CZ40888A3 - Způsob výroby avermectinových derivátů - Google Patents

Description

. -

rsiSP ; V·'». :' "f *y«die*‘l8 «** w&**m výroby4«·»»** í**"**»1 i mt***» \ i; 0*4*á*jrM· ·#·*««*·♦ ...... ’;-: : "SS: - ΐ «rS^pBSlf^ y0to*Ave tti~\. :Mft»k, kur* mjí ryteto^m*ip*f»»i*ít>ii Wkp Host e také ýajieli výréba »«rotóeH ť*ařteetttecí kmenů .·'" ' jřlK·’ ' : ví:V " . m^h Straptomyo** averaitlli·» a to aejAPma i» eyedáÉttli* . ;pOC a, 31817* 31271 a 33272* ZvláStě dva aledhí kmeny jaou k diapoeiei v· zmrazené* fílyaované formě e byly získány ozáření* kmene mitllis ATCC 31867 ultrafialovým světlem* t evropském patentovém episuď· 814 731* uveřejnénéa 18· března 1987» který odpovídá ys patentové přihlááce δ. 886 867» podané 16* července 1986 se uvádí celé řada sloučenin, které jetu příbuzné ; ýříredaím nebo známým avermectinovým derivátům, aváak nejsou přírodního původu a mají nový eubstituoen v poloze 25· Při použiti posledního a uvedeigýeh organis-aů, který byl popadá" v evnepekém/pateiítovém spisu δ. 214 731 e« uvedený kmen odvozuje odfi, avermitilie U<

Sste 'j5':. :#3vpíi^^*......... m 4 *29 048 '##' popisují avévmeetiay

ryŽŠ +··, ^ř>| T :: ASCC .31271« Při použití tohoto mikroorganismu 3« možno získat zlepšená výtižky nových avenaectino- -výoh derivátů, substituovaných v poloze 25 v pří* padé, Že e« tyto mikroorganismy p Šatu ji na určitém prostředí. Každý a kmenů ATCC 31267, 31272, 31271 t HC11 12121 může také produkovat kromě nových 4·-rivétů, substituovaných v poloze 2$ ježtč různá množ· štvi známých přírodních avermectlnů, v nichž 3· aub· stituentem v poloze 25 ieopr©pylová nebo sek.butylo-vé skupina (1-matfaylpropyl)· : Uhlíková kostra avermeetinu, které bude déle znázorněna, 3® odvozena od acetátů a propionétú a eubatituent v poloze 23 přírodních ever· mectinů je odvozen od L-iaoleueinu (R s (s)-sek#butyl) nebo od L-valinu (R » isopropyl), jak hylo popeáno v publikaci fiaher a Mroaik, "laerolide Amtibiotise", Academie Press /1984), kap* 14·

Pod pojmem "známé" nebo "přírod* ní" avermeetiny ee rozumí ty látky, které jsou pro* dukovány 8· avermitlli* ATCC 31267, ATCC 31271 a ATCC 31272« přičemž eubstltuentem v poloze 25 je bul iae·" propyl nebo (8)-sek* butyl (1-methylpropyl)* Averaectin, ktirý wi^peloae 25 jiný aubztituent než isopropyl nebo eek·butyl (S)-formS se nazývají novými avemaeeti* ny nebo avermectiny jiného než přírodního původu*

Kmeny S. averaitilie, které d«ou uvedeny ve avrohu zmíněných US patentových §pi»ech produkují skupinu látkek, které se souhrnní označují jako C-076, fsto skupino látek «ostává s osmi iřu*·: tělně ©dlilnýchi svlek blízce příbuznýohaloučenin, které se obvykle označují jako 0*076,Ala, Alb, A2a, Alt»· Bia, Blb, B2a o B2b. Skupina Ma" uvedených sloučenin ϊΑθΙΚΡ5»0® ":J*í$jP0fp!& stituentem v polose 25 <S)-sek.butyl, ekupine "b" uveden^oh sloučenin zahrnuje ty látky, v nichž je aub-3titaente® v poloue 25 isoprepylový zbytek, Označení *ABa *B* se týká avermectiau, v nichž eubstituentem v poloze f je v prvnímpřípedl methoxyskupina a ve druh^ kydre^ Číslo mectiny* v nichž se v poloze 22-23 nacháal dvojná vasbo a číslo "2* b« týká evermeotinů,"3β|Λ«ΝΙ: jí v poloze 22 atom vodíku a v peleše 23 hydroxylovou skupinu. této piihlálky nebude užito žádných identifikujících označení, pokud jde o aubatituent v poloze 25 nových averaeetlnd. Označení AI, A2, B1 a B2 bylo zachováno pro nová aver-mectiny, jejichž strukturní vlastnosti odpovídají svrchu·' uvedený»^ vlastnosten dosud zn-áaýoh avereectinových derivátů* Μ tvorba Hutaní, proatýeh Minnoatt dahydrogenéey e-katoky#»lin postranního řatiaea již byla uvadena pro Baolllua gubtilie v publikaci flUeeka

ÍW··/ ' \ *. I taeudomonag: p^la;: * /; autant vlak nebyle ještá nikdy popsána v případ* lálo* li Streptomyeoe. '· ' ··."' ·; ’’: ' '·;}.· ’.··' ;'· ^ .'" :. ' · vV;'V.i/' > \·; ,;·’-· i..·..;':·'· .. v;; ?; .’ ·· j\; :. ..··.. V;. · ' . v '. '" -,. 'r'V: ':?!Í'\^. ;:JÉ||S*p&4^a*^ :* 3®tU), X» 1414 * 14ti (lfi$)« V. publikaci «· popisuj tahá formantaee f« everoltlil e Agly«l aa přltoanoetl ainafunelnu, čími ja možno loklaat siyianá prolukou alollk aflykanu ^Waaotim 8«. Stajssl taká při pás to váni S. airarai tlila .0*8#" vy· eooe produkčního kaono aa přítemaoati eineřunginu jako inhibitoru j^thyltranaforla loeháaí k proluko! avermaatinovyeh derivátů, které jaou proatl ©-«ethylová «kuplny na aglykona m uhliktvá· atom vpoloze Jav oleanlroaové dlaaefcaridováakapiny· -. /'--f/, · · , .' 7' '?''. V: '-W .:.;:·· ' : .-'i '' Vy./V../:' VyOv/ v- '; ‘ . //Λ' ·· ý . ;'·.·; ·'-·.·' ^.ó··^·^^'.· -O' - \'·' i ,·' ' '' Ί·' ' '; _ U* vMaatový ipl» «, 4 37» 3)3 popisu;)· ilmritatiajr, příbuet, atuplni 0-076 · J· jlrt, a ískóvéní pisto váním ISA»5218, což autanta kmene S. evermttilis AfCC 31272, získaná© zářením tohoto kmene ultrafialovém světlem. Uutaňte 3# identifikována jako ATCC 31780. Sloučeniny, příbuzné skupinš €*076, produkované fermentací tétomutanty nemají 0*076 furahoitf:krs^ Mimoto *^ ailti^ok tloktn lét§ kácfa došlo k odštépení jedné nabo obou oltamdroeov?«!k sacharidových skupin, kdežto v jiných látkách této v skupiny došlo k oxidaci ekupiny v poleze 5 na ket©« ; ^ V skupinu* ' : vých mutant S. pvarmijMis, které jsou schopné produkovat avermettinoyederivéty, v nichž chybí 0~methy-loyé akapii^y, byly popsány v publikaci Ruby a další, 6th Interttertional Symposium on tha "Biology of Aoti nomycetesM, Debreeen, laěarsko, 26* až 30. srpna 198$ a * publikaci Sehulman a další, Antiaierobial Agenta ,·.' ·," ,· -· l . · · „ -..:1: ' · ϊ. ·.. v:··.·'* '·’ : and Chemotherapy Ji» 744*7» (1907)* Rrvní a téchto skupin produkuje převážné ave»®ectiny B vzhlede® k • ·,··. · ·, .· . ti. ..'"V.· neschopnosti methylace hydroxylová skuliny v poloze 5 makrocyklického laktonovéh© kruhu* Druhá skupina tšchto mutant produkuj® 3 #-0, 3M-0*bis-demethylav#r* mectiny (avermectiny, která nemají 0*methylový zby~ tok'.jako eubstituoiftt v poloze 3 ne obou oloondro* ooi^eíi :*0jweae^ídoiřpk o^ftoíifc), lyl# látky se :' nazývají; doeotfeyleveraiotlay. třetí akupina autant :r iMHfcí schopna aethylaee v žádné poloze* V ;. V publikaci Schulman o dolil. 7od* .Proč» 44* 931 (1995) o· popisuje aoýiená pro dukce averaactinů 9 faraeatoeí S. avermitilieá za přítomnoeti různpeh látokf například sinefunginu, 3-adenoaylethioninu a S-edeaeaylhoaoeyeteintt^která inhibují methylaci hydroxylové skupiny v poloze $ aglykonová skupiny působením enzymu avermectlnu B-*0-methyltransferáay. Hutanty Streptooyoea evtr-mectilia, které nemají: poet o produkují zvýšená anožatví složek averaecti-nu B, ^ež byly rovnáš popsány například v publikaci Schulman a další, Antinocrobial Agenta and Choaiatry ih 6^ liutagonoení 0. aCermitilie jo možno získat mutanty, jimi chybí dehydrogenéza 2-oxokyaelin a - rozritrany® řetízeem nebo tranaaainé-za aminokyselin a rozvitvenym řetizcem. lutageneeou takto zíekanýeh jodnodušo blokovaných nutam, jo noi«* no dálo. získat ;*u&iÉltyf. d*hydrog*nízy2-oxo-kya»lin s rosTětvtnjfa ř«tlz<s*m, \. tak tranaailináza aminokyselin i roev#tT*Bým: fatla-£ e*m. Tytoeutanty álž nemá jí schopneaprodwkovat v*tií lanožetví přírodníeh avaa^aeetiwft v n#příto«noeti pující a neofiekávané,že tyto eutynta mohou produko- nosti elouííenln vaorce SCOOH, kd· R Miaaená iaepropyl, (S)-*»lc.butyl nebo jinou skupinu, tak, jek bude dále uvedeaonebo prekuraor uvedená sloučeniny. delt# ví* ce je překvapující, X# mutanty, jim* chybí dehydro-genóza 2-oxokyeeUn » rozvětveným řetězce® a které tedy nejsou schopné rozkládat Wsoleuoin aebo Wa- ,.. .··...- '....> ·,·..· ·ι.:. '·/ ·.· .·. ·' '. ... · -r,v.··· v .--.· :·.>ι ··. ι ,· . . - .. > .

Un, jsou schopné aeimilovat celou ředu slouXenin na rděné deriváty avermeetinu nepřírodního pdvodu, které jsou prosté přírodníth svenleotind· » yřbÉ*ŠÍI|^^ rozkládat L-isoleuein, Iirleucin nebo L-valin a požadují tyto tři aminokyseliny ke svůmu růstu, jsou schopné asimilovat také jiné sloučeniny za vaniku nepřirodních avermectinů, prostých přítomnosti přírodních avermectinů. uvedená, jsou pří-·: osmi zřetelní odlišných, evlak blízce příbuzných ' V-*oapei t M «nesené ieo- j^pyl nebo (S)-sek.butyl. Ťy%6;'%áA3^^ lovény vá podstat! distém stavu, jak bylo popsáno v US patentovém spisu' 8* '4^;Í«f';: ;:S; izolace je přinejmenším pracný* fři produkci nepří-rodních avermectinů způsobem podle *n-op*U$i patentového spisu d. 214 731 může dojít také k tverbš určitého množatví přírodních avermectinů v závislos-' ti na přítomnosti dehydroeenázy f-oxokyseiin s roz-všiveným řetšzeema ©minákyselin Svalinu a l»-ie©Xett-^ činu V: - bunce mikroorganismu S· avermetilis, který je ušit k pre4«ÍM$&y^^

Matnost «volit produkci bud přírodních nebo nepřítodnich avermectinů a tak snížit počet produkovaných vláken a jejich komplexnost na co nejmenší množství se současného zvýšení čistoty těchto látek e zjednodušení celého postupu by proto bylo velmi žádoucí*

Kmeny S* avermitilia, která nemají dehydrogsnázu 2«©xokyselin a ro«větveným řetězetm nebo transamtí^zu aminokyselin · rozvětveným řetězcem jsou produkovány mutací kmene $« evsrmitilis, pro dukujícího svsrmsetin, zejména mutacemi kmenů ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 nebo KCXB 12121« BelŠÍ mutací kmenů, které nemají jednu z uvedených vlast-noetí, je možno získat kmenů!, jimž chybí oba uvedené enzymy, Tyto mutanty jsou neschopné syntetizovat přírodní avermectlnové deriváty, pokud do prostředí, v němě jsou pěstovány, nsnl přidána alifatická kyselina sobsahem isopropylová nebo (S)-sek,butylové skupiny naho prokurzor táto látky. Tyto mutanty jaou sch&pná produkce přírodních i nepřírodních avermsetl-ni v případě, I· jsou pěstovány ve vodném prostředí sa aerobních podmínek za přltomnoasti příslulného primářů nebo sloučeniny, která je v průběhu fermen-taěního postupu z prekurzoru vytvořeno·

Tyto mutanty, jimž chybí ds- :hydřci^M®a; ·|-οχ©^βό1ΙΛ::;β. rozyltven^-řát izolují z kolonií po působení příslušných činidel fc, ' 11 i. f -áMeá. -temlk, art&Hutf »*H WM.l*itíU Vtffla·* t>o pokusu prekaeaj· kap#£l«$iie«k «ňafaného β^ ÍH$Ěff^Úá Í0la»ií P$l ΊΗΡΡ***< *»feetrétu, kte*# j^WýfrHW. f^Q^1«#~OÉůUVM*&MáÍĎVÁ$ ¥03# tJtMtKrlvaXMrerá Μ» t1*5-l-l-**®,l*”J"*»*W·· láftw Wpium»* ¥*««<*» *-e*olcy».lii» a ::i ;í\ ' -v. .-v1:--- .í',: .'··'.;..· ·.·.· .· '·.' '·-·.· ·' - 'V^- -'v '- ' - -:-.----:. ' -" '."·'·'- '-.V ; .-· -.· roeyftveaý* řatiaeaa»

% w**«aty# které nemají tvm»~ anlxi^'ÍÉiáii0lK9re0lÍ33, ·β laolujf * kolonií »0 «1 *é· I «ré «eaetiopiwfii *$«tu žit prostředí, které ne-fkM^0j^i8ol0tž0in, t-le«ei»t 0 Svalin, foetup se fípovédi tak, ta té jednotlivé kolonie, roatouoí tmT proetř*dí«9 0 glukosou, sk«0*b»xx «faraa a všeei kaseinu přenese do podobného pro- etřadi, které v«ak neobsahuje I^lsoleucin, L-leucin ' ·* ‘ ' -·* · * ř ' s L-valin. f&p*mé kieřé neobsahují pause transřerásu aminokyselin a ro«vltves#m fetiše** mého* TT«*ÍW a-eacekyseltny jako prpÉraox^' pro *$*©*. bu asermsetiisfi* #0 pfekvapnjíeí aneoSekávané, lf popsané mutanty, jita* ehybí dehydrogsnéza **»*©. hareelin * rosYltvaay* řetězcem a/nebo traneaminéza aminokyselin · roavétvanym řetězcem *í uohoYéYají eehopnoet produkce averaeetinů, svléfti nepřírodníeh avermeetlnů. Neschopnost mutant produkovat přírodní deriváty koenzymu A s alifatický*! kyselinami při” růstu na běžné» preetředí by mohlo být Xetálal mutaci v případě, žá by na těchto derivátech závisela** oeliatvoat membrány nebe v případě, že by nahromadění Pvpxokyeellny bylo toxické. Mimoto žádná mutanta by neměla produkovat acetyl CoA a propioayl CoA při degradaci L-isoleueinu a L-valinu, protož· je při tom zapotřebí enzymů, které mutanty neobsahují· ře-žadevek na přítomnost derivátů acyl CoAprobioaym-tézu avermeotinu vedl k očekávání* že mutanty by neměly produkovat ani nepřítodni evermeetiny, což se vžak nepotvrdilo* nepřítomnost dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným ře^ěseem v popsaných mutantách má za následek zábránu syntézy CoA e áey- ‘ levou skupinou alifatické kyseliny · rozvětveným řetězcem při degradsei L-iaolouclnu, t-leueinu a h-yalitttt: m^ítá-i ;:ímáiássfc&^^^ ; mectlnů* Podobnlmutanty, kteri^memsji;^ aminokyselin s rozvětveným řetězcem také nemohou , syntstizoéit^^^ .· ti oké ky zeliny ero z v itveným řetěíBcem^tekie --¾ nejsou schopné produkovat přírodní avermeotiny.

Jcteřéi»obft»lwijítpen8«lnéauaeaohoueyntetiaoT*t S-oxokyeeliny $ rozvětveným řetiseem aisoleucinu, leuoinu e velinu, přidaného do Sivaého prostředí řidnou transeainaeí. Druhou přlllnou Jé skutečnost, lo produkce 2-oxokyselin s rozvétvenýa řettseea o aminokyselin s rosvétvemým fetišem* v buňkách de eaesovdne nutností válené»* tlohto aminokyselin do fermestaéního prostředí* Přítomnost téchto eminoky* solili brání uskutečnění tito bieeyatésy o tím i yro-dukc i í-oxokysolin snáoým mecfaanienea potlač ení en-; : tyad a *p Itaou inhibio í pásohonio aainokyaelin# které áeoukon*8nyal produktytétobiesyntiajř.řrotoSe t-^Okekyeeliny, které #*ee subetrdto* pro dehydroge-nám» 2-exokyselin · roeritveoý* řetlscea nejsou pH* sp&sobe podle vynálesu se tedy utíydmutant, které ; neobsahují dehydrogendsu dvedenýob 2-oxokyselin, ««iont, které neobsahují oba střehu uvedené eneymy* ' «ota» k tomuto ú$elu užít jakéhokoliv mikroorganismu, ktárý je aož-no získat transformací, transdukeí, genetickou rtkom-binací nebo některými jinými genetlckýmipostupy při použití nukleových kyselin nebo ekvivalentního materiálu z popsaných mikroorganismů a tak přenesením vlastností těchto mikroorganismů ne další aikroorga-v niamy.

Pod pojmem "avermectinVnebo ?avexmu*et iný?, tak, jak se užívají v průběhu přihléě-ky# se rozumí sloučeniny dále uvedeného vzorce I, v nimž subetituentém P v poloze 25 může být jakákoliv skupina, která je v této poloze aaimilovatelné urfii-tým kmenem S. avermitilis, používaným v průběhu způsobu podle vynálezu·

Popsané mutanty jsou velmi oenné pro produkty nepřirodních avermectinů způsobem, který bude dále popsán a ilustrován jednotlivými příkla-dy« Postup je zvláětl cenný pro výrobu výhodných avermect lnových derivátů, tj. sloučenin, v nichž substituentom v poloze 29 je oykloalkyl nebo eyklo-alkenyl vždy s 4 až 6 atomy uhlíku, popřípadě substituovaný alkylovýu zbytkem o 1 až 4 atomech uhlíku, l-methylthioethyl nebo heterocyklieký kruh a $ neb# 6 •torny vkruhu & a obsahem kyslíku nebo síry, svlážtě 3-thienyl nebo 3-furyl·

Mutace určitého kmene čeledi > ifiraptpiiyóoÉ:'':^ se provádí známým spůsobe® a je ®ožno při ní použít eelá řady mutačních činidel, jakým 3sou například ; ultrafialová světlo, X~paprsky,přidání H-methyl-N'- ·' -nitro*N-nÍtroaogu©nidinu, ethylmethanaulfonétu, ky-; aeliny dusité^ a hořčičného dusíku, například K-ast^yl^ bie (2-ehlorethyl)aminu a podobně* Tvorbu mutací ja ao^no uskutečnit jak na apórdch, tak nevagetatlvníeh kulturách kmenů i# avermitilis, která jaouschopně produkovat přírodní averasctiny, je například možno použít kmene S. avermitilis áfCC 31272· p|StUpŮ*gÉ^ v oboru velmi dobře anámy, je možno kolonio, aíska-ně mutagenesí podrobit selekci nanepřítomnoat de· ; hydrog#ttá»y 2--oxokyeeli» e rosvětvenfm řetěseem při použiti biochamiekýeh postupů, která dovolují vy* -^Setřeni velkěho počtu bakteriálních kolonií, která byly podrobeny náhodní mutagenesl podlá produkce 14C02 se zvoleních £l4oi) 2-oxokyaelía s rosyětw-ným řetězcem, jak bylo popeáno v publikaci Tábor ψ daiží· d*Beot* -¾¾¾¾ fento postup spočívá y tom, že £ sepžetují lEoioais sIskeii^eh mutentve vyhloubeních mikrotitrační plotny no vhodná» Živná» prostředí, prostupnost buněk se evýží působením toluenu e pak kyselina 2-oxolsokepronové do každáho vyhloubení e prostředí, ©e vySetřuáe nsd tlivými vyhloubeníel ne pří toanoet enačenáho oxidu uhličitého*Je»ožno ' nebo kyseliny C1^l3*^®w*3-»etliyl»áiolaou mleto -evrehu uvedená kyseliny £H2*lJ**»ex©~ix©i»yř©ttOvá* : . Produkce snaženého #xidu uhllditáho ee snadno zjti* iuje tak, že se jednotlivé vyhloubení překryjí vlh· kým filtračním papírem* nasyceným hydroxidem ba*»·-tý«, aby bylo možno saohytit jakýkoliv snažený oxid uhličitý a prokéíit jej ve form* snaženého ukliži* tanu bernstáho «utaredledmflí* lhÍt^btyt ·||«Ι chybí dehyd**«endsa a-exeky*«Hn s roavžtvený® řetlsee* poskytují *uteradi«d*any* která ee blíží; té», která byly sískány od nanadlkeyanýeh kontrolnieh kálonM, to smamend* že matanty /mepredukiijá' žáámý marním# ; I// r»ir»bí dmllí uktoccn·*!’ >řl peatltí JdttlWrttiliv svrehu uvedeného dinidla, které může způsbit vznik mutace* : fekto sískené kolonie i· i*o-lují podle ntdoetatku transferézy aminokyselin « rozvětveném řetězcem, proto!e tyto kolonie nemohou růst ne prostředí Kf a glukosou bos přidání I»-ieo-leuiinu, ífleuolnu · l-valinu (XIV)· Všechny tři aminokyseliny musí hétvprestředí přítomny pro dobré růst kolonií. Mimoto se Ukázalo, !e autenty, neofesa-bující transaminázy nerostou na prostředích» doplň!·» méch vfieai třemi ketokyselinami, které jeou aubstré·» ty pro transaminézy* Jediné enzym tedy katalýzu je tří ketokyselin» * t©2-oxo->* ·.; -methylvalerové, 2-oxoisokapronové a 2-o*oi*ov«le- rovév::,:v;:':' . V::^jhá*ebttt^^ ;jimž chybí jak dehydroganáza'2-oxokyselln s roavět-veném řetězcem, taktraneemináza aminokyselin · ros* větvené® řetěscem, mají svláítní výanam, protože pravděpodobnost jsjich návratu ka kulturám, produkujícím přírodní avermectin ja výjimečně malá* Jednoduše blokovaná metalésy ee »a některých okolností

Krom» produkce požadovaných aleX" :{·.· proaukovaaýohdený® kmenem mikroorganismů mutegenesí, dovoluje taká opocení protoplaetd včlenění požadovat* ných aXaX z jednoho kmene nebo jeho chromoeomu do druhého kmene* například je možno opojit protoplatty kmene S* avermitlXle9 který nemá dehydrogenézu 2-oxo-kyselin s rozvětveným řetězcem a transaainózu amine* V·, kyselin « rozvětvenýmřetězeea skmenem,který tyt© enzyioy obsahuje, Simi mdže vzniknout kmen, kterému 'v;' - chybí pouze transamináza aminokyselin srozyětveným řetězcem. Je známo, že spojení protoplaetd je možno provádět v kombinaci požadovaných aXel z diyergent» i · niob linií.; Popsaný kmeni, evermttilis *TC-9P3; (A10C.; §3669), kierýmeobsafcujetranseminá^^ : s rozvětveným řetězcem,byl získán uvedenou techno- ; ; flaathostl mutamt, pokud jde o morfologii a o rtit v kultuře, byly popsány v t?§ patentovém spisu ě« 4 419 04t« Mutanty je možno odlišit podle nedoetntku dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řstězeem a/nebo transaminézy eminokyse- lin z rozvětveným řetězcem, jak již bylo uvedeno* _ ; · : .· . , ^ ·' ··. < ^ V.. Λ'·. ’’ fy/·.·'ι·\· . .i;--v branuje těmto mutantám produkovat přírodní ayermtotlny při růstu na definovaná preptřadí,'která je * podeta-il prosté allfetiokých. kyselin obecného vzorce HCOOH, v nimž 1 znamená isopropyl nebo (S)-sefc.butyl nebo eloudeniny, která je aeino sta uvedené látky převést v průbáhn feraentace. řexonomioké výzkumy, provódéné sbírkou American type Oultura Colleátton, potvrdily,

Se vlastnosti dve* nataat 1*3 a ifrttl», která byly -' isolovány svrehu uvedeným sledování* značeného oxidu uhličitého, jaou velaiblieká vleetnoetwa povodního ta UfCC 33W) .tvoří podstatná aáná řetleeS aper ail původní kmen, aatanta U*CC 5356®) praktie· ky netvoří veduiné ayeelium a opery, ^ avlak nepatrné anožství řetizeů «per, která vytvářejí, aá podobný ' «heraktér jako v případ* kata· AfCC 3U?Í# Xataata »1-©3S taká patrná Spatná vypSívS rafinosu jak· je· , Siný zdroj uhlíku, kdeit© mateře# kaen a matanta 1*3 Pařínéaa vypiívtjí* t aaiieh pokusech v|ek navy* užíval rmíinozu řád# a uvedených kmenů. Další vlast-nectí autanty ΙΟ·026 byla skuteSaost, Se tentek kmen produkoval menií aneietví aelaninováho plyacntn neS :í:||*hí^ÍÍ»lh£^^ ::;;.:va||:aeitia#i:AS> ATCC 31272 ▼ BS petentetás *pieu β,.'4 429 042 fttfeýl© meSno prokázat rdet mateřského kmen· opi muteait ne -•aeharóz# jak© jediném zdroji «Miku. Mutenty 1-3 » SL-026 »eae|í peset dehydroganázu 2-oxoky*elin e reitéttený* freiéeeem* Mutanta td$-U9 íáfOC 53*70), které j· dvojnéeobné deřieientní, byla zíakéna další suteei mutantu 1-3 CATCO 53β67). Mutanta JC-923 ' ' iáfCG $$$$$)§ která pyle zíekéaa epojeiií» pretepl**-tů, sá podobný tetek k mateřskému ksesl jek© astmat* i(j;.^·.:·^.·:λ í':"/: :'i:··Γ;:·'·;··ΐ;’v'"C4?^: '>-v:.^‘:í :; v:i:íf ;;f| ; Aaerioen Type Gulture CoUtction, Reekwill· . Meryliund,J l odkud je ; ;«|3iÍ^ ,’.· .'' o· V’:'· ·.· ·’...νΝ .'.’· ··. .,;- .·'·';'· .' -‘ · '. ·|ν\ 'Λ ’ ·':‘_l; '> + /'. ‘ N: ·,-<' ' · ' V'Í:.· · -·>νΛ fΐ,§| ▼ iouladu ·· zákonem* Vleohna osazení doetupnoeti ;::;|ÍmÍ;;:%adeA;^d^^ ; -jpdvedtt^ sdilt»g||^

Keždý z kmenů S. avermitilie ATCC 31267, AICG 31271, A*CC 31272 a BCXB 12121 je schopen produkce přírodních everaeetinů, které je možno osmažit obecným vzorcem X l1

kde přerušovaná žáre v poloze 22-23 znamená případnou dvojnou vazba, R1 znamená hydrexylovou skupinu pouae v připadá, še není přítomna dvojná vazbp, ** znamená 4'*(«-L*oleandroByl)-S-I>-oleaiidro-eylekupinm veoree

chj° t3 * atom vodíku neb© methyl · ieopropyl nebo (S)-sek.butyl, V US patentovém opiem δ. 4 265 se poplete averBectin obecného vzorce X, který je v poloze t# substituovaný methylovou o ethylovém skupinou* M1 znamená hydroxylovou skupinu s K3 snesené methylový zbytek. V avermeetittech jiného aei pří·* · rodního původu* které 3e aoino získat apůaobsm pedle vynálezu zneaené I odlidaý sttbstltusnt od isopropylo-v# noho (S)-eek.butylové skupiny* r·^

Blouéeaimyt kteréže možno užít při bíoeyatéze sloučenin obecného vzorů* I se" nacházejí v bono· S* avernitilis, Tyté sloučeniny, tQX~valia,; L«leueina Vlsoleueln patrnévetuím-31 do biosyntézy avermactinů přeměneu ne 2«exoky#e~ liny s následnou dekarboxylací těchto kyeelinpůso-bení* fiehydrogenézy 2-oxokyselin e rozvětveným řetězcem, eoučasně ze produkt váže na koenzym A· Přitomnoet těchto látek 3b přidanou současné tvorby isopropylevých derivátů a (S)-sek«butylových derivátů sloučenin obecného vzorce 1« což vytváří problémy při oddělování isopropylových a (8)-sek·butylových derivátů# prostředí s obsahem příslušného primeru produkují svrchu uvedené mutaniy sloučeniny obecného vzorce X nebo obvykleji suš* dvou nebo většího počtu sloučenin obecného vzorce I# v nichž 1 odpovídá poulítánu prit-meru. Mohou vznikat až Čtyři produkty# ktlrá se ob- -vykle uvádějí jako B-avermectin Al,f A2, B1 a B2 podlil osnaěení v US patentovém spisu δ* 4 419. 04t· Skup!· nou B 3# suhstitutat na; uhlíkovém atomu v poloze f|« 1 V případě, že B je cyklopentyl, mohou například vzniknout čtyři možné averaeotinové derivátyi

\ASM A ; b?v;· vd^^iá^eha ..:¾ |H|: hydroxyskupina oh3 dvojná vasba H hydrexyskupina H ©yklopentil avermeetin ΑΧ eykXopentyl avermeetin k2 eykXopsntyl avermeotin BX eyklopentylá avermectin B2 ? nepřírodníeh avermeetineeh je : aubstitueht 1 na uhlíkovém atomu v· peleše $$ ve slou* Ženinách obecnáho vzorce 1 odllěný od lfopropXylové skupiny, nebe od (8)-eek-butylové skupiny.

Sloučeniny obecného vzorce I, v nichž je přítomna dvojná vasba a které neobsahuji kydroxylovou skupinu je možno získat také a odpoví* dajících sloučenin obecného vsoree I* v nimž R1 snaaená hydroxyXovou skupinu a sloučenina neobsahuje dvojnou vazbu de3^ijjptae£*. Reakce se provédí :k|B tak* že ee -néhydroxylové skupiny* které ee nacházejí vpolohách f a 4"» například na· vázáním terč.batyldiaethylsilyléxyaCetylevé skupiny# načež se provádí reakce se substituovaným thiokarbC* nylhalogenidem, napříkiad se < 4**methylřenoxy )thio- ,v kerbonyXchXoridem s nésXedným zahříváním ve vysoko- ' ' 2§-~ : vroucím organickém roapouštidle, například v tri* ehlorbenzenu k dosažení dehydratace. V získaném , produktu se pak odštípí ochranné skupiny, čímž aa síaké nenasycené výsledná látka. fante postup spolu a příslušnými reakčními činidly a reakčními podmínkami byl popsán y US patentovém spisu č. 4 328 333«

Sloučeniny obecného veoroe I, 'v.,v/»lml .# anamenéatom vodíku, je rovnlž aežao aíe-kat a odpovídajících sloučenin, v nichž znamená methylovou skupinu demethylací. Tato reakce ae pro* vádí' tok,: že. ae na 9-»eth©xyelouSeninu vhodném způsobem chráněný derivát působí oetansm Řtiilaatým a výsledný^ ae pak hydro- lyzuje j! zfed?nou kyselinou na požadovaném 9-kato-dlouCeninu. Tato látka ae pak redukuje například při použití borohydrldu sodíku, čímž se získá 9-hydroxy-derivát. Příslulná činidla a reekční podmínky pro tyto postupy jsou popsány v US patentován spisu č. · - " Í;;>?fí:;;:55;-:·' 'i '

Obecného vsoroe X, 1 v nimi R «marněná atom vodíku a dvojná vasba není . přítomná^ fs možno .aísfcmt « odpovídajících sloučenin, které obsahují dvojnou vasbu a neobsahuji oub- ^ :S§itueiil R1 selektivní katalytickou hydrogenaeí , i. při použití příslušného katalyzátoru. Redukci je možno mekutoSnít například při použiti trio*(tri* fonylřo8fin)rhodiumchloridu s obsahem jednovazné-ho rhodia, jak bylo popsáno v uveřejněné evropské patentová přihlášce š* 0001689 a v odpovídajícím OS patentovém spisu S. 4 199 569# vydaném dubna 1980.

Sloučeniny obecného vzorce I, :v nÍaS;:|^ znamená atom vodíku, je možnozískat z :á;: odpovídajících slouSenln# v nichž R* snamoné 4#--(«-lr*oleandroeyl)-oc-L-oleandrosyloxyskupinu tak# že ««odstraní 4'-(«-l»-oleaiidrosyl)-ří-li-oleandro-sová skupina mírnou hydrolýsou působením kyseliny ve směsi vody a organického rozpouštědla, dímž se síské sglykon s fcydroxyskuplnou v polose 13* tento ’ ^lyk^-vSStípak: Isiiege^je^^ ženeulfonylhalogenldem, čímž ^ se *íakél3-dsoxy-Í3--halogenovený derivát# který se pak podrobí selek-: tivníté radjftei> ’ například při použití hydridu tri-butylcínu# Aby bylo možno sabránlt nežádoucím vedlejším raakeím jo žádoucí chránit hydroxylovou skupinu#; například navázáním ochranné terc.butyldimethylsilylové skupiny* tuto skupinu áe

pak možno snadno odstranit po prováděná halogene©i neb© redukci půtobením methanolii, kt*rý ©fesahuá· aa~ lé množství kyseliny. VSechny tyto postupy áaou «po-* lil a příaluánými re akčními Činidly a retkfiními pod~ míákaal při 3#áioh prevádání popsány v uveřejn&ié evropská patentová přihlááce 9» G0G2615* 1¾¾¾ ttiit při fermentaei S. avermitilis pro bioayntéeu averaeatin&^.-lak přírodního tak aepřírodaího p&voáu /1/-; / 1¾¾¾¾¾ .: áS : /ΐ/¾¾¾ /Í*:#fiÉSÉͧ!ÍB^ ..»í/v ·.- ‘1/ ,:' i-r' /11//1 - ·: lil// Tlllll-ll-1 lSpl'l£:/ ' *! Kl·' .¾ /l/|fe|r§i^^ —-'· . - “;/// ‘/v/· v - ··/ · .·'///. /? ' ;· ·. /·;.· _ : V ’- · /,-, ./--. ... ;/ //·//.‘K/ ’ j //.-' '., ;·, · //' / /- · :..'-/;V/'//// zlí lili .': / ' /·'._./ - -'. /· // .·· ;/ V;/· i1' ·'.;'·. ... ' - /í///-/////////ly/'1 y "ZÍ/v///; '/1·;

Slon aoyklickáho řetěsee nebo kruhu. · . - ' · ' ·:·.··.·. //' --/·..,-/·«-///-v/-;··:'/-; ··;·-·/ - ·'--/'v.1. -'.-''·-'.·;;.‘: ·. '·' . / /*/ ··:

Substituenl R, který se ηβοϊιέζί: v poloz«25 může tedy být alkylový zbytek, alkeny-levý', zbytek, alkiayXový * elkoxyalkylový nebo alkyl*·, thůoalkylový zbytek vidy o 3 až 8 atomech* uhlíku, rozvětvený v polo*® «, cykloalkylalkylový zbytek o 5 ež 8 atomech uhlíku, v nímž alkylová skupina t obsahuje $ až 5 atomů uhlíku a je rozvětvena v poloze a, dále cykloalkyl o 3 až B atomech uhlíku neb© cyklo©Ikony1 o $ až 8 atomech uhlíku, vždy popřípadě substituovaný methylenovým zbytkem neb© jednu nebo větším podtem alkylových skupin e 1 ai 4 atomech uhlíku nebo atomy halogenu, a to fluoru, chloru, jodu nabo bromu,, dále heteroeyklieký zbytek o 3 ai 6 atomech v kruhu a obsahem kyslíku nebo síry, a to nasycený nebo zcela nebo částečně nenasycený» popřípadě substituovaný jednou nebo větším poštám alky-lových skupin nebo atomů halogenu*

Sloučeniny, které je možno převést na sloučenlmyobeenáh© vzorce »0bb8, t j* prekur^ sory, které je mošno v průběhu fermentašního postupu na tyto sloučeniny převádět, je mošno vyjádřit obecným vzorcem ΙΪ-Β kde £ má svrchu uvedený význam, znamená skupiny -CHVOJI, *CBOf *Ciyaít# -C0QR4 ! kde ' . J· : R znamená atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 «Η atomech uhlíku a R^ znamená atom vodíku^ elkyloyý zbytek’, o 1 až 4 atomech uhlíku nebo zbytek aminokyseliny* zvláltě asperigové, glutaaové nebo methioninu, například . -CH( CGOH) CH^COGH* ^CH(COOH) m^^COOM a -WeoOHMCHg^SCH^ jimž chybí pouz* trensemináza aminokyselin s rozvit-veným řetlzosa mohou s-oxokyseliny být použity jako prekurzory. To znamená* že tyto kmeny jsou schopné H - CO - f ÍIW)

# -.¾ ?ΐ· ίϊέ'· -¾¾

Po oboru vynáleau spadají rovněž iaomerní formy slOaSsain obecného yserefc ΙΪ-Α a i-::4^¾¾¾¾^ § %|fc#»|íjtÍlj^ měrních averaectind m uhlíkové® sternu v polože & při jejich použiti# 3-^>'·· iWlfe^íiK^^iÉří'íiÉwíilttiĚy^^iM»í^ÍÍÍiŠS®iÉ^^ šitilis, jemuž chybí dehydrogenáse ?-oxokyselln s ; · rosvitveaým řetéacem a/nebo transsmlaása aminokyBelin a rpsvltveným řeUeeem ve vodné® živném proetředi, 1 ' > " t , t ) > „ ^ ^ které obsahuje využitelný adroj dueíku, uhlíku, anorganických solí o sloučeninu obecného vzorce SC0OH ne- 5 · > - 1 > t » bo aloučeninu, kterou je možno na tuto látku převést ' ' ' v prftběku ftrmentaoe, t j# prekureor. Kyselina nebe -r ' elouéenins, kterou je možno a·-tato kyselinu převést** •t do «< fementaéního prostředí -přidává při naolko- ‘ ; vání nebe v urSitých .^flervelooii-v' pr&btiut řerseuts* > ; «ή* V případ#, že se užije autania, která neobsahuje traneeninázu, stasí prostředí obsshovst Ii-isei*uet!*f

mvermoetimu j# mošno sledovat tak, Sa a· odebírají ^fcerky' fermsntačního prostředí, tyto vzorky se eartra· ;itt jí organickým rozpouštidlem a pak se užije: obříma- ';. togrefie, například vysokotlaké kapelinovéchromi-:|Íésgédfle«v/;ÍÍjw -,. dotáhne maximálního výt*žku výsledného produktu, za c obvyklých podmínek 4 aš 1? dnů* ·" S výhodou se přldévá evrchu i.vedená sloučenina, :.a to karboxylová ^ kyselina nebo·.. i lo»-danlna, kterou je možno na tuto karboxylovou kysali-nu převlát v množství 0,05 až 3,0 g m litr* Sloučeninu je možno přidávat kontinuální, přerušované nebe je mošně přidat ealé množství najednou* Kyselinu obec* ného vzorce KCOOK je možno přidat jako takovou aobo ve formé soli, například ve formě soli sodné, liihné '; aabo amonné nobe va formé slouianiny, kterou jo itoB-no :n«^tdéiiettjiž bylo úvode·* no. y případé, že se kyselina neokáži v pevné tmmi,: a výhodou e* rozpustí ve vhodném rozpouštědle, nnpří-' kladve vedl nebo [:v alkoholu © 1 až 4 atomech uK.íku*

Prostředí, které et užívá prp fermentaci, mdle být, a to svlálti v případě, že aubstituentem v poloze 25 má být isopropylový sbýtek nebo {S)-eek.butylový zbytek, některá a obvyklých prostředí, která obsahují využitelně zdroje uhlíku, dusíku a stepových prvků. V případe, Se eubstituen-tem v poloze 39 má být skupina, která ee v přírodních avermectinech nevyskytuje, tj* skupina, ©dližná od isopropylová neb© (S)-sek^butyiová skupiny, je £er-nentefiaí prostředí velen© tok, aby svolená oloiky neobsahovaly látky, v nichž P snesená isopropyl nebo" {S)*sek*butyl, nebo aby obsahovaly pout· velmi malé anolstvl těchto látek. ^--itenK* několik dnů při teplotě, pohybující se s výhodou v ros*· ;;:ue»í· °C ee řementaání prostředí odstředí . nebo zfiltruje a takto oddělená ayoelium se extrahuje, a výhodou při použití acetonu noho aethenolu. Organický extrakt se zahustí a požadovaný produkt se pak extrahuje organický* rozpouštědlem, míeitelným { a vodou, například methylenchlorldem ethylaaetátem, chloroforme*» butanolem nebo nethyllsobutylketenem* takto získaný extrakt se pak odpaří do sucha a takto sísksný surový produkt s# pak dál# čisti podle potře·*' by ohrematógrařlohy, například při poulí ti přepona-tivní chrometografie v reverzní fázi nebo vysokotlaká ^káphli^ .. - JiL;-; 5:¾¾ 33 m , /¾¾¾ ' -V · · . ;·. . ·...· :'· :-:. ,v /// -v.·.;!;* .·. ¥3feled«# produkt «0 efc«p*Xe «*·- , kárá jako eai* «loučenin obecného tiW* 3« ▼ »*·* ' a-rojaá T«*b« jt fHtm*. »3 wttaeai ·.'. i 0“7- ·' 1 '. .'i: '··'i; · . < ·, '····. vyl.'V, .··'' 1 ..· - ' />. .''''''.'''Jí.';.,'.'·· •thjrl. FoMly tMkto líttk · ulta riMt * .-.- . I·. ;/v ·?////'·, "//r·!:/ - --¾;/¾. ·;· ·>..;'·,vj . - .:v>-//-,,-/“ν'*. ·;ί·. -·':' v· -v!’ ·'""·: ."/-'"v·1' i?;,- ti 31* použité auieaté a priaero * ▼ *óvi*lo®ti *»a po· ’ : -; - f ho o je jlck prekuraorů nemaži žádný poáetatný vlilr na produkci avermectlnového derivátu, lúřltickýa poiedav-. kaa sta provádéni *pů*obu podle vynéleseu pr© výrobu v pr&béka ferBaataéaiko pogtupu. deko prieery je «plno atít, etjmá- -. &;Sjý«iJLip8Í|^^ $Ι$|ίΙ©ίίβί$ΛϊΙ^^ .·;.- v/í/X;:-/.-/ V;///'//í> •-.-'íftS/-v.: λ ;/- /fi;-Í5'v-i/í‘‘;aS;i:ai kyeelina 4,4-difluorcyklohexankarboxylová ye í&m* lithné soli, kyselina methylencykloh®xsnkarboxylová, ·- . 1 kyselina X-methyleyklohexankanboxylová (ois/trans) kyselina l-cyklopentenkarboxylovó, kyselina l-eyklopwiiiexinkarboxylová, kyselinatetrefeydropyran-4-kanboxylová, kyselina thiofea~ 2~karboxylová, kyseline-J-ft-furankerboxylové, .kyselina f»ehlertki©řen*4*4tai^syl0Tá^/ .kyselina cyklobuteankarboxyloré, : kyselina eyklopentenkarboxylovó,. ... ;:kýasliaa ,;eyklel^kj^^es^ kyselina cykloheptankarboxylová, kyselina P-asthylcyklopsopenkarboxylové, kyselina 3-eyklohexsn-l-karboxylová, ..kýseliiia... a-asibylprepisnoTe, , kyselina y-methyl-4~»ethoxomáeelná* hydroxyoethylcyklopsntan, ř5É^eíeito^ :|^se3-fik:; |?«|kiel^ kyselina 3-cyklopentylpropionová, kyselina tetraíiydrothiofen. 3-karboxyloirá,

..'V 3-ffletbylcyklobut*mkarboxylová kyeelina, ve formi litlmé soli, kyselina S-fluorcyklobutankarboxylová, kyselina 3-methylencyklobutenkarboxylové ve fprmě lithaé *©H, - kyeelina g-aetbyl^mettoylthioeMiaelné, kyaallna tetrahyércthiopyran-4-k»rboxylovéř cyklobutyXmethylamin, etbyleaklobutamkerboxylát, . ::.';^h.'- - v:; •thyletter kyseliny 2~{3-tbi©fenkarb©nyl)prepieiievár ; ;.λv::; Γ:;: V':; ^r.Λ;;;;:;; j i'-

Mutenty a obsahem O-aatliyltran·-' ferázy^e aoSn© získat s autant, které na obsahují defaydroganás® 2-oxekyselin « roavětvenýa řatéacam a/nabo t mutant, které neobsahují trans aalnáeu ami nokyselin a rozvětveným řetězcem* Mutauty, vnichž se mutace 9 pokud $áe o tífiinnost dehydrogenázy mako-kyselin a rosvStveným řatSecem a/nebo transimindiy aminokyselin e rozvětveným řetSecem kombinuje eg mutací jedné nebo obou O-methyltraneferéz poskytují s* averaitilis, které při přidání sloučenin obecného vzorce HCOOH nebo sloučenin, které d· aoš-no ne tyto látky v průběhu feraentaee převéet pro· dukují primárně everateetiny 0, demethylcveraectiny nebo demetkylavemeetiny S*/ÍyiO «utnuty *e:, aíeké* vaflí dalii mutací mutent# jim* chybí dehydrogenáea 2-oxoky*elin · recvitvaným řetésoem a/neb© trna»-amináaa aminokyeelin a reavéiveaým řetéeeea. půaobe*- · Λ nín ultreďialováho »v#t«* Wnebo chemických autage* stá· dek© d»ou například K-m*thyl~M-nitr oeourethen# nitroeo«uanidin# et^laotkeneulfonát nebo dimá dintd* la, tak# |ak byla svrchu uvedena* llutanty# která Όβ<·. ma^í dehydrogenázu £*©xokyeelin s rozvětveným fatlé* ; eea nebo nenají trensalnéZu aminokyselin a roavetTe- · ným řetásce» a nened* d«dnu nebo ob# o-methyltrsns-_ ferásy, d* možno dále měnit působením ultrafialového : ilautenty# literé::|c®a; :¾¾¾¾íí noitídahydrogcnáEyS-oxokyeelinarůBvitvanýařatda- ^e-:i^*vitlii^:'ia^ váný autantani tohoto typu#jeou cheraktcriaovány ; přítomno·tí bydroxylové akupiny na uhlíkovám atoau

aýnaba atomech, která se nacházejí v polohách 3* nebo 3* oleandrosových skupin· ;=E;#iwr*li».: uihíIíÍÍM': ·ΐήκΐ||ίΛΐ^;;. .1' no identifikovat způsobem, který bylpopsán v publikaci 3ohulaan a dal»í, Ant iaiorobial Agent* and ehemothera^f#;'l|fi 620 - 624» (1SŮ6)· Avermeetlnová deriváty* které je aoSno získat připouMití těchto mutant lze ulít ke «tejný· áčelům a «tejný· způsobe» jako mámě averaeotlnová deriváty·. fStlí waeiství averoectinů S včetně těch látek, které neobsahují methylová Ska-plny:na oleandrosová diaebherldovéskupin*, je »oi-no 2ískat taká tak, Se «« pěstv^i saitantyV získaná ^:, některý» ee «vrchu uvedenýeh způsobů, která nesiají dehydrogenázu 2#oxokyselin a rozvětveným řetězeem r: β/nebo transaminázu a»inoky«elin « rozvětvený» ře- ; tězcea obvyklý® způsobem ze přítomnosti látky, kte- .> ré působí inhibici déinnoeti 0-Bethyltr^«faráeyf jako je například einefungin, 8-adenoxylethionin »«bo. S-adenosylhomoeystsin. : -z Sloučeniny, získaná apůoobes C podle vynálezu jsou vysoce tí činná onilpa^titdlai /:4 látky, která je aoíno udit ae jaána jako enthelain-tike, ektoparaeitloidní, ineektlcidní a ekarieidní prostředky.

Svrchu uvedená Zátky jsou tedy účinná při láčbS různých stavů, která jsou apůsobe-: ay endoperesity, ,· tesejaána helalnthiásy, která je áejSastlji způsobena skupinou parasltlekýck hlís-, tů, která ee oaneSují jako nematody a která aobou «působit tižká hospodářská ztráty u vepřů,eve£, ^ Umí a okutu 1 u dalíioh hospodářských zvířat, vdet- delším nemetodůa, kteří napadají aejrlaaaějll «eledi avířat, jako jaou například Dirořileria u poů, a pro ti dalě ímpareaitůa, která aohounapadnout i člo-vákevče tni ;pípMS^g /;ájiÍ^íS|jj|^ - vd:; jakO:';^ AnoyiosioaarReeator, 4»όβ^|^::>|ΐχ^^|,:g ee ,· des*' írinohinelia,; Capilleria, trlehurie, #steř©^ • teká a vSetnS parazitů, která ae nacházejí v|kr|i('ai: dalších tkáních, jako jeou Servi a miao střevní stadia Stronayloldes a Trichinella.

I 1 při:.iáěběekiopsrasttáriiíeh 'inřafcait kte^ aahrnudí «« jttéAtt mttpV&pQŮět :?í chy, ovádi, bQdeaAy, deXeí bodavý brnya « t«kd eigru- v jíci larvy čeledi dvoukřídlých, ktaré nohou napadat skot a koně· -:v'^ ticldní dčinalc proti doaácía Ik4deůa, d»ke deo»* **- příklad ΙτέΟΙ,ηοϋ a aowohy doaácí, Jsattaíiímá i §Í|ÍIÍ. dalcoi l proti algrudícía dadineda rodu orthaptara. podávají ve terně prostřadfed, které $·*« přiepisoba*-ay tpaeiřiokému použiti tfahta létak a potřabáa hoa* titala, ohled de «apotřabí všit také na to, proti daldaa peraaitu neb© hnyssu d»«« eleadaainy použity. V případě poulit* dak© antbaJjitatika d· aolao slou-fieniny, síaka&é spdaobea podle vynéiesu padat par* ©rálal d·*® kepe&i# bolus, tablatu nebo v kapalné foÍMt naho Je týt© látky aožno podávat indelcěn* naho i v implantovaná formě. viaekay tyto prostřad* : ky d# aožno připravovat běžným spdeobam. Kapala, hala* naho tableta pa přípravný! tak* 2a se dělané ©lelka misi s vh©a»ý*dÉ«aě Pjf^teefa^a řadldia*

7 1/ /

» X > .‘“'ý

'tf

IfÉ

nebo nosiCem, který dál# obeskuje ježt I. δinidlo, napomáhající rozpadu a/nebo pojivo, například škrob, laktesu, mastek, steeran hořešnatý a poddbnl* Ke-palný prostředek v je možno připravit tak, 2a aa díln-ná látka disperguje ve vodnáa roztoku spolu a disper-gaěním šinidlem nebo sméčedlem a podobni, prostředky pro injekční podání je možno připravit například ve formě sterilních roztěká, která nohou obsah©vat ještě 'další složky,.například dostatečné množství solí nebo . glukózy,:. aby byl roztek isotonický 'M/Št&ri#· fyta pro* -·: středky budou obsahovat rázná množství účinná látky v závislosti na .t|pu pu infekce a na hmotnosti hostitele. Při perorálnía podání as obvykle podává dávka 0,0$1 ai IP mg/kg baotnosti v jediná dávce nebo rozděleni selkám 1 aš 5 dní, zásadní ja však možno použít i vyšší nebo nižší dávky. ' . -¾

Sloučeniny, získaná způsobem . podb . vynálezu je možno podávat taká 'r:íř;·. zvířata, k tomuto álelu je možno připravit také ^íslnlná koncentráty á přídavná krmivá, určené k promíchání s běžný® krmivém* Při použití jakoinsekticidy e proti zemědělský® škůdcům se slouleniny, získaná apůaobea padla vynálezu užívej! jako postřiky, popraSky, tmít· a podobal bliaý® způsobem. farnantace 9· av*rmitill» X-3 (AJCC 53567)

Stupeň S. avermitilia AfCC 31273 e© pěstuje v souvislé vrstvě na svarovém prostředí (Kew Pateh) po dobu 1* dnů ppi taplotl 30 °C. tlil je*· živného prostředí * nésladujícím aloženími ; a«ar " 1$ grand 1000 *1 1,0 gramd/1 $o a«/i 50 ag/i ·’ V'· ·. Ai voda do ostaň sodný. 3H?Q kytalina ieovalerová kyselina iaomáselná kyselina mtthylauáaelné >ϋο3,οή«Ιη.:^: ; letíc 1» sgo at/1

roli» m ag/X roztok otopových prvků** i al/1 * «láva T-8 3· směs ošal zeleninových Slav (rafejte, ****** ««lak* řepa, petrSel, salát, řeřieka a Špenát), soli, kyseliny eepergové a eitreaevá a přlreáaíeh příchuti (Oaapbell Soup Coapaay* Caaden Η·«Χ·)· X3t eloSení roztoku stopových prvků t anoSství v , 4*2 CaClg 11,0 0,65 ZnCl^ 0,68 0,54 1 litru 0,1N SOI· ' Spory #t sklidí tm %H ploten « uvedou «o do suspenze ve SO 110,091 trla-pufw» « kyselinou maleinovou o pH 9»0. ; .'''-.'"V:·· \·· lefcvi8ky o obaeheia It mg U-m»tl&l~U*-td%r&~1tenttr09Q~ guanidlnu (HTG). Lahvidke eo inkubuje m protřepdvdní :^0Í kleto* preoyjí li rottokem cbloridú sodného.

HtttDflB &·ΐ· yfŠÍ;^

Jteaayté spory se uvedou do sus-P*n** v rostoku chloridu sodného a suspense so 1 *·*<· ·· ateáaf* fb|t*** dpi otbyloziglykolix^ foto •uspěna# »· uohevdvd pfi topl*td-ie.*C a uiívd to ;Ja~ I» adroá btuték, které se sledu** sta příteeaoat Wt^t· i tohoto aaofitví 4« ateisto získat přibliiiid 10* Re* *· ;4|r|^o^Í^ i; % j i. v ΪΜ ..A‘j ’ · ·*$.&: ',· ;-/ Γ *>,£·': m lil

:¾¾¾ •A: Mauttfaft

5¾ 3¾¾

lonií na jedné platní* Prostředí ΎΊ?Ώ obsahuje vidy X® g/X extraktu s kvasnio, paptonu Baoto a dextrosy prostředí 1« upravuje ha pí S,9 přad aterillzaci v autoklávu. Složky, ©snalené {x)ja možno získat od Bifeo Leboratoíraa* Detroit, ;|íéklfktt:^f3«· ffitubažLá;:

Jednotlivé koloni# a# izoluji z ' ploten pa a až 3 týdnech růstupři teplot! 28 dC a uloží se do jednotlivých vyhloubení standardní mikro-titraftní plotny s 96 vyhloubeními. hal! množství" každé : bulimie' jajtakd: nanese na čerstvé agarová prostředí, 7aby;hyl^;:l®iiie;::8|»kht Životaschopných buněk y připadl, 2« by kolonie byla identifikována jako mutanta. s^b»ž ? ;

Po každého vyhloubaní sa přidá přibližně 75 aiktelitrd prostředí kf v kapalném sta-vu o obsáhán 1 i glukosy, <5#1 % amlnokyetiin «.. ke- «•lnu a 0,O1 % každé % kyselin leovaXar@váf Í»®~ nástin# a 2*mt thylaástlné * Fa nlkolik* dne®h inkttba-; ## #1 : ttplatS přítOaBOSt:' étltydrogenósy p-oxokyšalin a rosvátiřtiiý» řstSecem. lil# prostředí M# obsahuje 6g hydreeanřeařorsdnanu sodní ho, 1 ddihydroeea-fosfareSnanu drbselnáhQ, Q,$ & ofelerída sodného a (1 i chloridu anoirnáb#* Prostředí' se stariliattde * autolclévuepakaepřldélmlstarlUaoTwaéíaolMsí-ranu hořeíínetdho · 1 *1 0,111 ehleridu vépenstéko za aseptiekých podmínek. :¾¾ i likrosaapena· 5 # tdineaa * prostředí m «i pl$p*a*l tak* it #« neméeiteinó sais. podrobí působení ultwvnktt* E..i5 al pískaná suspen-as sa přidá l#f nl roztoku s obsáhám [14C-ll-g--oxokepronové kyaaliny ¥ mnoistirí 2,5/uC/eiI a 10,0 ; ^uCjf^a*ol« f© nllešalibrů tát#, «misi sa pak přidá do ks§dáh® vyhloubení nitretitrainí plotter, která obsahuje zkoumaná koloaia* , irs6»i.lea3at— éív jednotlivých vybloubeníeb *š:_ saahyauje a stane- ; ví způsobe», popsaným v publikaci Ťabor a dalii, <?· Bacttriol· ^|, 489 - 486 (1976) "Conveniant Method ; tor 8atacting ^%0g ÍR kultipÍ· S«e^l«a: A|^lÍaatioii ^toΐ ftapid.. Sereeaiagřor ílutant»"* ISutanty, ;;kp*4 :íip$í:vdsli!ydr^ea^^ rozvětveným řetěz cem neprodukují vitilí mnoěství značeného uhličitanu barnatáho neá kontrol^ kolonie.

Baliím způsobem, který slepiuje kontrast mas! kontrolními pokusy a positivním poku-sam mm snovaný oxid uhliditý bylo aošm| prokázat tmavou skvrnu na autoradiogramu tvorbu znuděného uhličitanu baraetébé* kdežto.;negativní výsledek maní vyznačen žádnou skvrnou nabo pouze velmi světlou skvrnou· ifednotílvé kolonie va svrchu uvedené® stupni 4 ** odebírájí * agarovéhoprostředí ďil pa 7 al 14 dneeh růstu a nikoliv až pa dvou att třech týdnech jako svrchu a pak se pří*o sladují podle svrchu uvedených stupňů 6 a 7* Původní stupeň 5 sa v tomto připadl yynecká·

MU citlivější zpúaob, ktwtfm · .···· ··.·.·.·. *_“ ' · . . , . ja mošna kvantitativná «jišlovat uvolňování «nadaná* ko oxidu uhličitého spočívá v tom, Sa ·« ajištiná mutanty pdatují na vhodném proatřodí, ktavá saatává z proatřadí K9 a obsahem 1 % glukosy, 0,1 # "Synceaa--beeae*, což 3« eynteticfcá amšs aminokyselin, při* blilnl odpovídající běžným aminokyselinám kasvinu, avšak boa Ir-valinu, lr-i«olemoinu a L*&«ueinu· ýo vypíatování bunšk do vytoká hustoty ti bunkypnomyjf prostředím Š9 a znovu se ‘ , . :,· ''i'!*'·.···;··. -· -- V·. ' . ··- - · uvadou do auapanaa V tomtéž prostředí· obsahem % % 'λ-;- " / toluenu. falům byl předem rozptýlen působením ta . ultrazvuku, takša vmlkla mléčné bílá di©parat to- ' lttonu v proatřadí _|lši Suspenze buněk, puřbu a telme* . nu sa inkubuje 0 minut při teplotě 30 iíaž se bu&ty stanou propustnými· fakto změněné hušky se pak proBgrýi v proatřadí M9 a pak aa znovu «vadou do au·-pana* v l/5pdvodního objemu uvedeného proatřadí· % provedení akoulky sa pak ušije 180 mikreliird tak* -to připravené suspenze.

HaakCní objem 300mikrelitrft obea-huje Punky# poamlnšné působením toluenu, $,# tnM thia* minpyrofoařátu (TPř), 0,11 m koanaymu A (CoA), 0,68 mM nlkotinamidadenindimikleotidu (RAP), 2,6 sak dithiethroitelu <*$*), 4,1 m chloridu hořaenatdfco," m m m«*mf e pa 7,5 a « gog ep» c14G~i]-t-©*®~ isokapronátu aikroourie na mikroaoi. Účinnost počítání impulsů byla 73 #· Beekee byla provádčne v 19 ml scintilačních nádobkách s obsahem 2x2 em papíru Whatmen 4, který byl natlačen do Šroubovacího usáviru lahvičky» Papír obsahuje 3© mikrolitrů IX Hyeainhyároxidu (lit roatok methylbenzethíoniahydro-4SI v metha&elu, Sigma Chemleal Co*, Mt* louis, ' MG 6317S), kt«*ý sachycuj· smáčený oxid uhličitý, vyvíjejích se pil reakci* Smis se inkubuje $ hodiny, ' %»&*%M: ρορ^:§:|οϊ|θ||^ : li;:γγ (universální 1SS kapalina pro ecintllační počítač), Hew Bnglend Xueléar Research Products, Boston, MA 02110) a radioaktivita se m«$í kapalinovým scin-. tilačním j^čítačémvp© dosačení rovnovážného stavu va avrohu uvedeném ro zpouětčdle po dobu alespoň 4 hodin. Slepá kontrola, která neobsahuje iádhá buňky poskytuje 50 ai |0p impulsů aa minutu. , ·· poskytují počty impulsů, které přibliín# odpovídali slepé reakci, která neobsahuje kdežto původní; kman poskytuje několikrát vyl»i počty impulsů nač Slepá kontrole.

Ieolace tam· HL-026 (AtCC 5|$66) , oúvotseného od kUM S. eumtiUt X-3 (ATCC 53567)

Povděk pomér- ml nitbi $j*f: ;b*®·; vp#£· ;|^iót;|: ;3^ΐ: taolovéao a eJtoumáno ne *TOu »ehopneat produkovat :§£|$bři^^ penttnkarboxylová, 2ieolétů, * niob* řad· produkovala napřírodní av*rta®c tlny, prefM přírodních aver-nectinů byl vybrán, M*»', kita$ poskytoval vysoké vy~ táíky evenaeetlnu.f:přl péatování v íabvíoSi v* srovnání • původním kmenem S* avermitilis 1-3 (AfCC 53567), tento kmen byl oznaSen HM>26 (AfCC 5356#)# tvorba kmenů S* averaltlU· POS^llf (AfCC 53670), §tirď ::iitfa3f^ řatiaoAmm;:7' -7^77¾^ 7777^¾ :1-3/ (ATCC 5356?), pietováního na čerství agarovd plotní (SAMIO ítyři dny ee neodka;Je do baňky a eb^a-

mm ml, obsahu jjlo leh $0 ml prostředí SCX 0 |B t:,Wtíjům ' se pak protřepévá př! 200 ot/mine teplota 30 'd0 celkem 24 hodin, konečné pH 3e8,2. .

Baňka ee odstraní z třepačky a '^vei-^pbstřpai «ρ».-be$í% kem ř minut, při 2000 ot/aln. Hanky ee pak znovu «vedou do suspenze y prostředí SC* v množství 50 ml v Srlenmeyerov# baňce o objemu 300 ml a baňky ee «lekl :ma:*eteS^ na 2 hediny při teplete JO ®C* '. 10 ml takto získané suspenze ee uloží do sterilní zkumavky.

StttPttň 4 '* t56yUl ethylmethensulíonátu se přidá do zkumavky v dobře vltrsnd digestoři, obsah et důkledn* promíchá, pek se, vli$e do sterilní banky o objemu 300 ml a banka se protřepává ) hodiny ba rotační třepe*ee při teplot* 3$ °C* ·:·' ·'·; _ ... ‘ .·. /;. _ ; γ. .... *· ' ' . , ··.··"'; "'V·'-', '·' r .' · ' . .··’· ·'. '· ··*' . [. ..· ' ^ ;';7 r ϊ·ΐ··.-···';\ . i : . '· . ;; 'ie. v he sterilního proétředífCW a v ti spáni •e polcredejje eelke« tQ hodin při teplot* *0 %. '^κίΛΜ··^^ ;: 3v%:

Banky se vydmou, obsah ae odstře* « etikem 10 mlmt při 8080 ot^djp při t»plotS SÓ *C. řek se henky probdí tek9 Ίο ae mem «vedou do aus-, ·,·. .·λ·:;·· ϊ·;\. 7..7.r..w· -¾ •y0·'. /:777.: ,7 ·.. ·ί ·: peiise v prostředí gettr' "«love t:e odstředí a anovu ee uvedou do euspenae * 341 ml prostředí SCM, · :

Stupán T / : Biží^ se odetwl o*ko«eí eotitk, : f o99 nanáfií na kolonií na ' : dednu plotna & aiodude o#seliopi!©a^b^ pro» :; . atřodi M9 rglukoeou * pJ^toeaoetí nebo v sopříioeaoiti Ii*l«ueinu, L-ieoXouoinu nebo Svalinu e v přítoonoetft ntbo nepřítoonoeti kombÍnecí t»«hto eainokyeelin* Hledané Í^žS|^r^:.'ΐ: ;; /// ml omlnokyeeUnenDi. fyto kmony, odrozené od S· avor- :; / ;<ypÉí^v ^w : prost-řadí, ktaré 3« dopln&ao Rodnou nobdtrdtiín pod* 'tom- %H ?-oxokyselin, o to kyaeliny s-oxotaokaprono- ./fj$OUygÍgÉlbi)g^ y#to/; ehovéniá· eeela :..·' ':· -v..·, y' y- .=·· _ . ... '. -///.. . ':///··. '· :. ‘ ‘ ' '' -/. '..·'· .·.' ., -;. ..·'· /.y >:;·'. 'V.: ;· ... , "'-.v kun* · v* :yý -; ;.·'.-_,.' ' . ' <;·.;'?j·;·:-*.·/ ' ’·, //.. . ././·/ . '..·,; .;./>.. '^ό'·Τ·Ž'.'/.-.· '· /’:’>: ·’·;-/ ·"-.""'y'?.;· .,//./y- /;./· '; ná trentemlnáaa etačí k tranerainaoi oyrchu uvoden^eh '.ý; ‘: ./'·.. /'··-;< - .,--/// ·’ ·'. . ,/../ "' ry; y . ·· y -/ / -·; .·'. '.;·?·'' :.:.-. :/'' ·..-,/· -./·/· · : ·;· /.' -; :...--v - .v··' ' ’..·;,’· /.-,./. .)///.../. -''S^ !-r- :' -Vfe”· t:/= >’ -&#y;:

Frofitfreďi SCM •iožka :Λ·ίβ»0§«1*ν1 ^«utolyaátK.kiřeaiil.e ' 10 jpittéakt « ::íi®y§*|Jte aaóa;:- 9 1M síran hořečnatý U KjiBP04i pH 7,0 CHCI) 100 V- · .··'· , i-i :. . ' ' ' . Β3,0Μ3τ,:_8ϋΙΚ *Χ·|Ιφ ’>'··; množství 1r g/l hydPOf*n«ojiř©r«ěaen sodný ',· 6 dihydrogonfosforeSnan draselný 3 chlorid sodný 0,5 chlorid aaonný 1,0 1» síran hořažaatý 1,0 1,0 0#**ΤΟ|ΜΙ ;. ·;ν' M aminokyseliny kaeeinu »,0 ?oto

Složení s tonásobného ; koncentrátii wSynoe»®*lJeeee* složka g/l 1)1, :n;w«Ji Báiďw w. i nfii 11 JI·*· t; :ί^ιί»ιιπ^«ί»ι« Ii).r ·»Ι· .. íi-arginin 4

Irusperagová kyselin© 7 á./.y-y-\h^' 0 ;':§»©y*tiii , : A: : glycin 1 . * . ‘ X**lysin 7 L-nethionin 3 L-fenylalanin $ : · *© / lp*thre©nia 4 ^l**tyrosi*i:. l.·#;/- ::Ír>tr^tořsn:. :/,7: :;l m pM *! m sisrili· zujje se filtrací* Jeden ob^ea koncentrátu sa přidá k 99 objemům prostředí, aby byl© aoino dosáhnout standardní výsledné koncentrace*

Ziticání S· awmitili.-Jg-ft3 Um $3«W ape|e»í* protoplaetů kmene §# avermitília ATCC 31272, adolného

Utoč miú) odolný proti Speetinomyeinw, ýe spontánní mutaci kmene S# avermitille ATCC 31272* Tento kmen byl isolován vegetativního mycelia kmene ATCC 31272, naočkovaných na egarovýcb plotnéeb AS-l e obsahem 50 ^«g/rnl .ApoetA*, moaycin.u. Spory mutenty, kter# vyklíčily na bohatém livněm prostředí tfeou odolnlýií proti 50/Ug/ml t*v#* daného antibiotika ve srovnání e původní® kmene*» |é* bol spory za uvedených podmínek nevyklíiíí, foto dominantní oznedení bylo a úspěchemužito k oddělení ^isolátA/kmeéa^ ndzu aminokyselin s rozvětveným řetězcem* v%^®KKlA· roapuetný Ikrob ;.;i*í airan^iedný ,.í. 10 .: f 'agar, ;Í: 20 /i! destilovaná voda do 1 litru

Proatředí se upraví na pH f9$ • steriliauje · * aatefelévs 15 minut při teplotβ 121 °C, Pak «« 30 až 35 ml prostředí vláli do sterilních Petriho misek z plastické hmoty a průměru 100 mmt výlka vratvy je přibližnS 1$ mm*

Způsob aiskávóní životaschopných protoplaetů * kmenů Streptomyees avermitilia A· Spáry Alko očkovací materiál 1· Spory aa připravují běžným postupným ředěním na agarovýaíi plotnách, jednotlivé pe^iyf !ia; •po* outMi 10 wim% při 1000 g o pak »« ***** w*4m 4® emprns# ve ati^aáa objemu ©#0$*> *l&®*i©* : :,:; ' v-, tfíSš 3. mbliip* l©7 spor »· «*·«&*-O# 4o 30 ftá Živnáho prostředí i aarfcráfctap * ’kv©i»Í© § 3¾ ^ Vt; ^ 1* itycollálml fcpltipry knene pOO^Uf-#· páitufl v živném prostředíe l;ryptikÉ*»k „ i· sojji (TSB), ft| se vytvoří eákel v hodnotě ? oí $ při 600 na. Pak ·« kultur* do§«tkrát homogenizuj* ve «kleněné® *aří*fsji na .pletl tkání. /'" 2* HopofepiBfcvené <©3*ális» (iáf V; předl na dvojnáeobný objem preat#*dí tSO ě ψ získaného aetekiálu «a uloží do atarilní polyprapy-lanová akunpvky pro odetřeSování. 01t*a*v»kavé aonda ; 8β : 00]m>̧I^ĚÍ^ w $* im zpracování dooházi k dispergování my- eella p« jedné hábe dvou buňkách, které velmi rychle ^pai©U:;y:;^|ped.|# že jsou délepSstovány. 3* Takto apracováný «ateridl a· zředí na konečnou koneentraei40 % glycerolu, pipetou se přenese do lahviček a paksezmrazlfta teplotu #. podíify teletenechají roztát podle potřeby při teplotg místnosti a užijí k naočkování prostředí SSHj IMS stejná jako ve e^#liU\ uvedeném etupni A· 3· C. Kolonie na agerovém prostředí jako očkovací ... naterlál l^aet;zralých koloniíkmene tOS^lli, rostoucích na prostředí TSA nebo A XF0-2 es přeaeee očkovací kličkou do 200/Ul sterilní vody ve zkumavce pro mikroodstředlvku* ^ v;;' 2.1í skané eměe a* hoaogenizuje piskem pro jedno použití. ; 3. Homogenizovaná kolonie ae přidají k prostředí YSME jako ve stupni A.3· M* a ayoelia, pěetovanáho - . ; ; ; " ΖΜτ ρ^ 0Χ^φ^^φ 1. Kultury s* inkubudí sa protře- pávání na vodní lázni při‘“teplot# $ř °C přibliž»# 65 hodin. 2» Myeelia se pozorují aikroeko-pioky ve fázovém kontrastu 2 při. zvětšení 40x á pak ;;; sa odftřeáují ve skuaavce 10 ainut při přibližní 147# * při teplotě SO °C. V:ť:i;Í^ liální usazenina se znovu uvede do suspenze v 10 ai pufru pro protoplasty (P), jehož složeni bude dále uvedeno. Usazenina se hoaogenlauje 5 al lOx přísluš-ným zařízení» k dispergováni shluků. při 1000 f oelkeia 10 ainut. Supernatant se odloží a ;:«sa*éKtt»a;:4e:i opatrn#>:znQvú:;nvede; do suspenze ‘;l#vi|;o. pufru P. 5· Proaývacástupen se snovu opakuje* 6. Myceliélní ueasenina.se snovu uvede do suspenze v 10 »1 derstvého ro stoku lysoayau t obtahem 1,0 eg této látky * 3· P po *te~ rilizaci mtraoi filtrem s poryíV^ua· ';··':χ·ν|« Myoeliální smis se inkubuj© 60 minut na vodní lázni s teplotou 37 °C *« opatrného protřepávání· Vsorky n znovu úvodem do «m*-p#n»o ▼ rootolctt lysoeymu každých 15 minut· VsorlQr ae ponořují v mikroskopu vo fázovém kontrietu a snímá sepří temnost protoplastů.

é/IyčeliMM ;krát řozetfo" pfi 'podliti pipety ..'©....ohromu"'f .:$* ' Í£sk«^;:plt0fiál; SS :;S^ltrujé ;: -'vrstvou skÍoniná;:vaty; nsb© nsabaorbující buničitou : vatou. ‘ J 10. Frotoplesty.se odstředí . 7 minut při přibližní 1000 5, nade*; s« ©patrni znovu uvedou .d© suspp&áe ..v-:^;al pufra P a pozorují se v mikroskopu při fázovém kontrastu při zvltfiení 40«. 11., řrotoplasty se snovu odstředí jako svrchu a uvedou do suspemse v 1,0 ml pufru 0 P. Pak ee tato suspenze dál# ředí pufrem Pa deštilo-vánou vodou a nenááí se na plotny» které obsahují regenerační prostředí· Kolonie, které vyrostou z takte získaného materiálu, zředénáho deztilovanou vodou, jsou patrn* odvozeny od neúplných myeeliálníeh jednotek nebo od jednotek, které neobsahují proto-plasty. 13. Protoplaíy se zmrazí po po- : dílech 200 až JOO^ulv ledu-při teplotě ~7© °c*

Po 18 až 34 hodinách ee * ledu vyjmou.

Spojení protoplastd při použití pslýsthylsnglykslu (PBQ) 100© T" 1*:" f provedeny ae «tejnou «árii P1G 1000 (Si«ne Chemicel :fp**"::|t.* l^uif »: vel^lfti^: ·;ίi sterilizovány v eutoklávu ve zkleaénýsh iahvilkásh, bylo přidáno 1,0 ml puřru V a PB© byl rozpuétén «a^átí··^ . :;^áién* >'ΐ; tlené před použitím. Boztoky PSG byly užívány při teplotI místnosti* pravené aabo byly nyofcla nostlířéty aásobní aateriély, ||a|3béf||iné|p^ PHbUŽ»8 stanné, motafcirí protoplaatů každého genotypu bylo přineseno opatrné pipotoa é© zkumavky * plastů byl «#Pen iákal a bylo pO»8ito aekelik rAsnýcii koanantrací# Obnosí v kaéáé zMamrce byl upraven na y/ΐ" ί":-'^íS:'-íS- -' ; ·ΐ' ."V'' v·’ ..;···: ;' :;v; > -. _ _ . - · ·--/;' -. _··._, ·' '.·. .:·';· ; . ..;. ·'. .···_'. ·/. . ·\··<.«>.'Π>. ;; ··:·',; ; v;./ ., !· Supamatant byl opatrně slit* : Jfaaaenina pmopXaetft byla ©patra# uveéaaa do eae- -pmm t kon.anéa objeau SOO^ul paftrn f* §>ϊ;" rychle přidán© flíil^ vf|§gi^^ ";;g :^ν;: J ΐ ΐ pak© ve «tupni 4^ MS^sataai byl eptf$*a« »lit a ’ · pmbplaaty po op#3*»í byly a»oy» jwiNb«y do euepenze v 1,0 ml puřru P. sériově ředěna lo"1 až ΙΟ** v pufru $* V každém pokusu bylo také pro* ;;:γβ4όϊ^^ :-ο jediného kmene, tento ';' . materiál byl nanášen na plotkny jíjakokontrola. 10* Růsná ředění.;,ÍáÍí^te;/Mtapl^ lu a obsahem protoplaetů byla vnéěena na plotny ke stanovení počtu životaschopných regenerovaných jedinců každého sí kmene, použitého při uvedeném postupu, 1, SuspOnse protoplastů, a to buŮp© spojení dvou kmenů nebo jediného kmenu byly ředěnypřisluěným způsobem v puřru p a vždy 100^ul materiálu bylo nanáleno na agarové prostředí pro re* generaci velmi opatrným způsobem. Rosetření proto-plaetd;.v měkkém agaruhomí vrstvyd neslepSovaloje* &» V připadl potřeby bylo potíži* : ;::t6;vP0it«p^' #pi«»ébe<ve štu^ííi*||*v^ 3. RegeneraCní plotny byly ln-kubovdny v «otaveních »á«eích a plaatioká hmoty :;;:"y. pflpédlepojeniprotopláe-tá, u nich* byl· k jejich oanafcení užita odolnost proti spektinomyeinu byly regenarující protopiaety po li hádináeh převrstveny »1 nikkého agaru, jehož sležená bude dále uvedeno e obtahem 100^«g/Bl spektinomyeinu, agar bjrl sterilizován v autoklávu ΐ: -¾ "i: ív:vány .·|(ί|.!ό ;^ÍKeM^y ;!::·· :-; Metová prostředí, ,:.y*i>: protopiaety :;^· :-;;áÉŠ^ÍMteí4PÍÉ®fcÍÍÍp^^ í - :Sg0 proetředí ® publikaee Mopwood a deláí, 1985, Gene- . • ·:ΐίοΓ^ώ^^Μ^ο»; .m;""·: ^ ^1ÉHÍH^:|· éWf. - 'á|tv: Základní roatok ;*Íelk*,://;:- |,V «ROistvívg aacharosa , 0,tf U0,ťm£.:^ 10,12 glukosa 10 eminokyaeliny kaeeimu (Diřeo) 0,1 5,0 agar s ovesnou moukou (Olfeo) 3#Q $*1*0:;;.:*^ destilované voda do ::^^i:ttedlf: se; : ;1»0||^|: V’ pl>;' r;ř: n2ro4 <o,w> CaClg. IřH^O pufr MSS (1,0 H) SlS^^fsSS.·:^ -¾¾¾¾¾¾¾¾ í- ®-S8S:;: stopových prvků obsahuj®? llltru následu-jící mnoiatví jednotlivých složeki

ZnClj ;.^;40ag ř»eijč6a^p; 200 ng --7^77-: 10 ng 10 ag W:*m 10 ag Mékký agar se speetinomycinea pro převrstvení

Obsahuji úplné regeneradní prostředí jako svrchu až na 2« anolství agaru 4,10 g. Prostředí ae a terili au je stejným apůeobeav autoklévu, sehladí ii na teplotu 55 °C a přidé se 100 ag spéctinomyeinu. řak ·« ealé množství resdllí po objeau 5 ni do zkumavek, opatřených nadrcen* Kateriél a# saresí a o tomto stavu sesfcladuje, ano· vit so aterUlsntja v autoklévu at t«sa« před poplitím» - *7 - .^+.·Κ·*ίΐ;> - *7 - .^+.·Κ·*ίΐ;>

Modifikovaný pafr pro protoplatty •$áfcXddpí;%^ :·'' ^♦ρφώρ^Μέ·;· C; síran draselný destilovaná rode do

Proetřtdi ta sterilizuje v autoklávutfaimt při . tapXáil Xtl °C. řo eterilisaei ·· přidá následující tanoisiví sterilních gáaobních roztoků* £:¾;; i *x .

CaClg.28^0 0,60») 10 »1 pH a# upraví na 6r5, obje* at doplní na X litr, x Sloianí roztoka stopových prvlfcá bylo uvedeno tvrdla·

Mdli#; .ÉÉiil .iÉř' -Λ;

Základní roztok: 3 i 3 « ;3ΡΘ^;; 973 »1 extrakt z kvasnic (Dlfoo) Becro-papton (Ďifco) ISat§ó^i^á:;:a ' extraktem li «ladu (Difco) ΙΐΛζΐΓ destilované kádi do

Směs **; sterilizuje v autoklévu 25 minut pfttaplotf (l]r<ltt (80*)

Objem se upraví na 1 litr· výtladky, získané svrchu uvedeným způeebem j*ou znázorněny na přiletenýek výkreeeefe·

Ha obr* 1 $♦ v ultrafialovém : avetlo pH HO na v práblbu datu v ainutáelít znázorněn ehromatograf, slakaný vyeokotlakovou kapalinovém; 'mš: ;eria?i*|Íi^ÍÉ^ . ' . ··;._' · _ i-yl··· . ·;?·„V: '/' .·. · · ; ·" : - yX,?;·' 'i-:.’‘··\^':·“ v -..)/: 1 ^ ’*, po jejich ráatu na prostředí, prostém aii^tiel^^'’:-

Jqreelfci^^ *3,1« zname ná oligoaycin A.

Ne obr· 2 3« v ultrafialovém evětle při m snáaornln chr©m©t0gramf asi skaný v .při poaiitír^tt^^y^lú^ extrakcí bunék $* ; aver*· mitilia MA4848 (ATČC 3127?) po jejich Hietu na živném prostředí, prostém alifatických kyselin /WPM SynA 40 t 40/« produktem byly přírodní avermeetlny·

Ha obr* 3 je v ultrafialovém vpVStlor při 240 nm v prdblbu éaau snéaornia ohroma*. -tograa, «lekaný při použití frakce po extrakci bu-nék kmene $· avermitilia 1-3 (A$CC 53147) po rdattt a® prostředí $ &bsáhem kýeeliny eyklopentylkarbo*ylo-• éé^přiklf^^

Ha výkresech jsou naproato přtami znázorněny chromatogremy, «lekané pro jednotlivé' sloučeniny# " :¾¾¾¾

SlOŽonl živných prostředí, které budou použita v následujících příkladech, budou dále uvedeny· Všechny molekulové hmotnosti byly zjižtány , bombardováním rychlými atomy při hmotové epaktromotril, provóaoné na hmotovém spektrometru (Y0 Model 70701) *h*a* chloridem sodným. Rylo moSno *tanovit (M ♦ «*)% «wteífé epektrometri* v proudu elektronů byl* prbva* daaa ravuSS na hmotovém spektrometru <W Stydal Wiap) za zlákání . hodnoty a/e. pro iaavttl fragmenty· y.' ζ% ν^-Λ V V- :'·';' ;'.ΐ'· ,:· ;·ν i''·'·;= ’·; ·. --- · - \ ·· '.V,;.;;:; : M:'v ;,.''.·· ./‘-v sloSka maožatví v «Α bydrolyeovany škrob1 =--:: ayá^i^ p|j^ i ^:¾¾¾.¾ C ^ pfc«áaM1Ši^^ ® Škrab byl připrav·» hydrolýzou Škraba <1~amylé1ou % Baoillue ,lř|aheaiřor»ia (Movolnzymas, Wllton,

Cf, obchodní saaSka "Termasyl"), dextrozovy aktive1 1 Výroba·1 á® laeat Products, Xae. OXm©1# Sd QŤ0X3 --0 Výrabca1 $· fraiare Protein., liempbis, SR lilie. _ pR ·« upraví sa 7,1 hydroxid®» eodným.

Profltfr«dl složka množetví v g/1 hydrolyeovaný škrob 80

Ardamin pH 5 JMíS04.7*ž0 1 chlorid sodný 1 uhličitan vápenatý 7 **8©4.?κ^

ZnSO4.7Ha0 0,001 P-2000 (protipšnivá činidlo) 1 *1/1 :0: se upraví na 6,9přidánlm 25¾ hydroxidu sodného, gg»i t»áll 1W tm A *0 i 40 lelka g/1 ůestllertB* ve*r - ajiiii ki wiwawj ιιι^^ί hydrolysovaný škrob 40 rozpuetný branberový škrob 40 kyselina flutaaová 1#0 arginln 0,168 cystin $tml·. histidin 0,06$ eložka legrand vady lauein 0,798 lysin 0,297 methionin 0,108 fanylalanln 0,168 threonin 0,174 tryptofan 0,048 tyrosin 0,192 hydrogenfosforečnari draselný 1,0 ^4¾^¾ 1,0 chlorid sodný 1,0 uhličitan vápenatý yaS04.7Hg0 0,01 ' ;;; 0,001 0,001 ; ': Kra*třiáí :**. «ppetí: ie:vl^'> : 6,8 «8 7,0 a pak se jašt* 30 «lnut miehd při teplotě 121 °e. složitá g/1 destilované vody rozpuptný bramborový Škrob 40 hydrolysovaný Škrob 40 kysal lna glutamová 0,390 arginin 0,188 eyetin 0,084 ..v:ld.stidin 0,089 lysinkydroshlorid 0, Wt ^i-·· -:Í6l^UM8 .fs^lalanln^;; .· V 0,16® ' tlirsonin ;. 'v" .. ', '0,11*1' tryptofan 0,04® v::0,itt . Iiydrsganf^^^ "'%.: J:i-';·;'?-:: : i ; chlorid sočný . :. ; χ> ·'. uhličitan vápenatý 3,$ MO^TOjp 0,01 linCl?.4Ha0 0,001 pB ee upraví na 6,9 aS 7,0, prostředí se míehá 30 minut při 121 °C* -foatup /f použitím vysokotlaké kapalinové ohroma- -togrsďle ψύ 190 «I vody 70 al aootonitrllu do X litru aethanol· ::r

Ultreephere ODS ?5 cm (Baeknan Inatruaaat»» průtok1 0,75 a/ain ;..; ;i*t*ktfíi': zeslabení: přibližní 6 ž«aU3i«t are CTitorit Jlttl 35 al aoetonitrilu + 390 al mothanolu

Standardy: ; o oblámu 10 al a ofejoa co doplní aothanolea 2. naváží m 0*5 «« «koumané látky do baňky é.':obáawi 10 ml © objem 00 doplní methanoloa. ;«#v míst x©0/wi : * iotél aaošatví roztoka 2 v lohvičee a přidá i« χοο,αχ aobiiat fá*** 1 ;,liÉi^V’;.;;: ΐ/··^ :.Mi:JÉ\:'^·'·.· X* X aX protřepaného butonu *· Odstředí : ¾ nevstál jinošství eupsrna- tantu bez porušení >;··':;;:;^·"5^:,;Μ %β přidá ae lOOyUl vody, vhodné pro vysoko· tXakou chromatografii k usazenině a usa· zsnlna se nyní disperguje, 4* přidají se 2 aX ředidla B a. vše «r'pr®*í*|f'' ; % výsXsdiaieaěe se aí·- 1$**^ ávemectinové deriváty Přírodní :"ÍkmhL^^Ěiá. iak byXy y práhla f^jr^ · -přihlášky popsány, tiyXy podrobeny svrchu uvadsná ^ skkotXaká kapalinové chromatografii a doba rata»^ vrohslu pro jadnotlivéevermectinovéderiváty dšltna retoadní doba» pro oUgosydin A, irští? byx ;;.^Éiíu J*kb:: 'liliA vSdy pozorován při vysokotlaké kapalinové okr**^ ioyreřii jak© vedlejší produkt při řermemtaoi s. aver-mitllis a je jediným produktem, který 3« možné odlišit vysokotlakou kapalinovou chromá toerafií y prodmk*» tech popsaných mutant v případě, io tyto mutaaiy jsou pšstoványv proatředíiproetém kypěli: KCOO^,v nimž 8 má svrchu uvedený výsnam noho prostředí, prostém slouěeain, které 3# na uvedené kyseliny mošno převést. Sypieký retenční Oas pro ©lifomyein A 3a 12,5 až 14 minut· Podíl f retenčních dob (lít) poskytuje možnost srovnat totožnost a výtěžky avermectino- *ýoh derivátů. ?eředí% ; i-::J^^ :"· '.81·.; β AI (Ob|*· |)· . λ/;;*fV . KiV^. m

Sgi<b; 0,70 Atb £:¾/ ^ ¾¾ ÍWí^lgJ S--;iuí:S''fSi^S^-Sáj Blb Bia '. i,«3 ' · .; Alb Μϊ 77 jf : ·*(#*# ‘-IMMflfcPX#·· fe;:;©ádii«9,<./á*»t7ttoi :Wl»}% Alb od sefee navoAjen·

nepřírodni evermictlw cykiopeatyi as Cyklopentyl B1 cyklopeatyl AI RT/RT (ollgomycin A) #&*/ Í*It'

Boba retenee byla v rosmezl 1 aš t atnaty, oligouyein A 11 obvykla vymývá přiblilnl po 12,3 al 14 «itiutáetu V náeledujíoích příkladech byly averaeetinová deriváty etanoveny «vraho «voděný* po-* •tupen, není-11 uvedeno jinak·

Cyklopentyl evermectin AS A* averaitilis 1*3 (AfCCI 133171 se plotuje při teplot® 28 eft 30 °c v prostředí A$**7 za protřepávání etikem 24 hodin*?odíl o objeví* \f ;-É| / ,· XOO ml prostředí AS-7* inkubace se :;p^á|í|^^ podmínek celkem. 24h©din*Peksé X mltét© kultury užije k naočkování 40 ml prostředí A?«$ v lahvi o objevní 300 »1, po 24 hodinách sejí pak přidá jed tg 0,4 g/1 sodné;soli kyseliny cyklopsntankarboxylové. Produkční lahve se pretřepávají při teplot* 28 až . 24 eykle- ': pentyXavoraictim it^ kdežto odpovídajíoí titr pří^ rodního derivátu Aga byl O* Bodlo rovněž k produkci dalftích eyklopentylavermeetlnových derivátů. Pří kled g Cyklopsntyl averaectin A2 SSaraaený vzorek 3* avorvitlli* HL-Q26 (ASCC S35Č8) byl užit k naočkování 100 »1 prostředí 48-7 v lahvi o objevu 800 ml.t růstu do» •lo;: při inkubaci při :tepl©ti: pávání po dobu 24 hodin· Pak byl podíl © objemu1 *1 : užit k naočkování dvou deliích iahví e ebiei|i« //Λ/ "$φ' 500 ml i obsahem 100 ml prostředí AS*T« po--.19- hodinách

ttžitknaolkóvámí ;Λ 10 litrů prostředí Ař-5 (menSí množství chloridu «od* ndho)» Po 24 hsdiméehinkabaet přiteplotli© '-K fiᚍS; "«/X ky*«liny oyklopentan* karboxylové. Směs byla míchána tak» aby podíl ros* puštěného kyslíku byl udržován nad 20 % nasycení# fltry derivátu cyklopentyl A2 po 120» 163» 216#»264 a 31P hodinách byly 16» 40» $5» 90 a 110 ««/1* Na rozdíl od tSehto hodnot byl v tlcht© vzorcích titr odpovídajících přírodních avermectlnů A2a 0» 40 aaná» 3« tento derivát nabylo možno prokázat* |Ékl«>p*»tyl. averaectin A2 ^ S#ifi Λ ·· '':.-v ·, '.:· '""'···-- .'v;. -^,/^//./:- -/; ',.;.· ;-/:\.//··. ···:;:·.. -/^.4/: {/' V' ..;---///·;; // ; : - ; · '·;·. // ///<£//'/ prostředí obetaaoeno e ky*elina cyklopentankarboxy- !/ lová byla přidávána «pakovaní ke avyi*ní titru eyklopentyl avarmectinu, Jinak byly podmínky při naoSkování a fermentaei stejné jako v příkladu 2 ad na ta» la v prostředí Af*»f bylo navíc jelti | gfi krdsainu pH* celkem tedy 10 g/1 a mimoto bylo při* dáno βkyseliny eyklopentan-kerboxyloví p©30* 172 a 220 hodinách· Jitryeykl©- ;; pa 120* im$ 214* tu a 312 bodináeb. Příklad 4

Oyklopeatyl avevmeotigty -jSSÉIiwtt áS^ř|||g0;;;ai3l^:y|w i;;' ^.:;| ^?ÍÍ|l^t^iifflip!ÍSÍ8^JÍ^^ . ώΐΐη1/^ lÍ3Bdí^:ÍS^:v 11¾^¾¾¾^¾¾¾¾¾¾^. ! ;í f*|·· IP:; $^¾¾^ ayeokotlakottkepelinoveuehroaatograřileyklopaatyl- :^eÍÍe«||^

i|4|*S^*;: |f itš'>m{3fí|l^^ ' ::i· 1¾¾ vS; 1S .;\rř:;;i· k 1^^ í d*| j ; ^ V touto připadl byly pietovány kmeny S* avermitllis 1-3 UřCC §3567) · 8« ay«rai- UtCO 53568) *a «tajných podmínek* Byla užita tři živná proetředí, a to VIVK Syn 4'' 40 í 40, © 1PM Syn B 40 í 40. K naodkování 100 ml proetředí A3-7 v lahvích o objemu §00 ml byla užita zmrazené kultura každého z uvedených organiead, lahve lahvi o ohromu 300 ml a obsahem 40 ml nSkterého z uvedených prostředí* Vieohny zkouSky byly provádlny dvakrát· »o H hodinách Inkubeee při teplot· 28 dC •a protřepávání bylo do každé lahve přidáno 0,4 g/1 \ eedí^«©lÍÍ;ltyi^ii^ ^::1^ 'produktu, kterém je oyklapeiital avermeetln áf* Hfr·'·· : eledky jsou uvedeny v tabule· If:

,. ' λ,; : Kmen S* v- , . Cyklopentyl - ,' ‘ βνοίΐ^ίΐη,^δ mg/1 - ;:.:;ipo; f nif AfCC 53568 6? : 40 áfO€ 1356? Kiíť'# mcú 53568 ’ 0 1 B t 40 AfCC 53568 36 Iř'íúi4. í

Cykiokexyl averoectiny ’ V tomto příkladu byl© po fi hodi- ; nách přidáno 0fy g/1 kyseliny cyklohexankarboxylovd ' místo kyseliny cyklopentonkarboxylové, jinak mftaokny podmínky byly stejní jako v příkladu 4. Bylo možno identifikovat ityři eyklohexylaveraectiay při fyséks# tloká kapalinová obronotografii v?erk&# odebraných po $43 hodinách faraóntaea. «stonáná doby P**° «yklo- /-1¾^ 3-cyklohtxenyl avsrmectiny ."; V tomto příkladu bylo přidáno pf 16 hodinách 3,2 g/1 kyseliny l-oykloHoxenkeařboxy-lové místo kyseliny cyklopontankarboxylové, jinak byly váechny podmínky stojná jako v přikladu 4· Vo vzorku, ktsrý byl odebrán po |X2 hodinách a analy-** zován vysokotlakou kapalinovou chromatogrsfií bylo možno prokázat několik cyklohsxenyl avermectinů. «stonání doby těchto látek byly 12,88 (32), 16,39 (42)· 27,3? až 26,36 (Bl-iao*o*y> a 3*,«3 a« 37,13 3-thienyl avermeetiny V tomto příkladu bylo přidáno po 96 hodinách 0#05 g/1 kyseliny ti*iořen-3~kerboxy· levé mleto kyseliny cyklopenteniarboxylovó, jinak byly váechny podmínky stejné jako v přikladu 4· V© vzorku, odebraném po $lf hodinách bylo možno vysokotlakou kapalinovou ehromategrafií prokézet celkem čtyři 3-thlenyl avermeetiny. RetenCná doby tSekto 3-thienyl avermectinů ltt Alp 11 * AI byly 6,96, 8*76 13,8 a 23,5 minut, P ř í k 1 ad 9 1-methylthioethyl evermeotinu V tomto přikladu bylo přidáno po H a 96 hodinách 0,4 a !,t g/1 kyseliny f-methyi-tbiopropionové místo kyseliny cyklopentankarboxylové* jinak byly vfteobny podmínky stojná jako v příkladu 4* ; po^tAO :h®di^ možno proké2at « dva l^mettiylthleethyl averaeetinevé deriváty při vypokotleké kapalinové ehroaatograřit· Ratendní doby pro 3-thienylavermectiau Af a 81 byly $,30 a 13,Od minut· Vrchol., jjahal retenCní doba byla přibližní 7*2 ainut a který ee nachází na přední stra-:-páll;-yaN^Ípi^M-^: :;3^Ι|βι|ϊ:ν^^ώί^^ je 7,557 ainut náleží patrnSslouCeninl B2, kdežto sloučenina AI je patrni skryta ve vrebálu* dehož retenční doba je 17,22 ainut* f^paátl^ :-¾¾¾ ' ;|| ·;ΐέζί&*ϊ · nách přidáno 0,2 g/1 kyseliny 2-aethylvalerové aí*to kyseliny cyklopentankarboxylovl, Jinak byly vžeehny ^daíifi^aielai:^ nda po 312 hodinách bylo možno prokásat vysokotlakOtt kapalinovou ehreaatografií/ čtyři 2-pentyl avermecti** ny* Retenční doba pro 2~pentyl avermectiny B2, A2, 81 ; a AI £e: - 86 - Příklad 11 l-methyl-3-butenyl avermectiny V touto příkladu se po 96 hodinách přidává 0,2 g/1 kyseliny 2-methyl-4-pentenové místo kyseliny cyklopentankerboxylové, jinak jsou všechp.v podmínky stejné deko ▼ příklad- v# vaorku, odebraném po 312 hodinách bylo UoSho *—*4*** vysokotlakou kapalinovou chroaatografií Čtyři 1-methyl-3-buteny1 avermectiny· Retenční doby pro l«*uethyl*'3*butenyl avermectiny B2, A2, B1 a AI byly 11,13, 14,78, 22,10 a 28,92 olinut. Příklad 12 1-methyl-l-butenyl avermectiny" V tomto příkladu bylo po 96 hodinách přidáno 0,2 g/1 kyseliny ?-methyl-2-pentenové místo kyseliny cyklopentankerboxylové, jinak byly všechny ostatní podmínky stejné jako v příkladu 4.

Ve vzorku, který byl odebrán po 312 hodinách fermen- ftáce bylo možno prokázat Čtyři;l-methyl-l-butenyl 'ΐϊ vysokotlaké kapalinové chromatogrefli* i Retendnídoby % lehto ílémel^yl^ ; byly bs*: Aff;m· Γ «inat. / Příklad 13 V tomto příkladu do popsáno po* Užití mutanty k výrobS přírodních avermectlnů, odvozených od L-val inu v nepřítomnosti avermectinů, kte- ' ré jsou odvozeny od L-lsoietteimu* Obsah zmrazené kultury Svavermitili* 1-3 UfCC 335d7) byl přenesen do lahve o objemu 500 »1 s obsahem 100 al prostředí A8-7. Po přibližní 24 hodinách feraentace při teplotIIB ©I 30 °e za stálého protřepávání rychlostí přibližní 200 ot/ain byl 1 ml takto získané kultury užit k naočkování 40 ml živného prostředí WPM Syn A 40 i 40 v lahvi o objemu 300 ml, pak byla láhev inkubována 14 hodin při teplotI m až 30 eÚ z© stálého protře-plvání· Po této dobé byly přidéiny 4 ml roztoku ky-v;sell»y: isomáselnéi sterilizovaného filtrací po neutralizaci ne pH 6 a# 7 hydroxidem sodným s obsahem 4 mg/wk uvedená kyseliny a inkubace pokračovala.; «t#3ným1působtmd«8tř8dnů1Vysokotlakoukepaliao- vrcholy krom? vrcholu pro oligemyein. V podobných po-kuocch s kyselinou g-mefhyUáeelaouuU^ ieoaáeelné bylo moSno pozorovat komplementární Styři vrcholy pro avermeotlny, odvozená od &-Í8©ltuei»U# Přikladu

Byl opakován zp&eob podle přikla1 ' dula tín roadilemf &k|^oayl@ydobylyvi||ltp náeleduýíel l:;|eeuvt1i^;;uvor^ 1 1® znamená oleandroeový dieecheridový zbytek» “a oetet-ni eubetitaenty mají význam, uvedený v tabulfe

retenční áoba/retwfcSni doba {oligoayein A)

50 3 -Μ» n s ·** 00 ; * ·* í*l * CM ·». cm <M . * H ·.. . .0 CM CM «0 ♦ · . <φ ' C* Μ» a v ·;·ϋΚ’ .-£' vo ;,U0; ; ·. n 'M' rt ..... mL· m .-'· t ; 2 É*» ' ·*“= '0' * m- : 0 *HI .# rl ,*0F . r-l . r-l H H H . O . ': m <r> '·'<*»: ' 3 Ch <*> « 3¾ : "©'/ H o Λ© t- <>v .!¥ - &' H ' '** H ,«* H "· rtl o «*. '•I 0 H m £ ; «Λ 00 % . t*· O "Sř· . o% H ' * o vi* . ' ..-0.; . " m : O .0'

jako pro sloučeninu 7 {ψ uj®£mo2jTO) eqop yecgae^w/eqop

t~ vď vo Ό 1 m;. >o g 1 3 3 3 3 1 & 1 I 0 3 ΤΪ i i

H retenční áoba/retenční době (oligoeycin A)

některá se svrchu uvedených sloučenin budou dále po* drobněji uvedeny· sloučenina fyzikélnl-ehemieké údaj® 6 (A?) bílý prášek, teplota tání 135-140 °C, molekulová Hmotnost 925» 219, 209* 191* 179* 167* 149» 127, 113, 111» 95 a §7. 6 (AI) bílý prášek, teplota tání 120-124 °C, molekulové hmotnost 907, a/e 576, 303, 275* 257, 219, 191, 167, 145» 127, 113#» 111, 95 a 87. 6 (B2) blijí prál«k, teplota tíní 110-112 °C, oolalculo /6 hmotnost 9X1» m/e 321, 303. 261, 257, 237, 219, 209, 191, M*» 179, 167, 145, 127, ; llS^xiii^xtx;'. j 113, 111, 95 a 87. 6 (Bl) bílý prášek, teplota tání 135-13® °C# molekulová hmotnost $93» 95 95 fyeikólnš-Gheraická údaje • 87#

i US) 10 (AS) bílý prášek, teplota tání 112-117 e, molekulové hmotnost 953# m/e 624# 48?, 349, 331# 275# 265, 247, 237tá 219, 207# 195# 179, 145# 127, U|# 111, 95 a 87* bílý prášek# teplota tání 131-135 °C, molekulové hmotnost 951, m/e 624, 480# 347# 329, 273, 263, 205, 193, 179, 143, : 127, 113# 111, 95 a 87, bílý prášek, teplota tání 167 molekulová hmotnost $53# rn/^e 349# 331, 2*5» 265, 257, 247, V tomto příkladu 3a uveden sp&aoh leolaee pro aveřmeotiny A2, vytvořená a kyseliny cyklopent©nk©rboxylová jako prekursoru. Plné živná : prostředí po fermenteei napřikladpodle příkladu 2 . e« zflltru^e © myeeltální bunidná hmota 's©' dvažrái Γ·ν';'··.·'··'··' /•V.'*'·..;··'·.·':· 7,f:‘’;-v :-V. /:·;· ^'V;'5··.·;^;·^^·· ·. ^ · ---.-7-:7- - extrahuje třemi objemy acetonu. Acenojídvé ©xtřakty se zahusti na smis vody a ©laj© a ©loj se extrahuj© methylenehloríáem, načež se methylanehloridov# roztok zahusti na tmavl hnid# olej. tento olej se pak rozpustí ve niti aethanolu a vody v poměru 4 j 1 a vysledn# roztok se ostrahu je hexanem k odatranění , alifatických kysolln a tukovítýoh látek. Odpařením zažel methanolu a vody ea zíeká svitl© hnid# olej, kter# obsahuj© přibližně 10 $ hmotnostních oyklopenty-; ©*oim©ciiad7iÉ«-$uřb^ roforaem v onožstvl 3 ml chloroformu nag/oleje, pak se přidá jelti 0,35 g aktivovaného uhlí na 1 g oleje ©lig sllikogelu na 1 g oleje, smis se 1 hodinu mí-chá a pak se ařUtruj©. ítltrát 7s©7a^#í7'^ olej s© zředí 1 ml isopropyletheru na 1 g oleje. V#» •ledn# roztok se pak po kapkách přidá d© 2f ml hexanu ne 1 g ©lej©9 dluž dojde k vysrdženl ©ar©váho avormectinu v© forai bílého prážku· První podíl ·· vlzoíuj© přibližně $ °Č, čímž se ©leká druh# podíl výsledné .^77.7¾¾ ; v- poůilr »e dál® spraeová- ' imýi vysokotlakou kapalinovou ehromatograifii k asl8. kání Čistého produktu* Postupuje |« tak, Μφ'## ku: semli je 4,1 «1 emisi Isopropyletheru* aethylky©. : 5 nidu, ethylaoetétu, hexanu e kyseliny opiové v pen§*. ru 8f t |9 í ?5 J 50 * 0,188* Tsorký ee Vstřiknou na . sloupee prepai^i^íkáv *^οοί^;#1*4.:ni . sloupec se. uvedenou smísí rospoultédel rychlostí 30 ml/ain a frak®#, které obsáhají výsledný produkt ee spoji, ta f:M:e tekl® 1 ml vaniklé smlsl obsahujappiblif~ gg mé 50 ag produktu* Vaorkyse pak vitfiknou do preparát ivní ho sloupce G-18 týehl roamird jako ''*v$*hm uvedený sloupec s obsahem oxldukřemičítého a sloupe© :* §. 'v|i$ýď^pi^stí|^ ; a vody s obsahem 2?$ mlvody, doplil^lloi^^ ae thanples. oe ;*aMeÉrÍ0tá^^ produkt· .·/>;? ^5¾¾¾¾ "::Odpovídá jícícyklopentylaveraeetin frakce při svrehu uvedené vysokotlaké kapalinové chromatograíli. !*w* 7;' ';

Mycélium S· avormitilis JC 923 <ATCC 53669), vypěstované na prostředí A IřP-2 s obsahem ageru se ulije k naočkování 50 ml prostředí AS·2 v lahvi o objemu 300 ml e láhev se pak pro* třepává při 220 Ot/ain a při teplot* 30 °C etikem $4 hodin· řek se naočkují dvě lahve o objemu 300 ml s obsahem 50 ml prostředí A?-5 vády 1 ml takto aískaná kultury· Jedna z uvedeních lahví obsahovala 0,1 % kyseliny 2-aethylaéselné, druhá tuto kyselinu neobse-** hověla, řermentaee byla prováÉěnall dnů, při teplotě 30 °C o« stálého protřepóvání. Obsahy obou lahví byly zpracovány stehny ta způsobem tak, Se plné živné prostředí bylo extrahováno čtyřnásobným přebytkem ; směsi aeetonltrilu a methanolu v poměru 510 t 15)»

Po energickém pro třepání k usnadněné extrakce anti-biotika z buněk byl čirý suápetaatant analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatograďli na přítomnost acermeetinu. V případě, že mohyla přidána alifatieká kyselina, nebylo možno prokázat avermeetlny typu *a" při citlivosti nillí ne* 0tf0 mg/l* 2a přítomnosti ii^eláay. 2-®ěthyl»áaelná byloaoSn© prokázat . A2a, Bia· a Ala v množství 0,5, 1,3, ·;.., 1,4 a 1,1 mg/1. :¾¾¾¾ --..:¾¾ i; ·-- :/; ipříkladná' byl® fařaentad'- . ní prostředí na~©5kováno S* avermitills JO 923 (AfCC 53669) očkovacím materiálem, který byl vypěstován na prostředí AS-7 stejně jako v příkladu 1$,* áako primer byla užit© kyselina S-taetfcylaáselná v koncentraci 0,05 %* V tomto, případ i bylo získáno při kontrolní řermentaei (bez prekurzorud 0,|t 0,9, méně nei 0,2 , .s- a ttánl ne* 0,2 mg/1 averaectinů B2e, áfa, Bia a Ala, kde*t při přidání alifatické kyšaliny bylo možno získat f,S, 5,0 4,9 a ř,3 mg/1 těchto látek* V tomto příkladu bylo prostřadí 'UMI naočkováno 3» avermitilia JC 9S3 UfC© 13X191 z prostředí AS-7 stehně jako v příkladu 17· V tomto případě byla přidána kyselina 2-aethylaáeelná48 ;V|ífe6aájBi 0,05 %, buňky byly oddělaný filtraci, zváženy ka «jištění vlhké hmotnosti a pak extrahovány ětyř-náaobnym hmotnostním přebytkem a extrakěního ras·* pouitědla, Při tomto zahuštění je možno dosáhnout větší citlivosti při měření titru svermectinu ve srovnání s případem, kdy byla extrahována celá živné j^éitřsdí· řro averaee tiny má(ÍMÉSfe> případě přidání kyseliny 2~methylmáeelná, hodnoty v případě kontroly bes přidání uvedená kyseliny mě* ly hodnoty 0,3, 03, 03 a 0,1 mg/1. Tyto xiíská hod* noty jsou patrně důsledkem nízkého množství ando* genníeh alifatiekých kyselin nabo sloudtnin, z nichž aa tyto kyseliny nohou tvářit v produkéním prostře* :|ťiíV|w·^ P ř í k la d 19

Formante©a byla prováděna obdob* hy® způsobem jako v příkladu 18 a tím rozdílem, ša

místo kyseliny ž-aethylméselná bylo přidáno 0,045 %M ;^t®· *|^6aa0.;‘ ^ t-' «božství 4 mg/1. Příklad 20 řermentaee etikem 16 lahvi byla ;P*4«ÉI^ '5§6?61> V: |itífcříéh 3^;^ prostředí AP*5, inkubace byla prováděna při teplot# 30 °C» živná prostředí byle naočkováno 1 ml 24 hodin stará kultury uvedeného kmene v prostředí AS-7 p* inkubaci v lahvi e objemu 300 ml § ehsahem 90 ol uve-éonáho prostředí při teplat· 3® °C* Po 66 hodinách růstu na prostředí AP-5 byla přidána k osmi lahvím %*eliito:; ie««^ řek'byly....... obsahy lahví zpracovávány stejným způsobem #ako v příkladu 16# T lahvích, jejichž prostředí bylo doplněno, byly konoentrece derivátů BSb, A?b, Blb a Alb 5,6, 41« 4$ a 68 mg/1* Jda o průmlr ze dvou po-;íbSÍ*::^^ míly' hodnoty .Z; 0,5, 4,0, 4,5 4 018,5 ag/l#1littOte^lo^ ];: : ·.· · - ;:’· · ’·.' ;.; v V:.·''*;''",'.' ' '; ' ^ lahvíoh, 3«3ieii prostředí nebylo doplněno, možno v: * méně niž 0,2 mg/l odpovídajících avsrmectlnů B2a, A2a, * Bia, a Ha· íi^/a V tomto příkladu byly prováděhy středí 2 al va Blamevlcách z plesUekébmoty o objemu 1$ »1· Oěkovaeí materiál byl připraven stejném ®pů-oobsa jako v příkladu 20 na pyeatřtdí dér? při teplotě 3Q°C, zkumavky pak byly pro třepá vény v Šikmé pé*v; loae při teplotě 30°C. Ke dvěma o těchto zkumavek pak byla po 96 hodinách od naodkovéní prostředí AP-f .. přidána jako prekureor alifatické kyselina, a to ky* s slina oyklofcaaaakarbexylové (CHO) v fconeentrael 0,043 *· 400 hodin po naodkování živného prostředí AP-5 množstvím 0,05 ml kultury v živném prostředí AS-7 bylo přidáno do každé ekuaavky θ «1 extrakfiní-ho rozpouštědla, kterém byla smi* ecatoaitrilu a nsthanolu v poměru 810 : 75 a byl stanoven titr m

VB 103 103

avermectinu v eupematantu vysokotlakou kapalinovou ehromatograřil způsobem, uvedeným v popisné δbati# fm l avftriftec|ihy-"

Blb, Alb, A3b a Ala bylo možno prokázat průměrnou koncentraci as dvou zkumavek 3,5, 6,8, 3,0, 1,4, 0,3, 0,3, 0,4, 0,3 ménf než 0,3 mg/1, Odpovídající hodnoty pro zkumavky, k nimž nabyl přidán prtkursor byly máně než 0,3, méně než 0,3, tadn? než 0,3, mán* : | než 0,3, 4,2, 2,9, 9,3* 1,3, 0,3 m£A* žádný z batat* .níeh přírodních avarmaotinů nebylo možno prokázat* '

Claims (1)

1. Způsob výroby everaectinových derivát^ tí®, Se as pSetuje za VÉtSb*^ aíbb ÍtÉ|pt^N^ bez de~ bydrogenáay ?-oxokyeelin 9 rozvStveným řetgzcem nebo bez transaminásy aminokyselin s rozvětveným řetězcem nibo bez obou t řehto enzymů ve vodném živném prostředí, kter<í obsahuj a využit tlný; zdroj dusíku, uhlíku a ií anorganických solí a sloudeninu, využitelnou při bio- iyatés*' >ÉVe*ÉSf cí se ti®, le jako sloučenina, využitelná při biosyn-téss averaeetinu st do Živného prostředí přidává ky-•sline obseného vzorce nebo sloučenina, kterou je možno na tuto kyselinu převést fermentseí i* avermitilis* příčeni R má od-liiný význam od ieopropylové nebo ÍS)-iek*butyl©vé skupiny* 3* %ůeob podle bědu 1, vyznačují-cí ee tím, ie,ee užije kmene S. avermitili* ATCC 335Ů7 *fee nm, mc mm aicc n m. 4* Způaon podl# bodu 1» vyanadu-iUÍ ·· tím, že se m sloučenin*, vyažitelná při bioeykatác* avermeetlnu do živného prostředí přidává kde » snemená a~ro*vátv*nou akuplnu, 3·3** oklikový ' atom, na n«jž 3» váeána ekapina-COOH 3* *>ov~ n«8 vázán n* al**poň t atomy nebo skupinu, ' : :: Odlilná^/OtM nebo sloučeninu, kterou 3* možno na uvedenou látka převést v průběhu fermentaoe. f. Zp&aob podle bodá 4# vyaaa-:''k^*ť.;é.e tím, *e *e a*i3» el©«S*ai»a, v níi * ino* le# polo *· α a obeahuá íc í 3 «Ϊ 6 otM tthlíkat eyía©- 5 «i ® atowd oklika a v xi«a§ alkyl*i$ afcyiok 3« *o«vitv«a v polo·* a a obsahuje $ aS I atomů uhlíku, dála eyklo-alkyl o 3 až 8 atomech oklika naho oykloalMyl O 5 itíif/¾ atouooli ofelika, vždy popřípadě sub·tituovany tt*tkyl*nov3Ntt zbytk*m nebo 3*dnía nebo vátlía pofit·» elleylOTýefe abytkfc o I «I, A atoueeh uhlíSíu nebo atomů' bálo®enu, nebo hattreeyklio)^ kruh o 3 až 6 atomech ▼ kruhu « obeahem kyiiíku Babo «Íry,naeyoený Baba aeela nebo Sáeteůal neaaeyeený a popřípadě eubstituo-3«dnia nebo vétŠíapoSteia elkylových zbytků o -1 eft 4 atomech uhlíku nebe atomů halogenu, nebo ae ull^e slouůenina, kterou že metne na uvedenou látku 6» Způeob podle bodu 4f vymatu* ;|íeí;:a*;; tím * Se fte Jeke elGuIenina,..kterou že metne převéet na aleuienlnu obecného vaeree Jt SCOOH utije eloufienins obecného kde H aá «vrchu uvedený výssna»» n mámená oelé díelo O, # aabo 6 a . Z mámené ekupinu -CH^OH, <*C$§bf v'ifcárl«* kda ’/.. v' i* zněměné atom vodíku nebo alkylový · ' y * ' / '',ί;-'Λ,'ν ' /:'''· :·',.' r ,: . · t”: r * '••'•'•V.·.'·'.’.’ ‘-^í-.V: '. · ' V’V: VBÍIM^ « •CH<COOIHeHg)?CÉ«m »fb© ^COepHOI^^Bj, «•fe© v případě, že kmeni S. evormitilis chybí pouze treneeminéza aminokyselin « rozvltvoným *#t*jře«at Je možno ^alo sloučeninu, kterou lze převrat na sloučo* ninu obecného vzorce BC09H ulit alouSenimu obecného -1 ';; t* Způsob podle bodu 5, vyanaůtt· jící oo tím, že so užilo elouěonina, v níž & znamená :;iyklobiitylJ :^/ΐ" .^yě^ři&p«ityl: v eyklohtptyl ; #**athyleyklopropyX 3-«^^áS|^Í;'φ. ; l^eyklopentonyl % J·'*{:>?(;-¾ >*et^íey||eb«3qrl (0i*/tip«aa) ^¾¾.¾ .£.:f V‘. ::: : v 3-cyklopontonyl i-í:: ’ v^áaFltíŮJdpkeéijiÉ^Ě·^^ ΐ^Γ^;'ΐ: --:.¾¾:.;-Civí 3~řluoro*ykr©butyl ' 4t4'i*Ůlílu©reykloíiexyl · / iwpmmi ; «•fc.bmtyl. 'ÍNpdtttyl .... ž · 3~di*e tfcylpr opyl 2-hexyl . 4 8-p#at-0*#nyl 2- ae tfeyl thio © thy 1 £-2-methylpentyl I-2-m*thylpentyl 4-tetrehydropyranyl ;3*fupyl $*ehlorthieayl 3- tetrehydrothienyX .; 4- methylthio-2-butyX 4-tetrahydrothiopyreayX ,' 3ÍCÍ *«; tía, i* se uSíl3t elottŽeiiiaa# v ní! 8. cykloptiityl» oyklo&eayl »©&© thienyl* b©&* §, vysaadu- jící se tím, *· it sioadtiiiaa, ▼ BÍi I mmmá alkylový 2:© atomoob ublíka, tfOEVgtvoiiý polose (**>/«: ^3i»k©a t80í>rapy2,©t# ne©© (§)-«·!&.- : : Iwtyl©'** sfcupiay. 10# Způsob podle bodu 5, rystmču-||©l s« tím, *e #« á©k© toaoii t# *y«mitiHs ušlá® kmen A2CC 53567, ATCC 53568, ÁISC 5366$ nebo ATCC 53670.

57 mm