gen neu (erbB2 o HBR2) codifica una proteína tirosina
quinasa receptora de 185 kDa.
La amplificación y/o sobreexpresión del gen
erbB2 humano se correlaciona con un mal pronóstico en
cánceres de mama y de ovario. Slamon et al., Science 235:
177-82 (1987); Slamon et al., Science 244:
707-12 (1989). La sobreexpresión de erbB2 se
ha correlacionado con otros carcinomas incluyendo carcinomas de
estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon y
vejiga. Por consiguiente, en la Patente de Estados Unidos Nº
4.968.603, Slamon et al., describen y reivindican diversos
ensayos de diagnóstico para determinar la amplificación o expresión
del gen erbB2 en células tumorales. Slamon et al.,
descubrieron que la presencia de múltiples copias del oncogén
erbB2 en células tumorales indica que es más probable que la
enfermedad se extienda más allá del punto del tumor primario, y
que, por lo tanto, la enfermedad puede necesitar un tratamiento más
agresivo del que, en caso contrario, podría estar indicado por otros
factores de diagnóstico. Slamon et al., concluyen que el
ensayo de amplificación del gen erbB2, junto con la
determinación del estado del ganglio linfático, proporciona una
utilidad de pronóstico enormemente mejorada.
Un gen adicional relacionado, llamado
erbB3 (o HER3), que codifica el receptor
ErbB-3 (p180^{HER3}) también se ha descrito.
Véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.183.884; Kraus et
al., PNAS USA 86: 9193-97 (1989); Solicitud de
Patente EP Nº 444.961A1; Kraus et al., PNAS USA 90:
2900-04 (1993). Kraus et al., (1989)
descubrieron que niveles marcadamente elevados de ARNm de
erbB3 estaban presentes en ciertas líneas celulares
tumorales mamarias humanas, lo que indicaba que erbB3, al
igual que erbB1 y erbB2, pueden jugar un papel en
cánceres humanos. Además, Kraus et al. (1993) mostraron que
la activación dependiente de EGF del dominio catalítico de
ErbB-3 de un receptor quimérico
EGFR/ErbB-3 dio como resultado una respuesta
proliferativa en células NIH-3T3 transfectadas.
Además, estos investigadores demostraron que algunas líneas
celulares tumorales mamarias humanas muestran una significativa
elevación de la fosforilación de tirosina del receptor
ErbB-3 en estado estacionario, lo que implicaba
además a este receptor en tumores humanos. El papel de erbB3
en el cáncer ha sido explorado por otros, y se ha descubierto que
este gen se sobreexpresa en cánceres de mama (Lemoine et
al., Br. J. Cancer 66: 1116-21 [1992]),
gastrointestinales (Poller et al., J. Pathol. 168:
275-80 [1992]; Rajkumer et al., J. Pathol.
170: 271-78 [1993]; Sanidas et al., Int. J.
Cancer 54: 935-40 [1993]), y pancreáticos (Lemoine
et al., J. Pathol. 168: 269-73 [1992], y
Friess et al., Clinical Cancer Research 1:
1413-20 [1995]).
La subfamilia de clase I de proteínas tirosina
quinasas receptoras del factor de crecimiento se ha ampliado
adicionalmente para incluir al receptor ErbB-4
(HER4), que es el producto del gen erbB4 (HER4). Véase la
Solicitud de Patente EP Nº 599.274; Plowman et al., PNAS USA
90: 1746-50 (1993); y Plowman et al., Nature
366: 473-75 (1993). Plowman et al.,
descubrieron que la expresión aumentada de erbB4 se
correlacionaba estrechamente con algunos carcinomas de origen
epitelial, incluyendo adenocarcinomas de mama. Los métodos de
diagnóstico para la detección de afecciones neoplásicas humanas
(especialmente cánceres de mama) que evalúan la expresión de
erbB4 se describen en la Solicitud de Patente EP Nº
599.274.
La búsqueda del activador del oncogén
erbB2 condujo al descubrimiento de una familia de
polipéptidos de herregulina. En seres humanos, los polipéptidos de
herregulina caracterizados hasta ahora se obtienen del corte y
empalme alterno de un único gen que fue mapeado en el brazo corto
del cromosoma 8 por Lee y Wood, Genomics 16: 790-91
(1993).
Holmes et al., aislaron y clonaron una
familia de activadores polipeptídicos para el receptor
ErbB-2 que llamaron
herregulina-\alpha (HRG-\alpha),
herregulina-\beta1 (HRG-\beta1),
herregulina-\beta2 (HRG-\beta2)
y herregulina-\beta3
(HRG-\beta3). Véase Holmes et al., Science
256: 1205-10 (1992); WO 92/20798; y Patente de
Estados Unidos Nº 5.367.060. Estos investigadores demostraron la
capacidad de los polipéptidos de herregulina purificados para
activar la fosforilación de tirosina del receptor
ErbB-2 en células tumorales de mama MCF7. Además,
la actividad mitogénica de los polipéptidos de herregulina sobre
células SK-BR-3 (que expresan
niveles altos del receptor ErbB-2) también se
demostró.
Las herregulinas son grandes proteínas
multi-dominio que se expresan habitualmente como
"pro-herregulinas". Las
pro-herregulinas han mostrado experimentar
procesamiento proteolítico hasta una forma soluble madura
(habitualmente de aproximadamente 44-45 kDa). Se ha
mostrado que el procesamiento se produce de forma intracelular o en
la superficie celular. Los dominios en la forma soluble incluyen
(en orden desde el extremo N al C) un dominio de homología a
inmunoglobulina (similar a Ig), una región espaciadora rica en
puntos de glicosilación y un dominio similar a un dominio
descubierto en EGF que es suficiente para la unión al y la
activación del receptor ErbB. Véase Barbacci, et al., J.
Biol. Chem. 270: 9585-89 (1995).
Los dominios similares a EGF de herregulina se
caracterizan por similitudes estructurales sustanciales a (Jacobsen
et al., Biochemistry 35: 3402-17 [1996]), y
homología en la secuencia limitada con, los restos
1-48 de EGF (Holmes, et al., supra).
Las similitudes funcionales entre los dominios similares a EGF de
herregulina y EGF se han establecido mediante datos que muestran
que los bloques de secuencia de EGF sustituidos en
herregulina-\beta1 no alteran la unión a células
que co-expresan ErbB-3 y
ErbB-2. Barbacci et al., supra.
Aunque las herregulinas son sustancialmente
idénticas en los primeros 213 restos de aminoácidos, se clasifican
en dos tipos principales, \alpha y \beta, en base a dos dominios
similares a EGF que difieren en sus partes
C-terminales. Por ejemplo, el dominio similar a EGF
de herregulina-\alpha difiere del de la isoforma
\beta1 en nueve sustituciones cerca del extremo C. Se ha descrito
que la isoforma \beta se une a receptores ErbB con
aproximadamente una afinidad de ocho a 10 veces mayor que la
isoforma \alpha. Wen et al., Mol. Cell. Biol. 14:
1909-19 (1994).
La estructura en solución del dominio EGF de
herregulina-\alpha se ha determinado recientemente
a alta resolución mediante RMN. Jacobsen et al.,
supra; Nagata et al., EMBO J. 13,
3517-3523 (1994). Las características principales
de este dominio incluyen (1) un subdominio
N-terminal que contiene una lámina \beta central
de tres cadenas con una hélice intermitente y (2) un subdominio
C-terminal más pequeño que contiene un corto tramo
de lámina \beta. El dominio de EGF se estabiliza mediante tres
puentes disulfuro, dos en el subdominio N-terminal
y uno en el subdominio C-terminal. El emparejamiento
de los seis restos cisteína correspondientes se conserva en los
dominios similares a EGF de todas las herregulinas y de EGF.
El factor de diferenciación neu (NDF) de 44 kDa,
que es el equivalente de rata de la HRG humana, fue descrito en
primer lugar por Peles et al., Cell, 69:
205-16 (1992) y Wen et al., Cell, 69:
559-72 (1992). Al igual que los polipéptidos de
herregulina humanos, NDF tiene un dominio similar a Ig seguido de un
dominio similar a EGF y carece de un péptido señal
N-terminal. Posteriormente, Wen et al.,
realizaron "clonación exhaustiva" para ampliar la familia de
NDF. Wen et al., Mol. Cell. Biol., 14:
1909-19 (1994). Este trabajo mostró seis
pro-NDF fibroblásticos distintos. Adoptando la
nomenclatura de Holmes et al., los NDF se clasificaron como
polipéptidos \alpha o \beta en base a las secuencias de los
dominios similares a EGF. Las isoformas 1 a 4 se caracterizan en
base a una región variable entre el dominio similar a EGF y el
dominio transmembrana. Además, las isoformas a, b y c se definen en
base a dominios citoplásmicos de longitud variable. Estos
investigadores concluyen que diferentes isoformas de NDF se generan
mediante corte y empalme alternativo y realizan distintas funciones
específicas de tejido. Véase también EP 505 148; WO 93/22424; y WO
94/28133 (que describen NDF).
Falls et al., Cell 72:
801-815 (1993) describen otro miembro de la familia
de herregulina que llaman "polipéptido con actividad inductora de
receptores de acetilcolina (ARIA)". El polipéptido ARIA obtenido
de pollo estimula la síntesis de receptores de acetilcolina
musculares. Véase WO 94/08007. ARIA es una herregulina de tipo
\beta y carece de toda la región espaciadora entre el dominio
similar a Ig y el dominio similar a EGF de
HRG-\alpha y
HRG\beta1-\beta3.
Marchionni et al., Nature 362:
312-318 (1993) identificaron varias proteínas
obtenidas de bóvidos que llaman "factores de crecimiento gliales
(GGF)". Estos GGF comparten el dominio similar a Ig y el dominio
similar a EGF con las otras proteínas de herregulina descritas
anteriormente, pero además tienen un domino kringle
amino-terminal. Los GGF generalmente no tienen la
región espaciadora completa entre el dominio similar a Ig y el
dominio similar a EGF. Solamente uno de los GGF, GGFII, tiene un
péptido señal N-terminal. Véase también WO
92/18627; WO 94/00140; WO 94/04560; WO 94/26298; WO 95/32724 (que
describen GGF y usos de los mismos).
Ho et al., describen otro miembro de la
familia de herregulina llamado "factor derivado de neuronas
sensoriales y motoras (SMDF)". Ho et al., J. Biol. Chem.
270: 14523-32 (1995). Esta proteína tiene un dominio
similar a EGF característico de todos los demás polipéptidos de
herregulina pero un dominio N-terminal distinto.
Además, SMDF carece tanto del dominio similar a Ig como de la región
espaciadora descubierta en otros polipéptidos de herregulina. Otra
característica de SMDF es la presencia de dos tramos de aminoácidos
hidrofóbicos cerca del extremo N.
Aunque los polipéptidos de herregulina se
identificaron en primer lugar en base a su capacidad para activar
el receptor ErbB-2 (véase Holmes et al.,
supra), se descubrió que algunas células de ovario que
expresan neu (erbB2) y fibroblastos transfectados con neu no
se unían ni reticulaban con NDF, ni experimentaban fosforilación de
tirosina en respuesta a NDF. Peles et al., EMBO J. 12:
961-71 (1993). Este descubrimiento indicaba que era
necesario otro componente celular para otorgar una completa
sensibilidad a herregulina.
Carraway et al., posteriormente
demostraron que
^{125}I-rHRG-\beta1
177-244 se unía a fibroblastos de
NIH-3T3 transfectados de forma estable con
erbB3 bovino pero no a células parentales no transfectadas.
Estos investigadores también expresaron receptor
ErbB-3 bovino en células de insecto y mostraron que
HRG-\beta1 177-244 se unía a una
preparación de receptor ErbB-3 solubilizado a partir
de estas células. Los investigadores concluyeron que
ErbB-3 es un receptor para herregulina y media la
fosforilación de restos tirosina intrínsecos así como la
fosforilación del receptor ErbB-2 en células que
expresan ambos receptores. Carraway et al., J. Biol. Chem.
269: 14303-06 (1994). Sliwkowski et al.,
descubrieron que las células transfectadas con erbB3 en
solitario muestran bajas afinidades por herregulina, mientras que
las células transfectadas con erbB2 y erbB3 muestran
afinidades más altas. Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269:
14661-65 (1994).
Plowman y sus colegas han estudiado de forma
similar la activación del receptor
ErbB-4/ErbB-2. Ellos expresaron el
receptor ErbB2 en solitario, el receptor ErbB4 en solitario, o los
dos receptores juntos en linfocitos T humanos y demostraron que la
herregulina es capaz de estimular la fosforilación de tirosina de
ErbB-4, pero solamente podía estimular la
fosforilación de ErbB-2 en células que expresan
ambos receptores. Plowman et al., Nature 336:
473-75 (1993).
Estas observaciones son coherentes con el
concepto de "conversación cruzada del receptor"
(cross-talking) descrito anteriormente por
Kokai et al., Cell 58: 287-92 (1989), Stern
et al., EMBO J. 7: 995-1001 (1988), y King
et al., 4: 13-18 (1989). Estos investigadores
descubrieron que la unión de EGF al EGFR daba como resultado la
activación del dominio quinasa de EGFR y la fosforilación cruzada
del receptor ErbB-2. Se cree que esto es un
resultado de la heterodimerización del receptor inducida por ligando
y la fosforilación cruzada concomitante de los receptores en el
heterodímero. Wada et al., Cell 61: 1339-47
(1990).
Por lo tanto, se cree que los receptores ErbB se
activan mediante dimerización del receptor inducida por ligando.
Específicamente, las herregulinas pueden unirse por separado a
receptores ErbB-3 y ErbB-4, pero no
al receptor ErbB-2. Sin embargo,
ErbB-2 es necesario para la señalización y los
heterodímeros que contienen ErbB-2 en combinación
con ErbB-3 o ErbB-4 se unen a
herregulinas con mayor afinidad que los homodímeros que contienen
ErbB-3 o ErbB-4. Plowman et
al., Nature 366: 473-75 (1993); Sliwkowski et
al., J. Biol. Chem. 269: 14661-65 (1994).
Las actividades biológicas de herregulinas han
sido investigadas por varios grupos. Por ejemplo, Holmes et
al. (supra) descubrieron que la herregulina ejerce un
efecto mitogénico sobre líneas celulares mamarias (tales como
SK-BR-3 y MCF-7).
Lewis et al., describieron que la
herregulina-\beta1 estimulaba la proliferación y
aumentaba la formación de colonias en agar blando en varias líneas
celulares tumorales de mama y de ovario humanas. Lewis et
al., Cancer Research 56: 1457-65 (1996). Estos
investigadores también demostraron que ErbB-2 es un
mediador crítico en la sensibilidad a herregulina.
Pinkas-Kramarski et al.,
descubrieron que NDF (herregulina de rata) se expresa en neuronas y
células gliales en cerebro de rata embrionario y de adulto y
cultivos primarios de células de cerebro de rata, y sugirieron que
NDF puede actuar como un factor de supervivencia y maduración para
astrocitos. Pinkas-Kramarski et al., PNAS
USA 91: 9387-91 (1994). Danilenko et al.,
describieron que la interacción de NDF y el receptor
ErbB-2 es importante para dirigir la migración y
diferenciación epidérmica durante la cicatrización de heridas.
Danilenko et al., Abstract 3101, FASEB
8(4-5): A535 (1994).
Meyer y Birchmeier analizaron la expresión de
herregulina de ratón durante la embriogénesis y en el animal
perinatal usando experimentos de hibridación in situ y
protección de ARNasa. Meyer y Birchmeier, PNAS USA 91:
1064-68 (1994). Estos autores concluyen, en base a
la expresión de esta molécula, que la herregulina juega un papel
in vivo como factor mesenquimático y neuronal. Estos
descubrimientos también indicaban que la herregulina tiene una
función en el desarrollo de los epitelios.
Falls et al. (supra) descubrieron
que el ARIA de pollo juega un papel en la diferenciación del
miotubo, concretamente afectando a la síntesis y concentración de
receptores de neurotransmisor en las células musculares
postsinápticas de neuronas motoras. Corfas y Fischbach demostraron
que ARIA también aumenta el número de canales de sodio en el
músculo de pollo. Corfas y Fischbach, J. Neuroscience 13:
2118-25 (1993).
Se ha descrito que los GGF bovinos son
mitogénicos para células de Schwann. Véase por ejemplo, Brockes
et al., J. Biol. Chem. 255: 8374-77 (1980);
Lemke y Brockes, J. Neurosci. 4: 75-83 (1984);
Brockes et al., J. Neuroscience 4: 75-83
(1984); Brockes et al., Ann. Neurol. 20:
317-22 (1986); Brockes, Methods in Enzym. 147:
217-225 (1987); Marchionni et al.,
supra. Las células de Schwann proporcionan la formación de
vainas de mielina alrededor de los axones de neuronas mielinizadas
y, por lo tanto, juegan un papel importante en el desarrollo,
función y regeneración de nervios periféricos. Las implicaciones de
este papel desde un punto de vista terapéutico han sido señaladas
por Levi et al., J. Neuroscience 14: 1309-19
(1994). Levi et al., describieron el potencial para la
construcción de una prótesis celular que incluye células de Schwann
que podían transplantarse en áreas de médula espinal dañada. Se han
descrito métodos para cultivar células de Schwann ex vivo.
Véase WO 94/00140; Li et al., J. Neuroscience 16:
2012-19
(1996).
(1996).
\global\parskip0.870000\baselineskip
GGFII ha demostrado ser mitogénico para
mioblastos humanos quiescentes subconfluentes, y la diferenciación
de mioblastos humanos clonales en presencia continua de GGFII da
como resultado un mayor número de miotubos después de seis días de
diferenciación. Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462,
18D, 540 (1994); véase también WO 94/26298.
La relación entre la estructura y función de
nuevas proteínas puede investigarse usando cualquiera de diversas
técnicas de análisis mutacional disponibles. Los ejemplos de dichas
técnicas incluyen mutagénesis por barrido de alanina y presentación
en fagémidos. El barrido de alanina puede usarse para identificar
restos activos (es decir, restos que tienen un efecto significativo
sobre la función de la proteína) en una proteína o dominio
proteico. Por ejemplo, Cunningham y Wells usaron barrido de alanina
para identificar restos en la hormona del crecimiento humana que
eran importantes para la unión a su receptor. Cunningham y Wells,
Science 244: 1081-85 (1989). En el barrido de
alanina, un gen que codifica la proteína o dominio a barrer se
inserta en un vector de expresión, y se realiza la mutagénesis para
generar una serie de vectores que codifican proteínas o dominios en
los que restos secuenciales se convierten en alanina. Las proteínas
o dominios codificados se expresan a partir de estos vectores, y
las actividades de las variantes sustituidas por alanina se ensayan
a continuación para identificar aquellas con actividad alterada. Una
alteración de la actividad indica que el resto en la posición
sustituida por alanina es un resto activo.
La presentación en fagémidos se desarrolló para
permitir el cribado de gran número de polipéptidos variantes para
una actividad de unión particular. Smith y Parmley demostraron que
pueden "presentarse" eficazmente péptidos extraños en la
superficie de fagos filamentosos insertando fragmentos génicos
cortos en el gen III del fago fd. Smith, Science 228:
1315-17 (1985); Parmley y Smith, Gene 73:
305-18 (1985). La proteína de la envuelta del gen
III está presente en aproximadamente cinco copias en un extremo de
la partícula de fago. Los fagos modificados se denominaron "fagos
de fusión" puesto que presentaban los péptidos extraños
fusionados a la proteína de la envuelta del gen III. Puesto que
cada partícula de fago de fusión presentaba aproximadamente cinco
copias de la proteína de fusión, este modo de presentación en fagos
se denominó "presentación polivalente".
Scott et al. y Cwirla et al.,
mostraron que las bibliotecas de presentación en fagos de fusión
podían cribarse mediante selecciones secuenciales por afinidad
conocidas como "panning" (o inmunopurificación) Scott
et al., Science 249: 386-90 (1990); Cwirla
et al., PNAS USA 87: 6378-82 (1990). Sin
embargo, los primeros esfuerzos para seleccionar fagos de fusión de
alta afinidad fracasaron, presumiblemente debido a la polivalencia
de las partículas de fago. Este problema se resolvió con el
desarrollo de un "sistema de presentación en fagos
monovalente" en el que la proteína de fusión se expresa a un
nivel bajo a partir de de un fagémido y un fago ayudante
proporciona un gran exceso de proteína de la envuelta de tipo
salvaje. Bass et al., Proteins 8: 309-14
(1990); Lowman et al., Biochem. 30: 10832-38
(1991). La presentación en fagos monovalente puede usarse para
generar y cribar gran número de polipéptidos variantes para aislar
aquellos que se unen con alta afinidad a una diana de interés.
La presente invención proporciona una variante
de herregulina que tiene una secuencia de aminoácidos que no se
encuentra en la naturaleza y la capacidad de unirse a un receptor
ErbB, con al menos un aumento en 5 veces de la afinidad por el
receptor ErbB-3 con respecto a la herregulina de la
que se obtiene la variante, donde dicha variante de herregulina
comprende un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas
entre
A183G, E184W, K185D, E186R K187E, T188G,
M2261;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G,
M226I;
F197Y, M198K, K200R, D201I, M2261;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M2261;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R,
K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M2261;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, M226I;
A183G, K18SE, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185F, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, N223H, M226I; y
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I;
donde los restos se numeran desde el extremo N
de herregulina-\beta1 humana nativa de 645
aminoácidos.
La variante de herregulina puede ser una
variante de cualquier miembro de la familia de herregulina de
cualquier especie. En una realización, la variante de herregulina es
una variante de una herregulina humana, tal como, por ejemplo,
herregulina-\beta1 humana.
Algunas variantes de herregulina de la invención
que tienen conjuntos de sustituciones de aminoácidos muestran al
menos un aumento en 50 veces de la afinidad por el receptor
ErbB-3, que también está acompañado por un aumento
de la afinidad por el receptor ErbB-4.
Además de incluir una o más de las mutaciones
descritas en este documento, la variante de herregulina puede tener
una o más modificaciones diferentes, tales como una sustitución de
aminoácidos, una inserción de al menos un aminoácido, una
eliminación de al menos un aminoácido o una modificación química.
Por ejemplo, la presente invención proporciona una variante de
herregulina que es un fragmento. En una variación de esta
realización, el fragmento incluye restos correspondientes a una
parte de herregulina-\beta1 humana que se
extienden de aproximadamente el resto 175 a aproximadamente el resto
230 (es decir, el dominio similar a EGF).
Además de una variante de herregulina, la
presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico,
vector y célula huésped relacionada. La presente invención también
proporciona un método de producción de una variante de herregulina
en el que una célula huésped que contiene un vector de expresión
capaz de expresar la variante de herregulina se cultiva en
condiciones que permiten la expresión de la variante de herregulina,
y a continuación la variante de herregulina se recupera del
cultivo.
Otros aspectos de la invención se refieren a
diversos usos de una variante de herregulina. Por ejemplo, la
presente invención proporciona un método de unión a un receptor ErbB
en el que la variante de herregulina se pone en contacto con una
célula que expresa un receptor ErbB. La variante de herregulina
puede ponerse en contacto con células en cultivo, por ejemplo, para
promover la supervivencia, proliferación o diferenciación ex
vivo de células, tales como células gliales, de Schwann o
musculares.
Como alternativa, la variante de herregulina
puede combinarse con un portador farmacéuticamente aceptable y
usarse para tratar uno de una amplia gama de cánceres, así como
enfermedades y trastornos que afectan al sistema nervioso,
musculatura y epitelios. Por lo tanto, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica.
La presente invención también incluye un método
para determinar si una muestra contiene un receptor ErbB que se une
a herregulina. En particular, una variante de herregulina se pone en
contacto con una muestra, y la unión específica entre la variante
de herregulina y un componente de la muestra se determina como una
indicación de la presencia y/o cantidad de receptor o receptores
ErbB presentes en la muestra.
La Figura 1 muestra un alineamiento entre las
secuencias de aminoácidos en los dominios similares a EGF de varios
polipéptidos de herregulina y la secuencia de aminoácidos del
dominio similar a EGF de herregulina-\beta1
humana ("beta1"). Las secuencias alineadas son las siguientes:
herregulina-\alpha humana (alfa),
herregulina-\beta2 y -\beta3 humana (beta2 y
beta3), factores de diferenciación neu a2 y b1 a b4 (ndfa2 y
ndfb1-4), factor de crecimiento glial II (ggf),
factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (smdf),
herregulina-\gamma humana, y polipéptido que
induce la actividad de receptores de acetilcolina (aria). El número
mostrado para cada secuencia es el número de restos del primer
aminoácido mostrado, según se numera desde el extremo N del
polipéptido nativo cuya secuencia se muestra. "#" indica las
diferencias entre los dominios similares a EGF de tipo \alpha y
\beta.
\global\parskip0.850000\baselineskip
La Figura 2 muestra los resultados de un barrido
de alanina del dominio similar a EGF de
herregulina-\beta1 (restos
177-228 de herregulina-\beta1).
Los aminoácidos individuales en este dominio se mutaron a alanina y
se presentaron de forma monovalente en fagos como proteínas de
fusión a gIII, como se describe en el Ejemplo 2. El histograma
muestra el cambio de afinidad de unión de cada variante de alanina
por fusiones del receptor ErbB-3 y
ErbB-4-Ig
(ErbB-3-Ig e
ErbB-4-Ig), según lo medido con
ELISA de fagos. El eje X enumera cada aminoácido que se cambió por
alanina y su posición. El eje Y es la relación de la CE_{50} para
cada variante con respecto a la CE_{50} para el dominio similar a
EGF de herregulina-\beta1 de tipo salvaje, también
presentado en un fago. La CE_{50} se calculó como la
concentración de fusión de receptor soluble necesaria para desplazar
el 50% de la cantidad total de fago unido a una fusión de receptor
inmovilizada. Los resultados de unión a ErbB-3 se
muestran con barras negras, y los resultados de unión a
ErbB-4 se muestran con barras blancas.
La Figura 3 muestra los aminoácidos
seleccionados para la unión a
ErbB-3-Ig en cada posición en el
dominio similar a EGF de herregulina-\beta1
(restos 177-228 de
herregulina-\beta1) aleatorizado en los estudios
de presentación en fagos descritos en el Ejemplo 3. La longitud de
las barras indica la frecuencia de aparición de un aminoácido
particular en cada posición en las variantes de bibliotecas de
presentación en fagos A-E y G-I
para las que se determinaron secuencias (es decir, una barra más
larga indica una mayor frecuencia). Se secuenciaron doce clones de
cada biblioteca, aunque en la biblioteca H, solamente un clon de los
doce representaba una variante que tiene mutaciones en la ventana
de aleatorización deseada (véase el Ejemplo 3). "WT" indica la
secuencia de aminoácidos de tipo salvaje del dominio similar a EGF
de herregulina-\beta1.
La Figura 4 muestra las sustituciones de
aminoácidos en los dominios similares a EGF de variantes de
combinación descritas en el Ejemplo 3. La secuencia de aminoácidos
del dominio similar a EGF de herregulina-\beta1 de
tipo salvaje (HRG8), una variante de este dominio que contiene una
eliminación de los restos 202-204 de
herregulina-\beta1 (HRG63), y el dominio análogo
en EGF se muestran en la parte superior. La numeración de restos
para la parte de la secuencia de aminoácidos de
herregulina-\beta1 mostrada se indica encima de
esta secuencia (numerada desde el extremo N de la
herregulina-\beta1 humana nativa). La numeración
de restos para la parte de la secuencia de aminoácidos de EGF
mostrada se indica debajo de esta secuencia (numerada desde el
extremo N de EGF humano nativo). Un "." indica un resto que es
idéntico al resto de tipo salvaje en la posición particular. Una
"-" indica la ausencia de un resto.
La presente invención proporciona una variante
de herregulina-\beta1 humana, teniendo dicha
variante una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la
naturaleza y la capacidad de unirse a un receptor ErbB con al menos
un aumento en 5 veces de la afinidad por el receptor
ErbB-3 con respecto a la herregulina de la que se
obtiene la variante, donde dicha variante de herregulina comprende
un conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G,
M226I;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G,
M226I;
F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M226I;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R,
K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, N223H, M226I; y
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I;
donde los restos se numeran desde el extremo N
de herregulina-\beta1 humana nativa de 645
aminoácidos.
Además de las sustituciones de aminoácidos
especificadas en este documento, las variantes de herregulina según
la presente invención pueden tener modificaciones adicionales,
incluyendo, por ejemplo, eliminaciones de aminoácidos. En una
realización, una variante de herregulina tiene eliminaciones N- y
C-terminales, dejando solamente aminoácidos
correspondientes a "el dominio similar a EGF mínimo" que es
suficiente para la unión a y la activación de un receptor ErbB.
Una variante de herregulina de la invención es
capaz de unirse al receptor ErbB-3. Además de la
unión al receptor ErbB, la variante de herregulina puede poseer una
o más actividades biológicas diferentes de una herregulina
nativa.
La presente invención también proporciona
moléculas de ácido nucleico, vectores y células huésped relacionadas
con las variantes de herregulina. Una molécula de ácido nucleico de
la invención codifica, o es complementaria a una molécula de ácido
nucleico que codifica, una variante de herregulina de la invención o
un fragmento de la misma. La molécula de ácido nucleico puede ser
ADN o ARN de cadena doble o sencilla. Una molécula de ácido
nucleico de la invención puede insertarse en un vector apropiado
para la propagación y/o expresión de una variante de herregulina
codificada. Dichos vectores se introducen en huéspedes adecuados,
por ejemplo, para permitir la reproducción recombinante de una
variante de herregulina.
Las variantes de herregulina de la invención son
útiles en diversas aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas. En
particular, las variantes de herregulina pueden usarse para tratar
cáncer y diversas enfermedades y trastornos del sistema nervioso,
musculatura y epitelios. Por consiguiente, la presente invención
abarca una composición farmacéutica que incluye una variante de
herregulina.
Las variantes de herregulina también pueden
emplearse en diversas aplicaciones no terapéuticas, tales como
métodos de cultivo celular y métodos de diagnóstico. Por ejemplo,
las variantes de herregulina pueden usarse para promover la
supervivencia, proliferación o diferenciación ex vivo de
células, incluyendo células gliales y musculares. En una aplicación
de diagnóstico ejemplar, se emplean variantes de herregulina en el
diagnóstico de un cáncer caracterizado por sobreexpresión de
erbB (por ejemplo, erbB2).
Como se usan en este documento, las siguientes
palabras o frases tienen las definiciones que se indican
posteriormente, a no ser que se indique otra cosa.
Los términos "aminoácido" y "resto" se
usan de forma intercambiable en este documento.
La expresión "aminoácido de tipo salvaje" o
"resto de tipo salvaje" significa el aminoácido presente en
una posición o posiciones dadas en un polipéptido nativo.
Los aminoácidos se representan en este documento
mediante el código estándar de tres letras o una letra.
Se dice que los restos en dos o más polipéptidos
"se corresponden" si los restos ocupan una posición análoga en
las estructuras polipeptídicas. Como se conoce bien en el sector,
posiciones análogas en dos o más polipéptidos pueden determinarse
alineando las secuencias polipeptídicas en base a la secuencia de
aminoácidos o a similitudes estructurales. Los expertos en la
materia comprenden que puede ser necesario introducir huecos en
cualquier secuencia para producir un alineamiento satisfactorio. Por
ejemplo, los restos en EGF humano que corresponden a restos en
herregulina-\beta1 humana se muestran en un
alineamiento entre la secuencia de aminoácidos del dominio similar
a EGF de herregulina-\beta1 (restos
177-228 de herregulina-\beta1) y
el dominio de EGF análogo (restos 1-48 de EGF) en
la
Figura 4.
Figura 4.
Se dice que los restos en dos o más herregulinas
se "corresponden" si los restos se alinean en el mejor
alineamiento de secuencia. El "mejor alineamiento de secuencia"
entre dos polipéptidos se define como el alineamiento que produce
el mayor número de restos idénticos alineados. El mejor alineamiento
de secuencia para varios polipéptidos de herregulina se muestra en
la Figura 1.
Las posiciones de restos en
herregulina-\beta1 se designan en este documento
mediante el código de tres letras o de una letra para el
aminoácido, seguido del número de posición, numerado desde el
extremo N de
pro-herregulina-\beta1 humana
nativa (que tiene 645 aminoácidos de longitud). Por ejemplo, la
serina en la posición 177 de herregulina-\beta1
se denomina "Ser177" o "S177".
En lo sucesivo en este documento, a no ser que
se indique otra cosa, las posiciones de los restos en una
herregulina, variante de herregulina o proteína relacionada, tal
como EGF, se especifican en este documento en referencia a la
numeración de aminoácidos de herregulina-\beta1
humana nativa. Por ejemplo, una variante de
herregulina-\beta1 puede tener una eliminación
N-terminal de los restos 1-176. El
primer aminoácido en esta variante se identifica en este documento
como "el resto correspondiente a Ser177 de
herregulina-\beta1 humana de 645 aminoácidos"
puesto que el primer resto de la variante de herregulina y Ser177 de
herregulina-\beta1 están alineados en el mejor
alineamiento entre los dos polipéptidos.
El ejemplo 3 describe variantes de
herregulina-\beta1 que contienen restos
correspondientes a los restos 177 a 228 de
herregulina-\beta1, que se denomina "el dominio
similar a EGF mínimo". Para estas variantes, los números de
restos también se expresan, entre paréntesis, en términos de la
posición del resto en el dominio similar a EGF mínimo (en lo
sucesivo en este documento "herregulina-\beta1
EGF" o "HRG-\beta1 EGF"), es decir, los
restos 1-52. Las posiciones de los restos numeradas
según la herregulina-\beta1 humana nativa pueden
convertirse en posiciones de restos en el dominio similar a EGF
mínimo restando 176 del número de posición original. Por ejemplo,
para herregulina-\beta1 Ser177, la resta de 176 de
177 da 1, y de este modo herregulina-\beta1 EGF
Ser1 identifica la misma posición que
herregulina-\beta1 Ser177. El mismo sistema de
numeración se usa en el Ejemplo 4.
Las sustituciones de aminoácidos se indican
enumerando la posición del resto seguida del código para el
aminoácido sustituido en el polipéptido de herregulina. De este
modo, una sustitución de alanina en Ser177 de
herregulina-\beta1 se expresa como
"herregulina-\beta1 Ser177Ala",
"Ser177Ala", o "S177A". En este ejemplo, serina es el
"aminoácido sustituido", y alanina es el "aminoácido de
sustitución".
Como se usa para describir dos secuencias de
aminoácidos, el término "homólogas" indica que las secuencias
de aminoácidos tienen cierto grado de identidad en la secuencia de
aminoácidos.
La presente invención incluye una variante de
herregulina. La expresión "variante de herregulina" significa
una variante polipeptídica de una herregulina nativa. Una
herregulina nativa se define como un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos de longitud completa de cualquiera de la
familia de polipéptidos de herregulina de origen natural. Esta
familia abarca pro-herregulinas así como las formas
solubles de estas proteínas. La presente invención se ejemplifica
con variantes de herregulina-\beta1 humana. Véase
los Ejemplos 1-3. Sin embargo, la familia de
herregulina abarca cualquier polipéptido de origen natural que tiene
un dominio similar a EGF que tiene al menos el 70 por ciento de
identidad en la secuencia con el dominio similar a EGF de
herregulina-\beta1 cuando estos dominios se
alinean en el mejor alineamiento. Por lo tanto, una herregulina
nativa puede ser de cualquier especie y una entre varias isoformas o
formas alélicas de origen natural. Los polipéptidos de herregulina
ejemplares incluyen factores de diferenciación neu, factores de
crecimiento gliales, factor derivado de neuronas sensoriales y
motoras, y polipéptido que induce la actividad de receptores de
acetilcolina.
La variante de herregulina puede ser una
variante de una herregulina de mamífero. En una variación de esta
realización, la variante de herregulina puede ser una variante de
una herregulina humana. Los ejemplos de herregulinas humanas
incluyen herregulina-\alpha
(HRG-\alpha), herregulina-\beta1
(HRG-\beta1),
herregulina-\beta2 (HRG-\beta2),
herregulina-\beta3 (HRG-\beta3)
y herregulina-\gamma
(HRG-\gamma).
Una variante de herregulina según la presente
invención tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en
la naturaleza en la que un resto de tipo salvaje en una herregulina
nativa se sustituye por un resto diferente.
Generalmente, si hay que conservar la función en
una posición seleccionada para la sustitución, el resto usado para
sustituir al resto seleccionado no tiene un carácter sustancialmente
diferente del resto de tipo salvaje, es decir, la sustitución de
aminoácidos es una sustitución conservativa. Los aminoácidos pueden
agruparse según el carácter como se muestra en la Tabla 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para preservar la función, por lo tanto, el
resto usado para sustituir al resto de tipo salvaje se
seleccionaría habitualmente entre el mismo grupo o un grupo
relacionado. Además, puede usarse serina o alanina para sustituir a
la mayoría de los demás restos. La Tabla 2 muestra sustituciones
conservativas para cada aminoácido, identificando grupos
relacionados para cada uno e indicando qué aminoácidos pueden
sustituirse por serina o alanina. La Tabla 2 también muestra
sustituciones de aminoácidos preferidas.
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La presente invención es una variante de
herregulina-\beta1 humana que incluye un conjunto
de sustituciones de aminoácidos, tales como cualquiera de las
variantes de herregulina descritas en el Ejemplo 3. El conjunto de
sustituciones de aminoácidos se selecciona entre el grupo indicado
posteriormente (el número de variante del Ejemplo 3 se muestra en
la columna de la izquierda, seguido por el conjunto de sustituciones
de aminoácidos para esa variante):
- B5:
- A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
- B10:
- A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, M226I;
- D1:
- F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I;
- E2:
- P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- E3:
- P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
- E6:
- P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
- E8:
- P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
- I1:
- N223W, M226I;
- I2:
- N223H, M226I;
- HRG37:
- S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
- HRG48:
- P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG53:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;
- HRG54:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- HRG55:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- HRG56:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
- HRG57:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- HRG58:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG59:
- F197Y; M198R, D201T, M226I;
- HRG60:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
- HRG61:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG62:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG71:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; y
- HRG73:
- A183G, K18SE, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de estos conjuntos de sustituciones de
aminoácidos produce al menos un aumento en cinco veces de la
afinidad por el receptor ErbB-3, según se determina
mediante ELISA de fagos. Véase el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
En una variación de esta realización, el
conjunto de sustituciones de aminoácidos se selecciona entre el
siguiente grupo:
- B5:
- A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
- E2:
- P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- I2:
- N223H, M226I;
- HRG48:
- P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG53:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;
- HRG56:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
- HRG57:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
- HRG58:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG59:
- F197Y, M198R, D201T, M226I;
- HRG60:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
- HRG61:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG62:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG71:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; y
- HRG73:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de estos conjuntos de sustituciones de
aminoácidos produce al menos un aumento de 20 veces en la afinidad
por el receptor ErbB-3, según se determina mediante
ELISA de fagos. Véase el Ejemplo 3.
En otra variación de esta realización, el
conjunto de sustituciones de aminoácidos se selecciona entre el
siguiente grupo:
- HRG58:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
- HRG60:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
- HRG71:
- F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; y
- HRG73:
- A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de estos conjuntos de sustituciones de
aminoácidos produce al menos un aumento de 50 veces en la afinidad
por el receptor ErbB-3, según se determina mediante
ELISA de fagos. Véase el Ejemplo 3.
Además de las anteriores sustituciones de
aminoácidos, la variante de herregulina puede tener opcionalmente
cualquiera de las siguientes modificaciones, de forma aislada o en
combinación: (1) una o más sustituciones de aminoácidos
adicionales; (2) uno o más aminoácidos añadidos al extremo N o C de,
o insertados en, la secuencia de aminoácidos de la variante de
herregulina; (3) uno o más aminoácidos eliminados de la variante de
herregulina; y (4) una o más modificaciones covalentes de un
aminoácido en la variante de herregulina.
Por lo tanto, la variante de herregulina puede
ser "sustancialmente de longitud completa", que, como se usa
en este documento, significa que la variante de herregulina tiene al
menos 90% de la longitud de la herregulina nativa con la que la
variante es más homóloga. Como alternativa, la variante de
herregulina puede ser un "fragmento" que tiene menos del 90%
de la longitud de la herregulina nativa más homóloga. Las variantes
de herregulina que son fragmentos son habitualmente de
aproximadamente 30 a aproximadamente 100 aminoácidos, más
habitualmente de aproximadamente 40 a aproximadamente 60
aminoácidos, aún más habitualmente de aproximadamente 45 a
aproximadamente 65 aminoácidos y lo más habitualmente de
aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.
Por ejemplo, la variante de herregulina puede
incluir aminoácidos correspondientes a "el dominio similar a EGF
mínimo". El dominio similar a EGF mínimo es una parte de una
herregulina nativa que es suficiente para la unión y activación de
un receptor ErbB. En general, el dominio similar a EGF mínimo tiene
menos de aproximadamente 70 aminoácidos y habitualmente menos de
aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Como se usa en este
documento en referencia a herregulina-\beta1
humana, el dominio similar a EGF mínimo se extiende desde los restos
177-228. A no ser que se indique otra cosa,
"HRG-\beta1 EGF" se refiere al dominio
similar a EGF mínimo.
Ejemplos de modificaciones covalentes adecuadas
de una variante de herregulina según la presente invención
incluyen, aunque sin limitación, conjugación con una marca
detectable, "pegilación" y conjugación con un agente
citotóxico. Una variante de herregulina puede conjugarse con
cualquiera de una gran diversidad de marcas disponibles para
producir un conjugado útil para detectar la presencia de receptores
ErbB en una muestra. Las marcas adecuadas incluyen un radioisótopo,
una marca fluorescente y una marca enzimática. Las marcas de
radioisótopo ejemplares son ^{35}S, ^{14}C, ^{125}I, ^{3}H
y ^{131}I. Las variantes de herregulina pueden estar conjugadas a
radioisótopos como se describe generalmente en Current Protocols in
Immunology Vols. 1 & 2 (Coligen et al. ed., Wiley
Publishers).
Las marcas fluorescentes adecuadas para la
conjugación a una variante de herregulina incluyen un quelato de
tierra rara (un quelato de europio), fluoresceína, rodamina,
dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas, y derivados de los
mismos. Pueden prepararse conjugados como se describe, por ejemplo,
en Current Protocols in Immunology, supra.
Diversos sistemas
enzima-sustrato están disponibles, y la Patente de
Estados Unidos Nº 4.275.149 proporciona una revisión de algunos de
estos. En general, las enzimas útiles en dichos sistemas catalizan
una alteración de un sustrato fácilmente detectable. Por ejemplo,
la enzima puede catalizar un cambio de color, que puede medirse
mediante espectrofotometría, o un cambio de fluorescencia o
quimioluminiscencia, que puede detectarse usando un fluorímetro o
quimioluminómetro, respectivamente. Las marcas enzimáticas
ejemplares incluyen una luciferasa, malato deshidrogenasa, ureasa,
una peroxidasa, fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, una
sacárido oxidasa, una oxidasa heterocíclica, lactoperoxidasa,
microperoxidasa y similares. Las variantes de herregulina pueden
conjugarse con marcas enzimáticas como se describe generalmente en
O'Sullivan et al., Methods in Enzym. 73:
47-166 (1981), y en Current Protocols in Immunology
(supra). Los sustratos adecuados para su uso con una marca
enzimática dada son bien conocidos por los expertos en la
materia.
Otra modificación ejemplar de una variante de
herregulina de la invención es la pegilación, que se refiere a la
conjugación de uno o más grupos polietilenglicol (PEG) al grupo o
grupos e-amino de un polipéptido. La pegilación
puede desearse cuando la variante de herregulina esté destinada a un
uso farmacéutico, puesto que la pegilación puede aumentar la
semi-vida in vivo y/o reducir la
inmunogenicidad y la potencial toxicidad de proteínas terapéuticas.
Véase por ejemplo, Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252:
3582-86 (1977).
La conjugación de una variante de herregulina
con un agente citotóxico produce un agente citotóxico dirigido que
se une específicamente a células que expresan receptores ErbB
apropiados en su superficie. La expresión "agente citotóxico"
se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las
células y/o causa la destrucción de las células. La expresión
incluye, por ejemplo, un isótopo radiactivo (por ejemplo, I, Y, Pr)
y un agente quimioterapéutico.
Un "agente quimioterapéutico" se define en
este documento como cualquier compuesto químico útil en el
tratamiento del cáncer. El término "cáncer" se refiere a la
afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza por
crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen
aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y
leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen
cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer
de pulmón macrocítico, cáncer gástrico, cáncer pancreático, tumores
de células gliales tales como glioblastoma y neurofibromatosis,
cáncer de cuello del útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado,
cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer
colorrectal, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas
salivales, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer
de vulva, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y diversos
tipos de cáncer de cabeza y cuello. Los ejemplos de agentes
quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorrubicina,
5-Fluorouracilo (5-FU), Citosina
arabinósido (Ara-C), Ciclofosfamida, Tiotepa,
Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino, Melfalan,
Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida, Mitomicina C,
Mitoxantrona, Vincristina, VP-16, Vinorrelbina,
Carboplatino, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina,
Dactinomicina, una Mitomicina, Nicotinamida, una Esperamicina,
Melfalan y cualquier mostaza de nitrógeno relacionada, y un agente
terapéutico endocrino (tal como dietilestilbestrol [DES],
Tamoxifeno, un fármaco que antagoniza la hormona liberadora de
hormona luteinizante, una progestina, una
anti-progestina, etc)..
Además de la conjugación a un compuesto químico,
cualquiera de las variantes de herregulina descritas anteriormente
puede modificarse mediante fusión a un polipéptido heterólogo para
producir una "variante de herregulina quimérica". (Las
variantes de herregulina quiméricas también se denominan en este
documento como "proteínas de fusión"). Habitualmente, el
polipéptido heterólogo está fusionado en el extremo N o C de la
variante de herregulina para preservar la actividad biológica
(descrita con más detalle posteriormente) de la variante de
herregulina. Sin embargo, el polipéptido heterólogo también puede
introducirse en regiones de la variante de herregulina que no son
críticas para la actividad biológica. Generalmente, las variantes de
herregulina quiméricas se producen mediante técnicas recombinantes.
Los ejemplos de variantes de herregulina quiméricas incluyen una
variante de herregulina fusionada a una "secuencia señal", un
"asa de purificación" y una secuencia de inmunoglobulina.
Una "secuencia señal" es una secuencia de
aminoácidos que dirige la secreción de un polipéptido fusionado a
ella a partir de una célula que expresa la proteína quimérica. Por
lo tanto, la fusión de una variante de herregulina a una secuencia
señal facilita la producción recombinante de la variante de
herregulina puesto que la variante de herregulina quimérica se
secreta en el medio de cultivo de la célula huésped, del que la
variante de herregulina quimérica puede recuperarse con relativa
facilidad.
Una secuencia señal adecuada puede obtenerse de
cualquier proteína que tenga una secuencia señal y habitualmente
(pero no siempre) está fusionada al extremo N de la variante de
herregulina. El ADN que codifica secuencias señal procariotas puede
obtenerse, por ejemplo, a partir de lamB u ompF,
MalE, PhoA y otros genes. Una secuencia señal
procariota conveniente para poner en práctica la presente invención
es la secuencia señal de enterotoxina II (STII) termoestable de
E. coli.
Un "asa de purificación" es una parte de un
polipéptido que se une a otro polipéptido, llamado un "socio de
unión". La fusión de un asa de purificación a una variante de
herregulina otorga a la variante la capacidad de unirse al socio de
unión, lo que facilita la purificación de la variante de herregulina
quimérica resultante. Generalmente, el asa de purificación se
selecciona de modo que el socio de unión no reaccione
sustancialmente de forma cruzada con otros componentes presentes en
la mezcla de la que debe purificarse la variante de herregulina
quimérica. Como se usa en este documento, la expresión "no
reacciona sustancialmente de forma cruzada" significa que la
afinidad del socio de unión por el asa de purificación es al menos
aproximadamente 20 veces, habitualmente al menos aproximadamente
100 veces, más habitualmente al menos aproximadamente 1000 veces,
cualquier afinidad por cualesquiera otros componentes presentes en
la mezcla.
En una realización, el asa de purificación es un
epítopo reconocido por un anticuerpo, y la variante de herregulina
quimérica se denomina por lo tanto una "variante de herregulina
marcada con epítopo". Los epítopos adecuados generalmente tienen
al menos cinco aminoácidos, habitualmente entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 50 aminoácidos y más habitualmente entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 30 aminoácidos.
Una molécula quimérica que incluye una variante
de herregulina fusionada a una secuencia de inmunoglobulina se
denomina "una inmunoadhesina variante de herregulina". En una
realización, la secuencia de inmunoglobulina es un dominio
constante de inmunoglobulina. La secuencia de inmunoglobulina en una
inmunoadhesina variante de herregulina puede obtenerse a partir de
los subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}, IgA, IgE,
IgD o IgM. En una realización, la secuencia de inmunoglobulina se
obtiene a partir de IgG_{1} o IgG_{3}.
Otros ejemplos de variantes de herregulina
quiméricas incluyen variantes de herregulina fusionadas a
tiorredoxina, un "epítopo de unión al receptor salvaje", o un
polipéptido citotóxico. La fusión de una variante de herregulina
con tiorredoxina aumenta la expresión y proporciona un asa de
purificación que facilita la purificación usando fenilarsina óxido,
que puede unirse covalentemente a un soporte sólido, tal como
agarosa. (Agarosa funcionalizada con fenilarsina está disponible en
el mercado como resina Thibond^{TM} de Invitrogen Corp., San
Diego, CA). Las proteínas de fusión a variantes de tiorredoxina
ejemplares se describen en el Ejemplo 2.
La expresión "epítopo de unión al receptor
salvaje" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula
de IgG (por ejemplo, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4})
que aumenta la semi-vida en suero in vivo de
la IgG. Epítopos de unión al receptor salvaje adecuados para fusión
a una variante de herregulina según la presente invención incluyen
cualquiera de los epítopos de unión al receptor salvaje
conocidos.
La expresión "polipéptido citotóxico" se
refiere a un polipéptido que inhibe una función celular o destruye
células. Polipéptidos citotóxicos adecuados para fusión a una
variante de herregulina incluyen una toxina enzimáticamente activa
de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal y fragmentos de la
misma y un producto de oncogén/inhibidor de tirosina quinasa, tales
como un péptido que inhibe la unión de una tirosina quinasa a una
proteína sustrato que contiene SH2 (véase WO 94/07913, por
ejemplo).
En una realización, una variante de herregulina
quimérica incluye una variante de herregulina fusionada a una
enzima que convierte a un "profármaco" en un fármaco activo.
Habitualmente, el "profármaco" es una forma precursora o
derivada de un fármaco citotóxico que es menos citotóxica que el
propio fármaco y es capaz de ser activado enzimáticamente o
convertido en el fármaco citotóxico. Los profármacos de la presente
invención incluyen, aunque sin limitación, un profármaco que
contiene fosfato, un profármaco que contiene tiofosfato, un
profármaco que contiene sulfato, un profármaco que contiene un
péptido, un profármaco modificado con D-aminoácido,
un profármaco glicosilado, un profármaco que contiene
\beta-lactama, un profármaco que contiene
fenoxiacetamida, un profármaco que contiene fenilacetamida,
5-fluorocitosina, un profármaco de
5-fluorouridina y derivados de los mismos. Los
ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse para
producir un profármaco para su uso en la presente invención
incluyen, aunque sin limitación, los agentes quimioterapéuticos
descritos anteriormente.
Una variante de herregulina según la presente
invención es capaz de unirse a un receptor ErbB. La expresión
"receptor ErbB" se refiere a cualquiera de los receptores de
tirosina quinasa de clase I de mamífero. Los ejemplos de dicho
receptores incluyen el receptor ErbB-1 (también
conocido como "el receptor EGF"), el receptor
ErbB-2 (también llamado "el receptor HER2"), el
receptor ErbB-3 (o "HER3"), y el receptor ErbB4
(o "HER4"). La frase "capaz de unirse a" se usa para
describir un polipéptido que se une a otro polipéptido con una
constante de disociación (K_{d}) de al menos 1 mM.
Variantes de herregulina que son capaces de
unirse a los receptores ErbB-3 y
ErbB-4 se han descrito anteriormente y se describen
en los ejemplos. La producción de variantes de herregulina
adicionales, que tienen modificaciones adicionales (por ejemplo
sustituciones, adiciones, inserciones, o eliminaciones o
modificaciones covalentes de aminoácidos adicionales) y de
variantes de herregulina quiméricas está dentro del alcance del
experto en la materia.
Además, a la luz de las enseñanzas en este
documento, los expertos en la materia pueden diseñar gran número de
variantes adicionales que preservan la actividad de unión de las
variantes de herregulina de la invención. Por ejemplo, no se espera
que una sustitución conservativa en un resto no crítico de una
variante de herregulina (como se identifica en el Ejemplo 2) altere
significativamente la unión al receptor ErbB. Además, cualesquiera
efectos sobre la unión al receptor ErbB pueden determinarse
fácilmente en un ensayo de unión a una muestra, tal como los
descritos en los Ejemplos 1-3. Por lo tanto, la
presente invención abarca todas las variantes de herregulina que
tienen al menos un aumento de 5 veces en la afinidad del receptor
ErB-3 con respecto a la herregulina de la que se
obtiene la variante y que comprenden sustituciones de aminoácidos en
las posiciones específicas descritas anteriormente,
independientemente de cualesquiera modificaciones adicionales que
puedan estar presentes.
Además de la unión al receptor ErbB, una
variante de herregulina de la invención puede poseer una o más
actividades biológicas diferentes de una herregulina nativa. Por
ejemplo, la variante de herregulina también puede tener la
capacidad de activar un receptor ErbB. La frase "capacidad de
activar un receptor ErbB" se refiere a la capacidad de hacer que
el dominio quinasa intracelular de un receptor ErbB fosforile restos
tirosina. Generalmente, la activación del receptor implica la unión
de una herregulina a un complejo receptor de dos o más receptores
ErbB (por ejemplo, un complejo
ErbB-2/ErbB-3 o
ErbB-2/ErbB-4). La unión al receptor
activa un dominio quinasa de uno o más de los receptores, lo que da
como resultado la fosforilación de restos tirosina en uno o más de
los receptores y/o fosforilación de restos tirosina en polipéptido o
polipéptidos de sustrato adicionales. La fosforilación de receptor
ErbB puede cuantificarse usando los ensayos de fosforilación de
tirosina descritos en el
Ejemplo 3.
Ejemplo 3.
Además, una variante de herregulina de la
invención puede ser capaz de aumentar la supervivencia,
proliferación y/o diferenciación de células que tienen receptores
ErbB adecuados. La frase "aumentar la supervivencia de
células" se refiere a aumentar el periodo de existencia de
células, in vitro o in vivo, con respecto al periodo
de existencia de células que no han sido expuestas a la variante de
herregulina ("células no tratadas").
La expresión "aumentar la proliferación de
células" significa aumentar la tasa o número de divisiones
mitóticas, in vitro o in vivo, con respecto a células
no tratadas. Un aumento de la proliferación celular en cultivo
celular puede detectarse contando el número de células antes y
después de la exposición a la variante de herregulina o mediante
examen microscópico del grado de confluencia. La proliferación
celular también puede cuantificarse midiendo la captación de
^{3}H-timidina por las células.
La frase "aumentar la diferenciación de
células" se refiere a aumentar el grado de especialización
celular. La especialización celular se caracteriza por la
adquisición de una o más características que difieren de las de las
células originales. Por lo tanto, el grado de especialización
celular se determina habitualmente cribando un cambio en el
fenotipo de la célula (por ejemplo, identificando un cambio en la
morfología celular).
Células ejemplares que expresan receptores ErbB,
y por lo tanto son sensibles a herregulinas, incluyen células
SK-BR-3, células gliales, células de
glioblastoma, células de Schwann, hepatocitos, células epiteliales
y células musculares. Las células gliales se obtienen del sistema
nervioso central e incluyen oligodendrocitos y astrocitos. Las
células musculares que expresan receptores ErbB incluyen precursores
de células musculares (mioblastos) así como las más especializadas
células esqueléticas, cardiacas y de músculo liso.
Otras actividades biológicas que puede poseer
una variante de herregulina de la invención incluyen inducción de
la formación de canales iónicos (por ejemplo canal de Na^{+});
inducción de síntesis de receptor de acetilcolina en la unión
neuromuscular; potenciación de la formación de una unión sináptica
entre una neurona y una célula muscular, nerviosa o glandular;
regulación negativa del receptor de estrógeno; e internalización
celular (posiblemente asociada con localización nuclear).
Una variante de herregulina se produce mediante
cualquier método adecuado, incluyendo síntesis peptídica y técnicas
recombinantes. Generalmente, se emplean técnicas recombinantes, que
se describen en detalle posteriormente, para una variante de
herregulina más larga de aproximadamente 50 aminoácidos.
La presente invención también incluye una
molécula de ácido nucleico relacionada con la variante de
herregulina. La expresión "molécula de ácido nucleico" abarca
moléculas de ADN de cadena sencilla y de cadena doble, incluyendo
ADN genómico, ADNc, ADN producido mediante una reacción de
amplificación (tal como reacción en cadena de la polimerasa
["PCR"]), y ADN producido mediante síntesis de
oligonucleótidos, así como moléculas de ARN, tales como ARNm. El
ADN genómico puede incluir regiones no transcritas y transcritas
(tales como regiones no codificantes 5' y 3', intrones y regiones
codificantes de variante de herregulina). Las moléculas de ADNc y
ARN contienen secuencias correspondientes a regiones
transcritas.
Una molécula de ácido nucleico según la presente
invención tiene una secuencia de nucleótidos que no se encuentra en
la naturaleza y codifica, o es complementaria a, una molécula de
ácido nucleico que codifica una variante de herregulina de la
invención. Una secuencia de nucleótidos complementaria es capaz de
formar enlaces de Watson-Crick con su complemento,
en los que la adenina se empareja con timina o uracilo y guanina se
empareja con citosina. Una molécula de ADN de doble cadena codifica
una de las variantes de herregulina, mientras que una molécula de
ADN o ARN de cadena sencilla es la cadena codificante (sentido) o la
cadena no codificante (anti-sentido).
Debido a la redundancia del código genético, hay
gran número de posibles moléculas de ácido nucleico relacionadas
con cada variante de herregulina. Más específicamente, puesto que
varios codones diferentes codifican el mismo aminoácido, gran
número de diferentes moléculas de ácido nucleico codifican (o son
complementarias a una molécula de ácido nucleico que codifica) la
misma variante de herregulina.
Generalmente, una variante de herregulina de la
invención se produce mutando una secuencia de ADN de origen natural
para introducir las mutaciones deseadas en la secuencia de
aminoácidos de la variante de herregulina. Sin embargo, también
puede ser ventajoso cambiar uno o más codones en una molécula de
ácido nucleico sin alterar el aminoácido codificado. Ejemplos de
dichas "mutaciones silenciosas" en el alcance de la presente
invención incluyen, por ejemplo, mutaciones que crean o destruyen
puntos de endonucleasa de restricción para facilitar la
construcción de un vector deseado y mutaciones que aumentan la
expresión de la variante de herregulina codificada. Los ejemplos de
estas últimas incluyen sustituciones de nucleótidos diseñadas para
reducir la formación de estructuras de tipo
stem-loop 5' en el ARNm transcrito o para
proporcionar codones que se transcriben más fácilmente por el
huésped seleccionado (por ejemplo, los bien conocidos codones de
preferencia para expresión en E. coli o levadura).
Una molécula de ácido nucleico de la invención
puede incorporarse en un vector (como se describe adicionalmente
posteriormente) o usarse, por ejemplo, como una sonda de hibridación
o un cebador de amplificación. Una sonda de hibridación que
comprende un ácido nucleico según la presente invención es útil para
detectar una molécula de ácido nucleico que contiene una mutación
deseada, tal como, por ejemplo; en el cribado de transformantes
bacterianos para identificar clones que contienen la molécula de
ácido nucleico mutada.
Dichas sondas son generalmente de al menos
aproximadamente 20 nucleótidos y habitualmente de menos de dos
kilobases. La sonda incluye un número de nucleótidos que es
suficiente, en las condiciones de hibridación usadas, para hibridar
con una secuencia mutada a detectar y para estar sustancialmente
libre de hibridación con otras secuencias. Habitualmente, una sonda
que comprende un ácido nucleico de la presente invención es de al
menos aproximadamente 50 nucleótidos, y habitualmente
aproximadamente 100 nucleótidos de longitud.
Un cebador de amplificación que comprende un
ácido nucleico según la presente invención puede usarse en un
protocolo de amplificación convencional, tal como PCR, para detectar
una molécula de ácido nucleico que contiene una mutación deseada o
para producir suficientes cantidades de dicha molécula para
secuenciación, inserción en un vector, etc. Un cebador de
amplificación se usa habitualmente como miembro de un par de
cebadores, que incluye un cebador cadena arriba 5' que hibrida con
el extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico a amplificar y un
cebador cadena abajo 3' que hibrida con el complemento del extremo
3' de la secuencia a amplificar.
En general, un cebador que comprende un ácido
nucleico según la presente invención incluye un número de
nucleótidos que es suficiente, en las condiciones de hibridación
usadas, para hibridar con una secuencia mutada y para estar
sustancialmente libre de hibridación con otras secuencias. La
especificidad del cebador aumenta con el número de nucleótidos que
hibridan con la secuencia mutada. Además, la especificidad se
correlaciona con la proporción de restos en el cebador que hibridan
con la secuencia mutada. Un cebador que comprende un ácido nucleico
de la presente invención generalmente incluye al menos
aproximadamente 15 nucleótidos, y habitualmente al menos
aproximadamente 20 nucleótidos. No es necesario que el cebador
supere aproximadamente los 30 nucleótidos, y habitualmente no
supera aproximadamente los 25 nucleótidos. En una variación de esta
realización, el cebador incluye entre aproximadamente 20 y
aproximadamente 25 nucleótidos. Generalmente, el cebador debe tener
una T_{m} en el intervalo de aproximadamente 55ºC a
aproximadamente 75ºC. En la práctica, la T_{m} está habitualmente
entre aproximadamente 60ºC y aproximadamente 65ºC para facilitar la
amplificación en condiciones astringentes.
Una molécula de ácido nucleico de la presente
invención puede incorporarse en un vector para propagación y/o
expresión en una célula huésped. Dichos vectores habitualmente
contienen una secuencia de replicación capaz de realizar la
replicación del vector en una célula huésped adecuada (es decir, un
origen de replicación) así como secuencias que codifican un
marcador seleccionable, tales como un gen de resistencia a
antibióticos. Después de la transformación de un huésped adecuado,
el vector puede replicarse y funcionar independientemente del
genoma de huésped o integrarse en el genoma del huésped. El diseño
del vector depende, entre otras cosas, del uso pretendido y de la
célula huésped para el vector, y el diseño de un vector de variante
de herregulina para un uso y célula huésped particular está dentro
del alcance de un experto en la materia.
Si el vector es para la expresión de una
variante de herregulina, el vector incluye una o más secuencias de
control capaces de realizar y/o aumentar la expresión de una
secuencia codificante de variante de herregulina unida de forma
operativa. Las secuencias de control que son adecuadas para la
expresión en procariotas, por ejemplo, incluyen una secuencia
promotora, una secuencia operadora y un punto de unión al ribosoma.
Las secuencias de control para la expresión en células eucariotas
incluyen un promotor, un potenciador y una secuencia de terminación
de la transcripción (es decir, una señal de poliadenilación).
La expresión "unido de forma operativa"
significa que dos secuencias de ácido nucleico están en una
relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor (o
potenciador) está unido de forma operativa a una secuencia
codificante si realiza (o aumenta) la transcripción de la secuencia.
Un punto de unión al ribosoma está unido de forma operativa a una
secuencia codificante si está situado de forma que facilite la
traducción. Las secuencias de ácido nucleico unidas de forma
operativa a menudo son contiguas, pero esto no es un requisito. Por
ejemplo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos con
una secuencia codificante para aumentar la transcripción de la
secuencia codificante.
Un vector de expresión de variante de
herregulina también puede incluir otras secuencias, tales como, por
ejemplo, secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia
señal o un gen amplificable. Como se ha descrito anteriormente, una
secuencia señal dirige la secreción de un polipéptido fusionado a
ella desde una célula que expresa la proteína quimérica.
En el vector de expresión, el ácido nucleico que
codifica una secuencia señal está unido a una secuencia codificante
de variante de herregulina para preservar el marco de lectura de la
secuencia codificante de variante de herregulina. La inclusión de
un gen amplificable (por ejemplo, el gen de dihidrofolato reductasa
[DHFR]) en un vector de expresión de variante de herregulina
permite la selección de células huésped que contienen múltiples
copias de la molécula de ácido nucleico que codifica la variante de
herregulina.
Un vector de la presente invención se produce
uniendo elementos deseados mediante ligamiento en puntos de
restricción convenientes. Si dichos puntos no existen, pueden
introducirse puntos adecuados mediante mutagénesis convencional
(por ejemplo, mutagénesis dirigida o con casete) o pueden usarse
adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos según la
práctica convencional.
La presente invención también proporciona una
célula huésped que contiene un vector de la presente invención. Una
gran variedad de células huésped están disponibles para propagación
y/o expresión de vectores. Los ejemplos incluyen células
procariotas (tales como E. coli y cepas de Bacillus,
Pseudomonas y otras bacterias), levaduras y otras células
fúngicas, células de insecto, células vegetales y fagos, así como
células de eucariotas superiores (tales como células de ovario de
hámster chino y otras células de mamífero). Las células huésped
según la presente invención incluyen células en cultivo y células
presentes en animales vivos, tales como animales transgénicos.
Véase la Patente de Estados Unidos 5.364.934 para más información
sobre vectores y células huésped adecuadas para su uso en la
producción recombinante de una variante de herregulina.
Un vector de la presente invención se introduce
en una célula huésped mediante cualquier método conveniente, que
variará dependiendo del sistema vector-huésped
empleado. Generalmente, un vector se introduce en una célula
huésped mediante transformación (también conocida como
"transfección") o infección con un virus (por ejemplo, fago)
que porta el vector. Si la célula huésped es una célula procariota
(u otra célula que tiene una pared celular), los métodos de
transformación convenientes incluyen el método de tratamiento con
calcio descrito por Cohen et al., PNAS USA 69:
2110-14 (1972), y el método de polietilenglicol de
Chung et al., Nuc. Acids. Res. 16: 3580 (1988). Si una
célula procariota se usa como huésped y el vector es un vector
fagémido, el vector puede introducirse en la célula huésped
mediante infección, como se describe en el Ejemplo 1. Las células
de levadura pueden transformarse usando polietilenglicol, por
ejemplo, como describe Hinnen, PNAS U.S.A. 75:
1929-33 (1978). Las células de mamífero se
transforman convenientemente usando el método de precipitación con
fosfato de calcio descrito por Graham et al., Virology 52:
546 (1978), y Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:
3-10 (1990). Sin embargo, otros métodos conocidos
para introducir ADN en células huésped, tales como inyección
nuclear, electroporación (véase el Ejemplo 1) y fusión de
protoplastos también son adecuados para su uso en la presente
invención.
Una célula huésped que contiene una molécula de
ácido nucleico que codifica una variante de herregulina puede
producirse mediante recombinación homóloga, como se describe en WO
91/06667. En resumen, este método implica transformar una célula
huésped que contiene un gen de herregulina endógeno con un vector de
recombinación homóloga que incluye la secuencia a introducir. El
vector de recombinación homóloga también incluye al menos una
secuencia de al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud
que es homóloga con una secuencia endógena que flanquea al gen de
herregulina endógeno. Las secuencias flanqueantes adecuadas se
identifican fácilmente, por ejemplo, mediante el método de paseo
cromosómico, usando como punto de partida una secuencia de ácido
nucleico de herregulina nativa conocida. El vector de recombinación
homóloga adicionalmente incluye un gen amplificable, tal como el
gen DHFR.
La transformación se realiza en condiciones
tales que el vector se integra en el genoma de la célula huésped
mediante recombinación. Las células que integran el vector se
cultivan a continuación en condiciones que seleccionan la
amplificación del gen amplificable. Las células resultantes se
criban a continuación para niveles altos de producción de variante
de herregulina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para producir una variante de herregulina de
forma recombinante, se preparan células huésped que contienen un
vector de expresión de variante de herregulina y se cultivan en
condiciones adecuadas para el crecimiento celular y para la
expresión de la variante de herregulina. En particular, el medio de
cultivo contiene nutrientes apropiados y factores de crecimiento
para la célula huésped empleada. Los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios para el crecimiento de una célula huésped
seleccionada son, en muchos casos, bien conocidos o pueden
determinarse fácilmente de forma empírica por los expertos en la
materia. Las condiciones de cultivo adecuadas para células huésped
de mamífero, por ejemplo, se describen en Mammalian Cell Culture
(Mather ed., Plenum Press 1984), y en Barnes y Sato, Cell 22: 649
(1980).
Además, las condiciones de cultivo deben
permitir la transcripción, traducción y transporte de proteínas
entre compartimentos celulares. Los factores que afectan a estos
procesos se conocen bien e incluyen, por ejemplo, el número de
AND/ARN; los factores que estabilizan el ARN; nutrientes,
suplementos, e inductores o represores transcripcionales presentes
en el medio de cultivo; temperatura, pH, y osmolalidad del cultivo;
y densidad celular. El ajuste de estos factores para promover la
expresión en un sistema vector-célula huésped
particular está dentro del alcance de un experto en la materia. Los
principios y técnicas prácticas para maximizar la productividad de
cultivos de células de mamífero in vitro, por ejemplo, pueden
encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach
(Butler ed., IRL Press 1991).
El procedimiento de cultivo celular empleado en
la producción de una variante de herregulina de la presente
invención puede ser cualquiera de varios procedimientos bien
conocidos para producción a gran o pequeña escala de proteínas.
Estos incluyen, aunque sin limitación, el uso de un biorreactor de
lecho fluidizado, un biorreactor de fibra hueca, un sistema de
cultivo en frasco rotatorio y un sistema de biorreactor con tanque
agitado. Una variante de herregulina puede producirse, por ejemplo,
en un proceso discontinuo (batch),
semi-continuo (fed-batch) o
de modo continuo.
Los métodos para la recuperación de proteínas
recombinantes producidas como se ha descrito anteriormente se
conocen bien y varían dependiendo del sistema de expresión empleado.
Por ejemplo, si, como es habitual, la variante de herregulina está
fusionada a una secuencia señal, la variante de herregulina se
recupera del medio de cultivo o del periplasma. Convenientemente,
la variante se secreta al espacio periplásmico en forma de proteína
madura. La variante de herregulina también puede expresarse de forma
intracelular y recuperarse de lisados celulares.
La variante de herregulina puede purificarse del
medio de cultivo o un lisado celular mediante cualquier método
capaz de separar la variante de componentes de la célula huésped o
medio de cultivo. Habitualmente, la variante de herregulina se
separa de los componentes de la célula huésped y/o el medio de
cultivo que interferirían en el uso pretendido de la variante de
herregulina. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado
celular se centrifuga o filtra habitualmente para eliminar restos
celulares. A continuación, el sobrenadante se concentra
habitualmente o diluye a un volumen deseado o se diafiltra en un
tampón adecuado para acondicionar la preparación para una
purificación adicional.
La variante de herregulina se purifica
adicionalmente habitualmente de la misma manera que la herregulina
nativa más homóloga, teniendo en cuenta cualesquiera diferencias
sustanciales de propiedades entre las dos moléculas. Por ejemplo,
si la variante de herregulina es una variante de herregulina marcada
con epítopo, la purificación puede realizarse usando una columna de
inmunoafinidad que contiene anticuerpo para la marca epitópica. Los
siguientes procedimientos ejemplares para purificar herregulinas
pueden usarse o adaptarse para purificar una variante de
herregulina de la invención: fraccionamiento en una columna de
inmunoafinidad, fraccionamiento en una columna de intercambio
iónico, precipitación con sulfato de amonio o etanol, HPLC de fase
inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en
heparina-Sepharose, cromatografía en una resina de
intercambio catiónico, cromatoenfoque, SDS-PAGE y
filtración en gel (por ejemplo, usando una columna High Load
Superdex 75^{TM} prep grade).
Si la variante de herregulina se expresa
inicialmente en forma insoluble, agregada (especialmente en células
huésped bacterianas), puede ser necesario disolver y renaturalizar
la variante de herregulina usando técnicas disponibles en el sector
para solubilizar y renaturalizar cuerpos refráctiles de proteína
recombinante. Véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº
4.511.502.
En una variación de esta realización, la
variante de herregulina se purifica (1) a un grado suficiente para
obtener al menos 15 restos, y preferentemente 20 restos, de
secuencia de aminoácidos N-terminal o interna,
usando un secuenciador de taza giratoria, o (2) a homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o
reductoras usando tinción de azul de Coomassie. Como se usa en este
documento, "homogeneidad" significa menos de aproximadamente
el 5% de contaminación con otras proteínas fuente, según se
determina tiñendo con azul de Coomassie.
En términos generales, las variantes de
herregulina según la presente invención pueden usarse en las mismas
aplicaciones que las herregulinas nativas. Por supuesto, algunas
variantes de herregulina dentro del alcance de la invención pueden
ser más adecuadas para una aplicación que para otras aplicaciones.
Sin embargo, los expertos en la materia pueden averiguar fácilmente
qué variantes de herregulina son apropiadas para una aplicación
dada usando uno o más ensayos convencionales para determinar la
actividad biológica de las variantes.
Las herregulinas son útiles para tratar un
amplio intervalo de enfermedades y trastornos que afectan al
sistema nervioso, musculatura y epitelios. Además, pueden usarse
herregulinas en el tratamiento del cáncer. Como se usa en este
documento, "tratamiento" abarca el tratamiento de una
enfermedad o trastorno existente así como medidas
profilácticas.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que incluye una variante
de herregulina que es útil para tratar cualquiera de diversas
enfermedades o trastornos. Una composición farmacéutica con
variante de herregulina puede emplearse para tratar a un mamífero.
En particular, la composición es útil para tratar seres humanos,
animales de granja (por ejemplo, vacas y ovejas), animales de
zoológico, animales usados en deportes (por ejemplo, caballos) y
mascotas (por ejemplo, perros y gatos).
La composición también puede ser útil para
tratar a un paciente humano.
Una variante de herregulina según la presente
invención puede ser útil para promover el desarrollo, mantenimiento
y/o regeneración de una neurona in vivo. Las neuronas que
responden a dicha variante incluyen neuronas del sistema nervioso
central (cerebro y médula espinal), neuronas del sistema nervioso
periférico (incluyendo neuronas simpáticas, parasimpáticas,
sensoriales y entéricas) y motoneuronas. Enfermedades o trastornos
susceptibles al tratamiento con variante de herregulina aparecen en
individuos que han sufrido daño del sistema nervioso debido, por
ejemplo, a trauma, cirugía, apoplejía, isquemia, infección,
enfermedad metabólica, deficiencia alimenticia, cáncer o un agente
tóxico.
Una variante de herregulina puede proporcionar
beneficios terapéuticos a dichos individuos promoviendo la
supervivencia, proliferación o diferenciación de neuronas. Por
ejemplo, puede usarse una variante de herregulina para promover la
supervivencia o proliferación de motoneuronas que han sido dañadas
por trauma o cirugía. Una variante de herregulina también puede
emplearse para tratar trastornos motoneuronales, tales como
esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de Lou Gehrig),
parálisis de Bell y diversas afecciones que implican atrofia o
parálisis muscular espinal. Además, una variante de herregulina
también puede ser útil para tratar un trastorno neurodegenerativo
humano, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson,
epilepsia, esclerosis múltiple, corea de Huntington, síndrome de
Down, sordera nerviosa y enfermedad de Meniere.
Además, una variante de herregulina de la
invención puede usarse para tratar neuropatía, especialmente
neuropatía periférica. Como se usa en este documento, la expresión
"neuropatía periférica" se refiere a un trastorno que afecta
al sistema nervioso periférico, generalmente manifestado como uno o
una combinación de disfunciones motoras, sensoriales,
sensorimotoras o autonómicas neurales. Los ejemplos incluyen, aunque
sin limitación, neuropatía sensorimotora distal y neuropatías
autonómicas, tales como motilidad reducida del tracto
gastrointestinal o atonía de la vejiga urinaria. Las neuropatías
periféricas susceptibles al tratamiento con variante de herregulina
pueden heredarse, pueden resultar de una enfermedad sistémica o
pueden ser inducidas por un agente tóxico. Los ejemplos de
neuropatías hereditarias incluyen enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de
Refsum, Abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de
Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Fabry y
síndrome de Dejerine-Sottas. Los ejemplos de
neuropatías asociadas con enfermedad sistémica incluyen síndrome
post-polio; y los ejemplos neuropatías inducidas por
un agente tóxico incluyen las causadas por el tratamiento con un
agente
quimioterapéutico.
quimioterapéutico.
Una variante de herregulina también puede
emplearse para mejorar la función neural. Los efectos beneficiosos
del tratamiento con la variante de herregulina se atribuyen a la
inducción de la formación de canales iónicos en membranas celulares
y al aumento de la formación de uniones sinápticas.
Una variante de herregulina según la presente
invención también puede usarse para tratar células musculares y
afecciones médicas que afectan a células musculares. En particular,
dicha variante de herregulina puede ser útil para tratar daño
muscular, reduciendo la atrofia de las células musculares, y
aumentando la supervivencia, proliferación y/o regeneración de
células musculares. Los ejemplos de afecciones patofisiológicas de
la musculatura susceptibles al tratamiento con una variante de
herregulina incluyen enfermedades del músculo esquelético (por
ejemplo, miopatía o distrofia), trastornos del músculo cardiaco
(incluyendo arritmias cardiacas auriculares, cardiomiopatía, daño
isquémico, enfermedad congénita y trauma cardiaco) y trastornos del
músculo liso (tales como esclerosis arterial, lesión vascular o
enfermedad vascular congénita). Una variante de herregulina también
puede emplearse para reducir la hipertensión y para aumentar los
receptores de acetilcolina funcionales en células musculares (por
ejemplo, en individuos que tienen miastenia gravis o
taquicardia).
Una variante de herregulina de la invención
también puede potenciar la reparación y/o regeneración de tejidos
que expresan receptores ErbB, especialmente ErbB-2 y
receptores ErbB-3 o ErbB-4. Por
consiguiente, una variante de herregulina puede ser útil para
tratar heridas dérmicas, enfermedades gastrointestinales, esófago
de Barrett, enfermedad renal en fase terminal quística o no quística
o enfermedad intestinal inflamatoria. Una variante de herregulina
también puede emplearse para promover la
re-epitelización en el tracto gastrointestinal,
respiratorio, reproductor o urinario humano.
Además, una variante de herregulina según la
presente invención puede ser útil para inhibir la invasión y
metástasis de células tumorales. En particular, un tumor
caracterizado por niveles reducidos de herregulina endógena (Park
et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 34: 521 [1993]) es
sensible al tratamiento con una variante de herregulina de la
invención. Adicionalmente, un tumor que sobreexpresa receptores ErbB
puede tratarse usando una variante de herregulina conjugada a un
agente citotóxico (descrito anteriormente) para dirigir al agente
citotóxico al tejido tumoral. Un conjugado de variante de
herregulina-enzima también puede emplearse para
dirigir una terapia con profármaco (descrita anteriormente) a
células que expresan receptores ErbB.
Una composición farmacéutica según la presente
invención se prepara para almacenamiento mezclando una variante de
herregulina que tiene el grado de pureza deseado con un portador,
excipiente o estabilizante fisiológicamente aceptable opcional, tal
como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª Edición
(Osol ed., 1980). La composición puede almacenarse en forma de una
torta liofilizada o una solución acuosa. Un portador, excipiente o
estabilizante farmacéuticamente aceptable no es tóxico para
receptores a las dosificaciones empleadas, y puede incluir un
tampón (tal como un tampón fosfato, tampón citrato y tampones hechos
a partir de otros ácidos orgánicos), un antioxidante (por ejemplo,
ácido ascórbico), un polipéptido de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 restos), una proteína (tal como albúmina del
suero, gelatina y una inmunoglobulina), un polímero hidrofílico
(tal como polivinilpirrolidona), un aminoácido (tal como glicina,
glutamina, asparagina, arginina y lisina), un monosacárido, un
disacárido y otros carbohidratos (incluyendo glucosa, manosa y
dextrinas), un agente quelante (por ejemplo, ácido
etilendiaminotetraacético [EDTA]), un alcohol de azúcar (tal como
manitol y sorbitol), un contraión formador de sal (por ejemplo,
sodio) y/o un tensioactivo no iónico (tal como Tween^{TM},
Pluronics^{TM} y PEG). El portador fisiológicamente aceptable
puede ser una solución acuosa tamponada.
Una composición con variante de herregulina para
administración in vivo habitualmente es estéril. La
esterilización se realiza fácilmente mediante filtración a través de
una membrana de filtración estéril. Si la composición se almacena
en forma liofilizada, la composición puede filtrarse antes o después
de la liofilización y reconstitución.
Una composición farmacéutica con variante de
herregulina de la invención se coloca generalmente en un recipiente
que tiene un puerto de acceso estéril, tal como, por ejemplo, una
bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón
perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Los métodos para administrar una composición
farmacéutica con variante de herregulina no difieren de métodos
conocidos para administrar proteínas terapéuticas. Las vías de
administración adecuadas incluyen, por ejemplo, vías intravenosa,
intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular,
intraarterial o intralesional. Una composición farmacéutica con
variante de herregulina puede administrarse de forma continua
mediante infusión o mediante inyección en embolada.
Si se desea, también puede usarse una
preparación de liberación sostenida para administrar una variante
de herregulina. Una preparación de liberación sostenida ejemplar
tiene una matriz semipermeable de un polímero hidrofóbico al que
está unida la variante de herregulina. Los ejemplos de polímeros
adecuados incluyen un poliéster, un hidrogel, un polilacturo, un
copolímero de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
acetato de etilen-vinilo no degradable, un
copolímero degradable de ácido láctico-ácido glicólico y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Dichas matrices están en forma de artículos conformados, tales como
películas o microcápsulas.
Una preparación de variante de herregulina de
liberación sostenida puede incluir una variante de herregulina
atrapada en liposomas. Los liposomas son pequeñas vesículas
compuestas por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o
tensioactivos. Estos componentes se disponen habitualmente en una
formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de membranas
biológicas. Los liposomas que contienen variantes de herregulina se
preparan mediante métodos conocidos, tales como, por ejemplo, los
descritos en Epstein et al., PNAS USA 82:
3688-92 (1985), y Hwang et al., PNAS USA 77:
4030-34 (1980). Habitualmente, los liposomas en
dichas preparaciones son del tipo pequeño unilamelar
(aproximadamente 200-800 Angstroms) en que el
contenido de lípido es mayor de aproximadamente el 30 por ciento en
moles de colesterol, estando el porcentaje específico ajustado para
proporcionar la terapia óptima. Los liposomas útiles pueden
generarse mediante método de evaporación de fase inversa, usando una
composición lipídica que incluye, por ejemplo, fosfatidilcolina,
colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG
(PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de
filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el
diámetro deseado.
Para el tratamiento de enfermedades o trastornos
neurológicos, una variante de herregulina puede adsorberse a una
membrana, tal como una membrana silástica, que puede implantarse en
las proximidades del tejido neural dañado, como se describe en WO
91/04014.
La dosificación de una composición con variante
de herregulina a emplear terapéuticamente depende, por ejemplo, de
los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del
paciente. Por consiguiente, es necesario que el médico valore
cuantitativamente la dosificación y modifique la vía de
administración según sea necesario para obtener el efecto
terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede variar
entre aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal
o más al día, pero habitualmente está entre aproximadamente 10
\mug/kg/día y 10 mg/kg/día. Generalmente, el médico comienza con
una dosificación baja de una composición farmacéutica con variante
de herregulina y aumenta la dosificación hasta que se alcanza el
efecto terapéutico deseado.
La administración de una variante de herregulina
de la invención puede combinarse con otros regímenes terapéuticos.
Para el tratamiento de afecciones neurológicas, una variante de
herregulina se combina opcionalmente, o se administra en concierto,
con otro factor neurotrófico para conseguir un efecto terapéutico
deseado. Por ejemplo, una variante de herregulina puede usarse
junto con factor de crecimiento nervioso (NGF), una neurotrofina
(por ejemplo, NT-3, -4, o -5), factor nervioso
derivado del cerebro (BDNF), y factor de crecimiento similar a
insulina (por ejemplo, IGF-1 o
IGF-2), gas6, u otro factor neurotrófico para
conseguir un efecto estimulador sinérgico sobre neuronas. Las
dosificaciones adecuadas para los factores neurotróficos no difieren
de las conocidas en el sector para dichas moléculas.
Para el tratamiento del cáncer, pueden
administrarse radiación y/o un agente quimioterapéutico de forma
concomitante con una variante de herregulina. Los programas de
preparación y dosificación adecuados para dichos agentes
quimioterapéuticos son según lo recomendado por el fabricante o
según lo determinado empíricamente por el médico. Para programas de
preparación y dosificación para agentes quimioterapéuticos
convencionales, véase Chemotherapy Service (Perry ed., Williams
& Wilkins 1992). La administración del agente quimioterapéutico
puede preceder, o seguir, a la administración de la variante de
herregulina, o el agente quimioterapéutico puede administrarse
simultáneamente con ésta. Los anticuerpos contra antígenos asociados
a tumores, tales como anticuerpos que se unen a al receptor EGFR,
ErbB-2, ErbB-3, o
ErbB-4, o factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) también pueden co-administrase con una
variante de herregulina, como puede ser el caso de una o más
citoquinas.
Las variantes de herregulina según la presente
invención también pueden emplearse en diversas aplicaciones no
terapéuticas, tales como métodos de cultivo celular y métodos de
diagnóstico. Por ejemplo, puede usarse una variante de herregulina
para promover la supervivencia, proliferación o diferenciación de
células ex vivo, tales como células gliales, de Schwann y
musculares. Los cultivos de dichas células son útiles para producir
factores específicos de células, tales como, por ejemplo, el
receptor del factor de crecimiento nervioso (P75^{NGFR}) que es
un factor específico de células de Schwann. Los factores específicos
de células pueden emplearse directamente como herramientas de
diagnóstico o emplearse para generar anticuerpos para uso en
diagnóstico.
Los cultivos celulares ex vivo también
puede usarse como prótesis celulares para transplante. Por ejemplo,
cultivos de células de Schwann pueden transplantarse en áreas de
médula espinal dañada para promover la regeneración de axones
centrales interrumpidos o pueden usarse para ayudar en la reparación
de lesiones nerviosas periféricas.
Por consiguiente, puede realizarse un método de
cultivo celular en el que se proporcionan células sensibles a
herregulina en un medio de cultivo celular adecuado. Los medios de
cultivo tisular adecuados son bien conocidos por los expertos en la
materia e incluyen, aunque sin limitación, Medio Mínimo Esencial
(MEM), RPMI-1640 y Medio Eagle Modificado por
Dulbecco (DMEM). Estos medios de cultivo tisular están disponibles
en el mercado de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) y GIBCO
(Grand Island, NY). Las células se cultivan en el medio de cultivo
celular en condiciones que permiten que las células crezcan en
presencia de una variante de herregulina. Los procedimientos
adecuados para el cultivo celular no difieren de procedimientos
conocidos e incluyen, por ejemplo, cultivo líquido, cultivo en agar
y cultivo en un coágulo.
Las células se cultivan en presencia de una
cantidad eficaz de una variante de herregulina. La cantidad de
variante de herregulina puede variar, dependiendo del tipo celular y
de las condiciones de cultivo celular, pero generalmente está en el
intervalo de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 mg/ml. Una
concentración apropiada para un cultivo celular dado puede
determinarse fácilmente empíricamente por los expertos en la
materia.
Técnicas para cultivar células de Schwann ex
vivo se describen en Li et al. (supra), y Sklar
et al. (supra) describen el cultivo ex vivo de
mioblastos humanos clonales. Una variante de herregulina de la
invención puede sustituir a los otros polipéptidos de herregulina
usados en estos métodos.
Una variante de herregulina también puede
emplearse en el diagnóstico de un cáncer caracterizado por
sobreexpresión de erbB (por ejemplo, erbB2). En un método de
diagnóstico según la presente invención, se obtiene una muestra de
un individuo y se pone en contacto con una variante de herregulina
en condiciones que permiten la unión específica entre la variante y
cualesquiera receptores ErbB presentes en la muestra. La muestra
puede ser una muestra de tejido, una muestra de fluido corporal o
una célula. En el caso de un tumor sólido, puede tomarse una
muestra de tejido de un tumor extirpado quirúrgicamente y prepararse
para un ensayo mediante técnicas convencionales. En el caso de
linfomas y leucemias, se obtiene una muestra que contiene
linfocitos, células de leucemia o tejidos linfáticos. Otras
muestras, incluyendo muestras de orina, lágrimas, suero, líquido
cefalorraquídeo, heces, esputo, extracto celular y similares, pueden
ser útiles para diagnosticar tumores particulares. Como se usa con
respecto a este método, la expresión "unión específica"
significa que la variante de herregulina se une a un receptor ErbB
con una afinidad que es lo suficientemente alta para que la
variante de herregulina no reaccione sustancialmente de forma
cruzada con otros componentes presentes en la muestra en las
condiciones de reacción adecuadas.
La cantidad de variante de herregulina que se
une específicamente a la muestra se determina como una indicación
del contenido de receptor ErbB. Por ejemplo, una muestra de tejido
puede obtenerse de un tumor primario y usarse para preparar bloques
fijados con formalina, incluidos en parafina. Véase Muss et
al., supra; Press et al., Cancer Research 54:
2771-77 (1994). A continuación se preparan secciones
tisulares según técnicas conocidas.
Una variante de herregulina se pone en contacto
con una sección tisular en condiciones que permitan la unión
específica entre la variante y receptores ErbB presentes en la
sección. La unión se detecta generalmente usando una marca, tal
como un radioisótopo, una marca fluorescente, o un sistema de
marcado enzima-sustrato. La marca puede conjugarse
directamente con la variante de herregulina, como se ha descrito
anteriormente.
Como alternativa, la marca puede estar unida a
la variante de herregulina indirectamente. Por ejemplo, la marca
puede conjugarse a un anticuerpo anti-variante de
herregulina o conjugarse a biotina o avidina y usarse con un
anticuerpo anti-variante de herregulina conjugado a
avidina o biotina (respectivamente), como se describe generalmente
en Current Protocols in Immunology (supra). La unión
selectiva entre biotina y avidina enlaza la marca a la variante de
herregulina.
Aunque normalmente se contempla el análisis
in vitro, también pueden realizarse análisis in vivo
usando una variante de herregulina conjugada con una marca
detectable adecuada (por ejemplo, In para la formación de
imágenes). Véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
4.938.948.
Un método de diagnóstico descrito en este
documento puede usarse en combinación con otras evaluaciones de
diagnóstico/terapéuticas tales como determinación del estado de los
ganglios linfáticos, tamaño del tumor primario, grado histológico,
estado de estrógeno o progesterona, contenido de ADN del tumor
(ploidía), o proliferación celular (fracción de la fase S). Véase
Muss et al., New Eng. J. Med. 330: 1260-66
(1994).
Una variante de herregulina según la presente
invención también es útil como patrón en ensayos para herregulinas
(tales como un radioinmunoensayo, un inmunoensayo ligado a enzimas y
un ensayo con radiorreceptor), en una técnica de purificación por
afinidad (por ejemplo, para un receptor ErbB tal como receptor
ErbB-3 o ErbB-4), en un ensayo de
unión competitiva al receptor. Una variante de herregulina también
puede emplearse como inmunógeno para generar anticuerpos
anti-variante de herregulina útiles en la detección
y/o purificación de variantes de herregulina.
Un kit de diagnóstico puede ser útil para poner
en práctica los métodos descritos anteriormente es decir, una
combinación envasada de reactivos para su uso para ensayar una
muestra. Los componentes del kit se proporcionan habitualmente en
proporciones predeterminadas. Un kit para detectar receptores ErbB
puede incluir, por ejemplo, una variante de herregulina marcada con
una marca adecuada o una variante de herregulina con un reactivo o
reactivos marcados para el marcado indirecto. Si la marca es una
enzima, el kit habitualmente incluye cualquier sustrato o cofactor
requerido por la marca enzimática. Otros aditivos, tales como
estabilizantes, tampones y similares, también pueden incluirse en
el kit. Los reactivos del kit pueden proporcionarse en forma de
polvos secos, habitualmente liofilizados, junto con excipientes para
preparar soluciones de reactivos del kit de la concentración
apropiada. Los kits habitualmente también incluyen instrucciones
para realizar el ensayo para el que está diseñado el kit.
También puede proporcionarse un artículo de
fabricación que contenga una composición farmacéutica con variante
de herregulina útil para el tratamiento de un trastorno descrito
anteriormente. El artículo de fabricación incluye un recipiente y
una marca. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos,
viales, jeringas y tubos de ensayo. El recipiente puede estar hecho
de cualquiera de diversos materiales, tales como vidrio o plástico
y puede tener un puerto de acceso estéril. La marca en, o asociada
con, el recipiente indica el trastorno para cuyo tratamiento se
usará la composición.
El artículo de fabricación puede ser un
componente de un kit que incluye un segundo recipiente que incluye
un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina
tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa.
El kit también puede incluir otros materiales que son deseables
desde un punto de vista comercial o del usuario, tales como otros
tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos en el
envase con instrucciones de uso.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La parte más pequeña de
HRG-\beta1 EGF que proporciona unión de alta
afinidad al receptor en el contexto de presentación en fagos se
determinó preparando vectores fagémidos que producían
HRG-\beta1 147-227,
147-244, 177-227, o
177-244 fusionados al extremo C de pIII de M13.
Estos fragmentos de dominio similar a HRG-\beta1
EGF se amplificaron a partir del vector pHL89 (que se describe en
Holmes, et al., Science 256: 1205-10 [1992])
mediante PCR con cebadores que tienen salientes que contienen
NsiI/XbaI.
Estos fragmentos se insertaron en el vector de
presentación en fagémidos pam-g3 mediante
ligamiento-digestión por restricción en los mismos
puntos para generar construcciones pHRG1-g3
(177-227), pHRG2-g3
(177-244), pHRG4-g3
(147-227) y pHRG5-g3
(147-244). pam-g3 era un derivado de
phGHam-g3, que se diseñó para presentación en fagos
de hormona del crecimiento humana (hGH) y se describió en Lowman
et al., Biochemistry 30: 10832-38 (1991).
pam-g3 se produjo eliminando el gen de hGH presente
en phGHam-g3 y sustituyendo este gen por un
fragmento "de relleno", que proporciona espacio para escisión
en los puntos de restricción usados para la clonación.
pHRG1-g3 contenía una mutación Ala227Val que se
había introducido al generar la construcción. Una plantilla que
contenía uracilo de cadena sencilla se produjo a partir de esta
construcción y se usó en mutagénesis dirigida para restaurar
Ala227, generando pHRG6-g3
(177-227). En cada una de las construcciones
descritas anteriormente, el fragmento de dominio similar a
HRG-\beta1 EGF estaba unido al resto 247 de
pIII.
En un esfuerzo para determinar si la inclusión
de un enlazador flexible extendido en la unión entre
HRG-\beta1 EGF y pIII podría aliviar la potencial
interferencia de pIII en la unión a ErbB-3, se
prepararon dos construcciones que tenían enlazadores en esta unión
a partir de la plantilla pHRG1-g3.
pHRG8-g3 expresaba HRG-\beta1
177-228 unido a pIII 323 a través de un enlazador
que contiene tres repeticiones de GGGS consecutivas (SEC ID Nº:
34), y pHRG11-g3 expresaba
HRG-\beta1 177-230 unida a pIII
247 a través de un enlace GGGSGGG (SEC ID Nº: 35).
Los dominios similares a
HRG-\beta1 EGF expresados a partir de las
construcciones descritas anteriormente se designan en este
documento eliminando la "p" y la "-g3" que aparecen en el
nombre de la construcción. Por lo tanto, el dominio similar a
HRG-\beta1 EGF expresado a partir de la
construcción pHRG2-g3 se designa como
"HRG2".
Los dominios se presentaron de forma monovalente
en fagos como proteínas de fusión pIII, según lo descrito por Bass
et al., Proteins 8: 309-14 (1990), y después
se analizó su unión a la fusión de alta afinidad de receptor
ErbB-2/3-Ig
(ErbB-2/3-Ig) usando la técnica de
ELISA de fagos descrita por Cunningham et al., EMBO J. 13:
2508-15 (1994), con ligeras modificaciones. Para
producir los fagos que presentaban los dominios, las mezclas de
reacción de mutagénesis se electrotransformaron en células
XL1-Blue^{TM} (Stratagene, Inc., La Jolla, CA),
según el protocolo del fabricante. Las células transformadas se
infectaron a continuación con 10^{11} unidades formadoras de
placa (pfu) del fago ayudante M13K07 (Promega Corp., Madison, WI).
Se prepararon soluciones madre de fago (aproximadamente 10^{14}
fagémidos/ml) precipitando caldos de cultivo de las células después
de 18-24 horas (h) de cultivo con PEG al 20%
(2000)/NaCl 2,5 M, según el método de Sambrook y Maniatis,
Molecular Cloning a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press 429
(1989). Los fagos se resuspendieron en solución salina tamponada
con fosfato (PBS: fosfato sódico 0,01 M, NaCl 0,1 M, pH 7,5).
Se prepararon fusiones de receptor
ErbB-Ig usando vectores que expresaban el dominio
extracelular (ECD) del receptor ErbB-2,
ErbB-3 o ErbB-4 fusionado a un
dominio constante de IgG humana. En primer lugar un único punto
MIuI se insertó en un vector que expresa una cadena pesada de IgG
humana (pDR2) en la región que codifica el dominio bisagra de la
inmunoglobulina. También se introdujeron puntos MIuI en un conjunto
de vectores de expresión de ErbB en la región que codifica el
ECD/uniones transmembrana de estos receptores. Toda la mutagénesis
se realizó según el método de Kunkel et al., Methods Enzymol.
154: 367-82. (1987).
Los puntos MIuI se usaron para preparar
construcciones que expresaban la fusión de receptor
ErbB-Ig deseada. Las uniones de fusión de las
diversas fusiones del receptor eran las siguientes (en orden desde
el extremo N al extremo C): para ErbB-2, Glu646 de
ErbB2 se fusionó a
Thr-Arg-Asp-Lys-Thr
(TRDKT; SEC ID Nº: 36), que se fusionó a His224 de VH
(H224_{VH}); para ErbB-3, Leu617 de
ErbB-3 se fusionó a
TRDKT-H224_{VH}; para ErbB-4,
Gly640 de ErbB-4 se fusionó a
TRDKT-H224_{VH}. Los números de restos del
receptor ErbB se indican según el sistema de numeración de Plowman
et al. PNAS USA 90: 1746-50 (1993). La
secuencia TR conservada se obtenía del punto MIuI, y la secuencia
DKT conservada se obtenía de un enlazador. Las construcciones de
expresión final tenían una estructura principal de plásmido de tipo
pRK donde la expresión eucariota estaba impulsada por un promotor
de citomegalovirus (CMV).
Las fusiones de receptor se expresaron a partir
de estas construcciones, se purificaron y se les dejó formar
dímeros unidos mediante puentes disulfuro. Las fusiones
homodiméricas de receptor ErbB-2,
ErbB-3 y ErbB-4-Ig
se produjeron transfectando células con la construcción que codifica
la fusión de receptor apropiada. Las fusiones de receptor
heterodiméricas se generaron co-transfectando dos
vectores de expresión que codifican diferentes fusiones de receptor
en las mismas células. Las fusiones de receptor secretadas
resultantes eran mezclas de dos tipos de homodímeros y el
heterodímero esperado.
Para expresar las fusiones de receptor, células
HEK-293 adherentes (ATCC No. CRL1573) se
transfectaron con el vector o vectores de expresión apropiados
usando el método de precipitación con fosfato cálcico descrito por
Gorman et al., DNA and Protein Eng. Tech. 2:
3-10 (1990). El medio que contenía suero se
sustituyo por medio libre de suero a las 15 h después de la
transfección y las células transfectadas se cultivaron sin suero
durante 5-7 días.
El medio acondicionado resultante se recogió y
se pasó a través de columnas Protein A (1 ml Pharmacia
HiTrap^{TM}, Piscataway, NJ). Las fusiones de receptor purificadas
se eluyeron con ácido cítrico 0,1 M (pH 4,2) en tubos que contenían
Tris-HCl 1 M (pH 9,0). Las proteínas eluídas se
dializaron a continuación contra PBS y se concentraron usando
filtros Centri-prep-30^{TM}
(Amicon, Beverly, MA). Se añadió glicerol a una concentración final
del 25% y la preparación se almacenó a -20ºC. La concentración de
fusión de receptor se determinó mediante un
Fc-ELISA.
Placas de microvaloración (placas de 96 pocillos
Nunc Maxisorp^{TM}, Inter Med, Dinamarca) para ELISA de fagos se
prepararon de la siguiente manera. Los pocillos se
pre-recubrieron durante una noche con 0,5 \mug de
anticuerpos de conejo anti-IgG humana (específicos
del fragmento Fc gamma) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) en
100 \mul de NaCO_{3} 50 mM (pH 9,6). Los pocillos se bloquearon
durante 30 minutos (min) con 200 \mul de PBS que contenía el 0,1%
de albúmina de suero bovino (BSA) y se aclararon con tampón de
lavado (PBS que contenía Tween 20^{TM} al 0,05%). Los pocillos se
recubrieron a continuación con 0,1 \mug de
ErbB-2/3-Ig en tampón de unión (PBS,
BSA al 0,1%, Tween 20^{TM} al 0,05%) durante 1 h, y se lavaron de
nuevo.
Diluciones sucesivas de
ErbB-2/3-Ig soluble (competidor) y
una concentración de fago predeterminada para dar el 60% de
saturación (sin competidor) se añadieron a los pocillos en 100
\mul de tampón de unión. Después de la incubación durante 2 h a
temperatura ambiente, las placas se lavaron exhaustivamente y se
trataron con una dilución 1:900 de conjugado de peroxidasa de
rábano picante anti-M13 (Pharmacia, Piscataway, NJ)
durante 20 min. La cantidad de unión al fago se determinó ensayando
la actividad de peroxidasa de rábano picante usando solución de
sustrato de o-fenilendiamina diclorhidrato (Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO). Los valores de CE_{50} se
calcularon como la concentración de
ErbB-2/3-Ig soluble requerida para
competir con la mitad del fago de la placa.
Los resultados se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las soluciones madre de fagos se unían
específicamente a ErbB-2/3-Ig
inmovilizado y podían sufrir la competencia de valores de CE_{50}
similares (5-42 nM). Estos valores eran
aproximadamente 100 veces más altos que la constante de disociación
(K_{d}) medida anteriormente. Holmes, et al., supra.
Sin embargo, los valores de CE_{50} obtenidos de la ELISA de
fagos a menudo son más altos que la auténtica K_{d},
particularmente para interacciones de alta afinidad. Esto puede
deberse a la alta concentración de recubrimiento con receptor
necesaria para dar una señal razonable para el fago unido, un bajo
porcentaje de receptor activo en soluciones competidoras, o
interferencia por parte del enlace de la proteína a pIII.
En cualquier caso, la
HRG-\beta1 147-176 no parecía
aumentar la unión del fago que presenta el dominio similar a
HRG-\beta1 EGF a
ErbB-3-Ig, mientras que
HRG-\beta1 228-244 contribuía
ligeramente a la afinidad de unión. Por lo tanto, el dominio
similar a EGF mínimo de HRG-\beta1 se definió como
HRG-\beta1 177-228.
También se realizó ELISA de fagos para las
construcciones que codifican fusiones de
HRG-\beta1 EGF-pIII que contienen
enlazadores insertados entre HRG-\beta1 EGF y el
fragmento pIII. Se observaron mejoras moderadas de la afinidad de
unión para las fusiones que contenían enlazador, junto con una
expresión aumentada de fusiones funcionales, según se determinó
mediante valoraciones cuantitativas de unión de las soluciones madre
de fagos. La fusión de HRG-\beta1 EGF mediante un
enlazador al resto 323 de pIII, en lugar de al resto 247
(pHRG8-g3) dio como resultado una ligera mejora de
la afinidad. Esta construcción se usaba, por lo tanto, como el
vector plantilla para la construcción de bibliotecas de
presentación en fagos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Este ejemplo describe la identificación de
restos activos en el dominio similar a EGF de
herregulina-\beta1 (HRG-\beta1)
(HRG-\beta1 177-229) que juega un
papel en la unión de HRG-\beta1 a los receptores
ErbB-3 y ErbB-4. Los restos activos
se identificaron mutando aminoácidos individuales en este dominio a
alanina. Los dominios mutados (en lo sucesivo en este documento
"variantes") se presentaron de forma monovalente en el fago en
forma de proteínas de fusión a pIII y las afinidades de variantes
por ErbB-3 y ErbB-4 se determinaron
mediante ELISA de fagos. Las variantes seleccionadas se expresaron
como proteínas de fusión a tiorredoxina, cuya afinidad por
ErbB-3 y ErbB-4 también se
ensayó.
Se generaron variantes sustituidas por alanina
mediante mutagénesis dirigida según Kunkel et al., Methods
Enzymol. 154: 367-82 (1987) (en lo sucesivo en este
documento "mutagénesis de Kunkel"), usando una plantilla de
ADN de cadena sencilla que contiene uracilo preparada a partir de
pHRG2-g3. pHRG2-g3, que se describe
en el Ejemplo 1, expresaba HRG-\beta1
177-244 fusionada a pIII 247. Se usó una serie de
oligonucleótidos para generar una serie de construcciones que
expresaban una serie de variantes en las que se mutaron restos
consecutivos a alanina. Se prepararon soluciones madre de fagos a
partir de estas construcciones como se describe en el Ejemplo 1,
excepto que se usó PEG (8000) para precipitar el fago. Las
afinidades de las variantes sustituidas por alanina por
ErbB-3-Ig y
ErbB-4-Ig se determinaron mediante
ELISA de fagos como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se
muestran en la Figura 2, que indica la proporción de la CE_{50}
para cada variante comparada con la CE_{50} para
HRG-\beta1 177-244 de tipo
salvaje, también presentada en fagos. En este diagrama, una
proporción de uno indica que no había diferencia de afinidad por la
unión a la variante en comparación con HRG-\beta1
177-224 de tipo salvaje, y una proporción de, por
ejemplo, cinco indica que la variante se unía al receptor con una
afinidad cinco veces menor que la de HRG-\beta1
177-224 de tipo salvaje.
Varias variantes sustituidas por alanina se
expresaron en forma soluble como proteínas de fusión a tiorredoxina
(Trx). Para preparar vectores de expresión adecuados, un vector de
expresión de Trx se generó en primer lugar a partir de pET23a
(Novagen, Inc., Madison, WI). pET23a se digirió con NdeI (que corta
en la base 238) y HindIII (que corta en la base 173) y se inserto
un fragmento que codifica Trx. Este fragmento se obtuvo de pTrxFus
(bases 2722-3180; Invitrogen Corp., San Diego, CA).
El punto NdeI, que incluye el punto de inicio de la traducción de
Trx, se destruyó a continuación cortando con NdeI y ligando de nuevo
con Klenow. Esto eliminaba el sitio NdeI, al tiempo que conservaba
el inicio de la traducción de Trx.
Los vectores que codifican variantes de
HRG-\beta1 sustituidas por alanina se generaron
inicialmente mediante mutagénesis de Kunkel en un vector
pRK5.gDhrgB1 (descrito en Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech.
2: 2-10 [1990]). Las secuencias que codifican las
variantes podían escindirse de estos vectores usando NdeI y BamHI.
Para facilitar la clonación de dichos fragmentos en el vector de
expresión de Trx, se usó mutagénesis de Kunkel para introducir un
sitio KpnI en el vector pRK5.gDhrgB1 que codifica
HRG-\beta1 146-244 de tipo
salvaje inmediatamente cadena arriba del sitio NdeI (en la base
5407). Un fragmento KpnI-BamHI que codifica
HRG-\beta1 146-244 de tipo salvaje
se escindió a continuación de pRK5.gDhrgB1 y se insertó en el vector
de expresión de Trx en los sitios de clonación KpnI y BamHI en el
extremo 3' de la secuencia que codifica Trx. Esto introdujo un
sitio NdeI inmediatamente cadena abajo del sitio KpnI. En el vector
resultante, la secuencia de HRG-\beta1 de tipo
salvaje podía eliminarse digiriendo con NdeI y BamHI y sustituirse
por un fragmento NdeI-BamHI que codifica una
variante. La serie de vectores de expresión de
Trx-variante obtenida de este modo expresaba
fusiones de Trx-variante que contenían un punto de
reconocimiento de enteroquinasa proteasa (DDDDK; SEC ID Nº: 37)
entre las secuencias de Trx y la variante.
La expresión de proteínas de fusión
Trx-variante era impulsada por el promotor de T7
inducible a partir de pET23a. La clonación, el cultivo celular y la
expresión se realizaron como se describe en el manual del sistema
Novagen pET. En resumen, la clonación se realizó en células
XL1-Blue^{TM} (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y
la expresión de proteína soluble en células huésped BL21DE3
(Novagen, Inc., Madison, WI). Las células BL21DE3 que contenían un
vector de expresión de Trx-variante se cultivaron a
37ºC en medio LB hasta que la DO_{550} alcanzaba
0,3-0,6. La expresión de
Trx-variante se indujo a continuación mediante la
adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
0,4 nM (IPTG), y se permitió que el crecimiento continuara durante
2-4 h a 28ºC. Las células se recogieron mediante
centrifugado, se resuspendieron en Tris-HCl 0,02 M,
EDTA 0,025 M (pH 7,5) a un volumen que era 1/20avo del volumen del
cultivo celular.
Las células se lisaron mediante congelación en
hielo seco, descongelación a 37ºC, seguida de sonicación vigorosa.
El ciclo de congelación, descongelación y sonicación se repitió tres
veces. La proteína se disolvió adicionalmente en GdHCl 6 M,
Tris-HCl 0,1 M (pH 8,8), se sometió a sulfitolisis
mediante la adición de Na_{2}SO_{3} 0,1 M,
Na_{2}S_{4}O_{6} 0,2 M y se agitó a temperatura ambiente
durante 1,5 h. la proteína se dializó en Tris-HCl
0,05 M (pH 7,5), metionina 0,01 M. Después de la diálisis, el
material insoluble se eliminó mediante centrifugado a 35K x g
durante 15 min.
El sobrenadante se purificó mediante
cromatografía Fast Flow Q Sepharose^{TM} (Pharmacia, Piscataway,
NJ) usando una columna de 15 ml equilibrada con
Tris-HCl 0,01 M (pH 7,5). La proteína se eluyó
usando un gradiente de NaCl 0-2 M con un caudal de
5 ml/min. La fusiones de Trx-variante se eluyeron
entre NaCl 0,5-0,6 M y se volvieron a plegar
durante una noche a temperatura ambiente después de la adición de
cisteína 1 mM. La preparación resultante se dializó en
Tris-HCl 0,05 M (pH 7,5), metionina 0,01 M. se
descubrió que las fusiones de Trx-variante eran
esencialmente homogéneas según se determinó mediante análisis de
aminoácidos y SDS-PAGE.
Las afinidades de las fusiones de
Trx-variante por las fusiones de receptor
ErbB-Ig se determinaron midiendo la inhibición de
la unión de ^{125}I-HRG-\beta1
177-244 a ErbB-3-Ig
y ErbB-4-Ig. Las fusiones de
receptor recubrieron placas (Nunc Maxisorp C^{TM} pocillos con
tiras separables, Inter Med, Dinamarca) mediante
anti-IgG humana, como se describe en el Ejemplo 1
para el ELISA de fagos. Se realizaron ensayos de unión con una
cantidad constante de
^{125}I-HRG-\beta1
177-244 (100-300 pM) y
concentraciones variables (100 pM - 4 \muM) de fusión
Trx-variante sin marcar. Después de la incubación
durante 1-3 h a temperatura ambiente, las placas se
lavaron y la cantidad de
^{125}I-HRG-\beta1
177-244 unida en cada pocillo se contó en un
contador gamma (Isodata, ICN Biomedic Systems, Huntsville, AL). Para
los ensayos de unión a ErbB-3, el tampón de bloqueo
era TBST (Tris-HCl 0,025 M [pH 7,5], NaCl 0,15 M,
Tween 20^{TM} al 0,02%) que contenía BSA al 1%; el tampón de
unión era medio de cultivo celular RPMI 1640^{TM}
(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) que contenía
glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, tampón HEPES 10 mM (pH 7,2), BSA al 0,2%; y el
tampón de lavado era TBST. Para los ensayos de unión a
ErbB-4, se usó PBS que contenía BSA al 1% como
tampones de bloqueo y unión, y el tampón de lavado era PBS que
contenía Tween 20^{TM} al 0,05%.
Los resultados se muestran en las Tablas 4 y
5.
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Ejemplo
3
Este ejemplo describe la selección de variantes
de HRG-\beta1 que contienen restos
correspondientes al dominio similar a EGF mínimo
(HRG-\beta1 177-228). Para estas
variantes, los números de restos también se expresan, entre
paréntesis, en términos de la posición del resto en el dominio
similar a EGF mínimo (es decir, HRG-\beta1 EGF
1-52).
Se prepararon variantes de
HRG-\beta1 EGF y se seleccionaron para la unión a
ErbB-3-Ig usando presentación en
fagos monovalente, según el método de Bass et al., Proteins
8: 309-14 (1990). Como se describe con detalle
posteriormente, se preparó un vector fagémido de
HRG-\beta1 EGF, en el que
HRG-\beta1 EGF se fusionó a un fragmento
C-terminal de la proteína de la envuelta pIII de
M13. Se realizó mutagénesis de Kunkel para introducir codones de
terminación en este vector en puntos seleccionados para
aleatorización. Esta etapa asegura que el vector de partida es
incapaz de expresar el polipéptido de tipo salvaje. Tramos de cuatro
a seis restos por biblioteca se aleatorizaron de forma lineal,
excepto las seis cisteínas, Phe189 (HRG-\beta1 EGF
Phe13) y los dos restos más C-terminales (véase la
Figura 3). Phe189 no se alteraba puesto que este resto se conserva
como resto aromático en EGF y TGF-\alpha y forma
una interacción de pegado con Tyr208 (HRG-\beta1
EGF Tyr32) Jacobsen et al., Biochemistry 35:
3402-17 (1996). De este modo
HRG-\beta1 EGF estaba abarcado en ocho
bibliotecas, designadas A-E, G, H e I.
La biblioteca E, que abarcaba
HRG-\beta1 202-209
(HRG-\beta1 EGF 26-33), contenía
una eliminación de tres restos. La región eliminada corresponde a
un giro desordenado entre la segunda y tercera lámina \beta de
HRG-\beta1 EGF, y los aminoácidos equivalentes
están ausentes en EGF y TGF-\alpha. Una variante
de HRG-\beta1 EGF de control en la que
HRG-\beta1 202-204
(HRG-\beta1 EGF 26-28) de HRG8 se
eliminan (HRG63) se unía a
ErbB-3-Ig con una afinidad similar a
la del tipo salvaje (Tabla 13).
Una biblioteca adicional (F) se creó para
aleatorizar un parche superficial compuesto por cadenas laterales
de la primera y segunda láminas \beta, que incluía
HRG-\beta1 178, 180, 198, y 200
(HRG-\beta1 EGF 2, 4, 22 y 24).
Los puntos seleccionados en los vectores de
partida se aleatorizaron mediante mutagénesis de Kunkel para
producir bibliotecas de HRG-\beta1 EGF. Se
produjeron fagos que presentaban HRG-\beta1 EGF
mutados a partir de las bibliotecas en condiciones tales que,
estadísticamente, cada partícula de fago presentaba no más de una
copia del HRG-\beta1 EGF mutado. Véase Bass et
al., supra. Estos fagos se seleccionaron a continuación
por la unión a (se clasificaron contra)
ErbB-3-Ig inmovilizado en una placa
de ELISA. Los fagos unidos se eluyeron y se usaron para reinfectar
células huésped, que se usaron para producir nuevos fagos para otra
ronda de clasificación. Este proceso se repitió de seis a siete
veces para cada biblioteca. A continuación se secuenciaron doce
clones del fago seleccionado de cada biblioteca.
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Se construyeron bibliotecas de fagos mediante
mutagénesis de Kunkel usando una plantilla de ADN de cadena
sencilla que contenía uracilo preparada a partir de
pHRG8-g3. pHRG8-g3, que se describe
en el Ejemplo 1, expresaba HRG-\beta1
177-228 (HRG-\beta1 EGF
1-52) fusionado mediante un enlazador al resto 323
de pIII. Para cada biblioteca, codones de terminación TAA y TGA se
instalaron en posiciones seleccionadas para aleatorización para
generar plantillas a medida, que eliminaban el fondo de tipo salvaje
de las reservas. Las posiciones se aleatorizaron completamente
mediante mutación a codones NNS (donde N es cualquiera de las
cuatro bases y S es G o C). Se usó un oligonucleótido para la
reacción de mutagénesis de cada biblioteca excepto para la
biblioteca F, para la cual se usaron simultáneamente dos
oligonucleótidos (uno que aleatorizaba HRG-\beta1
178 y 180 [HRG-\beta1 EGF 2 y 4] y el otro que
aleatorizaba HRG\beta-1 198 y 200
[HRG-\beta1 EGF 22 y 24]). Los oligonucleótidos
de mutagénesis contenían salientes de 18 bases en cualquier lado de
los restos aleatorizados.
Las mezclas de reacción de mutagénesis se
electro-transformaron en células
XL-1 Blue (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), según
el protocolo del fabricante. Las células transformadas se infectaron
a continuación con 10^{11} pfu de fago ayudante M13K07 (Promega
Corp., Madison, WI), y se prepararon soluciones madre de fagos
(aproximadamente 10^{14} fagémidos/ml) como se describe en el
Ejemplo 1.
Entre 1,0 x 10^{8} y 6,4 x 10^{8}
transformantes se obtuvieron para cada biblioteca, lo que
significaba que las bibliotecas que contienen cinco o menos codones
aleatorizados tenían una excelente representación de las posibles
combinaciones de secuencia de aminoácidos (3,36 x 10^{7} posibles
secuencias de ADN; 3,2 x 10^{6} posibles secuencias de
aminoácidos). La biblioteca B, que contiene seis codones
aleatorizados (1,1 x 10^{9} secuencias de ADN), tenía 4,8 x
10^{6} transformantes totales.
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Se prepararon fagos monovalentes y se realizó la
selección en ErbB-3-Ig unido
previamente a placas de microvaloración mediante captura con
anticuerpos policlonales para el fragmento Fc humano, como se
describe en el Ejemplo 1. Aproximadamente 10^{12} fagos en 100
\mul de tampón de unión (PBS, BSA al 0,1%, Tween 20^{TM} al
0,05%) se aplicaron a una placa recubierta con
ErbB-3-Ig y una placa de control a
la que no se había añadido
ErbB-3-Ig. Después de una incubación
de 2 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron exhaustivamente
(12x) y los fagos se eluyeron añadiendo 100 \mul de una solución
de HCl 50 mM y Tween^{TM} 20 al 0,05% y agitando durante 10
min.
Los eluatos se neutralizaron con 10 \mul de
Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y se usaron 20 \mul para
valoración cuantitativa en células XL-1 Blue en
fase logarítmica. El resto se usó para infectar 1 ml de células
XL-1 Blue en fase logarítmica (30 min a 37ºC), que
a continuación se superinfectaron con 2 x 10^{10} pfu de fago
M13KO7 y se cultivaron en 25 ml de caldo 2YT (16 g/l de triptona, 10
g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl) que contenía 50
\mug/ml de carbenicilina durante 18-24 h. Los
fagos se recogieron como se ha descrito anteriormente y el ciclo se
repitió. Las bibliotecas se enriquecieron rápidamente, de modo que
en la roda seis de selección la proporción de fago eluído de los
pocillos positivos (recubiertos con
ErbB-3-Ig) con respecto a los
pocillos negativos (pre-recubrimiento
anti-Fc humano solamente) estaba entre 39 y
9200.
Después de la ronda seis (bibliotecas A, B,
D-F) o ronda siete (bibliotecas C,
G-I) de selección, doce clones de cada biblioteca
se tomaron aleatoriamente y se secuenciaron mediante el método
didesoxi. Véase Sanger et al., PNAS USA 74:
5463-67 (1977). Los aminoácidos en las posiciones
aleatorizadas deducidos a partir de las secuencias de ADN se
muestran en las Tablas 6-12 (un "." indica un
resto que es idéntico al resto de tipo salvaje). Los restos
consenso seleccionados en cada posición se presentan gráficamente en
la Figura 3. En general, había gran número de mutaciones, en
algunos casos con cambios drásticos en el carácter de las cadenas
laterales. En varias posiciones que clasificaban para un resto
particular, se descubrió una mezcla de codones de ADN, lo que
proporcionaba confianza en que las bibliotecas tenían gran
diversidad y que la selección era a nivel de proteínas. En varias
de las bibliotecas, había una mutación espontánea de
HRG-\beta1 Met22.6Ile
(HRG-\beta1 EGF Met50Ile) debida a un cambio de
una base en este codón. Esta mutación da como resultado un aumento
significativo de la afinidad por la unión a
ErbB-3-Ig. Los resultados de
secuenciación para cada biblioteca se resumen posteriormente.
\newpage
Biblioteca A -
HRG-\beta1 177-181
(HRG-\beta1 EGF
1-5)
HRG-\beta1
177-181 (HRG-\beta1 EGF
1-5) está presente en la primera cadena \beta en
el subdominio N-terminal de tipo salvaje. Los
cambios de aminoácidos en las variantes seleccionadas de esta
biblioteca se muestran en la Tabla 6.
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Después de la aleatorización, Ser177 (Ser1)
clasificaba exclusivamente para Trp. His178 (His2) clasificaba para
restos hidrofílicos mezclados, pero el resto de tipo salvaje no
estaba entre ellos. Leu179 (Leu3) se conservaba en todas las
variantes secuenciadas. Val180 (Val4) clasificaba para tipo salvaje
en ocho de 12 variantes, y las restantes variantes tenían
sustituciones conservativas en esta posición, con la excepción de
una mutación Val180Glu (Val4Glu). En Lys181 (Lys5), Pro aparecía en
ocho variantes, y el resto de tipo salvaje se descubrió en dos
variantes.
Cuatro variantes de la biblioteca A no contenían
sustituciones de aminoácidos en posiciones aleatorizadas en la
biblioteca A. En su lugar, estas variantes contenían sustituciones
de aminoácidos en posiciones aleatorizadas en la biblioteca B, y
por lo tanto estas variantes se enumeran como variantes
B1-B4 en la Tabla 7. Análogamente, cuatro variantes
de la biblioteca B no contenían sustituciones de aminoácidos en
posiciones aleatorizadas en la biblioteca B, sino que en su lugar
contenían substituciones en posiciones aleatorizadas en la
biblioteca A. Estas variantes se enumeran como variantes
A5-A8 en la Tabla 6.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Biblioteca B -
HRG-\beta1 183-188
(HRG-\beta1 EGF
7-12)
HRG-\beta1
183-188 (HRG-\beta1 EGF
7-12) tenía carácter helicoidal en la proteína de
tipo salvaje. Los cambios de aminoácidos en las variantes
seleccionadas de esta biblioteca se muestran en la Tabla 7.
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La aleatorización de esta región producía los
cambios más dramáticos a partir de la secuencia de tipo salvaje,
aunque el carácter generalmente hidrofílico de esta región se
mantuvo en las variantes secuenciadas. En particular, este tramo de
seis restos clasificaba para restos Gly en la primera y última
posiciones, A1a183 y Thr188 (Ala7 y Thrl2). También había un cambio
de registro de cargas positivas y negativas en Lys185 (Lys9), que
clasificaba para Glu y Asp, entre otros; Glu186 (Glu10), que
clasificaba exclusivamente para Arg; y Lys187 (Lys11), que
clasificaba para Glu y Asp. Glu184 (Glu8) clasificaba para diversos
tipos diferentes de restos, lo que indicaba que esta cadena lateral
no juega un papel importante en la unión al receptor
ErbB-3.
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Biblioteca C -
HRG-\beta1 191-195
(HRG-\beta1 EGF
15-19)
HRG-\beta1
191-195 (HRG-\beta1 EGF
15-19) incluye el giro \beta entre la hélice y la
segunda cadena \beta. Los cambios de aminoácidos en las variantes
seleccionadas de esta biblioteca se muestran en la Tabla 8.
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La aleatorización y selección producían
variantes en las que la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje en
esta región estaba casi completamente conservada. Se encontraron
mutaciones solamente en dos variantes, ambas en Glu195 (Glu19).
Este resultado es coherente con un papel importante para los restos
de tipo salvaje en esta región en la unión al receptor
ErbB-3.
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Biblioteca D -
HRG-\beta1 197-201
(HRG-\beta1 EGF
21-25)
HRG-\beta1
197-201 (HRG-\beta1 EGF
21-25) está presente en la segunda cadena \beta en
el subdominio N-terminal. Los cambios de
aminoácidos en las variantes seleccionadas de esta biblioteca se
muestran en la Tabla 9.
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La aleatorización en esta región produjo un
aumento o una pérdida de carga para dos de los cinco restos. Phe197
(Phe21) clasificaba para Tyr en 10 de 12 variantes, manteniendo la
aromaticidad en esta posición. Met198 (Met22) clasificaba para un
resto cargado positivamente en 11 de 12 variantes. Val199 (Va123) se
conservaba en todas las variantes, y Lys200 (Lys24) clasificaba
para tipo salvaje o para Arg, conservando la carga positiva en esta
posición. Asp201 (Asp25) clasificaba para restos no cargados Thr o
Ile, conservando el carácter de rama \beta de esta posición. Las
variantes D1, D2, D8, D12 también incluían la mutación espontánea
que aumentaba la afinidad Met226Ile
(Met50Ile).
(Met50Ile).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Biblioteca E -
HRG-\beta1 205-209
(HRG-\beta1 EGF
29-33)
HRG-\beta1
205-209 (HRG-\beta1 EGF
29-33) incluye restos presentes en la tercera cadena
\beta en el subdominio N-terminal. Los cambios de
aminoácidos en las variantes seleccionadas de esta biblioteca se
muestran en la Tabla 10.
Después de la aleatorización, Pro205 (Pro29)
clasificaba para Thr o Tyr. Ser206 (Ser30) clasificaba para restos
mezclados, predominantemente aquellos que tenían cadenas laterales
básicas, aunque Gly también aparece dos veces (en secuencias
obtenidas de la misma variante). Una inversión de cadenas laterales
se producía para Arg207 (Arg31) y Tyr208 (Tyr32), la primera de las
cuales clasificaba exclusivamente para Tyr y la segunda de las
cuales clasificaba principalmente para Arg (siete variantes) y Leu
(cuatro variantes). Este descubrimiento era particularmente
inesperado, dado que Tyr208 se pega a Phe189 (Phe13) en la
estructura y se conserva en la secuencia de EGF. Véase Jacobsen
et al., Biochemistry 35: 3402-17 (1996). En
Leu209 (Leu33), La sustitución relativamente conservativa de Met se
descubrió en la mayoría de las variantes, pero también se encontraba
Gly.
Biblioteca G -
HRG-\beta1 211-216
(HRG-\beta1 EGF
35-40)
HRG-\beta1
211-216 (HRG-\beta1 EGF
35-40) incluye La primera cadena \beta del
subdominio C-terminal de
HRG-\beta1 EGF. Los cambios de aminoácidos en las
variantes seleccionadas de esta biblioteca se muestran en la Tabla
11.
Después de la aleatorización, 10 de 12 variantes
contenían una mutación Lys211Arg (Lys35Arg), conservando de este
modo una carga positiva en esta posición, que se encuentra entre dos
cisteínas. Pro213 (Pro37) clasificaba para restos hidrofílicos
mezclados, y Asn214 (Asn38) clasificaba para una mezcla de restos,
con Leu y Val apareciendo con mayor frecuencia. Glu215 (Glu39) se
conservaba en todas las variantes y Phe216 (Phe40) se conservaba en
ocho de 12 variantes con una sustitución conservativa de Tyr en tres
de las restantes variantes.
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Biblioteca H -
HRG-\beta1 217-220
(HRG-\beta1
41-44)
La biblioteca de HRG-\beta1
217-220 (HRG-\beta1 EGF
41-44) demostró ser vulnerable a contaminación por
una variante de alta afinidad de la biblioteca B (variante B5). Esta
variante se descubrió en 11 de 12 variantes. En la única variante
no afectada, la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje se
conservaba excepto por una mutación Asp219Glu (Asp43Glu). Este
resultado sugiere que esta región requiere el tipo salvaje o
secuencias similares para la unión óptima.
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Biblioteca I
HRG-\beta1 222-226
(HRG-\beta1 EGF
46-50)
HRG-\beta1
222-226 (HRG-\beta1 EGF
46-50) incluye una corta cadena de lamina \beta
que se alinea con la cadena de lámina \beta en
HRG-\beta1 213-216
(HRG-\beta1 EGF 38-40). Los
cambios de aminoácidos en las variantes seleccionadas de esta
biblioteca se muestran en la Tabla 12.
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Después de la aleatorización de
HRG-\beta1 222-226, solamente dos
tipos de variantes se descubrieron en las 12 secuenciadas, las que
tienen restos de tipo salvaje conservadas en Gln222 (Gln46), Tyr224
(Tyr48) y Val225 (Val49), y las que tienen una mutación Met226Ile
(Met50Ile). Asn223 (Asn47) clasificaba para His (nueve variantes) o
Trp (tres variantes). El fuerte efecto potenciador de la afinidad de
Met226Ile se demuestra por su presencia en todas las variantes
secuenciadas de esta biblioteca y una alta frecuencia de aparición
en variantes de varias otras bibliotecas.
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Biblioteca F -
HRG-\beta1 178, 180, 198, y 200
(HRG-\beta1 EGF 2, 4, 22 y
24)
Cuando His178 (His2), Val180 (Val4), Met198
(Met22) y Lys200 (Lys24) se aleatorizaban simultáneamente,
solamente se descubría un tipo de variante. His178, Val180 y Lys200
clasificaban para restos de tipo salvaje, y Met198 clasificaba para
Lys. Estas variantes contenían adicionalmente la mutación espontánea
Met226Ile (Met50Ile), que daba a las variantes una ventaja
selectiva significativa sobre otras secuencias. Es sorprendente que
la His de tipo salvaje se descubriera en la posición 178, puesto
que ninguna de las 12 variantes secuenciadas de la biblioteca A
contenía His178.
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Las posiciones en las que la sustitución por
alanina afectaba fuertemente a la afinidad de unión tendían a
clasificar para el resto de tipo salvaje. Véase, por ejemplo, los
datos para posiciones en la unión entre los subdominios N- y
C-terminales, (es decir, el giro \beta en
HRG-\beta1 191-195
[HRG-\beta1 EGF 15-19] y el bucle
en HRG-\beta1 217-220
[HRG-\beta1 EGF 41-44])
Adicionalmente, las posiciones en las que la sustitución por
alanina producía efectos menos significativos tendían a experimentar
mutación sustancial después de la presentación en fagos, como se
observa para el tramo helicoidal en HRG-\beta1
183-188 (HRG-\beta1 EGF
7-12).
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Las variantes individuales de cada biblioteca se
seleccionaron por producción de fagos y caracterización adicional
de los HRG-\beta1 EGF mutados ("variantes")
presentados en los fagos. La elección de variantes para
caracterización adicional se basaba en la frecuencia de selección,
con una tendencia hacia secuencias que no contenían la ventajosa
sustitución Met226Ile (Met50Ile). Además, los vectores de fagémidos
para uso en la producción de fagos que presentan
HRG-\beta1 EGF mutados que contienen diversas
combinaciones de las anteriores mutaciones ("variantes de
combinación") se prepararon mediante mutagénesis de Kunkel,
usando plantillas preparadas a partir de varias de las variantes
descritas anteriormente. Las sustituciones de aminoácidos en las
variantes de combinación se indican en la Figura 4. Las afinidades
de las variantes y variantes de combinación por la unión a
ErbB-3-Ig (con respecto a la
afinidad de HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje) se
determinaban mediante ELISA de fagos, como se describe en el
Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 13. También se
ensayó la afinidad de unión a
ErbB-4-Ig con respecto a algunas de
las variantes y variantes de combinación para evaluar la
especificidad.
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Las variantes de la biblioteca A tenían valores
de CE_{50} muy similares a HRG-\beta1 EGF de
tipo salvaje. Las variantes de las bibliotecas B y D tenían una
afinidad significativamente aumentada por
ErbB-3-Ig y
ErbB-4-Ig, en el intervalo de tres a
cinco veces la afinidad de tipo salvaje por variantes seleccionadas
que no contienen Met226Ile (Met50Ile). (Véase las variantes B3 y
D4). Aumentos de afinidad sustancialmente mayores (hasta 26 veces
la del HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje) se midieron
para variantes que contenían Met226Ile (Met50Ile). (Véase las
variantes B5, B10,
y D1).
y D1).
Las variantes de la biblioteca E mostraban
aumentos de afinidad aún mayores. Por ejemplo, la variante E2, que
difería de la secuencia consenso de la biblioteca (Figura 3) en
HRG-\beta1 206 y 208 (HRG-\beta1
EGF 30 y 32), tenía un aumento de afinidad de 28 veces. Los efectos
parecen estar asociados con las sustituciones de aminoácidos en
HRG-\beta1 205-209
(HRG-\beta1 EGF 29-33) en lugar de
con la eliminación de tres restos adyacentes, puesto que la
afinidad por ErbB-3-Ig de una
variante 202-204 (\Delta26-28) de
control (HRG63) era similar a la del HRG-\beta1
EGF de tipo salvaje (Tabla 13).
La única variante de la biblioteca F, que tiene
sustituciones Met198Lys (Met22Lys) y Met226Ile (Met50Ile), mostraba
un aumento solamente ligeramente superior a la de Met226Ile en
solitario, lo que indicaba un pequeño efecto atribuible a la
mutación Met198Lys. Las variantes de la biblioteca G mostraban poco,
si mostraban algún, aumento de la afinidad por
ErbB-3-Ig. La única mutación
Asp219Glu (Asp43Glu) de la solitaria variante de la biblioteca H
proporcionaba un modesto aumento de afinidad. Las dos variantes de
la biblioteca I tenían aumentos significativos de afinidad por
ErbB-3-Ig y
ErbB-4-Ig. Los aumentos eran
atribuibles a un efecto de aproximadamente seis veces de la
mutación Met226Ile (Met50Ile) (véase la variante HRG90), y un
aumento adicional de aproximadamente dos a tres veces de Asn223
(Asn47) para mutaciones de Trp o His. La Presentación en fagos de
variantes de combinación que contenían mutaciones de la variante A3
presentaba un mal rendimiento. La combinación A3 + B3 tenía una
CE_{50} para ErbB-3-Ig similar a
la de la variante B3, pero las demás combinaciones ensayadas no se
unieron con afinidad detectable. Esto podía deberse a una
interacción desventajosa de las mutaciones Ser177Trp, His178Glu o
Lys181Pro (Ser1Trp, His2Glu o Lys5Pro) con mutaciones de las otras
bibliotecas. La combinación de las mutaciones B3 y E2 produjo
afinidades ligeramente disminuidas con respecto a la de la variante
E2.
La combinación de mutaciones de variantes de las
otras bibliotecas dio un comportamiento cercano al aditivo y dio
como resultado el aumento de valores de CE_{50} en más de 50
veces. Los valores de CE_{50} para las mejores variantes de
combinación estaban próximos al límite inferior del ensayo a la
concentración de recubrimiento del receptor usada (aproximadamente
4 nM). El uso de niveles inferiores de recubrimiento de receptor
produjo valores de CE_{50} sub-nanomolares para
estas variantes de combinación, pero no permitió la medición de
afinidad de tipo salvaje, debido a la unión mínima de fago de
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje. Las mejoras
variantes de combinación contenían la secuencia D4, la secuencia B3
o E2 y la única mutación Met50Ile o la secuencia 12.
En general, las variantes que mostraban aumentos
de afinidad por ErbB-3-Ig también
mostraban aumentos similares de afinidad por
ErbB-4-Ig.
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Varias variantes se expresaron en forma soluble
(es decir, HRG-\beta1 EGF mutados se expresaron
sin pIII de M13). Para facilitar la expresión periplásmica de
variantes solubles, se instalaron codones TAG después de
HRG-\beta1 226 (HRG-\beta1 EGF
52) en el fagémido correspondiente mediante mutagénesis de Kunkel, y
las construcciones resultantes se transformaron en células 34B8
(genotipo: ton\DeltaD pho\DeltaDE15 \Delta
(argF-lac)169 deoC2 ompT\Delta degP41
(\DeltaPstI-kanR)). Las construcciones incluían
aquellas para expresar variantes A3, E2 y F1, y variantes de
combinación HRG58 (D4+E2+M50I) y HRG73 (B3+D4+E2+I2), así como la
construcción que expresaba HRG-\beta1 EGF de tipo
salvaje (HRG8).
La expresión a niveles de aproximadamente 1 mg/l
se consiguió de la siguiente manera. Los cultivos celulares se
cultivaron a una densidad de DO_{550} = 1,0 en medio LB que
contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y se usaron para inocular
medio AP5 modificado a una dilución 1/100. (El medio AP5 modificado
contenía: 1,5 g/l de glucosa, 11 g/l de Hycase SF, 0,6 g/l de
extracto de levadura, 0,19 g/l de MgSO_{4} anhidro o 0,394 g/l de
MgSO_{4}*7H_{2}O, 1,07 g/l de cloruro de amonio, 3,73 g/l de
KCl, 1,2 g/l de NaCl, 120 ml/l de trietanolamina 1 M [pH 7,4]).
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje
y variantes del mismo se purificaron a homogeneidad a partir de
productos resultantes de choques periplásmicos en una única etapa
de HPLC de fase inversa. En resumen, Las células se recogieron
después de 24 h de cultivo a 30ºC (DO_{550} = 1,2) mediante
centrifugado a 4500 rpm, y los sedimentos se congelaron en
etanol/hielo seco durante 2 h. Después de la resuspensión y
descongelación en MgCl_{2} 5 mM, CaCl_{2} 75 mM fenil metil
sulfonil fluoruro 1 mM, y Tris-HCl 10 mM (pH 7,6),
las células sometidas a choque se retiraron mediante centrifugado,
dejando los productos resultantes del choque. Los productos
resultantes del choque se filtraron y se cromatografiaron mediante
HPLC de fase inversa C18 semipreparativa usando un gradiente del
0-40% de acetonitrilo durante 80 min, con un caudal
de 3 ml/min. Las fracciones que mostraron mediante espectrometría
de masas por electropulverización contener
HRG-\beta1 EGF (o variantes del mismo) se
liofilizaron y se resuspendieron en EDTA 1 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 7,6). Se descubrió que las
proteínas eran esencialmente homogéneas según lo determinado
mediante análisis de aminoácidos y SDS-PAGE.
Las afinidades de las variantes solubles por
ErbB-Ig se determinaron midiendo la inhibición de la
unión de ^{125}I-HRG a las fusiones de receptor
ErbB-2/3, -3 y -4-Ig, como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Aunque la preparación de
ErbB-2/3-Ig también contiene
homodímeros ErbB-2/2 y 3/3 (como resultado de la
co-expresión de ErbB-2- y
-3-Ig), el desplazamiento de ^{125}IHRG debe ser
predominantemente a partir de
ErbB-2/3-Ig debido a la
aproximadamente 100 veces mayor afinidad del
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje por el
heterodímero 2/3 frente al homodímero 3/3.
Los resultados se muestran en la Tabla 14.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes mostraban mayor afinidad por
ErbB-3-Ig que
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje (hasta 4 veces),
aunque los aumentos de afinidad eran menos dramáticos que los
determinados mediante ELISA de fagos. El análisis en este formato
también mostró que las mutaciones E2 otorgan afinidad enormemente
aumentada, y que las mutaciones adicionales D4 y Met50Ile (en la
construcción HRG58) no contribuyen de forma aditiva. Como se observó
en las ELISA de fagos, las variantes mostraron aumentos de afinidad
por ErbB-4-Ig que eran similares a
los aumentos de afinidad por
ErbB-3-Ig. Las afinidades de las
variantes por ErbB-2/3-Ig eran
similares a la afinidad de HRG-\beta1 EGF de tipo
salvaje por el heterodímero 2/3, aunque la construcción sustituida
al máximo (HRG72) se unía de forma 6 veces más débil a
ErbB-2/3-Ig que el
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje.
También se ensayo la capacidad de las variantes
solubles para estimular la fosforilación de tirosina del receptor
ErbB-2 en células de carcinoma de cáncer de mama
MCF7. Esto se consiguió en un formato KIRA-ELISA
como se describe en Sadick et al., Analyt. Biochem. 235:
207-214, en el que se cree que la fosforilación de
ErbB-2 detectada se debe principalmente a la
formación de heterodímeros ErbB-2/3.
En resumen, se añadieron células 2 x 10^{5}
MCF-7 a cada pocillo de una placa de cultivo de 96
pocillos de fondo plano y se cultivaron durante una noche. A la
mañana siguiente el medio de cultivo se sustituyó por medio que
contenía una variante o HRG8 (de tipo salvaje) a concentraciones que
varían entre 0 y 10 nM. Las células se estimularon a 37ºC durante
30 min, el medio de cultivo se decantó. Para lisar las células y
disolver los receptores, se añadieron 100 \mul de tampón de lisis
a cada pocillo. El tampón de lisis consistía en NaCl 150 mM, HEPES
50 mM, Triton-X100 al 0,5%, timerosol al 0,01%, 30
kIU/ml de aprotinina (ICN Biochemicals, Aurora, OH), clorhidrato de
4-(2-aminoetil)bencenosulfonil fluoruro 1 mM
(AEBSF; ICN Biochemicals), y ortovanadato sódico 2 mM. La placa se
agitó a continuación suavemente en un agitador de placas (Bellco
Instruments, Vineland, NJ) durante 60 min a temperatura
ambiente.
Mientras las células se estaban solubilizando,
una placa de microvaloración de ELISA (Nunc Maxisorp^{TM}, Inter
Med, Dinamarca) que se había recubierto durante una noche a 4ºC con
el anticuerpo policlonal anti-ErbB-2
ECD purificado por afinidad (1,0 \mug/ml en tampón carbonato 50
mM (pH 9,6) se decantó, y se bloqueó con tampón de bloqueo (PBS,
BSA al 0,5% [Intergen Co., Purchase, NY], timerosol al 0,01%)
durante 60 min a temperatura ambiente con agitación suave. Después
de 60 min, la placa recubierta con el anticuerpo
anti-ErbB-2 ECD se lavó seis veces
con tampón de lavado (PBS, Tween 20^{TM} al 0,05%, timerosol al
0,01%) usando un lavador de placas automatizado (ScanWasher 300,
Skatron Instruments, Inc., Sterling, VA).
El lisado que contenía ErbB-2
solubilizado de cada pocillo de microvaloración de cultivo celular
se transfirió a cada pocillo de ELISA recubierto con anticuerpo
anti-ErbB2 ECD y bloqueado y se incubaron durante 2
h a temperatura ambiente con agitación suave. El receptor no unido
se eliminó lavando con tampón de lavado, y se añadieron 100 \mul
de 4G10 biotinilado (anticuerpo antifosfotirosina) diluido a 0,2
\mug/ml en tampón de dilución (PBS, BSA al 0,5%, Tween 20^{TM}
al 0,05%, EDTA 5 mM, timerosol al 0,01%) a cada pocillo. Después de
la incubación durante 2 h a temperatura ambiente, se lavó la placa,
y se añadieron 100 \mul de estreptavidina conjugada a peroxidasa
de rábano picante (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA),
diluida a 1:50000 en tampón de dilución a cada pocillo. La placa se
incubó durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave.
El conjugado de avidina libre se eliminó lavando, y se añadieron 100
\mul de solución de sustrato recién preparada (tetrametil
benzidina, TMB, kit de sustrato de dos componentes, Kirkegard y
Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo. Se dejó continuar a la
reacción durante 10 min, después de lo cual el desarrollo de color
se interrumpió mediante la adición de H_{3}PO_{4}
1,0 M.
1,0 M.
Los resultados se muestran en la Tabla 14. La
CE_{50} es la concentración de variante (o HRG8) necesaria para
alcanzar el 50% de la fosforilación máxima de tirosina. En general,
las CE_{50} para la estimulación de la fosforilación mediante las
variantes ensayadas no diferían sustancialmente de la CE_{50} para
HRG-\beta1 EGF de tipo salvaje. Además, los
valores se correlacionaban bien con las CI_{50} para la unión a
las fusiones de receptor anteriores.
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Ejemplo
4
Este ejemplo describe la selección de variantes
de HRG-\beta1 para la unión al receptor
ErbB-4 y, en particular, variantes que tienen una
mayor especificidad por el receptor ErbB-4, con
respecto al receptor ErbB-3, que la
HRG-\beta1 de tipo salvaje. Dichas variantes
tienen, por ejemplo, una proporción más baja de CE_{50} de la
variante:del tipo salvaje para la unión a
ErbB-4-Ig que para la unión a
ErbB-3-Ig. Las variantes estudiadas
contenían restos correspondientes a HRG-\beta1
177-244, que incluye el dominio similar a EGF
mínimo (HRG-\beta1 177-228). En
este ejemplo, "HRG-\beta1 EGF" se refiere a
la región del dominio similar a EGF que se extiende desde los
restos 177-244. Los números de los restos se
expresan en términos de posición en HRG-\beta1
humana nativa de 645 aminoácidos y, entre paréntesis, en términos de
posición en HRG-\beta1 EGF (es decir,
HRG-\beta1 EGF 1-68).
Las variantes se produjeron mediante
aleatorización en His178, Leu179 y Arg207 (His2, Leu3 y Arg31).
Estos restos se seleccionaron porque el barrido de alanina (Ejemplo
2) indicaba que la sustitución de alanina en estas posiciones daba
como resultado una pérdida significativamente mayor de afinidad por
el receptor ErbB-3, en comparación con el receptor
ErbB-4, lo que sugería que estos restos pueden ser
más importantes para la unión al receptor ErbB-3
que para la unión al receptor ErbB-4.
Adicionalmente, se predijo que estos restos están próximos entre sí
en la superficie de la molécula de HRG-\beta1,
formando potencialmente un punto de unión.
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Se prepararon y seleccionaron variantes de
HRG-\beta1 EGF para la unión a
ErbB-4-Ig usando presentación en
fagos monovalente, según el método de Bass et al., Proteins
8: 309-14 (1990). En resumen, el vector fagémido de
HRG-\beta1 EGF era pHRG2-p3
(descrito en el Ejemplo 1), en el que HRG-\beta1
177-244 se fusionó a un fragmento
C-terminal de la proteína de la envuelta pIII de
M13. Se realizó mutagénesis de Kunkel para introducir codones de
terminación en este vector en His178, Leu179 y Arg207 (His2, Leu3 y
Arg31) para asegurarse de que el vector de partida no podía
expresar el polipéptido de tipo salvaje.
A continuación estos sitios se aleatorizaron
mediante mutagénesis de Kunkel para producir una biblioteca de
HRG-\beta1 EGF. Se produjeron
HRG-\beta1 EGF mutados de forma monovalente
mediante presentación en fagos a partir de la biblioteca. Véase
Bass et al., supra. Estos fagos se clasificaron a
continuación contra homodímeros
ErbB-4-Ig inmovilizados en una placa
de ELISA. Los fagos unidos se eluyeron y se usaron para reinfectar
células huésped, que se usaron para producir nuevos fagos. La mitad
de los fagos de la primera ronda de clasificación se clasificaron
contra ErbB-4-Ig inmovilizado
durante tres rondas adicionales de clasificación. La otra mitad de
los fagos de la primera ronda se clasificó contra
ErbB-4-Ig inmovilizado durante tres
rondas adicionales en presencia de
ErbB-3-Ig soluble (10 nM). Se
esperaba que la clasificación de la presencia de
ErbB-3-Ig soluble (es decir,
"contra-selección" contra
ErbB-3-Ig) eliminara variantes con
mayor afinidad por ErbB-3-Ig,
permitiendo el enriquecimiento de aquellas con mayor afinidad por
ErbB-4-Ig en cada ronda de
clasificación. Después de la clasificación, se secuenciaron doce
clones de cada una de las dos bibliotecas resultantes.
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La biblioteca de fagos inicial se construyó
mediante mutagénesis de Kunkel usando una plantilla de ADN de
cadena sencilla que contenía uracilo. Se instalaron codones de
terminación TAA y TGA en posiciones seleccionadas por
aleatorización para generar una plantilla a medida, que eliminaba el
fondo de tipo salvaje de las reservas. Las posiciones se
aleatorizaron completamente mediante mutación a codones NNS (donde N
es cualquiera de las cuatro bases y S es G o C). Se usaron dos
oligonucleótidos de mutagénesis, uno para aleatorizar His178 y
Leu179 (His2 y Leu3) y uno para aleatorizar Arg207 (Arg31). Los
oligonucleótidos contenían salientes de 15 bases en cualquier lado
de los restos aleatorizados.
La mezcla de reacción de mutagénesis final se
electro-transformó en células XL-1
Blue (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), según el protocolo del
fabricante. Las células transformadas se infectaron a continuación
con 10^{11} pfu de fago ayudante M13K07 (Promega Corp., Madison,
WI), y se prepararon soluciones madre de fagos (aproximadamente
10^{14} fagémidos/ml) como se describe en el Ejemplo 1.
Se obtuvieron al menos 10^{8} transformantes,
lo que indicaba que la biblioteca tenía una excelente
representación de las posibles combinaciones de secuencia de
aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon fagos monovalentes y la selección
se realizó en ErbB-4-Ig unido
previamente a placas de microvaloración mediante captura con
anticuerpos policlonales para el fragmento Fc humano, como se
describe en el Ejemplo 1. Aproximadamente 10^{12} fagos en 100
\mul de tampón de unión (PBS, BSA al 0,1%, Tween 20^{TM} al
0,05%) se aplicaron a una placa recubierta con
ErbB-4-Ig y una placa de control a
la que no se había añadido
ErbB-4-Ig. Después de la primera
ronda de clasificación, la mitad de los fagos resultantes (en lo
sucesivo en este documento la "biblioteca contraseleccionada")
se clasificaron en presencia de
ErbB-3-Ig 10 mM en el tampón de
unión. Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente, las
placas se lavaron exhaustivamente (12x) y los fagos se eluyeron
añadiendo 100 \mul de una solución de HCl 50 mM y Tween^{TM} 20
al 0,05% y agitando durante 10 min.
Los eluatos se neutralizaron con 10 \mul de
Tris-HCl 1 M (pH 8,0) y 20 \mul se usaron para
valoración cuantitativa en células XL-1 Blue en
fase logarítmica. El resto se usó para infectar 1 ml de células
XL-1 Blue en fase logarítmica (30 min a 37ºC), que
a continuación se superinfectaron con 2 x 10^{10} pfu de fago
M13KO7 y se cultivaron en 25 ml de caldo 2YT (16 g/l de triptona, 10
g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl) que contenía 50
\mug/ml de carbenicilina durante 18-24 h. Los
fagos se recogieron como se ha descrito anteriormente y el ciclo se
repitió.
Después de la ronda cuatro de selección, doce
clones de cada biblioteca se tomaron aleatoriamente y se
secuenciaron mediante el método didesoxi. Véase Sanger et
al., PNAS USA 74: 5463-67 (1977). Los
aminoácidos en las posiciones aleatorizadas deducidos de las
secuencias de ADN se muestran en la Tabla 15 (un "." indica un
resto que es idéntico al resto de tipo salvaje).
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Una variante predominaba en cada biblioteca,
estando representada en siete de los doce clones secuenciados a
partir de cada biblioteca. La variante predominante de la biblioteca
contra-seleccionada contra
ErbB-3-Ig volvía a clasificar para
el resto de tipo salvaje en las posiciones His178 y Leu179 (His2 y
Leu3) y tenía Pro en Arg207 (Arg31). La variante predominante de la
biblioteca que se clasificó sin contra-selección
clasificaba para tipo salvaje en las posiciones His178 y Arg207
(His2 y Arg31) y tenía Met en Leu179 (Leu3). En variantes de cada
una de las bibliotecas, había una sustitución espontánea de Met por
HRG-\beta1 228-231
(HRG-\beta1 EGF 52-55).
Las afinidades de unión al receptor se midieron
mediante ELISA de fagos para todas las variantes únicas de cada
biblioteca, como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se
muestran en la Tabla 15. Las afinidades de las variantes por
ErbB-3-Ig y
ErbB-4-Ig se determinaron para
evaluar la especificidad.
Las afinidades de la mayoría de las variantes
por las fusiones del receptor ErbB-Ig se reducían
entre aproximadamente 1,2 veces y 2,2 veces. Solamente una variante
mostraba un ligero aumento de afinidad, y solamente por
ErbB-3-Ig. Sin embargo, tres
variantes tenían afinidades por
ErbB-4-Ig que estaban menos de dos
veces por debajo de la afinidad de HRG-\beta1 de
tipo salvaje, mientras que sus afinidades por
ErbB-3-Ig estaban de 6 a 9 veces
por debajo de la afinidad de HRG-\beta1 de tipo
salvaje. Todas estas variantes volvían a clasificar para el resto
de tipo salvaje en Leu179 (Leu3). Una variante clasificaba para Glu
en His178 (His2) y para tipo salvaje en Arg207 (Arg31). Otra
variante clasificaba para tipo salvaje en His178 (His2) y para Pro
en Arg 207 (Arg31). Ésta era la variante predominante en la
biblioteca contraseleccionada.
La tercera variante clasificaba para Leu en
His178 (His2) y para tipo salvaje en Arg207 (Arg31) y también tenía
la sustitución espontánea de Met por HRG-\beta1
228-231 (HRG-\beta1 EGF
52-55). La afinidad de esta variante por
ErbB-3-Ig se reducía 6,4 veces,
mientras que otra variante con la misma secuencia en His178, Leu179
y Arg207 (His2, Leu3 y Arg31), pero que carecía de la sustitución
espontánea, conservaba aproximadamente la afinidad de tipo salvaje
por ErbB-3-Ig. Por lo tanto, la
reducción de afinidad por la unión a
ErbB-3-Ig es atribuible en gran
medida a esta sustitución espontánea. Puesto que es improbable que
HRG-\beta1 228-231
(HRG-\beta1 EGF 52-55) esté en
posición proximal respecto a la región aleatorizada en la superficie
de la molécula de HRG-\beta1, los datos sugieren
que al menos dos regiones distintas de HRG-\beta1
son importantes para la unión al receptor ErbB, concretamente
restos His178, Leu179 y Arg207 (His2, Leu3, y Arg31) y
HRG-\beta1 228-231
(HRG-\beta1 EGF 52-55).
Dos de las tres variantes que muestran una
especificidad aumentada por la unión a
ErbB-4-Ig representaban ocho de los
doce clones aislados de la biblioteca
contra-seleccionada. La otra variante representaba
solamente uno de los doce clones aislados de la biblioteca que se
clasificó sin contra-selección. Por lo tanto, la
contra-selección contra
ErbB-3-Ig produjo un enriquecimiento
significativo en variantes que mostraban una mayor especificidad
por ErbB-4-Ig, con respecto a
ErbB-3-Ig, que la de
HRG-\beta1 de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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1978, vol. 75, 1929-33 [0110]
\bulletGRAHAM et al.
Virology, 1978, vol. 52, 546 [0110]
\bulletGORMAN et al. DNA and
Protein Eng. Tech., 1990, vol. 2, 3-10
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\bullet Mammalian Cell Culture. Plenum
Press, 1984 [0113]
\bulletBARNES; SATO. Cell,
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\bullet Mammalian Cell Biotechnology: a
Practical Approach. IRL Press, 1991 [0114]
\bulletPARK et al. Proc. Am.
Assoc. Cancer Res., 1993, vol. 34, 521 [0131]
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences.
1980 [0132]
\bulletEPSTEIN et al. PNAS
USA, 1985, vol. 82, 3688-92 [0137]
\bulletHWANG et al. PNAS
USA, 1980, vol. 77, 4030-34 [0137]
\bullet Chemotherapy Service. Williams &
Wilkins, 1992 [0141]
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Research, 1994, vol. 54, 2771-77
[0148]
\bulletMUSS et al. New Eng.
J. Med., 1994, vol. 330, 1260-66
[0152]
\bulletLOWMAN et al.
Biochemistry, 1991, vol. 30, 10832-38
[0159]
\bulletCUNNINGHAM et al.
EMBO J., 1994, vol. 13, 2508-15
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Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press,
1989, vol. 429 [0162]
\bulletKUNKEL et al. Methods
Enzymol., 1987, vol. 154, 367-82 [0163]
[0174]
\bulletGORMAN et al. DNA
Prot. Eng. Tech., 1990, vol. 2, 2-10
[0176]
\bulletSANGER et al. PNAS
USA, 1977, vol. 74, 5463-67 [0192]
[0229]
\bulletSADICK et al. Analyt.
Biochem., vol. 235, 207-214 [0215]
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Ballinger, Marcus D.
\hskip3.9cmJones, Jennifer T.
\hskip3.9cmFairbrother, Wayne J.
\hskip3.9cmSliwkowski, Mark X.
\hskip3.9cmWells, James A.
\hskip3.9cmGenentech, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VARIANTES DE HERREGULINA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 92
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Skjerven, Morrill, MacPherson, et al.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 25 Metro Drive, Suite 700
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Jose
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 95110
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: Pendiente
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-FEB-1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/799.054
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-FEB-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Haliday, Emily M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 38,903
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: M-4761-1P PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (408) 453-9200
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (408) 453-7979
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rattus rattus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rattus rattus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rattus rattus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rattus rattus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Rattus rattus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Gallus domesticus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52.
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: No relevante (recombinante)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 92:
Claims (17)
1. Variante de
herregulina-\beta1 humana, teniendo dicha variante
una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza y
la capacidad de unirse a un receptor ErbB con al menos un aumento de
5 veces en la afinidad por el receptor ErbB-3 con
respecto a la herregulina de la que se obtiene la variante, donde
dicha variante de herregulina comprende un conjunto de sustituciones
de aminoácidos seleccionadas entre
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G,
M226I;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T138G,
M226I;
F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M226I;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R,
K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, N223H, M226I; y
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H,
M226I;
donde los restos se numeran desde el extremo N
de herregulina-\beta1 humana nativa de 645
aminoácidos.
2. Variantes de herregulina según la
reivindicación 1, donde dicha variante de herregulina comprende un
conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G,
M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
N223H, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185F, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, M2261;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G,
R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, N223H, M226I; y
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H,
M226I;
donde la variante tiene al menos un aumento de
20 veces en la afinidad por el receptor ErbB-3 con
respecto a la herregulina de la que se obtiene la variante.
3. Variante de herregulina según la
reivindicación 1, donde dicha variante de herregulina comprende un
conjunto de sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L,
L209M, N223H, M2261; y
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R,
D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H,
M226I;
donde la variante tiene al menos un aumento de
50 veces en la afinidad por el receptor ErbB-3 con
respecto a la herregulina de la que se obtiene la variante.
4. Variante de herregulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha variante de herregulina es
un fragmento.
5. Variante de herregulina según la
reivindicación 4, donde dicho fragmento comprende restos
correspondientes a una parte de
herregulina-\beta1 humana que se extiende desde
aproximadamente el resto 175 hasta aproximadamente el resto
230.
6. Molécula de ácido nucleico que codifica la
variante de herregulina según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
7. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 6.
8. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 7.
9. Método de producción de una variante de una
herregulina que comprende:
(a) cultivar la célula huésped según la
reivindicación 8 en condiciones que permiten la expresión de la
variante de herregulina; y
(b) recuperar la variante de herregulina del
cultivo.
10. Composición que comprende la variante de
herregulina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un
portador farmacéuticamente aceptable.
11. Método de unión a un receptor ErbB que
comprende poner en contacto la variante de herregulina según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con una célula que expresa
dicho receptor ErbB, donde dicha célula está en cultivo
celular.
12. Método según la reivindicación 11, donde
dicha unión aumenta la supervivencia, proliferación o diferenciación
de dicha célula.
13. Método según la reivindicación 12, donde
dicha célula se selecciona entre una célula glial, una célula de
Schwann y una célula muscular.
14. Variante de herregulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de heridas
dérmicas, enfermedad gastrointestinal, síndrome esofágico de
Barrett, enfermedad renal quística o no quística en fase terminal o
enfermedad intestinal inflamatoria.
15. Uso de una variante de herregulina según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la fabricación de un
medicamento para uso en el tratamiento de heridas dérmicas,
enfermedad gastrointestinal, síndrome esofágico de Barrett,
enfermedad renal quística o no quística en fase terminal o
enfermedad intestinal inflamatoria.
16. Método para determinar si una muestra
contiene un receptor ErbB que se une a herregulina que
comprende:
(a) poner en contacto la variante de herregulina
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con dicha muestra;
y
(b) determinar si dicha variante de herregulina
se une específicamente a un componente de dicha muestra.
17. Método, variante o uso según cualquiera de
las reivindicaciones 11 a 16, donde dicha variante de herregulina
está purificada.
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