NO172447B - Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner Download PDFInfo
- Publication number
- NO172447B NO172447B NO880262A NO880262A NO172447B NO 172447 B NO172447 B NO 172447B NO 880262 A NO880262 A NO 880262A NO 880262 A NO880262 A NO 880262A NO 172447 B NO172447 B NO 172447B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- avermectins
- avermitilis
- mutants
- compounds
- avermectin
- Prior art date
Links
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 title claims description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 60
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 claims description 47
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 27
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 28
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 23
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 14
- 101710116650 FAD-dependent monooxygenase Proteins 0.000 description 13
- 101710128228 O-methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N sinefungin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[C@H](CC[C@H](N)C(O)=O)N)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LMXOHSDXUQEUSF-YECHIGJVSA-N 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 (S)-sec-butyl (1 -methylpropyl) Chemical group 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- VZFUCHSFHOYXIS-UHFFFAOYSA-N cycloheptane carboxylic acid Natural products OC(=O)C1CCCCCC1 VZFUCHSFHOYXIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DBDJCJKVEBFXHG-UHFFFAOYSA-N L-Oleandrose Natural products COC1CC(O)OC(C)C1O DBDJCJKVEBFXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBDJCJKVEBFXHG-BNHYGAARSA-N Oleandrose Natural products O(C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](C)O[C@H](O)C1 DBDJCJKVEBFXHG-BNHYGAARSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229950008974 sinefungin Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- MNULEGDCPYONBU-UIXCWHRQSA-N (1R,4E,5'S,6S,6'S,7R,8S,10R,11R,12S,14R,15S,16R,18Z,20Z,22R,25S,27R,28S,29R)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-[(2R)-2-hydroxypropyl]-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C/C=C\1)[C@@H]2C MNULEGDCPYONBU-UIXCWHRQSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-CBLVMMTCSA-N (1R,4Z,5'S,6S,6'S,7R,8S,10R,11R,12S,14R,15S,16R,18Z,20Z,22R,25S,27R,28S,29R)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-[(2R)-2-hydroxypropyl]-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C/C=C\1)[C@@H]2C MNULEGDCPYONBU-CBLVMMTCSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-WABYXMGOSA-N (1S,4E,5'R,6R,6'R,7S,8R,10S,11S,12R,14S,15R,16S,18E,22S,25R,27S,28R,29S)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC[C@H]1CC[C@H]2O[C@@]3(CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O3)[C@H](C)[C@@H](OC(=O)\C=C\[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@](C)(O)[C@H](O)[C@@H](C)C\C=C\C=C1)[C@H]2C MNULEGDCPYONBU-WABYXMGOSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-QECWTJOCSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-QECWTJOCSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-BOXGPLBDSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11s,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-BOXGPLBDSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-YOKYSHDFSA-N (5'R,10S,11R,12S,14S,15R,16R,18R,19S,20R,26R,29S)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2S)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C=CC(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)C=CC=CC(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YOKYSHDFSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 3
- 108010046716 3-Methyl-2-Oxobutanoate Dehydrogenase (Lipoamide) Proteins 0.000 description 3
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-MQLHLVDXSA-N CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C\C=C\1)C2C Polymers CC[C@@H]1CC[C@@H]2O[C@]3(CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O3)[C@@H](C)[C@H](OC(=O)\C=C\[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@](C)(O)[C@@H](O)[C@H](C)C\C=C\C=C\1)C2C MNULEGDCPYONBU-MQLHLVDXSA-N 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 230000000507 anthelmentic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 3
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 3
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 3
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N oligomycin A Natural products CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 2
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N cyclopentanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCC1 JBDSSBMEKXHSJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical class ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- GOYBREOSJSERKM-ACZMJKKPSA-N oleandrose Chemical compound O=CC[C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O GOYBREOSJSERKM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- DKVBOUDTNWVDEP-NJCHZNEYSA-N teicoplanin aglycone Chemical group N([C@H](C(N[C@@H](C1=CC(O)=CC(O)=C1C=1C(O)=CC=C2C=1)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)OC=1C=C3C=C(C=1O)OC1=CC=C(C=C1Cl)C[C@H](C(=O)N1)NC([C@H](N)C=4C=C(O5)C(O)=CC=4)=O)C(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3NC(=O)[C@@H]1C1=CC5=CC(O)=C1 DKVBOUDTNWVDEP-NJCHZNEYSA-N 0.000 description 2
- 229960002363 thiamine pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000008170 thiamine pyrophosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011678 thiamine pyrophosphate Substances 0.000 description 2
- YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N thiamine(1+) diphosphate chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N YXVCLPJQTZXJLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N tiglic acid Natural products CC(C)=C(C)C(O)=O UAXOELSVPTZZQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBQZUBPODLPCFG-PIBDHAAFSA-N (2S)-2-amino-4-[[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl-ethylsulfonio]butanoate Chemical compound CC[S+](CC[C@@H](C([O-])=O)N)C[C@H]([C@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 UBQZUBPODLPCFG-PIBDHAAFSA-N 0.000 description 1
- OVBFMEVBMNZIBR-RXMQYKEDSA-N (2r)-2-methylpentanoic acid Chemical compound CCC[C@@H](C)C(O)=O OVBFMEVBMNZIBR-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- OVBFMEVBMNZIBR-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-methylpentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](C)C(O)=O OVBFMEVBMNZIBR-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OVBFMEVBMNZIBR-UHFFFAOYSA-N -2-Methylpentanoic acid Natural products CCCC(C)C(O)=O OVBFMEVBMNZIBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFOASZQZPWEJAA-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbutyric acid Chemical compound CC(C)C(C)C(O)=O XFOASZQZPWEJAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVKMFSAVYPAZTQ-UHFFFAOYSA-N 2-methylhexanoic acid Chemical compound CCCCC(C)C(O)=O CVKMFSAVYPAZTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(=O)C(O)=O BKAJNAXTPSGJCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000254032 Acrididae Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000258993 Anthrenus museorum Species 0.000 description 1
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 241000244186 Ascaris Species 0.000 description 1
- JVGWUGTWQIAGHJ-DFAYUBCLSA-N Avermectin A2a Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](C(C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](OC)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 JVGWUGTWQIAGHJ-DFAYUBCLSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000257161 Calliphoridae Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000253350 Capillaria Species 0.000 description 1
- 241000243990 Dirofilaria Species 0.000 description 1
- 241000510032 Ellipsaria lineolata Species 0.000 description 1
- 241000498256 Enterobius Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000257226 Muscidae Species 0.000 description 1
- CAUBWLYZCDDYEF-UHFFFAOYSA-N N-Nitroso-N-methylurethane Chemical compound CCOC(=O)N(C)N=O CAUBWLYZCDDYEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- OJQHWWHKSRTXRT-HHWRGAEVSA-N NC1=NC=NC2=C1N=CN2[C@@H]([C@@H]1O)O[C@H](C[S+]2C=CC=CC=CC=C2)[C@H]1O Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2[C@@H]([C@@H]1O)O[C@H](C[S+]2C=CC=CC=CC=C2)[C@H]1O OJQHWWHKSRTXRT-HHWRGAEVSA-N 0.000 description 1
- 241000498271 Necator Species 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000258242 Siphonaptera Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000244174 Strongyloides Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000130767 Tineidae Species 0.000 description 1
- 241000243774 Trichinella Species 0.000 description 1
- 241001489151 Trichuris Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000895 acaricidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000642 acaricide Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000000921 anthelmintic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124339 anthelmintic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 description 1
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 description 1
- 229940125687 antiparasitic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- JVGWUGTWQIAGHJ-UHFFFAOYSA-N avermectin A2a Natural products C1C(O)C(C)C(C(C)CC)OC11OC(CC=C(C)C(OC2OC(C)C(OC3OC(C)C(O)C(OC)C3)C(OC)C2)C(C)C=CC=C2C3(C(C(=O)O4)C=C(C)C(OC)C3OC2)O)CC4C1 JVGWUGTWQIAGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N avermectin b2 Chemical compound O1C(C)C(O)C(OC)CC1OC1C(OC)CC(O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)C(O)C4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)OC1C ZPAKHHSWIYDSBJ-QDXJZMFISA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- MJAMCTLGWXIKOT-UHFFFAOYSA-M benzyl-dimethyl-[2-[2-[2-methyl-4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethyl]azanium;hydroxide Chemical compound [OH-].CC1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 MJAMCTLGWXIKOT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- ISQVBYGGNVVVHB-UHFFFAOYSA-N cyclopentylmethanol Chemical compound OCC1CCCC1 ISQVBYGGNVVVHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 239000013057 ectoparasiticide Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000079386 endoparasite Species 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 244000000050 gastrointestinal parasite Species 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical group 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000014837 parasitic helminthiasis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008560 physiological behavior Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K trisodium;[(z)-18-[1,3-bis[[(z)-12-sulfonatooxyoctadec-9-enoyl]oxy]propan-2-yloxy]-18-oxooctadec-9-en-7-yl] sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCC(OS([O-])(=O)=O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N vanillin Chemical compound COC1=CC(C=O)=CC=C1O MWOOGOJBHIARFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N vanillin Natural products COC1=CC(O)=CC(C=O)=C1 FGQOOHJZONJGDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012141 vanillin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/10—Anthelmintics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
- C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
- C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av B-avermectiner med Streptomyces avermitilis som mangler 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B og dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer.
US-patent 4.310.519 og 4.429.042 beskriver avermectinene, som utgjør et kompleks av beslektede midler med betydelig antiparasittisk aktivitet, og deres fremstilling ved aerob fermentering av stammer av Streptomyces avermitilis; nemlig S. avermitilis ATCC nr. 31267, 31271 og 31272. De to siste av de angitte stammer utgjør henholdsvis en dypfryst ampulle og et lyofilisert rør av en kultur oppnådd ved ultrafiolett bestråling av S. avermitilis ATCC 31267.
EP 214.731 av 18. mars, 1987, beskriver en rekke forbindelser (her omtalt som ikke-naturlige avermectiner) som er beslektet med de naturlige eller kjente avermectiner, men som har en ny substituentgruppe i 25-stillingen, samt en fremgangsmåte for fremstilling av disse ved fermentering av en avermectin-dannende organisme i nærvær av visse nærmere angitte karboksylsyrer, eller derivater eller forløpere derav (precursors). S. avermitilis-organismer benyttet til fremstilling av de nevnte nye C-25-substituerte avermectiner er S. avermitilis ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121. Sistnevnte organisme, beskrevet i EP 214.731, oppnås fra S. avermitilis ATCC 31271. Denne gir forbedret utbytte av de nye C-25-substituerte avermectiner når den dyrkes i et "semi-defined" medium. Både ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121 kan i tillegg til de nye C-25-substituerte derivater, også produsere varierende mengder av de kjente eller naturlige avermectiner, hvor 25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl).
Karbonskjelettet av avermectinene (vist nedenfor i formel (I)) skriver seg fra acetater og propionater, og C-25-substituenten av naturlige avermectiner fra L-isoleucin (R=(S)-sek-butyl) eller L-valin (R=isopropyl) [Fisher & Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) Ch. 14] .
Ved "kjente" eller "naturlige" avermectiner menes de avemectiner som produseres av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 og ATCC 31272, hvor substituenten i 25-stillingen enten er isopropyl eller (S)-sek-butyl (1-metylpropyl). Avermectiner hvor substituenten i 25-stillingen er forskjellig fra isopropyl eller sek-butyl (S-form) omtales her som nye eller ikke-naturlige avermectiner.
Stammene av S. avermitilis angitt i ovennevnte US-patenter danner en klasse av substanser som der generisk er beskrevet som C-076. Klassen omfatter åtte distinkte, men nært beslektede forbindelser beskrevet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. "a"-serien av forbindelser refererer til de naturlige avermectiner hvor 25-substituenten er (S)-sek-butyl, og "b<H->serien til de hvor 25-substituenten er isopropyl. Betegnelsene "A" og "B" refererer til avermectiner hvor 5-substituenten er henholdsvis metoksy eller hydroksy. Endelig, viser tallet "1" til avermectiner som i 22-23-stillingen har en dobbeltbinding; og tallet "2" til avermectiner som har et hydrogen i 22-stilling og hydroksy i 23-stilling.
I denne søknad benyttes ingen slike kjennemerker for 25-substituenten i ikke-naturlige avermectiner. Kjennemerkene Al, A2, Bl og B2 er bibeholdt for å angi ikke-naturlige avermectiner som har strukturelle trekk som korresponderer med det som ovenfor er angitt for naturlige avermectiner.
Frembringelse av mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer er beskrevet for Bacillus subtilis, Willecke & Pardee, J. Biol. Chem. 246. 5264-72
(1971) og Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), men ikke for Streptomyces.
S. avermitilis Agly-1, en mutant stamme som praktisk talt bare produserer avermectin aglykon Ala og A2a, er rapportert av Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985). Fermentering av S. avermitilis Agly-1 i nærvær av sinefungin, som forårsaket øket produksjon av avermectin aglykon B-komponenter, er også rapportert. Likeledes resulterte S. avermitilis 08, en høytytende stamme for avermectiner, ved fermentering i nærvær av sinefungin som hemmer av O-metyl-transferaser, i produksjon av avermectiner som manglet 0-metylgrupper på aglykonet ved C-5 og i oleandrose-disakkarid-delen.
US-patent 4.378.353 beskriver C-076-relaterte forbindelser og deres fremstilling ved dyrking av MA-5218, en mutant av S. avermitilis ATCC 31272 som oppnås fra denne ved ultrafiolett bestråling. Mutanten er betegnet ATCC 31780. De C-076-relaterte forbindelsene som fremstilles av mutanten, mangler C-076-furanringen. I enkelte av de omtalte forbindelsene er én eller begge oleandrosesukker-delene dessuten avspaltet mens gruppen i 5-stilling hos andre er oksydert til en ketogruppe.
Tre klasser av O-metyltransferase-mutanter av S. avermitilis som danner avermectiner med manglende 0-metylgrupper, er beskrevet av Ruby et al., 6th International Symposium on the "Biology of Actinomycetes", Debrecen, Ungarn, august 26-30 (1985) og Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987). Den første klassen produserer primært B-avermectiner fordi de mangler evne til metylering av C-5 hydroksylgruppen i den makrocykliske laktonring. Den andre klassen danner 3'-0, 3"-0-bis-demetyl-avermectiner (avermectiner som mangler O-metylsubstituenten i 3-stillingen i begge oleandrose-monosakkarid-restene), og som refereres til som demetylavermectiner. Den tredje klassen er ute av stand til å metylere i noen som helst posisjon.
Schulman et al., Fed. Proe. 44., 931 (1985) beskriver øket produksjon av B-avermectiner ved fermentering av S. avermitilis i nærvær av substanser som sinefungin, S-adenosyl-etionin og S-adenosylhomocystein som hemmer avermectin-B-O-metyltransferaseenzymet i å metylere C-5 hydroksgruppen i aglykon-delen. Streptomyces avermitilis-mutanter som mangler 0-metyltransferaseaktivitet og produserer økede mengder avermectin-B-komponenter, er også beskrevet av Schulman et al., i Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29. 620-624
(1986).
Mutagenese av S. avermitilis fører til mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer. Mutantene har ikke lenger evnen til å danne vesentlige mengder av de naturlige avermectiner når det under fermenteringsprosessen mangler tilsatt RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller en forbindelse som kan omdannes til RCOOH. Det er nå høyst overraskende funnet at mutantene danner avermectiner, naturlige og ikke-naturlige, ved fermentering i nærvær av en tilsatt forbindelse R-COOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl eller en annen nærmere angitt gruppe, eller i nærvær av en forløper til den nevnte RCOOH. Enda mer overraskende er det at de her beskrevne mutanter, som kun mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og som er ute av stand til å nedbryte L-isoleucin, L-leucin eller L-valin, kan assimilere et bredt utvalg av forbindelser via avermectin-biosyntesen under produksjon av ikke-naturlige avermectiner som er fri for naturlige avermectiner.
Mutagenese av de således frembragte enkeltblokkerte mutanter fører til mutanter som mangler både dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Forbausende nok, danner disse dobbeltblokkerte mutanter i det vesentlige kun naturlige- og ikke-naturlige B-avermectiner når de dyrkes i nærvær av en tilsatt forbindelse R-COOH, hvor R er som angitt ovenfor.
Som nevnt, fremstilles de naturlige avermectiner som en kompleks blanding av åtte distinkte, men nær beslektede forbindelser; formel (I), R=isopropyl og (S)-sek-butyl. Selv om de har kunnet isoleres i tilnærmet ren form (se US-patent 4.429.042) er metodikken, i beste fall, omstendelig. B-avermectinene har i alminnelighet bedre anthelmintisk virkning enn de tilsvarende A-avermectinene. Fremstillingen av ikke-naturlige avermectiner (A og B komponenter) i henhold til fremgangsmåten beskrevet i EP 214.731, kan også danne varierende mengder av noen av de naturlige avermectiner som følge av forekomst av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer, og av aminosyrene L-valin og L-isoleucin i S. avermitilis mikroorganismenes celler og i det medium som benyttes for deres fremstilling.
Muligheten for å fremstille kun de mer bioeffektive B-komponenter av naturlige- eller ikke-naturlige avermectiner slik at antallet og kompleksisiteten av produktene reduseres og renheten av det valgte avermectin således kan økes, og separasjonsteknikken dermed forenkles, har vært et ønskelig mål.
S. avermitilis-stammer som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, produseres ved mutasjon av avermectinproduserende stammer av S. avermitilis og spesielt ved mutasjon av S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 eller NCIB 12121. Mutantene kan ikke syntetisere naturlige avermectiner uten at fettsyren, eller en forløper til denne, som har isopropyl- eller sek-butyl- (S-form) gruppen, tilsettes til fermenteringsmediet for mutantene. De er i stand til produksjon av naturlige og ikke-naturlige avermectiner ved fermentering under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium som inneholder en passende "primer"-syre eller en forbindelse som kan omdannes til en sådan under fermenteringsprosessen.
Mutanter som er karakterisert ved deres manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, isoleres fra de muterte koloniene på basis av en <14>C02-bestemmelse. Ved denne teknikk indikerer manglende <1A>C02-utvikling i permeabiliserte celler fra et substrat av [<14>C-1]-2-oksoisokapronsyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metyl-valeriansyre eller av [UC-1]-2-okso-3-metyl-smørsyre at dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer mangler.
Det var overraskende og uventet at de her beskrevne mutanter som manglet dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, bibeholdt evnen til å produsere avermectiner, spesielt ikke-naturlige avermectiner. Mutanter med manglende evne til å danne naturlige fett-acyl koenzym A-derivater ved vekst på et konvensjonelt medium, kunne ha vært en letal mutasjon dersom membranintegriteten hadde vært avhengig av de nevnte derivater, eller dersom 2-oksosyre-akkumulering av førstnevnte mutant hadde ført til cytotoksisitet. Det var dessuten ikke forventet at noen av mutantene skulle være i stand til å syntetisere acetyl-CoA og propionyl-CoA ved nedbrytende metabolisme av L-isoleucin og L-valin, idet dette fordrer de enzymaktiviter som mutantene mangler. Behovet for disse ovennevnte acyl-CoA-derivater for avermectin-biosyntese har ført til den antagelse at mutantene ved produksjon av ikke-naturlig avermectin, kunne være alvorlig svekket, noe som altså ikke var tilfellet.
Den manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer i de her beskrevne mutanter, resulterer i at syntese av forgrenet-fett-acyl-CoA fra nedbrytning av L-isoleucin, L-leucin og L-valin, og derved, syntesen av naturlige avermectiner, forhindres, bortsett fra når R-COOH (hvor R er (S)-sek-butyl eller isopropyl) eller en forløper, tilsettes til fermenteringsmediet.
Videre mutering av mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, danner mutanter som dessuten mangler O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Mutanter som mangler O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B kan ikke metylere C-5 oksygenet i avermectinenes aglykon-del. Mutanter som mangler denne virkning danner praktisk talt bare B-avermectiner ved at fremstillingen A-avermectiner forhindres.
Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan man anvende enhver organisme, uansett forekomst eller fysiologisk oppførsel, som kan utvikles ved hjelp av transformasjon, transduksjon, genetisk rekombinasjon eller annen genetisk teknikk, ved å benytte en nukleinsyre eller ekvivalent materiale fra de her beskrevne arter som har oppnådd de karakteristiske sider ved de her beskrevne mutanter.
Uttrykket "avermectin" eller "avermectiner" refererer til forbindelser som har den senere angitte formel (I), men hvor 25-substituenten (R) kan være en hvilken som helst gruppe i denne posisjon som kan assimileres av S. avermitilis i henhold til oppfinnelsen.
De her beskrevne mutanter er meget verdifulle for fremstilling av ikke-naturlige B-avermectiner etter de fremgangsmåter som det her vil bli gitt eksempler på. De er spesielt verdifulle for fremstilling av foretrukne avermectiner, dvs. forbindelser hvor C-25-substituenten er C5-C6-cykloalkyl.
Mutering av en avermectin-produserende stamme av Stre<p>tomyces avermitilis oppnås ved kjente teknikker som benytter én av flere mutasjonsforårsakende midler, innbefattet ultrafiolett bestråling, røntgenbestråling, N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin, etylmetansulfonat, salpetersyrling og nitrogen-sennepsgasser, f.eks. N-metylbis(2-kloretyl)amin, eller lignende. Mutagenesen kan foretas på sporer eller på en vegetativ kultur av S. avermitilis som er i stand til å produsere naturlige avermectiner, f.eks. S. avermitilis ATCC 31272.
Ved å følge fremgangsmåter som er velkjente på dette fagområdet, selekteres mutageniserte kolonier på manglende dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, på basis av en biokjemisk metode som gjør det mulig å gjennomsøke et stort antall vilkårlig mutageniserte bakteriekolonier ved <14>C02-produksjon fra utvalgte [<14>C-1]-2-oksosyrer (Tabor et al., J. Bact. 128. 485-486, 1976).
Metodikken består i å dyrke mutantkoloniene i brønner i en mikrotiter-plate på et egnet næringsmedium, permeabilisere cellene med toluen og deretter tilsette [UC-1]-2-oksosyren (f.eks. 2-oksoisokapronsyre) til hver brønn og kontrollere den overstående atmosfære på <14>C02. Alternativt kan [UC-1] -2-okso-3-metylvaleriansyre eller [<14>C-1]-2-okso-3-metylsmørsyre benyttes i stedet for [<1>AC-1]-2-okso-isokapronsyre. Utviklingen av <14>C02 kontrolleres hensiktsmessig ved å anbringe fuktet Ba (OH) 2-mettet filtrerpapir over de enkelte brønner for å fange opp eventuelt frigjort <1A>C02 og påvise eventuelt dannet Ba14C03 ved autoradiografi. Mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, gir autoradiogrammer som ligger nær opp til de ubehandlede (ikke-inokulerte) kontrollene; dvs. Ba<1A>C03 produseres ikke av mutantene.
De således oppnådde mutanter utsettes for videre mutagenese ved å benytte et av de ovenfor nevnte mutagener. Mutageniserte kolonier undersøkes på manglende O-metyltransferaseaktivitet for avermectin B ved kromatografi (tynnskiktskromatografi eller HPLC) etter fermentering i nærvær av tilsatt forløper (f.eks. 2-metyl-smørsyre). Avermectin A-forbindelser mangler praktisk talt fullstendig i fermenteringsbuljongen for slike mutanter.
I tillegg til dannelse av ønskede alleler av en gitt mikroorganismestamme ved mutagenese, muliggjør protoplastsammensmelting at ønskede alleler, produsert/identifisert i en stamme, overføres til kromosomet av en annen stamme. For eksempel kan én stamme av S. avermitilis som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, ved protoplastsammensmelting med en S. avermitilis-stamme som har de nevnte aktiviteter, frembringe en stamme av S. avermitilis som kun mangler 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B. Som fagmannen vil innse muliggjør teknikken som tillater sammensmelting av protoplaster, kombinasjon av ønskelige alleler fra divergente seleksjonslinjer i en enkelt stamme.
De morfologiske og dyrkningsmessige karakteristika for mutantene som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er generelt som beskrevet i US-patent 4.429.042. Særtrekkene ved mutantene utgjøres av deres mangel på dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, og disse karakteristika bestemmes som her beskrevet. Disse aktivitetsmangler resulterer i svikt når det gjelder mutantens evne til å produsere naturlige avermectiner ved dyrking i et definert medium som i det vesentlige er fritt for fettsyrer RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller forbindelser som kan omdannes til nevnte RCOOH under fermentering. En taksonomisk undersøkelse foretatt ved American Type Culture Collection har bekreftet at de karakteristiske trekk ved den mutante stamme 1-3, selektert ved den ovenfor angitte <14>C02-bestemmelse, er nær beslektet med opphavsstammen av ATCC 31272 beskrevet i US-patent 4.429.042, dog med visse unntak. Mutantstammen 1-3 (ATCC 53567) danner således betydelig færre sporekjeder enn ATCC 31272. I forsøk utført av søkerne, syntes raffinose ikke å opprettholde veksten av noen av disse stammer. I motsetning til hva som er angitt i beskrivelsen av ATCC 31272 i US-patent 4.429.042 har vi dessuten ikke kunnet påvise vekst av mutanten eller av ATCC 31272 med sukrose som eneste karbonkilde. Mutant 1-3 er negativ med hensyn til dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer. Den dobbelt negative mutant i henhold til oppfinnelsen, S. avermitilis 7881, som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer og 0-metyltransferaseaktivitet for avermectin B, fremstillet ved ytterligere mutagenese av mutant 1-3 (ATCC 53567), har en lignende taksonomisk relasjon til ATCC 31272 som den mutante stamme 1-3.
Streptomyces avermitilis 1-3 og 7881 er deponert i henhold til Budapest-traktaten i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, et anerkjent depositorium som gir permanent oppbevaring og vil gi lett offentlig tilgjengelighet om denne patentsøknad innvilges. De har fått betegnelsen henholdsvis Stre<p>tomyces avermitilis ATCC 53567 og ATCC 53692.
Sålenge søknaden verserer er det deponerte materialet tilgjengelig etter tillatelse fra Commissioner of the United States Patent and Trademark Office i henhold til 37 CFR 1.14 og 35 USC 122, og i overensstemmelse med patentlovgivningen i andre land hvor søknaden er innlevert. Samtlige begrensninger i den offentlige tilgjengelighet til de deponerte mikroorganismer vil bli permanent fjernet ved patentets innvilgning.
Hver enkelt stamme av S. avermitilis ATCC 312 67, ATCC 31271, ATCC 31272 og NCIB 12121 danner de naturlige avermectinene med formel (I)
hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding; R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler; R2 er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med formel
R<3> er hydrogen eller metyl; og
R er isopropyl eller (S)-sek-butyl.
US-patent 4.285.963 beskriver et avermectin med formel (I) hvor 25-stillingen er substituert med en metyl- og en etyl-gruppe; R<1> er hydroksy og R3 er metyl.
I de nevnte ikke-naturlige avermectiner er R-substituenten forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl og
som ovenfor definert.
De essensielle forbindelser som benyttes ved biosyntese av forbindelser med formel (I) forekommer i S. avermitilis-cellen og i mediet. Forbindelsene dannes ved nedbrytning av L-valin og L-isoleucin eller fra deres korresponderende 2-oksosyrer via dekarboksylering av 2-oksosyren med dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer under samtidig kobling av produktet med koenzym A. Deres nærvær er ansvarlig for den samtidige dannelsen av både isopropyl- og (S)-sek-butylforbindelsene (I). Dette kompliserer selvsagt separeringen av isopropylderivatene fra (S)-sek-butyl-derivatene.
Ved fermentering i et næringsmedium som inneholder passende primer-forbindelse, danner mutantene i henhold til oppfinnelsen en forbindelse med formel (I) eller, oftest, en blanding av to eller flere forbindelser med formel (I), hvor R tilsvarer den anvendte primer-forbindelse. Inntil to produkter, hensiktsmessig betegnet R-avermectin Bl og B2, i henhold til betegnelsene benyttet i US-patent 4.429.042, kan dannes. "R-11-gruppen viser selvsagt til C-25-substituenten. Når R er cyklopentyl er for eksempel følgende to avermectiner mulige:
I de ikke-naturlige avermectiner er C-25-substituenten "R" med formel (I) forskjellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl .
De forbindelser som i henhold til oppfinnelsen kan utnyttes av S. avermitilis for biosyntese av naturlige og ikke-naturlige avermectiner, er forbindelser med formel (II-A) innbefattet forbindelser som kan omdannes til (II-A) under fermenteringsprosessen. Disse forbindelsene omtales her som "primer-forbindelser". I formel (II-A) er R en alfa-forgrenet gruppe og karbonatomet i denne som -COOH-gruppen er tilknyttet, er også bundet til minst to andre atomer eller grupper som er forskjellige fra hydrogen. Denne definisjonen omfatter selvsagt mettede acykliske og cykliske grupper.
Mer spesifikt, kan R, som blir C-25-substituenten, være en alfa-forgrenet C3-C8-alkylgruppe eller en C5-C8-cykloalkyl-gruppe.
Forbindelser som kan omdannes til RCOOH under fermenteringsprosessen, dvs. forløpere, er forbindelser med formel (II-B), hvor R er som ovenfor definert:
n er 0, 2, 4 eller 6; og Z er -CH20H, -CHO, -CH2NH2, -C00R<4 >eller -CONHR<5>, hvor R<4> er H eller (C^) alkyl; R<5> er hydrogen, (C1.4)alkyl eller en rest av en aminosyre, spesielt asparagin-syre, glutaminsyre og metionin, f.eks. henholdsvis -CH(C00H)CH2C00H, -CH (COOH) (CH2) 2COOH og -CH(COOH) (CH2) 2SCH3.
Innenfor rammen av denne oppfinnelse faller også anvendelse av de isomere former av formel-(II-A)-forbindelser og forbindelser som kan omdannes til slike under fermenteringsprosessen, samt fremstilling av de isomere avermectiner ved C-25 som resulterer fra anvendelse av disse i den her beskrevne prosess.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen utføres ved aerob fermentering ved 28-30°C ved hjelp av Streptom<y>ces avermitilis ATCC 53692 eller en mutant derav avledet fra utgangsstammen Streptomyces avermitilis ATCC 53567, som har tilnærmet de samme morfologiske egenskaper som utgangsstammen og som har evnen til å danne de ovennevnte avermectiner, av et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde for nitrogen, karbon og uorganiske salter og en syre med formelen R-COOH, eller en forbindelse som kan omdannes til nevnte syre under fermenteringsprosessen, hvor R er som angitt ovenfor. Syren eller forbindelsen som kan omdannes til denne, tilsettes ved inokuleringen eller til forskjellige tider under fermenteringen. Dannelsen av avermectin-produktene kan følges ved uttak av prøver fra fermentoren, ekstrahere dem med et organisk oppløsningsmiddel og vurdere produktet ved kromatografi, for eksempel høytrykks-væskekrornatografi. Inkuberingen fortsettes inntil maksimalt produktutbytte oppnås, i alminnelighet fra 4 til 15 dager.
En foretrukket tilsetningsmengde av primer-forbindelsene
(karboksylsyre eller forbindelse som kan omdannes dertil)
utgjør mellom 0,05 og 3,0 g per liter. Primer-forbindelsen kan tilsettes kontinuerlig, periodevis eller på én gang. Syren (RCOOH) tilsettes som sådan eller som et salt, f.eks. som natrium-, litium- eller ammoniumsaltet eller som en forbindelse som kan omdannes til syren. Er syren fast, oppløses den fortrinnsvis i et hensiktsmessig
oppløsningsmiddel, for eksempel vann eller (CX.A) alkoholer.
De anvendte fermenteringsmedier kan, spesielt når C-25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl, være konvensjonelle medier som inneholder assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og sporelementer. Når C-25-substituenten skal være en ikke-naturlig gruppe; dvs. ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl, utgjøres dyrkningsmediet av et medium som mangler de valgte ingredienser eller som bare inneholder minimale mengder primer-forbindelser, hvor R-delen er isopropyl eller (S)-sek-butyl.
Etter flere dagers fermentering ved en temperatur som fortrinnsvis ligger i området 24-33°C, sentrifugeres eller filtreres gjæringsvæsken, hvorpå mycelie-kaken ekstraheres med aceton eller metanol. Ekstraktet konsentreres, hvoretter det ønskede produkt ekstraheres over i et organisk oppløsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, så som metylenklorid, etylacetat, kloroform, butanol eller metylisobutylketon. Ekstraktet konsentreres og råproduktet renses om nødvendig ved kromatografi, for eksempel ved preparativ, omvendt-fase HPLC.
Produktet oppnås i alminnelighet som en blanding av forbindelsene (I), hvor R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy, R<1> er OH og dobbeltbindingen mangler, eller R<1 >mangler og dobbeltbindingen forekommer, og hvor R<3> er H. Forbindelser hvor R<3> er CH3 forekommer praktisk talt ikke. Blandingsforholdet for forbindelsene kan imidlertid variere med den spesielle mutant og primer-forbindelse som er benyttet, og med de anvendte betingelser.
Kilden for R-gruppen; dvs. hvorvidt den kommer direkte fra R-COOH eller dannes fra en av de nevnte forløpere, eller fra en hvilken som helst forløper, er uvesentlig for produksjonen av avermectinene. Avgjørende for deres fremstilling i henhold til oppfinnelsen, er at den ønskede R-gruppe under fermenteringsprosessen gjøres tilgjengelig for S. avermitilis-stammene i henhold til oppfinnelsen.
Egnede forbindelser innbefatter:
2,3-dimetylsmørsyre
2-metylheksansyre
cyklopentan-karboksylsyre
cykloheksan-karboksy1syre
cykloheptan-karboksylsyre
hydroksymetylcyklopentan
(S)-2-metylpentansyre
(R)-2-metylpentansyre
Tre klasser av O-metyltransferasemutanter kan oppnås fra de her beskrevne 2-oksosyre-dehydrogenase-negative mutanter. Mutanter hvor en mutasjon i aktiv 2-oksosyre-dehydrogenaseaktivitet er kombinert med én eller flere av O-metyl-transf erase-mutasj onene for å oppnå stammer av S. avermitilis som når de gis RCOOH-forbindelser eller forbindelser som kan omdannes til RCOOH under fermenteringen, danner i det vesentlige B-avermectiner, demetyl-avermectiner eller avermectiner som ikke er metylert i det hele tatt. Disse mutantene oppnås ved mutagenese av de her beskrevne mutanter som mangler dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer ved hjelp av ultrafiolett lys og/eller kjemiske mutagener så som N-metyl-N-nitroso-uretan, nitroso-guanidin eller andre midler, så som de tidligere angitte. Som et alternativ kan forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase-positive mutanter som mangler én eller flere av O-metyltransferasene, muteres ved behandling med UV-lys eller med et mutageniserende middel for å gi de forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase-negative mutanter.
De ikke-naturlige avermectiner fremstillet ved hjelp av slike mutanter, karakteriseres ved at de har hydroksygrupper i C-5-stillingen i aglykon-delen og/eller C-3' og/eller C-3"-stillingene i oleandrose-delene.
De ovenfor beskrevne mutanter identifiseres etter metodikken beskrevet av Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). De kan benyttes for samme formål og på samme måte som kjente avermectiner.
Som et alternativ kan større mengder av B-avermectiner, innbefattet de som mangler metylgrupper på oleandrose-disakkarid-delen, fremstilles ved å dyrke de angitte mutanter, som mangler aktiv dehydrogenaseaktivitet for forgrenede 2-oksosyrer, i nærvær av en substans, som sinefungin, S-adeno-syletionin eller S-adenosylhomocystein, som hemmer 0-metyltransferaseaktivitet.
Forbindelsene fremstillet i henhold til oppfinnelsen er meget aktive antiparasittiske midler med spesiell anvendelse som anthelmintika, ektoparasitticider, insekticider og akaricider.
Forbindelsene er således effektive ved behandling av en rekke tilstander forårsaket av endoparasitter, spesielt helminthiasis som oftest forårsakes av en gruppe parasittære ormer betegnet nematoder, og som kan forårsake alvorlige økonomiske tap av svin, sau, hest, kyr og andre husdyr, inklusivt fjærkre. Forbindelsene er også virksomme mot andre nematoder som angriper dyr, for eksempel Dirofilaria i hunder, og forskjellige parasitter som kan infisere mennesker, herunder gastrointestinale parasitter, så som Ancvlostoma. Necator, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella. Capillaria. Trichuris. Enterobius og parasitter som forekommer i blod, vev og organer, så som filarier og ekstraintestinale stadier av Stronqyloides og Trichinella.
Forbindelsene har også betydning ved behandling av ektoparasittære infeksjoner, og særlig mot ektoparasittære artropoder, på dyr og fugl, så som blodmidd, midd, lus, lopper, spyfluer, bitende insekter og migrerende to-vingelarver, som kan angripe kveg og hester.
Forbindelsene er også insekticider med virkning overfor husholdnings-skadedyr som kakerlakker, klesmøll, museumsbiller og husfluer og mot skadeinsekter på lagret korn eller på kulturplanter, så som edderkopparter, bladlus og sommerfugl-larver, samt mot migrerende rettvinger, så som gresshopper.
Forbindelsene med formel (I) gis som et preparat egnet for den spesielt tiltenkte anvendelse, den spesielle art av vertsdyr som skal behandles og angjeldende parasitt eller insekt. For bruk som anthelmintikum kan forbindelsene gis peroralt i form av en kapsel, bolus, tablett eller flytende dose, eller alternativt, gis ved injeksjon eller som et implantat. Slike preparater fremstilles på konvensjonell måte i overensstemmelse med vanlig veterinærmedisinsk praksis. Kapsler, bolus-preparater eller tabletter kan således fremstilles ved å blande virkestoffet med et passende findelt fortynnings- eller bæremiddel som dessuten inneholder et sprengmiddel og/eller bindemiddel, så som stivelse, laktose, talk, magnesiumstearat etc. Et flytende preparat kan fremstilles ved å dispergere virkestoffet i en vandig oppløsning sammen med dispergerings- eller fuktemidler, og injiserbare preparater kan fremstilles i form av en steril oppløsning som kan inneholde andre substanser, for eksempel tilstrekkelige mengder av salter eller glukose til å gjøre oppløsningen isotonisk med blodet. Disse preparatene vil variere med hensyn til vekt av virkestoff, avhengig av arten av vertsdyr, grad og type av infeksjon og pasientens vekt. For peroral administrasjon gis i alminnelighet en dose på 0,001-10 mg per kg. legemsvekt som en enkeltdose eller som avdelte doser i 1-5 dager. Det vil imidlertid selvsagt være situasjoner hvor høyere eller lavere doseområder er indikert.
Som et alternativ, kan forbindelsene gis med dyrefo<A>ret, og i så fall kan en konsentrert fo<A>rtilsetning eller forblanding for tilblanding til det vanlige fo<A>r, fremstilles.
For bruk som insekticid og for behandling av skadegjørere i landbruket kan forbindelsene påføres som sprøytemiddel, dustepulver, emulsjoner og lignende, etter vanlig landbruks-praksis.
De angitte forbindelser oppløses i 1 liter 0,1N HC1.
Sporer ble høstet fra tre slike skåler og suspendert i
20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.
Trinn 2. 10 ml av sporesuspensjonen ble tilsatt til et glass som inneholdt 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Glasset ble inkubert og ristet ved 28°C i 60 minutter, hvorpå sporene ble vasket grundig med 1% NaCl-oppløsning.
Trinn 3. De vaskede sporene ble suspendert i 1% NaCl og blandet med et like stort volum 80% etylenglykol. Suspensjonen ble oppbevart ved -20°C og benyttet som cellekilde for gjennom-søkning med henblikk på mutanter. Den ga ca. 10<*> kolonier/ml ved spiring.
Dette sporeforrådet ble utspredd på YPD-plater for å gi ca. 100 kolonier per plate (YPD-mediet besto av 10 g/liter av hver av gjærekstraktene, Bacto peptone<*> og dekstrose; og 15 g/liter Bacto agar<*>, justert til pH 6,9 før autoklavering) ingredienser merket med stjerne leveres av Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238, U.S.A.
Trinn 4. Enkeltkolonier ble overført fra plater etter 2-3 ukers vekst ved 28°C og anbragt i individuelle brønner i en standard 96-brønns mikrotiter-plate. Litt av kolonien ble også overført til et friskt agarmedium for å tjene som kilde av levedyktige celler ved mutant-identifiseringen.
Trinn 5. Til hver brønn ble det tilsatt ca. 75 /zliter av et flytende M9-saltmedium inneholdende 1% glykose, 0,1% casaminosyrer og 0,01% hver av isovalerian-, isosmør- og 2-metylsmør-syrer. Etter inkubasjon ved 28°C i flere dager, ble cellene undersøkt på nærvær av dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer. (Hver liter M9-saltmedium inneholdt 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl og 1 g NH4C1. Mediet ble autoklavert, hvoretter 1 ml porsjon sterilisert IM MgS0A og 0,1M CaCl2 ble tilsatt aseptisk). Trinn 6. En mikrosuspensjon av 5% toluen i M9-saltmedium ble fremstillet ved kort ultralyd-behandling av den ikke-blandbare blanding. Til 25 ml av suspensjonen ble det tilsatt 1,2 ml av en oppløsning inneholdende [<14>C-l]-2-oksoisokapronsyre, 2,5 mikrocurie/ml og 10,0 mikrocurie/mikromol. 50 mikroliter av denne totalblanding ble tilsatt til hver brønn i mikrotiter-platen som inneholdt de kolonier som skulle måles.
Trinn 7. 1AC02 dannet i hver brønn ble fanget opp og registrert visuelt etter fremgangsmåten beskrevet av Tabor et al., J. Bacteriol. 128, 485-486 (1976) under tittelen "Convenient Method for Detecting <14>C02 in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants". Mutanter som manglet aktiv forgrenet-kjede 2-oksosyre-dehydrogenase dannet intet Ba<14>C03 utover hva som ble observert for kontrollene.
En mer raffinert metode som forbedrer kontrasten mellom en positiv <14>C02-registrering, tilkjennegitt ved en mørk flekk på autoradiogrammet som resultat av Ba<u>C03-dannelse, og et negativt resultat angitt ved manglende flekk eller en meget svak flekk, består i følgende modifiserte utsilingsmetode.
Enkeltkolonier (se Trinn 4 ovenfor) ble overført fra agarmediet etter 7-14 dagers vekst (i stedet for etter 2-3 uker, og bestemt direkte ifølge de ovenfor angitte Trinn 6 og 7). Trinn 5 av den ovenfor angitte metode ble utelatt.
En ytterligere forbedret bestemmelsesmetode som er kvantitativ med henblikk på <u>C02-frigjøring, består i å dyrke mutantene påvist ved de ovenfor angitte utsilingsmetoder, på et egnet medium som består av et M9-saltmedium med 1% glukose, og 0,1% "Syncasa-bcaa", (en syntetisk blanding av L-aminosyrer med tilnærmet samme sammensetning som kommersielle casaminosyrer, men uten L-valin, L-isoleucin og L-leucin; se nedenfor).
Etter vekst til høy celletetthet, ble cellene vasket i M9-saltmedium og resuspendert i et kaldt M9-saltmedium inneholdende 1% toluen og som var ultralydbehandlet for å gi en melkehvit toluendispersjon. Celle/buffer/toluensuspensjonen ble inkubert i 40 minutter ved 30°C for å permeabilisere cellene. De permeabiliserte cellene ble deretter vasket i M9-saltmedium og tilslutt resuspendert i 1/5 av det opprinnelige volum M9-mediumbuffer. 180 -liter av denne suspensjon ble benyttet per bestemmelse.
Et reaksjonsvolum på 300 -liter inneholdt de tolueniserte cellene, tiaminpyrofosfat (TPP), 0,4 mmol; koenzym A (CoA), 0,11 mmol; nikotinamidadenin-dinukleotid (NAD), 0,68 mmol; ditiotreitol (DTT), 2,6 mmol; MgCl2, 4,1 mmol; tris-HCl, 60 mmol; pH 7,5; og [<1/>,C-l]-2-okso-isokaproat, 6000 cpm., mikrocurie per mikromol. Telleeffektiviteten var 73%. Reaksjonen ble utført i 15 ml scintillasjonsglass som inneholdt et 2 x 2 cm Whatman #4 papirkvadrat presset inn i glassets skrulokk. Papiret inneholdt 30 /xliter IM Hyamine Hydroxide (IM oppløsning av metylbenzetoniumhydroksyd i metanol; fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, U.S.A.) som fanger opp <14>C02 utviklet under reaksjonen. Etter inkubering i 2 timer, ble papirene lagt i 10 ml Beckman Aquasol II (Universal LSC (liquid scintillation counter) fra New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118 U.S.A.) og radioaktiviteten målt i en væske-scintallasjons-teller etter stabilisering i oppløsningsmidlet i minst 4 timer. En blindprøve (dvs. - uten celler) ga ca. 50-300 cpm.
Mutant 1-3 og tilsvarende ga tall som var mindre enn eller lik blindprøven, mens opphavsstammen ga tall som var flere ganger høyere enn blindverdien.
Blandingen ble justert til pH 7 og sterilfiltrert. En volumdel konsentrat ble tilsatt til 99 volumdeler medium for å oppnå standard brukskonsentrasjoner.
Fremstilling av dobbeltblokkerte mutanter av S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) med manglende
dehydrogenase for forgrenede 2-oksosyrer og
avermectin- B- O- metyltransferase
Trinn 1. S. avermitilis ATCC 53567 ble dyrket som et sammenhengende dekke på New Patch agarmedium i 12 dager ved 30°C.
Sporene fra tre slike skåler ble høstet og suspendert i 20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.
Trinn 2. 10 ml av sporesuspensjonen ble tilsatt til et glass som inneholdt 10 mg N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG). Glasset ble inkubert og ristet ved 28°C i 60 minutter, hvorpå sporene ble vasket grundig med 1% NaCl-oppløsning.
Trinn 3. De vaskede sporene ble suspendert i 1% NaCl og blandet med et like stort volum 80% etylenglykol. Suspensjonen ble oppbevart ved -20°C og benyttet som cellekilde for gjennom-søkning med henblikk på mutanter.
Dette sporeforrådet ble utspredd på YPD-plater for å gi ca. 100 kolonier per plate. Kolonier av den mutageniserte populasjon (nitroso-guanidin-behandlet) Streptomyces avermitilis-stammen 1-3 (ATCC 53567) ble overført til et agarmedium fremstillet på følgende måte (gram per liter): fortynnet stivelse, 80; K2HPOA, 1; MgSOA.7H20, 1; Ardamine PH, 5; CaC03, 5; P-2000, 1 ml; FeSOA.7H20, 0,01; MnCl2.4H20, 0,001; ZnSOA.7H20, 0,001; Bachto agar, 17; destillert H20 til 980 ml. pH ble justert til 7,0 med NaOH før autoklavering ved 121°C i 20 minutter. Etter autoklaveringen ble 20 ml av en steril 5% forrådsoppløsning av (±)-2-metyl-smørsyre pH 7,0, tilsatt.
Agarkulturene ble inkubert 8-12 dager ved 28°C. Celler (mycel) ble fjernet fra agaroverflaten og anbragt i 250 /uliter aceton. 25 /iliter av acetonekstraktene ble deretter avsatt på tynnskiktsplater (Analtech Silica Gel GF, pre-coated). Kromatogrammet ble utviklet i 30-40 minutter med etylacetat som oppløsningsmiddel og deretter tørket og påsprøytet 3% vanillin i etanol. Platene ble plassert i en ovn ved 100°C i 1-3 minutter, deretter påsprøytet 3% svovelsyre i etanol og igjen anbragt i en 100°C ovn i 10-15 minutter. Mutanter som manglet avermectin-B O-metyltransferase ble identifisert ved en forandring i det kromatografiske mønster; dvs. flekker som korresponderete med avermectin-B-komponenter (Rf ca. 0,54 og 0,42 for henholdsvis Bl og B2) forekom fremdeles, men flekkene som korresponderte med avermectin-A-komponentene (Rf ca. 0,69 og 58 for henholdsvis Al og A2) manglet.
Generelle høvtrykks- væskekromatografi ( HPLC) metoder Mobilfase:
150 ml vann
70 ml acetonitril
bringes til 1 liter med metanol
Kolonne:
Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100)
væskestrøm: 0,75 ml/minutt
deteksjon: UV ved 240 nm
attenuering: nær 6
Prøve-fortynningsmiddel (D):
35 ml acetonitril pluss 390 ml metanol
Standarder:
1. Innvei 0,5 mg avermectin A2A i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 2. Innvei 0,5 mg testprodukt i en 10 ml målekolbe og tilsett metanol til volum-merket. 1 og 2 er standard-forrådsoppløsninger; for
standardoppløsninger for kromatografi:
tilsett 100 /xliter (1) og 100 /xliter (2) til prøveglass og tilsett 800 /xliter mobilfase.
Prøver:
1. Ta ut 1 ml grundig ristet buljong; sentrifugér.
2. Fjern mest mulig av supernatanten uten å forstyrre pelleten. 3. Tilsett 100 -liter HPLC-vann til pelleten og
dispergér den ved hjelp av vibrasjonsmikser.
4. Tilsett 2 ml fortynningsmiddel (D) og bland grundig.
5. Filtrér og foreta HPLC.
De naturlige avermectinene ble undersøkt kromatografisk ved HPLC etter denne metode og retensjonstiden for de enkelte avermectin-topper dividert med retensjonstiden for det forekommende oligomycin A, som tjener som indre standard ved en gitt HPLC-bestemmelse. Oligomycin A ses nesten bestandig ved HPLC som biprodukt av S. avermitilis-fermenterincrer, og er det eneste produkt som ses på kromatogrammet oppnådd ved undersøkelse av de her beskrevne mutanter når de dyrkes i et medium uten syrene RCOOH, hvor R er som definert ovenfor, eller i et medium uten forbindelser som kan omdannes til syrer med formel RCOOH, hvor R er som tidligere angitt. En typisk oligomycin A retensjonstid er 12,5-14 minutter. Forholdet mellom retensjonstider (RT) gir et mer sikkert grunnlag for sammenligning av identiteten og utbyttene av avermectin-produktene. Den generelle rekkefølge for forekomsten av avermectin-produktene på kromatogrammet er B2, A2, Bl og Al.
Bemerk at Bla og Alb ikke er separert.
Retensjonstidene varierer 1-2 minutter fra dag til dag,
Eksempel 1- 4
Avermectiner fra Streptomyces avermitilis 1- 3 ( ATCC 53567)
S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) fra en sporulert V-8 skål ble inokulert i 80 ml AS-7 medium i en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble inkubert på et roterende risteapparat ved 2 00 rpm ved 28-30°C. Etter 24 timers inkubering ble 1 ml av helbuljongen inokulert i 300 ml kolber som inneholdt 40 ml AP-5 medium. Duplikat-fermenteringer ble foretatt ved 28-30°C i nærvær av 400 ppm av hver av de nedenfor angitte primer-forbindelser, tilsatt etter 24 timer.
Etter 312 timer ble 2 ml prøver av helbuljongen blandet med 8 ml metanol:acetonitril (390:35). Etter filtrering ble 50 /uliter prøver injisert på en Beckman Ultrasphere ODS-kolonne (3,9 x 250 mm). Kolonnen ble eluert med metanol:acetonitril:vann (89:14:7) under 0,8 ml/min. og eluatet fulgt ved UV-deteksjon ved 240 nm. Retensjonstidene for de nye avermectinene er vist nedenfor.
Eksempel 5
Cykloheksyl- avermectiner fra Streptomyces avermitilis 7881
( ATCC 53692)
Et dypfryst glass av kultur S. avermitilis 7881 (ATCC 53 692) ble inokulert i 100 ml AS-7 medium i en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble inkubert på et roterende risteapparat ved 200 rpm ved 28-30°C. Etter 28 timers inkubering ble 5 ml av helbuljongen inokulert i et annet 100 ml AS-7 medium eller en 500 ml kolbe med tre skovler. Kolben ble igjen inkubert på et roterende risteapparat ved 200 rpm. ved 28-30°C. Etter 24 timers inkubering ble l ml av helbuljongen inokulert i en 300 ml kolbe som inneholdt 40 ml AP-5 medium. Kolbene ble inkubert ved 28-30°C ved 200 rpm. Etter 24 timer ble det tilsatt 400 ppm cykloheksankarboksylsyre og etter 312 timer ble prøver på 2 ml uttatt og undersøkt ved høytrykks-væskekrornatografi som beskrevet i Eksempel 1. Under disse betingelsene ble de eneste avermectin-forbindelsene som ble påvist i fermentet, eluert etter 14,84 (54,9 mg/liter) og 31,46 (32,1 mg/liter) minutter som tilsvarte henholdsvis cykloheksyl B2 og Bl.
Eksempel 6
Sek- butyl- avermectiner fra Streptomyces avermitilis 7881 ( ATCC 53692)
Fremgangsmåten i Eksempel 5 ble gjentatt, men med 400 ppm ±2-metylsmørsyre i stedet for cykloheksankarboksylsyre. Alle øvrige betingelser var som beskrevet i Eksempel 2. Kun sek-butyl -avermectin-B2 (11,60, 12,40 minutter, 63,5,
42,4 mg/liter) og sek-butyl-avermectin-Bl (23,1 minutter, 105,5 mg/liter) ble påvist i fermenteringsvæsken.
Eksempler 7- 29
Fremgangsmåten ifølge eksempel 5 ble gjentatt, men under anvendelse av 400 ppm av hver av de nedenfor angitte primer-forbindelser. Alle andre betingelser var de samme som de som er beskrevet i Eksempel 2. Retensjonstidene for de dannede avermectiner er angitt nedenfor.
Claims (4)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et B-avermectin med formel
hvor den stiplede linje i 22-23-stilling utgjør en eventuell dobbeltbinding;
R<1> er hydroksy og forekommer kun når dobbeltbindingen mangler;
R<2> er 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloksy med
formel
R3 er hydrogen; og
R er en alfa-forgrenet C3-C8-alkyl- eller en C5-C8-cykloalkylgruppe;
karakterisert ved aerob fermentering ved 28-30°c ved hjelp av Stre<p>tomyces avermitilis ATCC 53692 eller en mutant derav avledet fra utgangsstammen Streptomyces avermitilis ATCC 53567, som har tilnærmet de samme morfologiske egenskaper som utgangsstammen og som har evnen til å danne de ovennevnte avermectiner, av et vandig næringsmedium som består av en assimilerbar kilde for nitrogen, karbon og uorganiske salter og en syre med formelen R-COOH, eller en forbindelse som kan omdannes til nevnte syre under fermenteringsprosessen, hvor R er som angitt ovenfor.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at R er cyklopentyl eller cykloheksyl.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at R er sek-butyl.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at S. avermitilis-stammen er S. avermitilis ATCC 53692.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US651287A | 1987-01-23 | 1987-01-23 | |
| US10782587A | 1987-10-13 | 1987-10-13 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO880262D0 NO880262D0 (no) | 1988-01-22 |
| NO880262L NO880262L (no) | 1988-07-25 |
| NO172447B true NO172447B (no) | 1993-04-13 |
| NO172447C NO172447C (no) | 1993-07-21 |
Family
ID=26675723
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO880261A NO172446C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin |
| NO880262A NO172447C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO880261A NO172446C (no) | 1987-01-23 | 1988-01-22 | Fremgangsmaate for fremstilling av et ikke-naturlig avermectin |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0284176B1 (no) |
| JP (1) | JPH0817694B2 (no) |
| KR (1) | KR900007937B1 (no) |
| CN (1) | CN1065277C (no) |
| AP (1) | AP53A (no) |
| AR (1) | AR244344A1 (no) |
| AU (1) | AU636709B2 (no) |
| BG (1) | BG48572A3 (no) |
| CA (1) | CA1338141C (no) |
| CZ (1) | CZ290312B6 (no) |
| DE (1) | DE3883408T2 (no) |
| DK (1) | DK175724B1 (no) |
| EG (1) | EG18796A (no) |
| ES (1) | ES2058244T3 (no) |
| FI (1) | FI90087C (no) |
| HU (1) | HU203130B (no) |
| IE (1) | IE62467B1 (no) |
| IL (1) | IL85119A (no) |
| MA (1) | MA21161A1 (no) |
| MX (1) | MX169293B (no) |
| MY (1) | MY102581A (no) |
| NO (2) | NO172446C (no) |
| NZ (1) | NZ223270A (no) |
| PT (1) | PT86582B (no) |
| RU (1) | RU2096462C1 (no) |
| YU (2) | YU47877B (no) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2054822T3 (es) * | 1987-10-23 | 1994-08-16 | Pfizer | Procedimiento para la produccion de agliconas de avermectinas y sus cultivos. |
| GB8807280D0 (en) * | 1988-03-26 | 1988-04-27 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
| GB8809232D0 (en) * | 1988-04-19 | 1988-05-25 | Pfizer Ltd | Antiparasitic agents |
| GB8811036D0 (en) * | 1988-05-10 | 1988-06-15 | Glaxo Group Ltd | Chemical compounds |
| US5030622A (en) * | 1989-06-02 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Avermectin derivatives |
| US5057499A (en) * | 1989-06-02 | 1991-10-15 | Merck & Co. Inc. | Avermectin derivatives |
| NZ238521A (en) * | 1990-06-22 | 1992-12-23 | Merck & Co Inc | Process for the conversion of avermectin glycone to avermectin mono- and disaccharides by fermentation with streptomyces avermitilis ma6078 |
| NZ240128A (en) * | 1990-10-15 | 1994-01-26 | Merck & Co Inc | Production of 13-beta and 5-beta ivermectin monoglucopyranosides from |
| US5250422A (en) * | 1990-10-15 | 1993-10-05 | Merck & Co., Inc. | Biotransformation process for the production of invermectin derivatives |
| US6103504A (en) * | 1992-03-25 | 2000-08-15 | Pfizer Inc. | Process for production of avermectins and cultures therefor |
| US5292647A (en) * | 1992-11-30 | 1994-03-08 | Eli Lilly And Company | Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith |
| CN1038330C (zh) * | 1993-07-05 | 1998-05-13 | 塞泰克斯公司 | 阿弗麦菌素的生产与分离 |
| DE69433112T2 (de) * | 1993-07-30 | 2004-04-01 | Pfizer Inc. | Gene, die verzweigte-alpha-ketosäure-dehydrogenasekomplexe von streptomyces avermitius kodieren |
| US5466102A (en) | 1993-12-16 | 1995-11-14 | Kennametal Inc. | System for coupling machine tools |
| GB9716567D0 (en) * | 1997-08-05 | 1997-10-08 | Pfizer | Process |
| GB9825402D0 (en) * | 1998-11-19 | 1999-01-13 | Pfizer Ltd | Antiparasitic formulations |
| KR20040045440A (ko) | 2001-09-17 | 2004-06-01 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | 농약 배합물 |
| CN101560535B (zh) * | 2009-05-26 | 2012-05-23 | 浙江升华拜克生物股份有限公司 | 一种基于代谢参数our补糖发酵生产阿维菌素工艺 |
| US20120196821A1 (en) | 2009-10-19 | 2012-08-02 | Roger Mervyn Sargent | Method and formulation for the control of parasites |
| RU2454420C1 (ru) * | 2011-03-31 | 2012-06-27 | Автономная Некоммерческая Организация "Научно-Исследовательский Центр Биотехнологии Антибиотиков И Других Биологически Активных Веществ "Биоан" | Цитотоксические полусинтетические производные макролидного антибиотика олигомицина а и способ их получения |
| CN104877925B (zh) * | 2014-02-28 | 2018-05-25 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 | 一种异壁放线菌和三种新的抗真菌maclafungins类化合物及其制备和应用 |
| CN116602242B (zh) * | 2023-05-08 | 2024-01-23 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 一种提高反季鱼苗成活率的方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE434277B (sv) | 1976-04-19 | 1984-07-16 | Merck & Co Inc | Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis |
| US4429042A (en) | 1978-09-08 | 1984-01-31 | Merck & Co., Inc. | Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds |
| NZ204074A (en) * | 1982-05-10 | 1986-05-09 | Merck & Co Inc | Synergistic compositions containing avermectins |
| NZ207655A (en) * | 1983-04-07 | 1986-09-10 | Merck & Co Inc | Synergistic veterinary compositions containing an avermectin compound and clorsulon |
| NZ210505A (en) * | 1983-12-22 | 1988-06-30 | Merck & Co Inc | Parasiticidal compositions containing avermectin or milbemycin derivatives |
| US4579864A (en) * | 1984-06-11 | 1986-04-01 | Merck & Co., Inc. | Avermectin and milbemycin 13-keto, 13-imino and 13-amino derivatives |
| ES8800986A1 (es) * | 1985-07-27 | 1987-12-01 | Pfizer | Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina |
| GB8606120D0 (en) * | 1986-03-12 | 1986-04-16 | Glaxo Group Ltd | Process |
| EP0240274A3 (en) * | 1986-04-03 | 1990-03-14 | Merck & Co. Inc. | Avermectins as growth promotant agents |
-
1988
- 1988-01-18 EP EP88300353A patent/EP0284176B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 IL IL85119A patent/IL85119A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-01-18 DE DE88300353T patent/DE3883408T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-18 BG BG82655A patent/BG48572A3/xx unknown
- 1988-01-18 ES ES88300353T patent/ES2058244T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-19 MA MA21398A patent/MA21161A1/fr unknown
- 1988-01-21 PT PT86582A patent/PT86582B/pt unknown
- 1988-01-21 CZ CS1988408A patent/CZ290312B6/cs unknown
- 1988-01-21 YU YU10988A patent/YU47877B/sh unknown
- 1988-01-21 CA CA000556996A patent/CA1338141C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-22 DK DK198800286A patent/DK175724B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 KR KR1019880000469A patent/KR900007937B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 JP JP63012461A patent/JPH0817694B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 CN CN88100373A patent/CN1065277C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-22 NO NO880261A patent/NO172446C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 AR AR88309889A patent/AR244344A1/es active
- 1988-01-22 HU HU88259A patent/HU203130B/hu unknown
- 1988-01-22 IE IE15988A patent/IE62467B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 NO NO880262A patent/NO172447C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-01-22 NZ NZ223270A patent/NZ223270A/en unknown
- 1988-01-22 RU SU884355097A patent/RU2096462C1/ru active
- 1988-01-22 AP APAP/P/1988/000077A patent/AP53A/en active
- 1988-01-22 MX MX026651A patent/MX169293B/es unknown
- 1988-01-22 FI FI880279A patent/FI90087C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-01-25 MY MYPI88000058A patent/MY102581A/en unknown
- 1988-02-21 EG EG3488A patent/EG18796A/xx active
-
1990
- 1990-05-21 YU YU99090A patent/YU47886B/sh unknown
-
1991
- 1991-02-15 AU AU71113/91A patent/AU636709B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5077278A (en) | Non-natural demethylavermectins compositions and method of use | |
| EP0276131B1 (en) | Non-natural demethylavermectins and process therefor | |
| NO172447B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av b-avermectiner | |
| US5234831A (en) | Cultures for production of B avermectins | |
| US5238848A (en) | Cultures for production of avermectins | |
| EP0313297B1 (en) | Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor | |
| US5240850A (en) | Cultures for production of avermectin aglycones | |
| US5387509A (en) | Ethylated avermectins | |
| US5525506A (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor | |
| EP0640142B1 (en) | Process for production of avermectins and cultures therefor | |
| AP64A (en) | "Process for production of B avermectins and cultures therefor". |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |