PL156764B1 - Sposób wytwarzania awermektyny PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania awermektyny, znamienny tym, ze szczep Streptomyces avermitilis nie wykazujacy aktywnosci dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgalezio- nym lancuchu i/lub aktywnosci transaminazy amino- kwasów o rozgalezionym lancuchu poddaje sie fermenta- cji z napowietrzaniem w wodnej, odzywczej pozywce zawierajacej przyswajalne zródlo azotu, wegla i soli nie- organicznych oraz zwiazku nadajacego sie do wykorzy- stania w biosyntezie awermektyny o wzorze R-COOH lub zwiazku ulegajacego przeksztalceniu w zwiazek o wzorze R-COOH majacego wzór R-(CH 2)n -Z, w których to wzorach R oznacza lancuchowa grupe a -rozgaleziona, której atom wegla polaczony z grupa -COOH lub z grupa o wzorze -(CH 2)-n-Z jest równiez przylaczony do co naj- mniej dwóch innych atomów lub grup innych niz atomy wodoru, n jest 0,2, 4 lub 6, a Z oznacza grupe -CH 2OH, -CHO, -CH 2NH 2 lub grupe o wzorze -COOR5 lub o wzorze -CONHR6, w których to wzorach odpowiednio R5 oznacza atom wodoru lub grupe (C 1-C 6) alkilowa a R6 oznacza atom wodoru, grupe (C 1-C 4) alkilowa lub grupe -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)2COOH lub -CH(COOH) (CH2) 2SCH3. Wzór 1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania awermektyny polegający na zastosowaniu szczepów Streptomyces avermitilis nie wykazujących aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu do wytwarzania naturalnych i nienaturalnych awermektyn.

W opisach patentowych St. Zjedn. Am. nr nr 4 310 519 i 4429042 przedstawiono awermektyny, kompleks spokrewnionych czynników o silnym działaniu przeciwpasożytniczym, oraz sposób ich wytwarzania na drodze fermentacji z napowietrzaniem szczepów Streptomyces avermitilis, takich mianowicie jak S. avermitilis ATCC nr nr 31 267, 31 271 i 31 272. Dwa ostatnie szczepy są

156 764 3 odpowiednio postacią zamrożoną w fiolce oraz zliofilizowaną w probówce hodowli otrzymanej drogą naświetlania promieniami nadfioletowymi szczepu S. avermitilis ATCC 31267.

W Europejskim opisie patentowym nr 214731, opublikowanym 18 marca 1987, stanowiącym odpowiednik zgłoszenia patentowego St. Zjedn. Am. nr 886 867, zgłoszonego 16 lipca 1986, przedstawiono szereg związków (określanych tu jako nienaturalne awermektyny), spokrewnionych z naturalnymi czyli znanymi awermektynami, ale zawierających nowy podstawnik w pozycji 25, oraz sposób ich wytwarzania drogą fermentacji produkującego awermektynę drobnoustroju w obecności różnych wyspecyfikowanych kwasów karboksylowych lub ich pochodnych albo prekursorów. Drobnoustrojami S. avermitilis stosowanymi do wytwarzania wspomnianych nowych, podstawionych przy atomie węgla wpozycji 25, awermektyn są S. avermitilis ATCC 31267,31271, 31272 i NCIB 12121. Ten ostatni drobnoustrój, opisany w Europejskim opisie patentowym nr 214 731, wywodzi się S. avermitilis ATCC 31271. Wytwarza on z wyższą wydajnością nowe, podstawione w pozycji 25 awermektyny podczas hodowli w określonej w połowie pożywce. Każdy ze szczepów ATCC 31267, 31271, 31272 i NCIB 12121 może poza nowymi, podstawionymi w pozycji 25, pochodnymi wytwarzać również różne ilości znanych czyli naturalnych awermektyn, w których podstawnikiem przy atomie węgla w pozycji 25 jest grupa izopropylowa lub (S)-II-rz. butylowa (1-metylopropylowa).

Szkielet węglowy awermektyn (opisany wzorem 1) pochodzi z octanów i propionianów a podstawnik C-25 w naturalnych awermektynach z L-izoleucyny (R = /S/-II-rz.-butyl) lub Lwaliny (R = izopropyl), [Fisher i Mrozik, „Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984), rozdział 14]·

Jako „znane lub „naturalne awermektyny określa się awermektyny, wytwarzane przez S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 i ATCC 31272, w których podstawnik przy C-25 jest grupą izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową (1-metylopropylową). Awermektyny, w których podstawnik przy C-25 jest inny niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa. są określane w opisie jako „nowe lub „nienaturalne awermektyny.

Szczepy S. avermitilis cytowane we wspomnianych wyżej opisach patentowych St. Zj. Am. wytwarzają klasę substancji o nazwie rodzajowej C-076. Klasa ta składa się z ośmiu różnych, ale blisko spokrewnionych związków określanych jako C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Bib, B2a i B2b. Serie „a odnoszą się do naturalnych awermektyn, w których w pozycji 25 znajduje się grupa (S)-II-rz.-butylowa zaś serie „b“ do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji 25 jest grupa izoporpylowa. Litery „A i „B“ odnoszą się odpowiednio do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji 5 jest grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Liczba „ 1 “ odnosi się do awermektyn, w których obecne jest podwójne wiązanie w pozycji 22-23 zaś liczba „2“ do awermektyn, zawierających atom wodoru w pozycji 22 i grupę hydroksylową w pozycji 23.

W niniejszym opisie nie są stosowane powyższe identyfikatory dla określenia podstawników w pozycji 25 nienaturalnych awermektyn. Identyfikatory Al, A2, BI i B2 zostały utrzymane do nienaturalnych awermektyn o cechach strukturalnych odpowiadających opisanym powyżej naturalnym awermektynom.

Wytwarzanie mutantów nie wykazujących aktywności dehydrogenazy σ-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu zostało opisane dla Bacillus subtilis przez Willecke'go i Pardee w J. Biol. Chem., 246, 5264-5272 (1971) oraz dla Pseudomonas putida przez Martina i wsp. w J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), natomiast nigdzie dla Streptomyces.

S. avermitilis Agly-1, mutant który produkuje praktycznie tylko aglikony awermektyny Ala i A2a został opisany przez Schulmana i wsp. w J. Antibiot., 38 (11), 1494-1498 (1985). Opisana jest także fermentacja S. avermitilis Agly-1 w obecności sinefunginy, która wywołuje zwiększenie wytwarzania komponentów aglikonu awermektyny B. Podobnie S. avermitilis 08, wysokowydajny szczep produkujący awermektyny, podczas fermentacji w obecności sinefunginy jako inhibitora transferaz 0-metylowych, wytwarza awermektyny nie zawierające grup 0-metylowych w aglikonie w pozycji 5 oraz w reszcie dwucukru oleandrozy.

W opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 378 353 opisano związki spokrewnione z C-076 oraz ich wytwarzanie na drodze hodowania szczepu MA-5218, mutanta szczepu S. avermitilis ATCC 31272, otrzymanego drogą naświetlania promieniowaniem nadfioletowym i zidentyfikowanego jako ATCC 31780. Wytwarzane przez tego mutanta związki spokrewnione z C-076 nie zawierają

156 764 pierścienia furanowego. Ponadto, w niektórych z opisywanych związków jedna lub obie reszty cukru oleandrozy są oderwane, a w innych grupa w pozycji 5 jest utleniona do grupy keto.

Trzy klasy mutantów O-metylotransferazowych S. avermitilis wytwarzających awermektyny nie zawierające grup O-metylowych zostały opisane przez Ruby'ego i wsp. w materiałach z „6th International Symposium on the Bilogy of Actinomycctes, Debrecen, Węgry, 26-30 sierpień 1985, oraz przez Schulmana i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 744-747 (1987). Pierwsza klasa wytwarza przede wszystkim awermektyny B ze względu na brak zdolności metylowania grupy hydroksylowej w pozycji 5 makrocyklicznego laktonu. Druga klasa wytwarza 3'-0,3bis-demetyloawermektyny (awermektyny nie zawierające grup O-metylowych w pozycji 3 obu reszt monocukrowych), określane jako demetyloawermektyny. Trzecia klasa nie jest zdolna do metylo- ’ wania w żadnej pozycji.

Schulman i wsp. opisali w Fed. Proc. 44, 931 (1985) sposób zwiększania wytwarzania awermektyn B drogą fermentacji S. avermitilis w obecności substancji takich jak sinefungina, Sadenozyloetionina i S-adenozylohomocysteina, które hamują metylowanie grupy hydroksylowej w pozycji C-5 reszty aglikonu przez O-metylotransferazę awermektyny B. Mutanty Streptomyces avermitilis nie wykazuje aktywności O-metylotransferazy i wytwarzające zwiększone ilości komponentów awermektyny B zostały także opisane przez Schulmana i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986).

Drogą mutagenezy S. avermitilis wytwarzane są mutanty wykazujące brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu lub aktywności transaminazy aminokwasów w rozgałęzionym łańcuchu. W wyniku mutagenezy tak otrzymanych, pojedynczo blokowanych mutantów otrzymuje się mutanty, które wykazują brak zarówno aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu jak i aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Mutanty nie wykazują już zdolności do wytwarzania znaczących ilości naturalnych awermektyn przy nieobecności dodanego związku o wzorze RCOOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową, lub związku ulegającego przekształceniu w RCOOH podczas procesu fermentacji. Zaskakująco i nieoczekiwanie stwierdzono jednak, że mutanty wytwarzają awermektyny, naturalne i nienaturalne, gdy fermentację prowadzi się w obecności dodanego związku o wzorze R-COOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.butylową albo inną grupę ujawnioną w tym opisie, albo w obecności prekursora związku o wzorze RCOOH. Jeszcze bardziej zaskakujący jest fakt, że opisywane tutaj mutanty nie wykazujące tylko aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, które są niezdolne do rozkładnia L-izoleucyny lub L-waliny, są zdolne do przyswajania wielu różnych związków w szlak biosyntetyczny awermektyny i wytwarzania nienaturalnych awermektyn wolnych od naturalnych awermektyn.

Co najmniej tak samo zaskakująca jest obserwacja, że opisane tutaj mutanty nie wykazujące aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, które są niezdolne do rozkładania L-izoleucyny, L-leucyny lub L-waliny i wymagają tych trzech aminokwasów dla wzrostu, są także zdolne do przyswajania innych związków i wytwarzania nienaturalnych awermektyn wolnych od naturalnych awermektyn.

Naturalne awermektyny, jak uprzednio wspomniano, są wytwarzane w postaci kompleksowej mieszaniny ośmiu różnych, ale blisko spokrewnionych związków (wzór 1, R = izopropyl, i (S)-IIrz.-butyl). Chociaż zostały one wyodrębnione w praktycznie czystej postaci (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 4429042), to stosowana metoda jest w najlepszym przypadku pracochłonna. W procesie wytwarzania nienaturalnych awermektyn według sposobu przedstawionego w Europejskim opisie patentowym nr 214731 można również otrzymywać niektóre z naturalnych awermektyn w różnych ilościach, ze względu na obecność dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i aminokwasów L-waliny i L-izoleucyny w komórkach S. avermitilis stosowanego w tym procesie.

Pożądane jest więc uzyskanie możliwości wyboru wytwarzania albo naturalnych awermektyn a tym samym minimalizacja ilości i kompleksowości produktów, i w ten sposób poprawa czystości wybranej awermektyny oraz uproszczenia procesu rozdzielania.

Szczepy S. avermitilis nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu lub aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu otrzymywane są drogą mutacji wytwarzających awermektynę szczepów S. avermitilis, zwłaszcza S. avermi156 764 tilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 lub NCIB 12121. Dalsza mutacja jednego z powyższych zablokowanych mutantów daje szczepy nie wykazujące obu aktywności. Mutanty nie są zdolne do syntezy naturalnych awermektyn z wyjątkiem przypadku, gdy doda się kwas tłuszczowy lub jego prekursor, zawierający grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową, do pożywki, w której mutanty są fermentowane. Są one zdolne do wytwarzania naturalnych i nienaturalnych awermektyn podczas fermentacji z zapowietrzaniem w środowisku wodnym, w pożywce zawierającej odpowiedni kwas primerowy lub związek ulegający przekształcaniu w ten kwas podczas fermentacji.

Mutanty charakteryzujące się brakiem aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu są izolowane ze zmutowanych kolonii na podstawie oznaczeń ^ł4CO2. W oznaczeniu brak wydzielania ¹⁴CO2 przez kolonię z substratu, takiego jak kwas (¹⁴C-l)-2-ketoizokapronowy, kwas (¹4C-l)-2-keto-3-metylomasłowy lub (¹4C-l)-2-ketowalerianowy, wskazuje na brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Mutanty charakteryzujące się brakiem aktywności transaminazy aminokwasów izoluje się ze zmutowanych kolonii na podstawie braku zdolności do wzrostu na podłożu nie zawierającym L-izoleucyny, L-leucyny i L-waliny. W praktyce, pojedyncze kolonie rosnące na pożywce glukozowo-agarowej M9 zawierającej sole i wszystkie indywidualne aminokwasy wchodzące w skład preparatu „casamino acid“, przenosi się na podobne podłoże, które jednak nie zawiera L-izoleucyny, L-leucyny i L-waliny. Powyższe mutanty, które wykazują tylko brak aktywności transferazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu są zdolne do wykorzystywania 2-ketokwasów jako prekursorów w procesie wytwarzania awermektyn.

Jest zaskakujące i niespodziewane, że powyższe mutanty nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach utrzymują dalej zdolność wytwarzania awermektyn, w szczególności nienaturalnych. Niezdolność mutantów do wytwarzania acylowych pochodnych koenzymu A z naturalnymi kwasami tłuszczowymi, podczas hodowli na typowym podłożu, może dawać letalną mutację, jeśli integralność membrany zależy od powyższych pochodnych, lub jeśli akumulacja 2-ketokwasu przez poprzedni mutant prowadzi do cytotoksyczności. Ponadto, nie oczekiwano by któryś z mutantów był zdolny do syntetyzowania acetylo-CoA i propionylo-CoA z metabolitów L-izoleucyny i L-waliny, gdyż wymaga to aktywności enzymatycznej, której brak mutantom. Wymaganie obecności powyższych pochodnych acylowych CaA w procesie biosyntezy awermektyny, o czym wspomniano uprzednio, prowadziło do wniosku, że mutanty mogą być poważnie osłabione pod względem zdolności wytwarzania nienaturalnych awermektyn, co nieoczekiwanie nastąpiło.

Brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu u opisanych uprzednio mutantów prowadzi do zahamowania syntezy pochodnych acylowych CoA z kwasami tłuszczowymi o rozgałęzionym łańcuchu pochodzącymi z degradacji L-izoleucyny, L-leucyny i L-waliny, i tym samym syntezy naturalnych awermektyn. W podobny sposób, mutanty S. avermitilis wykazujące brak aktwyności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu także charakteryzują się niezdolnością do syntezy pochodnych acylowych CaA z kwasami tłuszczowymi o rozgałęzionym łańcuchu, i tym samym niezdolnością wytwarzania naturalnych awermektyn. Brak tych pochodnych acylowych CoA wynika z dwóch przyczyn. Po pierwsze, takie transaminazonegatywne mutanty nie są zdolne do syntezowania 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu z obecnych w podłożu izoleucyny, leucyny i waliny, normalną drogą transaminowania. Po drugie w przypadku tych mutantów transaminazowychwytwarzanie 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu drogą biosyntezy komórkowych aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu jest hamowane koniecznością włączenia tych aminokwasów w pożywkę wzrostową. Obecność tych aminokwasów uniemożliwia wykorzystanie tego szlaku biosyntetycznego (i wytwarzanie przejściowych 2-ketokwasów) poprzez dobrze znany mechanizm represji enzymatycznej i hamowania przez te aminokwasy produktów końcowych szlaku. Brak tych 2-ketokwasów, które są substratami dla dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, skutecznie wstrzymuje syntezę pochodnej acylowej CoA z kwasem tłuszczowym o rozgałęzionym łańcuchu. Wynalazek obejmuje więc zastosowanie takich dehydrogenezo-negatywnych i transaminazo-negatywnych mutantów oraz mutantów łączących obie te cechy.

156 764

W sposobie według wynalazku stosuje się dowolne drobnoustroje, niezależnie od ich wyglądu i cech fizjologicznych, które można otrzymać drogą transformacji, transdukcji, rekombinacji genetycznej lub innych manipulacji genetycznych wykorzystujących kwas nukleinowy lub równorzędny materiał z opisanego tutaj gatunku, o ile odpowiadają one charakterystyce przedstawionych w tym opisie mutantów.

Określenia „awermektyna lub „awermektyny dotyczy związków o wzorze 1, w którym podstawnik R w pozycji 25 może być dowolną grupą przyswajalną przez S. avermitilis według wynalazku.

Opisane mutanty mają wysoką wartość dla wytwarzania nienaturalnych ewermektyn sposobem ujawnionym i zilustrowanym w przykładach. Są one specjalnie cenne dla wytwarzania korzystnych awermektyn, to znaczy związków o wzorze 1, w którym podstawnikiem przy atomie węgla w pozycji 25 jest grupa C4-C6-cykIoalkilowa lub cykloalkenylowa, ewentualnie podstawiona grupa Ci-C4-alkilową, grupa 1-metylotioetylowa, albo 5 lub 6-czlonowa grupa heterocykliczna zawierająca w pierścieniu atom tlenu lub siarki, zwłaszcza 3-tienylowa lub 3-furylowa.

Mutację wytwarzającego awermektynę szczepu z gatunku Streptomyce avermitilis prowadzi się stosując znane sposoby i różne czynniki mutujące, takie jak promieniowanie nadfioletowe, promieniowanie rentgenowskie, N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyna, metanosulfonian etylu, kwas azotawy i iperyty azotowe, np. N-metylo-bis(2-chloroetylo)aminę, lub inne czynniki. Mutagenezę można prowadzić na zarodnikach lub hodowli wegetatywnej S. avermitilis wytwarzającego naturalne ewermektyny, np. S. avermitilis ATCC 31272.

Stosując postępowanie dobrze znane specjalistom, zmutowane kolonie selekcjonowano pod kątem braku dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Posługiwano się w tym celu badaniem biochemicznym pozwalającym na ocenę wielkich ilości losowo mutowanych kolonii bakteryjnych na wytwarzanie ¹4cC>2 z (¹4C-l)-2-ketokwasów (Tabor i wsp. J. Bact., 128,485-486 /1976/).

Metoda polega na hodowaniu kolonii mutanta w studzienkach na płytce do mikromiareczkowania, na odpowiednim podłożu odżywczym, nasączeniu do komórek toluenu, dodaniu do każdej studzienki (i*C-l)-2-ketokwasu (np. kwasu 2-ketoizokapronowego) i badaniu atmosfery nad fermentacją na obecność ™CO2. Alternatywnie, zamiast kwasu (i4C-l)-2-keto-3-metylowalerianowy lub kwas (i*C-l)-2-keto-3-metylom^słowy. Sprawdzanie wytwarzania ^CO2 prowadzi się umieszczając zwilżoną bibułę nasyconą Ba(OH)2 nad każdą pojedynczą studzienką w celu związania ewentualnie wydzielonego ^MCO2 i oznaczenie powstałego Ba^COe za pomocą autoradiografii. Mutanty nie wykazujące aktwyności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu dają autoradiogramy takie jak i próba kontrolna, to znaczy nie wykrywa się Ba^CCb.

Tak otrzymane mutanty poddaje się dalszej mutagenezie stosując jeden z opisanych powyżej czynników mutagennych. Zmutowane kolonie selekcjonuje się wybierając wykazujące brak aktywności transferazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu na podstawie braku ich wzrostu na płytkach na podłożu glukozowym M9, chyba, że w obecności L-izoleucyny, L-leucyny i L-waliny. Wszystkie te trzy aminokwasy muszą być obecne aby mógł zachodzić wzrost. Ponadto wykazano, że powyższe mutanty transaminazo-negatywne nie rosną na podłożach zawierających dodatek wszystkich trzech 2-ketokwasów służących jako substraty dla reakcji transaminowania. Pojedynczy enzym transaminazowy katalizuje więc transaminowanie każdego z trzech ketokwasów (kwasu 2-keto-3-metylowalerianowego, kwasu ketoizokapronowego i 2-ketoizowalerianowego).

Podwójnie blokowane mutanty, nie wykazujące zarówno aktywności dehydrogenazy 2ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, jak też aktywności transaminazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, mają szczególne znaczenie, gdyż prawdopodobieństwo ich rewersji do szczepów produkujących naturalne awermektyny jest wyjątkowo małe. Pojedynczo blokowane mutanty mogą w pewnych warunkach ulec rewersji do drobnoustrojów wytwarzających naturalne awermektyny.

Poza wytwarzaniem pożądanych alleli danego szczepu drobnoustroju drogą mutagenezy, fuzja protoplastów pozwala na wprowadzanie pożądanych alleli wytwarzanych i zidentyfikowanych w jednym szczepie do chromozomu innego szczepu. Np. szczep S. avermitilis nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i aktywności transaminazy o rozgałęzionym łańcuchu może przez fuzję protoplastów ze szczepu S. avermitilis, wykazującego powyższe aktywności, wytwarzać szczep S. avermitilis nie wykazujący tylko aktywności transami156 764 nazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Jak wiadomo specjalistom, technologia fuzji protoplastów pozwala na kombinowanie pożądanych alleli z różnych wyselekcjonowanych linii w jeden szczep. Opisany tutaj S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669), nie wykazujący aktywności transaminazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, został otrzymany za pomocą tej technologii.

Charakterystyka morfologiczna i hodowlana mutantów stosowanych w sposobie według wynalazku jest generalnie taka sama jak opisano w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 429 042. Wyróżniającą cechą mutantów stosowanych w sposobie według wynalazku jest brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i/lub aktywności transaminazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, które to cechy są oznaczane w opisany uprzednio sposób. W wyniku braku powyższych aktywności mutanty nie wytwarzają naturalnych awermektyn podczas hodowania w określonej pożywce praktycznie nie zawierającej kwasów tłuszczowych o wzorze RCOOH, w którym R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową, lub związków ulegających przekształceniu w te kwasy podczas fermentacji. Badania taksonomiczne prowadzone w American Type Culture Collection potwierdziły, że charakterystyki dwóch mutantów 1-3 i KL-026, wys^^^l^icĆ^nowanych na podstawie opisanego uprzednio oznaczania ¹⁴CC>2, są ściśle zbliżone do charakterystyki macierzystego szczepu ATCC 31272 opisanego w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4429042, z niektórymi tylko różnicami. Mianowicie, mutant 1-3 (szczep ATCC 53567) tworzy znacznie mniej łańcuchów zarodników niż szczep ATCC 31272, zaś mutant HL-026 (szczep ATCC 53568) nie wytwarza praktycznie grzybni powietrznej i zarodników, ale tworzone w bardzo znikomej ilości łańcuchy zarodników mają charakter podobny do wytwarzanych przez ATCC 31272. Także, mutant KL-026 wykazuje wątpliwą zdolność wykorzystywania rafinozy jako jedynego źródła węgla, podczas gdy szczep ATCC 31272 i mutant 1-3 są zdolne do zużywania rafinozy.

W przeprowadzonych doświadczeniach stwierdzono, że rafinoza nie wydaje się podtrzymywać wzrostu żądanego z tych szczepów. Dalej, mutant HL-026 wytwarza mniej pigmentu melaminy niż pozostałe dwa szczepy i zupełnie jej nie wytwarza na agarze tyrozynowym. Na koniec, w przeciwieństwie do opisu przedstawionego dla ATCC 31272 w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 429 042 nie udało się nam wykryć wzrostu mutantów lub szczepu ATCC 31272 przy zastosowaniu sacharozy jako jedynego źródła węgla. Mutanty 1-3 i KL-026 wykazują tylko brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Podwójnie blokowany mutant PGS-119 (szczep ATCC 53670), wytwarzany drogą dalszej mutagenezy mutanta 1-3 (ATCC 53567) i JC.923 (ATCC 53669) otrzymanego przez fuzję protoplastów, jest w podobnym stosunku taksonomicznym do ATCC 31272 jak mutant 1-3.

Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026, PGS-119 i JC-923 zostały zdeponowane na warunkach Traktatu Budapeszteńskiego w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, znanej kolekcji zapewniającej ciągłość przechowywania i łatwy dostęp publiczny do szczepów po uzyskaniu patentu na to zgłoszenie. Szczepy otrzymały odpowiednio oznaczenia Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53678, ATCC 53560 i ATCC 53669. Depozyty są dostępne w okresie oczekiwania na udzielenie patentu dla uznanych przez Komisarza Urzędu Stanów Zjednoczonych d/s Patentów i Znaków Towarowych za upoważnionych zgodnie z przepisami 37 CFR 1.14 i 35 USC 122, oraz zgodnie z zagranicznymi przepisami patentowymi w krajach, w których odpowiedniki tego zgłoszenia lub jego pochodne zostały złożone. Wszelkie ograniczenia dostępności publicznej zdeponowanych drobnoustrojów zostaną nieodwołalnie zniesione po uzyskaniu patentu.

Każdy ze szczepów S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 i NCIB 12121 wytwarza naturalne awermektyny o wzorze 1, w którym przerywana linia w pozycji 22-23 oznacza ewentualnie podwójne wiązanie, R¹ oznacza grupę hydroksylową, a jest obecna jedynie wtedy, gdy nie występuje podwójne wiązanie, R² oznacza grupę 4'-(a-L-oleandrozylo)-a-L-oleandrozylooksylową o wzorze 2, R³ oznacza atom wodoru lub grupę metylową, a R oznacza grupę izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową.

W opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4285 963 przedstawiono awermektynę o wzorze 1, w którym pozycja 25 jest podstawioną grupą metylową i grupą etylową, R1 oznacza grupę hydroksylową, a R³ oznacza grupę metylową.

W nienaturalnych awermektynach, opisywanych tutaj, R jest innym podstawnikiem niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rzęd.-butylowa, określonym poniżej.

156 764

Związki podstawowe dla wykorzystania w biosyntezie związków o wzorze 1 występują w komórce S. avermitilis. Związki powyższe, to znaczy L-walina, L-leucyna i L-izoleucyna, wchodzą w szlak biosyntezy awermektyn, jak się przyjmuje, drogą przekształcenia w 2-ketokwas i dekarboksylacji kwasu przez dehydrogenazę 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, z jednoczesnym sprzęgnięciem produktu z koenzymem A. Ich obecność wywołuje jednoczesną produkcję zarówno izopropylowych jak i (S)-II-rz.-butylowych związków o wzorze 1. Powstaje przy tym oczywiście problem rozdziału pochodnej izopropylowej i (S)-II-rz.-butylowej.

Podczas fermentacji w odżywczej pożywce zawierającej odpowiedni związek primerowy, mutanty stosowane w sposobie według wynalazku wytwarzają związek o wzorze 1 albo częściej mieszaninę dwóch lub więcej związków o wzorze 1, w którym R odpowiada zastosowanemu związkowi primerowemu. W ten sposób może być wytwarzane do czterech związków, określanych zwykle dla wygody jako R-awermektyna Al, A2, BI i B2, zgodnie z nazewnictwem przyjętym w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4429042. Grupa R oznacza oczywiście podstawnik przy atomie węgla w pozycji 25. Przykładowo, gdy R oznacza grupę cyklopentylową, możliwe są cztery następujące awermektyny.

Nazwa zwyczajowa cyklopentyloawermektyna Al cyklopentyloawermektyna A2 cyklopentyloawermektyna BI cyklopentyloawermektyna B2

R1	R3
podwójne wiązanie	CH3
grupa hydroksylowa	CH3
podwójne wiązanie	H
grupa hydroksylowa	H

W nienaturalnych awermektynach podstawnik R w pozycji C-25 związku o wzorze 1 jest inny niż grupa izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa.

Związki o wzorze 1, w którym obecne jest podwójne wiązanie a brak jest grupy hydroksylowej mogą być alternatywnie otrzymywane z odpowiedniego związku o wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę hydroksylową i nie występuje podwójne wiązanie, na drodze reakcji odwadniania. Reakcję tę prowadzi się ochraniając najpierw selektywnie grupy hydroksylowe w pozycjach 5 i 4, tworząc np. pochodną III-rz.-butylodwumetylosililooksyacetylową. Ochronioną pochodną poddaje się reakcji z podstawionym halogenkiem tiokarbonylu, takim jak chlorek (4-metylofenoksy)-tiokarbonylu, i następnie ogrzewa w wysokowrzącym rozpuszczalniku, np. trójchlorobenzenie, w celu odwodnienia. Po usunięciu grup ochronnych otrzymuje się nienasycony związek. Proces ten oraz odpowiednie reagenty i warunki reakcji zostały opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 328 335.

Związki o wzorze 1, w którym R³ oznacza atom wodoru, mogą również być otrzymywane z odpowiednich związków, w których R³ oznacza grupę metylową, drogą demetylowania. Reakcję prowadzi się poddając związek 5-metoksylowy lub jego odpowiednio ochronioną pochodną reakcji z octanem rtęciowym i następnie hydrolizując otrzymany 3-acetoksyenol rozcieńczonym kwasem i otrzymując związek 5-keto. Związek ten poddaje się redukcji, np. za pomocą borowodorku sodowego i otrzymuje się pochodną 5-hydroksylową. Odpowiednie reagenty i warunki reakcji zostały przedstawione w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4423 209.

Związki o wzorze 1, w którym R1 oznacza atom wodoru i brak jest podwójnego wiązania, można wytwarzać z odpowiednich związków, w których występuje podwójne wiązanie a brakuje podstawnika R\ Stosuje się do tego celu selektywne, katalityczne uwodornianie w obecności odpowiedniego katalizatora. Przykładowo, redukcję można prowadzić stosując chlorek tris(trójfenylofosfino/rodu/I), jak to opisano w Europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 001 689 i w jego odpowiedniku, opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 199 569.

Związki o wzorze 1, w którym R² oznacza atom wodoru, wytwarza się z odpowiednich związków, w których R2 oznacza grupę 4'-(a-L-oleandrozylo)-a-L-oleandrozylooksylową, drogą usuwania tej grupy za pomocą łagodnej hydrolizy kwasem w rozpuszczalniku wodnoorganicznym. Otrzymuje się aglikon zawierający grupę hydroksylową w pozycji 13, który następnie chlorowuje się, np. w reakcji z halogenkiem benzenosulfonylowym. Otrzymuje się 13-dezoksy-13-chlorowcopochodną, którą poddaje się selektywnej redukcji, np. za pomocą wodorku trójbutylocyny. Dla uniknięcia niepożądanych reakcji ubocznych należy chronić inne grupy hydroksylowe, które mogą występować w cząsteczce, np. za pomocą grupy III-rz.-butylo-dwumetylosililowej. Grupę tę z

156 764 łatwością się usuwa po zakończeniu reakcji chlorowcowania lub redukcji, traktując produkt metanolem zawierającym śladową ilość kwasu. Wszystkie etapy powyższego procesu oraz odpowiednie do tego reagenty i warunki reakcji zostały opisane w Europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0002 615.

Związkami przyswajalnymi przez S. avermitilis według wynalazku w procesie biosyntezy awermektyn, naturalnych i nienaturalnych, są związki o wzorze R-COOH, w tym także związki ulegające przekształceniu w związek o wzorze R-COOH podczas procesu biosyntezy. Powyższe związki są w opisie określane jako „związki primerowe. Sposób wytwarzania awermektyny według wynalazku polega na tym, że szczep Streptomyces avermitilis nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu poddaje się fermentacji z napowietrzaniem w wodnej, odżywczej pożywce zawierającej przyswajalne źródło azotu, węgla i soli nieorganicznych oraz związku nadającego się do wykorzystania w biosyntezie awermektyny o wzorze R-COOH łub związku ulegającego przekształceniu w związek o wzorze R-COOH mającego wzór R-(CH2)n-Z, w których to wzorach R oznacza łańcuchową grupę a - rozgałęzioną, której atom węgla połączony z grupą -COOH lub z grupą o wzorze -(CH2)n-Z jest również przyłączony do co najmniej dwóch innych atomów lub grup innych atomów lub grup innych niż atomy wodoru, n jest 0,2,4 lub 6, a Z oznacza grupę -CH2OH, -CHO, -CH2NH2 lub grupę o wzorze -COOR⁵ lub o wzorze -CONHR6, w których to wzorach odpowiednio R5 oznacza atom wodoru lub grupę (C1-C6) alkilową a R6 oznacza atom wodoru, grupę (G-C4) alkilową lub grupę -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)₂COOH lub -CH(COOH) (CH2)₂SCHa.

Dokładniej, podstawnik R w pozycji 25 może oznaczać σ-rozgałęzioną grupę Ca-Ce-alkilową, alkenylową, alkinylową, alkoksyalkilową lub alkilotioalkilową, grupę Cs-Cs-cykloalkiloalkilową, w której grupa alkilowa jest a- rozgałęzioną grupą C₂-Cs-alkilową, grupę C3-Cs-cykloalkilową lub Cs-Cs-cykloalkenylową, z których każda może być ewentualnie podstawiona grupą metylenową lub jedną albo kilkoma grupami Ci-C₄-alkilowymi albo atomami chlorowca (fluoru, chloru, jodu, lub bromu), albo R oznacza 3 do 6-czlonowy pierścień heterocykliczny zawierający atom tlenu lub siarki, który może być nasycony lub częściowo albo całkowicie nienasycony, i który może ewentualnie być podstawiony jedną lub kilkoma grupami Ci-C₄-alkilowymi albo atomami chlorowca.

W procesie według wynalazku wykorzystuje się także izomeryczne odmiany związków o wzorze R-COOH oraz związki ulegające podczas fermentacji przekształceniu w związki o wzorze R-COOH, a także izomeryczne w pozycji C-25 awermektyny otrzymane w wyniku stosowania izomerycznych związków o wzorze R-COOH.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się związek o wzorze R-COOH, w którym R oznacza grupę cyklobutylową, cyklopentylową, cykloheksylową, cykloheptylową, 2-metylocyklopropylową, 3-cykloheksenylową, 1-cyklopentenylową, 1-cykloheksenylową, 3-metylocykloheksylową cis lub trans, 4-metylenocykloheksylową, 3-metylocyklobutylową, 3-metylenocyklobutylową, 3-cyklopentenylową, l-cyklopropyloetylową, 3-fluorocyklobutylową, 4,4-dwufluorocykloheksylową, izopropylową, Il-rz.-butylową, 2-pentylową, 2,3-dwumetylopropylową, 2-heksylową, 2-pent-4-enylową, 2-metyloticetylową, S-2-metylopentylową, R-2-metylopentylową, tienylową, zwłaszcza 2-tienylową, 3-tienylową, 4-czterowodoropiranylową, 3-furylową, 2-chlorotienylową, 3-czterowodorotienylową, 4-metylotio-2-butylową, 4-czterowodorotiopiranylową, 4-metoksy-2-butylową lub 4-metylotio-2-butylową.

Jak wspomniano, proces prowadzony sposobem według wynalazku polega na poddawaniu fermentacji z napowietrzaniem szczepu S. avermitilis, wykazującego brak aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i/lub brak aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, w wodnej pożywce zawierającej przyswajalne źródło azotu, węgla, sole nieorganiczne i związek o wzorze RCOOH, albo związek ulegający podczas fermentacji przekształceniu w powyższy związek (to znaczy prekursor). Kwas lub związek przekształcający się w kwas dodaje się do fermentacji albo podczas zaszczepiania albo porcjami podczas fermentacji. Cdy stosuje się negatywny mutant transaminazowy, wówczas pożywka musi zawierać L-izoleucynę, L-leucynę, i L-walinę dla zapewnienia wzrostu mutanta. Proces wytwarzania awermektyny może być kontrolowany drogą pobierania próbek z fermentacji, ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym i oznaczanie ilości produktu za pomocą chromatografii, np. wysokorozdzielczej chromato

156 764 grafii cieczowej. Fermentację kontynuuje się aż do uzyskania maksymalnej wydajności produktu, zwykle w ciągu 4-15 dni.

Korzystna ilość każdego dodatku związków primerowych (kwasu karboksylowego lub związku przekształcającego się w kwas) wynosi od 0,05 do 3,0 g/litr. Związek primerowy można dodawać w sposób ciągły, porcjami lub jednorazowo. Kwas (RCOOH) dodaje się w stanie wolnym albo jako sól, taką jak sodowa, litowa lub amoniowa, albo w postaci wspomnianego uprzednio związku ulegającego przekształceniu w kwas. Jeśli stosuje się stały kwas, wówczas korzystnie rozpuszcza się go w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak woda lub alkohol o 1-4 atomach węgla.

Pożywki stosowane do fermentacji, zwłaszcza gdy podstawnikiem w pozycji 25 może być grupa izopropylowa lub (S)-rz.-butylowa, mogą być zwykłymi pożywkami zawierającymi przyswajalne źródła węgla, azotu i pierwiastków śladowych. Gdy podstawnikiem przy C-25 ma być nie naturalna grupa, to znaczy nie izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa, wówczas stosuje się pożywkę nie zawierającą lub zawierającą tylko minimalne ilości związków primerowych, w których ugrupowanie R jest resztą izopropylową lub (S)-II-rz.-butylową.

Po fermentacji prowadzonej w ciągu kilku dni w temperaturze zawartej korzystnie w zakresie 24-33°C, brzeczkę odwirowuje się lub sączy i grzybnię ekstrahuje się, korzystnie acetonem lub metanolem. Ekstrakt zatęża się i pożądany produkt ekstrahuje się niemieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem, takim jak chlorek metylenu, octan etylu, chloroform, butanol lub keton metylowoizobutylowy. Ekstrakt zatęża się a surowy produkt, w razie potrzeby, dalej się oczyszcza chromatograficznie, np. stosując preparatywną wysokorozdzielczą chromatografię cieczową z odwróconą fazą.

Produkt otrzymuje się na ogół w postaci mieszaniny związków o wzorze 1, w którym R² oznacza grupę 4'-(a-L-oleandroz,ylo)-a-L-olcandio^/ylociksylową, R¹ oznacza grupę hydroksylową i brak jest podwójnego wiązania lub brak jest R¹ i występuje podwójne wiązanie, a R3 oznacza atom wodoru lub grupę metylową. Proporcje poszczególnych komponentów mieszaniny mogą być różne w zależności od stosowanego mutanta, związku primerowego i warunków prowadzenia procesu.

Źródło grupy R, to znaczy czy pochodzi ona bezpośrednio z kwasu R-COOH, czy też z jednego z wymienionych uprzednio prekursorów lub z innych prekursorów, nie ma znaczenia dla wytwarzania awermektyn. Podstawowe znaczenie dla procesu ich wytwarzania sposobem według wynalazku ma dostępność pożądanej grupy R dla szczepów S. avermitilis w procesie fermentacji.

Do odpowiednich związków należą między innymi następujące: kwas 2,3-dwumetylomasłowy, kwas 2-metylokapronowy, kwas 2-metylcpent-4-encwy, kwas 2-cykloprcpylcprcpionowy, sól litowa kwasu 4,4-dwuflucroheksanokarboksylowegc, kwas 4-metylenccyklcheskanowy, kwas 3-metylocykloheksanokarbcksylowy (cis/trans), kwas 2-cyklopentenokarbcksylowy, kwas 1-cykloheksenokarbcksylowy, kwas czterowodoropirano-4-karboksylowy, kwas tiofeno-2-karboksylowy, kwas furano-2-karboksylowy, kwas furano-3-karboksylowy, kwas 2chlorctiofeno-4-karboksylowy, kwas cyklobutanokarboksylowy, kwas cyklopentanokarboksylowy, kwas cykloheksanokarboksylowy, kwas cykloheptanokarboksylowy, kwas-2-metylocykloprcpanokaIbx)ksylowy, kwas 3-cyvkioheTseno-l-karboksy'k)\vy, kwas 2-metylctioprcpionowy, kwas 2-metylo-4-metoksvmaslowv, kwas tiofenoG-karboksyłowy, hvdrcksvmetvlccyklcpentan, 3-ticfenokarboksyaldehvd, kwas 3-cykloheksvlopropicnowy, kwas 3-cyklopentylcpropionowv, hydroksymetylocyklobutan, kwas cztercwodorotiofeno-3-karboksylowy, 3-cyklopentvlcpropanol-1, sól litowakwasu3-metylocyklobutanokarboksylowego, kwas 3-fluorocyklobutanokarbcksylowy, sól litowa kwasu 3-metylenocyklobutanckarboksylowego, kwas 3-metvlc-4-metvlotiomasłowy, kwas czterow-od^opi^no^-karboksyłowy, cyklobutylometyloamina, cyklobutanokarboksylan etylu, 4-hydroksymetvlocyklopenten, ester etylowy kwasu 2-(3-tiofenokarbcnvlo)propionowego, kwas (S^-metylo-walerianowy, kwas (R)-2-metylowalerianowy.

Mutanty O-metylotransferazowe można otrzymywać z opisanych powyżej negatywnych mutantów dehydrogenazowych 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub negatywnych mutantów transaminazowych aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Mutanty, w których mutacje w kierunku uzyskania aktywności dehydrogenazy i/lub aktywności transaminazy są skombinozowane z mutacjami w kierunku uzyskania aktywności jednej lub obu 0-metvlctransferaz dają szczepy S. avermitilis, które mogą, w obecności kwasu RCOOH lub związków ulega156 764 jących przekształceniu w ten kwas podczas fermentacji, wytwarzać przede wszystkim awermektyny B, demetyloawermektyny lub demetyloawermektyny B. Powyższe mutanty są otrzymywane drogą mutagenezy opisanych tutaj mutantów nie wykazujących aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, prowadzonej za pomocą promeniowania nadfioletowego i/lub chemicznych mutagenów, takich jak N-metylo-N-nitrozouretan, nitrozoguanidyna, metylosulfonian etylu lub podobny czynnik wymieniony uprzednio. Alternatywnie, mutanty dehydrogenazododatnie i/lub transaminazododatnie, które nie wykazują aktywności jednej lub obu O-metylotransferaz można mutować działając promieniami nadfioletowymi lub czynnikiem mutagennym i otrzymywać mutanty dehydrogenazo-negatywne i/lub transaminonazo-negatywne.

Nienaturalne awemektyny wytwarzane przez takie mutanty charakteryzują się obecnością grup hydroksylowych w pozycji C-5 reszty aglikonu i/lub w pozycjach C-3 i/lub C-3' reszt oleandrozy.

Do identyfikacji opisanych powyżej mutantów zastosowana została metodologia opisana przez Schulmana i wsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). Są one użyteczne dla tych samych celów i wykorzystywane w taki sam sposób jak szczepy wytwarzające znane awermektyny.

Alternatywnie, zwiększone ilości awermektyn B, w tym takich, które nie zawierają grupy metylowej w reszcie dwucukru oleandrozy, można wytwarzać drogą fermentacji mutantów według wynalazku, nie wykazujących aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu, w obecności substancji takich jak sinefungina, S-adenozyloetionina lub S-adenozylohomocysteina, które hamują aktywność O-metylotransferazy.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są wysoko aktywnymi czynnikami przciwpasożytniczymi, szczególnie przydatnymi jako środki przeciwrobacze, środki przeciw pasożytom zewnętrznym, środki owadobójcze i środki roztoczobójcze.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są więc skuteczne w zwalczaniu różnych schorzeń wywoływanych przez pasożyty wewnętrzne, takich w szczególności jak robaczyca, która najczęściej jest wywoływana przez grupę pasożytniczych robaków opisanych jako obleńce, które mogą powodować poważne straty gospodarcze w hodowlach świń, owiec, koni i bydła, a także mogą atakować zwierzęta domowe i drób. Związki te są także skuteczne przeciw innym obleńcom, które porażają inne gatunki zwierząt, np. Dirofilaria u psów, oraz przeciw różnym pasożytom, które mogą zarażać ludzi, w tym pasożytom przewodu żołądkowo-jelitowego, takim jak Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, a także pasożytom znajdowanym we krwi lub w innych tkankach i organach, takim jak nitkowce i stadia pozajelitowe Strongyloides i Trichinella.

Związki te są również użyteczne do zwalczania zakażeń pasożytami zewnętrznymi, w szczególności pasożytami z grupy stawonogów u zwierząt i ptaków, takimi jak klszcze, roztocza, wszy, pchły, muchy stajenne, owady gryzące oraz wędrujące larwy dwuskrzydłych, które to pasożyty mogą atakować bydło i konie.

Związki są także środkami owadobójczymi, aktywnymi przeciw szkodnikom domowym, takim jak karaluch, mól ubraniowy, mrzyk i mucha domowa. Są one też użyteczne do zwalczania szkodników owadzich w magazynach zbożowych i roślinach hodowlanych, takich jak pajęczaki, mszyce, gąsienice oraz wędrujących owadów prostoskrzydłych, takich jak szarańcza.

Związki o wzorze 1 podaje się w postaci preparatów odpowiednich dla rodzaju stosowania, gatunku traktowanego zwierzęcia i zwalczanego pasożyta. Do stosowania przeciwrobaczego związki można podawać doustnie w postaci kapsułek, piguł, tabletek lub płynów albo alternatywnie można je podawać iniekcyjnie lub w postaci wszczepu. Preparaty takie sporządza się w rutynowy sposób, zgodnie ze standardową praktyką weterynaryjną. Kapsułki, piguły lub tabletki można sporządzać mieszając aktywny składnik z odpowiednim dobrze rozdrobnionym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem zawierającym dodatkowo środek rozpraszający i/lub wiążący, taki jak skrobia, laktoza, talk, stearynian magnezu itp. Preparaty ciekłe można wytwarzać sporządzając zawiesinę składnika aktywnego w wodzie razem z czynnikami rozpraszającymi lub zwilżającymi. Preparaty do iniekcji mogą mieć postać jałowych roztworów, które mogą zawierać także inne substancje, np. sole lub glukozę w ilości odpowiedniej dla uzyskania roztworu izotonicznego

156 764 względem krwi. Preparaty mogą zawierać różne ilości składnika aktywnego w zależności od gatunku leczonego zwierzęcia, stopnia i typu infekcji oraz ciężaru ciała pacjenta. Do podawania doustnego stosuje się zwykle dawki wynoszące od 0,001 do lOmg/kg ciężaru ciała zwierzęcia, w postaci jednorazowej lub podzielonej porcji podawanej w ciągu 1-5 dni, która powinna być wystarczająca. Może jednak wystąpić potrzeba stosowania dawek wyższych lub niższych od podanych powyżej.

Alternatywnie, związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być podawane z pokarmem zwierzęcym i dla tych celów można sporządzać koncentraty lub premiksy do następnego zmieszania z normalną karmą zwierzęcą.

Do stosowania w charakterze środków owadobójczych i do zwalczania szkodników roślin, związki wytwarzane sposobem według wynalazku podaje się w postaci pyłów, preparatów do opryskiwania i podobnych, zgodnie ze standardową praktyką agrochemiczną.

Wytwarzanie S, avermitilis 1-3 nie wykazującego aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu (szczep ATCC 53567).

Etap 1. S. avermitilis ATCC 31272 hodowano na podłożu „New Patch Agar Medium“w ciągu 12 dni, w temperaturze 30°C.

Skład podłoża:

Sok V-8x

CaCO3 agar

H2O pożywka odżywcza octan sodowy trójwodny kwas izowalerianowy kwas izomasłowy kwas 2-metylomasłowy izoleucyna leucyna walina roztwór pierwiastków śladowych

200 ml 3g 15g do 1000 ml

1,0 g/litr 1,4 g/litr 50 mg/litr 50 mg/litr 50 mg/litr

250 mg/litr 250 mg/litr 250 mg/litr 1 ml/litr

Mieszanina 8 soków roślinnych (pomidory, marchew, seler, buraki, pietruszka, sałata, rzepicha i szpinak) z dodatkiem soli, kwasu askrobinowego, kwasu cytrynowego i naturalnych aromatów. Producentem jest Campbell Soup Company, Camden, NJ.

xxSklad roztworu pierwiastków śladowych

FeCl3-6H2O	2,7 g
MnSO4-H2O	4,2
CuSO4 5H2O	0,5
CaCl2	11,0
H3BO3	0,62
COC12 · 6H2O	0,24
ZnCl2	0,68
NaMoOi	0,24

Rozpuszczone w 0,1 n kwasie solnym do objętości 1 litra 0,1 n HC1.

Zarodniki zebrano z trzech takich płytek i zawieszono w 20 ml 0,05 molarnego buforu tris-kwas maleinowy o pH 9,0Etap 2. 10 ml zawiesiny zarodników wlano do fiolki zawierającej 10 mg N-metylo-N'-nitro-Nnitrozoguanidyny (NTG). Fiolkę inkubowano i wstrząsano w temperaturze 28°C w ciągu 60 minut a następnie zarodniki przemyto obficie 1% roztworem chlorku sodowego.

Etap 3. Przemyte zarodniki zawieszono w 1% roztworze NaCl i zmieszano z taką samą objętością 80% glikolu etylenowego. Otrzymaną zawiesinę przetrzymywano w temperaturze -20°C i używano jako źródła komórek badanych na obecność mutantów. Otrzymywano około 10⁴ kolonii/ml podczas zarodnikowania.

Zawiesinę zarodników zasiewano na płytkach z podłożem YPD w ilości około 100 kolonii na jednej płytce. Podłoże YPD zawiera po 10 g/litr wyciągu drożdżowego, peptonu BactO) i dekstrozy oraz 15 g/litr agaru Bacto). Przed autokławowaniem pH doprowadzono do 6,9. Składniki oznaczone gwiazdką są wytwarzane przez Difco Laboratories, Detroit, Machigan 48238.

Etap 4. Pojdenycze kolonie pobierano z płytek po 2-3 tygodniach hodowli w temperaturze 28°C i umieszczano w poszczególnych studzienkach standardowej płytki do mikromiareczkowania

156 764 13 posiadającej 96 takich studzienek. Ponadto, małą ilość kolonii naniesiono na świeże podłoże agarowe dla uzyskania źródła żywych komórek podczas identyfikacji mutanta.

Etap 5. Do każdej studzienki dodano około 75 mikrolitrów ciekłej pożywki M9 z solami zawierającej 1% glukozy, 0,1% preparatu o nazwie „casamino acids“ oraz po 0,01% kwasu izowalerianowego, kwasu izomasłowego i kwasu 2-metylomasłowego. Po kilkudniowym inkubowaniu w temperaturze 28°C komórki badano na obecność dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu. Jeden litr pożywki z solami M9 zawiera 6 g Na2HPO4,3 g KH2PO4,0,5 g NaCl i 1 g NH4CI. Pożywkę autoklawowano i dodawano w warunkach jałowych po 1 ml wyjałowionego 1 molarnego roztworu MgSO4 i 0,1 molarnego roztworu CaCL.

Etap 6. Sporządzono mikrozawiesinę 5% toluenu w pożywce z solami M9 drogą krótkiego traktowania ultradźwiękami nie mieszających się ze sobą składników. Do 25 ml tej zawiesiny dodano 1,2 ml roztworu zawierającego 0,925 · 10² PBq/ml (3,7· 10²PBq) (mikromol) kwasu (^Cl)-2-ketoizokapronowego. 50 mikrolitrów tej mieszaniny dodano do każdej studzienki na płytce do mikromiareczkowania zawierającej poddawane badaniu kolonie.

Etap 7. Wytwarzany w każdej studzience ¹4CO2 wyłapywano i oznaczano stosując postępowanie opisane przez Tabora i wsp. w J. Bacteriol., 128,485-486(1976), zatytułowanej „Convenient Method for Detecting ¹4cC>2 in Pultiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants. Mutanty nie wykazujące aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu nie wytwarzały Ba^CO w ilości większej niż obserwowano dla prób kontrolnych.

Bardziej czuła metoda, w której lepiej uwidoczniony jest kontrast pomiędzy dodatnim wynikiem na obecność ™CO2 (ciemna plama na autoradiogramie jako wynik tworzenia się Ba^CCh) a ujemnym wynikiem (brak plamy lub b. jasna plama), polega na poniższym zmodyfikowanym skriningu.

Pojedyncze kolonie (patrz etap 4 powyżej) pobierano z podłoża agarowego po 7-14 dniach wzrostu) zamiast po 2-3 tygodniach i badano bezpośrednio tak jak opisano w etapie 6 i 7, omijając etap 5.

Jeszcze bardziej czuła metoda polegająca na ilościowym oznaczaniu wydzielonego ^MCO2 polega na hodowaniu mutantów wybranych na podstawie powyższego skriningu na odpowiednim podłożu zawierającym 1% pożywki z solami M9 oraz 0,1% pożywki „Syncasabcaa (syntetyczna mieszanina L-aminokwasów o składzie przybliżonym do składu handlowego preparatu o nazwie „casamino acids“ ale nie zawierająca L-waliny, L-izoleucyny i L-leucyny, opisana w dalszej części).

Po uzyskaniu dużej gęstości komórek przemyto je pożywką M9 i powtórnie zawieszono w tejże pożywce M9 zawierającej 1% toluenu. Mieszaninę traktowano ultradźwiękami i otrzymano mleczno białą dyspersję toluenu. Zawiesinę zawierającą komórki, bufor i toluen inkubowano w ciągu 40 minut w temperaturze 30°C w celu uzyskania przepuszczalności komórek, które następnie przemyto pożywką M9 i znów zawieszono w 1/5 pierwotnej ilości buforu M9. Porcję 18 mikrolitrów tej zawiesiny stosowano do każdego badania.

Porcja 300 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierała nasycone toluenem komórki, 0,4 milimola pirofosforanu tiaminy (TPP), 0,11 milimola koenzymu A (CoA), 0,68 milimola dwunukleotydu nikotynamido-adeninowego, 2,6 milimola dwutiotreitolu, 4,1 milimola MgCL, 60 milimoli Tris-HCl o pH 7,5 oraz 6000 cpm (¹4C-l)-a-ketoizokapronianu [mikrokiur/mikromol]. Wydajność zliczania wynosiła 73%. Reakcję prowadzono w 15 ml fiolkach scyntylacyjnych zawierających kwadratowe płytki o wymiarach 2 X 2 cm bibuły Whatmana nr 4 wprasowane w zakrętkę fiolki. Bibuła zawierała 30 mikrolitrów 1 m roztworu wodorotlenku hyaminy (1 molarny roztwór wodorotlenku metylobenzetoniowego w metanolu produkowanego przez firmę Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), który absorbuje ^MCO2 wydzielany w reakcji. Po inkubowaniu w ciągu 2 godzin bibułę zanurzano w 10 ml preparatu Aquasol II Beckman) uniwerslany LSC produkcji firmy New England Nuclear Research Products, Boston, MA 02118) i mierzono radioaktywność za pomocą ciekłego licznika scyntylacyjnego, po równoważeniu w tym rozpuszczalniku w ciągu 4 godzin lub dłużej. W próbie kontrolnej (nie zawierającej komórek) uzyskano wynik około 50-300 cpm.

Mutant 1-3 i inne do niego podobne dawały ilość impulsów mniejszą lub równą uzyskanej w ślepej próbie, natomiast macierzysty szczep dawał wielokrotnie wyższą ilość impulsów niż próba kontrolna.

156 764

Izolacja szczepu HL-026 (ATCC 53568) pochodzącego od S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567).

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) posiano na płytkach z agarem odżywczym. Pojawiła się stosunkowo duża ilość spontanicznych wariantów. Niektóre z nich nie tworzyły grzybni powietrznej po 4 dniach inkubowania w temperaturze 30°C. Kilka z tych wariantów izolowano i testowano na zdolność wytwarzania nienaturalnych awermektyn podczas fermentacji w pożywce AP-5, do której dodawano kwas cyklopentanokarboksylowy. Z izolowanych szczepów, z których wiele wytwarzało nienaturalne awermektyny wolne od naturalnych, wybrano szczep dający wyższe miana awermekty n w doświadczeniach w kolbach niż macierzysty S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) i nadano mu numer identyfikacyjny HL-026 (ATCC 53568).

Wytwarzanie S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53679) nie wykazującego aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu i transaminazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu.

Etap 1. Około 100 mg S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) hodowanego na płytce ze świeżym agarem SAMM w ciągu 4 dni zaszczepiano 300 ml kolbę zawierającą 50 ml pożywki SCM o pH 7,2. Kolbę wstrząsano przy 200 obrotach/minutę w temperaturze 30°C w ciągu 24 godzin (końcowe pH 8,2).

Etap 2. Kolbę usunięto z trzęsawki i 10 ml całkowitej brzeczki wirowano w jałowej probówce w ciągu 5 minut przy 2000 obrotach/minutę. Komórki zawieszono w 50 ml pożywki SCM w jałowych kolbach Erlenmeyra o pojemności 300 ml i wstrząsano je w ciągu 2 godzin w temperaturze 30°C, na trzęsawce obrotowej.

Etap 3. Porcję 10 ml zawiesiny umieszczono w jałowej probówce.

Etap 4. Porcję 250 mikrolitrów metanosulfonianu etylu dodano do probówki (pod dobrym wyciągiem), zawartość dokładnie wymieszano i wlano do jałowej 300 ml kolby, którą następnie wstrząsano na trzęsawce obrotowej w ciągu 3 godzin w temperaturze 30°C.

Etap 5. Do kolby dodano 40 ml świeżego jałowego podłoża SCM i wstrząsano w temperaturze 30°C, łącznie w ciągu 70 godzin.

Etap 6. Zawartość kolby wirowano przy 8000 obrotach/minutę w ciągu 10 minut, w temperaturze 20°C. Komórki przemyto zawieszając je powtórnie w podłożu SCM, wirowano i znów zawieszono w 10 ml podłoża SCM.

Etap 7. Komórki wydobyto i testowano na płytkach stosując około 150 kolonii/płytkę, na zdolność wzrostu na podłożu M9 zawierającym glukozę w obecności lub nieobecności L-leucyny, L-izoleucyny, L-waliny lub dowolnej kombinacji tych aminokwasów. Komórki pożądanego mutanta rosły jedynie na podłożach wzbogaconych w L-leucynę, L-izoleucynę i L-walinę. Pochodne szczepu S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) nie wykazujące aktywności transaminazy aminokwasu o rozgałęzionym łańcuchu nie rosły również na podłożach wzbogaconych w jeden lub więcej z trzech 2-ketokwasów (kwas 2-keto-izokapronówy, kwas 2-keto-3-metylowalerianowy i kwas 2-ketoizowalerianowy), które służą jako prekursory L-leucyny, L-izoleucyny i L-waliny. Takie zachowanie jest całkowicie odmienne od zachowania S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), który rósł dobrze na tych podłożach. Jak z tego wynika, pojedyncza transaminaza katalizuje transmitowanie powyższych 2-ketokwasów.

Podłoże SCM

Autoliza drożdżowa		lOg/litr
Wyciąg wołowy		5 g/litr
Enzymatyczny hydrolizat kazeiny		lOg/litr
1 molarny roztwór MgSO4		3 g/litr
1 molarny roztwór K2HPO4, pH 7,0 (HC1)	100 g/litr
Agar SAMM
Na2HPO4	6,0
KH2PO4	3,0
NaCl	0,5
NH4CI	1,0
1 m roztwór MgSO4	1,0
0,1 m roztwór CaCL	1,0
Dekstroza	8,0
Preparat „casamino acids“	20,0
Agar	20,0

156 764

Skład podłoża „Syncasa-bcaa“ (100-krotny koncentrat) g/litr

L-alanina 3

L-arginina 4 kwas L-asparaginowy 6

L-cystyna 1

Kwas L-glutaminowy 20

Glicyna 1

L-histydyna 2

L-lizyna 7

L-metionina 3

L-fenyłoalanina 6

L-prolina 10

L-seryna 6

L-treonina 4

L-tyrozyna 4

L-tryptofan 1

Wartość pH mieszaniny doprowadza się do 7 i wyjaławia przez sączenie. Jedną objętość koncentratu dodaje się do 99 objętości pożywki, uzyskując standardowe stężenia użytkowe.

Wytwarzanie S-avermitilis JC-923 (ATCC 53669) drogą fuzji protoplastów opornych na spektynomycynę szczepu S. avermitilis ATCC 31272 oraz S. avermitilis PGS 119 (53670).

Oporny na spektynomycynę S. avermitilis ATCC 31272 jest samorzutnym mutantem S. avermitilis ATCC 31272. Izolowano go z populacji grzybni wegetatywnej szczepu ATCC 31272 naniesionego na płytki z agarem AS-1 zawierającym 50 mikrogramów/ml spektynomycyny. Zarodniki mutanta zarodnikującego na bogatym podłożu są oporne na 50 mikrogramów/ml spektynomycyny, w porównaniu z zarodnikami izogenicznego macierzystego szczepu, który nie zarodnikuje w tych warunkach. Ten dominujący wskaźnik selekcjonujący był stosowany z powodzeniem do izolowania kolonii szczepu ATCC 31272 nie wykazującego aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu.

Agar AS-1 (Bogata pożywka do hodowania na płytkach Streptomyces)

Wyciąg drożdżowy	Ig
L-alanina	0,2 g
L-arginina	0,2 g
L-asparagina	0,5 g
Skrobia rozpuszczalna	5g
NaCl	25 g
Na2SO4	10g
Agar	20 g
Woda destylowana	1 litr

Wartość pH doprowadzono do 7,5, autoklawowano w ciągu 15 minut w temperaturze 121°C, wlewano 30-35 ml do plastikowych płytek Petri'ego o wymiarach 100 X 15 mm.

Sposób wytwarzania zdolnych do życia protoplastów szczepów Streptomyces avermitilis.

A. Zarodniki jako inokula.

1. Preparaty zarodnikowe przygotowywano w standardowy sposób, ilość zdolnych do życia zarodników oznaczano metodą rozcieńczeniową na płytkach na agarze i próbki zamrażano w 40% glicerynie w -70°C.

2. Przed użyciem powyższe zarodniki wirowano w ciągu 10 minut przy 1000 g i zawieszano w równej objętości 0,85% roztworu soli.

3. Porcję około 10⁷ zarodników zaszczepiono 30 ml zmodyfikowanej pożywki zawierającej wyciąg drożdżowy i wyciąg słodowy (YEME) oraz 0,5% glicyny, w trzech lub czterech kolbach z łamaczami o pojemności 300 ml.

156 764

B. Zamrożona i traktowana ultradźwiękami grzybnia jako inokulum.

1. Hodowle grzybniowe PGS-119 hodowano w pożywce tryptykazowo-sojowej (TSB) do uzyskania zmętnienia wynoszącego 2 do 9 przy 600 nm. Hodowlę następnie homogenizowano 10 razy za pomocą szklanego urządzenia do rozdrabniania tkanek.

2. Zhomogenizowaną grzybnię rozcieńczono dwukrotnie TBS i 20 ml umieszczono w jałowej polipropylenowej probówce wirowniczej. Sondę ultradźwiękową zanurzono w cieczy na głębokość 1-2 cm i próbkę traktowano ultradźwiękami w ciągu 10 sekund z 50% natężeniem. Ultradźwięki rozbiły masę grzybni na pojedyncze lub podwójne zespoły komórkowe, które wykazywały szybki, wykładniczy wzrost podczas hodowania.

3. Poddane działaniu ultradźwiękami preparaty rozcieńczano do końcowego stężenia za pomocą 40% gliceryny, przenoszono pipetą do fiolek i zamrażano w temperaturze -70°C.

4. Próbki rozmrażano w etapie A. 3, powyżej.

C. Kolonie hodowane na podłożu agarowym jako inokula.

1. Sześć dojrzałych hodowli PGS-119 rosnących na agarze TSA lub agarze YPD-2 przeniesiono za pomocą ezy do 200 mikrolitrów jałowej wody w mikropróbówce wirowniczej.

2. Mieszaninę homogenizowano ucierając ją pręcikiem.

3. Zhomogenizowane kolonie dodano do podłoża YEME, opisanego w etapie A. 3. powyżej.

D. Przygotowywanie protoplastów z grzybni wyhodowanej w glicynie.

1. Hodowlę prowadzono na trzęsawce w łaźni wodnej, w temperaturze 29°C, w ciągu około 65 godzin.

2. Grzybnię obserwowano pod mikroskopem fazowym przy powiększeniu 40x i zbierano w polipropylenową probówkę wirowniczą po wirowaniu przy około 1475 g, w ciągu 10 minut, w temperaturze 20°C.

3. Supernatant odrzucono a pastylki grzybni powtórnie zawieszono w 10 ml buforu dla protoplastów (P), opisanego poniżej. Pastylki homogenizowano 5-10 razy w urządzeniu do rozdrabniania tkanek w celu rozbicia kawałków.

4. Próbkę wirowano przy około 1000 g w ciągu 10 minut. Supernatant odrzucono a pastylki łagodnie zawieszono w 10 ml buforu P.

5. Powtórzono przemywanie.

6. Pastylki grzybni ponownie zawieszono w 10 ml świeżego roztworu 1,0 mg/ml lizozymu w buforze P, wyjałowionego drogą sączenia przez filtr o porach 0,22 mikrona.

7. Mieszaninę zawierającą grzybnię inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C, łagodnie wstrząsając w ciągu 60 minut. Próbki zawieszone w roztworze lizozymu obserwowano co 15 minut pod mikroskopem fazowym przy powiększeniu 40 X na obecność protoplastów.

8. Preparaty grzybni ucierano trzykrotnie za pomocą 5 ml pipety w celu uwolnienia protoplastów ze ścian komórkowych.

9. Preparaty przesączono przez wełnę szklaną lub nie absorbującą bawełnę.

10. Protoplasty odwirowywano przy około 1000 g w ciągu 7 minut, łagodnie zawieszono w 5 ml buforu P i obserwowano pod mikroskopem fazowym przy powiększeniu 40Χ.

11. Protoplasty odwirowywano jak powyżej i znów zawieszono w 1,0 ml buforu P. Sporządzono z tej zawiesiny rozcieńczenia w buforze P i wodzie destylowanej i nanoszono na płytki na podłoże regeneracyjne. Kolonie, które wyrosły z preparatów protoplastów rozcieńczonych wodą destylowaną przyjmowano za pochodzące z niecałkowicie lub zupełnie nie protoplastowanych zespołów grzybni.

12. Protoplasty zamrażano na lodzie w porcjach po 200-300 mikrolitrów w temperaturze -70°C. Po upływie 18-24 godzin próbki usuwano z lodu.

Fuzja protoplastów w glukolu polietylenowym (PEG) 1000.

. 1. Wszystkie opisane tutaj doświadczenia wykonywano stosując jedną szarżę PEG 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis. MO 63178), który wykazywał moło widoczną toksyczność w prowadzonych pracach.

2. Porcje po 1,0 g PEG autoklawowano w szklanych fiolkach, dodano 1,0 ml buforu P i PEG rozpuszczono ogrzewając fiolkę do temperatury 55°C, albo PEG odważano, rozpuszczano w buforze i bezpośrednio przed użyciem wyjaławiano drogą sączenia. Roztwory PEG stosowano w temperaturze otoczenia.

156 764

3. Protoplasty świeżo przygotowywano lub szybko rozmrażano w zamrożonej w temperaturze -70°C próbki za pomocą strumienia bieżącej wody. W przybliżeniu takie same ilości protoplastów z każdego genotypu przenoszono ostrożnie za pomocą pipety do poliwęglanowej probówki wirowniczej. W przypadku świeżo przygotowanych protoplastów mierzono zmętnienie i do fuzji stosowano kilka różnych stężeń. Objętość w każdej próbce doprowadzano buforem P do 5,0 ml.

4. Mieszaninę poddawaną fuzji wirowano w ciągu 7 minut przy około 1000 g.

5. Supernatant ostrożnie zdekantowano i pastylkę protoplastów delikatnie zawieszono powtórnie w buforze P w końcowej objętości wynoszącej 200 mikrolitrów.

6. Porcję 800 mikrolitrów 50% PEG dodano szybko do mieszaniny poddawanej fuzji, całość mieszano wciągając i wypuszczając z pipety pasterowskiej i inkubowano w ciągu 2 minut w pokojowej temperaturze. Dla rozcieńczenia PEG dodano 9 ml buforu P. Dodatkowe fuzje wykonywano seryjnie tak by okresy inkubowania były dokładnie odpowiednie.

7. Mieszaniny poddawane fuzji wirowano jak w etapie 4, supernatant zdekantowano starannie i przemyte protoplasty po dokonaniu fuzji zawieszano powtórnie w 1,0 ml buforu P.

8. Mieszaninę rozcieńczano seryjnie 10¹ i 10² razy w buforze P.

9. W każdym doświadczeniu wykonywano fuzję każdego pojedynczego szczepu i kontorlowano metodą płytkową.

10. Rozcieńczenia każdego preparatu protoplastów (zdolne do życia ilości) nanoszono na płytkę w celu oznaczenia ilości zdolnych do życia regenerantów każdego szczepu użytego w procesie wykonywania fuzji.

Regeneracja protoplastów.

1. Zawiesiny protoplastów, mieszaniny poddawane fuzji albo produkty fuzji rozcieńczano odpowiednio w buforze P i nanoszono w ilości 100 mikrolitrów na regeneracyjne podłoże agarowe, stosując technikę delikatnego nanoszenia. Nanoszenie produktów fuzji protoplastów na górne warstwy miękkiego agaru nie poprawiało w sposób znaczący ich regeneracji.

2. W razie potrzeby stosowano postępowanie opisane w etapie D. 11 opisanym powyżej.

3. Płytki w procesie regeneracji inkubowano w zamkniętych plastikowych naczyniach w temperaturze 29-30°C, przy wilgotności wynoszącej około 95%.

4. W przypadku fuzji protoplastów, w których oporność na spektynomycynę wykorzystywano jako dominujący wskaźnik selekcjonujący, regenerowane protoplasty nakładano z 3,5 ml roztworu 100 mikrogramów na ml spektynomycyny na miękki agar na okres 18 godzin, po czym autoklawowano i dodawano w temperaturze <45°C.

5. Protoplasty inkubowano w ciągu 7-10 dni. Pożywki wzrostowe, pożywki regeneracyjne i bufor dla protoplastów.

Kompletna pożywka regeneracyjna (zmodyfikowana pożywka według Hopwooda i wsp. Genetic Manipulation of Streptomyces:

A. Laboratory Manuał, str. 235/.

Podstawowy roztwór —

205 g 0,25 g

10,12g 10g 0,1 g 5,0 g 3,0 g

22,0 g do 955 ml

Autoklawować w ciągu 25 minut w temperaturze 121°C. Po autoklawowaniu dodać sterylny roztwór mieszaniny o składzie:

KH2PO4 (0,5%) 10 ml

CaCl₂ · 2HzO 5 ml

L-prolina (20%) 15 ml

Bufor MES (1,Om) Wml

Roztwór pierwiastków śladowych* 2,0 ml

NaOH (ln) 3,0 ml

Sacharoza

K2SO4

MgCL2-6H2O

Glukoza „Casamino acids Difco Wyciąg drożdżowy Difco Agar owsiany Difco Bacto Agar Difco Woda destylowana

156 764

Wartość pH doprowadza się do 6,5, rozcieńcza do 1 litra. * Roztwór pierwiastków śladowych (w litrze).

ZnCl2	40 mg
FeCls · 6H2O	200 mg
CuC12-2H2O	10 mg
MnCl2-4H2O	10 mg
Ν32Β40γ· 10H2O	10 mg
(ΝΗ4)βΜθ7θ24 · 4H2O	10 mg

Górna miękka warstwa agaru ze spektynomycyną. Skład taki sam jak kompletnej pożywki regeneracyjnej, ale: agar 4,10g

Autoklawuje się jak powyżej, ochładza do temperatury 55°C i dodaje 100 mg spektynomycyny. Porcje po 5 ml zamyka się w probówkach i zamraża. Autoklawuje się powtórnie przed użyciem.

Zmodyfikowany bufor dla protoplastów (P)

Podstawowy roztwór:

Sacharoza 205 g

K2SO4 0,25 g

MgCl2-6H2O 2,02 g

Destylowana woda do S>77 ml

Autoklawuje się w ciągu 25 minut w temperaturze 121°C, a następnie dodaje jałowe roztwory: KH2PO4 (0,5%) 1 ml

Roztwór pierwiastków śladowych * 2 ml

CaCl2-2H2O (3,68%) 10 ml bufor MES (1,0m) lOml * Skład taki sam jak uprzednio.

Doprowadza się pH do 6,5 i dopełnia objętość do 1 litra.

Zmodyfikowana pożywka zawierająca wyciąg drożdżowy i wyciąg słodowy (YEME).

Podstawowy roztwór
Wyciąg drożdżowy Difco	3g
Bacto-pepton Difco	5g
Wyciąg słodowy Bacto, Difco	3g
Glukoza	10g
Sacharoza	300 g
Destylowana woda do	973 n

Autoklawuje się w ciągu 25 minut w temperaturze 121°C, a następnie dodaje:

MgCli · 6H2O (2,5 m) 2 ml glycyna (20%) 25 ml

Objętość dopełnia się do 1 litra.

Figura 1 przedstawia wykres absorpcji w UV (przy 240 nm) w stosunku do czasu (w minutach) z chromatografowanych (HPLC) frakcji z ekstrakcji rozpuszczalnikiem komórek S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) z hodowli w pożywce nie zawierającej kwasów tłuszczowych (WSM SynA 40:40). Pik przy 13,12 odpowiada oligomycynie A. Fig. 2 wykres absorpcji w UV (przy 240 nm) z chromatografowanych frakcji (HPLC) t ekstrakcji rozpuszczlnikiem komórek S. avermitilis MA4848 (ATCC 31272) z hodowli w pożywce nie zawierającej kwasów tłuszczowych (WPM SynA 40:40). Produktami są naturalne awermektyny. Fig. 3 - wykres absorpcji w UV (przy 240 nm) z chromatografowanych (HPLC) frakcji z ekstrakcji rozpuszczalnikiem komórek S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) z hodowli w pożywce zawierającej kwas cykłopentanokarboksylowy (patrz przykład I).

Figury 1-3 odpowiadają dokładnie chromatogramom (HPLC) wskazanych związków.

Składy pożywek stosowanych w podanych poniżej przykładach są przedstawione poniżej. Wszystkie oznaczenia ciężaru cząsteczkowego wykonywano za pomocą spektrometrii masowej wykorzystującej bombardowanie szybkimi atomami, stosując spektrometr masowy VG Model

156 764

7070Ε i jako matrycę glikol trójetylenowy ze stałym chlorkiem sodowym. Oznaczano jon (M + Na) +. Spektrometrię masową ze wzbudzeniem elektronami wykonywano stosując spektrometr masowy VG Model 7070 F, który wykorzystywano tylko dla oznaczania wartości (m) e dla podstawowych fragmentów.

Pożywka AS-7

—	g/litr
Skrobia hydrolizowana3	20
Ardamine pHb	5
Pharmamediac	15
CaCO3	2
pG doprowadza się do 7,2 za pomocą NaOH

³ Preparowana drogą hydrolizy skrobii za pomocą alfa-amylazy z Bacillus hcheniformis (sprzedawanej przez firmę Novo Enzymes, Wilton, CT pod nazwą firmową „Termamyl) do zawartości dekstrozy 40+5%.

“ Z firmy Yeast Products., Inc., Clifton, NJ07012 ^c Z firmy Traders Protein, Memphis, TN 38 108

Pożywka AP-5 g/litr

Skrobia hydrolizowana 80

Ardamine pH 5

K2HPO4 1

MgSO4 · 7H2O 1

NaCl 1

CaCOa 7

FeSO4-7H2O 0,01

MnCl2-7H2O 0,001

ZnSO4-7H2O 0,001

Środek przeciwpienny P-2000 1 ml/litr

Wartość pH doprowadza się do 6,9 za pomocą 25% roztworu NaOH.

WPM Syn A 40:40 g/litr destylowanej wody

Skrobia hydrolizowana 40

Rozpuszczalna skrobia ziemniaczana 40

Kwas glutaminowy L0

Arginina 0,168

Cystydyna 0,084

Histydyna 0,069

Leucyna 0,798

Lizyna 0,297

Metionina 0,108

Fenyloalanina 0,168

Treonina 0,174

Tryptofan 0,048

Tyrozyna 0,192

K2HPO4 1,0

MgSO4-7H2O 1,0

NaCl 1,0

CaCOa 3,5

FeSO4-7H2O 0,01

MnCl2-H2O 0,001

ZnSO4-7H2O 0,001

156 764

Wartość pH doprowadza się do 6,8-7,0 i miesza w ciągu 30 minut w temperaturze 121°C. WPM Syn B 40:40 g/litr destylowanej wody

Skrobia hydrolizowana 40

Rozpuszczalna skrobia ziemniaczana 40

Kwas glutaminowy 0,390

Arginina 0J68

Cystydyna 0,084

Histydyna 0,069

Lizyny HC1 0,297

Metionina 0,108

Fenyloalanina 0,168

Treonina 0,174

Tryptofan 0,048

Tyrozyna 0,192

K2HPO4 1

MgSO4 · 7H,O 1

NaCl 1,

CaCO, 3,5

FeSO4-7H2O 0,01

MnCl2-4H2O 0,001

ZnSO4-7H2O 0,001

Wartość pH doprowadza się do 6,8-7,0 i miesza w ciągu 30 minut w temperaturze 121°C.

Ogólne zasady postępowania podczas wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej (HPLC).

Faza ruchoma: miesza się 150 ml wody i 70 ml acetonitrylu i dopełnia do 1 litra metanolem.

Kolumna: Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100); przepływ: 0,75 ml/minutę; detekcja: UV przy 240 nm; tłumienie: około 6.

Rozpuszczalnik dla próbek (D): mieszanina 35 ml acetonitrylu i 390 ml metanolu.

Standardy:

(1) odważa się 0,5 mg awermektyny A2a do 10 ml kolby i dopełnia do kreski metanolem;

(2) odważa się 0,5 mg testowanego produktu do 10 ml kolby i dopełnia do kreski metanolem; (1) i (2) są roztworami podstawowymi, z których sporządza się roztwór standardowy do chromatografii pobierając 100 mikrolitrów (1) i 100 mikrolitrów (2) i dodając w fiolce 800 mikrolitrów fazy ruchomej.

Próbki:

(1) pobiera się 1 ml dobrze wytrząśniętej brzeczki i wiruje ją, (2) usuwa się tak dużo supernatantu jak jest to możliwe, bez naruszenia pastylki, (3) dodaje się 100 mikrolitrów wody do HPLC do pastylki i miesza do otrzymania zawiesiny, (4) dodaje się 2 ml rozcieńczalnika (D) i dobrze miesza, (5) sączy się próbkę i poddaje chromatografii.

Naturalne awermektyny poddawano powyższej wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej i czasy retencji indywidualnych awermektyn dzielono przez czas retencji dla oligomycyny A, służącej w tych oznaczeniach jako standard wewnętrzny. Oligomycyna A jest prawie zawsze wykrywana za pomocą HPLC jako produkt uboczny fermentacji S. avermitilis i jest jedynym produktem wykrywanym przez HPLC, wytwarzanym przez opisane mutanty, gdy hoduje się je w pożywce nie zawierającej kwasów o wzorze RCOOH, w którym R ma znaczenie podane uprzednio lub związków ulegających przekształceniu w te kwasy. Czas retencji dla oligomycyny A wynosi typowo 12,5-14 minut. Stosunek czasów retencji (RT) stanowi lepszą podstawę dla porównywania identyczności i wydajności wytwarzanych awermektyn. Generalna kolejność pojawiania się awermektyn na chromatogramie (HPLC) jest następująca: B2, A2, BI i Al (patrz fig. 2).

156 764

Naturalna awermektyna R B2b B2a A2b A2a Bib Bla Alb Ala

Nienaturalne awermektyny cyklopentylo-b2 cyklopenzylo-A2 cyklopentylo-Bl cyklopentylo-Al

RT/RT/ oligomycyna A/

0,70

0,84

0,90

1,09

1,40

1,83

1,83

2,42 iy RT/RT/oiigomycyna A)

0,94 1,23 1,99 2,62

Stosunki RT/RT oznaczano na podstawie fig. 2 dla naturalnych awermektyn (Bla i Alb nie są rozdzielone) oraz z rysunku 3 dla nienaturalnych awermektyn. Czasy retencji różnią się o 1-2 minuty dla różnych dni, ale oligomycyna A pojawia się na ogół w czasie bliskim 12,5-14 minut.

Awermektyny w poniżej przedstawionych przykładach były oznaczane za pomocą powyżej opisanej HPLC.

Przykład I. Cyklopentyloawermektyna A2.

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) hodowano w temperaturze 28-30°C w pożywce AS-7, wstrząsając w ciągu 24 godzin. Porcję 5 ml stosowano do zaszczepiania 100 ml pożywki AS-7 w kolbie o pojemności 500 ml i całość inkubowano w takich samych warunkach w ciągu 24 godzin. Porcję 1 ml powyższej hodowli zaszczepiano 40 ml pożywki AP-5 w kolbie 300 ml, do której po upływie 24 godzin dodano 0,4g/litr soli sodowej kwasu cyklopentanokarboksylowego. Kolby produkcyjne wstrząsano w temperaturze 28-30°C. Po upływie 240 godzin otrzymano 35 mg/litr cyklopentyloawermektyny A2, natomiast miano odpowiedniej naturalnej awermektyny A2a wynosiło 0. Otrzymano także inne cyklopentyloawermektyny.

Przykład II. Cyklopentyloawermektyna A2.

Zamrożony w fiolkach S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) stosowano do zaszczepiania 100 ml pożywki AS-7, w 500 ml kolbie. Całość inkubowano w temperaturze 28-30°C, wstrząsając w ciągu 24 godzin. Porcjami po 1 ml zaszczepiano dwie dodatkowe kolby po 500 ml zawierające po 100 ml pożywki AS-7. Po 18 godzinach inkubowania hodowlą tą zaszczepiano 10 litrów pożywki AP-5 nie zawierającej chlorku sodowego. Po 24 godzinach inkubowania w temperaturze 28°C do pożywki dodano 0,4 g/litr kwasu cyklopentanokarboksylowego. Całość mieszano tak aby utrzymywać powyżej 20% nasycenia rozpuszczonego tlenu. Miano cyklopentyloawermektyny A2, w 120, 168, 216, 264 i 312 godzinie wynosiło odpowiednio 16, 40, 65, 88 i 110 mg/litr. Natomiast miano odpowiedniej naturalnej awermektyny A2a wynosiło w tych próbkach 0, to znaczy nie wykrywano jej.

Przykład III. Cyklopentyloawermektyna A2.

W niniejszym doświadczeniu stosowano wzbogaconą pożywkę i wielokrotne dodawanie kwasu cyklopentanokarboksylowego, w celu zwiększenia miana cyklopenytloawermektyny. Warunki otrzymywania inokulum i prowadzenia fermentacji były takie same jakie opisano w przykładzie II, z tym tylko, że dodano dodatkowo 5 g/litr preparatu Ardamine pH (razem 10 g/litr) do pożywki AP-5 oraz dodano także 0,4,0,2 i 0,2 g/litr kwasu cyklopentanokarboksylowego w 30, 172 i 220 godzinie. Miano cyklopentyloawermektyny A2 wynosiło odpowiednio 1,2, 11,78, 137 i 214 mg/litr w 120, 168, 216, 264 i 312 godzinie.

Przykład IV. Cyklopentyloawermektyny.

Zamrożony w fiolkach S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) stosowano do zaszczepiania 100 ml pożywki AS-7 w kolbach o pojemności 500 ml z łamaczami, które następnie inkubowano w ciągu 24-28 godzin w temperaturze 28-30°C. Porcję 1 ml tej hodowli stosowano do szczepienia 300 ml kolby zawierającej 40 ml pożywki AP-5 (nie zawierającej NaCl ale zawierającej 0,6 g/litr kwasu glutaminowego). Całość inkubowano w ciągu 96 godzin na trzęsawce w temperaturze 28-30°C, po czym dodano 0,4 g/litr soli sodowej kwasu cyklopentanokarboksylowego. Chromato22

156 764 grafia (HPLC) próbki z 216 godziny wykazywała obecność cyklopentyloawermektyn B2, A2, BI i Al o czasach retencji odpowiednio 12, 32, 15, 86, 25, 28 i 32,96 minut.

Przykład V. Cyklopentyloawermektyna A2.

W tym przykładzie S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) oraz S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) hodowano w identycznych warunkach. Stosowano trzy pożywki -AP-5, WPM syn A 40:40 oraz WPM Syn B 40:40. Zamrożoną hodowlę każdego szczepu stosowano do zaszczepiania 100 ml pożywki AS-7 w kolbach z łamaczami o pojemności 500 ml, które inkubowano w ciągu 24-26 godzin w temperaturze 28-30°C. Porcję 1 ml każdej hodowli stosowano do zaszczepiania kolb 300 ml zawierających każda po 40 ml jednej z trzech pożywek. Dla każdej pożywki stosowano po dwie kolby. Po 24 godzinach inkubowania w temperaturze 28°C i wstrząsania, do każdej kolby dodawano 0,4 g/litr soli sodowej kwasu cyklopentanokarboksylowego. Po 192 godzinach inkubowania oznaczano miano głównego produktu, cyklopentyloawermektyny A2 (tabela 1).

Tabela 1

Pożywka	Szczep S. avermitilis	Cyklopentyloawermektyna A2 mg/litr
AP-5	ATCC 53567	•29
	ATCC 53568	67
WPM Syn A 40:40	ATCC 53567	35
	ATCC 53568	115
WPM Syn B 40:40	ATCC 53567	38
	ATCC 53568	36

Przykład VI. Cykloheksyloawermektyny.

W tym przykładzie, 0,2 g/litr kwasu cykloheksanokarboksylowego dodawano po 96 godzinach inkubowania zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego. Pozostałe warunki były takie same jak opisano w przykładzie IV. W próbce z 240 godziny zidentyfikowano za pomocą HPLC cztery cykloheksyloawermektyny. Czasy retencji dla cykloheksyloawermektyn B2, A2, BI i Al wynosiły odpowiednio 14,84, 19,26, 31,46 i 41,14 minut.

Przykład VII. 3-cykloheksenyloawermektyny.

W tym przykładzie, zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego dodano po 96 godzinach inkubowania 0,2 g/litr kwasu 3-cykloheksenokarboksylowego. Pozostałe warunki były takie same jak opisano w przykładzie IV. W próbce z 312 godziny zidentyfikowano chromatograficznie (HPLC) kilka cykloheksenyloawermektyn. Czasy retencji wynosiły 12,88 (B2), 16,39 (A2), 27,37/28,36 (izomery BI) oraz 35,80 (37,13) izomery Al).

Przykład VIII. 3-tienyloawermektyny.

W tym przykładzie, zamiast kwasu cykopentanokarboksylowego dodano po 96 godzinach 0,05 g/litr kwasu tiofeno-3-karboksylowego. Pozostałe warunki były takie same jak opisano w przykładzie IV. W próbce z 312 godziny zidentyfikowano chromatograficznie (HPLC) cztery 3-tienyloawermektyny. Czasy retencji dla 3-tienyloawermektyn B2, A2, BI i Al wynosiły odpowiednio 6,96, 8,76, 13,8 i 23,5 minut.

Przykład IX. 1-metylotioetyloawermektyny.

Zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego, w tym przykładzie w 24 i 96 godzinie dodano odpowiednio 0,4 i 0,2 g/litr kwasu 2-metylotiopropionowego, pozostawiając pozostałe warunki z przykładu IV bez zmian. W próbce z 240 godziny wykryto za pomocą HPLC dwie 1metylotioetyloawermektyny. Czasy retencji dla 1-metylotioetyloawermektyn A2 i BI wynosiły odpowiednio 9,30, i 13,06 minut. Pasmo o czasie retencji ocenianym na około 7,2 minut wynurzające się z przegięcia w niewielkim paśmie 7,557 minut przyjmuje się za odpowiadające związkowi B2, zaś związek Al przyjmuje się za obecny w niewielkim paśmie przy 17,22 minut.

Przykład X. 2-pentyloawermektyny.

W tym przykładzie, zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego dodano po 96 godzinie 0,2 g/litr kwasu 2-metylowalerianowego. Pozostałe warunki były takie same jak opisano w przykładzie IV. W próbce z 312 godziny zidentyfikowano za pomocą HPLC cztery 2-pentyloawermektyny. Czasy retencji dla 2-pentyloawermektyn B2, A2, BI i Al wynosiły odpowiednio 12,88, 16,58, 31,90 i 41,92 minut.

Przykład XI. l-metylo-3-butenyloawermektyny.

W tym przykładzie, zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego dodano w 96 godzinie 0,2 g/I kwasu 2-mety!o-4-pentenowego, pozostawiając wszystkie inne warunki opisane w przykła156 764 dzie IV bez zmian. W próbce z 312 godziny zidentyfikowano cztery l-metylo-3-butenyloawermektyny za pomocą HPLC. Czasy retencji dla l-metylo-3-butenyloawermektyn B2, A2, BI i Al wynosiły odpowiednio 11,13, 14,78, 22,10 i 28,92 minut.

Przykład XII. 1-metylo-l-butenyloa\vei'mektyny.

W tym przykładzie, zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego dodano w 96 godzinie 0,2 g/litr kwasu 2-metylo-2-pentanowego. Pozostałe warunki były takie jak opisano w przykładzie IV. Wykryto za pomocą HPLC cztery 1-metylo-l-butenyloawermektyny w próbce z 312 godziny. Czasy retencji dla ^^i^c^et^yl^-^l-butenyloawermektyn B2, A2, BI i Al wynosiły odpowiednio 11,59, 14,93, 25,29 i 33,18 minut.

Przykład XIII. W tym przykładzie przedstawiono zastosowanie mutanta do wytwarzania naturalnych awermektyn pochodzących z L-waliny nie zawierających awermektyn wywodzących się z L-izoleucyny. Zawartość zamrożonej fiolki zawierającej S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) przeniesiono do 500 ml kolby z łamaczami zawierającej 100 ml pożywki AS-7, i następnie wstrząsano przy około 200 obrotach/minutę w ciągu około jednego dnia, w temperaturze 28-30°C. Porcję 1 ml tej hodowli stosowano do zaszczepiania 40 ml pożywki WPM Syn A 40:40 w kolbie o pojemności 300 ml, którą następnie inkubowano w temperaturze 28-30°C, w ciągu 24 godzin na trzęsawce. W tym czasie dodano porcję 4 ml wyjałowionego roztworu kwasu izomasłowego (zobojętnionego do pH 6-7 za pomocą NaOH) i inkubowanie kontynuowano, łącznie w ciągu 8 dni. Analiza chromatograficzna (HPLC) wykazała 4 główne pasma (nie licząc oligomycyny). W podobnym doświadczeniu, w którym kwas izomasłowy zastąpiono kwasem 2-metylomasłowym, obserwowano obecność czterech pasm odpowiadających awermektynom wywodzącym się z L-izoleucyny.

Przykład XIV. Powtórzono postępowanie z przykładu I, ale zamiast kwasu cyklopentanokarboksylowego zastosowano odpowiednie, podane w poniższym zestawieniu związki. Zestawiono także otrzymane z tych fermentacji związki o wzorze 1, w którym R² oznacza resztę oleandrozy a R, R1 i R³ są podane w tabeli 2.

Tabela 2

Związek nr	Primer	R	Produkt: RT/RT (oligomycyna A)
B2	A2	B,	A,
l	kwas 2-metylowalerianowy	pentyl-2	1	1,287	2,478	3,255
2	kwas 2-metyiopentenowy-4	4-pentyl-2	0,853	1,090	1,694	2,217
3	kwas 1-cykloheksenokarboksylowy	cykloheksenyl-1	0,785	1,021	1,665	2,179
4	kwas tiofeno-2-karboksylowy	tienyl-2		0,694	1,143	1,499
5	kwas furano-3-karboksylowy	furyl-3		0,705	1,095
6	kwas cyklobutanokarboksylowy	cyklobutyl	0,728	0,933	1,546	2,027
7	kwas cyklopentanokarboksylowy	cyklopentyl	0,960	1,236	1,970	2,568
8	kwas cykloheksanokarboksylowy	cykloheksyl	1,206	1,565	2,556	3,343
9	kwas cykloheptanokarboksylowy	cykloheptyl	1,465	1,923
10	kwas 3-cykloheksenokarboksylowy	cykloheksen-3-yl	1	1,273	2,125	2,780
11	kwas 2-metylotiopropionowy	1 -metylotioetyl	0,565	0,730	1,025	1,351
12	kwas tiofeno-3-karboksylowy	tienyl-3	0,539	0,639	1,069	1,388
13	hydroksymetylocyklopentan	cyklopentyl		identycznie jak dla 7
14	3-tiofenokarboksyaldehyd	tienyl-3		identycznie jak dla 12
15	kwas 3-cykloheksylopropionowy	cykloheksyl		identycznie jak dla 8
16	kwas 3-cyklopentylopropionowy	cyklopentyl		identycznie jak dla 7
17	hydroksymetylocyklobutan	cyklobutyl		identycznie jak dla 6
18	3-cykkope n ty Iop ropan ol-1	cyklopentyl		identycznie jak dla 7
19	cyklobutylometyloamina	cyklobutyl		identycznie jak dla 6
20	cyklobutanokarboksylan etylu	cyklobutyl		identycznie jak dla 6
21	kwas 2-(cyklobutylokarbonylo)-proplonowy	cyklobutyl		identycznie jak dla 6
22	2-(3-tiofenokarbonylo)propionian etylu	tientyl-3		identycznie jak dla 12
23	kwas 1-πletylocyklopropanokarboksy,lowy	1-metylocyklopropyl		1,236
24	kwas 2-metylopentenowy-2	2-pentenyl-2	0,812	1,091	1,923	2,253
			0,882	1,135
25	kwas furano-2-karboksylowy	furyl-2		0,709	1,146
26	kwas 5-metylotiofeno-2-karboksylowy	5-metylotienyl-2	0,533			1,514
27	kwas 1 -metylocyklopropanokarboksylowy	1-metylocyklopropyl		1,236
28	kwas cyklopropanokarboksylowy	cyklopropyl	0,802	1,048		2,236

Poniżej podano inne dane fizykochemiczne dla niektórych z powyżej wymienionych związków.

156 764

Związek Dane fizyko-chemiczne (A2) biały proszek; temperatura topnienia

135-140°C; ciężar cząsteczkowy 925; m/e 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219,

209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, i 87.

(Al) biały proszek; temperatura topnienia 120-124°C; ciężar cząsteczkowy 907; m/e 578, 303, 275, 257, 219, 191, 167,

145, 127, 113, 111, 95, i 87.

(B2) biały proszek; temperatura topnienia 110-112°C; ciężar cząsteczkowy 911; m/e 321, 303, 261, 257, 237, 219, 209,

191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, i 87.

(BI) biały proszek; temperatura topnienia 135-138°C; ciężar cząsteczkowy 893; m/e 303, 261, 257, 219, 191, 167, 145,

127, 113, 111, 95 i 87.

(A2) biały proszek; temperatura topnienia 112-117°C; ciężar cząsteczkowy 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331, 275, 365,

247, 237, 219, 207, 195, 179, 145, 127,

113, 111, 95 i 87.

(A2) biały proszek; temperatura topnienia 131-135°C; ciężar cząsteczkowy 951; m/e 624, 480, 347, 329, 275, 263, 245,

235, 217, 205, 193, 179, 145, 127, 113,

111, 95 i 87.

(A2) biały proszek; temperatura topnienia 167°C; ciężar cząsteczkowy 953; m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237,

219, 195, 145, 127, 113, 95 i 87.

Przykład XV. Wyodrębnianie cyklopentyloawermektyny A2.

W niniejszym przykładzie opisano proces wyodrębniania awermektyny typu A2 otrzymanej z fermentacji w obecności jako prekursora kwasu cyklopentanokarboksylowego. Całą brzeczkę z fermentacji podobnej do opisanej w przykładzie II przesączono i grzybnię ekstrahowano trzykrotnie trzema objętościami acetonu. Ekstrakt acetonowy zatężono i oleistąozostałość ekstrahowano chlorkiem metylenu. Roztwór w chlorku metylenu zatężono. Otrzymany ciemnbrązowy oleisty produkt rozpuszczono w mieszaninie 4:1 metanolu i wody i roztwór ekstrahowano heksanem w celu usunięcia kwasów tłuszczowych i lipidów. Roztwór metanolowo-wodny odparowano i otrzymano jasnobrązowy oleisty produkt zawierający około 10% wagowych cyklopentyloawermektyny A2. Surowy produkt rozcieńczono chloroformem (3 ml chloroformu na 1 g oleju), dodano 0,35 g/g oleistego produktu węgla aktywnego i lg/g oleistego produktu żelu krzemionkowego i całość mieszano w ciągu 1 godziny a następnie przesączono. Przesącz zatężono i oleistą pozostałość rozcieńczono eterem izopropylowym w proporcji 1 ml eteru na 1 g pozostałości. Otrzymany roztwór wkroplono do dużej objętości heksanu (25 ml heksanu na 1g oleistej pozostałości). Wytrącony biały osad surowej awermektyny odsączono. Przesącz ochłodzono do temperatury około 5°C w celu wytrącenia drugiej szarży. Surowy produkt poddano wysokorozdzielczej chromatografii cieczowej dla uzyskania oczyszczonego produktu. W tym celu surowy produkt rozpuszczono w mieszaninie 25:25:25:50:0,125 eteru izopropylowego, acetonitrylu, octanu etylu, heksanu i kwasu octowego (4,1 ml rozpuszczalnika na 1 g produktu). Próbki wstrzykiwano na preparatywną kolumnę o wymiarach 41,4 mm X 25 cm załadowaną żelem krzemionkowym i eluowano powyższą mieszaniną rozpuszczalników z szybkością 30ml/minutę. Frakcje zawierające produkt zebrano, zatężono i pozostałość rozcieńczono mieszaniną 86:14 metanolu i wody (1 ml na

156 764 około 50 mg produktu). Próbki następnie wstrzykiwano na kolumnę preparatywną C-18 (takie same wymiary jak powyżej) i eluowano 18-20 ml/minutę mieszaniny 275 ml wody i 1225 ml metanolu). Odpowiednie frakcje zatężono i przepuszczono drugi raz przez preparatywną kolumnę C-1-. Po odparowaniu do sucha odpowiednich frakcji otrzymano czysty tytułowy produkt.

Cyklopentyloawermektyny B2, A 1i B1 wyodrębniono z odpowiednich frakcji chromatograficznych z powyższych chromatografii.

Przykład XVI. Grzybnię S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) z hodowli w pożywce agarowej YPD-2 stosowano do zaszczepiania 50 ml pożywki AS-7 w 300 ml kolbie z łamaczami, którą wstrząsano (220 obrotów/minutę) w ciągu 24 godzin w temperaturze 30°C. Porcjami po 1 ml tej hodowli zaszczepiono 50 ml pożywki AP-5 w dwóch kolbach 300 ml bez łamaczy. W jednej kolbie znajdował się kwas 2-metylomasłowy (0,1 w) druga nie zawierała tego kwasu. Fermentację ze wstrząsaniem prowadzono w ciągu 11 dni, w temperaturze 30°C. Zawartość obu kolb przerabiano w taki sam sposób. Całą brzeczkę ekstrahowano czterema objętościami mieszaniny -10:75 acetonitrylu i metanolu. Po silnym wytrząsaniu dla ułatwienia ekstrakcji antybiotyku z komórek, klarowny supernatant analizowano za pomocą HLPC na zawartość awermektyn. W przypadku, gdy nie był dodawany jako prekursor kwas tłuszczowy, nie znajdowano dających się wykryć (czułość <0,20 mg/litr) ilości awermektyn (typu ,,a“). W obecności kwasu 2-metylomasłowego odnajdowano awermektyny B2a, A2a, Bla i Ala w ilościach wynoszących odpowiednio 0,5, 1,3, 1,4 i 1,1 mg/litr.

Przykład XVII. W tym przykładzie, prowadzono fermentację S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) w pożywce AP-5 zaszczepionej inokulum wyhodowanym w pożywce AS-7, tak jak w przykładzie XVI. Dodawano kwas 2-metylomasłowy w ilości 0,05%. Fermentacje kontrolne, do których nie dodawano kwasu tłuszczowego jako prekursora dały wartości 0,3, 0,9,<0,2 oraz <0,2 mg/litr odpowiednio dla awermektyn B2a, A2a, Bla i Ala, natomiast oznaczenia dla fermentacji, do których dodawano kwas tłuszczowy, wynosiły odpowiednio 2,8, 5,0, 4,5 i 2,3 mg/litr.

Przykład XVIII. W tym przykładzie, fermentację S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) w pożywce AP-5 prowadzono stosując do zaszczepiania inokulum wyhodowane na pożywce AS-7, jak w przykładzie XVII. Kwas 2-metylomasłowy dodawano w stężeniu 0,05% w 4- godzinie po zaszczepieniu, grzybnię odsączono, ważono na mokro i ekstrahowano czterema objętościami rozpuszczalnika. Takie postępowanie pozwalało na uzyskiwanie większej czułości podczas oznaczania awermektyn w stosunku do sposobu, w którym ekstrahowano całą brzeczkę bezpośrednio. Zawartość awermektyn B2a, A2a, Bla i Ala w fermentacjach prowadzonych z dodatkiem kwasu 2-metylomasłowego wynosiła odpowiednio 2,5, -,5, 4,5 i 3,5 mg/litr, natomiast w fermentacjach kontrolnych prowadzonych bez dodatku kwasu tłuszczowego odpowiednio 0,3, 0,3, 0,3 i 0,1 mg/litr. Tak niskie poziomy są najpewniej wynikiem małych zawartości endogennych kwasów tłuszczowych w surowej pożywce produkcyjnej AP-5.

Przykład XIX. Fermentacje prowadzono tak jak w przykładzie XVIII, ale zamiast kwasu 2-metylomasłowego dodawano 0,045% kwasu cyklopentanokarboksylowego. Stwierdzono obecność 4 mg/litr cyklopentyloawermektyny A2.

Przykład XX. W szesnastu kolbach o pojemności 300ml (bez łamaczy) zawierających po 50 ml pożywki AP-5 prowadzono fermentację S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) w temperaturze 30°C. Pożywkę zaszczepiano 1 ml hodowli tego szczepu prowadzonej w 50 ml pożywki AS-7, w ciągu 24 godzin, w temperaturze 30°C, w kolbie o pojemności 300 ml z łamaczami. Po 66 godzinach wzrostu w pożywce AP-5 do - kolb dodano 0,1% kwasu izomasłowego. Stosując postępowanie z przykładu XVI stwierdzono, że stężenie awermektyn B2b, A2b, Bib i Alb wynosiło (dla dwóch prób) odpowiednio 5,6, 45, 45 i 6- mg/litr. W hodowlach bez dodatku prekursora stwierdzono odpowiednio zawartości 0,5, 4,0, 4,5 i <-,5 mg/litr. Ponadto, stwierdzono obecność 1,1 i 1,1 mg/litr nie zidentyfikowanych związków oraz 0,2 mg/litr odpowiednich awermektyn B2a, A2a, Bla i Ala.

Przykład XXI. W tym przykładzie, prowadzono cztery fermentacje S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) w 2 ml pożywki AP-5 w plastikowych probówkach o pojemności 15 ml. Inokulant przygotowywano jak opisano w przykładzie XX, w pożywce AS-7 podczas wstrząsania w pozycji skośnej pod kątem 30°“. W 96 godzinie dodano jako prekursor 0,045% kwasu cykloheksanokarboksylowego (CHC) do dwóch probówek. Po upływie czterystu godzin od zaszczepienia pożywki

156 764

AP-5 za pomocą 0,05 ml hodowli w pożywce AS-7, do każdej probówki dodano 8 ml mieszaniny 810:75 acetonitrylu i metanolu i oznaczano miano awermektyn w supernatancie za pomocą HPLC. Stężenie (średnie z dwóch probówek) awermektyn CHC-B2, CHC-A2, CHC-A1, A2b, Bib, Alb, A2b i Ala wynosiło 3,5, 6,2, 3,0, 1,4,0,2, 0,2,0,4,0,2, <0,2mg/litr. Dla probówek, do których nie dodawano prekursora odpowiednie wartości wynosiły <0,2, <0,2, <0,2, <0,2, 4,2, 2,9, 9,3, 1,2 i 0,3 mg/litr. Wszystkie inne naturalne awermektyny były praktycznie niewykrywalne.

=-25,7

33,85

Fig.3

156 764

Fig.2

156 764

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 5000 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania awermektyny, znamienny tym, że szczep Streptomyces avermitilis nie wykazujący aktywności dehydrogenazy 2-ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu i/lub aktywności transaminazy aminokwasów o rozgałęzionym łańcuchu poddaje się fermentacji z napowietrzaniem w wodnej, odżywczej pożywce zawierającej przyswajalne źródło azotu, węgla i soli nieorganicznych oraz związku nadającego się do wykorzystania w biosyntezie awermektyny o wzorze R-COOH lub związku ulegającego przekształceniu w związek o wzorze R-COOH mającego wzór R-(CH2)n-Z, w których to wzorach R oznacza łańcuchową grupę α-rozgałęzioną, której atom węgla połączony z grupą -COOH lub z grupą o wzorze -(CH2)-n-Z jest również przyłączony do co najmniej dwóch innych atomów lub grup innych niż atomy wodoru, n jest 0,2,4 lub 6, a Z oznacza grupę -CH2OH, -CHO, -CH2NH2 lub grupę o wzorze -COOR⁵ lub o wzorze -CONHR⁶, w których to wzorach odpowiednio R5 oznacza atom wodoru lub grupę (C1-C6) alkilową a R6 oznacza atom wodoru, grupę (C1-C4) alkilową lub grupę -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH) (CH2)2COOH lub -CH(COOH) (CH2)2SCHs.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako związek nadający się do wykorzystania w biosyntezie awermektyny stosuje się kwas o wzorze R-COOH, w którym R oznacza grupę inną niż izopropylowa lub (S)-II-rz.-butylowa.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako S. avermitilis stosuje się szczep o numerze identyfikacyjnym ATCC 53567, ATCC 33568, ATCC 53669 lub ATCC 53670.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze R-COOH, w którym R oznacza rozgałęzioną w pozycji a grupę C3-Ce-alkilową, alkenylową, alkinylową, alkoksyalkilową lub alkilotioalkilową, grupę Cs-Cs-cykloalkiloalkilową, w której grupa alkilowa jest «-rozgałęzioną grupą C^-Co-alkilową. grupę C^^Ce^^^l^kf^alkilową, albo grupę C₅-Ce-cykloalkenylową, z których każda może być ewentualnie podstawiona grupą metylenową, albo jedną lub kilkoma grupami Ci-C4-alkiłowymi lub atomami chlorowca, albo R oznacza 3 do 6-członowy, zawierający tlen lub siarkę pierścień heterocykliczny, nasycony lub całkowicie albo częściowo nienasycony, który ewentualnie może być podstawiony jedną lub kilkoma grupami C1-C4alkilowymi lub atomami chlorowca.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się związek o wzorze R-COOH, w którym R oznacza grupę cyklobutylową, cyklopentylową, cykloheksylową, cykloheptylową, 2metylocyklopropylową,3-cykloheksenylową, 1-cyklopentenylową, 1-cykloheksenylową, 3-metylocykloheksylową cis lub trans, 4-metylenocykloheksylową, 3-mętylocyklobutylową, 3-metylenocyklobutylową, 3-cyklopentenylową, 1-cyklopropyloetylową, 3-fluorocyklobutylową, 4,4-dwufluorocykloheksylową, izopropylową, Il-rz.-butylową, 2-pentylową, 2,3-dwumetylopropylową, 2-heksylową, 2-pent-4-enylową, 2-metyloticetylową, S-2-metylopentylową, R-2-metylopentylową, tienylową, zwłaszcza 2-tienylową, 3-tienylową, 4-czterowodoropiranylową, 3-furylową, 2-chlorotienylową, 3-czterowodorotienylową, 4-metylotio-2-butylową, 4-czterowodorotiopiranylową, 4metoksy-2-butylową lub 4-metylotio-2-butylową.

   * * *