DD290214A5 - Verfahren zum herstellen von b-avermectinen und kulturen hierfuer - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von B-Avermectinen und Kulturen hierfuer. Staemme von Streptomyces avermitilis, denen die Dehydrogenase-Aktivitaet fuer verzweigtkettige 2-Oxosaeuren und die * fehlen; Verfahren zu deren Erzeugung und ihre Verwendung fuer die Herstellung natuerlicher und nicht-natuerlicher B-Avermectine, die als Mittel gegen Parasiten wertvoll sind.{Streptomyces avermitilis; keine Dehydrogenase-Aktivitaet fuer verzweigte 2-Oxosaeuren; keine * natuerliche und nicht-natuerliche B-Avermectine; Mittel gegen Parasiten}

Description

R-COOH

ableitet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Thienyl ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich R von einer Verbindung ableitet, die während des Fermentationsverfahrens in R-COOH umwandelbar ist, wobei diese Verbindung die Formel

R-(CH₂J_n-Z

besitzt, worin R wie voranstehend definiert ist, η 0,2,4 oder 6 ist, Z -CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH₂NH? oder-CONHR⁶ ist, wobei R⁴ (C₁^)-AlKyI ist, R⁵ Wasserstoff, (C₁^)-AlKyI, -CH(COOH)Ch₂COOK-CH(COOH) (CH^)₂COOH oder-CH(COOH) (CH₂)₂SCH₃ ist. 10. Verfahicn nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn R eine alpha-verzweigte C₃-C₈-Gruppe ist, sie nicht Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.

Anwendungsgebiet Her Erfindung

Diese trilndung bezieht sich auf Stämme von Streptomyces avermitilis, denen die Avermectin-B-O-Met.iyltransferase-Aktivität und die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettigo 2-Oxosäuren fehlen, auf Verfahren zum Herstellen dieser S. avermitilis und auf die Verwendung von S. avermitilis zur Herstellung natürlicher und nicht-natürlicher B-Avermectine.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die US Patente 4.310.519 und 4.429.042 beschreiben die Avermectine, einen Komplex miteinander verwandter Agentien mit starker Wirkung gegen Parasiten, und deren Herstellung durch aerobe Fermentation bestimmter Stämme von Streptomyces avermitilis, nämlich von S. avermitilis ATCC Nr.31267,31271 und 31272. Die beiden letztgenannten Stämme stellen Kulturen dar, die in einem Gläschen eingefroren bzw. in einem Rohrchen lyophilisiert wirden und durch ultraviolette Bestrahlung von S. avermitilis ATCC 31267 gewonnen worden waren.

Die EP 214.731, veröffentlicht am 18.März 1987, die der US-Patent-Anmeldung, Serial No.886.867 eingereicht am 16. Juli 1986, entspricht, offenbart eine Reihe von Verbindungen (die hier als nicht-natürliche Avermectine bezeichnet werden), die mit den natürlichen oder bekannten Avermectinen verwandt sind, aber in 25-Stellung eine neue Substituentengruppe besitzen, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung durch Fermentation eines Avermtctin produzierenden Organismus in Gegenwart bestimmter, spezifischer Carbonsäuren oder von Derivaten oder Vorläufern hiervon. Die S.avermitilis-Organismen, die zur Herstellung dieser neuen, C-25-substituierten Avermectine eingesetzt werden, sind S. avermitilis ATCC 31267,31271,31272 und NCIB 12121. Der letztgenannte Organismus, beschrieben in EP 214.731, wird aus S.avermitilis ATCC 31271 erhalten. Er liefert höhere Ausbeuten an den neuen C-25-substituierten Avermectinen, wenn er in einem halbdefinierten Medium kultiviert wird. Jeder der Stämme ATCC 31267,31271,31272 und NCIB 12121 kann außerdem zusätzlich zu den neuen C-25-substituierten Derivaten verschiedene Mengen der bekannten oder natürlichen Avermectine produzieren, in denen der 25-Substituent Isopropyl oder (S)-sec-butyl (1-Methylprcpyl) ist.

Das Kohlenstoffskelett der Avermectine (in Formel [I] unten angegeben) leitet sich von Acetaten und Propionaten ab, und der C-25-Substituent natürlicher Avermectine leitet sich von L-Isoleucin (R = (S)-sec-butyl) oder L-Valin (R = Isopropyl) ab (Fisher und Mrozik, „Macrolide Antibiotics", Academic Press 11984) Kap. 14).

Unter „bekannten" oder „natürlichen" Avermectinen sollen solche Avermectine verstanden werden, die von S.uvormitilis ATCC 31267, ATCC 31271 und ATCC 31272 produziert werden, wobei der Substiluent in 25-Stellung entweder Isopropyl oder (S)-sec-Butyl (1 -Methylpropyl) ist. Avermectine, in denen der Substituent in 25-Stellung ein anderer als Isopropyl oder sec-Butyl (S-Form) ist, werden in dieser Beschreibung als neue oder nicht-natürliche Avermectine bezeichnet. Die Stämme von S. avermltllls, die in den oben erwähnten US-Patenten genannt sind, produzieren eine Klasse von Verbindungen, die dort den Gattungsnamen („Generic") C-076 tragen. Die Klasse umfaßt achi unterschiedliche, aber eng verwandte Verbindungen, die als C-076-A1 b, -A1 b, -A2 a, -A2 b, -B1 a, -B1 b, -B 2 a und -B 2 b bezeichnet werden. Die „a"-Verbindungsreihe bezieht sich auf die natürlichen Avermectine, in denen der 25-Substituent (S)-sec-Butyl ist, und die „b"-Reihe auf diejenigen, in denen der 25-Substituent Isopropyl ist. Die Bezeichnungen „A" und „ES" beziehen sich auf Avermectine, in denen der 5-Substituent Methoxy bzw. Hydroxy ist. Schließlich bezieht sich die Ziffer „1" auf Avermectine, in denen in der 22-23-Position eine Doppelbindung vorliegt und die Ziffer „2" auf Avermectine, in denen in der 22-Position ein Wasserstoffatom und in der 23-Position Hydroxy gebunden vorliegt.

In dieser Anmeldung werden bezüglich des 25-Substituenten der nicht-natürlichen Avermectine solche Identifikationsmerkmale nicht verwendet. Die Identifikationsmerkmale A1, A2, B1 und B2 wurden beibehalten, um auf strukturelle Merkmale der nichtnatürlichen Avermectine zu verweisen, die denjenigen der natürlichen Avermectine entsprechen, wie oben angemerkt. Die Erzeugung von Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, wurde für Bacillus subtilis von Willecke und Pardee, J. Biol. Chem. 246,5264-72 (1971) und für Pseudomonas putida von Martin et al., J. Bacteriology, 115,198-204 (1973) beschrieben, aber nicht für Streptomyces.

Über S.avermltllls AgIy-I, einen mutanten Stamm, der faktisch nur die Avermectin-Aglycone A1 a und A2a produziert, wurde von Schulman et al., J. Antibiot. 38(11), 1494-1498 (1985) berichtet. Ebenfalls beschrieben wurde die Fermentation von S. avermitills AgIy-I in Gegenwart von Sinefungin, das eine erhöhte Produktion der Avermectin-Aglycon-B-Bestandteile verursachte. Ähnlich führte die Fermentation von S.avermitills 08, einem Stamm mit hoher Avermectin-Produktion, in Gegenwart von Sinefungin als Inhibitor der O-Methyl-Transferasen zur Produktion von Avermectinen ohne O-Methylgruppen am Aglycon in C-5-Position und an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe.

Das US-Patent 4.378.353 beschreibt mit C-076 verwandte Verbindungen und deren Herstellung durch Kultivation von MA-5218, einer Mutante von S.averm'iills ATCC 31272, die durch ultraviolette Bestrahlung daraus erhalten wurde. Die Mutante wird als ATCC 31780 identifiziert, üen dem C-076 verwandten Verbindungen, die diese Mutante produziert, fehlt der C-076-Furanring. Zusätzlich waren in einigen diessr genannten Verbindungen einer der oder beide Oleandrose-Zuckergruppen abgespalten, während in anderen die Gr'jppe in 5-Stftllung zu einer Keto-Gruppe oxidiert war.

Über drei Klassen von O-Methyltransferese-Mutanten von S. avermitilis, die Avermectine ohne O-Methyl-Gruppen produzieren, ist von Ruby et al., 6th International Symposium on the „Biology of Actinomycetes", Debrecen, Hungary, 26.-30. August (1985), und von Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31,744-7 (1987) berichtet worden. Die erste Klasse produziert vornehmlich B-Avermectine, da sie nicht in der Lage ist, die C-5-Hydroxylgruppe des macrocyclischen Lactonrings zu methylieren. Die zweite Klasse produziert 3'-O,-3"O-Bis-demethylavermectine (Avermectine, die in der 3-Stellung beider Oleandrose-Monosaccharidreste keinen O-Methyl-Substituenten tragen), die als Demethylavermectine bezeichnet werden. Die dritte Klasse kann in gar keiner Position methylieren.

Schulman et al., Fed. Proc. 44,931 (1985), offenbart eine erhöhte Produktion von B-Avermectinen durch Fermentieren von S. avermitilis in Gegenwart von Substanzen wie Sinefungin, S-Adenosylethionin und S-Adenosylhomocystein, die die Methylierung der C-5-Hydroxy-Gruppe der Aglycon-Einheit durch das Enzym Ayermectin-B-0-Methyltransferase inhibieren. Schulman et al. offenbart und bezieht sich in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29,620-624 (1986) auf Streptomycesavermitilis-Mutanten, die keine O-Methyltiansferase-Aktivität besitzen und erhöhte Mengen an Avermectin-B-Bestandteilen produzieren.

Die Mutaijsnese von S. avermitilis erzeugt Mutanten, der f. τ die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt. Die Mutanten besitzen in Abwesenheit einer zugesetzten v' rbindung RCOOH, worin R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, oder einer Verbindung, die sich während des Fermentationsverfahrons in RCOOH umwandeln läßt, nicht länger die Fähigkeit, nennenswerte Mengen an natürlichen Avermectinen zu produzieren. Überraschend und unerwartet konnte jedoch festgestellt werden, daß die Mutanten Avermectine, natürliche und nicht-nattrlic'io, produzieren, wenn sie in Anwesenheit einer zugesetzten Verbindung R-COOH, worin R Isopropyl oder (S)-sec Butyl oder eine andere, hier offenbarte Gruppe ist, oder eines Vorläufers für dieses RCOOH fermentiert werden. Noch erstaunlicher ist es, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen nur die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt und die L-Isoleucin, L-Leucin oder L-Valin nicht abbauen können, in der Lage sind, eine große Vielzahl von Verbindungen für den biosynthetischen Aufbau von Avermectin zu assimilieren und dabei nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, die von vorliegenden natürlichen Avermectinen frei sind.

Ziel und Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Mutagenese der so hergestellten, einfach blockierten Mutanten erzeugt Mutanten, denen sowohl die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren als auch die Avermectin-B-O-Methyltransferasa-Aktivität fehlen. Diese doppelt blockierten Mutanten produzieren überraschend und unerwartet im wesentlichen nur natürliche und nicht-natürliche B-Avermectine, wenn sie in Gegenwart einer zugesetzten Verbindung R-COOH, worin R wie oben definiert ist, kultiviert werden. Die natürlichen Avermectine werden, wie schon angemerkt, als komplexe Mischung von acht unterschiedlichen, aber nahe verwandten Verbindungen erzeugt; Formel (I), R = Isopropyl und (S)-sec-Bulyl. Während sie in im wesentlichen reiner Form isoliert wurden (siehe US Patent 4.429.042), ist das Herstellungsverfahren bestenfalls als mühsam zu bezeichnen. Die B-Avermectine besitzen im allgemeinen eine größere Aktivität als Antihelmintica als die A-Avermectine. Die Herstellung von nicht-natürlichen Avermectinen (der A- und B-Komponenten) nach dem Verfahren, das in der EP 214.731 beschrieben ist, kann wegen des Vorhandenseins der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und der Aminosäuren L-Valin und L-Isoleucin in der Zelle der Mikroorganismen S.avermitilis und im Medium, welche für ihre Herstellung eingesetzt werden, auch zu einigen der natürlichen Avermectine - in unterschiedlichen Mengen - führen.

Es ist ein wünschenswertes Ziel, nur die biologisch wirksameren B-Komponenten sowohl der natürlichen als auch der nichtnatürlichen Avermectine erzeugen zu können, um so dio Anzahl und die Komplexizität der Produkte möglichst klein zu halten und dadurch die Reinheit eines ausgewählten Avermectins zu steigern und dabei die Trennschritte zu vereinfachen. Stämme von S. avermitilis, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, werden durch Mutieren Avermectin produzierender Stämme von S. avermitllis erzeugt, und insbesondee durch Mutation von S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 oder NCIB 12121. Die Mutanten sind unfähig, die natürlichen Avermectine zu synthetisieren, es sei denn, man setzt die Fettsäure oder einen Vorläufer dafür, die/der die Isopropyl- oder sec-Butyl-Gruppe (S-Form) trägt, dem Medium zu, in dem die Mutanten fermentiert werden. Sie sind fällig, natürliche und nicht-natürliche Avermectine zu produzieren, wenn sie unter wäßrigen, aeroben Bedingungen in einem Nährmedium fermentiert werden, das eine geeignete Starter-Säure oder eine Verbindung enthält, die während des Fermentationsprozesses in diese überführt werden kann. Diejenigen Mutanten, die durch das Fehlen von Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren charakterisiert sind, werden auf der Grundlage einer ¹⁴CO₂-Bestimmung aus den mutierten Kolonien isoliert. In diesem Verfahren zeigt das Fehlen einer ¹⁴CO₂-Entwicklung aus 6inem Substrat aus [^MC-1 j-2-Oxoisocapronsäure oder [¹⁴C-I ]-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder (¹⁴C-I l-2-Oxo-3-methylbuttersäure durch permeacilisierte Zellen das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren auf.

Es war überraschend und unerwartet, daß die hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, ihre Fähigkeit zur Produktion von Avermectinen, insbesondere von nicht-natürlichen Avermectinen, behielten. Die Unfähigkeit der Mutanten, die natürlichen Fettsäure-Coenzym-A-Derivate zu produzieren, wenn sie auf einem gängigen Medium gezüchtet werden, hätte zu einer letalen Mutation führen können, wenn die Integrität der Membran von diesen Derivaten abhinge oder wenn die Akkumulierung von 2-Oxosäuren durch die erstgenannte Mutante Cytotoxizität zur Folge haben könnte. Man hatte darüber hinaus von den Mutanten nicht erwartet, daß sie in der Lage sein würden, Acetyl-CoA und Propionyl-CoA aus dem L-Isoleucin- und L-Valin-Katabolismus zu synthetisieren, da hierfür die Enzym-Aktivitätc-n notwendig sind, die den Mutanten fehlen. Der Bedarf an diesen Acyl-CoA-Dsrivaten für die Avermectin-Biosynthese, der oben erwähnt ist, führte zu der Erwartung, daß die Mutanten bezüglich der Produktion von nicht-natürlichen Avermectinen stark beeinträchtigt sein könnten, was überraschenderweise nicht der Fall war.

Das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren in den hier beschriebenen Mutanten führt dazu, daß die Synthese von verzweigtkettigen Acyl-CoA's aus dem Abbau von L-Isoleucin, L-Leucin und L-Valin blockiert wird, und damit auch die Synthese der natürlichen Avermectine, es sei denn, daß dem Fermentationsmedium eine Säure R-COOH (worin R (S)-sec-Butyl oder Isopropyl ist) oder ein Vorläufer dafür zugesetzt wird.

Weitere Mutation der Mangelmutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlen, erzeugt Mutanten, denen zusätzlich die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität fehlt. Mutanten ohne Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität können den C-5-Sauerstoff der Agylcon-Gruppe der Avermectine nicht methylieren. Mutanten, denen eine solche Aktivität fehlt, erzeugen im wesentlichen nur B-Avermectine unter Ausschluß der Bildung von A-Avermectinen.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch jedweden Organismus, ohne Ansehen seiner Erscheinungsform und seines physiologischen Verhaltens, der mittels Transformation, T'ansduktion, genetischer Rekombination oder eines anderen genetischen Verfahrens unter Verwendung einer Nukleinsäure oder eines äquivalenten Materials aus den hier beschriebenen Spezies gebildet wurde, wenn er dabei die Charakteristika der hier beschriebenen Mutanten angenommen hat. Die Ausdrücke „Avermectin" oder „Avermectine" beziehen sich, so wie sie hier gebraucht werden, auf Verbindungen mit der Formel (I) unten, in denen jedoch der 25-Substituent (R) eine beliebige Gruppe sein kann, die von den S. avermitilis-Stämmen dieser Erfindung für diese Stellung assimilierbar ist.

Die hier beschriebenen Mutanten sind für die Produktion von nicht-natürlichen B-Avermectinen durch die hier offenbarten und beispielhaft dargelegten Verfahren außerordentlich wertvoll. Sie sind insbesondere von Wert für die Herstellung bevorzugter Avermectine, d.h. von Verbindungen, in denen der C-25-Substituent C₄-C₆-Cycloalkyl oder -Cycloalkenyl, das fakultativ durch eine Ci-C₄-Alkylgruppe substituiert ist, 1 -Methylthioethyl oder eine 5- oder 6gliedrige, Sauerstoff oder Schwefel tragende heterocyclische Gruppe ist, insbesondere 3-Thienyl oder 3-Furyl.

Die Mutation eines Avermectine produzierenden Angehörigen der Spezies Streptomyces avermitilis wird nach bekannten Verfahren durchgeführt, wobei man eine Vielzahl von Mutationsauslösern verwenden kann, einschließlich Ultraviolett-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Methansulfonsäureethylester, salpetriger Säure und Stickstoff-Senfgas, z. B. N-Methylbis(2-chlorethyl)amin oder ähnliche Behandlungsverfahren. Die Mutagenese kann an Sporen oder an einer vegetativen Kultur von S. avermitilis, die natürliche Avermectine produzieren kann, durchgeführt werden, z.B. an S.avermitilis ATCC 31272.

Bei dem den Fachleuten gut bekannten Verfahren selektiert man die mutierten Kolonien auf das Fehlen der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren auf der Grundlage eines biochemischen Bestimmungsverfahrens, welches das Durchsuchen einer großen Anzahl zufällig mutierter bakterieller Kolonien auf eine ¹⁴C0₂-Produktion aus ausgewählten, verzweigtkettigen I¹⁴C-11-2-Oxosäuren erlaubt (Tabor et al., J. Bact. 128,486-486,1976).

Die Methode umfaßt das Züchten der Mutanten-Kolonien in den Schalen einer Mikrotiter-Platte auf einem geeigneten Nährmedium, das Permeabilisieren der Zellen mit Toluol und das anschließende Zusetzen von [¹⁴C-I )-2-0xosäure (z. B. 2-Oxoisocapronsäure) zu jeder Schale und das Untersuchen der Atmosphäre über der Kultur auf die Anwesenheit von '⁴CO₂. Alternativ kann anstelle von [¹⁴C-I ]-2-Oxoisocapronsäure [¹⁴C-I )-2-Oxo-3-methylvaleriansäure oder [¹⁴C-I |-2-Oxo-3-methylbuttersäure verwendet werden. Die Produktion von ¹⁴CO₂ wird bequemerweise gemessen, indem mit feuchtem Ba(OH)₂ gesättigtes Filterpapier oberhalb der einzelnen Schalen angebracht wird, um freigesetztes ¹⁴CO₂ aufzufangen, und das eventuell gebildete Ba¹⁴COa mittels Autoradiographie gefunden wird, Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, liefern Autoradiogramme, die denen der (nicht beimpften) Leerkontrollen annähernd gleichen; d.h. von diesen Mutanten wird kein zusätzliches Ba¹⁴CO₃ produziert

Die so erhaltenen Mutanten werden mit beliebigen der obengenannten Mutagene weiterer Mutagenese unterworfen. Mutierte

Kolonien werden mit Hilfe von Chromatographie (Dünnschicht- oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) auf das Fehlen von Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität untersucht, nachdem man sie in Gegenwart eines zugesetzten Vorläufers (z.B. 2-Methylbuttersäure) fermentiert hatte. Avermectin-A-Verbindungen sind in den Fermentationsbrühen solcher Mutanten im wesentlichen ni -ht vorhanden.

Zusätzlich zur Herstellung gewünschter AIIeIe eines gegebenen Stammes von Mikroorganismen durch Mutag9nese erlaubt die Protoplastenfusion das Einführen erwünschter AIIeIe, die von einem Stamm produziert/in einem Stamm identifiziert wurden, in das Chromosom eines anderen Stamms. Beispielsweise kann man aus einem Stamm von S. avermltills, dem die Dolv/drogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlen, durch Protoplastenfusion mit einem Stamm von S.avermitilis, der die vorgenannten Aktivitäten aufweist, einen Stamm von S.avor.nitilis erzeugen, dem nur die Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität fehlt. Wie die Fachleute wissen, ermöglicht die Protoplastenfusions-Technologie die Kombination erwünschter AIIeIe aus divergenten Selektionslinien in einem einzigen Stamm.

Die morphologischen Eigenschaften und das Verhalten der erfindungsgemäßen Mutanten in Kultur entsprechen im allgemeinen denjenigen, die im US Patent 4.429.042 beschrieben sind. Das unterscheidende Charakteristikum der erfindungsgemäßen Mutanten ist das Fehlen der Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und der Avermectin-B-O-Methyltransferase-Aktivität bei ihnen, und diese Charakteristika werden wie hier beschrieben bestimmt. Das Fehlen dieser Aktivitäten führt zur Unfähigkeit der Mutanten, beim Wachsen auf einem definierten Medium, das im wesentlichen frei von Fettsäuren RCOOH mit R gleich Isopropyl oder (S)-sec-Cutyl oder von Verbindungen ist, die während der Fermentation in dieses RCOOH umgewandelt werden können, die natürlichen B-Avermectine zu produzieren. Eine taxonomische Untersuchung, ausgeführt von der American Type Culture Collection, bestätigte, daß die Charakteristika des mutanten Stammes I-3, ausgewählt mittels des obenerwähnten ¹⁴CO₂-TeMs, eine enge Verwandtschaft zu denjenigen des elterlichen Stamms ATCC 31272 aufweisen, der im US Patent 4.429.042 beschrieben ist, jedoch mit bestimmten Ausnahmen. So bildet der mutante Stamm I-3 (ATCC 53567) signifikant weniger Sporenketten, als dies ATCC 31272 tut. In Experimenten der Anmelderin schien Raffinose das Wachstum von I-3 nicht zu unterstützen. Im Gegensatz zu der Beschreibung, die in der US 4.429.042 für ATCC 31272 gegeben wurde, konnten wir mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle kein Wachstum der Mutante oder von ATCC 31272 bemerken. Dar Mutante I-3 fehlt die Dehydrogenase -Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren. Die doppelt defizitäre, erfindungsgemäße Mangelmutante S. avermitiHs 7881, der die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlen und die durch weitere Mutation der Mutante I-3 (ATCC 53567) erzeugt wurde, besitzt eine ähnliche taxonomische Verwandtschaft mit ATCC 31272 wie der mutante Stamm I-3.

Streptomyces avermitiHs 1-3 und 7881 wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags in der American Type CuIt jre Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt, einer anerkannten Kulturenbank, die den Verbleib der hinterlegten Kulturen gewährleistet sowie leichten Zugriff der Öffentlichkeit auf diese, falls ein Patent auf diese Anmeldung erteilt wird. Ihnen wurden die Bezeichnungen Sireptomyces avermltilis ATCC 53567 bzw. ATCC 53692 gegeben. Die hinterlegten Kulturen sind einer Person, die vom Präsidenten des Patentamtes und des Warenzeichenamtes der Vereinigten Staaten besteilt wird, zugänglich, solange diese Anmeldung anhängig ist, und zwar gemäß 37 CFR 1.14 und 35USC 122, und in Übereinstimmung mit ausländischen Patentgesetzen von Ländern, in denen eine dieser Anmeldung entsprechende Anmeldung oder eine weiterführende Anmeldung eingereicht ist. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit der Mikroorganismen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich zurückgenommen, sobald das Patent erteilt ist.

Jededer Kulturen S.auermitllls ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 und NCIB 12121 produziert die natürlichen Avermectine, Verbindungen mit der Formel (I)

(D

CH.

worin die gestrichelte Linie in 22-23-Position eine fakultative Doppelbindung darstellt, R' Hydroxy ist und nur dann vorhanden ist, wenn die Doppelbindung fehlt, R² 4'-(alpha-L-0leandrosyl)-alpha-L-oleandrosyloxy mit der Formel

R³ Wasserstoff oder Methyl ist, und

R Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist. Das US Patent 4.285.963 beschreibt ein Avermectin mit der Formel (I), worin die 25-Stellung mit einer Methylgruppe und einer Ethylgruppe substituiert ist, R¹ Hydroxy ist und R³ Methyl ist.

In den nicht-natürlichen Avermectinen, auf die in dieser Schrift Bezug genommen wird, ist R ein Substituent, der nicht die Bedeutung Isopropyl oder (S)-sec-Butyl besitzt und der wie unten angegeben definiert ist.

Die Verbindungen, die für den Einsatz bei der Biosynthese der Verbindungen mit der Forme! (I) essentiell sind, sind in der Zelle von S. avermltills und im Medium vorhanden. Diese Verbindungen entstehen beim Abbau von L-Valin und L-Isoleucin oder aus den entsprechenden Oxosäuren davon via Decarboxylierung der 2-Oxosäuren durch die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren, gleichzeitig mit der Kopplung des Produkts an Coenzym A. Ihr Vorhandensein ist der Grund für die nebeneinander ablaufende Produktion sowohl der Isopropyl- als auch der (S)-sec-Butyl-Verbindungen mit der Formel (I). Hieraus entstehen natürlich P'obleme beim Trennen der Isopropyl· von den (S)-sec-Butyl-Derivaten.

Wenn sie in einem Nährmedium fermentiert werden, das die geeignete Starter-Verbindung enthält, produzieren die erfindurgsgemäßen Mutanten eine Verbindung mit der Formel (I) oder, wie es häufiger der Fall ist, eine Mischung von zwei oder mohr Verbindungen mit der Formel (I), worin R der eingesetzten Starter-Verbindung entspricht. Es können bis zu zwei Produkte gebildet werden, bequemlichkeitshalber mit Trivialnamen R-Avermectin B1 und B 2 genannt, entsprechend den im US Patent 4.429.042 verwendeten Bezeichnungen. Die „R"-Gruppe bezieht sich natürlich auf den C-25-Substituenten.

Beispielsweise sind, wenn R Cyclopentyl ist, die zwei möglichen Avermectine:

Trivial-Name R¹ R³

Cyclopentyl-

avermectin31 Doppelbindung H

Cyclopentv I-

avermectinB2 Hydroxy H

In den nicht-natürlichen Avermectinen ist der C-25-Substituent „ .1" in der Formel (I) ein anderer als Isopropyl oder (S)-sec-Butyl. Verbindungen mit der Formel (I), in denen die Doppelbindung vorliegt und OH fehlt, können alternativ durch eine Dehydrierungsreaktion aus den entsprechenden Verbindungen mit der Formel (I) hergestellt werden, in denen R¹ OH ist und die Doppelbindung fehlt. Die Reaktion wird durchgeführt, indem zuerst die Hydroxygruppen in 5- und 4"-Stellung selektiv geschützt werden, z. B. in Form des t-Butyldimethylsilyloxyacetyl-Derivats, dann mit einem substituierten Thiocarbonsäurehalogenid, zum Beispiel (4-Methylphenoxylthiocarbonsäurechlorid, umgesetzt wird und dann in einem Solvens mit hohem Siedepunkt, z. B. Trichlorbenzol, erhitzt wird, um die Dehydratati >n zu bewirken. Das Produkt wird schließlich von den Schutzgruppen befreit und liefert dabei die ungesättigte Verbindung. Diese Gchritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen, im US Patent 4.328.335 beschrieben.

Verbindungen mit der Formel (I), worin R¹ H ist und die Doppelbindung fehlt, können aus den entsprechenden Verbindungen, in denen die Doppelbindung vorliegt und R¹ fehlt, durch selektive katalytischo Hydrierung mit' lilfe eines geeigneten Katalysators hergestellt werden. Zum Beispiel kann man die Reduktion unter Verwendung von Tris(triph 3nylphosphan)rhodium(l)chlorid ausführen, wie in der Veröffentlichung der europäischen Patentanmeldung 0001689 und dem ihr entsprechenden US Patent 4.199.569, veröffentlicht am 22. April 1980, beschrieben.

Die Verbindungen mit der Formel (I), worin R* H ist, werden aus den entsprechenden Verbindungen hergestellt, in denen R² 4'-(alpha-L-Oleandrosyl)-alpha-L-oleantirosyloxy ist, indem man die 4'-(alpha-L-Olenndrosyl)-alpha-L-oieandrose-Gruppe durch milde Hydrolyse mit einer Säure in einem wäßrigen organischen Solvens entfernt und dabei das Aglycon mit einer Hydroxygruppe in der 13-Stellung erhält; dieses wird dann halogeniert, zum Beispiel durch Umsetzung mit einem Benzclsulfonylhaiogenid, wobei das 13-Desoxy-13-Halogen-Derivat entsteht, welches schließlich selektiv reduziert wird, zum Beispiel mit Tributylzinnhydrid. Um unerwünschte Nebenreaktionen zu vermeiden, ist es wünschenswert, andere Hydroxygruppen, die vorliegen können, zu schützen, zum Beispiel unter Verwendung einer tert.-Butyldimethylsilyl-Gruppe. Diese wird dann nach dem Halogenierungs- oder Reduktionsschritt durch Versetzen mit Methanol, das eine Spur Säure enthält, leicht abgespalten. All diese Schritte sind, zusammen mit geeigneten Reagentien und Reaktionsbedingungen für ihre Ausführung, in der europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr, 0002615 beschrieben. Die Verbindungen, die von den erfindungsgemäßen Stämmen von S. avermitilis für die Biosynthese von Avermectinen, natürlichen, und nicht-natürlichen, verwertet werden kennen, sind Verbindungen mit der Formel (H-A)

RCOOH (H-A)

einschließlich von Verbindungen, die während des Fermentationsprozesses in (H-A) überführt werden können. Diese Verbindungen werden hier als „Starter-Verbindungen" bezeichnet. In der Formgl (H-A) ist R eine alpha-verzweigte Gruppe, deren Kohlenstoffatom, an das die COOH-Gruppe gebunden ist, wiederum mit mindestens zwei weiteren Atomen oder Gruppen

verknüpft ist, die nicht Wasserstoff sind. Diese Definition umfaßt natürlich gesättigte und ungesättigte, acyclische und cyclische Gruppen einschließlich solcher, die fakultativ ein Schwefel- oder Sauerstoff-Heteroatom als Glied in der acyclischen Kette oder im cyclischen Ring tragen.

Spezifischer kann R, das zum C-25-Substituenten wird, eine alpha-verzweigte C₃-C₈-AIkVl, -Alkenyl, -Alkinyl, -Alkoxyalkyl oder -Alkylthioalkylgruppe, eine C^-Ca-Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine verzweigtketige C₂-C₅-Alkylgruppe ist, eine C^Cj-Cycloalkyl- oder Cg-Ca-Cycloalkenylgruppe, die beide fakultativ mit Methylen oder einer oder mehreren C₁-C, Alkylgruppen oder Halogenatomen (Fluor, Chlor, Iod oder Brom) substituiert sein können, oder ein 3- bis 6gliedriger, Sauerstoff oder Schwefel enthaltender, heterocyclischer Ring sein, der gesättigt oder ganz oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ durch eine oder mehrere Ci-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein kann.

Verbindungen, die im Fermentationsprozeß in RCOOH umwandelbar sind, d. h. Vorläufer, sind Verbindungen mit der Formel (H-B), worin R wie oben definiert ist:

R-(CH₂I_n-Z (H-B)_;

worinn 0,2,4OdOrOiStUHdZ-CH₂OH₁-CHO,-CH₂NH₂,-COOR⁴ oder-CONHR⁵ist, wobei R⁴Hoder(C,.₆)Alkyl ist, R⁵Wasserstoff, (C,_4)Alkyl oder der Rest einer Aminosäure ist, insbesondere von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Methionin, z. B.

-CH(COOH)Ch₂COOH₁-CH(COOH) (CH₂I₂COOH bzw.-CH(COOH) (CH₂J₂SCH₃.

Ebenfalls von dieser Erfindung eingeschlossen sind die isomeren Formen der Verbindungen mit der Formel (H-A) und Verbindungen, die während des Fermentationsvertahrens in diese umgewandelt werden können, und die am C-25 isomeren Avermectine, die infolge ihrer Verwendung im hier beschriebenen Verfahren entstehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem man einen Stamm s.avermitilis, dem die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Transferase-Aktivität fehlen, in einem wäßrigen Nährmedium aerob fermentiert, das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff, anorganische Salze und eine Verbindung mit der Formel RCOOH oder eine Verbindung enthält, die während der Fermentation in diese Verbindung umgewandelt werden kann (d.h. einen Vorläufer). Die Säure oder die Verbindung, die in diese überführt werden kann, wird der zu fermentierenden Kultur entweder zum Zeitpunkt des Animpfens oder in Intervallen während der Fermentation zugesetzt. Die Erzeugung der Avermectin-Produkte kann beobachtet werden, indem Proben aus der Fermentationsbrühe entnommen und mit einem organischen Solvens extrahiert werden und indem man das Erscheinen des Produkts mittels Chromatographie verfolgt, zum Beispiel unter Verwendung von Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die Ausbeute des Produktes maximal ist, im allgemeinen für einen Zeitraum von 4 bis 15 Tagen.

Eine bevorzugte Menge der jeweils zuzusetzenden Starter-Verbindungen (Carbonsäure oder Verbindung, die in diese umgewandelt werden kann) liegt zwischen 0,05 und 3,0 Gramm pro Liter. Die Starter-Verbindung kann kontinuierlich, intermittierend odsr auf einmal der Fermentationsbrühe zugesetzt werden. Die Säure (RCOOH) wird als solche oder als Salz zugesetzt, zum Beispiel als Natrium-, Lithium- oder Ammoniumsalz, oder in Form einer Verbindung, die sich in die Säure umwandeln läßt, wie oben definiert. Die Säure wird, wenn sie ein Feststoff ist, vorzugsweise in einem geeigneten Solvens wie Wasser oder (C,.₄)Alkoholen aufgelöst.

Die für die Fermentation verwendeten Medien können, insbesondere, wenn der C-25-Substituent Isopropyl oder (S)-sec-Butyl sein soll, gängige Medien sein, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente enthalten. Wenn der C-25-Substituent eine nicht-natürliche Gruppe sein soll, d. h. er r.icht Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist, dann ist das Formentationsmedium ein solches, in welchem unter den gev ählten Bestandteilen diejenigen Starter-Verbindungen fehlen oder nur in minimalen Mengen vorhanden sind, in denen die R-Giuppe Isopropyl oder (S)-sec-Butyl ist.

Nach mehrtägigem Fermentieren bei einer Temperatur im Bereich von vorzugsweise 24 bis 33°C wird die Fermentationsbrühe zentrifugiert oder filtriert, und der Mycelkuchen wird mit vorzugsweise Aceton oder Methanol extrahiert. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das gewünschte Produkt wird dann in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Solvens extrahiert, zum Beispiel in Methylenchlorid, Ethylacetat, Chloroform, Butanol oder Msthylisobutylketon. Der Solvens-Extrakt wird eingeengt, und das Rohprodukt wird, wenn notwendig, durch Chromatographie weiter gereinigt, zum Beispiel unter Verwendung von präparativer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (reverse phase HPLC).

Das Produkt erhält man im allgemeinen als Mischung der Verbindungen mit der Formel (I), worin R² 4'-(alpha-L-0leandrosyl)· alpha-L-oleandrosyloxy ist, R¹ OH ist und die Doppelbindung fehlt oder R¹ fehlt und die Doppelbindung vorhanden ist, und worin R³ H ist. Verbindungen, in denen R³ CH₃ ist, liegen im wesentlichen nicht vor. Die Anteile der einzelnen Verbindung können jedoch in Abhängigkeit von der jeweiligen Mutante, der eingesetzten Starter-Verbindung und den verwendeten Bedingungen schwanken.

Die Quelle für die R-Gruppe, d.h. ob diese direkt aus R-COOH stammt oder aus einem der obengenannten Vorläufer oder aus einem beliebigen Vorläufer gebildet wird, ist für die Produktion der Avermectine ohne Bedeutung. Das entscheidende Erfordernis des erfindungsgemäßen Verfahrens für ihre Herstellung ist, daß die gewünschte Gruppe R für die erfindungsgemäßen S. avermitills-Stämme im Fermentationsprozeß verfügbar gemacht wird.

Geeignete Verbindungen umfassen die folgenden:

2,3-Dimethylbuttersäure

2-Methylhexansäure

2-Methylpent-4-ensäure

2-Cyclopropyl-propionsäure

4,4-Difluorcyclohexancarbonsäure, Lithiumsalz

4-Methylencyclohexancarbonsä'jre

3-Methylcyclohexancarbonsäure(cis/trans)

1-Cyclopentencarbonsäure

I-Cyclohexencarbonsäure

Tetrahydropyran-4-carbonsäure

Thiophen-2-carbonsäure

3-Furansäure

2-Chlorthlophen-4-carbonsäure

Cyclobutancarbonsäure Cyclopentancarbonsäure Cyclohexancarbonsäure Cycloheptancarbonsaure

2-Methylcyclopropancarbonsäure

3-Cyclohexen1-carbonsäure

2-MethyUhiopropionsäure

2-Methyl-4-methoxybuttersäure

Thiophen-3-carbonsäure

Hydroxymethylcyclopentan

3-Thiophencarboxaldehyd

S-Cyclohexylpropionsäure

S-Cyclopentylpropionsäure

Hydroxymethylcyclobutan

Tetrahydrothiophen-S-carbonsäure

3-Cyclopenty 1-1 -propanol

S-Methylcyclobutancarbonsäure, Lithiu-nsalz

S-Fluorcyclobutancarbonsäure

S-Methyloncyclobutancarbonsäjre, Lithiumsalz

2-Methyl-4-methylthiobuttersäure

Tetrahydrothiopyran^-carbonsäure

Cyclobutylmethylamin

Cyclobutancarbonsäureethylester

4-Hydroxymethylcyclopenten

2-(3-Thiophencarbonyl)propionsäureethylester

(S)-2-Methylpentansäure

(R)-2-Methylpentansäure

Aus den hier beschriebenen, bezüglich der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren negativen Mangelmutanten können drei Klassen an O-Methyltransferase-Mutanten gewonnen werden. Mutanten, in denen eine Mutation der aktiven Oehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren mit einer oder mehreren O-Methyltransferase-Mutationen gekoppelt ist, ergibt Stämme von S.avermltilis, die, wenn sie mit RCOOH-Verbindungen oder Verbindungen gefüttert werden, welche während des Fermentationsprozesses in RCOOH überführt werden können, vorwiegend B Avermectine, Demethylavermectine oder Avermectine liefern, die überhaupt nicht methyliert sind. Dieso Mutanten erhält man durch Mutagenese der hier beschriebenen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, mit Hilfe von ultraviolettem Licht und/oder chemischen Mutagenen wie N-Methyl-N-Nitrosourethan, Nitrosoguanidin oder anderen Agentien wie den oben aufgezählten. Alternativ können bezüglich der Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren positive Mutanten, denen eine oder beide der O-Methyltransferasen fehlt/fehlen, durch Behandeln mit UV-Licht oder einem Mutagen mutiert werden, wobei man Dehydrogenase-Mangelmutanten füV verzweigtkettige 2-Oxosäuren erhält. Die nicht-natürlichen Avermectine, die von solchen Mutanten gebildet werden, sind dadurch gekennzeichnet, daß in C-5-Stel!ung der Aglycon-Einheit und/oder in C-3'- und/oder C-3"-Stellungen der Oleandrosegruppen Hydroxygruppen vorliegen. Die oben beschriebenen Mutanten werden nach dem Verfahren, das von Schulman et al.. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29,620-624 (1986) beschrieben wurde, identifiziert. Sie eignen sich in gleicher Weise für dieselben Zwecke wie die bekannten Avermectine.

Alternativ werden erhöhte Mengen der B-Avermectine einschließlich derer, denen Methyl-Gruppen an der Oleandrose-Disaccharid-Gruppe fehlen, durch Fermentieren der erfindungsgemäßen Mutanten, denen die Dehydrogenase-Aktivität für verzweigtkettige 2-Oxosäuren fehlt, in Gegenwart einer Substanz wie Sinefungin, S-Adenosylethionin oder S-Adenosylhomocystein hergestellt, welche die O-Methyl-Transferase-Aktivität inhibiert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind hochaktive Mittel gegen Parasiten und besitzen besonderen Wert als Antihelmintica, Ektoparasitizide, Insektizide und Acarizde.

So sind die Verbindung bei der Behandlung einer Vielzahl von Zuständen wirksam, die durch Endoparasiten verursacht werden, einschließlich insbesondere von Helminthose, die am häufigsten von einer Gruppe parasitärer Würmer verursacht wird, welche als Nematodon beschrieben wurden, und die schwere ökonomische Verluste bei Schweinen, Schafen, Pferden und Rindvieh verursachen sowie Haustiere und Geflügel befallen können. Die Verbindungen wirken auch gegen andere Nematoden, die verschiedene Tierspezies befallen können, einschließlich beispielsweise Dirofilaria in Hunden und verschiedene Parasiten, die Menschen infizieren können, worunter auch gastrointestinale Parasiten wie Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinelle, Capillaria, Trichuris, "!nterobius und Parasiten fallen, die im Blut oder in anderen Geweben oder Organen gefunden werden, z.B. Fadenwürmer und die extraintcstinalen Stadien von Strongyloides und Trichinella.

Die Verbindungen sind außerdem bei der Behandlung von Ectoparasiten-Infektionen von Wert, wobei insbesondere arthropode Ektoparasiten von Tisren und Vögeln eingeschlossen sind, z.B. Zecken, Milben, Läuse, Fliegen, Schmeißfliegen, saugende insekten und wandernde Zweiflügler-Larven, die Rindvieh und Pferde befallen können.

Die Verbir düngen sind auch Insektizide, die gegen Ungeziefer wirksam sind, z. B. gegen Küchenschaben, Kleidermotten, Teppichkäfer und Hausfliegen, und sie sind auch nützlich hei der Bekämpfung von Insekten-Schädlingen in gelagertem Getreide und landwirtschaftlichen Pflanzungen, z. B. von Blattspinnmilben, Blattläusen, Raupen und bei der Bekämpfung von wandernden Geradflüglern, ?. B. von Wanderheuschrecken.

Die Verbindungen mit der Formel (I) werden in liner Darreichungsform verabreicht, die dem spezifischen, ins Auge gefaßten Zweck und der jeweiligen Spezies des tierischen Wirts, der behandelt werden soll, und dem betreffenden Insekt angepaßt ist. Für die Verwendung als Antihelmintica können die Verbindungen ornl in Form einer Kapsel, eines Bolus, einer Tablette oder eines

flüssigen Arzneitranks verabreicht werden, oder sie können alternativ durch Injektion oder als Implantat gegeben worden. Solche Formulierungen werden der tierärztlichen Standardpraxis gemäß auf übliche Woiso hergestellt. So können Kapseln, BoIi oder Tablmten hergestellt werden, indem man den aktiven Bestandteil mit einem geeigneten, fein verteilten Verdünnungsmittel oder Träger vermischt, wobei zusätzlich ein den Zerfall förderndes Mittel und/oder ein Bindemittel enthalten sein kann, z. B. Stärke, Lactose, Talcum, Magneslumstearat etc. Eine Arzneitrank-Formulierur 9 kann man herstellen, Indem man den aktiven Bestandteil zusammen mit Dispersions· oder Netzmitteln etc. in elnor wäßri(ion Lösung dispergiert, und injiziorbare Formulierungen können in Form einer sterilen Lösung bereitet werden, dio ai<>Joro Substanzen enthalten kai. 'oispiolswoiso ausreichend Salzo und Glucose, um die Lösung mit Blut isotonisch zu machen. Diese Formulierungen werden bezüglich der Einwaage an aktiver Verbindung in Abhängigkeit vom zu behandelnden Wirtstier, von der Schwere und Art der Infektion und dom Körpergewicht des Wirts schwankon. Im allgemeinen wird für die orale Verabreichung eino Dosis von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Körpergewicht des Tieres ausreichen, die als einzelne Dosis oder in geteilten Dosen über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen dargurelcht wird, aber 63 können natürlich Umstände eintreten, in denen höhoro oder niedrigere Dosierungsberoiche angezeigt sein werden, und auch diose liegen im Rahmen dieser Erfindung,

Alternativ können die Verbindungen mit dem Tierfutter verabreicht werden, und für diesen Zweck kann man einen konzentrierten Futtorzusatz odor eine Vormischung herstellen, die mit dem normalen Tierfutter vermischt worden kann, rür den Einsatz als Insektizide und für die Behandlung von landwirtschaftlichen Schädlingen werden dio Verbindungen in Übereinstimmung mit der landwirtschaftlichen Praxis in Form von Sprays, Stäubemitteln, Emulsionen und ähnlichem angewendet.

Erzeugung von S.avermitills 1-3 (ATCC 53567)

Schritt 1. S.avermitills ATCC 31272 wurde auf New Patch Agar Medium 12 Tage lang bei 3O⁰C gezüchtet, bis ein konfluenter Rasen entstanden war. Üas Medium enthielt

V-8-Saft·	200 ml
CaCOi	3 Gramm
Agar	15Gramm
H2O ad	• 1000 ml
Nährbrühe	1,0Gramm/l
Natriumacetat χ 3H2O	1,4 Gramm/l
Isovaleriansäure	50 mg/1
Isobuttersäure	50 mg/1
2-Methylbuttersäure	50 mg/1
Isoleucin	250 mg/1
Leucin	250 mg/1
Valin	250 mg/1
Spuronelement-Lösung*·	1ml/l

' Eine Mischung auo 8 Gemüsesäften (Tomato, Karotte, Sellerie, Rote Beete, Petersilie, Lettich oder Kopfsalat, Brunnenkresse und Spinat) plus

SaUe, Asco, bin· und Zitronensäure und natürliche Aromastoffe. Zu beziehen von Campbell Soup Company, Camdon, NJ. ·· Zusammensetzung der Spurenelement-Lösung:

FeCI₃XSH₂O 2,7 g

. MnSC₄XH₂O 4,2

CuSC₄ x 5H₂O 0,5

CaCI₂ 11,0

H₃BO₃ 0,62

CoCI₂ x 6H₂O 0,24

ZnCI₂ 0,68

Na₂MoO₄ 0,24

Die obige Mischung ist in 1 Liter 0,1 N HCI zu lösen.

Von dreien solcher Platten wurden Sporen geerntet und in 20 ml 0,05 M Tris-Maleinsäuropuffer, pH 9,0, suspendiert.

Schritt 2.10 ml der Sporen-Suspension wurden ^;,i ein Gefäß gegeben, das 10 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) enthielt. Das Gefäß wurde bei 28°C 60 Minuten lang inkubiert undgeschüttelt, und dann wurden die Sporen aucgiebig mit 1%iger NaCI-Lösung gewaschen.

Schritt 3. Die gewaschenen Sporen wurden in 1%iger NaCI suspendiert und mit dem gleichen Volumen an 80%igemEthylenglycol gemischt. Man konservierte diese Suspens on bei -20°C und verwendete sie als Ausgangsmaterial für Zellen, die auf Mutanten untersucht werden sollten. Das ergab beim Aussäen etwa 10⁴ Kolonien/ml.

Diese Sporen-Stammlösung wurde auf YPD-Platten aufgebracht und ergab dabei annähernd 100 Kolonien pro Platte (YPD-Medium enthält jeweils 10g/l Hefeextrakt, Bacto-Pepton· und Dextroseundlög/IBacto-Agar», vordem Autoklavieren auf pH6,9 eingestellt). Die mit einem Sternchen versehenen Inhaltsstoffe sind von Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238 zu beziehen.

Schritt 4. Einzelne Kolonien wurden nach zwei- bis dreiwöchigem Wachstum bei 28°C von den Platten genommen und in einzelnen Schalen einer Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Schalen überführt. Außerdem wurde ein kleiner Teil der Kolonie auf ein frisches Agar-Medium aufgebracht, der als Quelle für lebensfähige Zellen dienen sollte, wenn die Mutanten identifiziert waren.

Schritt 5. In jede Schale gab man annähernd 75 Mikroliter einen flüssigen M 9-Salz-Mediums, das 1 % Glucose, 0,1 % Casaminosäuren und jeweils 0,01 % Isovaleriansäure, Isobuttersäure und 2-Methylbuttersäure enthielt. Nach einigen Tagen der Inkubation boi 28°C wurden die Zellen auf das Vorhandensein von Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren überprüft.

(Jeweils ein Liter M9-Salz-Medium enthält 6g Na₂HPO₄,3g KH₂PO₄,0,5g NaCI und 1 g NH₄CI. Das Medium wird autoklaviert und dann werden aseptisch jeweils 1 ml sterilisiertes 1M MgSO₄ und 0,1 M CaCI₂ zugesetzt).

Schritt β, Eino Mlkrosusponslonaus 6%Toluol in M9-Salz-Medium wurde durch oino kurzo Behandlung mit Ultraschall der nicht

mischbaren Mischung hergestellt. Zu 25ml dieser Suspension setzte man 1,2 ml oinor Lösung zu, dio |"C-1]-2-

Oxoisocapronsa°uro,2,5 Mlkrocurio/ml und 10,0 Mlkrocurie/Mikromolenthlolt.&O Mikroliterdiosorgosnniton Mischung wurdo in

jode der Schalen der Mikrotltorplatten gegeben, die dio zu untersuchenden Kolonion enthielt.

Schritt 7. Das '⁴CO₂, das in joder Schalo produziert wurdo, wurdo mifgofangon und nach dom von Tabor ot a'. J.Boctorlol.128

485-486 (1976) unter dem Titol „Convonlont Mothod for Dotocting '⁴CO₂ in MuItIpIo Samplos: Application to Rapid Scrooning for

Mutants" boschriobenon Vorfahren sichtbar gemacht. Mangelmutanten, denen die aklivo Dohydrogenaso für veizweigtkettigo

2-Oxosäuron fehlt, produzieren nicht mohr Bo¹⁴COj als das, das man boi den Kontrollen boobachtet.

Ein verfeinertes Vorfahren, das den Unterschied zwischen einom positiven Test auf '⁴CO₂, ersichtlich aus oinom dunklon Flocken

auf dom Autoradiogramm als Folge der Oa^t4COa-Bildung, und einom negativen Test, ersichtlich daraus, daß kein Fleck oder nur oinsohr schwacher Flock erscheint, verbessert, umfaßt das folgende, modifizierte Tostvorfahron.

Einzelne Kolonien (siehe Schritt 4 oben) wurden nach 7-14 Tagen des Wachstums vom Agar-Medium abgenommen (ohor als

nach 2 bis 3 Wochen) und direkt mit Hilfo der Schritte 6 und 7 untersucht. Der obengenannte Schritt S entfällt.

Ein noch stärker verfeinertes Untersuchungsverfahren, das die ^l4CO₂-Froisotzung quantitativ erfaßt, umfaßt das Züchten der Mutanten, die mktels der obengenannten Tests gefunden wurden, auf einem goeigneten Medium, das M 9-Salz-Medium mit Glucose, 1%ig, u.. j „Syncusa-bcaa" O, l%ig, enthält (oino synthetische Mischung von (.-Aminosäuren mit der angonähorton ZusammensetzungkommerziellorCasaminosäuron.aberohnedaßL-Valin.L-lsoleucinundL-Loucin vorhanden ist, siohe'jnten). Nachdem man sie bis zu hoher Zelldichte wachsen ließ, werden die Zellen in M9-Salz-Modium gewaschen und in kaltem, 1 % Toluol enthaltendem M9-Salz-Medium rosuspondiert, das mit Ultraschall bohandelt worden war, um eine milchig weiße Dispersion desToluols zu erzielen. Dio Zollon/Puffor/Toluol-Suspension wurde 40 Minuten It nc bei 3O⁰C inkubiert, um die Zellen

zu permeabilisieren. Die permeabilisierten Zellen wurden dann in M9-Salz-Medium gewaschen und schließlich in oinam Fünfteldes ursprünglichen Volumens an M9-Medium-Puffer resuspendiort. 180 Mikrolitor dieser Suspension wurden pro Gestimmungverwendet.

Ein Roaktionsvolumon von 300 Mikroliter enthielt die mit Toluol behandelton Zellen, 0,4 mM Thiamin Pyrophosphat ί ι HP),

0,11 mMCoenzymA(CoA),0,68mMNicotinamid-Adonin-Dinucleotid,2,6mMDithiothreitol(DTT),4,1mM MgCI₂,6OmM Tris-HCImit pH7,5 und 6,000cpm [^<4C-1-]alpha-Kotoisocaproat, Mikrocurie pro Mikromol. Die Zählausbeute betrug 73%. Die Reaktionwurde in 15ml fassenden Scintillationszählergefäßen durchgeführt, dio ein 2 cm χ 2 cm großes Whatman# 4-Papierquadrat enthielten, das in dio Schraubkappe der Gefäße gedruckt war. Das Papier enthielt 30 Mikroliter 1M

Hyaminhydroxid (1M Lösung aus Mothylbenzothoniumhydroxid in Methanol, zu beziohen von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO63178), das während der Reaktion freigesetztes '⁴CO₂ auffängt. Nach 2stündigem Inkubicren wurden die Papierchen in 10ml Beckman Aquasol Il (Universal LSC (Flüssigkeitsscintillationszähler), das von New England Nuclear Research Products, Boston, MA02118 bezogen werden kann), eingetaucht, und dio Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeitsscintillationszähler gemessen,

nachdem man sie in diesem Solvens mindestens 4 Stunden lang äquilibriert hatte. Eine Reaktionsmischung der Lecrkontrolle(d.h. keine Zellen) orgibt ca. 50-30OcPm.

Die Mutante I-3 und andere ergab Impulszahlen, dio niedriger als oder gleich groß wie die der Lenrkontroll-Reaktionsmischung

waren, während der elterliche Stamm eine Zahl von Impulsen ergab, die mehrfach höher als der Wert für die Leerkontrolle war.

Zusammensetzung von „Syncasa-bcaa , luOlaches Konzentrat	Gramm/Liter
	3
L-Alanin	4
L-Arginin	6
L-Asparaginsäure	1
L-Cystin	20
L-Glutaminsäure	1
Glycin	2
L-Histidin	7
L-Lysin	3
L-Mettvonin	6
L-Phenylalanin	10
L-Prolin	6
L-Serin	4
L-Threonin	4
L-Tyrosin	1
L-Tryptophan

Die Mischung wird auf pH 7 eingestellt und filtrationssterilis'ert. Ein Volumenteil des Konzentrats wird zu 99 Volumenteilen Medium zugesetzt, um die Konzentration für Standardbedingungen zu erzielen.

Erzeugung doppelt blockierter Mutanten von S. avermitilis 78b 1 (ATCC 53692), denen die Dehydrogenase für verzweigtkettige 2-Oxosäuren und die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlt

Schritt 1.S.avermitillsATCC53567wurdeaufNewPatch Agar Medium 12 Tagelang bei30°Cgezüchtet, bisein konfluenter Rasen

entstanden war.

Von dreien solcher Platten wurden Sporen geerntet und in 20 ml 0,05 M Tris-Maleinsäurepuffer, pH 9,0 suspendiert. Schritt 2.10ml der Sporen-Suspension wurden in ein Gefäß gegeben, das 10mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG)

enthielt. Das Gefäß wurde bei 28°C 60 Minuten lang inkubiert und geschüttelt, und dann wurden dio Sporen ausgiebig mit 1%iger

NaCI-Lösung gewaschen.

Schritt 3. Die gewaschenen Sporen wurden in 1%iyor NaCI suspendiert und mit dem,ileichen Volumen an 80%igemEthylenglycol gemischt. Man konservierte diese Suspension bei -20⁰C und vorwendete sie als Au&gangumaterial für Zellen, die auf Mutanten untersucht werden sollten.

Diese Sporen-Stammlösung wurde auf YPD-Platten aufgebracht und ergab dabei annähernd 100 Kolonien pro Platte. Kolonien der mutierten Population (die mit Nitrosoguanidin behandelt war) vom Stamm Streptomyces avermitllls I-3 (ATCC 53567) worden abgenommenund auf ein Agar-Medium verteilt aufgegeben, das wie folgihergestellt war (Gramm pro Liter): Verflüssigte Stärke,80,K₂HPO₄,1,MgSO₄ x 7H₂0,1,ArdaminpH,5,CaCO₃,5,P-2000,1ml,FeSO₄ χ 7H₂0,0,01,MnCI₂ χ 4Η₂Ο,0,001, ZnSO₄ χ 7 H₂0,0,001, Bacto-Agar, 17, destilliertes Wasser ad 980ml. Der pH wird mit NaOH auf 7,0 eingestellt, bevor bei 121⁰C 20 Minuten lang autokloviert wird. Nach dem Autoklavieren werden 20ml einer sterilen 5%igen Stammlösung von (±)-2-Methylbuttersätire, pH 7,0, zugesetzt.

Die Agar-Kulturenwerden8bis 12 Tage bei 28⁰C inkubiert.Zellen(Mycelien) werden vonderAgar-Oberfläche abgenommen und in 250 Mikroliter Aceton gegeben. Fünfundzwanzig (25) Mikroliter des Acetonoxtrakts werden dann auf mit Analtech Silica Gel GF vorbeschichtete Dünnschicht-Platten aufgetragen. 30 bis 40 Minuten lang wird mit Ethyiacetat als Solvens chromatographiert, dann wird das Chromatogramm getrocknet und mit 3% Vanillin in Ethanol besprüht, Die P! Wen werden 1 bis 3 Minuten lang in einen 100⁰C heißen Ofen gestellt und dann mit 3% Schwefelsäure in Ethanol besprüht, und dann werden sie nochmals 10 bis 15 Minuten lang in einen 100°C heißen Ofen gegeben. Mutanten, denen die Avermectin-B-O-Methyltransferase fehlt, werden anhand einer Änderung im Muster des Chromatogramms identifiziert, d.h. die Flecken, die den Avermectin-B-Komponenten entsprechen (Ri ca. 0,54 bzw. 0,42 für B1 bzw. B2) sind nach wie vor vorhanden, aber es fehlen die Flecken, die den Avermectin-A· Komponenten entsprechen (Ri ca. 0,69 und 0,58 für A1 bzw. A2).

Allgemeines Verfahren für die Hochleistungs-Flüssigkeltschromatographie (HPLC) Mobile Phase: 150ml Wasser 70ml Acetonitril ad1 Liter mit Methanol bringen Säule:

Ultrasphere ODS 25cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100) Flußrate: 0,7öml/Minute Detektion: UV bei 240nm Dämpfung: etwa 6 Probenverdünnungsmittol (D): 35ml Acetonitril plus390ml Methanol Standards:

1. Man wiege 0,5mg Avermoctin A2 a in einen 10ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf.

2. Man wiege 0,5mg Testprodukt in einen 10 ml fassenden Kolben ein und fülle mit Methanol auf. 1 und 2 sind Standard-Stammlösungen: zur Herstellung von Arbeits-Standards gebe man: 100μΙ (1) und ΙΟΟμΙ (2) in ein Röhrchen und setze 800μΙ mobile Phase hinzu.

Proben:

1. Man nehme 1 ml gut geschüttelte Kulturbrühe und zentrifugiere herunter

2. Man entferne soviel Überstand wie möglich, ohne das Pellet aufzuwirbeln

3. Man setze dem Pellet 100 μΙ HPLC-Wasser zu und vermische auf einem Vortex-Mischer, um zu dispergieren

4. Man setze 2 ml Verdünnungsmittel (D) zu und mische gut

5. Man filtriere dieses und lasse es über die HPLC-Säule laufen.

Die natürlichen und nicht-natürlichen Avermectine, die hier beschrieben sind, wurden diesem chromatographischen HPLC-Verfahren unterzogen, und die Retentionszeit des Erscheinens der einzelnen Avermectine wurde durch die Retentionszeit geteilt, die für das vorhandene Oligomycin A beobachtet wurde, welches als interner Standard für eine gegebene HFLC-Bestimmung dient. Oligomycin A wird bei Fermentationen von S. avermitills mit Hilfe von HPLC fast immer als Nebenprodukt beobachtet, und es istdas einzige Produkt, das sich durch HPLC nachweisen läßt, das von den hier beschriebenen Mutanten produziert wird, wenn diese in einem Medium kultiviert werdon, das frei von Säuren RCOOH, woboi R die hier angegebene Definition besitzt, oder von Verbindungen ist, die sich in Säuren mit der Formol RCOOH umwandeln lassen, wobei R die hier angegebene Bedeutung besitzt. Die typische Retentionszeit für Oligomycin A beträgt 12.5-14 Minuten. Das Verhältnis der Retentionszeiten (RT) liefert eine genauere Basis für den Vergleich der Identität und der Ausbeuten an Avermectin-Produkten. Das gewöhnliche Erscheinungsbild der Avermectine nach HPLC ist B2, A2, B1 und A1.

Natürliche	RT/RT(OligomyclnA)
Avermectine	0,70
B2b	0,84
B2a	0,90
A2b	1,09
A2a	1,40
B1b	1,83
B1a	1,83
A1b	2,42
A1a

Es ist anzumerken, daß B1 a und A1 b nicht aufgelöst sind.

Nicht natürliche	RT/RTIOIIgomyclnA)
Avormectlna	0,94
CyclopentylB2	1,23
CyclopentylA2	1,99
CyclopentylBI	2,62
CyclopentylAI

Die Retentionszeiten schwanken an den verschiedenen Meßtagen um 1-2 Minuten, wobei Oligomycin im allgemeinen nahe

12 5-14 Minuten erscheint.

In den folgenden Beispielen wurden die Avermectino nach dem oben beschriebenen HPLC-Verfahren bestimmt, sofern nichts

anderes angegeben ist.

Di 3 Zusammensetzung der in den folgenden Beispielen verwendeten Medien ist unten angegeben.

AS-7-Medlum	g/l
VerflüssigteStärke'	20
ArdaminpH6	5
Pharmamediac	15
CaCO3	2

' Hergestellt durch Hydrolyse von Stärke durch Alpha-Amylase aus Bacillus licheniformis (zu beziehen von Novo Enzymes, Wilton, CT, und verkauft unter dem Warenzeichen „Termamyl") auf ein Dextroseäquivalent von 40% ± 5%. ^b Von Yeasts Products, Inc., Clifton, NJ 07012 ' Von Traders Protein., Memphis, TN 38108 Einstellen des pH auf 7,2 mit NaOH.

AP-5 Medium	g/i
VerflüssigteStärke	80
ArdaminpH	5
K2HPO4	1
MgSO4 x 7 H2O	1
NaCI	1
CaCO3	7
FeSO4 x 7 H2O	0,01
MnCI2 x 7 H2O	0,001
ZnSO4x7 H2O	0,001
P-2000(Mittelgegen
Schaumbildung)'	1ml/

¹ Von The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 48640. Einstellen des pH auf 6,9 mit 25% NaOH

Beispiele 1-4

Avermectlne aus Streptomyces avermltilis I-3 (ATCC53567)

S.avbrmitilis I-3 ATCC5367) von einer sporulierten V-8-Platte wurde in 80ml AS-7-Medium in einen dreifach unterteilten, 500ml fassenden Kolben gegeben. Der Kolben wurde bei 28-3O⁰C unter Schütteln bei 200 Upm auf einem Rotationsschüttler inkubiert.

Nach 24stündiger Inkubation wurde 1 ml dr>r gesamten Brühe als Inokulum für 300ml fassende Kolben mit 40 ml AP-5-Medium eingesetzt. Die Fermentationen wurden bei 28-3O⁰C in Gegenwart von 400 ppm jeweils einer der Starter-Verbindungen, die unten aufgelistet sind und die nach 24 Stunden zugesetzt wurden, in doppelter Ausführung durchgeführt.

Nach 312 Stunden wurden 2 ml-Proben der gesamten Brühe mit 8ml Methanol: Acetonitril (390:35) vermischt. Nach Filtration wurden Proben mit einem Volumen von 50μΙ auf eine Beckman Ultrasphere ODS-Säule (3,9x 250 mm) injiziert. Die Säule wurde mit Methanol:Acetonitril:Wasser (89:14:7) mit einer Flußrate von 0,8 ml/min eluiert, und die Absorption des Eluates wurde mit einem UV-Detektor bei 240 nm verfolgt. Die Retentionszeiten der neuen Avermectine sind unten angegeben.

Retentionszeiten der Avermectlne (Minuten) Starter-Verbindung B2

1)±2-MethylbuUersäure 11,60»

12,40

2)Cyclopentancarbonsäure 12,32

SlCyclohexancarbonsäure 14,84

4) + 2-Methylbuttersäure 11,60

Sowohl +Mothylbuttersäure als auch -Methylbuttersäure weren in Avermectine eingebaut. Unter den gewählten chromatographischen Bedingungen wird die Auflösung der + und - Avermectine nur bei B 2 und A 2 erreicht.

Beispiel 5

Cyclohexyl-Avermectine aus Streptomyces avermitilis 7881

(ATCC53692)

Eine in einem Gläschen eingefrorene Kultur von S. avermitilis 7881 (ATCC 53692) wurde zum Inokulieren von 100ml AS-7-Medium in einem dreifach unterteilten, 500n.l fassenden Kolben eingesetzt. Der Kolben wurde bei 28-3O⁰C auf einem Rotationsschüttler unter Schütteln bei 200Upm inkubiert. Nach 28stündigem Inkubieren wurden 5 ml der gesamten Brühe zum

A2	B1	A1
14,75»	23,1	29,82
16,10
15,86	25,28	32,96
19,26	31,46	41,14
14,75	23,1	29,82

Beimpfen von weiteren 100ml AS-7-Medium in einem 500ml fassenden, dreifach unterteilten Kolben verwendet. Der Kolben wurde nochmals bei 28-3O⁰C auf einem Rotationsschüttler unter Schütteln bei 200Upm inkubiert. Nach 24stündiger Inkubation wurde 1 ml der gesamten Brühe verwendet, um einen 300 ml fassenden Kolben mit 40 ml AP-5-Medium zu beimpfen. Die Kolben wurden bei 28-30°C bei 200Upm inkubiert. Nach 24 Stunden wurden 400 ppm Cyclohexancarbonsäure zugesetzt, und nach 312 Stunden wurden Proben mit einem Volumen von 2 ml genommen und wie in Beispiel 1 beschrieben der Hochleistungs-FlUssigkeitschromatographie unterworfen. Unter diesen Bedingungen wurden die einzigen Avermectin-Bestandteiie, die man in der Fermentationsbrühe Finden konnte, bei 14,84 (54,9mg/l) und 31 46 (32,1 mg/l) Minuten eluiert, was Cyclohexyl-B^ bzw. -B1 entspricht.

Beispiel 6 Sec-Butyl-Avermectlne aus Streptomyaes avermitllis 7881

(ATCC 53692)

Das Verfahren des Beispiels 5 wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle von Cyclohexancarbonsäure 400 ppm ±2-Methylbuttersäure verwendet wurde, während alle anderen Bedingungen dieselben wie diejenigen waren, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Man fand in der Fermentationsbrühe nur sec-Butyl-'Wermectin B 2 (11,60,12,40 M'nuten, 63,5 42,4 mg/l) und sec-Butyl-AvermectinB1 (23,1 Minuten, 105,5mg/l).

Claims (7)

1. Verfahren zum Herstellen eines B-Avermectins, welches das aerobe Fermentieren eines Stammes von Streptomyces avermltilis, dem die Dohydrogenase-Aktivität für verzweigtketlige 2-Oxosäuren und die Avermectin-5-O-Methyltransferase-Aktivität fehlen, in einem wäßrigen Nährmedium umfaßt, das eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, Kohlenstoff und anorgrnische Salze und eine Verbindung enthält, die geeignet ist, in der Biosynthese eines Avermectins verwertet zu werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm von S.avermitilis die Identifikations-Charakteristika von ATCC 53692 besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung die Formel

R-COOH

besitzt, worin R eine alpha-verzweigtkettige Gr.'ppe ist, deren Kohlenstoffatom, an dem die -COOH-Gruppe gebunden ist, außerdem mindestens mit zwei ν iiteren Atomen oder Gruppen, die nicht Wasserstoff sind, vernküpft ist, oder daß sie eine Verbindung ist, die sich während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandeln läßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R eine alpha-ver.weigte C₃-C₈-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl-, -Alkoxyalkyl- oder -Alkylthioalkylgruppe, eine Cs-Ce-Cycloalkylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine alpha-verzweigte C₂-C₅-Alkylgruppe ist, eine C₃-C₈-CyClOaIkYl- oder eine C₅-C₈-Cycloalkenylgruppe, die beide fakultativ durch Methylen oder eine oder mehrore C₁-C₄-Alkylgruppen oder Halogenatome substituiert sein können, oder ein 3- bis 6gliedriper, sauerstoff- oder schwefelhaltiger heterocyclischer Ring ist, der gesättigt oder vollständig oder teilweise ungesättigt sein kann und der fakultativ mit einer oder mehreren C^d-Alkylgruppen oder Halogenatomen substituiert sein kann, oder eine Verbindung, die sich in während des Fermentationsverfahrens in diese Verbindung umwandeln läßt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung, die sich in das Substrat RCOOH umwandeln läßt,

R-(CH₂I_n-Z

ist, worin R wie voranstehend definiert ist, η 0,2,4 oder 6 ist und Z-CH₂OH, -CHO, -COOR⁴, -CH₂NH₂ oder-CONHR⁵ ist, wobei R⁴ H oder (C^-Alkyl ist, R⁵ Wasserstoff, (C,^)-Alkyl, -CH(COOH)CH₂COOh₁-CH(COOH) (CH₂J₂COOH oder-CH(COOH) (CH₂)₂SCH₃ ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin R bedeutet:
Cyclobutyl

Cyclopentyl

Cyclohexyl

Cycloheptyl

2-Methylcyclopropyl

3-Cyclohexenyl

1-Cyclopentenyl

1-Oyclohexenyl

3-Methylcyclohexyl (cis/trans)

4-Methylencyclohexyl

3-Methylcyclobutyl

3-Methylencyclobutyl

3-Cyclopentenyl

1-Cyclopropylethyl

3-Fluorcyclobutyl

4,4-Difluorcyclohexyl

Isopropyl

sec-Butyl

2-Pentyl

2,3-Dimethylpropyl

2-Hexyl

2-Pent-4-enyl

2-Methylth'ioethyl

S-2-Pontyl

R-2-Pentyl

2-Thienyl

3-Thienyl

4-Tetrahydropyranyl

3-Furyl

2-Chlorthienyl

3-Tetrahydrothienyl

4-Methylthio-2-butyl

4-Tetrahydrothiopyranyl

4-Methoxy-2-butyl oder

4-Methylthio-2-butyl.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich R von einer Carbonsäure mit der Formel