DK175720B1 - Kulturer af Streptomyces avermitilis og fremgangsmåde til fremstilling af B-avermectiner - Google Patents

Description

I DK 175720 B1 I Den foreliggende opfindelse angår Streptomyces avermiti- B lis uden avermectin B O-methyltransferase-aktivitet og B forgrenet 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet, en frem- B gangsmåde til fremstilling af nævnte S. avermitilis.

I US patenterne 4 310 519 og 4 429 042 angår avermectiner, I et kompleks af beslægtede midler med potent antiparasi- tisk aktivitet og deres produktion ved aerob fermentering i I af stammer af Streptomyces avermitilis; nemlig S. avermi- I 10 tilis ATCC Nos. 31267, 31271 og 31272. Sidstnævnte to stammer repræsenterer henholdsvis en frossen ampul og et lyophiliseret rør af en kultur opnået ved ultraviolet be- I stråling af S. avermitilis ATCC 31267.

I 15 I EP 214 731, svarende til US patentansøgning 886 867 fra I 16. juli 1986 er beskrevet et antal forbindelser (omtalt I i det efterfølgende som ikke-natur-avermectiner), beslæg- I tet med naturligt forekommende eller kendte avermectiner, I men som har en hidtil ukendt substituent i 25-stillingen, I 20 samt en proces til fremstilling af disse forbindelse ved I fermentering af en avermectin-producerende organisme i I nærværelse af visse specifikke carboxylsyrer eller deri- I vater eller prekursorer deraf. Organismen S. avermitilis, I λ der anvendes til at producere de nævnte nye C-25-substi- I 25 tuerede avermectiner, er S. avermitilis ATcc 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121. Sidstnævnte organisme, som er beskrevet i EP 214 731, er afledt af S. avermitilis ATCC 31271. Der er angivet forbedrede udbytter af de nye C-25-substituerede avermectiner, når dyrkningen sker i et se-30 mi-defineret medium. Hver af organismerne ATCC 31267, 31271, 31272 og NCIB 12121 kan også, udover de nye C-25-

I DK 175720 B1 I

I 2 I

I substituerede derivater, producere forskellige mængder af I

I de kendte eller naturligt forekommende avermectiner, hvor I

25-substituenten er isopropyl eller (S)-sek-butyl-(1- I

methylpropyl). I

I 5 I

I Carbon-skeletet af avermectinerne angivet i efterfølgende I

formel (I) er afledt fra acetater og propionater og C-25- I

I substituenten af naturlige avermectiner fra L-isoleucin I

I (R=(S)-sek-butyl) eller L-valin (R=isopropyl) [Fisher and I

10 Mrozik, "Macrolide Antibiotics", Academic Press (1984) I

I Ch. 14]. I

Ved kendte eller naturlige avermectiner menes avermecti- I

H ner produceret af S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 I

H 15 og ATCC 31272, hvor 25-positions-substituenten er for- I

skellig fra isopropyl eller sek-butyl (S-form), omtales I

som nye eller ikke-naturale avermectiner. I

Stammen af S. avermitilis, der er citeret i ovennævnte US I

H 20 patentskrifter, producerer en gruppe stoffer, som gene- I

H relt beskrives deri som C-076. Gruppen omfatter otte spe- I

cifikke eller nært beslægtede forbindelser, der omtales I

som C-706 Ala, Alb, A2a, Bla, Blb, B2a og B2b. "A"-serien I

af forbindelserne er til de naturale avermectiner hvor : 25 25-substituenten er (S)- sek-butyl, og "B"-serien omfat- 1 ter forbindelser med 25-substituenten isopropyl. Beteg-neiserne "A" og "B" refererer til avermectiner hvor 5-substituenten er methoxy eller hydroxy, respektivt. Endeel lig refererer "1" til avermectiner, hvor en dobbeltbin- 30 ding er til stede i 22-23-positionen, og "2” refererer til avermectiner med et hydrogen i 22-positionen og hy- 3 DK 175720 B1 droxy i 23-positionen.

I den nævnte beskrivelse til patentansøgningen er der ikke anvendt nogen sådan identifikator i henseende til 25-5 substituenten af de ikke-naturale avermectiner. Identifi-katorerne Al, A2, Bl og B2 er opretholdt til at referere til ikke-naturale avermectiner med strukturelle egenskaber svarende til egenskaberne for naturale avermectiner som ovenfor angivet.

10

Dannelsen af mutanter uden forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet er rapporteret for Bacillus subtilis, Willecke and Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) og Pseudomonas putida, Martin et al., J. Bacterio-15 logy, 115, 198-204 (1973), men ikke for Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, en mutant, som i realiteten kun producerer avermectin-aglyconer Ala og A2a, er rapporteret af Schulman et al-, J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 20 (1985). Ligeledes rapporteret er fermenteringen af S.

avermitilis Agly-1 i nærvær af sinefungin, som forårsager forøget produktion af avermectin aglycone B komponenter.

Ligeledes vil S. avermitilis 08, der er en højt producerende stamme af avermectiner, når den fermenteres i nær-25 vær af sinefungin som inhibitor for O-methyl-transfera-ser, resulterer i produktion af avermectiner, der mangler O-methylgrupper ved aglycon-substituenten ved C-5 i oleandrose-disaccharid-delen.

30 I US patentskrift nr. 4 378 353 beskrives C-076-beslægtede forbindelser og deres fremstilling ved dyrk- i

I DK 175720 B1 I

I 4 I

I ning af MA-5218, der er en mutant af S. avermitilis ATCC I

I 31272, som opnås deraf ved ultraviolet bestråling. Mutan- I

I ten er identificeret som ATCC 31780. De med C-076 beslæg- I

I tede forbindelser, der produceres af den nævnte mutant, I

I 5 mangler C-076 furanringen. Endvidere er i visse af de I

I rapporterede forbindelser en eller begge oleandrose- I

I sukker-delene fraspaltet, medens 5-positionen i andre I

I forbindelser var oxiderede til dannelse af en ketogruppe. I

10 Tre grupper O-methyltransferase-mutanter af S. avermiti- I

lis, som producerer avermectiner uden O-methyl-grupper er I

H omtalt af Ruby et al., 6th International Symposium on the I

"Biology of Actinomycetes" Debrecen, Hungary, August 26- I

I 30 (1985) og af Schulman et al., Antimicrobial Agents and I

I 15 Chemotherapy 31, 744-7 (1987). Den første gruppe produce- I

rer primært B avermectiner som følge af deres manglende I

evne til at methylere C-5-hydroxylgruppen i den makro- I

cycliske lactonring. Den anden gruppe producerer 3’-O, I

3”-0-bis-demethylavermectiner (avermectiner uden O- I

20 methyl-substituenten 3-position af begge oleandrose- I

H monosaccharid-rester), og som omtales som demethylaver- I

H mectiner. Den tredie gruppe er ude af stand til at methy- I

I ! lere i nogen position. I

H 25 Schulman et al., Fed. Proc. 4_4, 931 (1985) rapporterer I

forøget produktion af B avermectiner ved fermentering af i I

H S. avermitilis i nærvær af substanser som sinefungin, S- I

adenosylethion og S-adenosylhomocystein, der inhiberer I

H methylering af C-5 hydroxy-gruppen af aglycon-delen ved I

30 enzymet avermectin B-O-methyltransferase. Streptomyces I

H avermitilis mutanter, som mangler O-methyltransferase- I

5 DK 175720 B1 aktivitet og producerer øgede mængder avermectin B komponenter, er også beskrevet og refereret af Schulman et al., i Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2_9, 620-624 (1986).

5

Mutagenese af S. avermitilis producerer mutanter, som mangler forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- aktivitet. Mutanterne har ikke længere evnen til at producere væsentlige mængder af de naturale avermectiner i 10 fravær af tilsat forbindelse RCOOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller en forbindelse, der kan omdannes til RCOOH under fermenteringsprocessen. Det har imidlertid overraskende og uventet vist sig, at der har kunnet findes mutanter, som producerer avermectiner, natura-15 le og ikke-naturale, når der fermenteres i nærvær af en tilsat forbindelse med formlen R-COOH, hvor R er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller andre grupper angivet der, eller af en prækursor fra den nævnte RCOOH. Det er endog mere overraskende, at de omhandlede mutanter, som kun 20 mangler forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- aktivitet, og som er ude af stand til at nedbryde L-isoleucin, L-leucin eller L-valin, er i stand til at assimilere vidt forskellige forbindelser i den biosyntetiske dannelsesrække for avermectin med produktion af ik-25 ke-naturale avermectiner, som er fri for tilstedeværelse af naturale avermectiner.

Mutagenese af de således producerede specifikt blokerede mutanter giver mutanter, som mangler både forgrenet-kæde-30 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet og avermectin 3-0-methyltransferase-aktivitet. De nævnte dobbeltblokerede

I DK 175720 B1 I

Η

i 6 I

I mutanter vil overraskende og uventet producere i det væ- I

I | sentlige kun naturale og ikke-naturale B avermectiner, I

når dyrkningen sker i nærvær af tilsat forbindelse med I

formlen R-COOH, hvor R har den ovenfor beskrevne betyd- I

I 5 ning. I

I · De naturale avermectiner bliver som ovenfor bemærket pro- I

I duceret som en kompleks blanding af otte specifikke, men I

I nært beslægtede forbindelser med formlen (I), hvor R=iso- I

I 10 propyl og (S)-sek-butyl. Selvom de er blevet udvundet i I

I ' hovedsagelig ren tilstand (se US patentskrift nr. 4 429 I

I 042), er metodologien i bedste fald arbejdskrævende. B-

I avermectiner udviser generelt større anthelmintisk akti- I

I vitet, end de tilsvarende A-avermectiner gør. Produktio- I

I 15 nen af ikke-naturale avermectiner (A- og B-komponenter) i I

I j overensstemmelse med den i EP 214 731 beskrevne proces I

I ! kan også producere nogle af de naturale avermectiner i I

I forskellige mængder som følge af tilstedeværelsen af for- I

I grenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase og amino-syre-L- I

I 20 valin og L-isoleucin i cellerne af S. avermitilis mikro- I

I organismer og i mediet, der anvendes ved deres produk- I

tion. I

H Evnen til kun at producere de mere bioeffektive B- I

I 25 komponenter af enten naturale eller ikke-naturale aver- I

mectiner til at formindske antallet af kompleksitet for I

produkterne og ved at gøre dette til at forøge renheden I

I af en udvalgt avermectin og derved forenkle separations- I

I proceduren er et ønskeligt mål. , I

I 30 : I

S. avermitilis stammer uden forgrenet-kæde 2-oxo-syre- I

I DK 175720 B1 dehydrogenase-aktivitet produceres ved mutation af aver-mectin-producerende stammer af S. avermitilis og især ved mutation af S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 eller NCIB 12121. Mutanterne er ude af stand til at 5 syntetisere de naturale avermectiner, bortset fra hvor fedtsyre eller en prækursor dertil, som indeholder isopropyl- eller sek-butyl-gruppen (S-form), sættes til mediet, hvori mutanterne fermenteres. De er i stand til at producere naturale og ikke-naturale avermectiner, når 10 dyrkningen finder sted under vandige aerobe betingelser i et næringsmedium indeholdende en passende inertieringssy-re eller forbindelse, der kan omdannes dertil, ved fermenteringsprocessen.

i 15 Mutanter, som er karakteristiske ved deres mangel påfor- grenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet, isoleres fra de mutageniserede kolonier på basis af en 14CC>2-assay.

Ved denne procedure indikerer fravær af 14CC>2-evolution ved permeabiliserede celler fra et substrat af [14C-l]-2-20 oxoisocapronsyre eller [14C-1]-2-oxo-3-methyl-valerian- syre eller [14C-1]-2-oxo-3-methylsmørsyre fravær af for-grenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet.

Det er overraskende og uventet, at de her beskrevne mu-25 tanter uden forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- aktivitet har opretholdt deres evne til at producere avermectiner, især ikke-naturale avermectiner. Mutanternes manglende evne til at producere de naturlige fedtsy-reacyl-koenzym A derivater ved vækst i et konventionelt 30 medium kunne have været en dødelig mutation, hvis membranintegriteten afhang af de nævnte derivater, eller I DK 175720 B1 Η hvis 2-oxo-syre-akkumuleringen af den førnævnte mutant I førte cytotoxicitet. Yderligere var det ikke ventet, at I mutanterne ville være i stand til at syntetisere acetyl I CoA og propionyl CoA ud fra L-isoleucin og L-valin-ned- I 5 brydende metabolisme, da de kræver enzymaktivitet, som mutanterne mangler. Betingelsen for at disse acyl CoA de- rivater kan biosyntetisere avermectin som ovenfor anført førte til den forventning, at mutanterne måtte være al- vorligt beskadiget i relation til deres ikke-naturale 10 avermectin-produktion, hvilket overraskende viste ikke at | være tilfældet.

Manglen på forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- aktivitet i de her beskrevne mutanter resulterer i for- 15 hindring af forgrenet-kædefedtsyreacyl CoA syntese ud fra nedbrydningen af L-isoleucin, L-leucin og L-valin og der- H ved for syntesen af de naturale avermectiner, undtagen H når syren R-COOH, (hvor R er (S) sek-butyl eller isopro- H pyl), eller en prækursor deraf, sættes til fermenterings- 20 mediet.

Yderligere mutation af de forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet-manglende mutanter producerer mu-tanter, som yderligere mangler avermectin B O-methyl-25 transferase-aktivitet. Mutanter uden avermectin B 0-methyltransferase-aktivitet er ude af stand til at methy-lere C-5-oxygenet i alglycone-delen af avermectiner. Mu-tanter uden en sådan aktivitet producerer i hovedsagen kun B avermectiner ved at forhindre fremstillingen af A 30 avermectiner.

9 DK 175720 B1

Udtrykkene "avermectin" eller "avermectiner" anvendes i den foreliggende beskrivelse i forbindelse med forbindelse med formlen (I), der er angivet i det efterfølgende, men hvor 25-substituenten (R) kan være enhver gruppe, som 5 er assimilerbar ved den nævnte position med S. avermiti- j lis, som er genstand for opfindelsen.

De her beskrevne mutanter er særdeles værdifulde til fremstilling af ikke-naturale B avermectiner ved proces-10 serne, som er illustreret i det efterfølgende. De er især værdifulde til produktion af foretrukne avermectiner, dvs. forbindelser, hvor C-25 substituenten er CU-Cgcyclo-alkyl eller cycloalkenyl, eventuelt substitueret ved Ci-C^-alkyl-gruppen; 1-methylthioethyl eller 5- eller 6-15 leddet oxygen eller svovl-heterocyclisk gruppe, især 3-thienyl- eller 3-furyl.

Mutation af en avermectin-producerende stamme af Strepto-myces avermitilis udføres på i og for sig kendt måde un-20 der anvendelse af forskellige mutationsfremkaldende midler, såsom ultraviolet bestråling, røntgenbestråling, behandling med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, ethyl-methan_sulfonat, salpetersyrling og nitrogen-sennepsgasser, f.eks. N-methylbis{2-chlorethyl)amin eller lig-25 nende. Mutagenesen kan udføres på sporer eller en vegetativ kultur af S. avermitilis, som kan producere naturale avermectiner, f.eks. S. avermitilis ATCC 31272.

Ved at følge procedurer, som er velkendte af fagmanden, 30 bliver mutageniserede kolonier udvalgt for mangel påfor-grenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase på basis af en bio-

I DK 175720 B1 I

I 10 1

I kemisk assay, som tillader screening af et stort antal I

I tilfældigt mutageniserede bakterie-kolonier for 14CC>2-

I produktion fra udvalgte [14C-1]-2-oxo-forgrenet-kæde- I

I syrer Tabor et al., J. Bact. 128, 485-486, 1976). I

I 5 I

I Methodologien omfatter dyrkning af mutant kolonier i brøn-

I de i en mikrotiterplade på et egnet næringsmedium, per- I

I meabilisering af cellerne med toluen efterfulgt af til- I

I sætning af [14C-1]-2-oxo-syre (f.eks. 2-oxoisocapronsyre) I

I 10 til hver brønd og måling af 14CC>2-indholdet i luften over I

I fermenteringsblandingen. I stedet kan [14C-1]-2-oxo-3- I

I methylvaleransyre eller [14C-1]-2-oxo-3-methylsmørsyre I

anvendes i stedet for [14C-1]-2-oxo-isocapronsyre. Pro- I

I duktion af 14CO- kan påvises ved anbringelse af fugtigt I

I 15 Ba(OH)2-mættet filter-papir over de enkelte brønde til

I opfangning af 14C02~frigivet og detektion af eventuelt I

tilstedeværende Ba14C03 autoradiografi. Mutanter, som I

I mangler forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet I

til at give autoradiogrammer som approximatierer autodia- I

20 grammerne for blank (upodede) kontroller; dvs. ingen I

I yderligere Ba14C03 produceres af mutanterne. I

De således opnåede mutanter underkastes yderligere muta- I

genese under anvendelse af ovennævnte muterende midler. I

25 Mutagenerede kolonier undersøges for mangel på avermectin I

B O-methyltransferase-aktivitet ved kromatografi (tyndt- I

lags HPL kromatografi) efter fermentering i nærvær af I

tilsat (prækursor (f.eks. 2-methylsmørsyre). I

30 Avermectin A forbindelser er sædvanligvis ikke til stede I

i fermenteringsvæsken af sådanne mutanter. I

DK 175720 B1 11 s i

Udover produktion af de ønskede alleler af en given stamme af mikroorganismer ved mutagenese tillader protoplast-fusionen indføring af ønskede alleler, som er producere-5 de/identificerede i en stamme ind i kromosomet af en an- den stamme. F.eks. kan, en stamme af S. avermitilis, der mangler forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase og aver-mectin B O-methyltransferase ved protoplast-fusion med en S. avermitilis stamme med ovennævnte aktiviteter, produ-10 cere en stamme af S. avermitilis, der mangler avermectin B O-methyltransferase-aktivitet. Fagmanden er klar over, at protoplast-fusionsteknologien muliggør en kombination af ønskede alleler ud fra de forskellige cellelinier og ind i en enkelt stamme.

15

Morfologiske og kulturelle egenskaber for mutanterne ifølge opfindelsen er generelt beskrevet i US patentskrift nr. 4 429 042. De særligt karakteristiske træk ved mutanterne ifølge opfindelsen er deres mangel påforgre-20 net-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet og deres avermectin B O-methyltransferase-aktivitet, jævnfør den efterfølgende beskrivelse. Manglen på de nævnte aktiviteter resulterer i mutanternes manglende evne til at producere de naturale B avermectiner, når de dyrkes i et defi-25 neret medium, som hovedsagelig er fri for fedtsyrer med formlen R'COH, hvor R' er isopropyl eller (S)-sek-butyl, eller forbindelser, der er konvertible til de nævnte R'COOH-forbindelser under fermenteringen. En taxonomisk undersøgelse, som er udført af American Type Culture Col-30 leetion, bekræftede, at egenskaberne for mutantstamme I-3, udvalgt ved ovennævnte 14C02-assay, er tæt beslægtet

I DK 175720 B1 I

I I

I med sådanne for parental ATCC 31273-stammen, som er be- I

I skrevet i US 4 429 042, men med visse undtagelser. Såle- I

I des danner mutanten 1-3 {ATCC 53567) væsentligt færre i I

sporekæder end ATCC 31272. Ved forsøg, som ligger til I

I 5 grund for den foreliggende opfindelse, har det vist sig, I

at raffinose ikke synes at understøtte væksten af 1-3. I I

I modsætning til beskrivelsen for ATCC 31272 i US 4 429 042 I

I blev det ved de nævnte forsøg ikke muligt at detektere I

I vækst af mutanten eller af ATCC 31272 med saccharose som I

10 eneste carbonkilde. Mutanten 1-3 mangler forgrenet-kæde I

2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet. Mutanten ifølge op- I

I findelsen med den dobbelte deficiens eller mangel, nemlig I

S. avermitilis 7881, der mangler forgrenet-kæde 2-oxo- I

syre-dehydrogenase-aktivitet og avermectin B O-methyl- I

15 transferase-aktivitet, dannet ved yderligere mutagenese I

af mutant 1-3 (ATCC 53567), har et tilsvarende taxonomisk I

I forhold til ATCC 31272, som mutanten 1-3 har. I

Streptomyces avermitilis 1-3 og 7881 er blevet deponeret I

20 under betingelserne for Budapest traktaten i American Ty- I

pe Culture Collection, Rockville, Maryland og under de I

H formelle betingelser. De har fået betegnelserne henholds- I

vis Streptomyces avermitilis ATCC 53567 og ATCC 53692. I

25 Hver af stammerne S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, I

ATCC 31272 og NCIB 12121 producerer de naturale avermec-· I

tiner, forbindelser med den almene formel (I) I

I DK 175720 B1 , Γ3 22r^rch R2 γΛ^^γ-Ο-νί JV ( hvor den punkterede linie i 22-23-positionen repræsenterer en valgfri dobbelt-binding R1 er hydroxy og kan findes, når dobbeltbindingen er fraværende, R2 er 4 1 - (ot-L-oleandrosyl) -a-L-oleandrosyloxy med formlen CH - n tr CH3° CH30 I DK 175720 B1 I 14 I R3 er hydrogen eller methyl, og R' er isopropyl eller (S)-sek-butyl. US. Patent 4 285 963 beskriver en avermectin med formel (I) hvor 25-positionen I 5 er substitueret med en methyl- og en ethylgruppe; Rxer I hydroxy og R3 er methyl, Η I de ikke-naturale avermectiner omtalt i denne beskrivel- se, er R en substituent som er forskellig fra isopropyl I 10 eller (S)-sek-butyl som defineret her.

De forbindelser, som er væsentlige for gennemførelse af I

I biosyntesen af forbindelser med formel (I), findes i cel- lerne af S. avermitilis og i mediet. Disse forbindelser 15 fremkommer ved nedbrydning af L-valin og L-isoleucin el- H ler fra deres tilsvarende 2-oxo-syre ved en decarboxyle- H ring af syren ved hjælp af forgrenet-kæde 2-oxo-syre- dehydrogenase, der ledsager kobling af produktet med koenzym A. Deres tilstedeværelse er årsag til den samti- 20 dige produktion af både isopropyl- og (S)-sek-butyl- H forbindelser med formlen (I). Dette giver naturligvis an- H ledning til problemer med adskillelse af isopropyl- H derivaterne fra (S)-sek-butyl-derivaterne.

H 25 Når man fermenterer i et næringsmedium indeholdende en passende initieringsforbindelse, vil mutanterne ifølge opfindelsen producere en forbindelse med formlen (I) el-ler, hvilket mere sædvanligt er tilfældet, en blanding af to forbindelser med formlen (I), hvori R' svarer til den 30 anvendte initieringsforbindelse. Indtil to produkter, hensigtsmæssigt og trivielt omtalt som R'-avermectin Bl 15 DK 175720 B1 og B2, i overensstemmelse med de betegnelser, som anvendes i US patentskrift nr. 4 429 042, kan produceres.

Gruppen R refererer naturligvis til C-25-substituenten.

Når R f.eks. er cyclopentyl, vil de mulige avermectiner 5 være:

Trivialnavn R^ R3 cyclopentyl

10 avermectin Bl dobbeltbinding H

cyclopentyl

avermectin B2 hydroxy H

15 I de ikke-naturale avermectiner er C-25-substituenten en "R" af formel (I) forskellig fra isopropyl eller (S)-sek-butyl.

Forbindelserne med formlen (I), hvor dobbeltbindingen er 20 til stede, og OH er fraværende, kan i stedet fremstilles ud fra den tilsvarende forbindelse med formlen (I), hvor R1 er OH, og dobbeltbindingen er fraværende, ved en de-hydratiseringsreaktion. Reaktionen udføres ved først selektivt at beskytte hydroxygrupperne i 5- og 4-positio-25 nerne, f.eks. som t-butyldimethylsilyoxyacetyl-drivatet, og derefter omsætte med et substitueret thiocarbonylhalo- - gen, såsom (4-methylphenoxy)thio-carbonylchlorid, efterfulgt af opvarmning i et opløsningsmiddel med højt kogepunkt, f.eks. trichlorbenzen, til opnåelse af dehydrati-30 sering. Til slut fjernes den beskyttende gruppe fra produktet til dannelse af den umættede forbindelse. Disse

I DK 175720 B1 I

I 16 I

I trin sammen med passende reagenser og reaktionsbetingel- I

I ser er beskrevet i US patent nr. 4 328 335. I

I Forbindelser med formlen (I) , hvor R1 er H, og dobbelt- I

I 5 bindingen er fraværende, kan fremstilles ud fra den til- I

I svarende forbindelse, hvor dobbeltbindingen er til stede, I

og R1 er fraværende, ved selektiv katalytisk hydrogene- I

I ring under anvendelse af en passende katalysator. F.eks. I

I kan reduktionen opnås ved anvendelse af tris(triphenyl- I

I 10 phosphin)rhodium (I)chlorid som beskrevet i EP publikati- I

I on nr. 0 016 689 og den tilsvarende US patent nr. 4 199 I

569 fra 22. april 1980. I

Forbindelserne med formlen (I) hvor R2 er H, fremstilles I

I 15 ud fra de tilsvarende forbindelser, hvor R2 er 4'-(a-L- I

oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxy, ved fjernelse af 4'-(α- I

L-oleandrosyl)-a-L-oleandrose-gruppen ved mild hydrolyse I

I med en syre i et vandigt organisk opløsningsmiddel til I

dannelse af aglycone med en hydroxy-gruppe i 13-posi- I

20 tionen; denne bliver derpå halogeneret f.eks. ved reakti- I

on med et benzensulfonylhalid til dannelse af 13-deoxy- I

13-halogen-derivatet, som til slut selektivt reduceres, I

f.eks. med tributyltin-hydrid. For at undgå uønskede I

H sidereaktioner er det ønskeligt at beskytte enhver anden I

25 hydroxygruppe, som kan være til stede, f.eks. ved hjælp I

af’ 'en tert-butyldimethylsilyl-gruppe. Denne fjernes let I

efter halogeneringen eller reduktionen ved behandling med I

methanol indeholdende et spor af syre. Alle disse trin j I

tilsammen med egnede reagenser og reaktionsbetingelser j I

30 for deres gennemførelse er beskrevet i EP publikation nr. I

0 002 615. I

17 DK 175720 B1

Forbindelser, der kan udnyttes af S. avermitilis ifølge opfindelsen til biosyntese af avermectiner, naturale og ikke-naturale, er forbindelser med formlen (II-A) 5 R-COOH (II-A) i ! herunder forbindelser, der kan omdannes til (II-A) under fermentering. De nævnte forbindelser omtales i det efter-10 følgende som "initieringsforbindelser". I formlen II-A er R en a-forgrenet-kæde-gruppe, hvis carbonatom knyttet til gruppen -COOH også er knyttet til i det mindste to andre atomer eller grupper forskellig fra hydrogen. Denne definition omfatter naturligvis mættede og umættede acycliske 15 og cycliske grupper, herunder sådanne, som eventuelt har et svovl- eller oxygen-heteroatom, som indgår i den cycliske kæde eller den cycliske ring.

Mere specifikt kan R, som bliver til C-25-substituenten 20 være α-forgrenet C3-C8 alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxyal-kyl eller alkylthioalkyl; Cs-C8 cycloalkylalkyl, hvori alkyl-gruppen er α-forgrenet C2-C5 alkyl; C3-C8 cycloalkyl j

eller Cs~C8 cycloalkenyl, der alle kan være substitueret J

med methylen eller en eller flere C1-C4 alkyl-grupper el- ! 25 ler halogenatomer (fluor, chlor, iod eller brom); eller en 3 til 6 leddet oxygen- eller svovl-holdig hetero- ; cyclisk ring, som kan være mættet eller fuldt eller partielt umættet, og som eventuelt kan være substitueret med en eller flere C1-C4 alkyl-grupper eller halogenatomer.

Forbindelser, som kan omdannes til TCOOH; dvs. precurso- 30

I DK 175720 B1 I

I 18 I

I rer, under fermentationsprocessen, har formlerne (II-B) I

I hvor R har den ovennævnte betydning. I

I R-(CH2)n-Z (II-B) ' I

I 5 I

I n er 0, 2, 4 eller 6; og Z er -CH2OH, -CHO, -CH2NH2, - I

I COOR4 eller -CONHR5, hvor R4 er H eller (Ci-β) alkyl; R5 er I

I hydrogen, (Ci-g) alkyl eller resten af en aminosyre, især I

I asparaginsyre, glutaminsyre og methionin, nemlig hen- I

I 10 holdsvis -CH (COOH) CH2COHH, -CH (COOH) (CH2) 2COOH og - I

I CH (COOH) (CH2)2SCH3. I

Også omfattet af opfindelsen er de isomere former af for- I

bindeiser med formlen II-A og forbindelser, som kan om- I

15 dannes dertil ved fermenteringsprocessen, og de isomere I

I avermectiner ved C-25, der resulterer fra deres anvendel- I

se i de her beskrevne processer. I

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen gennemføres ved aerob I

20 fermentering med en stamme af S. avermitilis, de savner I

forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet og I

avermectin B O-methyltransferase-aktivitet, i et vandigt I

næringsmedium omfattende en assimilerbar kilde af nitro- I

gen, carbon, uorganiske salte og en forbindelse med form- I

25 len RCOOH, eller en forbindelse, der kan omdannes til den I

nævnte forbindelse (f.eks. en precursor) under fermente- I

ringen. Syren eller forbindelsen, som kan omdannes der- I

til, sættes til fermenteringen enten under podningen el- I

I I

ler med intervaller under fermenteringen. Produktion af I

H 30 avermectin-produkterne kan styres ved udtagning af prøver I

H fra fermenteringsvæsken, extraktion af disse med et orga- I

19 DK 175720 B1 nisk opløsningsmiddel og kromatografering af opløsningen, f.eks. ved højtryksvæskekromatografi. Dyrkningen fortsættes, indtil udbyttet af produktet er maximeret, sædvanligvis i løbet af en periode på 4 til 15 dage.

5

Et foretrukkent niveau for hver tilsætning af initieringsforbindelserne (carboxylsyre eller en hertil konvertibel forbindelse) ligger mellem 0,05 og 3,0 g pr. liter. Initieringsforbindelsen kan tilsættes kontinuert, inter-10 mitterende eller i en enkel portion til fermenterings blandingen. Syren (RCOOH) tilsættes som sådan eller i form af et salt, såsom natrium, lithium eller ammoniumsaltet, eller som en forbindelse, der kan omdannes til syren som ovenfor defineret. Hvis syren er et fast stof, 15 bliver den fortrinsvis opløst i et egnet opløsningsmiddel, såsom vand eller en alkohol med 1 til 4 carbonato-mer.

De til fermenteringen anvendte medier kan, især når C-25-20 substituenten skal være isopropyl eller (S)-sek-butyl, være konventionelle medier indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og sporelementer. Når C-25-substituenten skal være en ikke-natural gruppe, dvs. når den ikke er isopropyl eller (S)-sek-butyl, er fermente- j 25 ringsmediet, hvori den valgte bestanddel mangler, eller kun indeholder minimale mængder primær forbindelse, hvor R-gruppen er isopropyl eller (S)-sek-butyl.

Efter fermentering i et tidsrum på flere dage ved en tem-30 peratur fortrinsvis i området 24 til 33 °C bliver fermenteringsvæsken centrifugeret eller filtreret, og kagen af i I DK 175720 B1

I 20 I

I mycelium extraheres med fortrinsvis acetone eller metha- I nol. Opløsningsmiddelextrakten inddampes, og det ønskede I produkt extraheres derefter i et med vand ublandbart or-

I ganisk opløsningsmiddel, såsom methylenchlorid, ethylace- I

I 5 tat, chloroform, butanol eller methyslisobutylketon. Op- løsningsmiddelextrakten inddampes, og det rå produkt ren- I ses yderligere om fornøden ved kromatografi, f.eks. under I anvendelse af præparativ omvendt fase, højtryksvæskekro- I matografi.

I 10

H

Produktet fås sædvanligvis i form af en blanding af for-

bindeiserne med formlen (I) hvor R2 er 4’-(α-L-oleandro- I

H syl)-a-L-oleandrosyloxy, R1 er OH, og dobbeltbindingen er I

fraværende, eller R1 er fraværende, og dobbeltbindingen I

15 er til stede, og hvor R3 er CH3, findes i hovedsagen ik- I

ke. Mængdeforholdene af hver forbindelse kan variere i I

H afhængighed af den bestemte mutant og initieringsforbin- I

delsen, der anvendes, og de anvendte betingelser. I

H 20 Kilden for R-gruppen, dvs. hvorvidt den kommer direkte I

H fra R-COOH, produceres af en af de ovennævnte precursorer I

eller fra en hver precursor, er uden betydning for pro- I

duktionen af avermectiner. Den kritiske forudsætning for I

H processen ifølge opfindelsen og produktionen er, at den I

25 ønskede gruppe R er tilgængelig for S. avermitilis stam- I

H men ifølge opfindelsen under fermenteringen.

H Egnede forbindelse omfatter følgende: I

30 2,3-dimethylsmørsyre I

2-methylhexansyre I

21 DK 175720 B1 2-methylpent-4-ensyre 2-cyclopropyl-propionsyre 4,4-difluorcyclohexan carboxylsyre lithium salt 4-methylencyclohexan-carboxylsyre 5 3-methylcyclohexan-carboxylsyre (cis/trans) 1-cyclopenten carboxylsyre 1- cyclohexen-carboxylsyre tetrahydropyran-4-carboxylsyre thiophen-2-carboxylsyre 10 3-furoinsyre 2- chlorthiophen-4-carboxylsyre cyclobutan-carboxylsyre cyclopentan-carboxylsyre cyclohexan-carboxylsyre 15 cycloheptan-carboxylsyre 2- methylcyclopropan-carboxylsyre 3- cyclohexen-l-carboxylsyre 2-methylthiopropionsyre 2- methyl-4-methoxysmørsyre 20 thiophen-3-carboxylsyre hydroxymethylcyclopentan 3- thiophen-carboxaldehyd 3-cyclohexylpropionsyre 3-cyclopentylpropionsyre 25 hydroxymethylcyclobutan tetrahydrothiophen-3-carboxylsyre 3-cyclopentyl-l-propanol 3-methylcyclobutan-carboxylsyre lithium-salt 3-fluorcyclobutan-carboxylsyre 30 3-methylencyclobutan-carboxylsyre lithium-salt 2-methyl-4-methylthiosmørsyre

I DK 175720 B1 I

I 22 I

I tetrahydrothiopyran-4-carboxylsyre I

I cyclobutylmethylamin I

I ethylcyclobutancarboxylat I

I 4-hydroxymethylcyclopenten I

I 5 2-(3-thiophencarbonyl)propionsyre ethylester I

I (S)-2-methylpentansyre I

I ®-2-methylpentansyre I

I Tre grupper O-methyltransferase-mutanter kan opnås ud fra I

I 10 de omhandlede forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- I

I negative-mutanter. Mutanter, hvori en mutation i den ak- I

tive forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet er I

kombineret med en eller flere af O-methyltransferase- I

mutationerne til dannelse af stammer af S. avermitilis, I

15 vil ved tilførsel af forbindelser med formlen RCOOH eller I

I forbindelser, der kan omdannes hertil under fermente- I

ringsprocessen, producerer fortrinsvis B avermectiner, I

demethyl avermectiner eller avermectiner, som slet ikke I

er methylerede. De nævnte mutanter fås ved mutagenese af I

20 de her beskrevne mutanter, der mangler forgrenet-kæde 2- I

oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet ved hjælp af ultraviolet I

lys og/eller kemiske mutagener, såsom N-methyl-N-nitro- I

sourethan, nitrosoguanidin eller andre midler af den I

ovenfor angivne art. I stedet kan forgrenet-kæde 2-oxo- I

25 syre-dehydrogenase-positive mutanter, der mangler en el- I

ler flere af O-methyltransferaserne, muteres ved behand- I

ling med UV-lys eller et mutageniseringsmiddel til dan- I

nelse af de forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase- ! I

H negative mutanter. I

I 30 I

H De ikke-naturale avermectiner, som fremstilles ved hjælp I

23 DK 175720 B1 af sådanne mutanter, er karakteriseret ved tilstedeværelse af hydroxygrupper i C-5-positionen af aglycone-delen og/eller C-3'- og/eller 3’’-positionerne af oleandrose-delene.

5

De ovenfor beskrevne mutanter identificeres ved en metode, der er beskrevet af Schulman et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). De er velegnede til samme formål og på samme måde som de kendte 10 avermectiner.

I stedet kan stigende mængder B-avermectiner, herunder sådanne, som mangler methylgrupper ved oleandrose-disaccharid-delen, produceres ved fermentering af de om-15 handlede mutanter, som mangler aktiv forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase, i nærvær af et stof, såsom sine-fungin, S-adenosylethionin eller S-adenosylhomocystein, der inhiberer O-methyltransferase-aktivitet.

20 De omhandlede forbindelser er højaktive antiparasitiske midler med særlig egnethed som anthelmintica, ectoparasi-ticider, insecticider og acarichider.

Forbindelserne er således effektive til behandling af 25 forskellige lidelser, der er forårsaget af endoparasiter, herunder især helminthiasis, som hyppigst er forårsaget af en gruppe parasitiske orme, der kaldes nematoder, og som kan give store tab af husdyr, såsom svin, får, heste, kvæg og fjerkræ. Forbindelserne er også effektive overfor 30 andre nematoder, som inficerer forskellige dyrearter, f.eks. Dirofilaria på hunde og forskellige parasiter der

I DK 175720 B1 I

I 24 I

I inficerer mennesker, herunder gastro-intestinale parasi- I

I ter, såsom Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, I

I Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, og para- I

I siter i blod eller andet væv og organer, såsom trådorme I

5 og de extra-intestinale trin af Strongyloides og Trichi- I

I nella. I

I Forbindelserne er også værdifulde til behandling af ecto- I

parasit-infektioner, såsom især arthropod-ectoparasiter I

I 10 hos dyr og fugle, såsom blodmider, mider, lus, fluer, I

I spyfluer, stikkende insekter og vandrende to-vingede lar- I

ver, som kan angribe kvæg og heste. I

Forbindelserne er også aktive som insekticider over for I

15 husdyrpest, såsom kakerlakker, tøj-møl, tæppelus og hus- I

fluer, ligesom de er egnede over for insektpesticider i I

kornlagre og landbrugsplanter, såsom edderkoppemider, I

aphider, koldorme, og over for vandrende retvingede in- I

sekter, såsom græshopper. I

I 20 I

Forbindelserne ifølge formel I benyttes i form af et præ- I

parat, som er indrettet til det specifikke anvendelses- I

formål og de husdyr, som skal behandles samt de parasiter ; I

og insekter, som er involveret. Ved anvendelse som et I

H 25 anthelmintisk middel kan forbindelserne indgives oralt i I

form af kapsler, bolus, tablet eller flydende medikament, I

H eller de kan i stedet indgives ved injektion eller som en ! I

H implantering. Sådanne præparater fremstilles hensigtsmæs- I

H sig i overensstemmelse med standardiseret veterinær prak- I

H 30 sis. kapsler, boluser eller tabletter kan således frem- I

H stilles ved blanding af den aktive bestanddel med et eg- I

25 DK 175720 B1 net fint fordelt fortyndingsmiddel eller bæremedium, som yderligere indeholder et disintegreringsmiddel og/eller en binder, såsom en stivelse, lactose, talkum eller mag-nesiumstearat. Et væskepræparat kan fremstilles ved at 5 dispergere den aktive bestanddel i en vandig opløsning sammen med dispergerings- eller fugtemidler, og injicer-bare præparater kan fremstilles i form af en steril opløsning, som kan indeholde andre stoffer, f.eks. tilstrækkeligt salt eller glycose til at gøre opløsningen 10 isotonisk i forhold til blod. Disse præparater vil variere i henseende til vægt af aktiv bestanddel i afhængighed af arten af det værtsdyr, som skal behandles, graden og arten af infektion og dyrets legemsvægt. Til oral indgift benyttes sædvanligvis doser fra 0,001 til 10 mg pr. kg 15 legemsvægt, indgivet i form af en enkel dosis eller delt op i flere doser i et tidsrum mellem 1 og 5 dage, men der kan være tilfælde, hvor højere eller lavere doser er passende og falder inden for opfindelsens rammer.

20 I stedet kan forbindelserne indgives sammen med dyrets foder, og til dette formål kan fremstilles et koncentreret fodertilsætningsmiddel eller forblanding, som derefter kan opblandes i dyrets normale foder.

25 Til anvendelse som insekticid og til behandling af landbrugs-pest påføres forbindelserne i form af spray, støv, emulsioner og lignende i overensstemmelse med normal praksis inden for landbruget.

I DK 175720 B1 I

I 26 I

I Produktion af S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) I

I i Trin 1. S. avermitilis ATCC 31272 dyrkedes på et sammen- I

I hængende New Patch Agar Medium i 12 dage ved 30 °C. Medi- '! I

I 5 et omfattede: I

I V-8 Juice* 200 ml I

I CaC03 3 g I

I agar 15 g I

I 10 H2O indtil 1000 ml I

I næringsvæske 1,0 g/1 I

H natriumacetat.3H20 1,4 g/1 I

isovaleriansyre 50 mg/1 I

I isosmørsyre 50 mg/1 I

15 methylsmørsyre 50 mg/1 I

I isoleucin 250 mg/1 I

leucin 250 mg/1 I

valin 250 mg/1 I

sporelementer i opløsning** 1 ml/1 I

I 20 I

* En blanding af vegetabilske safter (tomat, gulerod, I

bladselleri, beder, persille, salat, brøndkarse og spi- I

i nat) plus salt, ascorbinsyre og citronsyre og naturale I

aromastoffer· Kan fås fra Campbell Soup Company, Camden, I

I 25 NJ. I

**Sammensætning af sporelement-opløsning: I

27 DK 175720 B1

FeCl3.6H20 2,7 g

MnS04. H20 4,2

CuS04.5H20 0,5

CaCl2 11,0 5 H3BO3 0,62

CoCl2.6H20 0,24

ZnCl2 0,68

Na2Mo04 0,24 | 10 Opløses i 1 liter 0,1N HCL.

Sporer blev høstet fra 3 sådanne plader og suspenderet i 20 ml 0,05M tris-maleinsyre-buffer, pH 9,0.

15 Trin 2. 10 ml af spore-suspensionen blev sat til en ampul j indeholdende 10 mg N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) . Ampullen blev dyrket og rystet ved 28 °C i 60 minutter, og sporerne blev derefter vasket grundigt med 1 % NaCl-opløsning.

20

Trin 3. De vaskede sporer blev suspenderet i 1 % NaCl-opløsning og blandet med samme rumfang 80 % ethylengly-col. Denne suspension blev opretholdt ved -20 °C og anvendt som en kilde for celler, der skulle screenes for 25 mutanter. Den gav ca. 104 kolonier/ml ved spiring.

Dette stampræparat af sporer blev spredt på YPD-plader til opnåelse af ca. 100 kolonier pr. plade (YPD-medium omfatter 10 g/1 af hver af stofferne gærekstrakt, Bacto 30 peptone* og dextrose; og 15 g/1 Bacto agar*, indstillet på pH = 6,9 før autoklavering). Ingredienserne mærket med 1

I DK 175720 B1 I

I 28 I

* kan købes hos Difco Laboratories, Detroit, Michigan I

I 48238. I

I Trin 4. Enkelte kolonier blev opsamlet fra pladerne efter I

I 5 vækst i 2-3 uger ved 28 °C og anbragt i individuelle I

brønde i en standard mikrotiterplade med 96 brønde. End- I

I videre blev en lille mængde af kolonien penslet på et I

I friskt agarmedium for at tjene som kilde for levedygtige I

H celler, når mutanterne identificeres. I

I 10 I

Trin 5. Til hver brønd sattes ca. 75 mikroliter af en væ- I

I ske M9 saltholdigt medium indeholdende 1 % glycose, 0,1 % I

I casaminosyre og 0,01 % af hver af stofferne isovalerian- I

syre, isosmørsyre og 2-rnethylsmørsyre. Efter flere dages I

I 15 dyrkning ved 28 °C blev cellerne prøvet for nærværelse af I

I forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase. (Hver liter af I

saltholdigt medium omfatter 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g I

NaCl og 1 g NH4C1. Mediet blev autoklaveret, og derefter I

blev 1 ml af hver steriliseret 1M MgS04og 0,1. M CaCl2 I

20 tilsat aseptisk). I

Trin 6. En mikrosuspension af 5 % toluen i M9 saltholdig I

medium blev fremstillet ved en kort ultralydbehandling af I

tofaseblandingen. Til 25 ml af denne suspension blev sat I

25 1,2 ml af en opløsning indeholdende [14C-1]-2-oxo-iso- I

capronsyre, 2,5 mikrocurie/ml og 10,0 mikro-curie/mikro- I

mol. 50 mikroliter af den totale blanding blev sat til I

hver af brøndene af mikrotiterpladerne indeholdende de I

H kolonier, som skulle prøves. I

I 30 I

29 DK 175720 B1

Trin 7. Isotopen 14CC>2, som blev produceret fra hver brønd, blev indfanget og visualiseret ved en procedure, som er beskrevet af Tabor et al., J. Bacteriol. 128, 485-486 (1976) "Convenient Method for Detecting 14CC>2 in Mul-5 tipie Samples: Application to Rapid Screening for Mu tants" Mutanter uden aktiv forgrenet-kæde 2-oxo-syre-dehydrogenase producerer ikke noget Ba14C03 ud over det i kontrolprøverne iagttagne.

10 En mere raffineret metode, som giver en forbedret kon- I

trast mellem et positivt assay for 14C02, angivet ved en mørk plet på autoradiogrammet som et resultat af Ba14CC>3-dannelse, og et negativt assay, som viser sig uden plet eller med en meget svag plet, omfatter følgende modifice-15 rede screen.

Enkelte kolonier (se ovennævnte trin 4) blev opsamlet fra agarmediet efter 7-14 dage af dyrkning (i stedet for 2-3 uger, og prøvet direkte ved ovennævnte trin 6 og 7). Trin 20 5 af den ovennævnte procedure blev udeladt.

En endnu mere raffineret assay-metode er kvantitativ i natur i henseende til 14CC>2-frigivelse, omfatter dyrkning af mutanterne, som er detekteret ved ovennævnte screening 25 på et egnet medium omfattende M9 saltholdigt medium med glucose, 1 % og "Syncasa-bcca", 0,1 % (en syntetisk blanding af L-amino-syrer med den tilnærmelsesvise sammensætning af kommercielle casaminosyrer, men uden L-valin, L-isoleucin og L-leucin, se nedenfor).

30

Efter dyrkning til en høj celledensitet blev cellerne va-

I DK 175720 B1 I

I 30 I

I sket i M9 saltholdigt medium og gensuspenderet i et koldt I

I M9 saltholdigt medium indeholdende 1 % toluen, som var I

I ultralydbehandlet til dannelse af en mælkeagtig hvid dis- I

persion af toluen. Celle/puffer/toluen-suspensionen blev I

I 5 dyrket i 40 min. ved 30 °C for at permeabilisere celler- I

I ne. De permeabiliserede celler blev derefter vasket M9 I

I medium-salte og til slut resuspenderet i en femtedel af I

det oprindelige rumfang M9 medium puffer. 180 mi kroliter I

af denne suspension blev anvendt pr. assay. I

I 10 I

I Et reaktionsvolumen på 300 mikroliter indeholdende de to- I

I lueniserede celler, thiamin-pyrophosphat (TPP), 0,4 mM; I

I koenzym A (CoA), 0,11 mM; nicotinamid-adenin-dinucleotid I

I f(NAD) , 0,68 mM, dithiothreitol (DTT), 2,6 mM; MgCl2, 4,1 I

I 15 mM; Tris-HCl, 60 mM; Tris-HCl, 60 mM, pH = 7,5; og [14C- I

1]-2-oxoisocaproat, 6,000 cpm, mikrocurie pr. mikromol. I

Effektiviteten af tællingen var 73 %. Reaktionen blev ud- I

ført i 15 ml scintillationsampuller indeholdende 2 x 2 cm I

Whatman nr. 4 papir, kvadratisk presset ind i ampullens I

20 skruelåg. Papiret indeholdende 30 mikroliter 1M hyamin- I

hydroxid (1M opløsning af methylbenzethonimhydroxid i I

H methanol, leveret af Sigma Chemical Co., St. Louis, MO I

H 63178), som indfanger ^COa, der udvikles ved reaktionen. I

Efter inkubering i 2 timer blev papiret neddykket i 10 ml I

H 25 Backman Aquasol II (Universal LSC (liquid scintillation I

H counter), som fås- fra New England Nuclear Research Pro- I

duets, Boston, MA 02118), og radioaktiviteten blev målt i I

en væskescintillationstæller efter indstilling af lige- I

H vægt i dette opløsningsmiddel i 4 timer eller mere. En I

H 30 blindkontrol for reaktion (dvs. ingen celler) giver 50- I

300 cpm. I

31 DK 175720 B1

Mutanten 1-3 og andre lignende gav tællinger, som var mindre end eller lig med blindprøven, medens udgangsstammen gav tællinger flere gange højere end blindkontrolvær-5 dien.

Sammensætning af "Syncasa - bccaa", 100 gange koncentrat gram/liter 10 L-alanin 3 L-arginin 4 L-asparaginsyre 6 L-cystin 1 15 L-glutaminsyre 20 glycin 1 L-histidin 2 L-lysin 7 L-methionin 3 20 L-phenylalanin 6 L-prolin 10 L-serin 6 L-threonin 4 L-tyrosin 4 25 L-tryptophan 1

Blandingen indstilles til en pH-værdi på 7 og steriliseres ved filtrering. Et rumfangkoncentrat tilsættes til 99 rumfang medium til at opnå standardkoncentrationer.

30

Produktion af dobbeltblokerende mutanter af S. avermiti-

I DK 175720 B1 I

I 32 I

I lis 7881 (ATCC 53692) manglende forgrenet-kæde 2-oxo- I

syre-dehydrogenase og avermectin B O-methyltransferase I

I 5 Trin 1. S. avermitilis ATCC 53567 dyrkedes i et sammen- I

I hængende New Patch Agar medium i 12 dage ved 30 °C. I

Sporer blev høstet fra 3 sådanne plader og suspenderet i I

I 20 ml af en 0,05M tris-maleinsyrepuffer, pH = 9,0. I

I 10 I

I Trin 2. 10 ml af sporesuspensionen blev sat til et præpa- I

ratglas indeholdende 10 mg N-methyl-N'-nitro-N- I

nitrosoguanidin (NTG). Præparatglasset blev dyrket og ry- I

stet ved 28 °C i 60 min, og sporerne blev derefter vasket I

15 grundigt med 1 % NaCl-opløsning. I

Trin 3. De vaskede sporer blev suspenderet i 1 % NaCl- I

opløsning og blandet med samme rumfang 80 % ethylengly- I

col. Denne suspension blev opretholdt ved - 20 °C og an- I

20 vendt som kilde for celler, som skulle screenes for mu- I

tanter. I

Denne sporeportion blev spredt på YPD-plader til opnåelse I

af ca. 100 kolonier pr. plade. Kolonier af den mutageni- I

25 serede population (nitrosoguanidin-behandlet) Streptomy- I

H ces avermitilis stamme 1-3 (ATCC· 53567) opsamles og spre- I

H des som pletter på et agar-medium, fremstillet påfølgende I

H måde (g pr. liter) : fortyndes stivelse, 80; K2HP04, 1; I

MgS04.7H20, 1; ardamin pH = 5; CaCC>3, 5; P-2000, 1 ml; Fe- I

H 30 S04.7H20, 0,01; MnCl2.4H20, 0,001; ZnS04.7H20, 0,001; Bac- I

to-agar, 17; destilleret H20 indtil 980 ml. pH-værdien I

I DK 175720 B1 = indstilles på 7,0 med NaOH forud for autoklavering ved 121 °C i 20 minutter. Efter autoklavering tilsattes 20 mi af en steril 5 % stamopløsning af (±)-2-methylsmørsyre, pH = 7,0.

Agar-kulturen dyrkes 8 til 12 dage ved 28 °C. Celler (mycelium) fjernes fra agaroverfladen og indføres i 260 mi-kroliter acetone. Femogtyve (25) mikroliter af acetone-extrakten blev derefter penslet på Analtech silica-gel 10 GF, forbehandlet ved tyndtlagskromatografi. Kromatogram-met køres i 30 til 40 min. med ethylacetat som opløsningsmiddel, tørres derefter og sprayes med 3 % vanilin i ' ethanol. Pladerne anbringes i en 100 °C ovn i 1-3 min., sprayes derefter med 3 % svovlsyre i ethanol og placeres 15 igen i en 100 °C ovn i 10 til 15 min. Mutanter uden aver-mectin B O-methyltransferase identificeres ved en ændring af det kromatografiske mønster, dvs. pletterne svarende til avermectin B komponenter (Rf ca. 0,54, 0,42 for Bl og B2, respektivt) er stadig til stede, men pletterne sva-20 rende til avermectin A komponenter (Rf ca. 0,69, 0,58 for Al og A2, respektivt) mangler.

Generel high performance liquid chromatography (HPLC) procedurer 25

Mobilfase: 150 ml vand 70 ml acetonitril bringes til 1 liter med methanol 30

I DK 175720 B1 I

I 34 I

Kolonne: I

I Ultrasphere ODS 25 cm (Becmkan Instruments, Fullerton, CA I

I 92634-3100) ' I

I 5 I

I Strømningshastighed: 0,75 ml/minut I

I detektion: UV 240 nm I

I attenuation: næsten 6 I

I 10 Prøve fortyndet (D) : I

I 35 ml acetonitril plus 390 ml methanol I

standard: I

15 1. Afvej 0,5 mg avermectin A2A i 10 ml kolbe og indstil I

H volum med methanol. I

2. Afvej 0,5 mg test-produkt i 10 ml kolbe og indstil vo- I

20 lum med methanol. I

1 og 2 er standard stam-opløsninger; for standard til I

analyse: I

25 tag 100 μΐ (1) og 100 μΐ (2) i et præparatglas og tilsæt I

800 μΐ mobil fase I

H Prøver: I

H 30 1. Tag 1 ml grundigt rystet væske; hensættes. I

35 DK 175720 B1 2. Fjern mest muligt supernatant uden at påvirke pillerne.

3. Tilsæt 100 μΐ HPLC vand til pillerne og bland ved 5 hvirvling til dispergering.

4. Tilsæt 2 ml diluent (D) og bland grundigt.

5. Filtrer samme og kør på HPLC.

10

De her beskrevne naturale og ikke-naturale avermectiner blev underkastet den nævnte HPLC kromatografiske procedure, som retentionstiden for toppen af de enkelte avermectiner blev divideret med retentionstiden iagttaget for 15 tilstedeværende oligomycin A, der tjener som international standard for en given HPLC-bestemmelse. Oligomycin A bliver næsten altid observeret ved HPLC som biprodukt for S. avermitilis fermentationer og er det eneste produkt, der ses ved HPLC, produceret af de beskrevne mutanter, j

20 når de dyrkes i et medium fri for syrerne RCOOH, hvor R I

er defineret som anført, eller i et medium fri for forbindelser, der kan omdannes til syrerne med formlen RCOOH, hvor R har den definerede betydning. Typisk vil oligomycin A have en retentionstid på 12,5-14 min. For-25 holdet mellem retentionstiderne (RT) giver en mere tyde- i lig basis for sammenligning af identiteten og udbytterne j af avermectin-produkter. Den generelle orden for udseen- j det af avermectin-produkterne på HPLC er B2, A2, Bl og Al.

30 i ! ! i j

DK 175720 B1 I

36 I

Natural avermectin RT/RT (oligomycin A) I

B2b 0,70 I

B2a 0,84 ' I

5 A2b 0,90 I

A2a 1,09 I

Blb 1,40 I

Bla 1,83 I

Alb 1,83 I

10 Ala 2,42 I

Bemærk at Bla og Alb ikke er adskilt. I

Ikke-natural avermectin RT/RT (oligomycin A) I

15 I

I cyclopentyl B2 0,94 I

I cyclopentyl A2 1,23 I

I 20 cyclopentyl Bl 1,99 I

cyclopentyl Al 2,62 I

Retentionstiden varierer 1-2 minutter på forskellige da- I

25 ge, idet oligomycin A generelt fremkommer efter 12,5-14 I

minutter. I

Η I efterfølgende eksempler blev avermectinerne bestemt ved I

H den ovenfor beskrevne HPLC-procedure, med mindre andet er I

H 30 opgivet. I

37 DK 175720 B1

Sammensætningen af medier, der anvendes i de efterfølgende eksempler, er følgende: AS-7 medium 5 fortyndet stivelse3 20 10 ardamin pH b 5 pharmamedia c 15

CaC03 2 15 aFremstillet ved hydrolyse af stivelse ved a-amylase fra Bacillus licheniformis (forhandles af Novo Enzymes, Wilton, CT under varemærket "Termamyl") til en dextrose-ækvivalent på 40 % ± 5 %.

20 b Fra Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012 c Fra Traders Protein., Memphis, TN 38108 25 Indstil pH til 7,2 med NaOH.

I DK 175720 B1 I

I 38 I

I AP-5 medium I

I 5 Fortyndet stivelse 80 I

I ardamin pH 5 I

I k2hpo4 1 I

MgS04.7H20 1 I

NaCl 1 I

10 CaC03 7 I

FeS04.7H20 0,01 I

I MnCl2.7H20 0,001 I

I ZnS04.7H20 0,001 I

I P-2000 (antifoam)3 I

I 15

a Fra The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640. I

I Indstil pH til 6,9 med 25 % NaOH.

H Eksempel 1-4 I

I 20

Avermectiner fra Streptomyces avermitilis 1-3 (ATCC I

I 53567) S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) fra en sporuleret V-8 25 plade podes i 80 ml AS-7 medium i en 500 ml tredobbelt luftet kolbe. Kolben blev dyrket i et roterende rysteap- parat med en hastighed på 200 omdrejninger pr. minut ed 28-30 °C. Efter 24 timers dyrkning blev 1 ml af den tota- le væske podet i 300 ml kolber indeholdende 4 0 ml AP-5 30 medium. Dobbeltfermentationer blev udført ved 28-30 °C i nærvær af 400 ppm af hver af de i det efterfølgende nævn- I DK 175720 B1 39 te initieringsforbindelser, tilsat efter 24 timers forløb,

Efter 312 timer blev 2 ml prøver af den totale væske 5 blandet med 8 ml methanol:acetonitril (390:35). Efter filtrering blev 50 μΐ injiceret i Beckman Ultrasphere ODS kolonne (3,9 x 250 mm). Kolonnen blev elueret med methanol : acetonitril : vand (89:14:7) ved 0,8 ml/min, og eluatet I

blev styret ved uv-detektion ved 240 nm. Retentionstiden I

10 af de hidtil ukendte avermectiner er vist i det efterføl- I

gende. I

Avermectin rentionstid (min) I

15 Initieringsforbindelse B2 A2 Bl_ Al I

1) ± 2-methylsmørsyre 111,60 114,75 23,1 29,82 I

12,40 16,10 I

20 2) cyclopentancarboxyl- I

syre 12,32 15,86 25,28 32,96 I

3) cyclohexancarboxyl- I

syre 14,84 19,26 31,46 41,14 I

25 ! I

4) +2 methylsmørsyre 11,60 14,75 23,1 29,82 1 I

Både +methylsmørsyre og -methylsmørsyre inkorporeres i I

avermectiner. Under de anvendte kromatografiske betingel- I

30 ser opnås spaltning af + og - avermectiner alene for B2 I

og A2. I

SDK 175720 B1 I

Streptomyces avermitilis 7881 I

vermilitis 7881 {ATCC 53692) I

Lium i en 500 ml luftet kolbe. I

irende rysteapparat med et om- I

d 28-30 °C. Efter 28 timers I

»tale væske podet i 100 ml AS- I

ftet kolbe. Kolben blev atter I

arat med et omdrejningstal på I

24 timers dyrkning blev 1 ml I

en 300 ml kolbe indeholdende I

:rne blev dyrket ved 28-30 °C I

tilsattes 400 ppm cyclohexan-,er blev udtaget 2 ml prøver, >m beskrevet i eksempel 1. Un-den eneste detekterede aver-ringsvæsken elueret ved 14,84 mg/1) minutter svarende til [ Bl.

Streptomyces avermitilis 7881 »lev gentaget med 400 ppm ±2-cyclohexancarboxylsyre, idet 41 DK 175720 B1 alle andre betingelser var de samme som i eksempel 2. Kun sek-butyl-avermectin B2 (11,60, 12,40 minutter, 63,5, ; 42,4 mg/1) og sek-butyl-avermectin, Bl (23,1 minutter, 105,5 mg/1) blev påvist i fermenteringsvæsken.

Claims (15)

1. Stamme af Streptomyces avermitilis, I I kendetegnet ved, at den mangler forgrenet-kæde I 5 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet og avermectin-B O- I I methyltransferase-aktivitet. I

2. Stamme af Streptomyces avermitilis, ifølge krav 1 I H ke.ndetegnet ved de permeabiliserede celler I 10 mangler evnen til at producere 14C02 fra tilsat [ 14C—1 ]-2- I I oxoisocapronsyre. I I I

3. Stamme af Streptomyces avermitilis I kendetegnet ved, at den er deponeret under num- I I 15 meret ATCC 53692. I

4. Fremgangsmåde til fremstilling af B avermectiner, I kendetegnet ved, at man underkaster en stamme I af Streptomyces avermitilis, der mangler forgrenet-kæde I 20 2-oxo-syre-dehydrogenase-aktivitet og avermectin 5-0- I methyltransferase-aktivitet, en aerob fermentering, i et I vandigt næringsmedium omfattende en assimilerbar kilde I for nitrogen, carbon og uorganiske salte samt en forbin- I delse, der kan udnyttes i biosyntesen af en avermectin. I I 25 I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, I kendetegnet ved, at der benyttes en stamme af I S. avermitilis, der er deponeret under nummeret ATCC I I 53692. I I 30 I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, I I DK 175720 B1 kendetegnet ved, at den tilsatte forbindelse har den almene formel: R-COOH (II-A) hvor R er en or-forgrenet-kæde, idet det carbonatom, som er knyttet til -C00H gruppen, også er knyttet til i det mindste to andre atomer eller grupper forskellig fra hydrogen; eller en forbindelse, der kan omdannes til den 10 nævnte forbindelse under fermenteringsprocessen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at R er α-forgrenet C3-C8 alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxyalkyl eller alkylthioalkyl;

15 C5-C8 cycloalkylalkyl, hvori alkylgruppen er a-forgrenet C2-C5 alkyl; C3-C8 cycloalkyl eller C5-C8 cycloalkenyl, idet hver af disse eventuelt kan være substitueret med methylen eller en eller flere alkylgrupper med 1 til 4 carbonatomer eller halogenatomer, eller en 3 til 6 leddet 20 oxygen- eller svovl-holdig heterocyclisk ring, som kan være mættet eller er fuldt eller delvis umættet, og som eventuelt kan være substitueret med en eller flere al-kylgrupper med 1 til 6 carbonatomer eller halogenatomer, eller en forbindelse, der kan omdannes til den nævnte 25 forbindelse under fermenteringsprocessen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at forbindelsen, der kan omdannes til substratet RCOOH, har formlen 30 R- (CH2)n-Z ____ I DK 175720 B1 I I hvor R har den ovenfor definerede betydning; n er 0, 2, 4 I I eller 6; og Z er -CH2OH, -CHO, -COOR4, =CH2NH2 eller - I I CONHR5, hvor R* er H eller (Ci-g) alkyl; R5 er hydrogen, I I 5 (C1-4) alkyl, -CH (COOH) CH2COOH, -CH (COOH) (CH2) 2COOH eller - I I CH(COOH) (CH2)2SCH3. I

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, I I kendetegnet ved, at R er I H cyclobutyl I I cyclopentyl I cyclohexyl I H cycloheptyl I 15 2-methylcyclopropyl I 3-cyclohexenyl I 1-cyclopentenyl I 1-cyclohexenyl I 3-methylcyclohexyl (cis/trans) I H 20 4-methylencyclohexyl I 3-methylcyclobutyl I 3-methylencyclobutyl I 3-cyclopentenyl I 1-cyclopropylethyl I 4,4-difluorcyclohexyl I H isopropyl I sek-butyl I 2-pentyl I H 30 2,3-dimethylpropyl I 2-hexyl I DK 175720 B1 2-pent-4-enyl 2- methylthioethyl S-2-pentyl i R-2-pentyl 5 2-thienyl 3- thienyl 4- tetrahydropyranyl 3- furyl 2-chlorthienyl 10 3-tetrahydrothienyl 4- methylthio-2-butyl 4-tetrahydrothiopyranyl 4-methoxy-2-butyl eller 4-methylthio-2-butyl. 15

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at R er afledt af en carboxyl- i syre med formlen

20 R-COOH, hvori R har den ovenfor definerede betydning.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, 25 kendetegnet ved, at R er cyclopentyl, cyclohe-xyl eller thienyl.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at R er afledt af en forbin-30 delse, som kan omdannes til R-COOH under fermentering, hvilken forbindelse har formlen: I DK 175720 B1 I I 46 I I R-(CH2)n-Z I I hvor R har den ovenfor definerede betydning; n er 0, 2, 4 I I 5 eller 6; Z er -CH2OH, -CHO, -COOR\ -CH2NH2 eller -CONHR5, I I hvor R4 er (Ci_6) alkyl; R5 er hydrogen, (Ci_4) alkyl, - I I CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)2COOH eller - I I CH(COOH) (CH2)2SCH3. I I 10 13. Fremgangsmåde ifølge krav 7, I I kendetegnet ved, at R er en α-forgrenet al- I I kylgruppe med 3-8 carbonatomer, bortset fra isopropyl el- I I ler (S)-sek-butyl. I I 15 14. Fremgangsmåde ifølge krav 7, I I kendetegnet ved, at den anvendte mikroorganisme I er S. avermitilis med deponeringsnummeret ATCC 53692. I

15. Stamme af Streptomyces avermitilis ifølge krav 1, I I 20 kendetegnet ved, at den producerer i det væ- I sentlige ingen C-076 avermectiner ved fermentering i van- I digt næringsmedium, der omfatter en assimilerbar kilde I for carbon, nitrogen og uorganiske salte under aerobe be- I I tingelser, hvilket medium er i det væsentlige fri for no- I 25 gen syre med formlen: I I R'-COOH, I eller en hertil med S. avermitilis konvertibel forbindel- I 30 se, hvor R' er isopropyl eller (S)-sek-butyl, men som I alene er i stand til at producere væsentlige mængder af B I I DK 175720 B1 avermectiner ved dyrkning i det nævnte medium, når dette indeholder en syre med formlen R'COOH eller en hertil konvertibel forbindelse under omsætning med S. avermiti-lis, hvor R' er isopropyl eller (S)-sek-butyl, hvorved i 5 den nævnte stamme fås ved mutering af Streptomyces aver-mitilis ATCC 53567.