HU201973B - Process for producing avermeclin beta derivatives - Google Patents

Process for producing avermeclin beta derivatives Download PDF

Info

Publication number
HU201973B
HU201973B HU88260D HU26088D HU201973B HU 201973 B HU201973 B HU 201973B HU 88260 D HU88260 D HU 88260D HU 26088 D HU26088 D HU 26088D HU 201973 B HU201973 B HU 201973B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
avermectin
acid
avermectins
mutants
formula
Prior art date
Application number
HU88260D
Other languages
English (en)
Other versions
HUT47644A (en
Inventor
Edmund William Hafner
Kelvin Scott Holdom
Shih-Jen Edward Lee
Original Assignee
Pfizer
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer filed Critical Pfizer
Publication of HUT47644A publication Critical patent/HUT47644A/hu
Publication of HU201973B publication Critical patent/HU201973B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/22—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/90—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having two or more relevant hetero rings, condensed among themselves or with a common carbocyclic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/10—Anthelmintics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás avermetin-B-O-metil-transzferáz aktivitással és elágazó láncú-2-οχοsav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező Streptomyces avermitilis mikroorganizmus segítségével természetes és nem-természetes B avermektinek előállítására.
Az avermiktineket a 4 310 519, és a 4 429 042 számú amaerikai egyesült államokbeli szabadalmak írják le. Az avermetinek parazitaellenes hatással rendelkező rokonvegyületek csoportja, előállításuk Streptomyces avertimitilis törzsek, nevezetesen a S.avermitilis ATCC 31267,31271, és a 31272 törzsek aerob fermentálásával történik. Az említett utóbbi két törzs az S.avertimitilis ATCC 31267 ultraibolya fény besugárzásával nyert mutánsa.
Az 1987. március 18-án közzétett EP 214731 sz. szabadalom, mely az 1986. július 16-án közzétett 886 867 szériaszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás megfelelője, számos olyan vegyületet tartalmaz, melyek a természetes vagy ismert avermetinek származékai, de a 25-ös helyzetben új szubsztituenst tartalmaznak (ezeket itt nem-természetes avermektineknek nevezzük). Az említett szabadalom szerint ezek előállítása avermektint termelő mikroorganizmus tenyésztésével történik, oly módon, hogy a tenyészet bizonyos speciális karbonsavakat vagy ezek származékait vagy ezek előanyagait tartalmazza. A 25. szénatomos szubsztituált, említett új avermektineket a S.avermitilis ATCC
31267.31271 és az NCIB 12121 törzsekkel állítják elő. Az EP 214 731 sz. szabadalom közölt utóbbi törzs a S.avermitilis ATCC 31271 törzsből származik. Ez az új 25. szénatomon szubsztituált avermektineket nagyobb hozammal termeli, ha félszintetikus tápközegben tenyésztjük. Az ATCC 31267,
31271.31272 és az NCIB 12121 törzsek mindegyike a 25-ös szénatomon szubsztituált származékok mellett változó mennyiségben az ismert természetes savermektineket is termelik, melyeknél a 25-ös szénatom szubsztituense izopropilcsoport vagy (S)szek-butil-csoport (1-metil-propil-csoport).
Az (I) általános képletű avermektinek szénváza acetátokból, propionátokból, a természetes acermetinek 25-ös helyzetű szubsztituense pedig L-izoleucinból (R N = (S)-szek-butil-csoport) vagy lovaimból (R = izopropilcsoport) származik. [Fischer és Mrozik, „Makrolide antibiotics, Academic Press (1984) 14. fejezet].
Ismert” vagy „természetes” avermektineknek nevezzük azokat, az S.avermitilis ATCC31267, ATCC 31271 és ATCC 31272 törzsek által termelt avermektineket, melyeknél a 25-ös helyzetű szubsztituens vagy izopropilcsoport, vagy (S)-szek-butilcsoport (1-metil-propil-csoport). Azokat az avermektineket, melyeknél a 25-ös helyzetű szubsztituens nem izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport, új vagy „nem-természetes” avermektineknek nevezzük.
A fent említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban szereplő S.avermetilis törzsek az azokban C-076 generikus megnevezéssel ellátott vegyületcsoportot termelik. Ez a csoport nyolc különböző, de szoros szerkezetbeli rokonságban levő vegyületből áll, melyeket C-076 Alá, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a, és B2b jelöléssel láttak el.
Ezekben az „a” jelölés jelenti azokat a természetes avermektineket, ahol a 25-ös szubsztituens (S)szek-butil-csoport, és a „b” jelölés azokat, melyeknél a 25-ös szubsztituens izopropilcsoport.
Az „A” és „B” jelölés azt jelenti, hogy az avermetinek 5-ös helyzetű szubsztituense metoxicsoport, illetve hidroxiesoport. Végül az „1” szám azokat az avermektineket jelöli, ahol kettőskötés van a 22-23-as szénatomok között és ekkor R1 jelentése hidrogénatom; a „2” szám arra utal, hogy az avermektinek 22-es szénatomján egy további hidrogénatom, a 23-as szénatomján hidroxilcsoport van.
A jelen találmányban nem ezt a jelölést használjuk, minthogy zömmel nem-természetes avermektinekről van szó. Az Al, A2, B1 és B2 jelölést megtartjuk, az olyan nem-természetes avermektinek jelölésére, melyek a fentiek szerinti szerkezetbeli tulajdonságokkal rendelkeznek.
Az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok előállítását Bacillus subtulis esetében Willecke és Pardes [J.Biol.Chem., 246:5264-72 (1971)], Pseudomonas putida esetében Martin és munkatársai [J.Bacteriology, 115:198-204 (1973)] írták le. Ilyen mutánsok előállítása Streptomyceseknél eddig még nem történt.
Sculman és munkatársai [SAntibiot., 38(11): 1494-98 (1985)] beszámolnak a S.avermitihs Agly-1 mutánsról, mely lényegében csak Alá és A2a avermektin aglikonokat termel. Ugyancsak beszámolnak a S.avermitilis Agly-1 szinefungin jelenlétében történő fermentálásáról, ami a B-avermektinaglikon komponensek fokozódott termelődését eredményezi. Hasonlóképpen, ha a magas avermektintermelőképességű S.avermitilis 08 törzset az O-metil-transzferázt gátló szinefungin jelenlétében tenyésztik, olyan avermektinek termelődnek, melyek aglikonjának 5-ös szénatomján és az oleandróz diszacharid csoporton hiányaik az oxi-metil-csoport.
A 4 378 353 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom C-076-tal rokon vegyületeket ír le, melyeket a S.avermitilis ATCC 31272 törzsből ultraibolya fény besugárzással kapott MA-5218 mutáns tenyészetével állítanak elő. A mutánst ATCC 31780 törzsként azonosították. A nevezett mutáns által termelt C-076-tal rokon vegyületeknél hiányzik a C-076 vegyületek furángyűrűje. Ezen kívül a leírt vegyületek némelyikénél hiányzik az egyik vagy mindkettő oleandróz cukorcsoport, másoknál pedig az 5-ös helyzetű csoport ketocsoporttá oxidált.
Ruby és munkatársa [6zh. International Symposium on the „Biology of Actionomycetes”, Debrecen, 1985. augusztus 26-30], valamint Schumlan és munkatársai [Antimicrobial Agents and Chemostherapy, 31: 744-7 (1987)] a S. avermititis O-metiltranszferáz mutáns, három csoportját írják le, melyek olyan avermektineket termelnek, ahol hinyoznak az O-metil-csoportok. Az első csoport főként B-avermektineket termel, minthogy a csoprotba tartozó mutánsok nem képesek a makrociklikus laktongyűrű 5-ös helyzetű hidroxilcsoportját metilezni. A második csoportba tartozó mutánsok 3’-O, 3”-O-bisz-demetil-avermektineket termelnek (olyan avermektineket, melyek mindkét oleandróz cukorcsoportján hiányzik a 3-as helyzetű O-metil
-2HU 201973 Β szubsztituens); ezeket demetil-avermektineknek hívják. A harmadik csoportba tartozó mutánsok egyik helyzetben sem képesek a metilezésre.
Schulman és munkatársai [Fed.Proc., 44: 931 (1985)] fokozott B-avermektin termelést érnek el
S.avermitilis mikroorganizmusokkal oly módon, hogy a fermentálást szmefungin, S-adenozil-etionin és S-adenozil-homocisztein jelenlétében végzik, mely anyagok gátolják a B-avermektin-O-metiltranszferáz enzimet és ezáltal az ágiikon 5-ös helyzetű hidroxiicsoportjának metilezését. Schulman és munkatársai [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29:620-624 (1986)] leírnak O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező Streptomyces avermitilis mutánsokat is, melyek fokozott mennyiségben termelnek B-vermektin komponenseket.
A S.avermitilis mutagenezise elágazó láncú-2oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat eredményez. Ezek a mutánsok már nem képesek jelentős mennyiségű természetes avermektinek termelésére, ha nem tudunk a tenyészethez RCOOH általános képletű vegyületet, ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butilcsoport, vagy olyan vegyületet mely a fermentációs folyamatok során az említett RCOOH vegyületté képes átalakulni. Ezek a mutánsok azonban melepetésszerűen és váratlanul természetes és nem-természetes avermektineket termeltek, ha a fermentáció R-COOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport, (S)-szek-butil-csoport vagy más itt tárgyalt csoport - vegyület vagy annak előanyaga jelenlétében történt. Még meglepőbb, hogy az itt leírt olyan mutánsok, melyek csak az elágazó láncú2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkeznek és képesek lebontani az L-izoleudnt, az L-leucint vagy az L-valint, a vegyületek széles variációját fel tudják használni az avermektin bioszintézisénél, természetes avermektineket nem tartalmazó, nem-természetes avermektineket termelve.
Az ilyen egyszeresen blokkolt mutánsok további mutagenezise olyan mutánsok keletkezéséhez vezet, melyek nem rendelkeznek az elágazó láncú-2oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és a avermektinB-O-metil-transzferáz aktivitással sem. Az ilyen kettősen blokkolt mutánsok meglepően és váratlanul lényegében csak avermektin-B-komponenseket termelnek, ha a fent meghatározott RCOOH általános képletű vegyületet adjuk a tenyészethez.
Mint már említettük, a természetes avermektinek nyolc különálló, de egymáshoz nagyon hasonló komponensből állnak, melyeknek (I) általános képletében R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szekbutil-csoport. Noha lényegében tiszta állapotban nyerhetők ki (lásd 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), az eljárás a legjobb esetben is munkaigényes. A B-avermektinek antelmintikus aktivitása általában jobb, mint a megfelelő A-avermektineké. A nem-természetes avermektinek (A és B komponensek) EP 214731 szabadalom szerinti előállításánál különböző mennyiségben természetes avermektinek is termelődhetnek, minthogy jelen van az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz és a S.avermitilis sejtjeiben és a tápközegben az L-valin és L-izoleucin aminosav.
A kívánatos cél: csak a biológiailag hatásosabb, természetes vagy nem-természetes B-komponensek termelése; a termékek számának, a termékkeverék komplexicitásának csökkentése; az adott avermiktin tisztaságának növelése, és ezáltal az elválasztási eljárás egyszerűsítése.
Az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező S.avermitilis törzseket az avermektintermelő S.avermitilis, főként az S.avermitilis ATCC 31267, AZCC31271, ATCC 31272 vagy az NCIB 12121 törzsek mutagenezisével állítjuk elő. A mutánsok képtelenek a természetes avermektinek szintézisére, hacsak izopropilcsoportot vagy (S)-szek-butil-csoportot tartalmazó zsírsavat vagy annak előanyagát nem adjuk a tápközeghez. A mutánsok természetes és nem-természetes avermektineket képesek termelni, ha vizes, aerob körülmények között tenyésztjük őket, olyan táptalajon, mely megfelelő primer savat vagy a fermentációs folyamatokban azzá átalakuló előanyagot tartalmaz. _ 14
A mutagenizált telepek közül a WC izotóppal jelzett széndioxid-termelés alapján választjuk ki azokat, melyek nem rendelkeznek az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással. Ennél az eljárásnál azt a jelenséget használjuk fel, hogy az említett enzimaktivitással nem rendelkező permeabilízált sejtek a [WC-l]-2-oxo-izokapronsav vagy a [14C-l]-2-oxo-3-metil-vajsav szubsztrátokból nem termeinek 14C izotóppal jelzett széndioxidot.
Meglepő és váratlan, hogy az itt ismertetett, az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok megtartják avermektineket, főleg a nem-természetes avermektineket termelő képességüket. Az a tény, hogy a szokásos táptalajon növekvő mutánsok képtelenek természetes zsírsav-koenzim-A-származékokat termelni, letális mutációt jelenthet, ha a membránok integritása az említett származékoktól függ, vagy, ha a 2-oxo-sav felhalmozódása citotoxicitáshoz vezet. Nem volt továbbá várható, hogy a mutánsok képesek az L-izoleucin és az L-valin degradatív metabolizmusa révén acetil-koenzim-A-t vagy propionilkoenzim-A-t szintetizálni, minthogy ez olyan enzimaktivitásokat igényel, amivel a mutánsok nem rendelkeznek. A fent említett avermektin bioszintézis acil-koenzim-A iránti igénye alapján azt várhatnánk, hogy a mutánsok nem-természetes avermektin termelése súlyosan zavart. A várakozással ellentétben, nem ez a helyzet.
Az itt leírt mutánsok elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitásának a hiánya megakadályozza az elágazó láncú acil-koenzim-A L-izoleucin, L-leucin és L-valin lebomlásával kapcsolatos szintézisét, és ezáltal a természetes avermektinek szintézisét is, hacsak a fermentációs tápközegben nem adunk R-COOH általános képletű vegyületet vagy előanyagát, ahol R jelentése (S)-szek-butilcsoport vagy izopropilcsoport.
A 2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsok mutagenezisével továbbá olyan mutánsokhoz juthatunk, melyek az avermektin-BO-metil-transzferáz aktivitással sem rendelkeznek. Az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsok képtelenek az avermektin aglikonok 5-ös helyzetű oxigénjét metilezni.
-3HU 201973 Β
Ezek a mutánsok lényegében csak B-vermektinek termelésére képesek, az A-avermektinekére nem.
A találmány szeimt (I) általános képletű avermektin-származékokat állítunk elő, ahol » ·
R hidroxicsoport, ha a 22,23-kettőskötés hiány- 5 zik, vagy hidrogénatom, ha a 22,23-kettőskötés jelen van,
R2 (II) képletű 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport,
R jelentése α-helyzetben elágazó láncú 3-7 szén- 10 atomos alkil-, 3-7 szénatomos alkenil-, 3-7 szénatomos alkinil-, (1-4 szénatomos alkoxi)-3-7 szénatomos alkil- vagy (1-4 szénatomos alkiltio)-2-7-szénatomos alkilcsoport; adott esetben egy vagy két halogénatommal vagy egy metiléncsoporttal 15 szubsztituált 3-8 szénatomos cikloalkilcsoport; egy 5-8 szénatomos cikloalkenilcsoport; furanil-, tetrahidrofuranil-, dihidropiranil-, tetrahidropiranil-, tetrahidro-tiopiranil-, tetrahidrotienil- vagy tienilcsoport. 20
Az itt leírt mutánsok a nem-természetes B-avermektinek leírt és példákkal szemléltetett előállítása szempontjából nagy értékűek. Különösen hasznosak ezek a mutánsok az előnyös avermektinek, azaz a 25-ös szénatomon 4-6 szénatomszámú cikloalkil- 25 vagy cikloalkenil-csoportot, 1-metil-tio-etil-csoportot vagy 3-tienil- vagy 3-furilcsoportot viselő avermektinek előállítása szempontjából.
Az avermektint termelő Streptomyces avermitilis törzsek mutációs kezelését az ismert eljárások 30 szerint végezzük a szokásos mutagén faktorokkal, azaz ultraibolya fény vagy Röntgen besugárzással, N-metil-N’-nitro-nitrozo-guanidinnal, etil-metánszulfonáttal, salétromossawal, N-mustárral, például N-metil-bisz(2-klór-etil)-aminnal, stb. történő 35 kezeléssel. A mutagenezist természetes avermektineket termelő S.avermitilis, például S.avermitilis ATCC 31272 törzs spóráin vagy vegetatív tenyészetén végezhetjük.
A szakemberek által jól ismert eljárást követve, 40 az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat a biokémiai vizsgálati eljárás alapján szelektáljuk, mely lehetővé teszi, hogy a ráadom mutagenizált baktériumtelepek nagy számát megvizsgáljuk abból a szempontból, 45 hogy bizonyos elágazó láncú [14C-l]-2-oxo-savakból termelnek-e 14C izotóppal jelzett széndioxidot (Tábor és munkatársai, J.Bact., 128: 485-486 /1976/).
Az eljárás abból áll, hogy a mutáns telepeket 50 alkalmas táptalajon, mikrotiter lemez lukaiban növesztjük, a sejteket toluollal permabilizáljuk, majd [14C-l]-2-oxo-savat (például 2-oxo-izokapronsavat) adunk minden egyes lukba, és vizsgáljuk a 14CO2 jelenlétét a tenyészet feletti légtérben. A 55 r4C-l]-2-oxo-izokapronsav helyett használhatunk [14C-l]-2-ono-3-metil-valeriánsavat vagy [14C-l]-2οχο-3-metil-vajsavat. A14C izotóppal jelzett széndioxid termelődését a szokásos módon mutatjuk ki, vagyis bárium-hidroxiddal átitatott szűrőpapírt he- 60 lyezünk az egyes lukak fölé, ami megköti a l4CO2-t, bármennyi is termelődött, és a 14C izotóppal jelzett ábrium-karbonátot autoradiográfiával kimutatjuk. Azoknál a mutánsoknál, ahol hiányzik az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitás, az adott 65 autoradiogramm közel azonos a vak kontroliéval (nem beoltott luk), azaz a mutáns nem eredményez több jelzett bárium-karbonátot.
Az így nyert mutánsokat további, fent említett mutagén kezelésnek vethetjük alá. A mutagenizált telepeket az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitás szempontjából vizsgáljuk tovább. Ehhez kromatográfiás (vékonyréteg vagy HPLC) eljárást használunk, a hozzáadott előanyag - például 2-metil-vajsav-jelenlétében végzett fermentálást követően. Az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsoknál a fermentléből lényegében hiányoznak az A-avermektin komponensek.
Egy adott törzs kívánt alléljeit a mikroogranizmus mutagén kezelése mellett előállíthatjuk protoplaszt fúzióval is. így például egy S.avermitilis törzset, mely nem rendelekzik sem az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz, sem az avermektin-BO-metil-transzferáz aktivitással fuzionálhatunk egy, a fenti aktivitással rendelkező S.avermitilis törzzsel. A fúzió olyan S.avermitilis törzset eredményezhet, mely csak az avermektin-B-O-metiltranszferáz aktivitással rendelkezik. Amint az a szakemberek előtt ismert eltérő szelekciós vonalú törzsek kívánt alléljeit egyetlen törzsbe egyesíthetjük a protoplasztfúziós technikával.
A találmány szerinti eljárással alkalmazott mutánsok alaktani és tenyészeti tulajdonságai hasonlóak a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírtakéhoz. A találmány szerinti mutánsok megkülönböztető tulajdonságai: az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitás és a B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitás hiánya, mely tulajdonságokat az itt leírtak alapján határozzuk meg. Az említett aktivitások hiánya azt eredményezi, hogy a mutánsok nem termelnek természetes B-avermektineket, ha a tenyésztés RCOOH általános képletű - ahol R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport - zsírsavakat, vagy a fermentáció alatt ezekké átalakuló vegyületeket nem tartalmazó szintetikus táptalajon történik. Az American Type Culture Collection alapján végzett rendszertani vizsgálatok megerősítik, hogy a fenti 14CO2 teszttel szelektált 1-3 mutáns törzs szoros rokonságot mutat a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt ATCC 31272 szülőtörzzsel, de vannak bizonyos eltérések is. így például az 1-3 (ATCC 53567) lényegesen kevesebb spórafűzért képez, mint az ATCC 31272 törzs. A hasznosítási kísérletek szerint, az 1-3 törzs nem hasznosítja növekedéséhez a raffinózt. Ellentétben az ATCC 31272 törzs 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt tulajdonságával, nem tapasztaltunk növekedést szacharózon, mint egyetlen szénforráson sem mutáns sem az ATCC 31272 törzs esetében. Az 1-3 mutáns nem rendelkezik elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással.
A találmány szerinti eljárás mikroorganizmusa az elágazó-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és a B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező S.avermitilis 7881 törzs, mely az 1-3 (ATCC 53567) mutáns további mutagenezisével keletkezett, az 1-3 mutánshoz hasonló rendszertani
-4HU 201973 Β viszonyban van az ATCC 31272 törzshöz.
A Streptomyces avermitilis 1-3 és 7881 törzsek a Budapesti Egyezményben szabályozott viszonyok között Streptomyces avermitilis ATCC 53567, illetve ATCC 53692 megnevezéssel lettek letétbe helyezve az American Type Culture Collection-ban, Rockville, Maryland, USA, ahonnan az ismert jogi rendelkezések mellett beszerezhetők.
A S.avermitilis ATCC 31267, AtcC 31271, ATCC 31272 és az NCIB 12121 törzsek mindegyike termel (I) általános képletű természetes avermektineket, ahol az (I) általános képletben a 22 és 23-as szénatomok közötti szaggatott vonal adott esetben kettős kötést jelent;
R1 jelentése hidroxilcsoport és csak akkor van jelen, ha nincs kettőskötés;
R2 jelentése (Π) általános képletű 4*-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport, melyben belül
R3 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport; és
R jelentése izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport.
A 4 285 963 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom olyan (I) általános képletű avermektineket ír le, ahol a 25-ös helyzetben a szubsztituens metilcsoport vagy etilcsoport; R1 jelentése hídroxilcsoport és R^jelentése metilcsoport.
A jelen találmányban szereplő nem-természetes avermektinek esetében R jelentése nem izopoopilcsoport, vagy (S)-szek-butil-csoport, jelentését az alábbiakban meghatározzuk.
Az (I) általános képletű vegyületek bioszintéziséhez felhasznált alapvegyületek a S.avermitilis sejtben és a tápközegben találhatók meg. Ezek a vegyületek az L-valin és L-izoleudn vagy az ezeknek megfelelő 2-oxo-savak lebomlásával keletkeznek a 2-oxo-savnak az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz által katalizált dekarboxilálódásán keresztül, mialatt a termék koenzim-A-val kapcsolódik össze. Jelenlétük magyarázza az izopropilcsoportot és az (S)-szek-butil-csoportot hordozó (I) általános képletű vegyületek egyidejű termelődését. Ezzel természetesen fellép az izopropil- és az (S)-szek-butil-származékok elválasztásának a feladata.
Amikor a táptalaj egy adott kiindulási primer vegyületet tartalmaz, a találmány szerinti mutánsok olyan (Γ) általános képletű vegyületet, vagy ami az általánosabb eset, két olyan (I) általános képletű vegyület keverékét termelik, melyben R jelentése megfelel az alkalmazott kiindulási vegyületnek. Maximum két termék keletkezhet, melyeket a 4 429 042 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom alapjá tiviálisan R-avermektin BI és B2 névvel illetünk. Az „R”-csoport természetesen a 25-ös helyzetű szubsztituenst jelenti. így például, ha R jelentése ciklopropilcsoport, a két lehetséges avermektin a következő:
triviális név R1 R3 ciklopentil-avermektin BI hidrogén- hidrogénatom atom ciklopentil-avermektin B2 hidroxil- hidrogéncsoport atom
A nem-természetes avermektineknél az (I) általános képlet 25-ös helyzetű R szubsztituense nem izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport.
Az (I) általános képletű vegyületeket, ahol jelen van a kettős kötés és hiányzik a hidroxilcsoport, dehidrációval állíthatjuk elő (I) általános képletű vegyületekből, ahol R jelentése hidroxilcsoport és a kettőskötés hiányzik. A reakciónál előzőleg például terc-butil-dimetil-szilil-oxi-acetil szármatékként - védjük az 5-ös és 4” helyzetű hidroxilcsoportokat, majd helyettesített tiokarbonil-halogeniddel, például (4-metil-fenoxi)-tiokarbonil-kloriddal reagáltatunk, és a terméket magas forráspontú oldószerben, például triklór-benzolban melegítve dehidratáljuk. A védőcsoportok eltávolítása után hozzájutunk a telítetlen vegyülethez. Ezek a reakciók a szükséges reagensek és reakciókörülmények leírásával szerepelnek a 4 328 335 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban.
Az (I) általános képletnek megfelelő vegyületek, ahol R1 jelentése hidrogénatom és a kettőskötés nincs meg, az olyan megfelelő vegyületek katalizátor jelenlétében végzett szelektív hidrogénezésével állíthatók elő, ahol jelen van a kettőskötés és azR1 hidrogénatom. A redukciót elvégezhetjük például trisz(trifenil-foszfm)-ródium(I)-klorid alkalmazásával a 0001689 számú európai szabadalmi leírás és az annak megfelelő, 199 569 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom alapján.
Az (I) általános képletnek megfelelő vegyületeket, ahol R2 jelentése hidrogénatom az Qlyan megfelelő vegyületekből állítjuk elő, ahol R2 jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport, enyhe savas hidrolízissel eltávolítva a 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandróz csoport. A vizes szerves oldószerben végzett hidroíizis eredményeként olyan aglikont nyerünk, mely a 13-as helyzetben hidroxilcsoportot visel. Ezt a terméket azután halogénezzük, például benzolszulfonil-halogeniddel, 13-deoxi-13-halo-származékhoz jutva, amit végül szelektíven redukálunk, például tributil-ón-hidriddel. A nem kívánatos mellékreakciók elkerülése céljából, kívánatos a többi jelenlevő hidroxilcsoportot, például tcrc-butil-dimetil-szilil-csoporttal védeni. A halogénezés vagy a redukciós lépés után a védőcsoport azután könnyen eltávolítható nyomnyi savat tartalmazó metanolban. Mindezek a reakciók, valamint a szükséges reagensek és az alkalmazott reakciókörülmények szerepelnek a 0002615 számú európai szabadalmi leírásban.
A természetes és nem-természetes avermektinek bioszintéziséhez a találmány szerinti S-avermitilis törzsek R-COOH általános képletű vegyületeket (primer vegyületek) használnak fel, ahol R jelentése a fenti.
A találmány szerinti eljárásnál, egy elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és B-avermektin-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező, fent meghatározott S.avermitilis ATCC 53692 törzset, annak mutánsát vagy variánsát aerob körülmények között tenyésztünk asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen sókat és RCOOH általános képletű vegyületet tartalmazó vizes tápközegben. A savat vagy a beoltás idejében adjuk a tápközeghez, vagy bizonyos időközönként
-5HU 201973 Β a fermentáció alatt. Az avermektinek termelődését minták vételével követjük nyomon. A kivett mintát szerves oldószerrel extraháljuk, és a terméket kromatográfiásan mutatjuk ki, például HPLC-t használva. Az inkubálását addig végezzük, amíg a tér- 5 mék mennyisége maximumot nem ér el. Ez rendszerint 4-5 napot jelent.
A hozzáadott primer anyagok - karbonsav előnyösen mennyisége 0,05-3,0 g literenként. A primer vegyületet hozzáadhatjuk a tenyészethez folya- 10 matosan, megszakításokkal vagy egyszerre. Az RCOOH általános képletű savat adhajtuk szabad sav formájában, sóként, mint például nátrium-, lítium- vagy ammóniumsó vagy a savvá átalakuló vegyület alakjában. Amennyiben a sav szilárd állapo- 15 tű, előnyös megfelelő oldószerben, például vízben vagy 1-4 szénatomszámú alkoholban oldani.
A fermentációhoz használt táptalaj a szokásos, asszimilálható szén- és nitrogénforrást és nyomelemeket tartalmazó tápközeg lehet. 20
A táptalajt úgy állítjuk össze, hogy ne vagy csak minimális mennyiségben tartalmazza azokat a primer vegyületeket, ahol R jelentése iropropilcsoport vagy (S)-szek-butil-csoport.
A 24-33 °C hőmérsékleten végzett fermentálás 25 befejeztével a fermentlevet lecentrifugáljuk vagy szűrjük, és a micéliumot előnyösen acetonnal vagy metanollal extraháljuk. Az extraktumot betöményítjük, és a kívánt terméket vízzel nem elegyedő oldószerrel - például mtilén-kloriddal, etil-acetát- 30 tál, kloroformmal, butanollal vagy metil-izobutilketonnal - extraháljuk. Az extraktumot betöményítjük, és a nyersterméket a kívánalmak szerint tovább tisztítjuk, például fordított fázisú, preparatív HPLC-t alkalmazva. 35
A nyerstermék általában az (I) általános képletű vegyületek keveréke, ahol R2 jelentése 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport; R1 jelentése hidroxilcsoport és a kettőskötés hiányzik, vagy R1 szubsztituens hidrogénatom és a kettőskötés 40 megvan; és R3 jelentése hidrogénatom. Azok a vegyületek, ahol R3 jelentése metilcsoport, lényegében hiányoznak. Az egyes komponensek aránya azonban erősen változhat az adott mutáns, az alkalmazott primer vegyület és a használt körülmények- 45 tői függően.
Az itt leírt elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenázt nem tartalmazó mutánsokból három típusú O-metil-transzferáz mutánsokat kaphatunk. A mutánsok, melyekben az elágazó láncú 2-oxo-sav-de- 50 hidrogenáz aktivitást nem tartalmazó mutáció egy vagy több O-metil-transzferázt nem tartalmazó mutációval párosul, főként B-avermektineket, demetil-avermektineket vagy egyáltalán nem metilezett avermektineket termelnek, ha RCOOH általános 55 képletű vegyületeket vagy a fermentáció során ezekké átalakuló vegyületeket adunk a tenyészetükhöz. A nevezett mutánsokat úgy kapjuk, hogy az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat ultraibolya fénnyel 60 és/vagy kémiai mutagénekkel, például N-metil-Nnitrozó-karbamiddal, nitrozóguanidinnel vagy más hatóanyaggal kezeljük, mint már fentebb említettük. Ettől eltérő módon az elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitással rendelkező, de egy vagy 65 6 több O-metil-transzferáz aktivitásban blokkolt mutánsokat ultraibolya fénnyel vagy mutagén hatóanyagokkal kezelhetjük, olyan mutánsokhoz jutva, melyek nem rendelkeznek elágazó láncú-2-οχοsav-dehidrogenáz aktivitással.
Az ilyen mutánsok által termelt nem-természetes avermektinekre az jellemző, hogy az ágiikon 5-ös szénatomján és/vagy az oleandróz 3’-as szénatom és/vagy 3”-as szénatomján hídroxilcsoportok találhatók.
A fent leírt mutánsokat Schulman és munkatársai módszerével [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29: 620-624 (1986)] azonosítottuk. Az így előállított avermektinek azonos céllal és módon használhatók fel, mint az eddig ismert avermektinek.
Nagyobb mennyiségű B-avermektint, ideértve azokat, melyek oleandróz diszacharid csoportján hiányzik a metilcsoport, alternatív módon előállíthatunk úgy, hogy a találmány szerinti mutánsokat, melyeknél nincs meg az elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitás, szinefungin, S-adenoziletionin vagy S-adenozil-homocisztein jelenlétében tenyésztjük, mely anyagok gátolják az O-metiltranszferáz aktivitást.
A találmány szerinti vegyületek magas aktivitású antiparazitikumok, különösen mint antelmintikák, ektoparaziticidek, inszektícidek és akaricidek alkalmazhatók.
Ezek szerint a vegyületek hatásosak endoparaziták által okozott különféle betegségek kezelésére, különösen a helmintiázis gyógyítására, melyet leggyakrabban a parazita férgek egy nematódákként leírt csoportja okoz. Ezek súlyos gazdasági kárt okoznak a sertéseknél, juhoknál, lovaknál és szarvasmarháknál és megbetegítenek más háziállatokat és baromfiakat is. A vegyületek hatásosak más nematódákkal szemben is, melyek különféle állatfajokat betegíthetnek meg, ilyenek például a kutyák Dirofilaria parazitái. Alkalmazhatók embereket is megfertőzhető parazitákkal szemben is, ideértve az emésztőrendszerben élő Ancylostoma-t, Necatort, Ascaris-t, Strongyloides-t, Trinchinella-t, Capillaria-t, Trichuris-t, Enterobins-t, valamint a vérben vagy más szövetekben és szervekben található parazitákat, például a Filaria férgeket és a bélrendszeren kívüli állapotban levő Strongyloides-t és Trichinella-t.
Sikerrel alkalmazhatók a vegyületek ektoparazitákkal szemben is, ideértve elsősorban az emlősök és madarak ízeltlábú ektoparazitáit, mint amilyenek az atkák, kullancsok, tetvek, legyek, húslegyek, csípő rovarok és a kétszárnyúak; szarvasm/frhákon, lovakon élősködő migráló lárvái.
A vegyületeket hatásos inszekticidként használhatjuk a háztartásban előforduló rovarokkal, például csótánnyal, ruhamollyal, múzeumbogárral, és háziléggyel szemben, de hatékonyak a raktározott gabonát és mezőgazdasági növényeket károsító rovarok elpusztításában is, mint amilyenek az atkák, levéltetvek, hernyók és a vándorló egyenesszárnyúak, például a sáskák.
Az (I) általános képletű vegyületek bejuttatást módja függ attól, hogy miként akarjuk alkalmazni, milyen gazdaállatot kívánunk kezelni vele, és mi-6HU 201973 Β lyen parazita, illetve rovar ellen használjuk. Például antelmintikaként használva, a vegyületeket beadhatjuk szájon keresztül kapszula, bólusz, tabletta vagy folyadék alakjában, de bejuttathatjuk injekcióként vagy beültetéssel is. Ezeket a készítményeket az állatgyógyászatban általánosan alkalmazott, szokásos eljárásokkal állítjuk elő. A kapszulák, bóluszok és tabletták előállításánál a hatóanyagot finoman elporított hígító- vagy hordozóanyagokkal keverjük össze, a készítmény tartalmazhat még szétesést elősegítő anyagokat és/vagy kötőanyagokat, például keményítőt, laktózt, talkumot, magnéziumsztearátot stb. A folyékony orális készítmény a hatóanyagot vizes oldatban diszpergálva tartalmazza diszpergáló-, nedvesítőanyag stb. mellett. Az injektálható készítményt steril oldat alakjában készítjük el, mely más anyagokat is tartalmaz, például a vérrel izotóniát biztosító sókat vagy glükózt. A készítmények a hatóanyag mennyiségét illetően változhatnak. A hatóanyag alkalmazott mennyisége függ a kezelendő gazdaállat fajtájától, a fertőzés súlyosságától, a gazdaállat testsúlyától. Szájon át történő beadásnál a hatóanyag mennyisége általában 0,001-10 mg között változik testtömegkilogrammonként. Ezt a mennyiséget beadhatjuk egyszeri vagy elosztott dózisban. Általában 1-5 napos kezelésére van szükség. Természetes a megadott mennyiségek a találmány oltalmi körét nem korlátozzák, ennél kevesebb vagy több hatóanyagot is alkalmazhatunk.
A vegyületeket beadhatjuk az állatok táplálékával is, e célból töményebb adalékkészítményt vagy premixet készítünk, melyet a szokásos állati táplálékokhoz keverhetünk.
Inszekticidként és a mezőgazdasági káros rovarok elleni készítményként ρεπηεζ hintőpor, emulzió, stb. alakjában alkalmazzuk a vegyületeket, mely készítményeket a mezőgazdaságban szokásos eljárások szerint készítjük el.
A S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzset az alábbi többlépéses eljáráson keresztül állíthatjuk elő:
1. lépés: S. avermitilis ATCC 31272 törzset növesztünk 30 °C hőmérsékleten 12 napon keresztül egybefüggő tenyészetté New Patch Agar táptalajon. A táptalaj összetétele:
V-8 lé* 200 ml kálcium-karbonát 3 g agar 15 g vízzel kiegészítve 1000 ml-re
Nutrient broth 1,0 g/liter nátrium-acetát-3-vízql,4 g/1 izovaleriánsav 50 mg/1 izovajsav 50 mg/1 a-metil-vajsav 50 mg/1 izoleucin 250 mg/1 leucin 250 mg/1 valin 250 mg/1 nyomelemoldat** 1 nd/l *Nyolc növényi lé keveréke: paradicsom, sárgarépa, zeller, répa, petrezselyem, saláta, vízitorma és spenót, hozzáadva só, aszkorbinsav, citromsav és
természetes aromásítóanyagok. (Campbell Soup Company, Camden, NJ, USA).
**A nyomelemoldat összetétele:
vas(III)-klorid-6-víz 2,7 g
mangén(II)-szulfát-víz 4,2 g
réz-szulfát-5-víz 0,5 g
kálcium-klorid 11,0 g
bórsav 0,62 g
kobalt-klorid-6-νίζ 0,24 g
cink-klorid 0,68 g
nátrium-molibdenát 0,24 g
A felsorolt sók 1 liter 0,ln sósavban feloldva.
Három lemezről spórákat gyűjtünk, és 20 ml 0,05 mólos trisz/maleinsav pufferben, pH = 9,0 szuszpendáljuk.
2. lépés: 10 ml spóraszuszpenziót hozzáadunk egy kémcsőben 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozóguanidinhez (NTG), és a csövet 28 “C hőmérsékleten rázatjuk 60 percen keresztül. Ezután a spórákat bőséges mennyiségű 1%-os nátrium-klorid-oldattal mossuk.
3. lépés: A mosott spórákat 1%-os nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, és a szuszpenziót azonos térfogatú 80%-os etílén-glikollal keverjük össze. A szuszpenziót -20 ’C hőmérsékleten tároljuk, és ezeket a sejteket használjuk a mutánsok keresésére. A szuszpenzió 1 milliliteréből kb. 104 telepet kapunk.
A spórákat YPD lemezekre szélesztjük, lemezenként kb. 100 telepet kapva. Az YPD táptalaj literenként 10 g élesztőkivonatot, 10 g Bacto peptont, 10 g dextrózt és 15 g Bacto agart tartalmaz, az autoklávozás előtt pH=6,9 értékre beállítva (a Bacto készítmények a Difco Laboratories-ból származnak, Detroit, Michigan 48238, USA).
4. lépés: 2-3 hetes, 28 ’C hőmérsékleten történő kinövesztés után különálló telepeket oltunk át a szabályos 96 lukú mikrotiter lemez egyes lukaiban. Ugyancsak átoltjuk a kérdéses telepeket friss agaros táptalajra is, hogy a mutánsok meghatározása után legyenek életerős sejtforrásaink.
5. lépés: minden egyes lukba bemérünk 75 mikroliter folyékony M9-es szintetikus tápközeget, mely 1% glükózt, 0,1% kazaminosavat, 0,01% izovaleriánsavat, 0,01% izovajsavat és 0,01% metilvajsavat is tartalmaz. Néhány napos 28 ’C hőmérsékleten történő inkubálás után a sejteknél megvizsgáljuk az elágazó láncú-2-oxo-sav-dehidrogenáz aktivitást. Az M9-es táptalaj egy litere 6 g dinátrium-hidrogén-foszfátot, 3 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g nátrium-klorídot és 1 g ammónium-kloridot tartalmaz. Autoklávozás után a fenti oldathoz hozzáadunk 1 ml steril 1M magnéziumszulfát oldatot és 1 ml 0,lM kálcium-kloridot.
6. lépés: 5% toluolt szuszpendálunk M9-es szintetikus táptalajban rövid ultrahangos kezeléssel. 25 ml ilyen szuszpenzióhoz hozzáadunk 1,2 ml [14C-l]-2-oxo-izokapronsav oldatot, melynek akti7
-7HU 201973 Β vitása milliliterenként 2,5 mikrocurie és mikromólonként 10,0 mikrocurie. Ebből a keverékből 50 mikrolitert adunk a mikrotiter lemez minden egyes, a viszgálandó telepeket tartalmazó lukába.
7. lépés: Az egyes tokákból termelődő jelzett széndioxidot (14CÖ2) megkötjük, és Tábor és munkatársai módszerével láthatóvá tesszük [J.Bacteriol., 128: 485-486 (1976), „Convenient method fór detecttog 14CŰ2 to multiple samples: Application 10 to rapid screening fór mutants”]. Azok a mutánsok, melyek nem tartalmaznak elágazó láncú-2-oxo-savdehidrogenáz aktivitást, csak annyi jelzett báriumkarbonátot eredményeznek, mint a kontrollok.
Egy javított módszernél, mely növeli a 14CO2 15 teszt érzékenységét, a pozitív vizsgálatnál a jelzett bárium-karbonát keletkezésének eredményeként sötét folt jelenik meg az autoradiogrammon; negatív vizsgálatnál nincs folt vagy csak nagyon halvány.
A fenti 4. lépésnél kapott különálló telepeket 20 2-3 hetes kinövesztés helyett 7-14 napos kinövesztés után kiemeljük az agarlemezről, és az 5. lépés kihagyásával közvetlenül vizsgáljuk a 6. és 7. lépésnél leírtak szerint.
A felszabaduló jelzett széndioxid mennyiségi 25 meghatározásán alapuló még tovább fejlesztett vizsgálati módszer a következő. A mutánsokat M9es pufferolt közegben tenyésztjük, mely 1% glükózt és 0,1% „Syncasa-bcaa”-t tartalmaz. A „Syncasabcaa” a kereskedelmi kazaminosavak összetételé- 30 vei körülbelül megegyező szintetikus L-aminosav keverék, de nem tartalmaz L-valint, L-izoleucmt, és L-leucint (1. alább).
Miután a tenyészet nagy sejtsűrűséget ért el, a sejteket M9-es pufferolt közegben mossuk, és M9- 35 es pufferben szuszpendáljuk fel, amely 1% toluolt is tartalmaz. Előzőleg a toluolt ultrahanggal diszpergáljuk, tejfehér szuszpenziót nyerve. A sejt/puffer/toluol szuszpenziót 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 40 percen keresztül, hogy a sejtek permeábi- 40 lisek legyenek. A permeabllizált sejteket M9-es pufferolt közegben mossuk, és az eredeti térfogat egy ötödében szuszpendáljuk ugyanebben a közegben. 180 mikroliter szuszpenziót használunk fel a vizsgálatokhoz. 45
A 300 mikroliteres reakciókeverék tartalmazza a toluollal kezelt sejteket, 0,4 mM triamin-pirofoszfátot (TPP), 0,11 mM koenzim-A-t (CoA),
0,68 mM nikotinamid-adenin dinukleitidot (NAD), 2,6 mM ditiotreitolt (DTT), 4,1 mM mag- 50 nézium-kloridot, 60 mM Trisz-CCl-t (pH = 7,5) és [14C-l]-2-oxo-izokapronátot, melynek aktivitása 6000 cpm, mikrocurie mikromólonként. A számlálási hatékonyság 73%-os.
A reakciót egy 15 milliliteres szcintillációs cső- 55 ben végezzük, melyben egy 2x2 cm-es Whatman 4-es papír négyzet van a zárókupakba szorítva. A papírba 30 mikroliter 1M Hyamine Hydroxide-ot (metil-benzetonin-hidroxid 1 mólos oldata metanolban; Sigma Chemical Co., St.Louis, MO. 63178, 60
USA) szívatunk be, mely elnyeli a termelődő jelzett széndioxidot. 2 órás inkubáció után, a papírt 10 ml Beckman Aquasol II (New England Nuclear Research Product, Boston, MA 02118, USA) szcintillációs számlálási folyadékba merítjük, és 4 órás vagy 65 8 ennél hosszabb kiegyenlsúlyozódás után mérjük a rádioaktivitást folyadék szcintillációs számlálóban. A kontroll vak kísérlet - azaz ahol nincsenek sejtek jelen - kb. 50-300 cpm értéket ad.
Az 1-3 mutánsok vagy az ehhez hasonlók a vak kontrolinál kisebb vagy azzal egyenértéket adnak, míg a szülőtörzs a vak érték többszörösét eredményezi.
A „Syncasa-bccaa” készítmény százszoros töménységű koncentrátum:
g/l
L-alanin 3
T .-arginin 4
L-aszparginsav 6
L-cisztin 1
L-glutamonsav 20 glicin 1
L-hisztidin 2
L-lizin 7
L-metionin 3
L-fenil-alanin 6
L-prolin 10
L-szerin 6
L-treonin 4
L-tirozin 4
L-triptofán 1
Az oldat kémhatását pH=7 értékre állítjuk be, és szűréssel sterilizáljuk. 1 rész koncentrátumot adunk 99 rész közeghez, hogy a szokásosan használt koncentrációkat beállítsuk.
Az elágazó láncú 2-oxo-sav-dehidrogenáz és az avermektin-B-O-metil-transzferáz aktivitásokkal nem rendelkező, kétszeresen blokkolt mutánst [S.avermitilis 7881 (ATCC 53692) törzs] az alábbi lépéseken keresztül állítjuk elő.
1. lépés: S.avermitilis ATCC 53567 törzset összefüggő tenyészetté növesztünk New Patch Agar Medium-on tenyésztve 12 napon át 30 ’C hőmérsékleten.
Három lemezről összegyűjtjük a spórákat, és 20 ml 0,05M trisz/maleinsav pufferben, pH=9,0 szuszpendáljuk.
2. lépés: 10 mg N-metil-N’-nitro-N-nitrozóguanidint (NTG) tartalmazó csőbe bemérünk 10 ml spóraszuszpenziót. A csövet rázatva inkubáljuk 28 ’C hőmérsékleten 60 percen keresztül, majd a spórákat alaposan kimossuk 1%-os nátrium-klorid oldattal.
3. lépés: A mosott spórákat 1%-os nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, és azonos térfogatú 80%-os etilénglikollal keverjük össze. A szuszpenziót -20 ’C hőmérsékleten tároljuk, és sejtforrásként használjuk a mutánsok kereséséhez.
A spóraszuszpenziót YPD lemezekre szélesztjük, hogy lemezenként kb. 100 telepet kapunk.
A nitrozóguanidinnel kezelt Streptomyces avermitilis 1-3 (ATCC 53567) törzs populációjának telepeit az alábbi összetételű agaros táptalajra viszszükát:
literenként 80 g hidrolizált keményítő, 1 g diká-8HU 201973 Β lium-hidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát-7víz, 5 g ardamine PH, 5 g kálcium-karbonát, 1 ml P-2000, 0,01 g vas(n)-szulfát-7-víz, 0,001 g mangén(n)-klorid-4-víz, 0,001 g cmk-szulfát-vfe, 17 g Bacto agar, desztillált vízzel 980 ml-re kiegészítve. A kémhatását pH=7,0 értékre állítjuk be nátriumhidroxiddal, majd 20 percig sterilezzük 121 °C hőmérsékleten autoklávozva. Sterilizálás után 20 ml steril 5%-os ( ± )-2-metil-vajsav törzsoldatot adunk a táptalajhoz, és a kémhatást pH=7,0 értékre állítjuk be.
Az agaros táptalajra oltott tenyészetet 28 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 8-12 napon keresztül. A sejteket (micéliumot) eltávolítjuk az agar felszínéről és 250 mikroliter acetonba visszük. 25 mikroliter acetonos extraktumot felviszünk egy Analtech Silica Gél GF készrétegre. A kromatogrammot 30-40 perces futtatással etil-acetáttal fejlesztjük ki. A lemez megszárítása után 3%-os etanolos vanilinoldattal permetezzük be, és 1-3 percre 100 ’C hőmérsékleten tartjuk. Ezt követően 3% kénsavat tartalmazó etanollal permetezzük le a lemezt, és 10-15 percre visszahelyezzük 100 ’C hőmérsékletre. Az avermektm-B-O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsokat a kromatogramm alapján azonosítjuk. A kromatogrammon megtalálhatjuk az (l-metil-propil)-avermetin-B-komponensek foltjai - Rp 0,54,0,42 értékeknél a Bl, illetve B2 viszont hiányoznak az avermektin A komponensek foltjai - 0,69 Rf értéknél az Al, illetve 0,58 értéknél az A2 foltjai.
A HPLC analízishez a következő rendszert használjuk:
Mozgófázis: 150 ml víz ml acetonitril literre metanollal kiegészítve.
Oszlop: Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Intruments, Dullerton, CA 92634-3100).
Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc.
Detektálás: 240 nm.
Csillapítás (értékenység): 6 közeli
A minta hígításához acetonitril/metanol 35:390 térfogatarányú elegyét használjuk.
Referens anyagok:
(1) 0,5 mg avermektin A2a-t mérünk be egy 10 ml-es mérőedénybe és metanollal 10 ml-re feltöltünk;
(2) 0,5 mg vizsgálati terméket bemérünk egy 10 ml-es mérőedénybe és metanollal 10 ml-re feltöltünk;
100 μΐ (1) oldatot és 100 μΐ (2) oldatot mérünk egy kémcsőbe és 800 μΐ mozgófázist adunk hozzá.
1) az összerázott fermentléből 1 ml kivétet lecentrifugálunk;
2) annyi felülúszót távolítunk el, amennyi csak lehetséges anélkül, hogy az üledéket felzavarnánk;
3) 100 μΐ HPLC minőségű vizet adunk az üledékhez, és vortex-szel szuszpendáljuk;
4) 2 ml fenti összetételű hígítóelegyet adunk hozzá és jól összekeveijük;
5) a szuszpenziót leszűrjük, a szűrletet HPLC analízisnek vetjük alá.
A természetes és nem-természetes avermektinek analíziséhez a fenti HPLC rendszert használjuk. A meghatározás belső standardjaként oligomi16 cin A-t használunk. A S.avermitilis fermentációknál csaknem mindig megfigyelhető a HPLC-vel az oligomicin A, mint melléktermék, és a találmányban szereplő mutásnok esetében csak ez az egy termék látható, ha olyan táptalajon tenyésztjük őket, mely nem tartalmaz RCOOH általános képletű vegyületet - ahol R jelentése a fentiekben meghatározott - vagy azzá átalakulni képes vegyületet. Az oligomicin A retenciós ideje általában 12^-14 perc. A retenciós idők aránya pontosabb lehetőséget ad az avermektin termékek azonosítására.
Az avermektin termékek általában a következő sorrendben jelennek meg a HPLC kromatogrammon:
B2, A2, Bl és Al.
természetes avermektinek retenciós idő (avermektin) retenciós idő (oligomicin A)
B2b 0,70
B2a 0,84
A2b 0,90
A2a 1,09 1,40
Blb
Bla 1,83
Alb 1,83
Alá 2,42
A Bla és az Alb nem válnak el.
nem-természetes retenciós idő
avermektinek (avermektin) retenciós idő (oligomicin A)
ciklopentil B2 0,94 ciklopentil A2 1,23 ciklopentil Bl 1,99 ciklopentil Al 2,62
A különböző napokon felvett kromatogrammon az oligomicin A retenciós ideje között általában 1-2 perc eltérés van. Általában 12,5-14 percnél jelenik meg a csúcsa.
A példákban, hacsak az eltérésre nem utalunk, a fenti HPLC rendszert alkalmaztuk.
A példákban az alábbi táptalajokat használtuk:
AS-7 táptalaj hidrolizált keményítő8 20 g/liter
Ardamin PHb 5 g/liter
Pharmamediac 15 g/liter kálcium-karbonát 2 g/liter 8 Bacillus licheriformis α-amilázával (Novo Enzymes, Wilton, CT; „Termamyl” néven forgalmazva) hidrolizált keményítő.
b Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012, USA. c Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA.
A táptalaj kémhatását nátrium-hidroxiddal
-9HU 201973 Β
pH = 7,2 értékre állítjuk be.
AP-5 táptalaj
hidrolizált keményítő 80 g/liter
Ardamine pH 5 g/liter
dikálium-hidrogén-foszfát 1 g/liter
magnézíum-szulfát-7 víz 1 g/liter
nátrium-klorid 1 g/liter
kálcium-karbonát 7 g/liter
vas(II)-szulfát-7 víz 0,01 g/liter
cink-szulfát-7 víz 0,001 g/liter
mangán(II)-klorid-7 víz 0,001 g/liter
P-2000(habzásgátló)a Imi
a The Dow Chemical Co., Midland, Michigan 15
48640, USA.
A táptalaj kémhatását pH = 6,9 értékre állítjuk be 25%-os nátrium-hidroxiddal.
Az elmondottak bővebb szemléltetésére az aláb- 20 biakban példákat adunk meg. A példák a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.
1-4. példa (referencia példák)
V-8 lemezen tenyésztett S.avermitílis 1-3 (ATCC 53567) törzzsel beoltunk 80 ml AS-7 táptalajt egy 500 ml-es, háromszorosan horpasztott oldalú Erlenmeyer lombikban. A lombikot percenként 200 fordulatszámú rázógépen rázatjuk 28-30 ’C hőmérsékleten. 24 órás inkubálás után nyert tenyészet 1 milliliterével beoltunk egy 300 ml-es lombikban levő 40 ml AP-5 táptalajt. A második fermentálást 28-30 ’C hőmérsékleten végezzük. 24 órás tenyésztés után 400 ppm mennyiséget adagolunk az alábbiakban felsorolt primer vegyületből.
A 312 órás tenyészetből 2 ml mintát veszünk, és azt 8 ml metanol/acetonitril (390:35) eleggyel keverjük össze. Szűrés után 50 μΐ szűrletet injektálunk a Beckman Ultrasphere ODS oszlopra (3,9x250 cm). Az oszlopot metanol/acetonitril/víz (89:14:7) eleggyel eluáljuk, 0,8 ml/perc áramlási sebesség mellett. Detektálás 240 nm-nél. A keletkezett (± 1metil-propil-, ciklopentil-, ciklohexil- és + 1-metilpropil-) avermektinek retenciós idejét az alábbiakban adjuk meg:
'1 retenciós idő (perc) primer vegyület B2 A2
B1 Al
1. ± 2-metil-vajsav *11,60 12,40 *14,75 16,10
2. ciklopentán-karbonsav 12,32 15,86
3. ciklohexán-karbonsav 14,84 19,26
4 (+)2-metil-vajsav 11,60 14,75
23,1 29,82
25,28 32,96
31,46 41,14 29,82
23,1
* Mind a (+)-metil-vajsav, mind a (-)-metil-vajsav beépül az avermektinekbe. Az adott kromatográfiás viszonyok között a ( +) és a (-) avermektiek csak a B2 és az A2 esetében válnak el.
5. példa
500 ml-es háromszorosan horpasztott oldalú Erlenmeyer lombikban levő 100 ml AS-7 táptalajt fagyasztva tárolt S.avermitilis 7881 (ATCC 53692) törzzsel oltunk be. A lombikokat körkörös rázógépen rázatjuk percenként 200 fordulatszám mellett 28-30 ’C hőmérsékleten. 28 órás tenyésztés után 5 ml tenyészettel beoltunk egy 500 ml-es, háromszorosan horpasztott lombikban 100 ml AS-7 táptalajt. A lombikot körkörös rázógépen rázatjuk percenként 200 fordulatszám mellett 28-30 ’C hőmérsékleten. 24 órás tenyészet 1 milliliterével beoltunk egy 300 ml-es lombikban 40 ml AP-5 táptalajt. A lombikot 28-30 ’C hőmérsékleten rázatjuk 200 fordulat/perc fordulatszámmal. A 24. órában 400 ppm ciklohexán-karbonsavat adunk a tenyészethez, és 312 óra után 2 ml mintát veszünk, amit az 1. példában leírtak alapján HPLC-vel analizálunk. Ezek között a körülmények között csak avermektin komponensek mutathatók ki a fermentléből: a ciklohexil B2, 14,84 percnél (54,9 mg/1), a ciklohexil B1 példa primer vegyület száma
31,46 percnél (32,1 mg/1) jelenik meg a kromatogrammon.
6. példa
Az 5. példában leírtak szerint végezzük az eljárást, de a ciklohexil-karbonsav helyett 400 ppm ±2-metil-vajsavat adva a tenyészethez. Az összes többi körülmény azonos a 2. példában leírtakkal. A fermentlében csak szek-butil-avermektin B2 (11,60, 12,40 percnél; 63,5, illetve 42,4 mg/1) és szek-butil-avermektin B1 (23,1 perc: 105,5 mg/1) mutatható ki.
Az előállított vegyületek 0,001-10 mg/kg dózis50 bán hatékonyak.
7-29. példa
Az 5. példa szerinti eljárást ismételjük meg azzal a különbséggel, hogy az alábbiakban felsorolt eljá55 rás további paraméterei megegyeznek a 2. példában megadottakkal. Az alábbi táblázatban a termékek retenciós időit adjuk meg.
avermektin retenciós idő (perc) B2 B1
7. 3-tiofén-karbonsav
8. 3-furán-karbonsav
9. 2-tiofén-karbonsav
10. 2-metil-epnt-4-énsav
6,95 13,79
7,81 14,13 14,7
7,32
11,0 22,2
-10HU 201973 Β
20 példa primer vegyület avermektin retenciós idő (perc) száma B2 BI
11. 2-metiltio-propionsav 7,9 13,353
12. 4-tetrahidropirán-karbonsav 7,55 14,72
13 4-metoxi-2-metil-vajsav 8,72 17,39
14. 3-ciklohexén-karbonsav 12,9 27,9
15. 4-tetrahidro-tiopirán-karbonsav 11,0 22,76
16. 3-tetrahidro-tíofén-karbonsav 8,97 17,96
17. 4,4-difluor-ciklohexán-karbonsav 14,85 32,26
18. 2-ciklopentén-karbonsav 12,43 26,23
19. 1-ciklopentén-karbonsav 12,43 26,23
20. 1-ciklohexén-karbonsav 15,24 33,23
21. 4-exo-metilén-ciklohexán-karbonsav 15,3 34,1
22. 2-furán-karbonsav 7,82 15,31
23. 2-tetrahidrofurán-karbonsav 6,16 11,62
24. 3-tetrahidrofurán-karbonsav 6,17 11,64
25. 2-metilpent-3-insav 10,5 21,78
26. 3,4-dihidropirán-2-karbonsav 7,72 15,10
27. 2-tetrahidropirán-karbonsav 7,55 14,72
28. 3-tetrahidropirán-karbonsav 7,56 14,74
29. 2-tetrahidro-tiopirán-karbonsav 11,00 22,76
A fenti példákban kapott vegyületek megneve- 25 Példa
zése a következő: száma Végtermék neve
Példa száma Végtermék neve
7. 25-(3-tienil-avermektin BI 25-(3-tienil)-avermaktin B2
8. 25-(3-furaml)-avermektin BI 25-(3-furanil)-avermektin B2
9. 25-(2-tienil)-avermektin BI 25-(2-tienil)-avermektin B2
10. 25-(l-metil-but-3-enil)-avermektin BI 25-(l-metil-but-3-enil)-avermektin B2
11. 25-(l-metil-tio-etil)-avermektinBl 25-(l-metil-tio-etil)-avermektin B2
12. 25-(4-tetrahidro-piranil)-avermektin BI 25-(4-tetrahidro-piranil)-avermektin B2
13. 25-(l-metil-3-metoxi-propil)-avermektm BI
25-(l-metil-3-metoxi-propil)-avennektin
B2
14. 25-(3-ciklohexenil)-avermektin BI 25-(3-áklohexenil)-avermektin B2
15. 25-(4-tetrahidro-tiopiranil)-avermektin BI 25-(4-tetrahidro-tiopiranil)-avermektin B2
16. 25-(3-tetrahidro-tienil)-avermektin BI 25-(3-tetrahidro-tienil)-avermektin B2
17. 25-(4,4-difluor-ciklohexanil)-avermektin BI
25-(4,4-difluor-ciklohexanil)-avennektin B2
18. 25-(2-ciklopentenil)-avermektin BI 25-(2-ciklopentenil)-avermektin B2
19. 25-(l-ciklopentenil)-avermektinBl 25-(l-ciklopentenil)-avermektin B2
20. 25-(l-ciklohexenil)-avermektin BI 25-(l-ciklohexenil)-avermektin B2
21. 25-(4-exo-metilén-ciklohexil)-avennektin BI
25-(4-exo-metilén-ciklohexil)-avermektin
B2
22. 25-(2-furanil)-avermektin BI
25-(2-furanil)-avermektin B2
23. 25-(2-tetrahidro-furanil)-avermektin BI 25-(2-tetrahidro-furanil)-avermektín B2
24. 25-(3-tetrahidro-furanil)-avermektin BI
25-(3-tetrahidro-furanil)-avermektin B2
25. 25-(l-metil-but-2-inil)-avennektin BI 25-(l-metil-but-2-ínil)-avennektin B2
26. 25-(3,4-dihidro-pirán-2-il)-avermektin BI 25-(3,4-dihidro-pirán-2-il)-avermektin B2
27. 25-(2-tetrahidro-priaml)-avermektin BI
25-(2-tetrahidro-pirainil)-avermektin B2
28. 25-(3-tetrahidro-piranil)-avermektin BI 25-(3-tetrahidro-piranil)-avermektin B2
29. 25-(2-tetrahidro-tiopiranil)-avennektin BI
25-(2-tetrahidro-tiopiranil)-avermektin B2

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50
    1. Eljárás (I) általános képletű avermektin-Bszármazékok előállítására - ahol
    R* 1 hidroxicsoport, ha a 22,23-kettőskötés hiányzik, vagy hidrogénatom, ha a 22,23-kettőskötés je55 len van,
    R2 (II) képletű 4’-(a-L-oleandrozil)-a-L-oleandrozil-oxi-csoport,
    R3 hidrogénatom, és
    R jelentése α-helyzetben elágazó láncú 3-7 szén60 atomos alkil-, 3-7 szénatomos alkenil·, 3-7 szénatomos alkinil-, (1-4 szénatomos alkoxi)-3-7 szénatomos alkil- vagy (1-4 szénatomos alkil-tio)-2-7 szénatomos alkilcsoport; adott esetben egy vagy két halogénatommal vagy egy metiléncsoporttal
    65 szubsztituált 3-8 szénatomos cikloalkilcsoport; 511
    -11HU 201S’73B
    8 szénatomos cikloalkenilcsoport; furanil-, tetrahidrofuranil-, dihidropiranil-, tetrahidropiranil-, tetrahidro-tiopiranil·, tetrahidrotienil- vagy tienilcsoport, azzal jellemezve, hogyaStreptomycesavermitilis ATCC 53692 törzset vagy annak elágazó láncú-2oxo-sav-dehidrogenáz aktivitással és avermektin-5O-metil-transzferáz aktivitással nem rendelkező mutánsát vagy variánsát asszimilálható nitrogénforrást, szénforrást, szervetlen sókat és RCOOH általános képletű vegyületet - ahol R jelentése a fenti tartalmazó vizes táptalajon, aerob körülmények között tenyésztjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan RCOOH általános képletű vegyüle22 tét használunk, ahol R jelentése ciklohexil-, 3-ciklohexenil-, 1-ciklopentenil-, 1-ciklohexenil-, 4-metilén-ciklohexil-, 4,4-difluor-ciklohexil-, szek-butil, 2-tienil-, 3-tienil-, 4-tetrahidro-pirarúl-, 3-furil-,
    5 3-tetrahidro-tienil-, 4-metil-tio-2-butil- vagy 4-tetrahidro-tiopiranil-, csoport.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan R-COOH általános képletű karbonsavat használunk, ahol R jelentése ciklohexil- vagy
    10 tienilcsoport.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan RCOOH általános képletű vegyületet alkalmazunk, ahol R jelentése α-helyzetben elágazó, 3-7 szénatomszámú alkilcsoport, azonban
    15 izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoporttól eltérő.
HU88260D 1987-01-23 1988-01-22 Process for producing avermeclin beta derivatives HU201973B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US651287A 1987-01-23 1987-01-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT47644A HUT47644A (en) 1989-03-28
HU201973B true HU201973B (en) 1991-01-28

Family

ID=21721247

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU88260D HU201973B (en) 1987-01-23 1988-01-22 Process for producing avermeclin beta derivatives
HU88261A HU200487B (en) 1987-01-23 1988-01-22 Process for producing new demethylavermeltin derivatives

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU88261A HU200487B (en) 1987-01-23 1988-01-22 Process for producing new demethylavermeltin derivatives

Country Status (30)

Country Link
EP (2) EP0276103B1 (hu)
JP (2) JPH0681757B2 (hu)
KR (2) KR900004419B1 (hu)
CN (1) CN1056883C (hu)
AR (1) AR241798A1 (hu)
AT (2) ATE96174T1 (hu)
AU (2) AU595673B2 (hu)
BG (1) BG51051A3 (hu)
BR (1) BR8800271A (hu)
CZ (1) CZ279782B6 (hu)
DD (2) DD267512A5 (hu)
DE (2) DE3884973T2 (hu)
DK (2) DK175720B1 (hu)
EG (1) EG18797A (hu)
ES (2) ES2059498T3 (hu)
FI (2) FI90088C (hu)
GR (1) GR3007586T3 (hu)
HU (2) HU201973B (hu)
IE (2) IE61066B1 (hu)
IL (2) IL85118A (hu)
IN (1) IN167980B (hu)
MA (1) MA21160A1 (hu)
MY (1) MY103514A (hu)
NZ (2) NZ223272A (hu)
PL (2) PL156763B1 (hu)
PT (2) PT86584B (hu)
RU (1) RU1806198C (hu)
SK (1) SK40788A3 (hu)
YU (1) YU47878B (hu)
ZA (3) ZA88447B (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806527A (en) * 1987-03-16 1989-02-21 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US4874749A (en) * 1987-07-31 1989-10-17 Merck & Co., Inc. 4"-Deoxy-4-N-methylamino avermectin Bla/Blb
DE3881147T2 (de) * 1987-10-23 1993-09-02 Pfizer Verfahren zur herstellung von aglykonen von avermectin und sie enthaltende kulturen.
GB8807280D0 (en) * 1988-03-26 1988-04-27 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8811036D0 (en) * 1988-05-10 1988-06-15 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB8813760D0 (en) * 1988-06-10 1988-07-13 American Cyanamid Co Chemical process
GB8815967D0 (en) * 1988-07-05 1988-08-10 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
NZ231772A (en) * 1988-12-23 1992-11-25 Merck & Co Inc Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal compositions thereof
NZ231773A (en) * 1988-12-23 1992-09-25 Merck & Co Inc Avermectin derivatives, preparation and parasiticidal pharmaceutical compositions thereof
US5015630A (en) * 1989-01-19 1991-05-14 Merck & Co., Inc. 5-oxime avermectin derivatives
US4897383A (en) * 1989-02-13 1990-01-30 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5252474A (en) * 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
US5030622A (en) * 1989-06-02 1991-07-09 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5057499A (en) * 1989-06-02 1991-10-15 Merck & Co. Inc. Avermectin derivatives
US5023241A (en) * 1989-07-31 1991-06-11 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US5830875A (en) * 1989-10-30 1998-11-03 Merck & Co., Inc. 24-and 25-substituted avermectin and milbemycin derivatives
JP2888586B2 (ja) * 1990-03-05 1999-05-10 社団法人北里研究所 エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法
US5169839A (en) * 1990-05-11 1992-12-08 Merck & Co., Inc. Derivatives of 3'- and 3"-o-desmethyl avermectin compounds, compositions and methods of treating melmintic and parasitic infections
US5208222A (en) * 1991-03-28 1993-05-04 Merck & Co., Inc. 4"-and 4'-alkylthio avermectin derivatives
US5240915A (en) * 1991-10-15 1993-08-31 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US6103504A (en) * 1992-03-25 2000-08-15 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US5292647A (en) * 1992-11-30 1994-03-08 Eli Lilly And Company Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith
CN1038330C (zh) * 1993-07-05 1998-05-13 塞泰克斯公司 阿弗麦菌素的生产与分离
ES2204914T3 (es) * 1993-07-30 2004-05-01 Pfizer Inc. Genes que codifican el complejo alfa cetoacido deshidrogenasa de cadena ramificada de streptomyces avermitilis.
PL177039B1 (pl) * 1993-10-05 1999-09-30 Pfizer Sposób otrzymywania doramektyny i przeciwpasożytnicze związki pośrednie w syntezie doramektyny
FI942725A (fi) * 1993-12-16 1995-06-17 Pfizer Haaraketjuista alfaketohappodenydrogenaasikompleksia koodaavia geenejä Streptomyces avermitiliksesta
US5701591A (en) * 1995-04-07 1997-12-23 Telecommunications Equipment Corporation Multi-function interactive communications system with circularly/elliptically polarized signal transmission and reception
SK11722000A3 (sk) * 1998-02-13 2001-04-09 Pfizer Products Inc. Gén streptomyces avermitilis riadici pomer b2 : b1 avermektínov
PL203818B1 (pl) * 1999-08-12 2009-11-30 Pfizer Prod Inc Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1
KR100415395B1 (ko) * 2000-08-02 2004-01-16 한국생명공학연구원 에버멕틴 ｂｃ-5-ｏ-메칠트랜스퍼라제의 유전자가 파괴된 스트렙토마이세스 에버미티리스 변이균주 및 그의 제조 방법
SI1476539T1 (sl) 2002-02-12 2009-06-30 Pfizer Prod Inc Gen streptomyces avermitilis, ki uravnava razmerje B2:B1 avermektinov
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
NZ188459A (en) * 1977-10-03 1982-09-07 Merck & Co Inc Derivatives of c-076 compounds and pesticidal compositions
US4429042A (en) 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
GB8606120D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process

Also Published As

Publication number Publication date
CN88100649A (zh) 1988-10-26
DK29088A (da) 1988-07-24
FI90091C (fi) 1993-12-27
PL270239A1 (en) 1989-06-26
KR880009027A (ko) 1988-09-13
ZA88449B (en) 1989-08-30
ATE96174T1 (de) 1993-11-15
SK279351B6 (sk) 1998-10-07
ES2053719T3 (es) 1994-08-01
FI880280A0 (fi) 1988-01-22
JPS63270684A (ja) 1988-11-08
NZ223271A (en) 1991-12-23
FI880281A0 (fi) 1988-01-22
EP0276131A2 (en) 1988-07-27
PT86583B (pt) 1991-12-31
IL85165A0 (en) 1988-07-31
AU7111091A (en) 1991-08-08
FI880280A (fi) 1988-07-24
PL156763B1 (pl) 1992-04-30
DE3879975T2 (de) 1993-07-15
ZA88447B (en) 1989-08-30
FI90088C (fi) 1993-12-27
DK29088D0 (da) 1988-01-22
DE3879975D1 (de) 1993-05-13
JPS63291576A (ja) 1988-11-29
EG18797A (en) 1994-06-30
FI880281A (fi) 1988-07-24
DE3884973D1 (de) 1993-11-25
PL270238A1 (en) 1989-06-26
IE61066B1 (en) 1994-09-21
DK175720B1 (da) 2005-02-07
AU1069688A (en) 1988-07-28
HU200487B (en) 1990-06-28
EP0276103A2 (en) 1988-07-27
PT86583A (en) 1988-02-01
FI90091B (fi) 1993-09-15
IE880160L (en) 1988-07-23
HUT47644A (en) 1989-03-28
BG51051A3 (en) 1993-01-15
IN167980B (hu) 1991-01-19
HUT47978A (en) 1989-04-28
PT86584A (en) 1988-02-01
KR900004419B1 (ko) 1990-06-25
PT86584B (pt) 1991-12-31
MY103514A (en) 1993-07-31
GR3007586T3 (hu) 1993-08-31
EP0276103B1 (en) 1993-10-20
IL85165A (en) 1992-07-15
DE3884973T2 (de) 1994-02-17
PL156764B1 (pl) 1992-04-30
DK28988A (da) 1988-07-24
RU1806198C (ru) 1993-03-30
EP0276103A3 (en) 1989-11-08
AU603416B2 (en) 1990-11-15
EP0276131B1 (en) 1993-04-07
ZA88448B (en) 1989-08-30
DD267512A5 (de) 1989-05-03
AU1074288A (en) 1988-07-28
IE880161L (en) 1988-07-23
ATE87927T1 (de) 1993-04-15
KR880009122A (ko) 1988-09-14
KR910002225B1 (ko) 1991-04-08
MA21160A1 (fr) 1988-10-01
FI90088B (fi) 1993-09-15
EP0276131A3 (en) 1989-10-25
CZ40788A3 (en) 1994-12-15
BR8800271A (pt) 1988-09-06
ES2059498T3 (es) 1994-11-16
JPH0817693B2 (ja) 1996-02-28
YU47878B (sh) 1996-05-20
AU595673B2 (en) 1990-04-05
IE61483B1 (en) 1994-11-02
SK40788A3 (en) 1998-10-07
IL85118A0 (en) 1988-06-30
JPH0681757B2 (ja) 1994-10-19
CZ279782B6 (cs) 1995-06-14
AU631298B2 (en) 1992-11-19
NZ223272A (en) 1989-12-21
DD290214A5 (de) 1991-05-23
YU11988A (en) 1989-08-31
IL85118A (en) 1993-01-31
CN1056883C (zh) 2000-09-27
DK28988D0 (da) 1988-01-22
AR241798A1 (es) 1992-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU201973B (en) Process for producing avermeclin beta derivatives
US5077278A (en) Non-natural demethylavermectins compositions and method of use
HU203130B (en) Process for producing avermectine derivatives
US5565359A (en) Cultures for production of B avermectins
US5238848A (en) Cultures for production of avermectins
EP0313297B1 (en) Process for production of avermectin aglycones and cultures therefor
US5240850A (en) Cultures for production of avermectin aglycones
US5387509A (en) Ethylated avermectins
US5525506A (en) Process for production of avermectins and cultures therefor
US6103504A (en) Process for production of avermectins and cultures therefor
AP64A (en) "Process for production of B avermectins and cultures therefor".