JP2858951B2 - アベルメクチン類の産生プロセスとそのための培養法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、側鎖のあるアミノ酸に対するトランスアミ
ナーゼ活性（ilvE）および側鎖のある２−オキソ酸の生
合成活性（“early ilv"）が欠けている、そして必須で
はないものの望ましくはアベルメクチンＢ−Ｏ−メチル
トランスフェラーゼ活性が欠けているストレプトミセス
アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）の菌株
に関し、かつ該S.アベルミチリスの産生法に関し、かつ
側鎖のある脂肪酸もしくは側鎖のある２−オキソ酸化合
物もしくはその誘導体もしくはその前駆体を用いること
により、天然型及び非天然型アベルメクチン類を産製す
るためにS.アベルミチリスを利用することに関するもの
である。

背景技術 米国特許第４、310、519号と４、429、042号は、優れ
た抗寄生虫活性を持つ化合物であるアベルメクチン類
と、それらをストレプトミセス アベルミチリス、すな
わち、S.アベルミチリス ATCC Nos.31267、31271およ
び31272の菌株を好気的に培養することにより生産する
ことについて記述している。それら菌株のうち、後者２
つについては、S.アベルミチリス ATCC 31267の紫外線
照射によりえた培養物を、ぞれぞれ凍結してバイヤル瓶
に保存したものおよび凍結乾燥したものである。

1986年７月16日に提出された米国特記出願番号886、8
67、の対応出願であり、1987年３月18日に公開されたEP
第214、731号は、とくに、25−位に優れた置換基を持つ
天然もしくは既知のアベルメクチン類に関連する多くの
化合物（ここでは、非天然アベルメクチンとしている）
について、および、特定のカルボン酸や、アベルメクチ
ン類の誘導体や前駆体存在下でアベルメクチン産生菌体
を培養することによりアベルメクチン類を調製するプロ
セスについて、ならびに、前述の非天然アベルメクチン
類を用いることによる昆虫や寄生虫感染またはそれらの
蔓延を治療し、予防するための合成物や方法について開
示している。優れた性質をもつ該Ｃ−25置換アベルメク
チン類を産生するのに用いたS.アベルミチリス菌株はS.
アベルミチリスATCC 31267、31271、31272およびCIB 12
121である。EP第214、731号に記載されている、これら
のうちの最後の菌株は、S.アベルミチリスATCC 31271よ
り誘導されたものである。それは、ある程度特定の培養
液中で培養されると、優れた性質を持つＣ−25置換アベ
ルメクチン類をよりよい産生率で産生する。ATCC 3126
7、31271、31272およびNCIB 12121はそれぞれ、優れた
性質を持つＣ−25置換アベルメクチン誘導体を産生する
だけでなく、25位の置換基がイソプロピルもしくは
（Ｓ）−sec−ブチル（１−メチルプロピル）である、
既知のもしくは天然のアベルメクチン類を種々の量産生
することがある。

アベルメクチン類の炭素骨格（下記の式（Ｉ）に記
述）は、酢酸もしくはプロピオン酸前駆体に由来するも
のであり、天然アベルメクチン類のＣ−25置換基はＬ−
イソロイシン（Ｒ＝（Ｓ）−sec−ブチル）もしくはＬ
−バリン（Ｒ＝イソプロピル）である（Fisher and Mro
zik,"マクロライド抗生物質”、アカデミック プレス
（1984）14章）。

”既知”もしくは”天然”アベルメクチン類はS.アベ
ルミチリス ATCC 31267、ATCC 31271およびATCC 31272
より産生されたアベルメクチン類を意味し、それらの25
位の置換基はイソプロピルもしくは（Ｓ）−sec−ブチ
ル（１−メチルプロピル）である。25位の置換基がイソ
プロピルもしくはsec−ブチル（Ｓ型）以外のアベルメ
クチン類は、ここでは優れた性質を持つもしくは非天然
のアベルメクチン類としている。

上記の米国特許で引用されているS.アベルミチリスの
菌株は、そこでＣ−076と一般的に記述されているクラ
スの物質を産生する。そのクラスは、８つの独立した、
しかし密接に関連した、Ｃ−076、Ala,Alb,A2a、A2b,B1
a,B1b,B2aおよびB2bと記述される化合物からなる。"a"
シリーズの化合物は、25位の置換基が（Ｓ）−sec−ブ
チルの天然アベルメクチン類であり、"b"シリーズは、2
5位の置換基がイソプロピルのそれらである。"A"と"B"
の記号は、５位の置換基がそれぞれメチルオキシ基もし
くはヒドロキシ基のアベルメクチン類である。最後に、
数字"1"は、22−23位の間に二重結合のあるアベルメク
チン類を指し、数字の"2"は22位に２つの水素を持ち、2
3位にヒドロキシ基と水素を持つアベルメクチン類であ
る。

今回の場合、非天然アベルメクチンの25位置換基に関
し、そのような識別子は用いない。A1,A2,B1そしてB2の
識別子は、前述の天然アベルメクチン類の構造的特徴に
対応する構造的特徴を持つ非天然アベルメクチン類につ
いて記述する際に引き続き利用する。

側鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠けている
変異株の世代については、バチラス サブチリス（Baci
llus subtilis）についてはWilleckeとPardeeが（J.Bio
l.Chem.246、p5264−72（1971））報告しており、シュ
ードモナス プティダ（Pseudomonas putida）について
はMartinらが（J.Bacteriology 115,p198−204）報告し
ている。

実質的にはアベルメクチンアグルコンA1aとA2aしか産
生しない変異株であるS.アベルミチリス Agly−１につ
いては、Schulmanらによって（J.Antibiot.38（11）,p1
494−1498（1985））報告されている。そこではさら
に、アベルメクチンアグリコンＢ化合物類の産生を増大
させるサイネフンジン（sinefungin）の存在下でのS.ア
ベルミチリスAgly−１の培養についても報告している。
同様に、アベルメクチンを大量に産生する株であるS.ア
ベルミチリス08は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素
阻害剤であるサイネフンジンの存在下で培養されると、
アグリコンのＣ−５位とオレアンドロース二糖体部分に
Ｏ−メチル基のないアベルメクチン類を産生するように
なる。

米国特許第４、378、353号はＣ−076関連化合物と、
紫外線照射により得られたS.アベルミチリス ATCC 312
72の変異株であるMA-5218の培養によるそれらの調製に
ついて記載している。この変異株はATCC 31780と呼ばれ
る。該変異株が産生するＣ−076関連化合物は、Ｃ−076
フラン環を欠いている。さらに、報告されている化合物
のあるものは、一つもしくは両方のオレアンドロース糖
領域が欠けており、また他のものは、５位の基がケト基
である。

Ｏ−メチル基を欠くアベルメクチン類を産生するS.ア
ベルミチリスの、３つのＯ−メチルトランスフェラーゼ
酵素変異株のクラスについては、Rubyら（第６回”アク
チノミセス（Actinomycetes）類の生物学”に関する国
際シンポジウム、デブリセン（Debrecen）、ハンガリ
ー、８月26−30日（1985））およびSchulmanら（Antimi
crobial Agents and Chemotherapy 31,p744−７（198
7））が報告している。最初のクラスは、マクロ環状ラ
クトン環のＣ−５位のヒドロキシル基をメチル化できな
い（ここでは後で、アベルメクチン Ｂ−Ｏ−メチルト
ランスフェラーゼ酵素活性として参照する）ことによ
り、主としてＢアベルメクチン類を産生する。２番目の
クラスは、ジメチルアベルメクチン類として参照され
る、３−Ｏ−bis−ジメチルアベルメクチン類（３位の
両オレアンドロース単糖残基がＯ−メチルに置換されて
いないアベルメクチン類）を産生する。３つ目のクラス
は、どの位置もメチル化できない。

Schulmanらは（Fed.Proc.44,p931（1985））、アベル
メクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素による
アグリコン領域のＣ−５ヒドロキシ残基のメチル化を阻
害するサイネフンジン、Ｓ−アデノ化エチオニンおよ
び、Ｓ−アデノ化ホモシステインといった物質の存在下
で、S.アベルミチリスを培養することにより、Ｂ アベ
ルメクチンの産生が増大することを開示した。Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ酵素活性に欠け、アベルメクチン
Ｂ化合物をより多く産生するストレプトミセス アベル
ミチリスの変異株についても、Schulman等によってAnti
microbial Agents and Chemotherapy 29、p620−624（1
986）で開示されかつ引用されている。

EP第284、176号は、1978年10月13日に登録された、米
国特許出願番号第107、825の対応出願であり、そこでは
譲受人の名前で登録され、1988年の９月28日に公開され
ており、1991年２月27日に登録された米国特許出願番号
第660、912を係属にすることにより合意して今や放棄さ
れ、その譲受人へ譲渡されているが、とりわけ、側鎖の
あるアミノ酸のトランスアミナーゼ活性もしくは側鎖の
ある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性のいずれかまた
は両方が欠けているストレプトミセス アベルミチリス
の菌株について、および、そのようなS.アベルミチリス
の菌株を生成した方法、および、それら菌株を用いる天
然型並びに非天然アベルメクチン類の産生について開示
している。そこで開示されているS.アベルミチリス菌株
の中には、ATCC 53567として寄託されている、側鎖２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠けるS.アベルミチリ
スの菌株や、ATCC 53670として寄託されている、側鎖ア
ミノ酸トランスアミナーゼ活性と側鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ活性がともに欠けるS.アベルミチリスの菌
株もある。

米国特許第５、077、278号は、その譲受人に譲渡され
ているが、とりわけ、非天然脱メチルアベルメクチン類
および、側鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性が欠け
ているストレプトミセス アベルミチリスの培養による
非天然脱メチルアベルメクチン類の産生過程について開
示している。

EP第276、103号は、譲受人の名前で出願され、1988年
７月27日に公開されて、1987年12月１日出願の米国特許
出願番号第126、650に対応する出願であるが、いまや19
91年２月26日出願の米国特許出願番号第660、971を係属
にすることに合意して放棄され、譲受人に譲渡されてい
るが、とりわけ、側鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性とアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
活性に欠けるストレプトミセス アベルミチリス菌株に
ついて、および、そのようなS.アベルミチリス菌株を生
成する方法、および、そのようなS.アベルミチリス菌株
を用いて天然および非天然Ｂアベルメクチン類を産生す
ることを開示している。

EP第317、148号は、1989年５月24日に公開されてお
り、1988年９月27日に出願された米国特許出願番号第24
9、749の対応出願であるが、いまや1991年１月25日に出
願された米国特許出願第647、674を係属にすることに合
意して放棄されているが、とりわけ、25位の炭素原子に
結合したα分岐した炭素原子を含まない、25位に優れた
性質を持つ置換基を持つ天然もしくは既知のアベルメク
チン類に関連した非天然アベルメクチン類について、お
よび、特にS.アベルミチリスATCC 53567およびATCC5356
8といった、側鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性を
欠くS.アベルミチリスの培養によりそれらを調製する過
程について開示している。そこでは、さらに組成物と、
そのような非天然アベルメクチン類による昆虫や寄生虫
感染もしくは蔓延の治療と予防法について開示してい
る。

側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性および側
鎖２−オキソ酸生合成活性が欠けていて、また場合によ
りアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活
性の欠けているS.アベルミチリスの変異株は、もはやＲ
−COOH（Ｒはイソプロピルもしくは（Ｓ）−sec−ブチ
ル）化合物または、培養過程でＲ−COOHと同じ様な働き
をする化合物を加えない限りまとまった量の天然アベル
メクチン類を産生する能力を持っていない。しかしなが
ら、驚くべきことにそして予期せぬことに、変異株は、
もしＲ−COOHもしくはＲ−Ｃ−COOH（Ｒはイソプロピル
もしくは（Ｓ）−sec−ブチル）、もしくはここで開示
する他のグループ、もしくはそれらの前駆体の存在下で
培養すれば、天然もしくは非天然のアベルメクチン類を
産生することが分かった。さらに驚くべきことには、こ
こで記述する変異株は、Ｌ−イソロイシン、もしくはＬ
−ロイシン、もしくはＬ−バリンを分解できず、また成
長のためにはこれら３つのアミノ酸を必要とするが、非
天然アベルメクチンを産生する際には、非常に多様な化
合物をアベルメクチン生合成経路に取り込むことが可能
である。

側鎖のある脂肪酸前駆体もしくは側鎖のある２−オキ
ソ酸前駆体を用いることによりアベルメクチンを産生す
る能力は、望ましい目標である。

発明の開示 側鎖のあるアミノ酸に対するトランスアミナーゼ活性
（ilvE）および側鎖のある２−オキソ酸の生合成活
性（"early ilv"）が欠けている、そして必須ではない
ものの望ましくはアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ活性が欠けているS.アベルミチリスの菌株
は、側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性が欠け
ているS.アベルミチリス変異株と、側鎖のある２−オキ
ソ酸生合成活性が欠けているS.アベルミチリス変異株を
原形質融合させることにより作成することができた。そ
のような菌株のそれぞれもしくは一つは、場合によりア
ベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性も
欠けることがあった。そのような原形質融合に用いたS.
アベルミチリス菌株は、S.アベルミチリスATCC 53567お
よびATCC 53670から変異させることにより得ることがで
きた。しかしながら、融合に使うそのような菌株のう
ち、ただ一つだけが側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゼ活性に欠けていた。というのは、ここで多くの変
異株は、アベルメクチンの合成において、側鎖のある２
−オキソ酸類や、それらの前駆体を利用するために、側
鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の存在が必
要であったからである。ここで、変異株としたものに
は、そのような融合で得た融合細胞（fusant）が含まれ
ている。結果として得た変異株は、それらが培養される
培養液中にイソプロピルもくしはsec−ブチル（Ｓ−
型）基を持つ脂肪酸やそれらの前駆体加えられないと実
質的な量の天然アベルメクチンを合成することができな
い。それらは、培養過程で、適当な引き金となる酸もし
くは同等の化合物を含む栄養培地で、好気的に水のある
条件で培養されたとき、実質的な量の天然もしくは非天
然アベルメクチンを産生することができる。

ここで、遺伝的組み替えを行い、側鎖のあるアミノ酸
トランスアミナーゼ活性の欠如で特徴づけられたこれら
の変異株は、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、そして
Ｌ−バリンを欠く定まった最低培養液中で成長できない
ということを利用して変異をかけたコロニーから選択し
た。そのような変異株は、時として科学論文ではilvE変
異株として参照される。実際、カザミノ酸中に見いださ
れるすべての個々のアミノ酸を補った、M9塩グルコース
ベースの寒天培地上で生育する単一のコロニーは、同様
だが、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリ
ンがない培地に移される。生育のためＬ−イソロイシ
ン、Ｌ−ロイシンおよびＬ−バリンの、すべて３つのア
ミノ酸が必要だが、しかし、そのようなアミノ酸のうち
２つでは生育することができないコロニーは、側鎖のあ
るアミノ酸トランスアミナーゼ活性がネガティブ（ilv
E）と考えられ、専門分野に詳しい人にはよく知られた
生化学アッセイで確認することができる。

ここで遺伝的組み替えを行い、側鎖のある２−オキソ
酸生合成活性の欠如で特徴づけられたそれらの変異株
は、Ｌ−イソロイシンとＬ−バリンを欠く培養液中で成
長できないということを利用して変異をかけたコロニー
から選択した。そのような変異株は、Ｌ−ロイシンの必
要性はまだ示されていないが、early ilv変異株として
参照される。実際、カザミノ酸中に見いだされるすべて
の個々のアミノ酸を補った、M9塩グルコースベースの寒
天培地上で生育する単一のコロニーは、同様だが、Ｌ−
イソロイシンとＬ−バリンがない培地に移される。その
ような変異株は、Ｌ−ロイシンを生育に必要としない。
変異をかけられ、その変異株は側鎖のあるアミノ酸トラ
ンスアミナーゼ活性もしくは側鎖のある２−オキソ酸生
合成活性の欠如で選択された、S.アベルミチリスの菌株
は、それ自身たとえば、アベルメクチンＢ−Ｏ−メチル
トランスフェラーゼ活性を欠くS.アベルミチリスの変異
株でありうる。あるいは、側鎖のあるアミノ酸トランス
アミナーゼ成活性が欠けているか、もしくは側鎖のある
２−オキソ酸生合成活性が欠けている、そのような変異
株のどちから一方もしくは両方は、変異をかけることに
より、アベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラー
ゼ活性に欠ける変異株として選択される。アベルメクチ
ンのアグリコンのＣ−５位の酸素をメチル化することが
できない。そのような活性に欠ける変異株は、基本的に
はＡアベルメクチンの産生を阻害することによりＢアベ
ルメクチンだけを産生するので、そのように同定する事
ができる。そのような変異株は望ましい。

S.アベルミチリスの変異株は、側鎖のあるアミノ酸ト
ランスアミナーゼ活性および側鎖のある２−オキソ酸生
合成活性の欠如、そして、場合によりアベルメクチンＢ
−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性の欠如で特徴づけ
られるが、さらにここではＯ−メチルトランスフェラー
ゼ活性についても言及する。そしてそれらは、側鎖のあ
るアミノ酸トランスアミナーゼ活性、および場合により
アベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性
に欠ける変異株と、側鎖のある２−オキソ酸生合成活
性、および場合によりアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルト
ランスフェラーゼ活性に欠ける変異株とを遺伝的に組み
替えることによりつくることができる。

驚くべきことに、そして予期せぬことに、ここで記述
した、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性と側鎖のある
アミノ酸トランスアミナーゼ活性に欠ける変異株は、細
胞外より供給された側鎖のある２−オキソ酸前駆体もし
くは、側鎖のある脂肪酸前駆体もくしはそれらと同等の
化合物を取り込むことにより、天然アベルメクチンと、
特に非天然アベルメクチンを産生する能力を保持してい
る。

この発明はさらに、その外見や生理学的振る舞いによ
らず、また、核酸もしくはここで記述した種類と同等の
物質を用い、形質転換、形質導入、遺伝的組み替えもし
くはその他の遺伝的手法により、そしてそれによりここ
で記述した変異株が獲得した特性を持つよう開発した、
いかなる有機体をも含んでいる。

ここで用いられる”アベルメクチン”もしくは”アベ
ルメクチン類”という言葉は、25位の置換基（Ｒ）がこ
の発明のS.アベルミチリスの該位置にあるものと同等の
基を持つ、式（Ｉ）の構造の化合物である。

ここで記述した変異株は、ここで開示し例示した過程
により非天然アベルメクチン類を産生するのにたいへん
有用である。それらは、望ましいアベルメクチン類を生
成するのにとりわけ有用である。そのアベルメクチン類
とは、すなわち、Ｃ−25の置換基がC₄−C₆であり、特に
好ましいアベルメクチン類は、Ｃ−25位にシクロヘキシ
ル基を持ち、さらに好ましいアベルメクチンは、Ｃ−25
位の置換基としてシクロヘキシル基を持つB1アベルメク
チンである。

詳細な記述 側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性（ilvE）
と側鎖のある２−オキソ酸生合成活性（"early ilv"）
に欠け、この発明の過程で有用な、S.アベルミチリスの
菌株の生成は、２つの適当な変異株を原形質融合させる
ことによりつくられた。それにもかかわらず、そのよう
な変異株は専門家に有名な他の方法でもつくることがで
きると、理解されている。そのような他の方法は、変異
させたり、適当なベクターを用いた遺伝子工学を含む
が、それに限定されるものではない。

ストレプトミセス アベルミチリスの種の内、アベル
メクチンを産生する変異株への変異は、紫外線照射、Ｘ
−線照射、Ｎ−メチルＮ′−ニトロＮ−ニトロソグアニ
ン、エチルメタンスルフォン酸塩、亜硝酸そしてナイト
ロジェンマスタード、すなわち、Ｎ−メチルビス（２−
塩化メタン）アミンや同様の処理を含む、種々の変異を
起こさせるものを用いるという、よく知られた方法によ
り行われた。変異源となるものは、S.アベルミチリス
ATCC 31272という、天然アベルメクチン類を産生する事
ができる、S.アベルミチリスの胞子もしくは、成長力の
ある培養株に与えられた。

変異させられたコロニーは、M9/グルコース限定培地
上では、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンそしてＬ−バ
リンがない限り生育できないことにもとづく、側鎖のあ
る２−オキソ酸生合成活性の欠如という特性を利用し
て、選択された。すべての３種のアミノ酸が成長を起こ
させるには存在しなければならない。さらに、該トラン
スアミナーゼ活性のない変異株は、トランスアミナーゼ
反応の基質として働く、それら３種の２−オキソ酸がす
べて培養液中に補われても生育しないことが示されてい
る。それ故、一つのトランスアミナーゼ酵素が、３種の
２−オキソ酸（２−オキソ−３−メチル吉草酸、２−オ
キソ−イソカプロン酸、２−オキソ−イソ吉草酸のそれ
ぞれのアミノ基転移を触媒しているように思える。

変異させられたコロニーは、M9/グルコース限定培地
上では、イソロイシンとバリンがないと生育できないこ
とに基づく、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性の欠如
という特性を利用して、選択された。イソロイシンとバ
リンがあれば、そのような変異株はM9/グルコーコ限定
培地上で生育できる。

さらに、変異により得た微生物の菌株から望ましい対
立形質をつくることに関し、原形質融合はある菌株でつ
くられ、同定された望ましい対立形質を、別の菌株の染
色体に導入することを可能とする。たとえば、側鎖のあ
る２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性および側鎖のある
アミノ酸トランスアミナーゼ活性の欠けたS.アベルミチ
リス菌株は、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性とＯ−
メチルトランスフェラーゼ活性の欠けたS.アベルミチリ
ス菌株と原形質融合することにより、側鎖のある２−オ
キソ酸生合成活性と側鎖のあるアミノ酸トランスアミナ
ーゼ活性とＯ−メチルトランスフェラーゼ活性のないS.
アベルミチリスの菌株を生成する。この分野の専門家が
認めるように、原形質融合技術は、望ましい対立形質を
選択の派生系列から一つの菌株に組み込むことを可能に
する。ここで記述した、側鎖のある２−オキソ酸生合成
活性と、側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性と
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠如した菌株であ
る、S.アベルミチリス 209R38（ATCC 55220）は、この
ような技術により生成された。この発明の変異株の形態
学的および培養時の特性は、一般的には、米国特許第
４、429、042号に記述されており、その示すところはこ
こでは参考として含まれている。この発明の変異株を区
別する特性は、それらの側鎖のある２−オキソ酸生合成
活性と側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性とＯ
−メチルトランスフェラーゼ活性が欠けていることであ
り、その特性はここで記述されたようにして決定され
る。

ストレプトミセス アベルミチリス 209R38,もしく
はFD 28857として参照されるものは、ブダペスト条約に
もとづきアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（American Type Culture Collection）、ロックビ
ル、メリーランドに寄託されている。そこでは、寄託物
の永久の保管機関と認められており、もし特許がこの出
願に認められたときには、一般の人々によってすぐに使
用できる。上記寄託物には、ストレプトミセス アベル
ミチリス ATCC 55220という寄託番号が与えられた。寄
託は、この出願が米国特許・通商省のコミッショナーに
より37 CFR 1.14とUSC 122に基づき、そして、この出願
もしくはその対応出願が出願された国々の外国特許法に
従い、係属中にも入手できる。寄託された微生物の一般
への分譲に関するすべての制限は、1993年２月９日もし
くは、クレームした発明の実施に微生物を必要とする特
許が与えられたときのいずれか早い日に、不可逆的に撤
廃されるであろう。

S.アベルミチリス ATCC 31267、ATCC 31271、ATCC 3
1272そしてNCIB 12121のいずれもが、式（Ｉ）の化合物
である、天然アベルメクチン類を産生する。

ここで22−23位にある破線は、場合により存在する二重
結合を示す； R¹は、ヒドロキシ基であり、二重結合がないときのみ
存在する。

R²は、次の構造からなる、４′−（アルファ−Ｌ−オ
レアンドロシル）−アルファ−Ｌ−オレアンドロシルオ
キシ基である。

R³は、水素もしくはメチルである。

Ｒは、イソプロピルもしくは（Ｓ）−sec−ブチルで
ある。

米国特許第４、285、963号は、式（Ｉ）のアベルメク
チン類を記載している。そこでは、25位は、メチル基と
エチル基で置き替わっている。また、R¹はヒドロキシ基
で、R³はメチルである。

ここで参照している非天然アベルメクチンでは、Ｒは
以下で定義するようにイソプロピルまたは（Ｓ）−sec
−ブチル以外の置換基である。

式（Ｉ）の化合物の生合成において利用される必須の
化合物は、S.アベルミチリスの細胞内で生じる。これら
の化合物、Ｌ−バリンとＬ−イソロイシンは、２−オキ
ソ酸に変換され、ついでコエンザイムＡと生成物が共役
するのにともなって、側鎖のある２−オキソ酸デヒドロ
ゲナーゼにより酸からカルボン酸が除去される経路を経
て、アベルメクチンの生合成に入っていくと信じられて
いる。それらの存在は、（Ｉ）式のイソプロピルと
（Ｓ）−sec−ブチル化合物がともに同時に生成される
ことで説明される。これは、もちろん、（Ｓ）−sec−
ブチル誘導体からイソプロピルを分離するという問題点
を提起する。

適当なプライマー化合物を含む栄養培地で培養された
ときには、この発明の変異株は、式（Ｉ）の化合物を産
生するか、もしくは多くの場合、Ｒが開始物質で用いた
ものに対応する、式（Ｉ）の２つもしくはそれ以上の化
合部との混合物を産生する。４種までの産生物が、通常
そして通称ではあるが、米国特許第４、429、042号で用
いられる記号では、Ｒ−アベルメクチンA1,A2,B1そして
B2として参照されるものが、産生され得る。"R−”基
は、もちろんＣ−25位の置換基である。たとえばＲがシ
クロヘキシルの場合、４つの可能なアベルメクチン類は
次の通りである。

通称 R¹ R³ シクロヘキシル アベルメクチンA1 二重結合 CH₃ シクロヘキシル アベルメクチンA2 ヒドロキシ結合 CH₃ シクロヘキシル アベルメクチンB1 二重結合 Ｈ シクロヘキシル アベルメクチンB2 ヒドロキシ結合 Ｈ 非天然アベルメクチン類では、式（Ｉ）のＣ−25置換
基"R"は、イソプロピルか（Ｓ）−sec−ブチル以外であ
る。

一方、二重結合が存在しOHの無い式（Ｉ）の化合物
は、R¹がOHで脱水素反応により二重結合がない、対応す
る式（Ｉ）の化合物のよりつくることができるであろ
う。たとえば、その反応は５と４″の位置のヒドロキシ
基を最初に選択的に保護することにより、実行される。
すなわち、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシアセチル誘
導体は、置換されたチオカルボニルハロゲン化物、たと
えば、（４−メチルフェノキシ）チオカルボニルクロラ
イドと反応させ、ついで、高沸点の溶媒、たとえば、ト
リクロロベンゼンのなかで加熱することにより脱水素す
ることができる。産生物は、最後に保護基をはずされ不
飽和の化合物を得る。これらの反応ステツプは、適切な
試薬および反応条件とともに米国特許第４、328、335号
に記載され、その示すところはここでは参考として含ん
でいる。

R³がＨの式（Ｉ）の化合物は、脱メチル化によりR³が
CH₃の対応する化合物よりつくることができるであろ
う。この反応は、５−メトキシ化合物か、望ましくは、
それらの保護された誘導体を、酢酸水銀で処理し、得ら
れた３−アセトキシエノールエーテルを希釈酸で加水分
解して５−ケト化合物を得ることにより達成される。こ
れらの反応ステツプに関する、適切な試薬および反応条
件は、米国特許第４、423、209号に記載され、その示す
ところはここでは参考として含んでいる。

R¹がＨで、二重結合がない（いわゆるジヒドロアベル
メクチン類）式（Ｉ）の化合物は、二重結合が存在し、
R¹がない対応する化合物から、適当な触媒を用いて、選
択的に触媒反応で水素添加することにより、つくること
ができる。たとえば、欧州特許応用公開第0001689号お
よびその対応出願で、米国特許第４、199、569号で記述
されているように、この還元はトリス（トリフェニルフ
ォスフィン）ロジウム（Ｉ）クロライドを用い、達成す
ることができるであろう。その示すところは、ここでは
参考として含んでいる。R²が水素の式（Ｉ）の化合物
は、R²が４′−（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−
Ｌ−オレアンドロシルオキシである対応する化合物か
ら、４′−（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−Ｌ−
オレアンドロース基を、水を含む有機溶媒中の酸で穏和
に加水分解することにより除去し、13位にヒドロキシ基
を持つアグリコンを産生することによりつくられる。こ
れは、さらにたとえばベンゼンスルフォニルハライドと
反応させることによりハロゲン化されて13−デオキシ−
13−ハロ誘導体をつくり、それは最終的にたとえばトリ
ブチルチンハライドを用いて、選択的に還元される。望
まない副反応を回避するため、存在し得る他のすべての
ヒドロキシル基をたとえば、ｔ−ブチルジメチルシリル
基を用いて保護することが望ましい。これは、すぐにハ
ロゲン化もしくは還元反応の後、微少量の酸を含むメタ
ノールで処理することで除去される。これらの反応ステ
ップは、適切な試薬と反応条件とともに、欧州特許応用
公開第0002615号に記載されている。

天然および非天然、アベルメクチン類の生合成のため
という、この発明のS.アベルミチリスによって利用され
得る化合物は、（II−Ａ）と（II−Ｂ）の式で表される
化合物である。

培養過程で（II−Ａ）および（II−Ｂ）と同等の化合物
を含んでいる。該化合物も、ここでは”プライマー化合
物”と参照される。

より明確には、Ｃ−25位の置換基になるＲは、Ｒ′も
しくは−CH₂R″である。Ｒ′は、アルファ位で分岐した
C₃−C₈アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ
アルキルもしくはアルキルチオアルキル基、または、そ
のアルキル基がアルファ位で分岐したC₂−C₅アルキル基
であるC₅−C₈シクロアルキル基、または、そのどちらか
が場合によりメチレンか、もしくは１つないしそれ以上
のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子（フッ素、塩
素、ヨウ素、臭素）で置換されている、C₃−C₈シクロア
ルキルまたはC₅−C₈シクロアルケニル基、または、飽和
しているか、完全にもしくは部分的に不飽和で、場合に
より１つもしくはそれ以上のC₁−C₄アルキル基もしくは
ハロゲン原子で置換された、３から６員の酸素または硫
黄を含むヘテロ環である。Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキ
ル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、アルコキシ
アルキル、もしくは、各アルキルもしくはアルコキシ基
に１から６炭素原子を含むアルキルチオアルキルであ
り、そこでは該アルキル、アルコキシアルケニルもしく
はアルキニル基が一つもしくは複数のハロゲン元素で置
換されている場合があるもの、または、C₃−C₈シクロア
ルキルもしくはC₅−C₈シクロアルケニル基で、そのどち
らかがメチレンまたは、１つもしくは複数のC₁−C₄アル
キル基もしくはハロゲン元素で置換されている場合があ
もの、または、飽和しているか、完全にもしくは部分的
に不飽和で、場合により１つもしくはそれ以上のC₁−C₄
アルキル基もしくはハロゲン原子で置換された、３から
６員の酸素または硫黄を含むヘテロ環であるもの、また
は、SR⁷という式で書かれる基で、ここで、R⁷はC₁−C₈
アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、C₃−
C₈シクロアルキル、C₅−C₈シクロアルケニル、フェニル
もしくは置換されたフェニルであり、その置換基はC₁−
C₄アルキル、C₁−C₄アルコキシまたはハロゲン、また
は、飽和しているか、完全にもしくは部分的に不飽和
で、場合により１つもしくはそれ以上のC₁−C₄アルキル
基もしくはハロゲン原子で置換された、３から６員の酸
素または硫黄を含むヘテロ環である。前述のＲ″の定義
で、３もしくはそれ以上の炭素原子を含むアルキル基
は、直鎖または分岐があるもののいずれかである。

ＲがＲ′であるRCOOHと同等の化合物は、すなわち培
養過程で前駆体であるが、式（II−Ｃ）の様な化合物で
ある。ここで、Ｒ′は上で定義されたものである。

Ｒ′(CH₂)_n−Ｚ （II−Ｃ） ここで、ｎは０、２、４、または６であり、Ｚは−CH₂O
H、−CHO、−C₂NH₂、−COOR⁵または−CONHR⁶であり、R⁵
は水素または（C₁−C₆）アルキル、R⁶は水素、（C₁−
C₄）アルキルもしくはアミノ酸残基、とくにアスパラギ
ン酸、グルタミン酸そしてメチオニン、すなわちそれぞ
れ、 −CH(COOH)CH₂COOH、−CH(COOH)(CH₂)₂COOHそして、−C
H(COOH)(CH₂)₂SCH₃ である。

Ｒが−CH₂R″であるRCOOHと同等の化合物は、すなわ
ち培養過程で前駆体であるが、式（II−Ｄ）の様な化合
物である。ここで、Ｒ″は上で定義されたものである。

Ｒ″(CH₂)_n−Ｚ′ （II−Ｄ） ここで、Ｚ′は−CH₂OH、−CH₂NH₂、−COOHまたは−CHO
であり、Ｚ′が−CH₂OH，−CH₂NH₂または−CHOのとき、
ｎは１、３または５であり、Ｚ′が−COOHのときｎは３
または５である。

と同等の化合物は、すなわち培養過程で前駆体である
が、式（II−Ｅ）の様な化合物である。ここで、ＲとＺ
は上で定義されたものである。

この発明ではさらに、式（II−Ａ）と（II−Ｂ）の異
性体化合物で、培養過程でそれらと同等の化合物、およ
び、ここで記述した過程で用いた結果えたＣ−25位で異
性体となったアベルメクチンも含んでいる。

この発明のプロセスは、側鎖のある２−オキソ酸生合
成活性、側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性お
よび好ましくはＯ−メチルトランスフェラーゼ活性に欠
けるS.アベルミチリスの菌株を培養期間中、窒素、炭
素、無機酸、およひRCOOH,RCOCOOHという式で書かれる
化合物もしくは、該化合物（すなわち前駆体）と同等の
化合物からなる水気のある栄養培地で、好気的に培養す
ることにより実行される。酸もしくはそれに同等の化合
物は、植菌時、かつまたは、培養時一定期間で与えられ
る。培地は、変異株の成長が起こるためにはＬ−イソロ
イシン、Ｌ−ロイシン、そしてＬ−バリンを含まなけれ
ばならない。アベルメクチン産物の産生は、培地からサ
ンプルを抜き取り、有機溶媒で抽出し、生成物の出現を
クロマトグラフィー、たとえば、高速液体クロマトグラ
フィで追跡することで、確認する事ができる。培養は、
生成物が最大に産出されるまで、通常４から21日続けら
れる。

ＲがＲ′（カルボン産もしくはそれと同等の化合物）
のときの、各プライマー化合物の望ましいレベルは、リ
ットルあたり0.05から3.0グラムである。Ｒが−CH₂R″
（カルボン産もしくはそれと同等の化合物）のときの、
各プライマー化合物の望ましい濃度は、１リットルあた
り0.05から4.0グラムであり、最良の産生はプライマー
化合物を、たとえば、数日間の間毎日加えるというよう
に、培地に徐々に加えていくことにより得られる。プラ
イマ化合物は、連続的、間欠的あるいは一度に培地に与
えることができる。酸（RCOOHまたはRCOCOOH）は、その
ような形または塩、たとえばナトリウム、リチウムまた
はアンモニウム塩、あるいは上述したような酸と同等の
化合物の形で加える。酸がもし固体なら、望ましくは水
もしくは（C₁−C₄）アルコールのような好ましい溶媒に
溶解する。

培養に用いる培地は、とくにＣ−25置換基がイソプロ
ピルまたは（Ｓ）sec−ブチルの場合には、炭素、窒素
および微少量必要な要素の取り込み源を含む一般的な培
地でよい。もし、Ｃ−25置換基が非天然基の場合、すな
わち、イソプロピルでないもしくは、（Ｓ）sec−ブチ
ルでないときには、培養培地は特定の要素が欠けている
か、Ｒ部分がイソプロピルか（Ｓ）sec−ブチルである
プライマーを最小限含むものとする。

望ましくは24から33℃の温度のもとで、数日の培養の
後、培養液は遠心し、ろ過して、菌糸体の塊は、望まし
くはアセトンまたはメタノールといった溶媒で抽出され
る。抽出溶媒は濃縮され、望まれている産生物は水に混
ざらない有機溶媒、たとえば、メチレンクロライド、エ
チルアセトン、クロロフォルム、ブタノールもしくはメ
チルイソブチルケトンで、抽出される。抽出した溶媒は
濃縮され、必要なら粗産物はさらに、たとえば、結晶
化、かつまたは、調製用逆相高速液体クロマトグラフィ
といったクロマトグラフィを用いることにより、精製さ
れる。

粗精製物は通常、R³が水素またはCH₃で、R²が４′−
（アルファ−Ｌ−オレアンドロシル）−アルファ−Ｌ−
オレアンドロシルオキシであり、R¹がOHで二重結合がな
い、または、R¹がなくて二重結合が存在する、式（Ｉ）
の化合物の混合物として得られる。しかし、比率は特定
の変異株、用いたプライマー化合物、用いた条件で変化
する。

Ｒ基の由来元は、すなわちそれはＲ−COOHまたはＲ−
COCOOHより直接由来するか、それらの前述した前駆体の
一つからつくられるか、あるいは他の前駆体からつくら
れるが、アベルメクチン類の産生にとっては重要でな
い。その産生というこの発明のプロセスにとって重要な
要求は、望ましいＲ基がこの発明のS.アベルメクチン菌
株にとって培養過程で利用できるようになっていること
である。

望ましいプライマー化合物は、以下のものを含む： 2,3−ジメチル酪酸 ２−メチルヘキサン酸 ２−メチルペント−４−エン酸 ２−シクロプロピルプロピオン酸 4,4−ジフルオロシクロヘキサンカルボン酸リチウム塩 ４−メチレンシクロヘキサンカルボン酸 ３−メチルシクロヘキサンカルボン酸（シス／トラン
ス） １−シクロペンテンカルボン酸 １−シクロヘキセンカルボン酸 テトラヒドロピラン−４−カルボン酸 チオフェン−２−カルボン酸 ３−フロン酸 ２−クロロチオフェン−４−カルボン酸 シクロブタンカルボン酸 シクロペンタンカルボン酸 シクロヘキサンカルボン酸 シクロヘプタンカルボン酸 ２−メチルシクロプロパンカルボン酸 ３−シクロヘキセン−１−カルボン酸 ２−メチルプロピオン酸 ２−メチル−４−メトキシ酪酸 チオペン−３−カルボン酸 ヒドロキシメチルシクロペンタン ３−チオフェンカルボキシアルデヒト ３−シクロペンチルプロピオン酸 ヒドロキシメチルシクロブタン テトラヒドロチオフェン−３−カルボン酸 ３−シクロペンチル−１−プロパノール ３−メチルシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ３−メチルクロロブタンカルボン酸 ３−メチレンシクロブタンカルボン酸リチウム塩 ２−メチル−４−メチルチオ酪酸 テトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸 シクロブチルメチルアミン エチルシクロブタンカルボン酸エステル ４−ヒドロキシメチルシクロペンテン ２−（３−チオフェンカルボニル）プロピオン酸エチル
エステル （Ｓ）−２−メチルペンタン酸 （Ｒ）−２−メチルペンタン酸 メチルチオ酢酸 エチルチオ酢酸 ３−メチル酪酸 ３−トリフルオロメチル酪酸 ３−メチルペンタン酸 ｎ−酪酸 シクロペンタン酢酸 チオフェン−３−酢酸 プロピオン酸 Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素変異株は、ここで
記述した側鎖のある２−オキソ酸生合成活性がなく、側
鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性もない変異株
から得ることができる。側鎖のある２−オキソ酸生合成
活性、側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性それ
にＯ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠けている変異
株は、RCOOHもしくはRCOCOOH化合物もしくは、それらと
同等の化合物を培養中に与えると、おもにＢアベルメク
チン類、すなわち、ジメチルアベルメクチン類またはジ
メチルアベルメクチンＢ化合物を産生する。該変異株
は、たとえば、ここで記述した、側鎖のある２−オキソ
酸生合成活性および側鎖のあるアミノ酸トランスアミナ
ーゼ活性のない変異株から、紫外線、かつまたは、Ｎ−
メチルＮ−ニトロソウレタン、Ｎ−メチルＮ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニン、エチルメタンスルホネート
や、上記で列挙した他の試薬といった化学変異源物質を
用いた変異により得ることができる。一方、側鎖のある
２−オキソ酸生合成活性、かつまたは、側鎖のあるアミ
ノ酸トランスアミナーゼ活性がある菌株で、Ｏ−メチル
トランスフェラーゼ活性が欠けるものは、UV処理や、変
異源物質処理で変異させ、Ｏ−メチルトランスフェラー
ゼ活性が欠けかつ、側鎖のある２−オキソ酸生合成活
性、かつまたは、側鎖のあるアミノ酸トランスアミナー
ゼ活性が欠ける変異株にすることができる。望ましく
は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠ける変異株
をさらに変異させ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性
と側鎖のある２−オキソ酸生合成活性がともに欠ける変
異株を得る。そのような変異株は、側鎖のあるアミノ酸
トランスアミナーゼ活性のない変異株との融合で、片方
の親として使うことができる。

そのような変異株でつくられた非天然アベルメクチン
類は、そのアグリコン部分、かつまたは、オレアンドロ
ース部分のＣ−３′かつまたはＣ−３″位Ｃ−５位にヒ
ドロキシル基があることを特徴とする。

上述の変異株は、Schulman等により記述された方法
（Antimictobial Agents and Chemotherapy、29、620−
624（1986））により、同定される。それらは、既知の
アベルメクチン類と同じ目的および同じ方法で用いるこ
とができる。

一方、オレアンドロース二糖領域のメチル基がないも
のも含む、種類が増え続けているＢアベルメクチン類
は、この発明の変異株を培養することにより産生され
る。その変異株は、サイネフンジン（音訳sinefungi
n）、Ｓ−アデノシル−エチオニンあるいは、Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性を阻害するＳ−アデノシルホ
モシステインの様な物質の存在下、側鎖のある２−オキ
ソ酸生合成および側鎖のあるアミノ酸トランスアミナー
ゼ活性が欠けている。

この発明の化合物は、特に駆虫剤、外部寄生虫駆除
剤、殺虫剤および殺ダニ剤として利用できる、高い活性
を持つ抗寄生虫薬である。

それ故この化合物は、とくに、家畜や家禽同様豚、
羊、馬、牛に重大な経済損失を与える、線虫と記述され
る寄生虫のグループによってもっともしばしば引き起こ
される、ぜん虫病を含む、外部寄生虫で引き起こされた
いろいろな状況を治療するのに有効である。その化合物
は、さらに、たとえば犬における犬糸状虫（Dirofilari
a）を含むいろいろな種の動物に影響する他の線虫や、
ズビニ鈎虫（Ancylostoma）、アメリカ鈎虫（Necato
r）、回虫（Ascaris）、糞線虫（Strongyloides）、ト
リンチネラ（Trinchinella）、毛細線虫（Capillari
a）、鞭虫（Trichuris）、ぎょう虫（Enterobius）とい
った消化管寄生虫を含む人間に感染することができる種
々の寄生虫、それにフィラリア虫や円虫および繊毛虫の
腸内状態のように血液や他の組織、器官で見つかる寄生
虫にも有効である。

この化合物は、さらに特に動物や鳥の節足動物の外部
寄生虫、たとえば、ダニ、しらみ、のみ、アオバエ、刺
す昆虫そして牛や馬に影響を与える、動き回るディプテ
ラス（dipterous）の幼虫といったものを含む外部寄生
虫の感染の治療にも価値がある。

その化合物は、ゴキブリ、イガ、絨毯に住む虫、それ
にイエバエといった家にいる害虫だけでなく、クモダ
ニ、アブラムシ、毛虫それにイナゴのような移動する直
し類といった農業植物や貯蔵穀物の害虫に対しても殺虫
作用がある。

式（Ｉ）の化合物は、現実に即した特定の使い方に対
し、もしくは、寄生虫や昆虫を持っていて治療を受けて
いる特定の種の宿主動物に対し適当な剤形で施される。
駆虫のために用いる場合、この化合物はカプセル、丸
薬、錠剤もしくは水溶剤の形で経口的に与えるか、ある
いは、注射もしくは埋め込むことにより与えられる。そ
のような剤形は、標準的な獣医が行う処置になじむ一般
的方法で、用意できる。そのようなカプセル、丸薬、あ
るいは錠剤は、有効成分を希釈剤や、担体と混合するこ
とにより用意できる。その担体はさらに崩壊剤、かつま
たは結合剤、たとえば、スターチ、乳糖、タルク、ステ
アリン酸マグネシウム等を含んでいる。水溶剤は、有効
成分を、分散剤もしくはぬれ剤とともに、水系の溶媒に
分散させることによりつくることができる。そして、注
射剤は、他の物質としてたとえば、十分な塩あるいはグ
ルコースを含むことにより、血液と同じ浸透圧になるよ
うにした、無菌溶液の形でつくられる。これらの剤形
は、治療しようとしているホスト動物の種類、感染の重
篤度および種類、体重によって決まる有効成分の重量に
よって変わるであろう。通常、経口投与では動物の体重
1Kgあたり0.001から10mgの薬物を、一回もしくは１から
５日の間隔で分けて与えるのが望ましいが、もちろん、
それよりも多いかもしくは、少ない薬物範囲が示される
場合もあるが、それもこの発明の範囲内である。

別の方法として、その化合物を動物の食物とともに与
えることもできるが、この目的のためには、濃縮した食
物添加剤を動物の食物に混ぜるために用意する。

殺虫剤として用い、農産物の害虫を駆除するために
は、化合物は噴霧するか、粉末でかけるか、エマルジョ
ンでかけるか、通常の農作業に適した方法で与える。

以下の実施例は、この発明の説明であり、いかなる場
合でもこの発明の範囲を限定するものとして解釈される
ためのものではない。

実施例１ 側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性、側鎖の
ある２−オキソ酸生合成活性、およびＯ−メチルトラン
スフェラーゼ活性が欠如した、S.アベルミチリスATCC 5
5220（F.D.28857）の作成 A.側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性の欠如
したS.アベルミチリス変異株Ｉ−３（ATCC 53567）の作
成 変異株Ｉ−３（ATCC 53567）は1988年９月28日に公開
された、欧州特許応用公開第284、176号の記述に従い調
製した。完全を期するため、その開示は以下で繰り返し
て記載する。

ステップ1.S.アベルミチリスATCC 31272は、30℃で12日
間ニューパッチ寒天培地上で集約的に生育させた。培地
は次の組成である。

Ｖ−８ジュース^＊ 200ml CaCO₃ 3grams 寒天 15grams 水 全量が1000mlになるように調製 普通ブイヨン 1.0grams/L 酢酸ナトリウム・３H₂O 1.4grams/L 吉草酸 50mg/L 酪酸 50mg/L ２−メチル酪酸 50mg/L イソロイシン 250mg/L ロイシン 250mg/L バリン 250mg/L 微量成分溶液^＊＊ 1ml/L ^＊ ８種類の野菜ジュース（トマト、人参、セロリ、フダ
ンソウ、パセリ、レタス、ミズタガラシ、ホウレンソ
ウ）の混合物に、塩、アスコルビン酸、クエン酸およ
び、天然調味料を加えたもの。キャンベルスープ社（Ca
mpbell Soup Company,Camden,NJ）より入手可能。^＊＊ 微量成分溶液の組成は以下の通り。

FeCl₃.6H₂O 2.7g MnSO₄.H₂O 4.2 CuSO₄.5H₂O 0.5 CaCl₂ 11.0 H₃BO₃ 0.62 CoCl₂.6H₂O 0.24 ZnCl₂ 0.68 Na₂MoO₄ 0.24 これらを１リットルの0.1N塩酸溶液に溶解する。

胞子は、そのような３つのプレートから刈り取り、pH
9.0,0.05Mのトリスマレイン酸20mlに懸濁した。

スタップ2.胞子の懸濁液10mlを、10mgのＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン（NTG）を含むバ
イアルに加えた。そのバイアルは、28℃、60分間、振と
う培養し、ついで、胞子は１％NaCl溶液で十分に洗っ
た。

ステップ3.洗浄し胞子は、１％NaCl溶液に懸濁し、等量
の80％エチレングリコールと混合した。この懸濁液は、
−20℃に保管され、変異株を探すための、細胞源として
使われた。それは発芽した際には、約10⁴コロニー/mlを
与えた。

この胞子のストックは、YPDプレートの上に広げら
れ、プレートあたり約100コロニーを産生した（YPD培地
は、イースト抽出物、バコ（Baco）ペプトンおよびデキ
ストロース各10g/l、バクトアガー（Bacto agar）15g/l
を含み、オートクレーブにかける前に、pH6.9に調
整）。アステリスクをつけた混合物は、ディフコラボラ
トリ（Difco Laboratories,Detroit,Michigan 48238）
から入手可能である。

ステップ4.28℃で２−３週間生育させた後、単一のコロ
ニーを拾い出し、標準的な96ウエルあるマイクロプレー
トの各ウエルにいれた。そのほかに、コロニーの一部
は、変異株を同定する際の、生育可能な細胞源として使
うため、新しい寒天培地上に置いた。

ステップ5.各ウエルには、１％グルコース、0.1％カゼ
ミノ酸それにイソ吉草酸、イソ酪酸、２−メチル酪酸各
0.01％を含む液体M9塩培地を約75マイクロリットル加え
た。28℃で数日間培養した後、細胞に、側鎖のある２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性があるかどうかアッセイ
した。（M9塩培地１リットルは、6g Na₂HPO₄、3g KH₂PO
₄、0.5g NaClおよび1g NH₄Clよりなる。その培地は、オ
ートクレブされ、それから殺菌した1M MgSO₄と0.1M CaC
l₂がそれぞれ1mlづつ無菌的に加えられる。） ステップ6.M9塩培地に５％とる塩を加えた微懸濁液は、
その混和しない混合物を短時間超音波処理することによ
り調製した。この懸濁液の25mlに［₁₄C−１］−２−オ
キソ−イソカプロン酸を、2.5マイクロキュリー/ml、か
つ、10.0マイクロキュリー／マイクロモル含む溶液を1.
2ml加えた。この全混合物50マイクロリットルを、アッ
セイしようとしているコロニーを含む微量滴定プレート
の各ウエルに加えた。

ステップ7.各ウエルから発生した₁₄CO₂はトラップさ
れ、”多数のサンプル中の₁₄CO₂を検出する簡便な方
法：変異株の早いスクリーニングへの応用”と題され
た、Tabor等が記載された方法（J.Bacteriol.128 p485
−486（1976））で可視化された。側鎖のある２−オキ
ソ酸デヒドロゲナーゼがない変異株は、対照として測定
したものを越えるBa₁₄CO₃を産生する事はなかった。

Ba₁₄CO₃形成の結果としてオートラジオグラムに黒い
スポットとして示される、₁₄CO₂のポジティブアッセイ
と、スポットがないか非常に薄いことによって示され
る、ネガティブアッセイの間のコントラストを改善す
る、より改良された方法は、つぎの改良した検査方法か
らなる。

単一コロニー（上記ステップ４をみよ）を、７−14日
（２−３週間よりも）の生育の後寒天培地から拾い出
し、上記ステップ６と７により直接的にアッセイする。
上記ステップ５は省略する。

さらにより改良されたアッセイ法は、₁₄CO₂の放出に
関し本来定量的な方法であるが、グルコース１％と、”
シンカサーブッカ（Syncasa−bcaa）"0.1％（市販のカ
ザミノ酸の組成とほぼ同じだが、下記のように、Ｌ−バ
リン、Ｌ−イソロイシンそれにＬ−ロイシンを含まない
Ｌ−アミノ酸の合成混合物）を含むM9塩培地からなる適
当な培地上で、上記のスクリーンを生育中の変異株に対
し行うという方法からなる。

高細胞密度に生育した後では、細胞はM9塩培地で洗っ
たのち、超音波処理によりトルエンの乳白濁分散液とし
た、１％のトルエンを含む、放射活性のないM9塩培地に
再懸濁する。細胞／緩衝液／トルエン懸濁液は、30℃で
40分間インキュベートして、細胞を透過するようにす
る。透過するようになった細胞は、M9培地塩で洗い、も
とのM9培地緩衝液の５分の１の量に最後に再懸濁した。
この懸濁液の180マイクロリットルを１アッセイごとに
使用した。

300マイクロリットルの反応溶液は、トルエン処理し
た細胞、チアミントリフォスフェート（TPP）0.4mM,コ
エンザイムＡ（CoA）0.11mM、ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（NAD）0.68mM、ジチオスレイトール（D
TT）2.6mM、MgCl₂ 4.1mM、Tris−HCl 60mM,pH7.5、それ
に［₁₄C−１］２−オキソイソカプロエート６、000cpm,
1マイクロモルあたり１マイクロキュリーを含んでい
た。カウントの効率は73％であった。反応は、バイアル
のネジ式の蓋に、２×2cmのワットマン（Whatman）＃４
の炉視を角型に押さえつけたものを入れた、15mlのシン
チレーションバイアルで行った。その濾紙は、30マイク
ロリットルの1M ヒアミンヒドロキサイド（メチルベン
ズエチオニンヒドロキサイドの1Mメタノール溶液、シグ
マ化学会社（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO 63178）
より入手可能）を含んでいて、反応中に発生した₁₄CO₂
をトラップする。２時間のインキュベーションの後、濾
紙は、ニューイングランド ヌクレア リサーチ プロ
ダクツ（New England Nuclear Reserch Product）,Bost
on,MA 02118）より入手できるベックマン アクアゾル
（Beckman Aquasol）II（一般的なLCS（液体シンチレー
ションカウンタ）10mlに浸され、放射活性は、この溶媒
中で４時間もしくはそれ以上かけて平衡になったのち、
液体シンチレーションカウンタで測定される。ブランク
の対照反応（すなわち、細胞がないもの）は約50−300c
pmを与える。

Ｉ−３およびそれに類似の変異株は、対照反応以下か
同等のカウントを与えるが、親株は、ブランク対照値の
数倍高いカウントを与える。

B.側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼおよびＯ−
メチルトランスフェラーゼ酵素活性の欠ける、S.アベル
ミチリス変異株2369の作成 Ｉ−３変異株の胞子は、上記のパートＡで記載した手
順と同様に、NTGを用い変異源物質による処理を与え
た。変異源処理のあと、胞子は以下の組成のYPD寒天上
で（プレートあたり約30コロニー）単一の隔離したコロ
ニーに広げられた。

イースト抽出物 10g バクトペプトン 10g デキストロース 5g バクトアガー 15g H₂O 1L pH〜6.9,121℃ 20分間オートクレーブ処理。

そのプレートは、約34℃で７日間インキュベートされ
た。それから、単一のコロニーがYDPプレートから無菌
の平たいつま楊子で拾い上げられ、以下で記述した様に
調製されたAP5/MB四分円プレート上にパッチとして広げ
られた。

AP5/MB産生寒天： 薄めたスターチ 180ml K₂HPO₄ 1g MgSO₄・7H₂O 1g アルダミン（Ardamine）PH 5g CaCO₃（大理石様白） 5g Ｐ−2000 1ml FeSO₄・7H₂O 0.01g MnCl₂・4H₂O 0.001g ZnSO₄・7H₂O 0.001g バクトアガー 17g H₂O 795ml pH〜7.0、121℃ 20分間オートクレーブ処理。オートク
レーブ処理の後、フィルターで殺菌した５％のメチル酪
酸ストック溶液20mlを寒天に無菌操作で加えた。それか
ら、四分円ペトリ皿は寒天でみたされた。

各パッチには、蒸留水中で約121℃、1.5時間オートクレ
ーブ処理した無菌の直径20mmのリーメイ（Reemay）＃22
50メンブレン（アールストゥローム フィルトゥレーシ
ョン（Ahlstrom Filtration）、Mount Holly Springs,P
A,U.S.A.）がかけられた。そして、そのプレートは、約
28℃で９日間インキュベートされた。

９日目に、メンブレンはコロニーパッチから無菌ピン
セットではがされ、ガラスシンチレーションバイアルに
入れられた。バイアルは、次のステップまで蓋された。

上述した方法で得た各コロニーのアセトン抽出物をア
ッセイするため、各抽出物20μｌは、アナルテック（An
altech）250ミクロンTLCプレート（アナルテック（Anal
tech） Inc.,Newark,DE,U.S.A.）上にスポットされ
た。そのプレートは、エーテルを入れたクロマトグラフ
用容器に入れられ、25分間展開された。ついでプレート
は、出され風乾された。産生物を見るため、プレートは
3Aエタノールに溶かした３％バニリンを噴霧され、つい
で３−５分間95−100℃の乾燥機の中に置かれた。つい
で、プレートには3Aエタノールに溶けた３％のH₂SO₄が
噴霧された。そのプレートは、B1aおよびB2aを産生する
が、アベルメクチンA1a,A2a、すなわちＯ−メチルトラ
ンスフェラーゼ酵素の欠けるコロニーを探すためにスク
リーンされた。変異株2369は、単一コロニーに分離、精
製されて、B1aとB2aは産生するが、A1aとA2aは小量もし
くは産生しない菌株として同定された。

C.側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性とＯ−
メチルトランスフェラーゼ活性に欠け、かつ高いタイタ
ーのアベルメクチンＢ化合物を産生する、S.アベルミチ
リス変異株7881の単離 7881菌株は、以下のようなNTGによる変異源処理の
後、変異株2369から得た。変異株2369の胞子は、上記パ
ートＡで記載した手順に沿ってNTGで変異源処理され
た。変異源処理の後、2369菌株の胞子は、YPD寒天上に
単一コロニーになるように広げられた。変異がかけられ
たコロニーは、YPD寒天プレートから取り出され、AS−
７培地を30ml含む300mlエルレンマイヤーフラスコに接
種するのに用いられた。そのフラスコは、28−30℃、20
0rpmで約40時間震とうしながらインキュベートされた。
ついで、培養産物2.5mlは、300mlのエルレンマイヤーフ
ラスコに400ppmのＳ（＋）−２−メチルブチレートを含
む30mlのAP−５培地が入っている、そのフラスコに接種
するのに用いられた。そのフラスコは、28−30℃、200r
pmで13−20日間震とうしながらインキュベートされた。
培養産物はついで溶媒で抽出され、以下で記述したHPLC
法によりアベルメクチンの産生が分析された。

AS−７培地とAP−５培地は以下の組成である。AS−７培地 g/l 薄めたスターチ^a 20 アルダミン pH^b 5 ファルマメディア^c 15 CaCO₃ 2 ^a スターチをバチラス イチェニフォルミス（Bacillus
Iiheniformis）から得たアルファアミラーゼ（ノボ エ
ンザイム（Novo Enzymes）、Wilton、CTから入手可能
で、"Termamyl"の商標で売られている）で加水分解して
40％±５％がデキストロース相当になるよう調製。^b イーストプロダクツ（Yeast Products）、Inc.、Clift
on,NJ 07012より^c トレーダーズプロテイン（Traders Protein）、Memphi
s,TN 38108より NaOHでpHは7.2に調整。AP−５培地 g/l 薄めたスターチ 80 アルダミン pH ５ K₂HPO₄ １ MgSO₄・7H₂O １ NaCl １ CaCO₃ ７ FeSO₄・7H₂O 0.01 MnCl₂・7H₂O 0.001 ZnSO₄・7H₂O 0.001 Ｐ−2000（難発砲性） 1ml/l 一般的な高速液体クロマトグラフィ（HPLC）の手順 移動相： 120ml 水 70ml アセトニトリル メタノールを加え１リットルとする カラム： ウルトラスフェア（Ultrasphere）ODS 25cm（ベックマ
ン インストゥルメント（Beckman Instruments）,Full
erton,CA 92634−3100） 流速:0.75ml/分 検出:240nmのUV 感度:6付近 サンプル希釈液（Ｄ）： 35mlアセトニトリルに390mlメタノールを加えたもの 標準： 1.10mlのフラスコに0.5mgアベルメクチンA2aを入れ、メ
タノールでその量としたもの 2.10mlのフラスコに0.5mgの試料を入れ、メタノールで
その量としたもの １と２は、標準ストック溶液である。実際の標準用液
は： （１）100μｌと、（２）100μｌをバイアルにいれ、移
動相800μｌを加える。

サンプル： 1.よく振った溶液1mlをとり、遠心する。

2.ペレットを乱さないようにして、可能な限り上精を除
く。

3.ペレットに100μｌのHPLC水を加え、よく震とうして
分散させる。

4.希釈液（Ｄ）2mlを加え、よく混ぜる。

5.それをろ過し、HPLCで測定する。

天然アベルメクチン類を、このHPLCクロマトグラフで
測定し、個々のアベルメクチン類のピークの保持時間
を、HPLCによる同定の内部標準となる、共存するオリゴ
マイシンＡで見られる保持時間で割った。オリゴマイシ
ンＡはS.アベルミチリス培養の副生成物としてHPLCでた
いていいつも観察され、ここで記述した変異株によって
つくられる産物であることが、HPLCで観察される。典型
的には、オリゴマイシンＡの保持時間は、９−10分であ
る。保持時間（RT）の比は、アベルメクチン産物の同定
と生成量を比較する重要な基準となる。HPLCでアベルメ
クチン産物が見られる一般的な順序はB2,A2,B1,ついでA
1である。天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） B2b 0.75 B2a 0.87 A2b 0.94 A2a 1.08 B1b 1.28 B1a 1.58 A1b 1.58 A1a 2.01非天然アベルメクチン RT/RT（オリゴマイシンＡ） シクロヘキシルB2 1.18 シクロヘキシルB1 2.16 シクロヘキシルA2 1.48 シクロヘキシルA1 2.75 保持時間は、日により１−２分変化し、オリゴマイシン
Ａは、９−10で現れる。

変異株7881は変異株2369と比較して、より多くのアベ
ルメクチンＢ化合物を産生するものとして同定された。
7881の高い産生能力に加え、それは側鎖のある２−オキ
ソ酸デヒドロゲナーゼ活性およびＯ−メチルトランスフ
ェラーゼ活性がともに欠けている。

D.側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性とＯ−
メチルトランスフェラーゼ活性がともに欠け、高い効率
でアベルメクチンＢ化合物を産生する、S.アベルミチリ
ス変異株20−29の作成 上記のパートＣで記述した手順は、変異株7881の胞子
が変異させられ、変異株20−29が単離できたという場合
にのみ用いられた。変異株20−29は、側鎖のある２−オ
キソ酸デヒドロゲナーゼ活性とＯ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性がともに欠け、変異株7881よりもより高効率
でアベルメクチンＢ化合物を産生する。

E.O−メチルトランスフェラーゼ活性に欠けるS.アベル
ミチリス変異株49−40の単離 変異株20−29の培養中、適当な側鎖のある脂肪酸前駆
体を培地中に加えることなく天然アベルメクチン類を産
生する能力がある、自然発生の変異株が同定された。49
−40として同定された変異株は、上記の透過性に処理し
た細胞を₁₄CO₂アッセイする事により、側鎖のある２−
オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性があると確認された。変
異株49−40は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠
けている。

F.O−メチルトランスフェラーゼ活性が欠け、生育にイ
ソロイシンと、バリンが必要な（側鎖のある２−オキソ
酸生合成活性に欠ける"early ilv"）S.アベルミチリス
変異株49−40H1の作成 菌株49−40には以下のように変異源が与えられた。

ステップ1.新鮮なSAMM寒天培地で４日間生育された菌株
49−40は、50mlのSCM培地（pH7.2）の入った300mlのフ
ラスコに接種された。そのフラスコは、200RPM,30℃で2
4時間震とうした（最終pH＝8.2）。

ステップ2.そのフラスコを震とう器よりはずし、全培養
液のうち10mlを2000RPMで５分間、殺菌した試験管で遠
心した。ついでその細胞は、殺菌した300mlエルレンマ
イヤーフラスコ中の50mlのSCM培地に再懸濁され、その
フラスコは、30℃で３時間回転式震とう機で震とうし
た。

ステップ3.懸濁液10mlを、殺菌した試験管に入れた。

ステップ4.エチルメタンスルフォネート（250μｌ）を
その試験管に加え（よく排気するフードの下で）、その
内容物を十分に混ぜ合わせ、次いで300mlの殺菌したフ
ラスコに入れ、30℃で４時間回転式震とう機でそのフラ
スコを震とうした。

ステップ5.新鮮な殺菌したSCM培地を（40ml）そのフラ
スコに加え、30℃で合計70時間震とうを継続した。

ステップ6.そのフラスコを震とう機よりはずし、その内
容物を8000回転で20℃、10分間遠心し、沈澱させた。細
胞は、SCM培地に再懸濁することにより洗い、再び遠心
沈澱させ、さらに10mlSCM培地に再懸濁させた。SCM培地 イースト自己分解物 10g/l 牛抽出物 5g/l カゼインの酵素加水分解物 10g/l 1M MgSO₄ 3g/l 1M K₂HPO₄;pH7.0（HCL） 100g/lSAMM寒天プレート g/L Na₂HPO₄ 6.0 KH₂PO₄ 3.0 NaCl 0.5 NH₄Cl 1.0 1M MgSO₄ 1.0 0.1M CaCl₂ 1.0 デキストロース 8.0 カザミノ酸類 20.0 寒天 20.0 変異源処理の後、培養物はYPD寒天上に（プレートあ
たり約150）、単一コロニーになるよう広げ、約５日
間、約30℃でインキュベートした。それから、各コロニ
ーからの菌体を、グルコースを含むM9塩寒天ベースの培
地にレプリカ培養のため置いた。レプリカプレートは、
30℃で３日間インキュベートした。そのプレートはスク
リーンされ、イソロイシンとバリンが生育に必要な変異
株を同定した。49−40H1と呼ばれる変異株は、Ｏ−メチ
ルトランスフェラーゼ活性を欠き、生育にイソロイシン
とバリンが必要という"early ilv"変異を獲得した。

G.O−メチルトランスフェラーゼ活性を欠き、生育にイ
ソロイシンとバリンを必要とし（"early ilv"）、その
唯一の炭素源としてイソロイシン、ロイシンそれにバリ
ンの混合物を利用する能力がある（ILV⁺）、S.アベルミ
チリス変異株49−40H1ILV⁺の単離 変異株49−40H1の胞子を、イソロイシン、ロイシンそ
れにバリン各0.33％の混合物を唯一の炭素源として含
む、M9限定塩寒天上に撒いた。そのプレートを、30℃デ
インキュベートし、よく生育しない49−40H1のコロニー
の中に、よく生育するものが現れないか定期的にスクリ
ーンした。よく生育するコロニーは、YPD寒天プレート
に植えることにより精製したが、そのようなコロニーの
内の一つが49−40H1ILV⁺と呼ばれる。変異株49−40H1IL
V⁺はＯ−メチルトランスフェラーゼ活性を欠き、生育に
イソロイシンとバリンを要求するが（"early ilv"）、
その唯一の炭素源としてイソロイシン、ロイシンそれに
バリンを利用する能力がある（ILV⁺）。

H.O−メチルトランスフェラーゼ活性を欠き（omt−）、
生育にイソロイシンとバリンを必要とし（"early il
v"、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性を欠く）、その
唯一の炭素源としてイソロイシン、ロイシンそれにバリ
ンの混合物を利用する能力があり（ILV⁺）、アグリニン
とウラシルを生育に要する（car−11）、S.アベルミチ
リス変異株PGS−131の単離 変異株49−40H1ILV⁺をSCM培地で生育させ、上記パー
トＦで記載した手順に従いEMSを用い、変異処理を与え
た。変異処理の後、培養液を希釈し、YPD寒天上に（プ
レートあたり約150）単一のコロニーになるよう撒い
た。そのプレートは、約30℃で５日間インキュベートし
た。次いで、単一コロニーからの菌体を、ロイシン、イ
ソロイシン、バリンを各100μg/ml含むM9塩寒天ベース
の培地にレプリカをとるよう撒いた。そのプレートは30
℃で３日間インキュベートし、生育されないコロニーを
スクリーンした。そのようなコロニーの一つが同定さ
れ、PGS−131と参照された。変異株PGS−131（omt^-、ea
rly ilv、ILV⁺、car−11）は、Ｏ−メチルトラハンスフ
ェラーゼ活性を欠き（omt^-）、生育にイソロイシンとバ
リンを必要とするが（"early ilv"、側鎖のある２−オ
キソ酸生合成活性を欠く）、その唯一の炭素源としてイ
ソロイシン、ロイシンそれにバリンの混合物を利用する
能力があり（ILV⁺）、アグリニンとウラシルを生育に要
する（試験的にcar−11と名付けた）。PGS−131は、以
下で記述した菌株209R38（ATCC 55220）を作成するため
の融合で、親菌株の一つとした。

I.側鎖のある２−オキソ酸生合成活性と側鎖のあるアミ
ノ酸トランスアミナーゼ活性に欠ける、S.アベルミチリ
ス変異株PGS−119の作成 変異株PGS−119（ATCC 53670）は、1988年９月28日に
公開された、欧州特許応用第284、176号に記載の方法で
調製した。完全を期するため、その開示を以下で繰り返
す。

ステップ1.新鮮なSAMM寒天プレート上で４日間生育した
S.アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）約100mgを、50m
lのSCM培地（pH7.2）が入っている300mlのフラスコに接
種する。そのフラスコは、200RPM,30℃で24時間震とう
する（最終pH＝8.2）。

ステップ2.そのフラスコを震とう器からはずし、全培養
液のうち10mlを2000RPMで５分間、殺菌した試験管で遠
心した。ついでその細胞は、殺菌した300mlエルレンマ
イヤーフラスコ中の50mlのSCM培地に再懸濁され、その
フラスコは、30℃で２時間回転式震とう器で震とうし
た。

ステップ3.懸濁液10mlを、殺菌した試験管に入れた。

ステップ4.エチルメタンスルフォネート（250μｌ）を
その試験管に加え（よく排気するフードの下で）、その
内容物を十分に混ぜ合わせ、次いで300mlの殺菌したフ
ラスコにいれ、30℃で３時間回転式震とう機でそのフラ
スコを震とうした。

ステップ5.新鮮な殺菌したSCM培地を（40ml）そのフラ
スコに加え、30℃で合計70時間震とうを継続した。

ステップ6.そのフラスコを震とう機よりはずし、その内
容物を8000回転で20℃、10分間遠心し、沈澱させた。細
胞は、SCM培地に再懸濁することにより洗い、再び遠心
沈澱させ、さらに10mlSCM培地に再懸濁させた。

ステップ7.細胞は集められ、それらがＬ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−バリンおよび該アミノ酸の組み合
わせの有無により、M9/グリコース限定培地上で生育で
きる能力を、約150コロニー／プレートのレプリカ培養
により、アッセイした。関心がある生育をする変異細胞
は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンそれに、Ｌ−バリ
ンが補われている培地でのみで生育すく。これらのS.ア
ベルミチリスＩ−３の派生種（ATCC 53567）は、側鎖の
あるアミノ酸トランスアミナーゼ活性がなく、またＬ−
ロイシン、Ｌ−イソロイシンそれに、Ｌ−バリンの前駆
体となる３種の２−オキソ酸（２−オキソカプロン酸、
２−オキソ−３−メチル吉草酸それに２−オキソイソ吉
草酸）の一つもしくは複数を加えた培地では生育しな
い。この振る舞いは、そのような培地上でよく生育する
S.アベルミチリスＩ−３（ATCC 53567）と完全に対立す
る。それゆえ、単一のトランスアミナーゼ酵素が該２−
オキソ酸のトランスアミナーゼ反応を触媒しているよう
に見える。

変異株PGS−119（ATCC 53670）はそのように同定さ
れ、側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性と側
鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性がともに欠け
ている。

J.側鎖のある２−オキソ酸生合成活性と側鎖のあるアミ
ノ酸トランスアミナーゼ活性に欠け、グアノシンを生育
に必要とする、S.アベルミチリスPGS−132の作成 変異株PGS−119（ATCC 53670）の胞子に、上記パート
Ｉで記載した手順に従いEMSを用い、変異処理を与え
た。変異処理の後、変異をかけた培養物を、YPD寒天上
に（プレートあたり約150）単一のコロニーになるよう
撒き、そのプレートは、約０℃で５日間インキュベート
した。次いで、単一コロニーからの菌体を、0.5％グル
コース、および、ロイシン、イソロイシン、バリンを各
100μl/ml含むM9塩寒天ベースの培地にレプリカをとる
よう撒いた。そのレプリカプレートは30℃で３日間イン
キュベートし、生育しないコロニーをスクリーンした。
そのようなコロニーの一つが同定され、PGS−132と参照
された。PGS−132は、側鎖のある２−オキソ酸生合成活
性と側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性に欠
け、グアノシンを生育に必要とする（gua）。PGS−132
は、以下で記述した菌株209R38（ATCC 55220）を作成す
るための融合で、親菌株の一つとした。

K.変異株PGS131とPGS132の融合と、S.アベルミチリス20
9R38（F.D.28857、ATCC 55220）の単離 PGS131とPGS132の原形質体を融合に用いるよう調製す
るため、各菌種の細胞を次のように調製した。YPD−４
寒天上で生育している新鮮な細胞を、300mlのエルレン
マイヤーフラスコ中のAS−７培地（40ml）に寒天プラグ
により無菌的に移した。そのフラスコは、30℃、200rpm
で１日間インキュベートした。2.5mlのAP−５培地で生
育した培養物を、300mlの止め具付き（baffled）エルレ
ンマイヤーフラスコ中の、50mlのYEME培地に接種するの
に用いた。そのフラスコは、30℃、200rpmで２日間イン
キュベートした。

YPD−４寒天とYEME培地は以下の組成である。YPD−４寒天 g/L ディフコ（Difco）−イースト抽出物 10 ディフコ（Difco）−バクト ペプトン 10 デキストロース ５ 酢酸ナトリウム ３ 寒天−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルフォン酸 10 ph7.0とするための水酸化ナトリウム 20 121℃で25分間オートクレーブ、 ついで3BCFAを加える。 1.3ml/L3BCFA （Ｓ）（＋）−メチル酪酸 ５％,pH7.2（HaOH） 10ml イソ吉草酸 ５％,pH7.1（HaOH） 4ml イソ酪酸 ５％,pH7.1（HaOH） 12ml よく混和し、ろ過滅菌。YEME培地 ベース溶液： ディフコ（Difco）−イースト抽出物 3g ディフコ（Difco）−バクト ペプトン 5g ディフコ（Difco）−バクト麦芽抽出物液 3g グルコース 10g シュークロース 300g 蒸留水で 973ml とする 121℃、25分オートクレーブする オートクレーブの後、殺菌した以下のものを加える： MgCl₂・6H₂O（2.5M） 2ml グリシン（20％） 25ml 全量を1Lに調製。

YEME培地で約２日間インキュベーションした後、細胞
は刈り取られ、原形質体はホップウッド等が、ストレプ
トミセスの遺伝子操作：実験室マニュアル、1985年、12
−14頁に記載の方法で調製した。利用に先立ち、リゾチ
ームをＰ緩衝液に溶かした。Ｐ緩衝液中の原形質体は、
Ｐ緩衝液中に融合前数日間−70℃で、凍結保存した。

融合を行わせるため、原形質体は−70℃の貯蔵状態か
ら、水道水の流水にさらし、急速に溶解した。おおよそ
同じ数のPGS131とPGS132の原形質体を静かに、ポリカー
ボネートの遠心管にピペットでいれた。その管の内容量
はＰ緩衝液で5.0mlに調節した。Ｐ緩衝液 ベース溶液： シュークロース 205g K₂SO₄ 0.25g MgCl₂・6H₂O 2.02g 蒸留水で 977g とする 121℃、25分オートクレーブする オートクレーブの後、殺菌した以下のものを加える： KH₂PO₄（0.5％） 1ml 微量要素溶液^＊ 2ml CaCl₂・2H₂O（3.68％） 10ml MES 緩衝液（1.0M） 10ml pHを6.5に調節し、全量を1Lとする。^＊ 微量要素溶液はパートＡで記載した通り。

次いで、原形質融合のための混合液は、約2000gで７
分間遠心した。上精を注意深く流し、原形質ペレットを
最終量が200μｌになるようＰ緩衝液に再懸濁した。そ
の懸濁液に50％PEGを800μｌ加えた。50％のPEGは、ガ
ラスバイアル中で1gのPEG1000（シグマ化学（Sigma Che
mical Co.）,St.Louis,MO 63178）をオートクレーブ処
理し、その各バイアルに1.0mlのＰ緩衝液を加えて55℃
で加熱するか、あるいは、使用直前にPEGを計量してＰ
緩衝液中に溶かし、ろ過滅菌することにより用意した。

原形質融合のための混合液は、パスツールピペットに
より吸い上げたり吐き出したりする操作により、混合し
た。融合したものは、室温で２分間インキュベートし
た。次いで、PEGを希釈するため、9mlのＰ緩衝液を加え
た。原形質融合のための混合液は、ついで約2000gで７
分間遠心し、上精を注意深く流して、融合し洗った原形
質体は1mlのＰ緩衝液に再懸濁した。融合した原形質体
の希釈系列は、Ｐ緩衝液で作成した。それから、系列希
釈液の1.0mlを、ディスポーザブルのプラスチックルー
プを用い、マックネイルの（Mac Neil′ｓ）RM14再生培
地（多少変更しているが）寒天プレートの表面に静かに
広げた。

マックネイルの（Mac Neil′ｓ）RM14再生培地（多少変
更） ベース溶液： シュークロース 205g K₂SO₄ 0.25g MgCl₂・6H₂O 10.12g グルコース 10g ディフコカザミノ酸 0.1g ディフコイースト抽出物 5.0g ディフコオートミル寒天 3.0g ディフコバクト寒天 22.0g 蒸留水で 955ml とする 121℃、25分オートクレーブする オートクレーブの後、殺菌した以下のものを加える： KH₂PO₄（0.5％） 10ml CaCl₂・2H₂O 5ml Ｌ−プロリン（20％） 15ml MES 緩衝液（1.0M） 10ml 微量要素溶液^＊ 2.0ml NaOH（1N） 3.0ml pHを6.5に調節し、全量を1Lとする。^＊ 微量要素溶液は以下の通り（リットルあたり）： ZnCl₂ 40mg FeCl₃・6H₂O 200mg CuCl₂・2H₂O 10mg MnCl₂・4H₂O 10mg Na₂B₄O₇・10H₂O 10mg (NH₄)₆Mo₇O₂₄・4H₂O 10mg 再生プレートで約30℃で８日間インキュベートする
と、基本的に10⁰、10^-1それに10^-2希釈のプレートに生
育がみられる。10⁰、10^-1それに10^-2希釈のプレート
は、別々に300mlのエルレンマイヤーフラスコ中の100ml
のAS−７培地に、接種した。そのフラスコは、約30℃、
200rpmで２日間インキュベートされた。得られたAS−７
培養物は、80％グリセロールと1:1に混合し、YDP寒天で
力価を測定し、−20℃で保存した。コンタミネーション
により、10⁰のAS−７培養物で廃棄した。10^-1および、1
0^-2の培養物の培養力価は、同じ値を与え、1.5×10⁷コ
ロニー/mlを与えた。その主なコロニーは、典型的にはY
PD寒天上で、例えば色がついていて柔らかいが、コロニ
ーの内約１％は小さい。

組み替えの起きた（融合した）コロニーを選択するた
め、培養物はM9/グリセロールにシンカサ（syncasa）と
パントテネートを加えた寒天プレートに撒かれ、約30℃
で５−７日間インキュベートした。

M9/グリセロールにシンカサとパントテネートを加えた
寒天 グリセリン 5g 寒天 20g H₂O 900ml 121℃、25分オートクレーブする 10X M9塩濃縮液（２価金属塩なし）を100ml加える； 10mlのシンカサ（100倍濃縮）； 1mlのD,L−パントネート（１％）、ろ過滅菌； 1mlの滅菌した1M MgSO₄；それに 1mlの滅菌した0.1MCaCl₂。

10X M9塩濃縮液（２価金属塩なし） Na₂HPO₄ 60g KH₂PO₄ 30g NaCl 5g NH₄Cl 10g H₂Oで全量 1Lとする。

121℃、25分オートクレーブする“シンカサ”の組成 100倍濃度 g/l Ｌ−アラニン 3 Ｌ−アルギニン 4 Ｌ−アスパラギン酸 6 Ｌ−システイン 1 Ｌ−グルタミンサン 20 グリシン 1 Ｌ−ヒスチジン 2 Ｌ−イソロイシン 5 Ｌ−ロイシン 9 Ｌ−リジン 7 Ｌ−メチオニン 3 Ｌ−フェニルアラニン 6 Ｌ−プロリン 10 Ｌ−セリン 6 Ｌ−スレオニン 4 Ｌ−チロシン 4 Ｌ−トリプトファン 1 Ｌ−バリン 6 混合物はpH7に調整され、ろ過滅菌した。濃縮液１容
量に対し、99容量の培地を加え、標準利用濃度とした。

組み替えを起こしたコロニーは、背景の小さい、針の
頭ほどの大きさのコロニーの中で、約直径0.5cmの大き
い健康そうなコロニーとして、容易に認められる。組み
替え産物は、生育にアルギニン、ウラシルそれにグアノ
シンを必要としない（car⁺、gua⁺）。グリセリンで保存
した細胞を−20℃から、M9/グリセロールにシンカサと
パントテネートを加えた寒天上に展開すると、10^-1培養
物の約25％のコロニー（575中163）がcar⁺かつgua⁺であ
り、10^-2培養物の13％（75中10）がcar⁺かつgua⁺であっ
た。それより薄い希釈では、car⁺、gua⁺組替種の生成が
落ちるが、組替種のグリセロールでの−20℃保存時に何
らかの不安定さがあることを示している。

多くのcar⁺、gua⁺の組替種について、上述した₁₄CO₂
法による、側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活
性の存在テストが行われた。そのような活性のある組替
種について、それらがイソロイシン、ロイシンそれにバ
リンを必要とするかどうか（ilvE）、上述した適当な培
地上でテストした。側鎖のある２−オキソ酸デヒドロゲ
ナーゲ活性があり、イソロイシン、ロイシン、それにバ
リンを必要とする（ilvE）組替種について、２−メチル
ブチレートもしくはシクロヘキサンカルボン酸といった
適当な前駆体を加えたAP−５培地で組替種を培養するこ
とにより、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性がないこ
とをスクリーンし、どの培養物がアベルメクチンＡタイ
プ化合物を賛成できないか決定した。上記のHPLC法は組
替種により産生されたアベルメクチン化合物の存在をア
ッセイするのに利用した。

そのような組替種の一つ（209R38）は、検出できる量
のアベルメクチンＡ化合物をつくらず、かつ、アベルメ
クチンＢを最もよく生産するものとして選ばれた。209R
38は、イソロイシン、ロイシンそれにバリン（それぞれ
0.25％−0.33％）の混合物を唯一の炭素源として利用す
ることができないことが分かったが、それはilvE変異株
に期待されていることである。その組替種は、その親の
一つに、early ilv変異を含むかどうか確かめるため、
詳しく検討された。このため、組替種209R38は、変異株
Ｉ−３をつくる際、上述した方法で変異を与えかつ選択
している際に単離された、ヒスチジンを必要とするATCC
31272という変異株（his^-）と、”逆交差”させた。”
逆交差”は、変異株209R38とhis−変異株を、上述した
融合の方法で原形質融合させることにより行った。組み
替えたコロニーは、各0.1％の３種の側鎖のある２−オ
キソ酸、すなわち２−オキソイソカプロン酸、２−オキ
ソ−３−メチル吉草酸それに、２−オキソ−３−メチル
酪酸を含むが、ヒスチジンを含まないM9塩／グリセロー
ル寒天で選択された。そのような培地では、his⁺、ilvE
⁺組替種は、それらがearly ilv変異を持っているかどう
かによらず、生育するであろう。なぜなら、培地中の２
−オキソ酸がそのような変異のイソロイシンおよびバリ
ンに対する栄養要求を満足させるからである。２−オキ
ソ酸のない、M9塩／グリセロール寒天に対するこれらの
組替種のレプリカ培養では、ある組替種は生育せず、20
9R38菌株の中に、early ilvが存在することを示してい
る。

組替種209R38（F.D.28857,ATCC 55220）は、early il
v変異（側鎖のある２−オキソ酸生合成活性欠如）とilv
E変異（側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性欠
如）を含み、さらにＯ−メチルトランスフェラーゼ活性
も欠けている。

実施例２ 側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性（ilvE）
および、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性（"early i
lv"）が欠如した、S.アベルミチリスを融合により作成
する別の方法 S.アベルミチリス ilvE、early ilv二重変異株をつ
くる別のルートは、アベルメクチン産生ilvE菌株と、ア
ベルメクチン産生early ilv菌株を融合させることによ
る。それらの一方もしくは両方が、プロリンやリジンが
必要といった、更にかつ別個の非−ilv栄養要求を含ん
でいても良い。その際、融合株は一般的にその原栄養要
求に対する追加の必要性という特徴により選択し、実施
例１で記述した方法で望ましいilvE、early ilv二重変
異遺伝タイプをスクリーンする。

実施例３ 側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活性（ilvE）
および、側鎖のある2-オキソ酸生合成活性（"early il
v"）が欠如した、S.アベルミチリスを変異により作成す
る別の方法 S.アベルミチリスのアベルメクチンを産生する菌株
を、専門家によく知られた標準的な方法で変異させ、そ
の変異株を実施例１で記述したearly ilv変異に対する
方法でスクリーンする。一度同定されたら、early ilv
菌株はついで、変異源にさらされ、得られた変異株は実
施例１に記載のilvE変異に対する方法でスクリーンす
る。

実施例４ S.アベルミチリス 209R38（ATCC 55220）によるアベ
ルメクチンＢ化合物の産生 S.アベルミチリス ATCC209R38が、側鎖のある脂肪酸
もしくは側鎖のある２−オキソ酸を前駆体として利用
し、アベルメクチンＢ化合物を産生する能力を力を決定
するため、以下の一連の培養を行った。

S.アベルミチリス209R38を、300mlエルレンマイヤー
フラスコ中の30mlのAS−７培地に接種し、そのフラスコ
は約30℃、200rpmで約40時間震とうしながらインキュベ
ートした。次いで、培養物の2.5mlを、下記の表１に示
した前駆体400ppmを含む30mlのAP−５培地が入った300m
lエルレンマイヤーフラスコに接種した。フラスコは、
約30℃、200rpmで20日間インキュベートされた。次い
で、培養物は溶媒で抽出され、上述したHPLC法に従いＢ
アベルメクチンの産生を分析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】側鎖のあるアミノ酸に対するトランスアミ
   ナーゼ活性ならびに側鎖のある２−オキソ酸の生合成活
   性が欠けているストレプトミセス アベルミチリス（St
   reptomyces avermitilis）。
2. 【請求項２】側鎖のあるアミノ酸に対するトランスアミ
   ナーゼ活性、側鎖のある２−オキソ酸の生合成活性、お
   よびアベルメクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
   活性が欠けている、ストレプトミセス アベルミチリ
   ス。
3. 【請求項３】ATCC 55220の特性を持つ、請求項２のスト
   レプトミセス アベルミチリス。
4. 【請求項４】ATCC 55220である、請求項３の菌株。
5. 【請求項５】側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ活
   性、側鎖のある２−オキソ酸生合成活性、およびアベル
   メクチンＢ−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性が欠け
   ているストレプトミセス アベルミチリスの菌株を、吸
   収して利用できる、窒素、炭素、無機酸源、および下記
   （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の化合物からなる
   水性栄養培地中で、好気的に培養することによる、アベ
   ルメクチンの製造方法： （ａ）式Ｒ−COOHの化合物 （式中ＲがＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
   ニル、アルキニル、アルコキシアルキルもしくはアルキ
   ルチオアルキル基；アルキル基がアルファ位で分岐した
   C₂−C₅アルキル基であるC₅−C₈シクロアルキル基；C₃−
   C₈シクロアルキルまたはC₅−C₈シクロアルケニル基（こ
   れらの基のいずれかがメチレンまたは１つ以上のC₁−C₄
   アルキル基またはハロゲン原子で置換されていいてもよ
   い）；または、飽和しているか、完全または部分的に不
   飽和であって、場合により１つ以上のC₁−C₄アルキル基
   またはハロゲン原子で置換された、酸素または硫黄を含
   む３から６員のヘテロ環である）、あるいは、培養中に
   該化合物に転化し得る下記式の前駆物質 Ｒ′(CH₂)_n−Ｚ （式中Ｒ′は上記で定義したものであり;nは０、２、
   ４、または６であり、Ｚは−CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、
   −C₂NH₂または−CONHR⁶であり、R⁵は水素または（C₁−C
   ₆）アルキル、R⁶は水素、（C₁−C₄）アルキル、−CH(CO
   OH)CH₂COOH、−CH(COOH)(CH₂)₂COOHもしくは、−CH(COO
   H)(CH₂)₂SCH₃である）； （ｂ）式Ｒ−COOHの化合物 （式中Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
   −C₈アルキニル、あるいはアルコキシアルキルまたはア
   ルキルチオアルキル（各アルキルもしくはアルコキシ基
   に１から６炭素原子を含む）であり、該アルキル、アル
   コキシアルケニルもしくはアルキニル基は一つ以上のハ
   ロゲン原子で置換されていてもよく；または、C₃−C₈シ
   クロアルキルもしくはC₅−C₈シクロアルケニル基（これ
   らの基のいずれかがメチレンまたは、１つ以上のC₁−C₄
   アルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよ
   い）；または、飽和しているか、完全または部分的に不
   飽和の、１つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原
   子で置換されていてもよい、酸素または硫黄を含む３か
   ら６員のヘテロ環；または、SR⁷基（R⁷はC₁−C₈アルキ
   ル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、C₃−C₈シク
   ロアルキル、C₅−C₈−シクロアルケニル、非置換または
   置換フェニル（置換基はC₁−C₄アルキル、C₁−C₄アルコ
   キシまたはハロゲン）、または、飽和しているか、完全
   または部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基
   もくしはハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素ま
   たは硫黄を含む３から６員のヘテロ環である））、ある
   いは、培養中に該化合物に転化し得る下記式の前駆物質 Ｒ″−(CH₂)_n−Ｚ′ （Ｚ′は−CH₂OH、−CH₂NH₂、−COOHまたは−CHOであ
   り、Ｚ′が−CH₂OH，−CH₂NH₂または−CHOのとき、ｎは
   １、３または５であり、Ｚ′が−COOHのときｎは３また
   は５である）； （ｃ）式 （式中ＲがＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
   ニル、アルキニル、アルコキシアルキルもしくはアルキ
   ルチオアルキル基、または、C₅−C₈シクロアルキルアル
   キル基（ここでアルキル基はアルファ位で分岐したC₂−
   C₅アルキル基である）；C₃−C₈シクロアルキルまたはC₅
   −C₈シクロアルケニル基（これらの基のいずれかがメチ
   レンか１つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子
   で置換されていてもよい）；または、飽和しているか、
   完全にもしくは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄ア
   ルキル基またはハロゲン原子で置換されていてよい、酸
   素または硫黄を含む３から６員のヘテロ環である）、あ
   るいは、培養中に該化合物に転化し得る前駆物質 （ＲはＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
   ニル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキル
   チオアルキル基；C₅−C₈シクロアルキルアルキル基（こ
   こでアルキル基はアルファ位で分岐したC₂−C₅アルキル
   基である）；C₃−C₈シクロアルキルまたはC₅−C₈シクロ
   アルケニル基（これらの基のどちらかがメチレンか、１
   つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子で置換さ
   れていてもよい）；または、飽和しているか、完全また
   は部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基また
   はハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素または硫
   黄を含む３から６員のヘテロ環であり；そして、Ｚが−
   CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−C₂NH₂または−CONHR⁶であ
   り、R⁵は水素または（C₁−C₆）アルキル、R⁶は水素、
   （C₁−C₄）アルキル、−CH(COOH)CH₂COOH、−CH(COOH)
   (CH₂)₂COOHまたは−CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃である）；ある
   いは （ｄ）式 （式中Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
   −C₈アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキルチ
   オアルキル（各アルキルもしくはアルコキシ基に１から
   ６炭素原子を含む）（ここで該アルキル、アルコキシ、
   アルケニルもしくはアルキニル基は一つ以上のハロゲン
   原子で置換されていてもよい）； C₃−C₈シクロアルキルもしくはC₅−C₈シクロアルケニル
   基（これらのいずれかがメチレンまたは、１つ以上のC₁
   −C₄アルキルまたはハロゲン原子で置換されていてもよ
   い）；飽和しているか、完全または部分的に不飽和で、
   １つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子で置換
   されていてもよい、酸素または硫黄を含む３から６員の
   ヘテロ環；または、SR⁷基（ここで、R⁷はC₁−C₈アルキ
   ル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、C₃−C₈シク
   ロアルキル、C₅−C₈シクロアルケニル、非置換または置
   換フェニル（該置換基はC₁−C₄アルキル、C₁−C₄アルコ
   キシまたはハロゲン）、または、飽和しているか、完全
   またはは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル
   基またはハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素ま
   たは硫黄を含む３から６員のヘテロ環である）、あるい
   は、培養中に該化合物に転化し得る下記式の前駆物質 （Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
   −C₈アルキニル、各アルキルもしくはアルコキシ基に１
   から６炭素原子を含むアルコキシアルキルまたはアルキ
   ルチオアルキル（該アルキル、アルコキシ、アルケニル
   もしくはアルキニル基は一つ以上のハロゲン原子で置換
   されていてもよい）；C₃−C₈シクロアルキルまたはC₅−
   C₈シクロアルケニル基（これらの基のいずれかがメチレ
   ンまたは、１つ以上のC₁−C₄アルキル基かハロゲン原子
   で置換されていてもよい）；飽和しているか、完全もし
   くは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基か
   ハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素または硫黄
   を含む３から６員のヘテロ環；または、SR⁷基（R⁷はC₁
   −C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、
   C₃−C₈シクロアルキル、C₅−C₈シクロアルケニル、非置
   換または置換フェニル（該置換基はC₁−C₄アルキル、C₁
   −C₄アルコキシまたはハロゲン、または、飽和している
   か、完全にもしくは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−
   C₄アルキル基かハロゲン原子で置換されていてもよい、
   酸素または硫黄を含む３から６員のヘテロ環であり；そ
   してＺが−CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−C₂NH₂または−CO
   NHR⁶であり、R⁵は水素または（C₁−C₆）アルキル、R⁶は
   水素、（C₁−C₄）アルキル、−CH(COOH)CH₂COOH、−CH
   (COOH)(CH₂)₂COOHもしくは、−CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃であ
   る）。
6. 【請求項６】Ｒ′が シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロヘキシル、 シクロヘプチル、 ２−メチルシクロプロピル、 ３−シクロヘキセニル、 １−シクロペンテニル、 １−シクロヘキセニル、 ３−メチルシクロヘキシル（シス／トランス） ４−メチレンシクロヘキシル、 ３−メチルシクロブチル、 ３−メチレンシクロブチル、 ３−シクロペンテニル、 １−シクロプロピルエチル、 ３−フルオロシクロブチル、 4,4−ジフルオロシクロヘキシル、 イソプロピル、 sec−ブチル、 ２−ペンチル、 2,3−ジメチルプロピル、 ２−ヘキシル、 ２−ペント−４−エニル、 ２−メチルチオメチル、 Ｓ−２−メチルペンチル、 Ｒ−２−メチルペンチル、 ２−チエニル、 ３−チエニル、 ４−テトラヒドロピラニル、 ３−フリル、 ２−クロロチエニル、 ３−テトラヒドロチエニル、 ４−メチルチオ−２−ブチル、 ４−テトラヒドロチオピラニル、 ４−メトキシ−２−ブチル、もしくは、 ４−メチルチオ−２−ブチルである請求項５の方法。
7. 【請求項７】Ｒ′がシクロヘキシルである請求項６の方
   法。
8. 【請求項８】Ｒ−COOHが メチルチオ酢酸、 エチルチオ酢酸、 ３−メチル酪酸、 ３−トリフルオロメチル酪酸、 ３−メチルペンタン酸、 ｎ−酪酸、 シクロペンタン酢酸、 チオフェン−３−酢酸、もしくは、 プロピオン酸である請求項５の方法。
9. 【請求項９】Ｂアベルメクチンの調製において、S.アベ
   ルミチリスの菌株が、ATCC55220の特性を持つS.アベル
   ミチリスである請求項５の方法。
10. 【請求項１０】式 の化合物がシクロヘキシルグリオキサル酸である請求項
    ５の方法。
11. 【請求項１１】側鎖のあるアミノ酸トランスアミナーゼ
    活性および側鎖のある2-オキソ酸生合成活性が欠けてい
    るストレプトミセス アベルミチリスの菌株を、吸収し
    て利用できる、窒素、炭素、無機酸源、および下記
    （ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の化合物からなる
    水性栄養培地中で、好気的に培養することによる、アベ
    ルメクチンの製造方法： （ａ）式Ｒ−COOHの化合物 （式中ＲがＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
    ニル、アルキニル、アルコキシアルキルもしくはアルキ
    ルチオアルキル基；アルキル基がアルファ位で分岐した
    C₂−C₅アルキル基であるC₅−C₈シクロアルキル基；C₃−
    C₈シクロアルキルまたはC₅−C₈シクロアルケニル基（こ
    れらの基のいずれかがメチレンまたは１つ以上のC₁−C₄
    アルキル基またはハロゲン原子で置換されていいてもよ
    い）；または、飽和しているか、完全または部分的に不
    飽和であって、場合により１つ以上のC₁−C₄アルキル基
    またはハロゲン原子で置換された、酸素または硫黄を含
    む３から６員のヘテロ環である）、あるいは、培養中に
    該化合物に転化し得る下記式の前駆物質 Ｒ′(CH₂)_n−Ｚ （式中Ｒ′は上記で定義したものであり;nは０、２、
    ４、または６であり、Ｚは−CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、
    −C₂NH₂または−CONHR⁶であり、R⁵は水素または（C₁−C
    ₆）アルキル、R⁶は水素、（C₁−C₄）アルキル、−CH(CO
    OH)CH₂COOH、−CH(COOH)(CH₂)₂COOHもしくは、−CH(COO
    H)(CH₂)₂SCH₃である）； （ｂ）式Ｒ−COOHの化合物 （式中Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
    −C₈アルキニル、あるいはアルコキシアルキルまたはア
    ルキルチオアルキル（各アルキルもしくはアルコキシ基
    に１から６炭素原子を含む）であり、該アルキル、アル
    コキシアルケニルもしくはアルキニル基は一つ以上のハ
    ロゲン原子で置換されていてもよく；または、C₃−C₈シ
    クロアルキルもしくはC₅−C₈シクロアルケニル基（これ
    らの基のいずれかがメチレンまたは、１つ以上のC₁−C₄
    アルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよ
    い）；または、飽和しているか、完全または部分的に不
    飽和の、１つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原
    子で置換されていてもよい、酸素または硫黄を含む３か
    ら６員のヘテロ環；または、SR⁷基（R⁷はC₁−C₈アルキ
    ル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、C₃−C₈シク
    ロアルキル、C₅−C₈シクロアルケニル、非置換または置
    換フェニル（置換基はC₁−C₄アルキル、C₁−C₄アルコキ
    シまたはハロゲン）、または、飽和しているか、完全ま
    たは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基も
    しくはハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素また
    は硫黄を含む３から６員のヘテロ環である））、あるい
    は、培養中に該化合物に転化し得る下記式の前駆物質 Ｒ″−(CH₂)_n−Ｚ′ （Ｚ′は−CH₂OH、−CH₂NH₂、−COOHまたは−CHOであ
    り、Ｚ′が−CH₂OH，−CH₂NH₂または−CHOのとき、ｎは
    １、３または５であり、Ｚ′が−COOHのときｎは３また
    は５である）； （ｃ）式 （式中ＲがＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
    ニル、アルキニル、アルコキシルアルキルもしくはアル
    キルチオアルキル基、または、C₅−C₈シクロアルキルア
    ルキル基（ここでアルキル基はアルファ位で分岐したC₂
    −C₅アルキル基である）；C₃−C₈シクロアルキルまたは
    C₅−C₈シクロアルケニル基（これらの基のいずれかがメ
    チレンか１つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原
    子で置換されていてもよい）；または、飽和している
    か、完全にもしくは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−
    C₄アルキル基またはハロゲン原子で置換されていてよ
    い、酸素または硫黄を含む３から６員のヘテロ環であ
    る）、あるいは、培養中に該化合物に転化し得る前駆物
    質 （ＲはＲ′であり； Ｒ′は、アルファ位で分岐したC₃−C₈アルキル、アルケ
    ニル、アルキニル、アルコキシアルキルまたはアルキル
    チオアルキル基；C₅−C₈シクロアルキルアルキル基（こ
    こでアルキル基はアルファ位で分岐したC₂−C₅アルキル
    基である）；C₃−C₈シクロアルキルまたはC₅−C₈シクロ
    アルケニル基（これらの基のどちらかがメチレンか、１
    つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲン原子で置換さ
    れていてもよい）；または、飽和しているか、完全また
    は部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基また
    はハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素または硫
    黄を含む３から６員のヘテロ環であり；そして、Ｚが−
    CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−C₂NH₂または−CONHR⁶であ
    り、R⁵は水素または（C₁−C₆）アルキル、R⁶は水素、
    （C₁−C₄）アルキル、−CH(COOH)CH₂COOH、−CH(COOH)
    (CH₂)₂COOHまたは−CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃である）；ある
    いは （ｄ）式 （式中Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
    −C₈アルキニル、アルコキシルアルキルまたはアルキル
    チオアルキル（各アルキルもしくはアルコキシ基に１か
    ら６炭素原子を含む）（ここで該アルキル、アルコキ
    シ、アルケニルもしくはアルキニル基は一つ以上のハロ
    ゲン原子で置換されていてもよい）；C₃−C₈シクロアル
    キルもしくはC₅−C₈シクロアルケニル基（これらのいず
    れかがメチレンまたは、１つ以上のC₁−C₄アルキルまた
    はハロゲン原子で置換されていてもよい）；飽和してい
    るか、完全または部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄
    アルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよ
    い、酸素または硫黄を含む３から６員のヘテロ環；また
    は、SR⁷基（ここで、R⁷はC₁−C₈アルキル、C₂−C₈アル
    ケニル、C₂−C₈アルキニル、C₃−C₈シクロアルキル、C₅
    −C₈シクロアルケニル、非置換または置換フェニル（該
    置換基はC₁−C₄アルキル、C₁−C₄アルコキシまたはハロ
    ゲン）、または、飽和しているか、完全またはは部分的
    に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基またはハロゲ
    ン原子で置換されていてもよい、酸素または硫黄を含む
    ３から６員のヘテロ環である）、あるいは、培養中に該
    化合物に転化し得る下記式の前駆物質 （Ｒは−CH₂R″であり； Ｒ″は、水素、C₁−C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂
    −C₈アルキニル、各アルキルもしくはアルコキシ基に１
    から６炭素原子を含むアルコキシアルキルまたはアルキ
    ルチオアルキル（該アルキル、アルコキシ、アルケニル
    もしくはアルキニル基は一つ以上のハロゲン原子で置換
    されていてもよい）；C₃−C₈シクロアルキルまたはC₅−
    C₈シクロアルケニル基（これらの基のいずれかがメチレ
    ンまたは、１つ以上のC₁−C₄アルキル基かハロゲン原子
    で置換されていてもよい）；飽和しているか、完全もし
    くは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−C₄アルキル基か
    ハロゲン原子で置換されていてもよい、酸素または硫黄
    を含む３から６員のヘテロ環；または、SR⁷基（R⁷はC₁
    −C₈アルキル、C₂−C₈アルケニル、C₂−C₈アルキニル、
    C₃−C₈シクロアルキル、C₅−C₈シクロアルケニル、非置
    換または置換フェニル（該置換基はC₁−C₄アルキル、C₁
    −C₄アルコキシまたはハロゲン、または、飽和している
    か、完全にもしくは部分的に不飽和で、１つ以上のC₁−
    C₄アルキル基かハロゲン原子で置換されていてもよい、
    酸素または硫黄を含む３から６員のヘテロ環であり；そ
    してＺが−CH₂OH、−CHO、−COOR⁵、−C₂NH₂または−CO
    NHR⁶であり、R⁵は水素または（C₁−C₆）アルキル、R⁶は
    水素、（C₁−C₄）アルキル、−CH(COOH)CH₂COOH、−CH
    (COOH)(CH₂)₂COOHもしくは、−CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃であ
    る）。