CN103124904B - 食蟹猴ccl17 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了编码食蟹猴CCLl7(CynoCCLl7)的分离的多核苷酸、可从这些多核苷酸的表达得到的多肽、重组细胞和使用方法。
Description
技术领域
本发明涉及食蟹猴(Macaca fascicularis,cynomolgus)CCL17和它的用途。
背景技术
CCL17(胸腺和活化调节的趋化因子,TARC)是CCR4的趋化因子配体。CCL17在胸腺中组成性地表达,且在活化以后从许多细胞来源产生,所述细胞来源包括PBMC、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞和支气管细胞(Imai等人,J Biol Chem,271:21514-21,1996;Sallusto等人,Eur J Immunol,29:1617-25,1999;Campbell等人,Nature,400:776-80,1999;Sekiya等人,J Immunol,165:2205-13,2000)。
CCL17会诱导表达CCR4的细胞(主要是Th2和皮肤T淋巴细胞)的趋化性,并因此涉入Th2免疫应答的维持(Imai等人,Int Immunol,11:81-8,1999)以及经典活化的巨噬细胞的抑制(Katakura等人,J Immunol,172:1407-13,2004)。已经证实,CCL17的中和会减少Th2细胞因子、气道嗜酸性粒细胞增多症和变应原诱发的哮喘的高反应性(Kawasaki等人,JImmunol,166:2055-62,2001),并保护免于肺纤维化(Belperio等人,JImmunol,173:4692-8,2004)。CCL17表达水平与慢性变应性病理学中的疾病表型相关,所述疾病表型包括哮喘(Leung等人,Eur Respir J,21:616-20,2003)、特应性皮炎(Jahnz-Rozyk等人,Allergy60:685-8,2005)和皮肤红斑狼疮(Wenzel等人,J Invest Dermatol,124:1241-8,2005)。因而,CCL17信号传递的调节剂(诸如中和性的抗-CCL17抗体)可以对炎症性病症、变应性病症和纤维化病症具有治疗益处。
在将用于人类的任何CCL17调节剂投放市场之前,将需要预测性药代动力学研究、安全性研究和效力研究。这样的研究将包括在CCL17-相关的病理学的动物模型中的体外和体内试验。调节剂与人CCL17直系同源物的交叉反应性的缺乏,可以在这些研究中造成挑战。因而,基于抗体的CCL17调节剂的应用,可能需要:评价所述抗体在物种之间的交叉反应性、制备针对特定模型动物表达的CCL17多肽的替代抗体、以及显著地体外表征这类替代抗体。交叉反应性的评价、替代物的制备和体外表征将需要使用得自适当动物模型的CCL17多核苷酸和多肽。
因而,需要鉴别编码CCL17的多核苷酸和CCL17多肽,其在被鉴别为适用于CCL17调节剂的预测性药代动力学研究、安全性研究和效力研究的动物模型中表达。也需要相关的方法,诸如表达这类多肽的方法和试验CCL17调节剂的交叉反应性的方法。
附图说明
图1.食蟹猴CCL17(cynoCCL17)(SEQ ID NO:1)相对于人CCL17(SEQ ID NO:5)的蛋白序列比对。根据cynoCCL17序列进行编号。假定的信号序列标有下划线。
图2.CynoCCL17-诱导的、CCRF-CEM细胞的钙流量。
发明内容
本发明的一个方面是一种分离的多核苷酸,其编码包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的另一个方面是一种分离的多核苷酸,其编码具有SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的另一个方面是一种载体,其包含本发明的分离的多核苷酸。
本发明的另一个方面是一种宿主细胞,其包含本发明的载体。
本发明的另一个方面是一种分离的多肽,其包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的多肽。
本发明的另一个方面是一种分离的多肽,其具有SEQ ID NO:3中所示的序列。
本发明的另一个方面是一种表达多肽的方法,所述方法包括下述步骤:提供本发明的宿主细胞;以及在足以表达至少一种本发明的多肽的条件下培养所述宿主细胞。
本发明的另一个方面是一种分离的抗体,其特异性地结合本发明的多肽。
本发明的另一个方面是一种确定人CCL17调节剂与食蟹猴CCL17的交叉反应性的方法,所述方法包括:提供CCL17调节剂和本发明的食蟹猴CCL17分离的多肽;使所述CCL17调节剂与所述食蟹猴CCL17分离的多肽接触;以及确定所述CCL17调节剂是否结合所述食蟹猴CCL17分离的多肽。
本发明的另一个方面是一种确定人CCL17调节剂与食蟹猴CCL17的交叉反应性的方法,所述方法包括:提供CCL17调节剂和本发明的食蟹猴CCL17分离的多肽;提供表达CCR4的细胞;使所述表达CCR4的细胞与所述CCL17调节剂和所述食蟹猴CCL17多肽接触;以及确定所述CCL17调节剂对CCL17生物活性的影响,其中CCL17生物活性的调节表明,所述CCL17治疗剂与所述食蟹猴CCL17交叉反应。
本发明的另一个方面是一种评估CCL17调节剂的安全性的方法,所述方法包括:提供CCL17调节剂、第一食蟹猴和第二食蟹猴;将所述CCL17调节剂施用给所述第一食蟹猴;以及确定所述第一食蟹猴相对于所述第二猴是否呈现有害症状,如果所述第一食蟹猴呈现有害症状,则表明所述CCL17调节剂用于人类可能是不安全的,并且如果所述第一食蟹猴没有呈现有害症状,则表明所述CCL17治疗剂用于人类可能是安全的。
具体实施方式
本说明书中所引用的所有出版物(包括但不限于:专利和专利申请)均以引用方式并入本文,如同在本文中完整给出。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。本文描述了示例性的组合物和方法,不过类似或等同于本文所述的组合物和方法的任何组合物和方法都可用于本发明实践或测试。
术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其它等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型例子。
术语“互补序列”是指反向平行于第一分离的多核苷酸序列并包含与第一多核苷酸序列中的核苷酸互补的核苷酸的第二分离的多核苷酸序列。
术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件,其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的例子可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。
术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。
术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
术语“抗体”包括整个抗体及其任何片段。抗体片段包含免疫球蛋白分子的至少一部分,诸如得自抗体重链或轻链的互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区或构架区。抗体可以是Fab、F(ab)、F(ab)2、scFv、dsFv或双体。抗体可以是嵌合抗体、人源化或人源性抗体、二聚抗体、四聚抗体或多聚抗体。上述抗体片段的结构、制备技术、以及所述抗体及其片段的用途本领域众所周知的(Ausubel等人编,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley & Sons,Inc.,NY1987-2001;Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,NY,1989;Harlow和Lane,Antibodies,a Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,NY,1989;Colligan等人编,Current Protocols in Immunology,JohnWiley & Sons,Inc.,NY1994-2001;Colligan等人,Current Protocols inProtein Science,John Wiley & Sons,NY,NY,1997-2001;Kohler等人,Nature,256:495-497,1975;Queen等人,Proc Natl Acad Sci,86:10029-33,1989;美国专利号4,816,567)。例如,可以从表达人免疫球蛋白的转基因小鼠或从噬菌体展示文库制备全人单克隆抗体(Lonberg等人,Nature,368:856-9,1994;Fishwild等人,Nature Biotech,14:845-51,1996;Mendez等人,Nature Genetics,15:146-56,1997;Knappik等人,JMol Biol,296:57-86,2000;Krebs等人,J Immunol Meth,265:67-84,2001)。
术语“有害症状”是指动物所呈现的表明已经发生对该动物的伤害的任何症状。
术语“调节剂”是指这样的分子或制剂:其被认为至少部分地通过活化或抑制CCL17生物活性而在人类或其它动物中提供治疗益处。CCL17治疗剂的例子包括抗-CCL17抗体、抗体片段、肽、多肽、寡核苷酸、低分子量化学化合物等。已知的CCL17调节剂是例如在美国专利号7,585,968中公开的siRNA分子或在(Morita等人,Clinica Chimica Acta,322:67-75,2002)中公开的单克隆抗体。
“调节CCL17生物活性”是指,部分地或完全地抑制、活化或增强CCL17生物活性。
本文使用的“CCL17生物活性”表示,作为CCL17与它的受体CCR4的结合的结果而在细胞内发生的任何活性。一种示例性的CCL17生物活性会导致在受体结合以后的细胞内钙流量的诱导,所述钙流量可以使用常规方法用钙敏感的染料(诸如Fluo-8)进行测量(Imai等人,J Biol Chem,272:15036-42,1997)。还可以使用确定的方法(Imai等人,J Biol Chem,272:15036-42,1997),通过测量例如响应于CCL17的T淋巴细胞迁移来监测CCL17生物活性。可以使用的适当细胞系是内源性地或重组地表达CCR4的任何细胞系,诸如CCRF-CEM、Jurkat或Hut78。
本发明提供了分离的食蟹猴(食蟹猴)CCL17(cynoCCL17)多核苷酸、包含这些多核苷酸的载体、分离的宿主细胞、可从这些多核苷酸的表达得到的多肽、用于表达本发明的多肽的方法、和使用本发明的多核苷酸和多肽的方法。
本发明的多核苷酸和载体可以用于表达cynoCCL17多肽。CynoCCL17多肽可以用于制备治疗性抗体,后者用于抑制cynoCCL17或得自其它物种的CCL17的活性。CynoCCL17多肽还可以用于体外或体内测定中,以鉴别其它治疗剂,诸如能够调节cynoCCL17或得自其它物种的CCL17的活性的小分子或肽。公开的其它方法可用于评估CCL17治疗剂的安全性和在动物物种之间的交叉反应性。本发明的全长cynoCCL17多肽序列(SEQ ID NO:1)与人CCL17多肽(SEQ ID NO:5)具有84%同一性和89%相似性,这允许进行CCL17治疗剂的预测性药代动力学研究、安全性研究和效力研究以及其它用途。
本发明的一个方面是一种分离的多核苷酸,其包含具有SEQ ID NO:2、4或13中所示的序列或其互补序列的多核苷酸。SEQ ID NO:2中所示的多核苷酸序列编码包含全长cynoCCL17的多肽。SEQ ID NO:4中所示的多核苷酸序列编码包含成熟的cynoCCL17的多肽。SEQ ID NO:13中所示的多核苷酸序列编码成熟的cynoCCL17,且为了在大肠杆菌中进行蛋白表达而经过密码子优化。
本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产,并装配成完整的单链或双链分子。可替换地,本发明的多核苷酸可以通过其它技术来生产,诸如PCR之后进行常规克隆。生产或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。
本发明的多核苷酸也可以包含至少一个非编码序列,诸如核糖体结合位点、mRNA稳定化序列、内含子和多腺苷酸化信号。多核苷酸序列还可以包含编码附加氨基酸的附加序列。这些附加多核苷酸序列可以例如编码标志物或标签序列,诸如六组氨酸、HA标签,以便利所述蛋白质的纯化或检测。
本发明的另一个实施例是一种包含分离的多核苷酸的载体,所述多核苷酸具有SEQ ID NO:2、4或13中所示的序列。本发明的载体可用于保持多核苷酸、复制多核苷酸或驱使由本发明载体编码的多肽在生物系统(包括再造生物系统)中的表达。载体可以为染色体载体、附加型载体和病毒衍生载体,例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、杆状病毒、乳多空病毒(例如SV40)、牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒、小核糖核酸病毒和逆转录酶病毒的载体,以及衍生自其组合的载体,例如粘粒和噬菌粒。
可以用佐剂、脂质、缓冲剂或其它适用于具体应用的赋形剂将本发明的载体配制在微粒中。
在本发明的一个实例中,载体是表达载体。表达载体通常包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其它位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。适用于所编码多肽的表达的核酸序列元件和亲本载体序列也是熟知的。可用于本发明的多肽的表达的示例性的衍生自质粒的表达载体包括大肠杆菌(大肠杆菌)复制起点、aph(3’)-1a卡那霉素抗性基因、具有内含子A的HCMV立即早期启动子、合成的多聚腺苷酸序列和牛生长激素终止子。另一个示例性的衍生自质粒的表达载体包括大肠杆菌复制起点、ant(4’)-1a卡那霉素抗性基因、劳氏肉瘤病毒长末端重复序列、HCMV立即早期启动子和SV40晚期多聚腺苷酸序列。
本发明的另一个实例是包含本发明载体的分离的宿主细胞。代表性宿主细胞例子包括古细菌细胞;细菌细胞,例如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、肠球菌(Enterococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus);真菌细胞,例如克鲁维酵母(Kluveromyces)、酿酒酵母(Saccharomyces)、担子菌(Basidomycete)、白假丝酵母(Candida albicans)或曲霉菌(Aspergillus);昆虫细胞,例如果蝇(Drosophila S2)和甜菜夜蛾(Spodoptera Sf9);动物细胞,例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1、Bowes黑色素瘤和骨髓瘤;以及植物细胞,例如裸子植物或被子植物细胞。本发明方法中的宿主细胞可以单个细胞或细胞群体的形式提供。细胞群体可以包括分离的或培养的细胞群体或存在于基质(例如组织)中的细胞群体。
使用众所周知的方法,可以将诸如载体等多核苷酸引入宿主细胞中(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001)。这样的示例性的方法是磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔和感染。
本发明的另一个方面是包含具有SEQ ID NO:1中所示序列的多肽的分离多肽。SEQ ID NO:1是包含全长cynoCCL17蛋白的多肽。
本发明的另一个方面是一种分离的多肽,其具有SEQ ID NO:3中所示的序列。SEQ ID NO:3是包含成熟的cynoCCL17蛋白的多肽。
本发明的多肽可以通过化学合成产生,例如在自动化肽合成仪上进行的固相肽合成。作为另外一种选择,本发明的多肽可以通过使用无细胞表达系统从编码这些多肽的多核苷酸获得,无细胞表达系统的例子有:基于网织红细胞裂解物的表达系统、基于麦胚提取物的表达系统以及基于大肠杆菌提取物的表达系统。也可以使用众所周知的技术通过重组方法得到本发明的多肽。
本发明的多肽可包含融合多肽,其具有与第二多肽融合的本发明的多肽。这样的第二多肽可以是前导序列或分泌信号序列、天然存在的前蛋白或前蛋白原序列、或部分地或完全地合成的序列。通过将具有SEQ ID NO:1或3所示的氨基酸序列的cynoCCL17多肽与从免疫球蛋白恒定结构域衍生出的一个或多个结构域(诸如CH1、CH2和CH3结构域)或Fc结构域缀合,可以形成示例性的融合蛋白。这样的构建体是本领域众所周知的,参见例如:美国专利号5116964、美国专利号5709859、PCT公开号WO04/002417;和PCT公开号WO05/081687。
为了诸如增强稳定性、溶解度、受体结合等目的,可以修饰本发明的多肽或片段的结构。例如,可以生产修饰的多肽,其中氨基酸序列已经通过例如氨基酸置换、缺失或添加而改变。考虑亮氨酸由异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸由谷氨酸、苏氨酸由丝氨酸的分开置换,或氨基酸由结构上相关的氨基酸的相似置换(即保守突变),在一些情况下但并非所有情况下对所得到的分子的生物学活性不具有主要作用。保守置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。遗传编码的氨基酸可以分成4个家族:(1)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸);(2)碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸);(3)非极性的(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸);和(4)不带电荷的、极性的(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳族氨基酸。可替换地,氨基酸所有组成成分可以分组为:(1)酸性的(天冬氨酸、谷氨酸);(2)碱性的(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、(3)脂族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸),其中丝氨酸和苏氨酸任选地分别分组为含羟基脂族的;(4)芳族的(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸);(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺);和(6)含硫的(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer(编),Biochemistry,第2版,WH Freeman and Co.,1981)。可以使用本文描述的测定通过评估修饰的多肽或片段以类似于未经修饰的多肽或片段的方式产生应答的能力,容易地测定多肽或其片段的氨基酸序列中的变化是否导致功能同系物。其中已发生超过一个置换的肽、多肽或蛋白质可以容易地以相同方式进行测试。
本发明的多肽还可配制在配药学上可接受的载体或稀释剂中。可以使用多种含水载体,如0.4%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的,通常不含颗粒物质。这些溶液可以通过常规的、熟知的消毒技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可以包含模拟生理条件所需的配药学上可接受的辅助性物质,例如pH调节剂和缓冲剂。本发明的多肽在这种药物制剂中的浓度可以差别很大,即从小于约0.5重量%(通常为约1重量%或至少约1重量%)至高达15重量%或20重量%,并且根据所选的具体施用方式基于流体体积、粘度和其它因素进行选择。
本发明的多肽可以冻干用于储存且在使用之前在合适的载体中再造。已证实该技术对常规的蛋白质制备物是有效的。冻干和再造技术是本领域所熟知的。
本发明的另一个实施例是一种用于表达多肽的方法,所述方法包括下述步骤:提供本发明的宿主细胞;在足以表达多肽的条件下培养所述宿主细胞,所述多肽包含SEQ ID NO:1中所示的序列或具有SEQ ID NO:3中所示的序列;和任选地,证实至少一种多肽的表达,所述多肽包含SEQ ID NO:1中所示的序列或具有SEQ ID NO:3中所示的序列。
宿主细胞可以在任何适合保持或增殖给定类型的宿主细胞并足以表达多肽的条件下培养。足以表达多肽的培养条件、培养基和相关方法是本领域熟知的。例如,许多哺乳类细胞类型可以在37℃下用适当缓冲的DMEM培养基进行有氧培养,而细菌、酵母和其它细胞类型可以在37℃和适当的大气条件下于LB培养基中进行培养。
在本发明的方法中,可以用本领域熟知的多种不同技术确认多肽的表达。例如,使用检测试剂(诸如对表达的多肽特异性的抗体),然后进行SDS-PAGE或FACS,可以证实多肽的表达。特异性地结合本发明的cynoCCL17多肽或与其交叉反应的抗体,是这样的试剂的一个例子。
本发明的另一个实施例是通过本发明的方法生产的多肽。这样的多肽可以包含翻译后修饰,包括例如糖基化或磷酸化。这样的多肽也可以包含替代多肽形式诸如剪接变体、截短形式或蛋白水解修饰形式。
本发明的另一个实施例是特异性地结合本发明的多肽的抗体。本发明的多肽可以用于生产针对cynoCCL17的多克隆或单克隆抗体。使用蛋白或核酸免疫制备鼠、嵌合、人源化和完全人单克隆抗体的技术是常规技术并为本领域技术人员所熟知。从上文可以找到此类技术的另外的讨论和描述。
本发明的另一个实施例是一种确定CCL17调节剂与食蟹猴CCL17的交叉反应性的方法。即使多肽和表位在被考虑用作调节剂的预测模型的物种之间和物种内部是保守的,在进行额外实验之前应当确定调节剂的交叉反应性(Loisel等人,Crit.Rev.in Onc.Hemato1.62:34-42,2007)。可以测定调节剂、本发明的抗体和针对多肽和其它抗原的其它CCL17抗体的交叉反应性,例如,使用竞争性的和非竞争性的测定系统,使用诸如BIAcore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、放射免疫测定法、ELISA、“夹心”免疫测定法、免疫沉淀测定法、蛋白质印迹、免疫放射测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术。这样的测定法是常规的和本领域众所周知的(Ausubel等人编,1994,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。还可以通过测定与CCL17的活化有关的生物活性的调节而评价交叉反应性。例如,使用特定测定可以评价人抗-CCL17抗体与cynoCCL17多肽的交叉反应性,所述测定评估人抗-CCL17抗体的阻断cynoCCL17对表达CCL17受体CCR4的细胞的生物活性的影响。CCR4可以内源性地在细胞上或在过表达系统中表达。可以使用人CCR4或得自其它物种的CCR4。人CCR4具有SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列。可以使用的示例性的细胞是CCRF-CEM、Jurkat和Hut78(用于内源表达)和L1.2、HEK293和B300-19(用于过表达CCR4)。
本发明的另一个实施例是一种用于确定CCL17调节剂在用于人类时是否安全的可能性的方法,所述方法包括:提供CCL17调节剂、第一食蟹猴和第二食蟹猴;将所述CCL17调节剂施用给所述第一食蟹猴;以及确定所述第一食蟹猴相对于所述第二猴是否呈现有害症状,如果所述第一食蟹猴呈现有害症状,则表明所述CCL17调节剂用于人类可能是不安全的,并且如果所述第一食蟹猴没有呈现有害症状,则表明所述CCL17治疗剂用于人类可能是安全的。
在本发明的方法中,容易地确定所述第一食蟹猴相对于所述第二猴是否呈现有害症状。例如,本领域的普通技术人员(例如兽医、兽医助理、动物技师或研究科学家)可以确定动物所呈现的症状是否为有害症状。有害症状的例子包括死亡、昏迷、癫痫、发烧、器官衰竭、组织畸形、器官功能受损、组织功能受损、癌症、肿瘤、溃疡、出血、感染等。可以试验的CCL17调节剂包括:抗体、抗体部分或片段、肽、多肽、寡核苷酸、小分子或其组合。
本发明现结合以下具体的、非限制性实例进行描述。
实例1
编码食蟹猴CCL17(CynoCCL17)的多核苷酸的分离
从人CCL17基因(SEQ ID NO:6,GenBank登录号NM_002987)的5’和3’非翻译区,设计引物。使用设计的引物(5’UTR1:SEQ ID NO:11;3’UTR:SEQ ID NO:12)和食蟹猴睾丸cDNA(BioChain)作为模板,进行PCR。使用TOPO-PA试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA),使用常规方法,分离和亚克隆扩增的约300bp片段。从几个转化体分离出质粒DNA,并测序。发现克隆的cynoCCL17cDNA的编码区的长度为300个核苷酸,且其编码预测的长度为100个氨基酸的蛋白,所述蛋白具有预测的32个氨基酸的信号肽。在食蟹猴和人CCL17蛋白质之间的同一性和相似性分别为84%和89%。与人CCL17相比,cynoCCL17在预测的信号肽区中具有9个氨基酸的插入片段。另外,与人CCL17相比,在cynoCCL173’核苷酸序列中的终止密码子导致所述蛋白质的3氨基酸截短。就CCL17而言,cynoCCL17的最接近的直系同源物是恒河猴(Macaca mulatta,Rhesusmonkey)cDNA(SEQ ID NO:12,GenBank登录号NM_001032852)。CynoCCL17和预测的编码全长CCL17和全长CCL17蛋白的恒河猴多核苷酸分别具有94.7%和91%同一性。除了cynoCCL17C-端相对于恒河猴的3氨基酸截短以外,cynoCCL17和预测的恒河猴成熟蛋白是相同的。
人CCL17和克隆的cynoCCL17多肽序列的比对显示在图1中。
实例2
CynoCCL17cDNA编码功能蛋白
蛋白表达。使用标准技术,为大肠杆菌表达对编码成熟的cynoCCL17和N-端甲硫氨酸的cDNA(SEQ ID NO:4)进行密码子优化(SEQ ID NO:13),并克隆进pET24d载体中用于细菌表达。将得到的载体转染进BL21(DE3)细胞中,在IPTG诱导以后,将成熟的cynoCCL17蛋白表达为包涵体(IB)。从得自6L摇瓶培养物的33g冷冻的湿的细菌沉淀物,制备含有cynoCCL17的包涵体(IB)。将所述细菌沉淀物再悬浮于300mL裂解缓冲液(20mM Tris,pH8.5,5mM EDTA,100mM NaCl)中,通过穿过微射流机2次,破碎细胞。通过在5000rpm离心10min,收集包涵体,并每次用约200mL洗涤缓冲液(裂解缓冲液+1%Triton X-100)洗涤2次。得到4g湿的包涵体沉淀物。
将所述包涵体(4g湿沉淀物)再悬浮于30mL含有8M脲、5mMEDTA、20mM Tris HCl的增溶缓冲液(pH7)中。通过在室温持续搅拌2小时的持续时间,进行增溶。通过在4℃/18000g离心10min,澄清溶解的包涵体,然后加载上串联的2×5mL HiTrap SP-Sepharose Fast Flow(SPFF)柱。流速为1mL/min。然后用缓冲液A(10mM磷酸钠,pH7,8M脲)洗涤柱,直到达到平坦的基线。为了洗脱蛋白,经历14个柱体积(140mL)施加0-100%B(缓冲液A+1M NaCl)的梯度,流速为1.5mL/min。以1.5mL/级分收集各个级分。合并主要峰级分,用于重折叠。如下开始重折叠:将上面得到的合并的级分(12mL)加入108mL重折叠缓冲液中,所述重折叠缓冲液通过使重折叠基质含有(终浓度)0.1M NaHCO3、2M胍HCl、3mM半胱氨酸和0.3mM胱氨酸的方式制备。允许重折叠在室温在轻微搅拌(约50rpm)下进行。
使用4.6×250mm C18反相柱,通过分析型RP-HPLC,监测重折叠的进程。流动相A为H2O/0.1%TFA,而相B为乙腈/0.1%TFA。在0.5mL/min,历时80min使用25-55%B的梯度,洗脱蛋白。重折叠在63小时结束。用醋酸酸化重折叠混合物至pH约3,并穿过0.45μm过滤器进行过滤,然后加载上10×250mm C18柱,流速为0.8mL/min。流动相A为H2O/0.1%TFA,而相B为乙腈/0.1%TFA。经历3个柱体积使用25-55%B的梯度洗脱蛋白,流速为0.8mL/min。合并含有主峰的级分,并使用具有3,500MWCO的透析盒在1XD-PBS中透析。收集透析液,并穿过0.2μm过滤器进行过滤。重折叠的纯化的cynoCCL17在还原SDS-PAGE中是约7kD。完整蛋白质量分析表明,所述蛋白质的N-端以丙氨酸开始。
钙流量。以40,000细胞/25μl,将CCRF-CEM细胞(ATCC)铺板在384-孔聚-D-赖氨酸包被的黑色白底平板中。将25μl Fluo-8NW染料(在含有0.5%普卢兰尼克F127的HBSS中)加给细胞。将所述细胞在37℃(5%CO2)温育30min,并在室温温育第二个30min时段。将12.5μl在5000ng/ml-3pg/ml范围内的CynoCCL17系列稀释物(在含有0.1%BSA的HBSS中)加入孔中。在490nm激发和525nm发射,测量荧光强度,计算的EC50为0.665ng/ml(图2)。
现已完整描述本发明,对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的是,在不脱离所附权利要求的精神或范围的前提下,可对本发明做出多种修改和变型。
Claims (1)
1.一种分离的食蟹猴(Macaca fascicularis)多肽,所述多肽由SEQ ID NO: 3的氨基酸序列组成。
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