AT11308U1 - Verfahren zur herstellung von geldanamycin - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Geldanamycin, Indema)Streptomyzeten mindestens einstufig vorkultiviert werden undb)mindestens ein Aliquot der nach a) erhaltenen Vorkultur in ein steriles Hauptkulturmedium umfassend mindestens eine Kohlenstoff-Quelle, mindestens eine Stickstoff-Quelle und mindestens eine anorganische Verbindung als Spurenelemente-Quelle überführt wird, wobei sich die Zusammensetzung des wässrigen Hauptkulturmediums von der des wässrigen Vorkulturmediums unterscheidet.

Description

österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15

Beschreibung

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON GELDANAMYCIN

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Geldanamycin mittels Streptomyzeten.

[0002] Ansamycine sind eine Gruppe bakterieller Metaboliten, die antibiotische Aktivität zeigen. Hierzu gehört auch Geldanamycin.

[0003] Erstmals beschrieben wurde Geldanamycin von DeBoer et al. als ein Metabolit des neu identifizierten Actinomyceten Streptomyces hygroscopicus var. geldanus var. nova (J. Antibiot. 23:442-7 (1970) und US 3,595,955).

[0004] Spätere Arbeiten wie beispielsweise die Studien von Rinehart et al. (Cancer Treat Rep. 61: 815-24 (1977)) deuteten auf ein Antitumorpotential dieser Substanz hin.

[0005] Es konnte gezeigt werden, das Geldanamycin spezifisch an das Heat Shock Protein 90 (Hsp90) bindet, welches für die Proteinfaltung notwendig ist und in Krebszellen überexprimiert wird. Durch diese Bindung von Geldanamycin werden Hsp90-Zielproteine wie Tyrosinkinasen, Steroidrezeptoren, Transkriptionsfaktoren und Zellzyklus-regulierende Kinasen abgebaut. Insbesondere kann die Zugabe von Geldanamycin zu einer Destabilisie-rung/Konformationsänderung der onkogenen Form des Zellzyklus-regulierenden Proteins p53 führen (Blagosklonny et al. (1995) Oncogene 11:933-9).

[0006] Erste klinische Studien konnten die antitumorigene Wirkung bestätigen, offenbarten jedoch auch eine hohe Hepatotoxizität (Supko et al. (1995) Cancer Chemother Pharmacol. 36: 305-15). Letztere konnte jedoch durch verschiedene Derivatisierungen gesenkt werden (vgl. z.B. Schulte und Neckers (1998) Cancer Chemother Pharmacol. 42: 273-9 und US 4,261,989).

[0007] Neben diesen medizinischen Verwendungen von Geldanamycin wurden auch, basierend auf den Arbeiten von Rothrock und Gottlieb (Can. J. Microbiol. (1984) 30: 1440-1447) und Toussaint et al. (Phytoprotection (1997) 78: 43-51) Anwendungen in der Pflanzen-zucht/Landwirtschaft vorgeschlagen. So beschreibt US 20080166320 die Verwendung von Geldanamycin gegen einen Pflanzenschädling.

[0008] Außer der in US 3,595,955 B1 beschrieben Aufreinigung sind weitere verschiedene Verfahren zur Herstellung von Geldanamycin und deren Derivate beschrieben worden.

[0009] WO 03/072794 offenbart ein solches Verfahren unter Verwendung von Streptomyces hydroscopicus, welcher in einer Nährlösung enthaltend Stärke und ein stärkeabbauendes Enzym gezüchtet wird.

[0010] WO 06/016773 beschreibt eine Methode zur Gewinnung von Geldanamycin und verschiedenen Derivaten unter Verwendung einer O-carbamoyl-Transferase-Negatiwariante von Streptomyces hygroscopicum subsp. duamyceticus im Labormaßstab. Weiterführende Arbeiten werden in WO 08/038877 offenbart.

[0011] Buchanan et al. (J. Nat. Prod. (2005) 68: 607-10) beschreibt einen genetisch veränderten Streptomyces hygroscopicus-Stamm (K309-27-1) geeignet zur Herstellung eines Geldana-mycin-Derivates.

[0012] Ein ähnlicher Ansatz wurde in der Veröffentlichung von Patel et al. beschrieben (Chem. Biol. (2004) 11: 1625-33).

[0013] Eine Reihe anderer Studien verfolgte den Zweck, die genetische Regulation der Gelda-namycin-Produktion in Streptomyzeten aufzuklären, um durch genetic engineering die Expressionsrate zu erhöhen. Als Beispiele für solche Studien seien die Arbeiten von Allen und Ritchie (Mol. Gen. Genet. (1994) 243: 595-9), Rascher et al. (Appl. Environ Microbiol. (2005) 71: 4862-71)oderShin etal. (J. Microbiol. Biotechnol. (2008) 18:1101-8) angeführt. 1/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 [0014] Im Rahmen der vorstehend aufgeführten Publikationen wurden Streptomyces hygrosco-picus-Stämme verwendet. Außerdem ist auch der Stamm Streptomyces violaceus niger als Geldanamycin-produzierender Stamm bekannt.

[0015] Aufgrund der therapeutischen Bedeutung des Geldanamycin bestand daher gegenüber dem Stande der Technik die Aufgabe, biotechnologische Verfahren zur Gewinnung dieses Wirkstoffes zu optimieren, insbesondere ein verbessertes Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen.

[0016] Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Geldanamycin gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass [0017] a) Streptomyzeten mindestens einstufig vorkultiviert werden und [0018] b) mindestens ein Aliquot der nach a) erhaltenen Vorkultur in ein steriles Hauptkultur medium umfassend mindestens eine Kohlenstoff-Quelle, mindestens eine Stickstoff-Quelle und mindestens eine anorganische Verbindung als Spurenelemente-Quelle überführt wird, [0019] wobei sich die Zusammensetzung des wässrigen Hauptkulturmediums von der des wässrigen Vorkulturmediums unterscheidet.

[0020] Der Begriff „Geldanamycin" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich vorzugsweise auf die Verbindung Geldanamycin selbst. In weiteren Ausführungsformen sind aber auch alle Derivate des Geldanamycin umfasst, die eine pharmakologische Wirkung, insbesondere eine antitumorigene, antibiotische, antiproliferative oder antiparasitäre Wirkung, in Säugern, insbesondere in Menschen aufweisen.

[0021] In weiteren Ausführungsformen sind unter dem Begriff „Geldanamycin" auch alle Derivate des Geldanamycin umfasst, die eine toxische Wirkung auf Pflanzenschädlinge aufweisen.

[0022] Solcherlei Derivate des Geldanamycin im Sinne der vorliegenden Erfindung sind u.a. bekannt aus den Dokumenten: [0023] WO 07/098229, WO 08/038877, WO 08/073424, WO 05/095347, WO 06/016773, US 4,261,989, US 5,932,566, US 6,872,715, Hu et al. (2004) J. Antibiotics. 57: 421-428, Le Brazi-dec et al. (2004) J. Med. Chem. 47: 3865-73. Eine Übersicht über verschiedene Derivate des Geldanamycins ist beispielsweise in dem Reviewartikel von Miyata (Curr. Pharm Des. (2005) 11: 1131-8) und dem Reviewartikel von Georgakis und Younes (Future Oncolol. (2005), 1: 273-81) zu finden.

[0024] Die entsprechende Offenbarung gilt hiermit als Offenbarung der vorliegenden Erfindung.

[0025] Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch die Herstellung wenigstens eines der Geldanamycin-Derivate, die durch die Substitution an Position 17 des Geldanamycins erhalten werden.

[0026] Der Begriff "Streptomyzeten" im Sinne der vorliegenden Erfindung steht für alle Strepto-myzeten-Stämme.

[0027] Der Begriff umfasst somit Streptomyzeten, die natürlicherweise Geldanamycin produzieren wie beispielsweise Streptomyces hydroscopicus und Streptomyces violaceus niger als auch Streptomyzeten-Stämme, die aufgrund genetic engineering Geldanamycin produzieren (können).

[0028] Vorzugsweise können erfindungsgemäß Streptomyzeten-Stämme wie Streptomyces hygroscopicus Stamm NRRL 3602 (beschrieben in Rascher et al. (2003), FEMS Microbiol. Lett., Vol 218: 223-230), Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus (hinterlegt unter Nummer JCM4427 bei der Japan Collection of Microorganisms, RIKEN Bioresource Center), Streptomyces hygroscopicus var. Geldanus, Streptomyces hygroscopicus var. geldanus (hinterlegt unter Nummer ATCC 55256 bei der American Type Culture Collection), Streptomyces hygroscopicus K279-78 (beschrieben in WO 2007/113269), Streptomyces geldanamycininus (hinterlegt unter 2/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 der Nummer DSM 41894 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) verwendet werden.

[0029] Bevorzugt werden für das erfindungsgemäße Verfahren Streptomyceten des Stammes Streptomyces violaceus niger eingesetzt. Insbesondere bevorzugt ist eine Verwendung des unter der Nummer DSM 40699 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegten Stammes.

[0030] Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine Vorkultivierung, Hauptkultivierung und Isolierung des Wirkstoffes.

[0031] Das Vorkulturmedium umfasst eine Stickstoff-Quelle, eine Kohlenstoff-Quelle und ggf. anorganische Salze von Alkali- und/oder Erdalkalimetallen sowie Antischaummittel.

[0032] Das Vorkulturmedium enthält Polysaccharide als Kohlenstoffquelle.

[0033] Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Dextrinen herausgestellt.

[0034] Die Stickstoff-Quelle des Vorkulturmediums ist Sojamehl.

[0035] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Vorkulturmedium Kalium-Verbindungen, vorzugsweise Dikaliumhydrogenphoshphat und Magnesium-Verbindungen, vorzugsweise Magnesiumsulfat.

[0036] Besonders bevorzugt ist ein Vorkulturmedium, dass Dextrin in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0 %, bevorzugt von 0,8 bis 1,5 %, besonders bevorzugt von 1,0 % Vorkulturmedium, und Sojamehl in einer Konzentration von 1,5 bis 8,0 % bevorzugt von 2,0 bis 3,0 %, besonders bevorzugt von 2,6 % Vorkulturmedium, Dikaliumhydrogenphosphat in einer Konzentration von 0,2 bis 9,0 %o, bevorzugt von 0,4 bis 0,7 %0 besonders bevorzugt von 0,5 %o Vorkulturmedium und Magnesiumsulfat in einer Konzentration von 0,02 bis 9,0 %o, bevorzugt von 0,04 bis 0,07 %o, besonders bevorzugt von 0,05 %o enthält.

[0037] Zum Animpfen der Vorkultur können Streptomyzeten in verschiedenen Stadien, u.a. auch im Sporenstadium verwendet werden.

[0038] Es hat sich gezeigt, dass sieh insbesondere bei Verwendung eines erfindungsgemäßen, wäßrigen Vorkulturmediums überraschend gute Verfahrensergebnisse erzielt werden können, wenn die Vorkultivierung der Streptomyzeten in mindestens zwei Stufen erfolgt.

[0039] Vorzugsweise wird in beiden dieser Stufen dasselbe Kulturmedium verwendet.

[0040] Dazu werden die erfindugsgemäß zum Einsatz kommenden Streptomyzeten zunächst in einer ersten Vorkulturstufe im wäßrigen Vorkulturmedium inkubiert und anschließend mindestens ein in dieser ersten Vorkulturstufe gewonnenes Aliquot, vorzugsweise unmittelbar nach der ersten Vorkultivierung, in einer zweiten Vorkulturstufe weiter gezüchtet.

[0041] Im Anschluss an diese zweite Vorkultur findet dann, vorzugsweise unmittelbar, die Kultivierung von mindestens einem Aliquot dieser zweiten Vorkultur in der Hauptkultur statt.

[0042] Erfindungsgemäß unterscheidet sich dabei das Vorkulturmedium in seiner Zusammensetzung vom Hauptkulturmedium.

[0043] Als wässriges Hauptkulturmedium wird ein Kulturmedium gewählt, das als Kohlenstoff-Quelle ein Mono- und/oder Disaccharid enthält.

[0044] Bevorzugt ist ein Hauptkulturmedium, das Glukose und/oder Saccharose als Kohlenstoff-Quelle enthält.

[0045] Insbesondere ist ein Hauptkulturmedium bevorzugt, das im wesentlichen frei von Polysacchariden ist, wobei „im wesentlichen" in diesem Zusammehang bedeutet, dass es bevorzugt höchstens 1,0 %, bevorzugter höchstens 0,5 %, noch bevorzugter höchstens 0,1 % Hauptkulturmedium Polysaccharide enthält.

[0046] Auch für das Hauptkulturmedium können die dem Fachmann bekannten Stoffe, Gemi- 3/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 sehe und dergleichen verwendet werden, die von Streptomyzeten als Stickstoffquelle verwendet werden können.

[0047] Als Stickstoff-Quelle enthält das Hauptkulturmedium Sojamehl.

[0048] Es hat sich gezeigt, dass es vorteilhaft ist, wenn das Hauptkulturmedium mindestens ein Spurenelement enthält.

[0049] Mit dem Begriff „Spurenelement" wird in der Biologie allgemein ein Stoff bezeichnet, der in nur sehr geringen Mengen für den Stoffwechsel eines jeweiligen Organismus notwendig ist und dort beispielsweise als Cofaktor von Enzymen eine essentielle Bedeutung hat. Obwohl diese Stoffe allgemein als "Spurenelement" bezeichnet werden, handelt es sich in der physiologisch relevanten Form um die entsprechenden Ionen.

[0050] Dementsprechend enthält das erfindungsgemäße Hauptkulturmedium mindestens eine anorganische Verbindungen als Spurenelemente-Quelle.

[0051] In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Hauptkulturmedium ein Kulturmedium verwendet, das mindestens eine, bevorzugt mindestens zwei, bevorzugter mindestens drei, noch bevorzugter mindestens vier, noch bevorzugter mindestens fünf, besonders bevorzugt sechs anorganische Verbindungen als Spurenelemente-Quellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen(ll)sulfat, Kupfer(ll)sulfat, Zinksulfat, Mangan(ll)sulfat, Kobalt(ll)chlorid und Natriummolybdat enthält.

[0052] Auch hat sich gezeigt, dass es von Vorteil ist, wenn das Hauptkulturmedium Ammoniumsulfat und/oder Calciumcarbonat und/oder Magnesiumsulfat enthält.

[0053] In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Hauptkulturmedium, jeweils bezogen auf 1 I Hauptkulturmedium, [0054] Glukose in einer Konzentration von 10 bis 200 g, vorzugsweise von 60 bis 100 g, besonders bevorzugt 70 g, und/oder [0055] Saccharose in einer Konzentration von 10 bis 120 g, vorzugsweise von 60 bis 100 g, besonders bevorzugt 90 g, und/oder [0056] Sojamehl in einer Konzentration von 5 bis 40 g, vorzugsweise 12 bis 20 g, besonders bevorzugt 16 g, und/oder [0057] Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 1 bis 10 g, vorzugsweise 6 bis 8 g, besonders bevorzugt 7,5 g/l, und/oder [0058] Calciumcarbonat in einer Konzentration von 1 bis 12 g, vorzugsweise von 5 bis 10 g, besonders bevorzugt 9,5 g, und/oder [0059] Eisen(ll)sulfat in einer Konzentration von 1 bis 50 mg, vorzugsweise von 8 bis 25, besonders bevorzugt 10 mg, und/oder [0060] Kupfer(11)suIfat in einer Konzentration von 2 bis 10 mg, vorzugsweise von 2 bis 4, besonders bevorzugt 3,3 mg, und/oder [0061] Zinksulfat in einer Konzentration von 25 bis 250 mg, vorzugsweise 50 mg, und/oder Mangan(ll)sulfat in einer Konzentration von 2 bis 20 mg, vorzugsweise von 03 bis 10 mg, besonders bevorzugt 4 mg, und/oder [0062] Kobalt(ll)chlorid in einer Konzentration von 1 bis 10 mg, vorzugsweise von 1,5 bis 5 mg, besonders bevorzugt 2 mg, und/oder [0063] und Natriummolybdat in einer Konzentration von 0,5 bis 5 mg, vorzugsweise von 1 bis 2 mg, besonders bevorzugt 1,3 mg.

[0064] Es ist weiterhin von Vorteil, wenn das Hauptkulturmedium zusätzlich Propylenglykol, vorzugweise in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 %, vorzugsweise bis 0,25 % Hauptkulturmedium enthält. 4/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 [0065] Der erfindungsgemäße Kultivierungsprozess bzw. Fermentationsprozess wird vorteilhafterweise unter Einhaltung der nachstehend aufgeführten Verfahrensparameter durchgeführt.

[0066] In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Vorkulturmedium während der Vorkultivierung der Streptomyzeten einen pH-Wert von 6,8 - 7,2 auf.

[0067] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Hauptkulturmedium während der Kultivierung der Streptomyzeten im Wesentlichen einen pH-Wert von 6,9 bis 7,4 auf.

[0068] Bei einer ggf. notwendigen Korrektur des pH-Wertes während der Kultivierung wird vorzugsweise eine sterile NaOH-Lösung bzw. eine sterile Schwefelsäure-Lösung verwendet.

[0069] Vorzugsweise sollte ein pH-Wert von 6,8 - 7,2 während der gesamten Vorkultivierung bzw. ein pH-Wert von 6,9 - 7,4 während der gesamten Hauptkultivierung eingehalten werden.

[0070] Für die Hauptkultivierung wird ein steriles Kulturmedium benötigt. Die Sterilisierung erfolgt vorzugsweise gemäß üblicherweise verwendeten Verfahren, besonders bevorzugt wird die Sterilisierung mittels Autoklavierung vorgenommen.

[0071] Hinsichtlich der Kultivierungstemperaturen sollte sowohl für die Vorkultivierung als auch für die Hauptkultivierung, vorzugsweise eine Temperatur im Bereich von 26 bis 30 °C, besonders bevorzugt eine Temperatur von 28 °C eingehalten werden.

[0072] Es ist daraufzu achten, dass vorzugsweise während der genannten Vorkultivierung bzw. Hauptkultivierung die angegebenen Temperaturen eingehalten werden.

[0073] Die Vorkultivierung und/oder die Hauptkultivierung erfolgt vorzugsweise bei einer Luftfeuchtigkeit von 60% bis 70%.

[0074] Außerdem sollte erfindungsgemäß die Kultivierung der Streptomyzeten unter mechanischer Bewegung, vorzugsweise sowohl bei der Vorkultivierung als auch bei der Hauptkultivierung, mit bis zu 200 Upm erfolgen.

[0075] Insbesondere bei der Hauptkultivierung sollte die Konzentration des gelösten Sauerstoffs bevorzugt einen Wert von 20% bis 30% aufweisen, wobei die Regulierung von dieser Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch die Variation der Drehzahl erfolgen kann.

[0076] So kann einem Absinken der Konzentration des gelösten Sauerstoffs beispielsweise durch eine Erhöhung der Drehzahl bis auf 450 Upm und/oder eine Erhöhung des Sauerstoffgegendrucks auf bis zu 1,5 bar entgegengewirkt werden.

[0077] Das Volumen der ersten Vorkulturstufe, d.h. das Volumen enthaltend das Kulturmedium und Streptomyzeten, beträgt vorzugsweise von 0,1 bis 25 %, [0078] besonders bevorzugt von 1,0 bis 15 %, ganz besonders bevorzugt von 2,5 bis 10 % der zweiten Vorkulturstufe.

[0079] Die Vorkultivierung der Streptomyzeten in der ersten Vorkulturstufe erfolgt vorzugsweise für 24 bis 96 h, besonders bevorzugt für 48 bis 80 h, ganz besonders bevorzugt für 60 bis 80 h. Besonders bevorzugt erfolgt die Vorkultivierung in der ersten Vorkulturstufe für bis zu 72 h.

[0080] Das Volumen der zweiten Vorkulturstufe, d.h. das Volumen enthaltend das Kulturmedium und Streptomyzeten, beträgt vorzugsweise von 0,1 bis 25 %, besonders bevorzugt von 1,0 bis 15 %, ganz besonders bevorzugt von 2,5 bis 10 % der Hauptkultur.

[0081] Die weitere Vorkultivierung der Streptomyzeten in der zweiten Vorkulturstufe erfolgt vorzugsweise für 24 bis 72 h, besonders bevorzugt von 32 bis 60 h, ganz besonders bevorzugt von 40 bis 56 h. Besonders bevorzugt erfolgt die Kultivierung in der zweiten Vorkulturstufe für bis zu 48 h.

[0082] Zur Hauptkultivierung kann mindestens ein Aliquot aus der Vorkultivierung überführt werden. Es ist jedoch auch möglich, dass jeweils mindestens ein Aliquot aus verschiedenen zweiten Vorkultivierungsstufen in die Hauptkultivierung überführt werden. 5/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 [0083] Die Hauptkultivierung der Streptomyzeten erfolgt vorzugsweise für 72 bis 240 h, besonders bevorzugt für 96 bis 168 h, ganz besonders bevorzugt für 108 bis 144 h. Besonders bevorzugt erfolgt die Hauptkultivierung für bis zu 120 h.

[0084] Die Hauptkultivierung der Streptomyzeten erfolgt vorzugsweise in einem Fermenter. Geeignet sind Fermenter, die vorzugsweise ein Volumen von 10 L bis 250 m3, besonders bevorzugt von 20 L bis 100 m3 aufweisen.

[0085] Ein erfindungsgemäß zum Einsatz kommender Fermenter sollte vorzugsweise über Schikanen, bevorzugt über mindestens drei Schikanen, besonders bevorzugt über vier Schikanen verfügen.

[0086] Etwaiger, insbesondere während der Hauptkultivierung entstehender Schaum, kann vorzugsweise unter Verwendung eines Entschäumungsmittels enthaltend Silikonöl bekämpft werden.

[0087] Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kultivierung von Streptomyzeten gewonnene Geldanamycin kann während und/oder nach der Kultivierung der Streptomyzeten isoliert werden. Dieses kann gemäß üblichen Verfahren erfolgen, insbesondere durch Abtrennung des Geldanamycins aus dem Kulturmedium. Gegebenfalls wird das isolierte Geldanamycin gereinigt.

[0088] Verfahren zur Isolierung von mit Hilfe von Streptomyzeten-Kulturen hergestellten Geldanamycin sind dem Fachmann bekannt.

[0089] Auch Verfahren zur Aufreinigung von Geldanamycin sind dem Fachmann bekannt, wobei eine Umkristallisation bevorzugt ist.

[0090] Grundlagen der Fermentationstechnologie sind auch u.a. dargestellt in: "Bioprozesstechnik" von Horst Chmiel (Hrsg.), Spektrum Akademischer Verlag (2008), "Principles of Fermentation Technology" von Peter Stanbury et al., Verlag Butterworth Heinemann (1999) oder "Fermentation Microbiology and Biotechnology" von El Mansi et al. (Hrsg), Verlag CRC Press Inc. (2002). Die entsprechende Offenbarung wird hiermit als Referenz eingeführt und gilt als Offenbarung der vorliegenden Anmeldung. BEISPIEL 1 BAKTERIENSTAMM: [0091] Streptomyces violaceus niger (Hinterlegt unter der Nummer DSM 40699 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) wurde als Bakterienstamm verwendet. VORKULTIVIERUNG: [0092] Die Vorkultivierung wurde zweistufig in Erlenmeyerkolben durchgeführt.

[0093] Für die erste Stufe wurde ein Erlenmeyerkolben (Füllvolumen 500 ml) mit 60 ml eines wässrigen Mediums der folgenden Zusammensetzung befüllt: Dextrin (weiss) 1.0 % [0094] Sojamehl fein 2.6 % [0095] Di-kaliumhydrogenphosphat 0,05 % [0096] Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,05 %o [0097] Die Konzentrationsangaben beziehen sich auf das Volumen des Mediums inkl. der Menge der zugesetzten Streptomyzeten zum Zeitpunkt des Animpfens.

[0098] Nach Zugabe der Streptomyzeten wurde der Erlenmeyerkolben mit Wattestopfen verschlossen.

[0099] In der darauf folgenden ersten Vorkulturstufe wurde das Vorkulturmedium für 72 h bei einer Temperatur von 28 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60-70%, einem pH-Wert von 6,8 - 7,2, 6/10 > österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 Upm und einem Hub von 50 mm inkubiert.

[00100] Im Anschluss an diese erste Vorkulturstufe wurden 10 ml dieser Kultur in einer 2. Vorkulturstufe, wie folgt, weiter kultiviert: [00101] Ein mit 1000 ml des vorstehend genannten Vorkulturmediums gefüllter Erlenmeyerkolben (Füllvolumen 2000 ml) wurde mit 10 ml der in der ersten Vorkultivierungsstufe enthaltenen Vorkultur angeimpft und für 48 h bei einer Temperatur von 28 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60-70%, einer Schüttelgeschwindigkeit von 200 Upm und einem Hub von 50 mm weiter inkubiert. HAUPTKULTIVIERUNG: [00102] Zur Hauptkultivierung wurde ein wässriges Hauptkulturmedium mit folgender Zusammensetzung verwendet: [00103] Sojamehl (fein, entfettet, getoastet) 1,6 % [00104] Ammoniumsulfat (technisch) 0,75 % [00105] Magnesiumsulfat Heptahydrat (technisch) 0,1 g/l % [00106] Glukose Monohydrat (rein) 7,0 % [00107] Saccarose zur Fermentation (krist.) 9,0 % [00108] Calciumcarbonat (gefällt) 0,95 % [00109] Spurenelementestammlösung 1,0 % (wie nachstehend beschrieben) [00110] Propylenglykol 2000 0,25 % [00111] mit Brunnenwasser auffüllen [00112] Die Spurenelemente-Stammlösung setzte sich wie folgt zusammen (wobei sich die

Konzentrationsangaben auf die Spurenelemente-Stammlösung beziehen): Eisen(ll)sulfat Heptahydrat (krist., rein) 1,0 %o [00113] Kupfer(ll)sulfat Pentahydrat z.A. 0,33 %o [00114] Zinksulfat-Hexahydrat, krist. techn. 5,00 %o [00115] Mangan(ll)sulfat Monohydrat reinst. 0,4 %o [00116] Kobalt(ll)chlorid-Hexahydrat z.A. 0,2 %o [00117] Natriummolybdat-Dihydrat z.A. 0,13 %o [00118] mit Brunnenwasser auffüllen [00119] Der pH-Wert der nativen Spurenelementestammlösung betrug 2,0.

[00120] Die pH-Wert-Einstellung der Spurenelement-Stammlösung erfolgte mit einer Lösung von 150 g Schwefelsäure (konz., techn.) pro Liter vollentsalztes Wasser.

[00121] Der pH-Wert des Hauptkulturmediums vor der Sterilisation betrug 7,0-7,5.

[00122] Die Sterilisation des Hauptkulturmediums erfolgte für 20 min bei 121 °C.

[00123] Der pH-Wert des sterilen Mediums betrug 7,3 - 7,6.

[00124] Das Auffüllvolumen nach der Sterilisation betrug 1161.

[00125] Das Hauptkulturmedium wurde mit 3,4 % der zweiten Vorkulturstufe, also mit insgesamt ca. 4 I dieser Vorkultur angeimpft.

[00126] Die Kultivierung erfolgte in einem 150 I Fermenter mit einer Höhe von 1,14 m und einen Durchmesser von 0,41. Der Fermenter verfügte über 3 Scheibenrührer mit einem Durchmesser von 0,21 m und 4 Schikanen mit einer Breite von 0,03 m. 7/10

Claims (9)

1. österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15 [00127] Die Fermentation erfolgte bei 28 °C, einer Luftrate von 120 l/min, einer Drehzahl von 100 Upm. [00128] Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde regelmäßig kontrolliert. [00129] Um ein Absinken der Konzentration des gelösten Sauerstoffs unter 20% zu vermeiden, wurde, wenn notwendig, die Drehzahl schrittweise um je 5 Upm bis maximal 450 Upm erhöht und der Gegendruck schrittweise um je 0,1 bar auf maximal 1,5 bar erhöht. [00130] Um ein Ansteigen der Konzentration des gelösten Sauerstoffs über 30% zu vermeiden, wurde, wenn notwendig, die Drehzahl schrittweise um je 5 Upm bis minimal 120 Upm erniedrigt und der Gegendruck schrittweise um je 0,1 bar auf minimal 0,7 bar reduziert. [00131] Die pH-Regulierung während der Fermentation erfolgte mittels einer Lösung von 200 g Natriumhydroxid (techn.) pro Liter Brunnenwasser bzw. mittels einer Lösung von 150 g Schwefelsäure (konz., techn.) pro Liter vollentsalztes Wasser. [00132] Die Lösungen wurden vorweg jeweils für 20 min bei 121 °C sterilisiert. [00133] Der pH-Wert der Kultur lag während der Fermentation zwischen 6,9 und 7,4. [00134] Bei Bedarf erfolgte eine Schaumbekämpfung durch Zugabe eines Entschäumers (Silikonöl siliziumoxidhaltig), der ebenfalls vorweg für mindestens 30 min bei 120 °C sterilisiert worden war. [00135] Die Hauptkultivierung erfolgte während einer Dauer von 120 h. Das Geldanamycin wurde aus dem Hauptkulturmedium mittels Gesamtbreiextraktion extrahiert unter Verwendung von Essigester verwendet. Die Lösung wurde nach der Extraktion abgedampft und der Wirkstoff nach einem Entfernungsschritt mit Cyclohexan in Methanol umkristallisiert. Ansprüche 1. Ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Geldanamycin oder Geldanamycin-Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass a) Streptomyzeten mindestens zweistufig vorkultiviert werden, wobei das Vorkulturmedium (i) Polysaccharide als Kohlenstoff-Quelle (ii) Sojamehl als Stickstoff-Quelle enthält, b) mindestens ein Aliquot der nach a) erhaltenen Vorkultur in ein steriles Hauptkulturmedium umfassend (i) ein Mono- und/oder Disaccharid als Kohlenstoff-Quelle (ii) Sojamehl als Stickstoff-Quelle (iii) mindestens eine anorganische Verbindung als Spurenelemente-Quelle überführt wird, und c) das durch die Kultivierung der Streptomyzeten gewonnene Geldanamycin oder Gelda-namycin-Derivat isoliert und ggf. aufgereinigt wird.
2. 2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Streptomyzeten des Stammes Streptomyces violaceus niger, vorzugsweise Streptomyces violaceus niger DSM40699 verwendet werden.
3. 3. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Vorkulturmedium als Kohlenstoff-Quelle Dextrin und das Hauptkulturmedium als Kohlenstoff-Quelle Glukose und/oder Saccharose enthält.
4. 4. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorkulturmedium Dikaliumhydrogenphosphat und Magnesiumsulfat enthält.
5. 5. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorkulturmedium Dextrine in einer Konzentration von 0,5 bis 5,0% Vorkulturmedium, Sojamehl in einer Konzentration von 1,5 bis 8,0% Vorkulturmedium, Dikaliumhydrogenphosphat in einer Konzentration von 0,2 bis 9,0 %o Vorkulturmedium und Magnesiumsulfat in einer Konzentration von 0,02 bis 9,0 %o Vorkulturmedium enthält. 8/10 österreichisches Patentamt AT 11 308 U1 2010-08-15
6. 6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Vorkulturmedium Dextrine in einer Konzentration von 0,8 bis 1,5 % Vorkulturmedium, Sojamehl in einer Konzentration von 2,0 bis 3,0% Vorkulturmedium, Dikaliumhydrogenphosphat in einer Konzentration von 0,4 bis 0,7 %o Vorkulturmedium und Magnesiumsulfat in einer Konzentration von 0,04 bis 0,07 %o Vorkulturmedium enthält.
7. 7. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hauptkulturmedium als Spurenelemente-Quelle mindestens zwei anorganische Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Eisen(ll)sulfat, Kupfer(11)suIfat, Zinksulfat, Mangan(ll)sulfat, Kobalt(lI)chlorid und Natriummolybdat, und ggf. Ammoniumsulfat und/oder Calciumcarbonat und/oder Magnesiumsulfat enthält.
8. 8. Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Hauptkulturmedium Glukose in einer Konzentration von 10 bis 200 g und/oder Saccharose in einer Konzentration von 10 bis 120 g und/oder Sojamehl in einer Konzentration von 5 bis 40 g und/oder Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 1 bis 10 g und/oder Calciumcarbonat in einer Konzentration von 1 bis 12 g und/oder Eisen(ll)sulfat in einer Konzentration von 1 bis 50 mg und/oder Kupfer(ll)sulfat in einer Konzentration von 2 bis 10 mg und/oder Zinksulfat in einer Konzentration von 25 bis 250 mg und/oder Mangan(ll)sulfat in einer Konzentration von 2 bis 20 mg und/oder Kobalt(ll)chlorid in einer Konzentration von 1 bis 10 mg und/oder Natriummolybdat in einer Konzentration von 0,5 bis 5 mg, jeweils bezogen auf 1 I Hauptkulturmedium, enthält.
9. 9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Hauptkulturmedium Glukose in einer Konzentration von 60 bis 100 g und/oder Saccharose in einer Konzentration von 60 bis 100 g und/oder Sojamehl in einer Konzentration von 12 bis 20 g und/oder Ammoniumsulfat in einer Konzentration von 6 bis 8 g und/oder Calciumcarbonat in einer Konzentration von 5 bis 10 g und/oder Eisen(ll)sulfat in einer Konzentration von 8 bis 25 mg und/oder Kupfer(ll)sulfat in einer Konzentration von 2 bis 4 mg und/oder Zinksulfat in einer Konzentration von 50 mg und/oder Mangan(ll)sulfat in einer Konzentration von 3 bis 10 mg und/oder Kobalt(ll)chlorid in einer Konzentration von 1,5 bis 5 mg und/oder Natriummolybdat in einer Konzentration von 1 bis 2 mg, jeweils bezogen auf 1 I Hauptkulturmedium, enthält. 9/10