CZ290312B6

CZ290312B6 - Nové kmeny Streptomyces avermitilis a způsob přípravy avermectinu

Info

Publication number: CZ290312B6
Application number: CS1988408A
Authority: CZ
Inventors: Edmund Willliam Hafner; Shih-Jen Edward Lee; Kelvin Scott Holdom
Original assignee: Pfizer Inc.,
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-21
Publication date: 2002-07-17
Also published as: YU47886B; DK28688D0; CN1065277C; IE62467B1; DK175724B1; IL85119A; DE3883408T2; AU7111391A; DK28688A; IE880159L; NO880261L; FI880279L; HU203130B; NO172446B; ES2058244T3; JPH0817694B2; CZ40888A3; MX169293B; AU636709B2; KR880009121A

Abstract

Streptomyces avermitilis postr daj c jednu nebo ob z n sleduj c ch aktivit: dehydrogen zovou aktivitu 2-oxo kyseliny s rozv tven²m °et zcem, charakterizovan² neschopnost sv²ch permeabilizovan²ch bun k produkovat .sup.14.n.CO.sub.2.n. z p°idan [.sup.14.n.C-1]-2-oxoisokapronov kyseliny, a transamin zovou aktivitu aminokyseliny s rozv tven²m °et zcem, charakterizovan² neschopnost r st v m diu postr daj c m L-isoleucin, L-leucin a L-valin. Postup p° pravy avermectinu zahrnuje aerobn fermentaci za pou it kmene Streptomyces avermitilis postr daj c jednu nebo ob z uveden²ch aktivit, vodn ho ivn ho m dia obsahuj c ho asimilovateln² zdroj dus ku, uhl ku a anorganick²ch kyselin a slou eniny schopn vyu it p°i biosynt ze avermectinu.\

Description

Nové kmeny Streptomyces avermitilis a způsob přípravy avermectinu

Oblast techniky

Vynález se týká nových kmenů Streptomyces avermitilis, postrádajících transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a dále postup přípravy avermectinu za pomoci těchto mikroorganizmů.

Dosavadní stav techniky

V patentech Spojených států amerických 4 310 519a 4429042 se popisují avermectiny jako komplex příbuzných látek, které mají vysokou antiparazitální účinnost a také jejich výroby aerobní fermentací kmenů Streptomyces avermitilis, a to zejména Streptomyces avermitilis ATCCč. 31267, 31271 a 31272. Zvláště uvedené dva poslední kmeny jsou k dispozici ve zmrazené nebo lyofilizované formě a byly získány ozářením kmene Streptomyces avermitilis ATCC 31267 ultrafialovým světlem.

V evropském patentovém spisu 214 731, uveřejněném 18. března 1987, který odpovídá patentové přihlášce Spojených států amerických 886 867, podané 16. července 1986, se uvádí celá řada sloučenin, které jsou příbuzné přírodním nebo známým avermectinovým derivátům, avšak nejsou přírodního původu a mají nový substituent v poloze 25. Při použití posledního z uvedených organismů, který byl popsán v evropském patentu 214 731, se uvedený kmen odvozuje od Streptomyces avermitilis ATCC 31271. Při použití tohoto mikroorganizmu je možno získat zlepšené výtěžky nových avermectinových derivátů, substituovaných v poloze 25 v případě, že se tyto mikroorganizmy pěstují na určitém prostředí. Každý z kmenů ATCC 31267, 31272, 31271 aNCIB 12121 může také produkovat kromě nových derivátů, substituovaných v poloze 25, ještě různá množství známých přírodních avermectinů, v nichž je substituentem v poloze 25 izopropylová nebo sek-butylová skupina (neboli 1-methylpropylová skupina).

Základní struktura neboli uhlíková kostra avermectinu, která bude znázorněna v dalším textu, je odvozena od acetátů a propionátů a substituent v poloze 25 přírodních avermectinů je odvozen od L-izoleucinu (R= (S)-sek-butylová skupina) nebo od L-valinu (R= izopropylová skupina), jak je uváděno v publikaci Fisher a Mrozik, „Macrolide Antibiotisc“, Academie Press (1984), kap. 14.

Pod pojmem „známé“ nebo „přírodní“ avermectiny se rozumí ty látky, které jsou produkovány Streptomyces avermetilis ATCC 31267, ATCC 31271 a ATCC 31272, přičemž substituentem v poloze 25 je buď izopropylová skupina nebo (S)-sek.butylová skupina neboli 1-methylpropylová skupina. Avermectin, který obsahuje v poloze 25 jiný substituent než izopropylovou skupinu nebo sek-butylovou skupinu v (S)-formě se nazývají novými avermectiny nebo avermectiny jiného než přírodního původu.

Kmeny Streptomyces avermitilis, které jsou uvedeny ve výše uváděných patentech Spojených států amerických produkují skupinu látek, které se souhrnně označují jako C-076. Tato skupina látek sestává z osmi zřetelně odlišných, avšak blízce příbuzných sloučenin, které se obvykle označují jako C-076, Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a a B2b. Skupina „a“ uvedených sloučenin zahrnuje přírodní avermectiny, v nichž je substituentem v poloze 25 (S)-sek-butylová skupina, skupina „b“ uvedených sloučenin zahrnuje ty látky, v nichž je substituentem v poloze 25 izopropylový zbytek. Označení „A“ a „B“ se týká avermectinu, v nichž substituentem v poloze 5 je v prvním případě methoxyskupina a ve druhém hydroxylová skupina. Číslo „1“ znamená avermectiny, v nichž se v poloze 22 - 23 nachází dvojná vazba a číslo „2“ se týká avermectinů, které obsahují v poloze 22 atom vodíku a v poloze 23 hydroxylovou skupinu.

-1CZ 290312 B6

Pokud se týče popisu předmětného vynálezu nebude užito žádných identifikujících označení, pokud jde o substituent v poloze 25 nových avermectinů. Označení Al, A2, B1 a B2 bylo zachováno pro nové avermectiny, jejichž strukturní vlastnosti odpovídají výše uvedeným strukturním vlastnostem dosud známých avermectinových derivátů.

Tvorba mutantů, postrádajících dehydrogenázovou aktivitu α-ketokyselin s rozvětveným řetězcem, je z dosavadního stavu techniky pro Bacillus subtilis známa, viz například publikace Martin a kol., J. Bacteriology, 115, 198- 204 (1973), přičemž ovšem příprava podobných mutantů nebyla až dosud nikde v publikacích podle dosavadního stavu techniky v případě rodu Streptomyces popsána.

S. avermitilis Agly-1, což je mutant, který produkuje v podstatě pouze aglykony avermectinů Ala a A2a, byl popsán v publikaci Schulman a kol., J. Antibiot., 38 (11), 1494-1498 (1985). V této publikaci se popisuje také fermentace 5. avermitilis Agly- za přítomnosti sinefunginu, čímž je možno dokázat zvýšené produkce složek aglykonu avermectinů B. Stejně také při pěstování Streptomyces avermitilis 0,8, což je vysoce produkční kmen pro přípravu avermectinů, za přítomnosti sinefunginu jako inhibitoru O-methyltransferáz dochází k produkci avermectinových derivátů, které jsou prosté O-methylové skupiny na aglykonu na uhlíkovém atomu v poloze 5 a v oleandrosové disacharidové skupině.

V patentu Spojených států amerických 4 378 353, se popisují sloučeniny, příbuzné látce C-076 a jejich získávání pěstováním MA-5218, což je mutant kmene Streptomyces avermitilis ATCC 31272, získaný ozářením tohoto kmene ultrafialovým světlem. Mutant je identifikován jako ATCC 31780. Sloučeniny, příbuzné látkám C-076, produkované fermentací tohoto mutantu nemají C-076, furanový kruh. Mimoto v některých těchto látkách došlo k odštěpení jedné nebo obou oleandrosových sacharidových skupin, kdežto v jiných látkách této skupiny došlo k oxidaci skupiny v poloze 5 na ketoskupinu.

Podle dosavadního stavu techniky byly specifikovány tři skupiny O-methyltransferázových mutantů Streptomyces avermitilis, které jsou schopné produkovat avermectinové deriváty, v nichž chybí O-methylové skupiny, přičemž v tomto směru je možno poukázat na publikaci Ruby a kol., 6^,h International Symposium on the „Biology of Actinomycetes“, Debrecen, Maďarsko, 26. až 30. srpna 1985 a publikaci Schulman a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7, (1987). První z těchto skupin produkuje převážně avermectiny B vzhledem k neschopnosti methylace hydroxylové skupiny v poloze 5 makrocyklického laktonového kruhu. Druhá skupina těchto mutantů produkuje 3'-0, 3-0-bis-demethylavermectiny (avermectiny, které nemají O-methylový zbytek jako substituent v poloze 3 na obou oleandrosových monosacharidových zbytcích), tyto látky se nazývají demethylavermectiny. Třetí skupina mutantů není schopna methylace v žádné poloze.

V publikaci Schulman a další, Fed. Proč. 44, 931 (1985) se popisuje zvýšená produkce avermectinů B fermentací Streptomyces avermitilis za přítomnosti různých látek, například sinefunginu, S-adenosylethioninu a S-adenosylhomocysteinu, které inhibují methylaci hydroxylové skupiny v poloze 5 aglykonové skupiny působením enzymu avermectinů B-Omethyltransferázy. Mutanty Streptomyces avermectilis, které postrádají O-methyltransferázovou aktivitu a produkují zvýšené množství složek avermectinů B, byly rovněž popsány v publikaci Schulman a kol., Antimicrobial Agents and Chemistry 29, 620-624 (1986).

Mutagenezí Streptomyces avermitilis je možno získat mutanty, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem. Mutagenezí takto získaných jednoduše blokovaných mutantů je možno dále získat mutanty, které postrádají jak dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem, tak transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem. Tyto mutanty již nemají schopnost produkovat větší množství přírodních avermectinů

-2CZ 290312 B6 v nepřítomnosti přidaných sloučenin vzorce RCOOH, ve kterém R znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu nebo při přidání sloučeniny, kterou je možno na uvedenou sloučeninu převést v průběhu fermentačního postupu. Je však překvapující a neočekávané, že tyto mutanty mohou produkovat avermectiny, a to přírodního i nepřírodního původu v případě, že se fermentace provádí v přítomnosti sloučenin vzorce R'COOH, kde R' znamená izopropylovou skupinu, (S)-sek-butylovou skupinu nebo jinou skupinu, tak, jak bude dále uvedeno, nebo prekurzor uvedené sloučeniny. Ještě více je překvapující, že mutanty, které postrádají pouze dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a které tedy nejsou schopny rozkládat L-izoleucin nebo L-valin, jsou schopné asimilovat celou řadu sloučenin na různé deriváty avermectinu nepřírodního původu, které jsou prosté přírodních avermectinů.

Překvapující je také zjištění, že mutanty, které postrádají transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem a které jsou proto neschopné rozkládat L-izoleucin, L-leucin nebo L-valin a požadují tyto tři aminokyseliny ke svému růstu, jsou schopné asimilovat také jiné sloučeniny za vzniku nepřírodních avermectinů, které jsou prosté přírodních avermectinů.

Jak již bylo uvedeno, jsou přírodní avermectiny produkovány jako komplexní směs osmi zřetelně odlišných, avšak blízce příbuzných sloučenin, u nichž v dále uvedeném obecném vzorci I R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu. Tyto látky byly sice izolovány ve v podstatě čistém stavu, jak bylo popsáno v patentu Spojených států amerických 4 429 042, avšak způsob izolace je přinejmenším pracný. Při produkci nepřírodních avermectinů postupem podle evropského patentu č. 214 731 může dojít také k tvorbě určitého množství přírodních avermectinů v závislosti na přítomnosti dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a aminokyselin L-valinu a L-izoleucinu v buňce mikroorganismu S. avermitilis, který je užit k produkci těchto látek.

Možnost volit produkci buď přírodních nebo nepřírodních avermectinů a tak snížit počet a komplikovanost získaných produktů na co nejmenší možnou míru za současného zvýšení čistoty těchto látek a zjednodušení celého postupu by proto bylo velmi žádoucí.

Kmeny Streptomyces avermitilis, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem jsou produkovány mutací kmene Streptomyces avermitilis, produkujícího avermectin, zejména mutacemi kmenů ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 nebo NCIB 12121. Další mutací kmenů, které nemají jednu z uvedených vlastností, je možno získat kmeny, jimž chybí oba uvedené enzymy. Tyto mutanty jsou neschopné syntetizovat přírodní avermectinové deriváty, pokud do prostředí, v němž jsou pěstovány, není přidána alifatická kyselina s obsahem izopropylové skupiny nebo (S)-sek-butylové skupiny nebo prekurzor této látky. Tyto mutanty jsou schopné produkovat přírodní i nepřírodní avermectiny v případě, že jsou pěstovány ve vodném prostředí za aerobních podmínek za přítomnosti příslušné primární kyseliny nebo sloučeniny, která je v průběhu fermentačního postupu na tuto sloučeninu převeditelná.

Tyto mutanty, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem, se izolují z kolonií po působení příslušných činidel na základě zkoušky na značený oxid uhličitý. V tomto pokusu prokazuje nepřítomnost značeného oxidu uhličitého ¹⁴CO2 nad permeabilizovanou kolonií při použití substrátu, kterým je kyselina [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronová, [¹⁴C—1]—

2-oxo-3-methylvalerová nebo [¹⁴C-l]-2-oxo-3-methylmáselná, nepřítomnost dehydrogenázové aktivity 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem.

Mutanty, které jsou charakterizovány tím, že postrádají transaminázovou aktivitu aminokyselin, se izolují z kolonií na základě své neschopnosti růstu na prostředí, které neobsahuje L-izoleucin, L-leucin, a L-valin. Postup se provádí tak, že se jednotlivé kolonie, pěstované na agarovém médiu s M9 solemi na bázi glukózy a všemi jednotlivými aminokyselinami vyskytujícími se v kasaminové kyselině, přenesou do podobného prostředí, které však neobsahuje L-izoleucin,

-3CZ 290312 B6

L-leucin a L-valin. Popsané mutanty, které postrádají pouze transferázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem mohou využívat 2-oxokyseIiny jako prekurzory pro výrobu avermectinů.

Je překvapující a neočekávané, že popsané mutanty, jimž chybí dehydrogenázová aktivita

2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázová aktivita aminokyselin s rozvětveným řetězcem si uchovávají schopnost produkovat avermectiny, zvláště nepřírodní avermectiny. Neschopnost mutantů produkovat přírodní mastné acylové deriváty koenzymu A při pěstování na běžném médiu by mohlo být letální mutací v případě, že by na těchto derivátech závisela celistvost membrány nebo v případě, že by nahromadění 2-oxokyseliny bylo toxické. Mimoto o žádném z těchto mutantů se nepředpokládá, že produkuje acetyl CoA a propionyl CoA při degradaci L-izoleucinu a L-valinu, protože je přitom zapotřebí enzymů, které mutanty neobsahují. Požadavek na přítomnost derivátů acyl CoA pro biosyntézu avermectinů vedl k očekávání, že mutanty by neměly produkovat ani nepřírodní avermectiny, což se však nepotvrdilo.

Nepřítomnost dehydrogenázové aktivity 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem v popsaných mutantech má za následek zabránění syntézy mastných acylových derivátů CoA s rozvětveným řetězcem při degradaci L-izoleucinu, L-leucinu a L-valinu a tím i zabránění syntézy přírodních avermectinů. Podobně mutanty, které postrádají transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem, také nemohou syntetizovat mastný acylový derivát CoA s rozvětveným řetězcem, takže také nejsou schopné produkovat přírodní avermectiny.

Neschopnost syntetizovat uvedený derivát má dvě příčiny. První příčina spočívá ve skutečnosti, že mutanty, které neobsahují transaminázu nemohou syntetizovat 2-oxokyseliny s rozvětveným řetězcem z izoleucinu, leucinu a valinu, přidaného do živného prostředí běžnou transaminací. Druhou příčinou je skutečnost, že produkce 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem z aminokyselin s rozvětveným řetězcem v buňkách je omezována nutností včlenění těchto aminokyselin do fermentačního prostředí. Přítomnost těchto aminokyselin brání uskutečnění této biosyntézy a tím i produkci 2-oxokyselin známým mechanismem zahrnujícím enzymovou represi a zpětnou inhibici působením aminokyselin, které jsou konečnými produkty této biosyntézy. Protože 2-oxokyseliny, které jsou substrátem pro dehydrogenázu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem, nejsou přítomny, znamená to i účinnou zábranu tvorby mastného acylového derivátu CoA s rozvětveným řetězcem. Při provádění postupu podle vynálezu se tedy užívají mutanty, které neobsahují dehydrogenázu uvedených 2-oxokyselin, mutanty, které neobsahují uvedenou transaminázu a mutanty, které neobsahují oba svrchu uvedené enzymy.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález se týká nových kmenů Streptomyces avermitilis postrádajících jednu nebo obě z následujících aktivit:

dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo kyseliny s rozvětveným řetězcem, což je charakterizováno neschopností svých permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂ z přidané [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny, a transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, což je charakterizováno neschopností růst v médiu postrádajících L-izoleucin, L-leucin a L-valin.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je nový kmen Streptomyces avermitilis, postrádající dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo-kyselin s rozvětveným řetězcem, charakterizovaný neschopností svých permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂ z přidané [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny.

-4CZ 290312 B6

Dalším aspektem předmětného vynálezu je Streptomyces avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567 nebo ATCC 53568.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je Streptomyces avermitilis, postrádající transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, charakterizovaný neschopností růst v médiu postrádajícím L-izoleucin, L-leucin a L-valin.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je Streptomyces avemitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53669 nebo ATCC 53670.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je Streptomyces avermitilis, neschopný produkovat látku C-076 při fermentaci ve vodném živném médiu, obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí za aerobních podmínek, přičemž toto médium je prosté kyseliny obecného vzorce:

R'-COOH nebo sloučeniny převeditelné na tuto kyselinu působením S. avermitilis, přičemž R' znamená izopropylovou skupinu, nebo (S)-sek-butylovou skupinu, ale schopný produkovat látku C-076 při fermentaci v tomto médiu, kdy toto médium obsahuje kyselinu obecného vzorce:

R'-COOH nebo sloučeninu převeditelnou na tuto kyselinu působením S. avermitilis, kde R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je Streptomyces avermitilis, výhodně výše uvedeného typu, kde uvedeným S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží postup přípravy avermectinu, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje aerobní fermentaci za použití kmene Streptomyces avermitilis postrádajícího jednu nebo obě z aktivit zahrnujících dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo-kyseliny s rozvětveným řetězcem a transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, podle některého z nároků 1 až 7, vodného živného média obsahujícího asimilovatelný zdroj dusíku, uhlíku a anorganických kyselin a sloučeniny schopné využití při biosyntéze avermectinu.

Ve výhodném provedení tohoto postupu je sloučeninou schopnou využití při biosyntéze avermectinu kyselina obecného vzorce:

R-COOH nebo sloučenina převeditelná na uvedenou kyselinu působením S. avermitilis, ve kterém R má jiný význam než izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu.

Podle dalšího výhodného provedení tohoto postupu kmenem S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.

Podle dalšího výhodného provedení tohoto postupu je uvedenou sloučeninou sloučenina obecného vzorce

R-COOH ve kterém R znamená skupinu s alfa-rozvětveným řetězcem, jejíž uhlíkový atom, ke kterému je připojena skupina -COOH, je rovněž připojen k přinejmenším dvěma jiným atomům nebo

-5CZ 290312 B6 skupinám jiným než atom vodíku, nebo sloučenina převeditelná na uvedenou sloučeninu během fermentačního procesu.

Podle dalšího výhodného provedení v uvedené sloučenině znamená R' alfa-rozvětvenou alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, alkoxyalkylovou skupinu nebo alkylthioalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, cykloalkylalkylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, kde alkylová skupina je alfa-rozvětvená alkylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo cykloalkenylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, přičemž libovolná z těchto skupin může být případně substituována methylenovou skupinou nebo jednou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů, nebo znamená tříčlenný až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycen nebo zcela nebo částečně nenasycen, přičemž může být případně substituován jednou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů, nebo sloučenina převeditelná na tuto sloučeninu během fermentačního procesu.

Podle dalšího výhodného provedení je uvedenou sloučeninou převeditelnou na substrát RCOOH sloučenina obecného vzorce:

R-(CH₂)_n-Z ve kterém:

R má stejný význam jako bylo definováno shora, n je 0, 2,4 nebo 6, a

Z znamená skupinu -CH₂OH, -CHO, -COOR⁵, -CH₂NH₂ nebo skupinu -CONHR⁶, kde

R⁵ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH nebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃, nebo v případě, kdy kmen S. avermitilis postrádá pouze transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, je sloučeninou převeditelnou na substrát R'-COOH sloučenina

R-CO-Z.

Podle dalšího výhodného provedení postupu podle vynálezu je substituentem R: cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina, cykloheptylová skupina,

2- methylcyklopropylová skupina,

3- cyklohexenylová skupina,

1-cyklopentenylová skupina,

1-cyklohexenylová skupina,

3- methylcyklohexylová skupina (cis/trans),

4— methylencyklohexylová skupina,

3-methyIcyklobutylová skupina,

3-methylencyklobutylová skupina,

3-cyklopentenylová skupina,

1-cyklopropylethylová skupina,

3-fluorcyklobutylová skupina,

-6CZ 290312 B6

4,4-difluorcyklohexylová skupina, izopropylová skupina, sek-butylová skupina,

2-pentylová skupina,

2,3-dimethylpropylová skupina,

2-hexylová skupina,

2-pent-4-enylová skupina,

2-methylthioethylová skupina,

S-2-methylpentylová skupina,

R-2-methylpentylová skupina,

2- thienylová skupina,

3- thienylová skupina,

4- tetrahydropyranylová skupina,

3-furylová skupina,

2- chlorthienylová skupina,

3- tetrahydrothienylová skupina,

4- methylthio-2-butylová skupina,

4-tetrahydrothiopyranylová skupina,

4-methoxy-2-butyIová skupina nebo

4-methylthio-2-butylová skupina.

Ve výhodném provedení substituent R znamená cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu nebo thienylovou skupinu.

Podle dalšího výhodného provedení substituent R znamená alfa-rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, a není izopropylová skupina nebo (S)-sek-butylová skupina.

Podle dalšího výhodného provedení tohoto postupu podle vynálezu, kmenem S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží nový kmen náležící do rodu Streptomyces, který neprodukuje látku C-076 při fermentaci ve vodném živném médiu obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických kyselin za aerobních podmínek, přičemž toto médium je prosté kyseliny obecného vzorce

R'-COOH nebo sloučeniny převeditelné na tuto kyselinu, S. avermitilis, ve kterém R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu, ale schopný produkovat látku C-076 při fermentaci v uvedeném médiu, kdy toto médium obsahuje kyselinu obecného vzorce

R'-COOH nebo sloučeninu převeditelnou na tuto kyselinu, S. avermitilis, ve kterém R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu, kde uvedený kmen se získá procesem zahrnujícím mutaci Streptomyces avermitilis ATCC 31271, ATCC 31272 nebo jejich mutantů a selekci kmenů charakterizovaných neschopností permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂z přidané [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny a/nebo neschopností růst v médiu postrádajícím L-izoleucin, L-leucin a L-valin.

Z výše uvedeného popisu a z části popisující dosavadní stav techniky je zřejmé, že je možno k danému účelu použít jakéhokoliv mikroorganismu, který je možno získat transformací, transdukcí, genetickou rekombinací nebo některými jinými genetickými postupy při použití

-7CZ 290312 B6 nukleových kyselin nebo ekvivalentního materiálu z popsaných mikroorganismů a tak dosáhnout přenesení vlastností těchto mikroorganismů na další mikroorganismy.

Pod pojmem „avermectin“ nebo „avermectiny“, tak, jak se užívají v popisu předmětného 5 vynálezu se rozumí sloučeniny obecného vzorce:

ve kterém:

přerušovaná čára na poloze 22-23 znamená případně přítomnou dvojnou vazbu,

R¹ znamená hydroxyskupinu, přičemž tato skupina je přítomná pouze v případě, že není přítomna dvojná vazba,

R² znamená 4'-(alfa-L-oleandrosyl)-alfa-L-oleandrosyloxyskupinu vzorce:

a R³ znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu.

Substituentem R v poloze 25 může být jakákoliv skupina, která je v této poloze asimilovatelná určitým kmenem Streptomyces avermitilis podle vynálezu.

Jak již bylo uvedeno výhodně substituent R znamená alfa-rozvětvenou alkylovou, alkenylovou, alkoxyalkylovou nebo alkylthioalkylovou skupinu, které obsahují 3 až 8 atomů uhlíku, alfa-rozvětvenou alkinylovou skupinu obsahující 4 až 8 atomů uhlíku, cykloalkylalkylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, přičemž uvedená alkylová skupina je alfa-rozvětvená 25 alkylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, dále cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až

-8CZ 290312 B6 atomů uhlíku nebo cykloalkenylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, přičemž každá z těchto skupin je případně substituovaná methylenovou skupinou nebo jednou alkylovou skupinou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů, nebo dále znamená tříčlenný až šestičlenný heterocyklický kruh obsahující atom kyslíku nebo síry, který může být nasycený nebo zcela nebo částečně nenasycený, přičemž může být případně substituován jednou alkylovou skupinou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů.

Popsané mutanty jsou velmi cenné pro přípravu nepřírodních avermectinů způsobem, který je popsán v tomto popisu a ilustrován následujícími konkrétními příklady provedení. Postup je zvláště cenný pro výrobu výhodných avermectinových derivátů, tj. sloučenin, v nichž substituentem v poloze 25 je cykloalkylová skupina nebo cykloalkenylová skupina vždy obsahující 4 až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovaná alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, 1-methylthioethylová skupina nebo heterocyklický kruh obsahující 5 nebo 6 atomů v kruhu, který obsahuje rovněž atomy kyslíku nebo síry, zvláště 3-thienylová skupina nebo 3-furylová skupina.

Mutace určitého kmene Streptomyces avermitilis, produkujícího avermectin se provádí známým způsobem a je možno při něm použít celé řady mutačních činidel, jakým jsou například ultrafialové světlo, rentgenové paprsky, přidání N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu, ethylmethansulfonátu, kyseliny dusité a dalších zdrojů dusíku, například N-methyl-bis(2-chlorethyl)amin a podobně. Tvorbu mutací je možno uskutečnit jak na sporách, tak na vegetativních kulturách kmenů Streptomyces avermitilis, které jsou schopné produkovat přírodní avermectiny, například je možno použít kmene S. avermitilis ATCC 31272.

Na základě postupů, které jsou v tomto oboru z dosavadního stavu techniky velmi dobře známy, je možno kolonie, získané mutagenezí podrobí selekci na nepřítomnost dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem při použití biochemických postupů, které dovolují vyšetření velkého počtu bakteriálních kolonií, které byly podrobeny náhodné mutagenezi podle produkce ¹⁴CO₂ ze zvolených [¹⁴C-l]-2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem, jak bylo popsáno v publikaci Tábor a kol., J. Bací. 128, 485-486,1976.

Tento postup spočívá vtom, že se pěstují kolonie získaných mutantů v jímkách mikrotitrační plotny na vhodném živném prostředí, prostupnost buněk se zvýší působením toluenu a pak se přidá zvolená [¹⁴C-l]-2-oxo-kyselina, například kyselina 2-oxoizokapronová do každé jímky a prostředí se testuje nad jednotlivými jímkami na přítomnost značeného oxidu uhličitého ¹⁴CO2. Je možno také užít kyselinu [¹⁴C-l]-2-oxo-3-methylvalerovou nebo kyselinu [¹⁴C-l]-2-oxo-3methylmáselnou místo kyseliny [¹⁴C-l-]-2-oxoizokapronové. Produkce značeného oxidu uhličitého ¹⁴CO2 se snadno zjišťuje tak, že se jednotlivé jímky překryjí vlhkým filtračním papírem, nasyceným hydroxidem bamatým, aby bylo možno zachytit veškerý podíl značeného oxidu uhličitého a prokázat jej ve formě značeného uhličitanu bamatého autoradiografií. Mutanty, které postrádají dehydrogenázou aktivitu 2-oxo-kyselin s rozvětveným řetězcem poskytují autoradiogramy, které se blíží těm, které byly získány od nenaočkovaných kontrolních kolonií, to znamená, že mutanty neprodukují žádný značený uhličitan bamatý Ba¹⁴CO₃.

Takto získané mutanty se pak podrobí další mutagenezi při použití jakéhokoliv výše uvedeného činidla, které může způsobit vznik mutace. Takto získané kolonie se izolují a oddělí se aminokyseliny s rozvětveným řetězcem postrádající transferázovou aktivitu, protože tyto kolonie nemohou růst na minimálních plotnách M9/glukóza bez přítomnosti L-izoleucinu, L-leucinu aL-valinu (ILV). Ktomu aby nastal růst kolonií musí být na médiu přítomny všechny tři aminokyseliny. Mimoto se ukázalo, že mutanty, neobsahující transaminázu nerostou na prostředcích, doplněných všemi třemi ketokyselinami, které slouží jako substráty pro transaminázové reakce. Jediný transaminázový enzym tedy katalyzuje transaminaci všech těchto tří ketokyselin, a to 2-oxo-3-methylvalerové, 2-oxoizokapronové a 2-oxoizovalerové.

-9CZ 290312 B6

Dvojnásobné blokované mutanty, jimž chybí jak dehydrogenázová aktivita 2-oxokyseIin s rozvětveným řetězcem, tak transaminázová aktivita aminokyselin s rozvětveným řetězcem, mají zvláštní význam, protože pravděpodobnost jejich reverze na kultury produkující přírodní avermectin je výjimečně malá. Jednoduše blokované mutanty se za některých okolností mohou měnit zpět na kultury produkující přírodní avermectiny.

Kromě produkce požadovaných alel produkovaných daným kmenem mikroorganismů mutagenezí, umožňuje protoplastová fuze rovněž včlenění požadovaných alel z jednoho kmene nebo jeho chromozomu do druhého kmene. Například je možno spojit protoplasty kmene 10 Streptomyces avermitilis, postrádající dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem s kmenem, který tyto enzymy obsahuje, čímž může vzniknout kmen, kterému chybí pouze transaminázová aktivita aminokyselin s rozvětveným řetězcem. Z dosavadního stavu techniky v tomto oboru je známo, že spojení protoplastů je možno provádět v kombinaci požadovaných alel z divergentních linií. 15 Popsaný kmen Streptomyces avermitilis JC-923 (AECC 53669), který postrádá transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem, byl získán uvedenou technologií.

Vlastnosti mutantů, pokud jde o morfologické a kultivační charakteristiky, byly popsány v patentu Spojených států amerických 4 429 042. Mutanty je možno odlišit podle toho, že 20 postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem, jak již bylo uvedeno. Nedostatek svrchu uvedených enzymů v mutantech zabraňuje těmto mutantům produkovat přírodní avermectiny při pěstování na definované médium, které je v podstatě prosté mastných kyselin obecného vzorce R'COOH, v němž R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek.butylovou 25 skupinu nebo sloučeniny, které je možno na uvedené látky převést v průběhu fermentace.

Taxonomické výzkumy, prováděné Američan Type Culture Collection, potvrdily, že vlastnosti dvou mutantů 1-3 a HL-026, které byly izolovány svrchu uvedeným sledováním značeného oxidu uhličitého ¹⁴CO₂, jsou velmi blízké vlastnostem původního kmene ATCC 31272, který byl popsán v patentu Spojených států amerických 4 429 042, avšak s některými rozdíly. Mutant 1-3 30 (ATCC 53567) tvoří podstatně méně řetězců spor než původní kmen, mutant HL-026 (ATCC 53568) prakticky netvoří vzdušné mycelium a spory, avšak nepatrné množství řetězců spor, které vytvářejí, má podobný charakter jako v případě kmene ATCC 31272. Mutant HL-026 také patrně špatně využívá rafinózu jako jediný zdroj uhlíku, kdežto mateřský kmen a mutant 1-3 rafinózu využívají. V našich pokusech však nevyužíval rafinózu žádný z uvedených kmenů. Další 35 vlastnosti mutantů HL-026 byla skutečnost, že tento kmen produkoval menší množství melaninového pigmentu než oba ostatní kmeny a zvláště tento pigment neprodukoval na agaru styrosinem. Na rozdíl od popisu kmene ATCC 31272 v patentu Spojených států amerických 4 429 042 nebylo možno prokázat růst mateřského kmene ani mutantů na sacharóze jako jediném zdroji uhlíku. Mutanty 1-3 a HL-026 neprojevují pouze dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin 40 s rozvětveným řetězcem. Mutant PGS-119 (ATCC 53670), který je dvojnásobně deficientní, byl získán další mutací mutantu 1-3 (ATCC 53567). Mutant JC-293 (ATCC 53669), který byl získán spojením protoplastů, má podobný vztah k mateřskému kmeni jako mutant 1-3.

Kmeny Streptomyces avermitilis 1-3 a 7881 byly uloženy v mezinárodní sbírce kultur Američan 45 Type Culture Collection, Rockwille, Maryland, odkud je možno oba uvedené kmeny volně získat. Tyto kmeny byly označeny Streptomyces avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 a ATCC 53670. Uložené kultury jsou v průběhu řízení mateřské přihlášky dostupné pouze podle ustanovení Commissioner of the Unitet States Patent and Trademark Office pod označením 37 CFR 1.14 a 35 USC 122 v souladu se zákonem. Všechna omezení dostupnosti 50 uvedených mikroorganismů, uložených v uvedené sbírce však budou neodvolatelně zrušena, jakmile bude na původní přihlášku udělen patent.

-10CZ 290312 B6

Každý z kmenů S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 a BCIB 12121 je schopen produkce přírodních avermectinů, které je možno označit následujícím obecným vzorcem I:

ve kterém:

přerušovaná čára v poloze 22-23 znamená případnou dvojnou vazbu

R¹ znamená hydroxylovou skupinu, která je přítomna pouze v případě, že není přítomna dvojná vazba,

R² znamená 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyl- skupinu vzorce

ch₃0 ch₃o

R³ znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu, a

R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu.

V patentu Spojených států amerických č. 4 285 963 se popisuje avermectin obecného vzorce I, který je v poloze 25 substituovaný methylovou a ethylovou skupinou, R¹ znamená hydroxylovou skupinu a R³ znamená methylový zbytek.

V avermectinech jiného než přírodního původu, které je možno získat způsobem podle vynálezu znamená R odlišný substituent od izopropylové nebo (S)-sek-butylové skupiny.

-11 CZ 290312 B6

Sloučeniny, které je možno využít při biosyntéze sloučenin obecného vzorce I se nacházejí v buňce Streptomyces avermitilis. Tyto sloučeniny, a to L-valin, L-leucin a L-izoleucin patrně vstupují do biosyntézy avermectinů přeměnou na 2-oxokyseliny s následnou dekarboxylací těchto kyselin působením dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem, současně se produkt váže na koenzym A. Přítomnost těchto látek je příčinou současné tvorby izopropylových derivátů a (S)-sek-butylových derivátů sloučenin obecného vzorce I, což vytváří problémy při oddělování izopropylových a (S)-sek-butylových derivátů sloučenin obecného vzorce I.

Při fermentaci v živném prostředí s obsahem příslušného primeru produkují výše uváděné mutanty sloučeniny obecného vzorce I nebo obvykleji směs dvou nebo většího počtu sloučenin obecného vzorce I, v nichž R odpovídá použitému primeru. Mohou vznikat až čtyři produkty, které se obvykle uvádějí jako R-avermectin Al, A2, Bl a B2 podle označení v patentu Spojených států amerických č. 4 429 042. Skupinou R je substituent na uhlíkovém atomu v poloze 25. V případě, že R je cyklopentylová skupina, mohou například vzniknout čtyři možné avermectinové deriváty:

triviální název	R¹	R³
cyklopentyl avermectin Al	dvojná vazba	ch₃
cyklopentyl avermectin A2	hydroxyskupina	ch₃
cyklopentyl avermectin Bl	dvojná vazba	H
cyklopentyl avermectin B2	hydroxyskupina	H

V nepřírodních avermectinech je substituent R na uhlíkovém atomu v poloze 25 ve sloučeninách obecného vzorce I odlišný od izopropylové skupiny, nebo od (S)-sek-butylové skupiny.

Sloučeniny obecného vzorce I, v nichž je přítomna dvojná vazba a které neobsahují hydroxylovou skupinu je možno získat také z odpovídajících sloučenin obecného vzorce I, v němž R¹ znamená hydroxylovou skupinu a sloučenina neobsahuje dvojnou vazbu, dehydratací. Reakce se provádí tak, že se nejprve provede selektivní chránění hydroxylových skupin, které se nacházejí v polohách 5 a 4, například navázáním terc.butyl-dimethylsilyloxyacetylové skupiny, načež se provádí reakce se substituovaným thiokarbonylchloridem, přičemž následuje zahřívání ve vysokovroucím organickém rozpouštědle, například v trichlorbenzenu k dosažení dehydratace.

V získaném produktu se pak odštěpí chránící skupiny, čímž se získá nenasycená výsledná látka. Tento postup spolu s příslušnými reakčními činidly a reakčními podmínkami je popsán v patentu Spojených států amerických č. 4 328 335.

Sloučeniny obecného vzorce I, v němž R³ znamená atom vodíku, je rovněž možno získat z odpovídajících sloučenin, v nichž R³ znamená methylovou skupinu, demethylací. Tato reakce se provádí tak, že se na 5-methoxy-sloučeninu nebo na její vhodným způsobem chráněný derivát působí octanem rtuťnatým a výsledný 3-acetoxyenolether se pak hydrolyzuje zředěnou kyselinou na požadovanou 5-keto-sloučeninu. Tato látka se pak redukuje například při použití borohydridu sodíku, čímž se získá 5-hydroxyderivát. Příslušná činidla a reakční podmínky pro tyto postupy jsou popsány v patentu Spojených států amerických č. 4 423 209.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R¹ znamená atom vodíku a dvojná vazba není přítomná, je možno získat z odpovídajících sloučenin, které obsahují dvojnou vazbu a neobsahují substituent R¹, selektivní katalytickou hydrogenací při použití příslušného katalyzátoru. Redukci je možno uskutečnit například za použití tris-(trifenylfosfm)rhodiumchloridu s obsahem jednovazného rhodia, přičemž tento postup je popsán ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č.O 001 689 a v odpovídajícím patentu Spojených států amerických č. 4 199 569, vydaném 22. dubna 1980.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R² znamená atom vodíku, je možno získat zodpovídajících sloučenin, v nichž R² znamená 4-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxyskupinu tak, že se odstraní tato 4-(α-L·-oleandrosyl)-α-L·-oleandrosylová skupina mírnou

-12CZ 290312 B6 hydrolýzou působením kyseliny ve směsi vody a organického rozpouštědla, čímž se získá aglykon s hydroxyskupinou v poloze 13. Tento aglykon se pak halogenuje, například reakcí s benzensulfonylhalogenidem, čímž se získá 13-deoxy-13-halogenovaný derivát, který se pak podrobí selektivní redukci, například při použití hydridu tributylcínu. Aby bylo možno zabránit nežádoucím vedlejším reakcím je vhodné chránit jakékoliv další případně přítomné hydroxylové skupiny, například za pomoci terc.butyldimethylsilylové skupiny. Tuto skupinu je pak možno snadno odstranit po provedené halogenaci nebo redukci působením methanolu, který obsahuje malé množství kyseliny. Všechny tyto postupy jsou spolu s příslušnými reakčními činidly areakčními podmínkami při jejich provádění popsány ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 0 002 615.

Sloučeniny, které je možno využít při fermentaci Streptomyces avermitilis pro biosyntézu avermectinů, jak přírodního tak nepřírodního původu, je možno vyjádřit obecným vzorcem Π-Α

R-COOH (II-A) včetně sloučenin, které je možno převést na sloučeniny H-A v průběhu fermentačního postupu. Tyto látky jsou také nazývány „primery“. V obecném vzorci Π-A znamená R skupinu s řetězcem v α-poloze, přičemž atom uhlíku, k němuž je vázána skupina -COOH, je rovněž vázán na alespoň dva další atomy nebo skupinu, odlišnou od atomu vodíku. Je zřejmé, že toto vymezení zahrnuje nasycené i nenasycené acyklické a cyklické skupiny, včetně skupin, které popřípadě obsahují jako heteroatom atom kyslíku nebo síry jako člen acyklického řetězce nebo kruhu.

Konkrétně je tedy možno uvést, že substituentem R, který se nachází v poloze 25, může tedy být alkylový zbytek, alkenylový zbytek, alkinylový, alkoxyalkylový nebo alkylthioalkylový zbytek obsahující v každém jednotlivém případě 3 až 8 atomů uhlíku, rozvětvený v poloze a, cykloalkylalkylový zbytek obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, v němž alkylová skupina obsahuje 2 až 5 atomů uhlíku a je rozvětvena v poloze a, dále cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo cykloalkenylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, vždy popřípadě substituovaný methylenovým zbytkem nebo jednou nebo větším počtem alkylových skupin obsahujících 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenu vybranými ze souboru zahrnujícího fluor, chlor, jod nebo brom, dále heterocyklický zbytek obsahující 3 až 6 atomů v kruhu s obsahem kyslíku nebo síry, a to nasycený nebo zcela nebo částečně nenasycený a popřípadě substituovaný jednou nebo větším počtem alkylových skupin nebo atomů halogenu.

Sloučeniny, které je možno převést na tyto sloučeniny obecného vzorce RCOOH, tj. prekurzory, které je možno v průběhu fermentačního postupu na tyto sloučeniny převádět, je možno vyjádřit obecným vzorcem Π-Β

R-(CH₂)_n-Z (Π-Β) ve kterém:

R má stejný význam jako bylo uvedeno výše, n znamená 0,2,4, nebo 6 a

Z znamená skupiny -CH₂OH, -CHO, -CH₂NH₂, -COOR⁴ nebo -CONHR⁵ kde R⁴ znamená atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 6 atomech uhlíku a

R⁵ znamená atom vodíku, alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku nebo zbytek aminokyseliny, zvláště asparagové, glutamové nebo methioninu, například -CH(COOH)-CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH a -CH(COOH)(CH₂)₂SCH3.

-13CZ 290312 B6

V případě kmenů Streptomyces avermitilis, postrádajících pouze transaminázu aminokyselin s rozvětveným řetězcem, mohou být 2-oxokyseliny použity jako prekurzory. To znamená, že tyto kmeny jsou schopné využívat sloučenin obecného vzorce II-C

R-CO-Z (II-C) kde R a Z mají stejný význam jako bylo uvedeno shora, pro biosyntézu uvedených avermectinových derivátů.

Do rozsahu vynálezu spadají rovněž izomemí formy sloučenin obecného vzorce II-A a sloučeniny, které je možno na tyto látky převést v průběhu fermentačního postupu a způsob výroby izomemích avermectinů na uhlíkovém atomu v poloze 25 při jejich použití.

Postup podle vynálezu se provádí tak, že se pěstuje za aerobních podmínek kmen Streptomyces avermitilis, postrádající dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem, ve vodném živném prostředí, které obsahuje využitelný zdroj dusíku, uhlíku, anorganických solí a sloučeninu obecného vzorce RCOOH nebo sloučeninu, kterou je možno na tuto látku převést v průběhu fermentace, tj., prekurzor, kde R má stejný význam jako bylo uvedeno výše. Kyselina nebo sloučenina, kterou je možno na tuto kyselinu převést se do fermentačního prostředí přidává při naočkování nebo v určitých intervalech v průběhu fermentace. V případě, že se použije mutant, který neobsahuje transaminázu, musí prostředí obsahovat L-izoleucin, L-leucin a L-valin, aby mutant mohl růst. Produkci avermectinů je možno sledovat tak, že se odebírají vzorky fermentačního prostředí, tyto vzorky se extrahují organickým rozpouštědlem a pak se užije chromatografie, například vysokoůčinná kapalinová chromatografie. Fermentace se provádí tak dlouho, až se dosáhne maximálního výtěžku výsledného produktu, za obvyklých podmínek 4 až 15 dnů.

S výhodou se přidává tato výše uvedená primární sloučenina, a sice karboxylová kyselina nebo sloučenina, kterou je možno na tuto karboxylovou kyselinu převést, v množství 0,05 gramu až 3,0 gramy na litr. Tuto sloučeninu je možno přidávat kontinuálně, přerušovaně nebo je možno přidat celé množství najednou. Kyselinu obecného vzorce RCOOH je možno přidat jako takovou nebo ve formě soli, například ve formě soli sodné, lithné nebo amonné nebo ve formě sloučeniny, kterou je možno na uvedenou kyselinu převést, jak již bylo uvedeno výše. V případě, že se kyselina nachází v pevné formě, s výhodou se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, například ve vodě nebo v alkoholu obsahujícím 1 až 4 atomy uhlíku.

Médium, které se užívá pro fermentaci, může být, a to zvláště v případě, kdy substituentem v poloze 25 je izopropylová skupina nebo (S)-sek-butylová skupina, některé z obvyklých médií, která obsahují využitelné zdroje uhlíku, dusíku a stopových prvků. V případě, že substituentem v poloze 25 má být skupina, která se v přírodních avermectinech nevyskytuje, tj. skupina, odlišná od izopropylové nebo (S)-sek-butylové skupiny, je fermentační médium voleno tak, aby zvolené složky neobsahovaly látky, v nichž R znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek.butylovou skupinu, nebo aby obsahovaly pouze velmi malé množství těchto látek.

Po fermentaci, která trvá několik dnů při teplotě, pohybující se s výhodou v rozmezí 24 až 33 °C, se fermentační prostředí odstředí nebo zfiltruje a takto oddělené mycelium se extrahuje, s výhodou při použití acetonu nebo methanolu. Organický extrakt se zahustí a požadovaný produkt se pak extrahuje organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, například methylenchloridem, ethylacetátem, chloroformem, butanolem nebo methylizobutylketonem. Takto získaný extrakt se pak odpaří do sucha a takto získaný surový produkt se pak dále čistí podle potřeby chromatograficky, například při použití preparativní chromatografie používající reverzní fázi

Výsledný produkt se obvykle získává jako směs sloučenin obecného vzorce I, v němž R²znamená 4'-(a-L-oleandrosyl)-a-L-oleandrosyloxyskupinu, R¹ znamená hydroxylovou

-14CZ 290312 B6 skupinu a dvojná vazba není přítomná, nebo R¹ znamená atom vodíku a dvojná vazba je přítomná, R³ znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu. Podíly těchto látek se mohou měnit v závislosti na použitém mutantu a primerů a v závislosti na použitých podmínkách.

Zdroje substituentů R, a to ať přímo sloučeniny obecného vzorce RCOOH, nebo některého zjejích prekurzoru, nemají žádný podstatný vliv na produkci avermectinového derivátu. Kritickým požadavkem na provádění postupu podle vynálezu pro výrobu uvedených derivátů je skutečnost, aby požadovaná skupina R byla dostupná pro použité kmeny S. avermectilis v průběhu fermentačního postupu.

Jako primery je možno užít zejména následující sloučeniny:

kyselina 2,3-dimethylmáselná, kyselina 2-methylhexanová, kyselina 2-methyl-4-pentenová, kyselina 2-cyklopropylpropionová, kyselina 4,4-difluorcyklohexankarboxylová ve formě lithné soli, kyselina methylencyklohexankarboxylová, kyselina 3-methylcyklohexankarboxylová (cis/trans), kyselina 1-cyklopentenkarboxylová, kyselina 1-cyklohexenkarboxylová, kyselina tetrahydropyran-4-karboxylová, kyselina thiofen-2-karboxylová, kyselina 3-a-furankarboxylová, kyselina 2-chlorthiofen-4-karboxylová, kyselina cyklobutankarboxylová, kyselina cyklopentankarboxylová, kyselina cyklohexankarboxylová, kyselina cykloheptankarboxylová, kyselina 2-methylcyklopropankarboxylová, kyselina 3-cyklohexen-l -karboxylová, kyselina 2-methylthiopropionová, kyselina 2-methyl-4-methoxomáselná, kyselina thiofen-3-karboxylová, hydroxymethylcyklopentan,

3-thiofenkarboxaldehyd, kyselina 3-cyklohexylpropionová, kyselina 3-cyklopentylpropionová, hydroxymethylcyklobutan, kyselina tetrahydrothiofen-3-karboxylová,

3-cyklopentyl-l-propanol,

3- methylcyklobutankarboxylová kyselina, ve formě lithné soli, kyselina 3-fluorcyklobutankarboxylová, kyselina 3-methylencyklobutankarboxylová ve formě lithné soli, kyselina 2-methyl-4-methylthiomáselná, kyselina tetrahydrothiopyran-4-karboxylová, cyklobutylmethylamin, ethylester kyseliny cyklobutankarboxylové,

4- hydroxymethylcyklopenten, ethylester kyseliny 2-(3-thiofenkarbonyl)propionové, kyselina S-2-methylpentanová, kyselina R-2-methylpentanová.

Mutanty s obsahem O-methyltransferázy je možno získat z mutantů, které neobsahují dehydrogenázu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo z mutantů, které neobsahují transaminázu

-15CZ 290312 B6 aminokyselin s rozvětveným řetězcem. Mutanty, v nichž se mutace, pokud jde o účinnost dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázy aminokyselin s rozvětveným řetězcem, kombinuje s mutací jedné nebo obou O-methyltransferáz, poskytují kmeny Streptomyces avermitilis, které při přidání sloučenin obecného vzorce R-COOH nebo sloučenin, které je možno na tyto sloučeniny v průběhu fermentace převést, produkují primárně avermectiny B, demethylavermectiny nebo demethylavermectiny B. Tyto mutanty se získají další mutací mutantů, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem působením ultrafialového záření a/nebo chemických mutagenů, jako jsou například N-methyl-N-nitrosourethan, nitrosoguanidin, ethylmethansulfonát nebo jiná činidla, která byla uvedena výše. Mutanty, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem nebo postrádají transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem a nemají jednu nebo obě O-methyltransferázy, je možno dále zpracovávat účinkem ultrafialového záření nebo metagenizačního činidla, přičemž se získají další mutanty, které jsou charakterizovány absencí dehydrogenázové aktivity 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo absencí transaminázové aktivity aminokyselin s rozvětveným řetězcem.

Nepřírodní avermectin produkovaný mutantami tohoto typu, jsou charakterizovány přítomností hydroxylové skupiny na uhlíkovém atomu v poloze 5 aglykonové skupiny a/nebo na uhlíkových atomech, které se nacházejí v polohách 3' a 3 oleandrosových skupin.

Výše uvedené mutanty je možno identifikovat postupem, který je specifikován v publikaci: Schulman a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). Tyto látky jsou vhodné ke stejným účelům a lze je použít stejným způsobem jako je tomu v případě známých avermectinů.

V alternativním provedení je možno větší množství avermectinů B včetně těch, které neobsahují methylové skupiny na oleandrosové disacharidové skupině, získat také tak, že se pěstují mutanty získané některým zvýše popsaných postupů, které postrádají dehydrogenázovou aktivitu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem a/nebo transaminázovou aktivitu aminokyselin s rozvětveným řetězcem obvyklým způsobem za přítomnosti látky, která působí inhibici O-methyltransferázové aktivity, jako je například sinefungin, S-adenosylethionin nebo

S-adenosylhomocystein.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu jsou vysoce účinné antiparazitální látky, které je možno užít zejména jako anthelmintika, ektoparaziticidní, insekticidní a akaricidní prostředky.

Svrchu uvedené látky jsou tedy účinné při léčbě různých stavů, které jsou způsobeny endoparazity, a to zejména helminthiázy, která je nejčastěji způsobena skupinou parazitických hlístů, které se označují jako nematody a které mohou způsobit těžké hospodářské ztráty u vepřů, ovcí, koní a skotu i u dalších hospodářských zvířat, včetně drůbeže. Uvedené látky jsou rovněž účinné proti dalším nematodům, kteří napadají nejrůznější čeledi zvířat, jako jsou například Dirofilaria u psů, a proti dalším parazitům, které mohou napadnou i člověka včetně parazitů, kteří žijí v zažívací soustavě, jako Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius a včetně parazitů, které se nacházejí v krvi a dalších tkáních, jako jsou červi a mimostřevní stadia Strongyloides a Trichinella.

Tyto látky jsou rovněž účinné při léčbě ektoparazitálních infekcí, které zahrnují zejména arthropoda u zvířat i ptáků, jako jsou mouchy, ovádi, bodalky, další bodavý hmyz a také migrující larvy čeledi dvoukřídlých, které mohou napadat skot a koně.

Uvedené látky mají rovněž insekticidní účinek proti domácím škůdcům, jako jsou například švábi, moli a mouchy domácí. Jsou účinné i proti hmyzu na osivu a proti parazitům na plodinách, jakož i proti migrujícím jedincům rodu orthoptera.

-16CZ 290312 B6

Sloučeniny obecného vzorce I se podávají ve formě prostředků, které jsou přizpůsobeny specifickému použití těchto látek a potřebám hostitele, ohled je zapotřebí vzít také na to, proti jakému parazitu nebo hmyzu jsou sloučeniny použity. V případě použití jako anthelmintika je možno sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu podat perorálně jako kapsli, bolus, tabletu nebo v kapalné formě, nebo je tyto látky možno podávat injekčně nebo i v implantované formě. Všechny tyto prostředky je možno připravovat běžným způsobem. Kapsle, bolus nebo tableta se připravují tak, že se účinná složka smísí s vhodným jemně práškovaným ředidlem nebo nosičem, který dále obsahuje ještě činidlo, napomáhající rozpadu a/nebo pojivo, například škrob, laktózu, mastek, stearan hořečnatý a podobně. Kapalný prostředek je možno připravit tak, že se účinná látka disperguje ve vodném roztoku spolu s dispergačním činidlem nebo smáčedlem a podobně, prostředky pro injekční podání je možno připravit například ve formě sterilních roztoků, které mohou obsahovat ještě další složky, například dostatečné množství solí nebo glukózy, aby byl roztok izotonický skrví. Tyto prostředky budou obsahovat různé množství účinné látky v závislosti na typu hostitele, na závažnosti a typu infekce a na hmotnosti hostitele. Při perorálním podání se obvykle podává dávka 0,001 až 10 mg/kg hmotnosti v jediné dávce nebo rozděleně celkem 1 až 5 dní, zásadně je však možno použít i vyšší nebo nižší dávky.

Sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu je možno podávat také v krmivu pro zvířata, k tomuto účelu je možno připravit také příslušné koncentráty a přídavná krmivá, určená k promíchání s běžným krmivém.

Při použití jako insekticidy a proti zemědělským škůdcům se sloučeniny, získané způsobem podle vynálezu užívají jako postřiky, poprašky, emulze a podobně běžným způsobem.

Fermentace S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

Stupeň 1.

S. avermitilis ATCC 31273 se pěstuje v souvislé vrstvě na agarovém prostředí (NewPatch) po dobu 12 dnů při teplotě 30 °C. Užije se živného prostředí s následujícím složením:

šťáva V-8*	200 ml
CaCO₃	3 gramy
agar	15 gramů
voda do	1000 ml
živný bujón	1,0 gramů/1
octan sodný.3H2O	1,4 gramů/1
kyselina izovalerová	50 mg/1
kyselina izomáselná	50 mg/1
kyselina methylmáselná	50 mg/1
izoleucin	250 mg/1
leucin	250 mg/1
valin	250 mg/1
roztok stopových prvků**	lml/1

šťáva V-8 je směs osmi zeleninových šťáv (rajče, mrkev, celer, řepa, petržel, salát, řeřicha a špenát), soli, kyseliny aspargové a citrónové a přírodních příchutí (Campbell Šoup Company, Camden, N. J.).

složení roztoku stopových prvků:

-17CZ 290312 B6 složka______

FeCl₃.6H₂O

MnSO₄.H₂O

CuSO₄.5H₂O

CaCl₂

H3BO3

CoC1₂.6H₂O

ZnCl₂

Na₂MoO₄ množství v g

2,7

4,2

0,5

11,0

0,62

0,24

0,68

0,24

Složky se rozpustí v 1 litru O,1N HC1.

Spory se sklidí ze tří ploten a uvedou se do suspenze ve 20 ml 0,05M tris-pufru s kyselinou maleinovou o pH 9,0.

Stupeň 2 ml suspenze spor se přidá do lahvičky s obsahem 10 mg N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu (NTG). Lahvička se inkubuje za protřepávání při teplotě 28 °C celkem 60 minut, načež se spory důkladně promyjí 1% roztokem chloridu sodného.

Stupeň 3

Promyté spory se uvedou do suspenze v 1% roztoku chloridu sodného a suspenze se smísí se stejným objemem 80% ethylenglykolu. Tato suspenze se uchovává při teplotě 10 °C a užívá se jako zdroj buněk, které se sledují na přítomnost mutantů. Z tohoto množství je možno získat přibližně 10⁴ kolonií buněk/ml.

Tyto spory se nanesou na plotny s prostředím YPD tak, aby vzniklo přibližně 100 kolonií na jedné plotně. Prostředí YPD obsahuje vždy 10 g/1 extraktu z kvasnic, peptonu Bacto a dextrózy a 15 g/1 agaru Bacto, prostředí se upravuje na pH 6,9 před sterilizací vautoklávu. Složky, označené (x) je možno získat od Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48238.

Stupeň 4

Jednotlivé kolonie se izolují z ploten po 2 až 3 týdnech růstu při teplotě 28 °C a uloží se do jednotlivých vyhloubení standardní mikrotitrační plotny s 96 vyhloubeními. Malé množství každé kolonie se také nanese na čerstvé agarové prostředí, aby bylo možno získat z kolonie další zdroj životaschopných buněk v případě, že by kolonie byla identifikována jako mutant.

Stupeň 5

Do každého vyhloubení se přidá přibližně 75 mikrolitrů prostředí M9 v kapalném stavu s obsahem 1 % glukózy, 0,1 % aminokyselin zkaseinu a 0,01 °/o každé z kyselin izovalerové, izomáselné a 2-methylmáselné. Po několika dnech inkubace při teplotě 28 °C se buňky sledují na přítomnost dehydrogenázy 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem.

Každý litr prostředí M9 obsahuje 6 g hydrogenfosforečnanu sodného, 3 g dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g chloridu sodného a 1 g chloridu amonného. Prostředí se sterilizuje vautoklávu a pak se přidá 1 ml sterilizovaného 1M síranu hořečnatého a 1 ml 0,lMchloridu vápenatého za aseptických podmínek.

-18CZ 290312 B6

Stupeň 6

Mikrosuspenze 5 % toluenu v prostředí M9 se připraví tak, že se nemísitelná směs podrobí působení ultrazvuku. K 25 ml získané suspenze se přidá 1,2 ml roztoku s obsahem [¹⁴C—1]—2— oxokapronové kyseliny v množství 2,5 pC/ml a 10,0 pC/pmol. 50 mikrolitrů této směsi se pak přidá do každého vyhloubení nitrotitrační plotny, která obsahuje zkoumané kolonie.

Stupeň 7

Značený oxid uhličitý, vznikající v jednotlivých vyhloubením se zachycuje a stanoví způsobem, popsaným v publikaci Tábor a další, J. Bacteriol. 128, 485 - 486 (1976) „Convenient Method for Detecting ¹⁴CO₂ in Multiple Samples: Application to Rapid Screening for Mutants“. Mutanty, které nemají dehydrogenázu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem neprodukují větší množství značeného uhličitanu bamatého než kontrolní kolonie.

Dalším způsobem, který zlepšuje kontrast mezi kontrolními pokusy a pozitivním pokusem na značený oxid uhličitý, bylo možno prokázat tmavou skvrnu na autoradiogramu tvorbu značeného uhličitanu bamatého, kdežto negativní výsledek není vyznačen žádnou skvrnou nebo pouze velmi světlou skvrnou.

Jednotlivé kolonie ve svrchu uvedeném stupni 4 se odebírají z agarového prostředí již po 7 až 14 dnech růstu a nikoliv až po dvou až třech týdnech jako svrchu a pak se přímo sledují podle svrchu uvedených stupňů 6 a 7. Původní stupeň 5 se v tomto případě vynechá.

Ještě citlivější způsob, kterým je možno kvantitativně zjišťovat uvolňování značeného oxidu uhličitého spočívá vtom, že se zjištěné mutanty pěstují na vhodném prostředí, které sestává z prostředí M9 s obsahem 1% glukózy, 0,1% „Syncasa-bccaa“, což je syntetická směs L-aminokyselin, přibližně odpovídající běžným aminokyselinám kaseinu, avšak bez L-valinu, L-izoleucinu a L-Leucinu.

Po vypěstování buněk do vysoké hustoty se buňky promyjí prostředím M9 a znovu se uvedou do suspenze v tomtéž prostředí s obsahem 1 % toluenu. Toluen byl předem rozptýlen působením ultrazvuku, takže vznikla mléčně bílá disperze toluenu v prostředí M9. Suspenze buněk, pufru a toluenu se inkubuje 40 minut při teplotě 30 °C, čímž se buňky stanou propustnými. Takto změněné buňky se pak promyjí v prostředí M9 a pak se znovu uvedou do suspenze v 1/5 původního objemu uvedeného prostředí. K provedení zkoušky se pak užije 180 mikrolitrů takto připravené suspenze.

Reakční objem 300 mikrolitrů obsahuje buňky, pozměněné působením toluenu, 0,4 mM thiaminpyrofosátu (TPP), 0,11 mM koenzymu A (CoA), 0,68 mM nikotinamidadenindinukleotidu (NAD), 2,6 mM dithiothreitolu (DTT), 4,1 mM chloridu hořečnatého, 60 mM tris-HCl, o pH 7,5 a 6 000 cpm [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronátu mikrocurie na mikromol. Účinnost počítání impulzů byla 73 %. Reakce byla prováděna v 15 ml scintilačních nádobkách s obsahem 2 x 2 cm papíru Whatman 4, který byl natlačen do šroubovacího uzávěru lahvičky. Papír obsahuje 30 mikrolitrů 1M Hyaminhydroxidu (1M roztok methylbenzethonimhydroxidu v methanolu, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), který zachycuje značený oxid uhličitý, vyvíjející se při reakci. Směs se inkubuje 2 hodiny, načež se papír ponoří do 10 ml Beckman Aquasol 11 (univerzální LSS kapalina pro scintilační počítač), New England Nuclear Research Products, Boston, MA02118) a radioaktivita se měří kapalinovým scintilačním počítačem po dosažení rovnovážného stavu ve svrchu uvedeném rozpouštědle po dobu alespoň 4 hodin. Slepá kontrola, která neobsahuje žádné buňky poskytuje 50 až 300 impulzů za minutu.

Mutant 1-3 a podobné mutanty poskytují počty impulzů, které přibližně odpovídají slepé reakci, která neobsahuje buňky, kdežto původní kmen poskytuje několikrát vyšší počty impulzů než slepá kontrola.

-19CZ 290312 B6

Izolace kmene HL-026 (ATCC 53568), odvozeného od kmene S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567)

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) se rozetře na plotny s živným agarem. Dojde k poměrně vysokému výskytu spontánních variant, z nichž některé nevytvářejí vzdušné mycelium po 4 dnech inkubace při teplotě 30 °C. Několik těchto variant bylo izolováno a zkoumáno na svou schopnost produkovat nepřírodní avermectiny v případě pěstování v prostředí AP-5, k němuž byla přidána kyselina cyklopentankarboxylová. Z izolátů, z nichž řada produkovala nepřírodní avermectiny, prosté přírodních avermectinů byl vybrán kmen, který poskytoval vysoké výtěžky avermectinu při pěstování v lahvích ve srovnání s původním kmenem S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), tento kmen byl označen HL-026 (ATCC 53568).

Tvorba kmenů S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670), které nemají dehydrogenázu 2-oxokyselin s rozvětveným řetězcem ani transaminázu aminokyselin s rozvětveným řetězcem

Stupeň 1

Přibližně 100 mg S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), pěstovaného na čerstvé agarové plotně (SAMM) čtyři dny, se naočkuje do baňky s objemem 300 ml, obsahující 50 ml prostředí SCM o pH 7,2. Baňka se pak protřepává při 200 ot/min a teplotě 30 °C celkem 24 hodin, konečné pH je 8,2.

Stupeň 2

Baňka se odstraní z třepačky a 10 ml prostředí se odstředí ve sterilní zkumavce celkem 5 minut, při 2000 ot/min. Buňky se pak znovu uvedou do suspenze v prostředí SCM v množství 50 ml v Erlenmeyerově baňce o objemu 300 ml a baňky se uloží na rotační třepačku na 2 hodiny při teplotě 30 °C.

Stupeň 3 ml takto získané suspenze se uloží do sterilní zkumavky.

Stupeň 4

250 μΐ ethylmethansulfonátu se přidá do zkumavky v dobře větrané digestoři, obsah se důkladně promíchá, pak se vlije do sterilní baňky o objemu 300 ml a baňka se protřepává 3 hodiny na rotační třepačce při teplotě 30 °C.

Stupeň 5

Do baňky se přidá 40 ml čerstvého sterilního prostředí SCM a v třepání se pokračuje celkem 70 hodin při teplotě 30 °C.

Stupeň 6

Buňky se vyjmou, obsah se odstředí celkem 10 minut při 8000 ot/min při teplotě 20 °C. Pak se buňky promyjí tak, že se znovu uvedou do suspenze v prostředí SCM, znovu se odstředí a znovu se uvedou do suspenze v 10 ml prostředí SCM.

Stupeň 7

Buňky se odstraní a zkouší se tak, že se nanáší na plotny vždy přibližně 150 kolonií na jednu plotnu a sleduje se schopnost buněk růst na prostředí M9 s glukózou v přítomnosti nebo v nepřítomnosti L-leucinu, L-izoleucinu nebo L-valinu a v přítomnosti nebo nepřítomnosti

-20CZ 290312 B6 kombinací těchto aminokyselin. Hledané buňky, u nichž došlo k mutaci rostou pouze na prostředí, které je doplněno všemi třemi uvedenými aminokyselinami. Tyto kmeny, odvozené od

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), které nemají transaminázu aminokyselin s rozvětveným řetězcem také nerostou na prostředí, které je doplněno jednou nebo větším počtem tří 2-oxokyselin, a to kyseliny 2-oxoizokapronové, 2-oxo-3-methylvalerové a 2-oxoizovalerové, které jsou prekurzory pro L-leucin, L-izoleucin a L-valin. Toto chování je zcela odlišné od chování původního kmene S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567), který na těchto prostředcích roste dobře. Je tedy zřejmé, že jediná transamináza stačí k transaminaci svrchu uvedených 2-oxokyselin.

Prostředí SCM složka množství v g/1

autolyzát kvasnic	10
extrakt z hovězího masa	5
enzymatický hydrolyzát kaseinu	10
1M síran hořečnatý	3
1M K₂HPO₄; pH 7,0 (HCl)	100
Agarové plotny SAMM
složka	množství v g/1
hydrogenfosforečnan sodný	6
dihydrogenfosforečnan draselný	3
chlorid sodný	0,5
chlorid amonný	1,0
1M síran hořečnatý	1,0
0,lM chlorid vápenatý	1,0
dextróza	8,0
aminokyseliny kaseinu	20,0
agar	20,0
Složení stonásobného koncentrátu „Syncasa-bccaa“
složka	gfl
L-alanin	3
L-arginin	4
L-asparagová kyselina	6
L-cystin	1
L-glutamová kyselina	20
glycin	1
L—histidin	2
L-lysin	7
L-methionin	3
L-fenylalanin	6
L-prolin	10
L-serin	6
L-threonin	4
L-tyrosin	4
L-tryptofan	1

Směs se upraví na pH 7 a sterilizuje se filtrací. Jeden objem koncentrátu se přidá k 99 objemům prostředí, aby bylo možno dosáhnout standardní výsledné koncentrace.

Získání S. avermitilis JC-923 (ATCC 53669) spojením protoplastů kmene S. avermitilis ATCC 31272, odolného proti Spectinomycinu a kmene S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670)

-21 CZ 290312 B6

Kmen S. avermitilis ATCC 31272, odolný proti Spectinomycinu, je spontánní mutací kmene S. avermitilis ATCC 31272. Tento kmen byl izolován z vegetativního mycelia kmene ATCC 31272, naočkovaného na agarových plotnách AS-1 s obsahem 50 pg/ml Spectinomycinu. Spory mutantu, které vyklíčily na bohatém živném prostředí, jsou odolnější proti 50 pg/ml uvedeného antibiotika ve srovnání s původním kmenem, jehož spoiy za uvedených podmínek nevyklíčí. Toto dominantní označení bylo s úspěchem užito k oddělení izolátů kmene ATCC 31272, který neobsahuje transaminázu aminokyselin s rozvětveným řetězcem.

AS-1 agar (Bohaté prostředí pro čeleď Streptomyces)

Extrakt z kvasnic1 g

L-alanin 0,2g

L-arginin 0,2g

L-asparagin 0,5g rozpustný škrob5 g

NaCl 25g síran sodný 10g agar 20g destilovaná voda do 1 litru

Prostředí se upraví na pH 7,5 a sterilizuje se v autoklávu 15 minut při teplotě 121 °C. Pak se 30 až 35 ml prostředí vloží do sterilních Petriho misek z plastické hmoty o průměru 100 mm, výška vrstvy je přibližně 15 mm.

Způsob získávání životaschopných protoplastů z kmenů Streptomyces avermitilis

A. Spoiy jako očkovací materiál

1. Spory se připravují běžným způsobem, počet životaschopných spor se stanoví postupným ředěním na agarových plotnách, jednotlivé podíly se pak ve 40 % glycerolu mrazí na teplotu -70 °C.

2. Před použitím se suspenze spor odstředí 10 minut při 1000 g a pak se znovu uvede do suspenze ve stejném objemu 0,85% chloridu sodného.

3. Přibližně 10⁷ spor se naočkuje do 30 ml živného prostředí s extraktem z kvasnic a ze sladu (prostředí YEME) s obsahem 0,5 % glycinu ve 300ml baňkách.

B. Zmrazené, ultrazvukem zpracované mycelium jako očkovací materiál

1. Myceliální kultury kmene PGS-119 se pěstují v živném prostředí stryptinázou ze sóji (TSB), až se vytvoří zákal v hodnotě 2 až 9 při 600 nm. Pak se kultura desetkrát homogenizuje ve skleněném zařízení na mletí tkání.

2. Homogenizované mycelium se zředí na dvojnásobný objem prostředí TSB a 20 ml získaného materiálu se uloží do sterilní polypropylenové zkumavky pro odstřeďování. Ultrazvuková sonda se ponoří do kapaliny do hloubky 1 až 2 cm a vzorek se zpracovává ultrazvukem 10 sekund při intenzitě 50 %. Při tomto zpracování dochází k dispergování mycelia po jedné nebo dvou buňkách, které velmi rychle rostou v případě, že jsou dále pěstovány.

3. Takto zpracovaný materiál se zředí na konečnou koncentraci 40 % glycerolu, pipetou se přenese do lahviček a pak se zmrazí na teplotu -70 °C.

-22CZ 290312 B6

4, Podíly tohoto materiálu se nechají roztát podle potřeby při teplotě místnosti a užijí k naočkování prostředí YEME stejně jako ve svrchu uvedeném stupni A.3.

C. Kolonie na agarovém prostředí jako očkovací materiál

1. Šest zralých kolonií kmene PGS-119, rostoucích na prostředí TSA nebo YPD-2 se přenese očkovací kličkou do 200 μΐ sterilní vody ve zkumavce pro mikroodstředivku.

2. Získaná směs se homogenizuje pískem pro jedno použití.

3. Homogenizované kolonie se přidají k prostředí YEME jako ve stupni A.3.

D. Příprava protoplastů z mycelia, pěstovaného za přítomnosti glycinu

1. Kultury se inkubují za protřepávání na vodní lázni při teplotě 29 °C přibližně 65 hodin.

2. Mycelia se pozorují mikroskopicky ve fázovém kontrastu 2 při zvětšení 40x a pak se odstřeďují ve zkumavce 10 minut při přibližně 1470 g při teplotě 20 °C.

3. Supematant se odloží a myceliální usazenina se znovu uvede do suspenze v 10 ml pufru pro protoplasty (P), jehož složení bude dále uvedeno. Usazenina se homogenizuje 5 až lOx příslušným zařízením k dispergování shluků.

4. Vzorek se odstředí přibližně při 1000 g celkem 10 minut. Supematant se odloží a usazenina se opatrně znovu uvede do suspenze v 10 ml pufru P.

5. Promývací stupeň se znovu opakuje.

6. Myceliální usazenina se znovu uvede do suspenze v 10 ml čerstvého roztoku lysozymu s obsahem 1,0 mg této látky v 1 ml pufru P po sterilizaci filtrací filtrem s póry 0,22 pm.

7. Myceliální směs se inkubuje 60 minut na vodní lázni s teplotou 37 °C za opatrného protřepávání. Vzorky se znovu uvedou do suspenze v roztoku lysozymu každých 15 minut. Vzorky se pozorují v mikroskopu ve fázovém kontrastu a snímá se přítomnost protoplastů.

8. Myceliální materiál se třikrát rozetře při použití pipety o objemu 5 ml na volné protoplasty.

9. Získaný materiál se zfíltruje vrstvou skleněné vaty nebo neabsorbující buničitou vatou.

10. Protoplasty se odstředí 7 minut při přibližně 1000 g, načež se opatrně znovu uvedou do suspenze v 5 ml pufru P a pozorují se v mikroskopu při fázovém kontrastu při zvětšení 40x.

11. Protoplasty se znovu odstředí jako svrchu a uvedou do suspenze v 1,0 ml pufru 0 P. Pak se tato suspenze dále ředí pufrem P a destilovanou vodou a nanáší se na plotny, které obsahují regenerační prostředí. Kolonie, které vyrostou z takto získaného materiálu, zředěného destilovanou vodou, jsou patrně odvozeny od neúplných myceliálních jednotek nebo od jednotek, které neobsahují protoplasty.

12. Protoplasty se zmrazí po podílech 200 až 300 μΐ v ledu při teplotě -70 °C. Po 18 až 24 hodinách se z ledu vyjmou.

-23CZ 290312 B6

Spojení protoplastů při použití polyethylenglykolu (PEG) 1000

1. Všechny popsané pokusy byly provedeny se stejnou šarží PEG 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), která byla jen velmi málo toxická.

2. Podíly po 1,0 g PEG byly sterilizovány v autoklávu ve skleněných lahvičkách, bylo přidáno 1,0 ml pufru P a PEG byl rozpuštěn zahřátím lahvičky na 55 °C, nebo byl PEG zvážen, rozpuštěn v pufru P a sterilizován filtrací až těsně před použitím. Roztoky PEG byly užívány při teplotě místnosti.

3. Protoplasty byly čerstvě připravené nebo byly rychle rozehřátý zásobní materiály, skladované při teplotě -70 °C pod tekoucí vodou. Přibližně stejné množství protoplastů každého genotypu bylo přeneseno opatrně pipetou do zkumavky z polykarbonátů. V případě čerstvě připravených protoplastů byl změřen zákal a bylo použito několik různých koncentrací. Objem v každé zkumavce byl upraven na 5,0 ml pufrem P.

4. Směs byla odstředěna po dobu 7 minut při přibližně 1000 g.

5. Supematant byl opatrně slit. Usazenina protoplastů byla opatrně uvedena do suspenze v konečném objemu 200 μΐ pufru P.

6. Ke směsi bylo rychle přidáno 800 μΐ 50% PEG. Směs byla promíchána opakováním nasátím a vypuštěním z Pasteurovy pipety. Směs byla inkubována 2 minuty při teplotě místnosti. Pak bylo přidáno 9 ml pufru P ke zředění PEG. Další spojení protoplastů bylo prováděno sériově, takže intervaly při inkubaci byly přesné.

7. Směs byla odstředěna stejně jako ve stupni 4., supematant byl opatrně slit a promyté protoplasty po spojení byly znovu uvedeny do suspenze v 1,0 ml pufru P.

8. Směs byla sériově ředěna 10^_l až 10“² v pufru P.

9. V každém pokusu bylo také provedeno spojení protoplastů z jediného kmene, tento materiál byl nanášen na plotny jako kontrola.

10. Různá ředění každého materiálu s obsahem protoplastů byla vnášena na plotny ke stanovení počtu životaschopných regenerovaných jedinců každého kmene, použitého při uvedeném postupu.

Regenerace protoplastů

1. Suspenze protoplastů, a to buď po spojení dvou kmenů nebo jediného kmenu byly ředěny příslušným způsobem v pufru P a vždy 100 μΐ materiálu bylo nanášeno na agarové prostředí pro regeneraci velmi opatrným způsobem. Rozetření protoplastů v měkkém agaru horní vrstvy nezlepšovalo jejich regeneraci.

2. V případě potřeby bylo použito postupu, popsaného ve stupni D.l 1.

3. Regenerační plotny byly inkubovány v zatavených sáčcích z plastické hmoty při teplotě 29 až 30 °C a vlhkosti přibližně 95 %.

4. V případě spojení protoplastů, u nichž byla kjejich označení užita odolnost proti spektinomycinu byly regenerující protoplasty po 18 hodinách převrstveny 3,5 ml měkkého agaru, jehož složení bude dále uvedeno s obsahem 100 pg/ml spektinomycinu, agar byl sterilizován v autoklávu a přidáván při teplotě nižší než 45 °C.

-24CZ 290312 B6

5. Protoplasty pak byly inkubovány po dobu 7 až 10 dnů.

Růstová prostředí, regenerační prostředí a pufr pro protoplasty

Úplné regenerační prostředí.

Toto prostředí je modifikované prostředí z publikace Hopwood a další, 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual, str. 235.

Základní roztok

složka	množství v g
sacharóza síran draselný MgCl₂.6H₂O glukóza aminokyseliny kaseinu (Difco) extrakt z kvasnic (Difco) agar s ovesnou moukou (Difco) Bacto agar (Difco) destilovaná voda do	205 0,25 10,12 10 0,1 5,0 3,0 22,0 955 ml

Prostředí se sterilizuje zautoklávu 25 minut při teplotě 121 °C. Po sterilizaci se přidají následující množství sterilních zásobních roztoků:

složka	množství v ml
KH₂PO₄ (0,5%) CaCl₂.2H₂O L-prolin (20%) pufr MES (1,0 M) roztok stopových prvků* NaOH (1M)	10 5 15 10 2,0 3,0

pH se upraví na 6,5, objem se doplní na 1 litr.

*Roztok stopových prvků obsahuje v 1 litru následující množství jednotlivých složek:

ZnCl₂ FeCl₃.6H₂O CuC1₂.2H₂O MnCl₂.4H₂O Na₂B₄O₇.10H₂O (NH4)₆MO₇O2₄.4H₂O

40 mg 200 mg 10 mg 10 mg 10 mg lOmg

Měkký agar se spectinomycinem pro převrstvení

Obsahuje úplné regenerační prostředí jako svrchu až na to, že množství agaru je 4,10 g. Prostředí se sterilizuje stejným způsobem vautoklávu, zchladí se na teplotu 55 °C a přidá se 100 mg spectinomycinu. Pak se celé množství rozdělí po objemu 5 ml do zkumavek, opatřených uzávěrem. Materiál se zmrazí a v tomto stavu se skladuje, znovu se sterilizuje v autoklávu až těsně před použitím.

-25CZ 290312 B6

Modifikovaný pufr pro protoplasty

Základní roztok:

sacharóza síran draselný MgCl₂.6H₂O destilovaná voda do

205 g

0,25 g

2,02 g

977 ml

Prostředí se sterilizuje v autoklávu 25 minut při teplotě 121 °C. Po sterilizaci se přidá následující množství sterilních zásobních roztoků:

KH₂PO₄(0,5%)	1 ml
roztok stopových prvků*	2 ml
CaCl₂.2H₂O (3,68%)	10 ml
pufřMES (1,0 M)	10 ml

pH se upraví na 6,5, objem se doplní na 1 litr.

‘Složení roztoku stopových prvků bylo uvedeno svrchu.

Modifikované prostředí YEME s extraktem z kvasnic a extraktem ze sladu

Základní roztok:

extrakt z kvasnic (Difco) Bacto-pepton (Difco) Bacto bujón s extraktem ze sladu (Difco) glukóza sacharóza destilovaná voda do

3g

5g

3g g

300 g

973 ml

Směs se sterilizuje v autoklávu 25 minut při teplotě 121 °C a pak se přidá:

MgCl₂.6H₂O (2,5 M) 2 ml glycin (20%) 25 ml

Objem se upraví na 1 litr.

Výsledky, získané svrchu uvedeným způsobem jsou znázorněny na přiložených výkresech.

Na obr. 1 je v ultrafialovém světle při 240 nm v průběhu času v minutách znázorněn chromatograf, získaný vysokotlakovou kapalinovou chromatografii při použití frakce, která byla získána extrakcí buněk S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) po jejich růstu na prostředí, prostém alifatických kyselin (WPM SynA 40 :40). Vrchol při 13,12 znamená oligomycin A.

Na obr. 2 je v ultrafialovém světle při 240 nm znázorněn chromatogram, získaný při použití frakce, vzniklé extrakcí buněk S. avermitilis MA4848 (ATCC 31272) po jejich růstu na živném prostředí, prostém alifatických kyselin /WPM SynA 40:40/. Produktem byly přírodní avermectiny.

Na obr. 3 je v ultrafialovém světle při 240 nm v průběhu času znázorněn chromatogram, získaný při použití frakce po extrakci buněk kmene S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) po růstu na prostředí s obsahem kyseliny cyklopentylkarboxylové (příklad 1).

-26CZ 290312 B6

Na výkresech jsou naprosto přesně znázorněny chromatogramy, získané pro jednotlivé sloučeniny.

Složení živných prostředí, která budou použita v následujících příkladech, budou dále uvedena. Všechny molekulové hmotnosti byly zjištěny bombardováním rychlými atomy při hmotové spektrometrii, prováděné na hmotovém spektrometru (VG Model 7070E) při použití triethylenglykolové matrice s pevným chloridem sodným. Bylo možno stanovit (M + Na)⁺. Hmotová spektrometrie v proudu elektronů byla provedena rovněž na hmotovém spektrometru (VG Model 7070F) za získání hodnoty m/e. Jsou uvedeny pouze hodnoty pro hlavní fragmenty.

Prostředí AS-7 složka hydrolyzovaný škrob³ardamin pH^bpharmamedia⁰uhličitan vápenatý množství v g/1 ^a Škrob byl připraven hydrolýzou škrobu α-amylázou z Bacillus licheniformis (Novo Enzymes, Wilton, CT, obchodní značka „Termamyl“), dextrózový ekvivalent 40 ± 5 %.

^b Výrobcem je Yeast Products, lne. Clifton, NJ 07012 ^c Výrobcem je Traders Protein., Memphis, TN 38108.

pH se upraví na 7,2 hydroxidem sodným.

Prostředí AP-5 složka __________________ hydrolyzovaný škrob Ardamin pH hydrogenfosforečnan draselný MgSO₄.7H₂O chlorid sodný uhličitan vápenatý FeSO₄.7H₂O

MnCl₂.7H₂O

ZnSO₄.7H₂O

P-2000 (protipěnivé činidlo) množství v g/1________________

0,01

0,001

0,001 ml/1 pH se upraví na 6,9 přidáním 25% hydroxidu sodného.

-27CZ 290312 B6 složka g/1 destilované vody

Prostředí WPM Syn A 40 : 40

hydrolyzovaný škrob	40
rozpustný bramborový škrob	40
kyselina glutamová	1,0
arginin	0,168
cystin	0,084
histidin	0,069
leucin	0,798
lysin	0,297
methionin	0,108
fenylalanin	0,168
threonin	0,174
tryptofan	0,048
tyrosin	0,192
hydrogenfosforečnan draselný	1,0
MgSO₄.7H₂O	1,0
chlorid sodný	1,0
uhličitan vápenatý	3,5
FeSO₄.7H₂O	0,01
MnCl₂.4H₂	0,001
ZnSO₄.7H₂O	0,001

Prostředí se upraví na pH 6,8 až 7,0 a pak se ještě 30 minut míchá při teplotě 121 °C.

Prostředí WPM Syn B 40 : 40

složka	g/1 destilované vody
rozpustný bramborový škrob hydrolyzovaný škrob kyselina glutamová arginin cystin histidin lysinhydrochlorid methionin fenylalanin threonin tryptofan tyrosin hydrogenfosforečnan draselný MgSO₄.7H₂O chlorid sodný uhličitan vápenatý FeSO₄.7H₂O MnCl₂.4H₂O ZnSO₄.7H₂O	40 40 0,390 0,168 0,084 0,069 0,297 0,108 0,168 0,174 0,048 0,192 1 1 1 3,5 0,01 0,001 0,001

pH se upraví na 6,9 až 7,0, prostředí se míchá 30 minut při 121 °C.

-28CZ 290312 B6

Postup s použitím vysokotlaké kapalinové chromatografie

Mobilní fáze

150 ml vody ml acetonitrilu do 1 litru methanol.

Sloupec

Ultrasphere ODS 25 cm (Beckman Instruments, Fullerton, CA 92634-3100) průtok: 0,75 detekce: ultrafialovým světlem a 240 nm zeslabení: přibližně 6

Ředidlo pro vzorek (D):

ml acetonitrilu + 390 ml methanolu

Standardy:

1. naváží se 0,5 mg avermectinů A2A do baňky o objemu 10 ml a objem se doplní methanolem,

2. naváží se 0,5 mg zkoumané látky do baňky o objemu 10 ml a objem se doplní methanolem.

Roztoky 1 a 2 jsou standardní zásobní roztoky. V případě použití se smísí 100 μΐ roztoku 1 a totéž množství roztoku 2 v lahvičce a přidá se 100 μΐ mobilní fáze.

Vzorky:

1. 1 ml protřepaného bujónu se odstředí,

2. odstraní se co největší množství supematantu bez porušení usazeniny,

3. přidá se 100 μΐ vody, vhodné pro vysokotlakou chromatografii k usazenině a usazenina se nyní disperguje,

4. přidají se 2 ml ředidla D a vše se promísí,

5. výsledná směs se zfiltruje a provede se chromatografie.

Avermectinové deriváty přírodního a nepřírodního typu, tak, jak byly v průběhu přihlášky popsány, byly podrobeny svrchu uvedené vysokotlaké kapalinové chromatografie a doba retence vrcholu pro jednotlivé avermectinové deriváty byla dělena retenční dobou pro oligomycin A, který byl užit jako vnitřní standard. Oligomycin A je téměř vždy pozorován při vysokotlaké kapalinové chromatografii jako vedlejší produkt při fermentací S. avermitilis a je jediným produktem, který je možno odlišit vysokotlakou kapalinovou chromatografii v produktech popsaných mutantů v případě, že tyto mutanty jsou pěstovány v prostředí, prostém kyselin obecného vzorce RCOOH, v němž R má svrchu uvedený význam nebo prostředí, prostém sloučenin, které je na uvedené kyseliny možno převést. Typický retenční čas pro oligomycin A je 12,5 až 14 minut. Podíl retenčních dob (RT) poskytuje možno srovnat totožnost a výtěžky avermectinových derivátů. Pořadím, sjakým se vymývají při provedení chromatografie avermectinové deriváty je B2, A2, B1 a Al (obr. 2).

-29CZ 290312 B6

přírodní avermectin	RT/RT (oligomycin A)
B2b B2a A2b A2a Blb Bia Alb Ala	0,70 0,84 0,90 1,09 1,40 1,83 1,83 2,42

Z tabulky je zřejmé, že nedošlo k oddělení derivátu Bia a Alb od sebe navzájem.

nepřírodní avermectin	RT/RT (oligomycin A)
cyklopentyl B2 cyklopentyl A2 cyklopentyl B1 cyklopentyl Al	0,94 1,23 1,99 2,62

Doba retence byla v rozmezí 1 až 2 minuty, oligomycin A se obvykle vymývá přibližně po 12,5 až 14 minutách.

V následujících příkladech byly avermectinové deriváty stanoveny svrchu uvedeným postupem, není-li uvedeno jinak.

Příklad 1

Cyklopentyl avermectin A2

S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) se pěstuje při teplotě 28 až 30 °C v prostředí AS-7 za protřepávání celkem 24 hodin. Podíl o objemu 5 ml se užije k naočkování lahve o objemu 500 ml s obsahem 100 ml prostředí AS-7, inkubace se provádí za týchž podmínek celkem 24 hodin. Pak se 1 ml této kultury užije k naočkování 40 ml prostředí AP-5 v lahvi o objemu 300 ml, po 24 hodinách se pak přidá ještě 0,4 g/1 sodné soli kyseliny cyklopentankarboxylové. Produkční lahve se protřepávají při teplotě 28 až 30 °C. Po 24 hodinách obsahovaly lahve 35 mg/1 cyklopentylavermictinu A2, kdežto odpovídající titr přírodního derivátu A2a byl 0. Došlo rovněž k produkci dalších cyklopentylavermectinových derivátů.

Příklad 2

Cyklopentyl avermectin A2

Zmrazený vzorek S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) byl užit k naočkování 100 ml prostředí AS-7 v lahvi o objemu 500 ml. K růstu došlo při inkubaci při teplotě 28 až 30 °C za protřepávání po dobu 24 hodin. Pak byl podíl o objemu 1 ml užit k naočkování dvou dalších lahví s objemem 500 ml s obsahem 100 ml prostředí AS-7 a po 18 hodinách inkubace byl obsah těchto lahví užit k naočkování 10 litrů prostředí AP-5 (menší množství chloridu sodného). Po 24 hodinách inkubace při teplotě 28 °C bylo k prostředí přidáno 0,4 g/1 kyseliny cyklopentankarboxylové. Směs byla míchána tak, aby podíl rozpuštěného kyslíku byl udržován nad 20 % nasycení. Titry derivátu cyklopentyl A2 po 120,168, 216,264 a 312 hodinách byly 16,40, 65, 88 a 110 mg/1. Na

-30CZ 290312 B6 rozdíl od těchto hodnot byl v těchto vzorcích titr odpovídajících přírodních avermectinů A2a 0, to znamená, že tento derivát nebylo možno prokázat.

Příklad 3

Cyklopentyl avermectin A2

V tomto pokusu bylo produkční prostředí obohaceno a kyselina cyklopentankarboxylová byla přidávána opakovaně ke zvýšení titru cyklopentyl avermectinů. Jinak byly podmínky při naočkování a fermentaci stejné jako v příkladu 2 až na to, že v prostředí AP-5 bylo navíc ještě 5g/lArdaminu pH, celkem tedy 10 g/1 a mimoto bylo přidáno 0,4, 0,2 a 0,2 g/1 kyseliny cyklopentankarboxylové po 30, 172 a 220 hodinách. Titry cyklopentylavermectinu A2 byly 1,2, 11,78, 137a214mg/l po 120,168,216,264 a 312 hodinách.

Příklad 4

Cyklopentyl avermectiny

Zmrazený vzorek S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) byl užit k naočkování 100 ml prostředí AS-7 v lahvi o objemu 500 ml, prostředí bylo inkubováno 24 až 28 hodin při teplotě 28 až 30 °C. Pak byl 1 ml této kultury užit k naočkování lahve s objemem 300 ml a s obsahem 40 ml prostředí AP-5 (nižší množství chloridu sodného, avšak navíc 0,6 g/1 kyseliny glutamové). Po 96 hodinách inkubace při teplotě 28 až 30 °C za protřepávání bylo přidáno 0,14 g/1 sodné soli kyseliny cyklopentankarboxylové. Ve vzorku po 216 hodinách bylo možno prokázat vysokotlakou kapalinovou chromatografií cyklopentylavermectiny B2, A2, B1 a AI s retenční dobou 12,32, 15,86,25,28 a 32,96 minut.

Příklad 5

Cyklopentyl avermectin A-2

V tomto případě byly pěstovány kmeny S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) a S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) za stejných podmínek. Byla užita tři živná prostředí, a to AP-5, WPM Syn A 40 : 40, a WPM Syn B 40 : 40. K naočkování 100 ml prostředí AS-7 v lahvích o objemu 500 ml byla užita zmrazená kultura každého z uvedených organismů, lahve pak byly inkubovány 24 až 26 hodin při teplotě 28 až 30 °C. Pak byl 1 ml každé kultury užit k naočkování lahví o objemu 300 ml s obsahem 40 ml některého z uvedených prostředí. Všechny zkoušky byly prováděny dvakrát. Po 24 hodinách inkubace při teplotě 28 °C za protřepávání bylo do každé lahve přidáno 0,4 g/1 sodné soli kyseliny cyklopentylkarboxylové a po 192 hodinách inkubace byl stanoven titr hlavního produktu, kterým je cyklopentyl avermectin A2. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I.

-31 CZ 290312 B6

Tabulka I

Prostředí ______________________Kmen S. avermitilis______Cyklopentyl avermectin A2 mg/1

AP-5	ATCC 53567 ATCC 53568	29 67
WPM Syn A 40 : 40	ATCC 53567	35
	ATCC 53568	115
WPM Syn B 40 : 40	ATCC 53567	38
	ATCC 53568	36

Příklad 6

Cyklohexyl avermectiny ίο V tomto příkladu bylo po 96 hodinách přidáno 0,2 g/1 kyseliny cyklohexankarboxylové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak všechny podmínky byly stejné jako v příkladu 4. Bylo možno identifikovat čtyři cyklohexylavermectiny při vysokotlaké kapalinové chromatografíi vzorků, odebraných po 240 hodinách fermentace. Retenční doby pro cyklohexyl avermectiny B2, A2, B1 a Al byly 14,84,19,26,31,46 a 41,14 minut.

Příklad 7

3-cyklohexenyl avermectiny

V tomto příkladu bylo přidáno po 96 hodinách 0,2 g/1 kyseliny 3-cyklohexenkarboxylové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak byly všechny podmínky stejné jako v příkladu 4. Ve vzorku, který byl odebrán po 312 hodinách a analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatografií bylo možno prokázat několik cyklohexenyl avermectinů. Retenční doby těchto látek byly 12,88 (B2), 16,39 (A2), 27,37 až 28,36 (Bl-mery) a 35,80 až 37,13 (Al-mery) minut.

Příklad 8

3-thienyl avermectiny

V tomto příkladu bylo přidáno po 96 hodinách 0,05 g/1 kyseliny thiofen-3-karboxyIové místo kyseliny cyklopentenkarboxylové, jinak byly všechny podmínky stejné jako v příkladu 4. Ve vzorku, odebraném po 312 hodinách bylo možno vysokotlakou kapalinovou chromatografií prokázat celkem čtyři 3-thienyl avermectiny. Retenční doby těchto 3-thienyl avermectinů B2, A2, B1 a Al byly 6,96, 8,76,13,8 a 23,5 minut.

Příklad 9

1-methylthioethyl avermectiny

V tomto příkladu bylo přidáno po 24 a 96 hodinách 0,4 a 0,2 g/1 kyseliny 2-methylthiopropionové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak byly všechny podmínky stejné jako v příkladu 4.

-32CZ 290312 B6

Ve vzorku, který byl odebrán po 240 hodinách, bylo možno prokázat dva 1-methylthioethyl avermectinové deriváty při vysokotlaké kapalinové chromatografii. Retenční doby pro 3-thienylavermectin A2 a B1 byly 9,30 a 13,06 minut. Vrchol, jehož retenční doba byla přibližně 7,2 minut a který se nachází na přední straně vrcholu, jehož retenční doba je 7,557 minut náleží patrně sloučenině B2, kdežto sloučenina AI je patrně skryta ve vrcholu, jehož retenční doba je 17,22 minut.

Příklad 10

2-pentyl avermectiny

V tomto příkladu bylo po 96 hodinách přidáno 0,2 g/1 kyseliny 2-methylvalerové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak byly všechny podmínky stejné jako v příkladu 4. Ve vzorku, odebraném po 312 hodinách bylo možno prokázat vysokotlakou kapalinovou chromatografií čtyři 2-pentyl avermectiny. Retenční doba pro 2-pentyl avermectiny B2, A2, B1 a AI je 12,88, 16,58, 31,90 a 41,92 minuty.

Příklad 11 l-methyl-3-butenyl avermectiny

V tomto příkladu se po 96 hodinách přidává 0,2 g/1 kyseliny 2-methyl-4-pentanové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak jsou všechny podmínky stejné jako v příkladu 4. Ve vzorku, odebraném po 312 hodinách bylo možno prokázat vysokotlakou kapalinovou chromatografií čtyři l-methyl-3-butenyl avermectiny. Retenční doby pro l-methyl-3-butenyl avermectiny B2, A2, B1 a AI byly 11,13, 14,78,22,10 a 28,92 minut.

Příklad 12

1-methyl-l-butenyl avermectiny

V tomto příkladu bylo po 96 hodinách přidáno 0,2 g/1 kyseliny 2-methyl-2-pentenové místo kyseliny cyklopentankarboxylové, jinak byly všechny ostatní podmínky stejné jako v příkladu 4. Ve vzorku, který byl odebrán po 312 hodinách fermentace bylo možno prokázat čtyři 1-methyll-butenyl avermectiny při vysokotlaké kapalinové chromatografii. Retenční doby těchto 1-methyl-l-butenyl avermectinů B2, A2, B1 a AI byly 11,59,14,93,25,29 a 33,18 minut.

Příklad 13

V tomto příkladu je popsáno použití mutantu k výrobě přírodních avermectinů, odvozených od L-valinu v nepřítomnosti avermectinů, které jsou odvozeny od L-izoleucinu. Obsah zmrazené kultury S. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) byl přenesen do lahve o objemu 500 ml s obsahem 100 ml prostředí AS-7. Po přibližně 24 hodinách fermentace při teplotě 28 až 30 °C za stálého protřepávání rychlostí přibližně 200 ot/min byl 1 ml takto získané kultury užit k naočkování 40 ml živného prostředí WPM Syn A 40:40 v lahvi o objemu 300 ml, pak byla láhev inkubována 24 hodin při teplotě 28 až 30 °C za stálého protřepávání. Po této době byly přidány 4 ml roztoku kyseliny izomáselné, sterilizovaného filtrací po neutralizaci na pH 6 až 7 hydroxidem sodným s obsahem 4 mg/ml uvedené kyseliny a inkubace pokračovala stejným způsobem ještě 8 dnů. Vysokotlakou kapalinovou chromatografií bylo možno prokázat čtyři hlavní vrcholy kromě vrcholu pro oligomycin. V podobných pokusech s kyselinou 2-methyl-33CZ 290312 B6 máselnou místo kyseliny izomáselné bylo možno pozorovat komplementární čtyři vrcholy pro avermectiny, odvozené od L-izoleucinu.

Příklad 14

Byl opakován způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že místo kyseliny cyklopentankarboxylové byly užity následující primeiy. Uvedeny jsou také avermectiny, identifikované při těchto fermentacích, tj. sloučeniny obecného vzorce I, v němž R² znamená oleandrosový disacharidový ío zbytek, a ostatní substituenty mají význam, uvedený v tabulce.

retenční doba/retenční doba (oligomycin A)

sloučenina	přiměř	R	B₂	a₂	Bi	A\|
1	kyselina 2-methylvalerová	2-pentyl	1	1,287	2,478	3,255
2	kyselina 2-methyl-4-pentenová	4-penten-2-yl	0,853 0,904	1,090 1,133	1,694 1,784	2,217 2,346
3	kyselina 1-cyklohexankarboxylová	cyklohexen-l-yl	0,785	1,021	1,665	2,179
4	kyselina thiofen-2-karboxylová	thien-2-yl		0,694	1,143	1,499
5	kyselina 3-a-furankarboxylová	3-furyl		0,705	1,095
6	kyselina cyklobutankarboxylová	cyklobutyl	0,728	0,933	1,546	2,027
7	kyselina cyklopentenkarboxylová	cyklopentyl	0,960	1,236	1,970	2,568
8	kyselina cyklohexankarboxylová	cyklohexyl	1,206	1,565	2,556	3,343
9	kyselina cykloheptan karboxylová	cykloheptyl	1,465	1,923
10	kyselina 3-cyklohexen-l-karboxylová	cyklohex-3-enyl	1	1,273	2,125	2,780
11	kyselina 2-methylthiopropionová	1-methylthioethyl	0,565	0,730	1,025	1,351
12	kyselina thiofen-/3-karboxylová	thienyl-3-yl	0,539	0,639	1,069	1,388
13	hydroxymethylcyklopentan	cyklopentyl		jako pro sloučeninu 7
14	3-thiofenkarboxaldehyd	thien-3-yl		jako pro sloučeninu 12
15	kyselina 3-cyklohexylpropionové	cyklohexyl		jako pro sloučeninu 8
16	kyselina 3-cyklopentalpropionová	cyklopentyl		jako pro sloučeninu 7
17	hydroxymethylcyklobutan	cyklobutyl		jako pro sloučeninu 6
18	3-cyklopentyl-l-propanol	cyklopentyl		jako pro sloučeninu 7
19	cyklobutylmethylamin	cyklobutyl		jako pro sloučeninu 6

-34CZ 290312 B6

Tabulka - pokračování

sloučenina	primer	R	retenční doba/retenční doba (oligomycin A)
b₂	^2	B\|	Aj
20	ethylcyklobutan karboxylát	cyklobutyl		jako pro sloučeninu 6
21	kyselina 2-(cyklobutylkarbonylj-propionová	cyklobutyl		jako pro sloučeninu 6
22	ethyl 2-(3-thiofenkarbonyl)propionát	thien-3-yl		jako pro sloučeninu 12
23	kyselina 1-methylcyklopropankarboxylová	1 -methy lcyklopropyl		1,236
24	kyselina 2-methylpent-2-enová	2-penten-2-yl	0,912 0,882	1,091 1,135	1,923	2,523
25	kyselina 2-a-furankarboxylová	2-furyl		0,709	1,146
26	kyselina 5-methylthiofen-2-karboxylová	5-methylthien-2-yl	0,533			1,514
27	kyselina 1-methy lcyklopropan karboxylová	1-methylcyklopropyl		1,236
28	kyselina cyklopropan karboxylová	cyklopropyl	0,802	1,048		2,236

Další fyzikálně-chemické údaje pro některé ze svrchu uvedených sloučenin budou dále 5 podrobněji uvedeny.

sloučenina fyzikálně-chemické údaje

6(A2)	bílý prášek, teplota tání 135 až 140 °C, molekulová hmotnost 925, m/e 596,454, 321, 303,275, 237, 219, 209,191,179, 167,145,127, 113,111, 95 a 87.
6 (AI)	bílý prášek, teplota tání 120 až 124 °C, molekulová hmotnost 907, m/e 578,303,275,257,219,191, 167,145,127,113, 111,95 a 87.
6 (B2)	bílý prášek, teplota tání 110 až 112 °C, molekulová hmotnost 911, m/e 321, 303,261, 257,237,219, 209,191,179, 167,145,127, 113,111, 95 a 87
6(B1)	bílý prášek, teplota tání 135 až 138 °C, molekulová hmotnost 893, m/e 303, 261, 257, 219,191,167, 145,127,113, 111,95 a 87.

-35CZ 290312 B6 sloučenina

8(A2) (A2) fyzikálně-chemické údaje bílý prášek, teplota tání 112 až 117 °C, molekulová hmotnost 953, m/e 624,482, 349, 331, 275, 265, 247, 237,219, 207,195,179, 145,127, 113, 111, 95 a 87.

bílý prášek, teplota tání 131 až 135 °C, molekulová hmotnost 951, m/e 624, 480,347,329, 275, 263, 245, 235,217,205,193, 179,145, 127, 113,111,95 a 87.

bílý prášek, teplota tání 167 °C, molekulová hmotnost 953, m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219,195, 145, 127, 113,95 a 87.

Příklad 15

Izolace cyklopentyl avermectinu A2

V tomto příkladu je uveden způsob izolace pro avermectiny A2, vytvořené z kyseliny cyklopentankarboxylové jako prekurzoru. Plné živné prostředí po fermentaci například podle příkladu 2 se zfiltruje a myceliální buněčná hmota se dvakrát extrahuje třemi objemy acetonu. Acenové extrakty se zahustí na směs vody a oleje a olej se extrahuje methylenchloridem, načež se methylenchloridový roztok zahustí na tmavě hnědý olej. Tento olej se pak rozpustí ve směsi methanolu a vody v poměru 4:1a výsledný roztok se extrahuje hexanem k odstranění alifatických kyselin a tukovitých látek. Odpařením směsi methanolu a vody se získá světle hnědý olej, který obsahuje přibližně 10 % hmotnostních cyklopentylavermectinu A2. Surový avermectin se pak zředí chloroformem v množství 3 ml chloroformu na g/oleje, pak se přidá ještě 0,35 g aktivovaného uhlí na 1 g oleje a 1 g silikagelu na 1 g oleje, směs se 1 hodinu míchá a pak se zfiltruje. Filtrát se odpaří a výsledný olej se zředí 1 ml izopropyletheru na 1 g oleje. Výsledný roztok se pak po kapkách přidá do 25 ml hexanu na 1 g oleje, čímž dojde k vysrážení surového avermectinu ve formě bílého prášku. První podíl se izoluje filtrací, filtrát se pak zchladí na teplotu přibližně 5 °C, čímž se získá druhý podíl výsledné látky.

Surové podíly se dále zpracovávají vysokotlakou kapalinovou chromatografií k získání čistého produktu. Postupuje se tak, že se surový materiál rozpustí, přičemž na 1 g surového prášku se užije 4,1 ml směsi izopropyletheru, methylkyanidu, ethylacetátu, hexanu a kyseliny octové v poměru 25:25 :25 :50:0,125. Vzorky se vstříknou na sloupec preparativního oxidu křemičitého o rozměrech 41,4 mm x 25 cm a sloupec se promývá svrchu uvedenou směsí rozpouštědel rychlostí 30 ml/min a frakce, které obsahují výsledný produkt se spojí, zahustí a zředí směsí methanolu a vody v poměru 86 : 14, takže 1 ml vzniklé směsi obsahuje přibližně 50 mg produktu. Vzorky se pak vstříknou do preparativního sloupce C—18 týchž rozměrů jako svrchu uvedený sloupec s obsahem oxidu křemičitého a sloupec se vymývá rychlostí 18 až 20 ml/min směsí methanolu a vody s obsahem 275 ml vody, doplněné na 2 litry methanolem. Frakce se znovu zahustí a znovu se nechají projít sloupcem C-18. Odpařením frakcí s obsahem výsledného produktu se získá čistý výsledný produkt.

Odpovídající cyklopentylavermectin Bl, AI a B2, je možno izolovat tak, že se odeberou příslušné frakce při svrchu uvedené vysokotlaké kapalinové chromatografíi.

-36CZ 290312 B6

Příklad 16

Mycelium S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669), vypěstované na prostředí YPD-2 s obsahem agaru se užije k naočkování 50 ml prostředí AS-2 v lahvi o objemu 300 ml a láhev se pak protřepává při 220 ot/min a při teplotě 30 °C celkem 24 hodin. Pak se naočkují dvě lahve o objemu 300 ml s obsahem 50 ml prostředí AP-5 vždy 1 ml takto získané kultury. Jedna z uvedených lahví obsahovala 0,1 % kyseliny 2-methylmáselné, druhá tuto kyselinu neobsahovala. Fermentace byla prováděna 11 dnů při teplotě 30 °C za stálého protřepávání. Obsahy obou lahví byly zpracovány stejným způsobem tak, že plné živné prostředí bylo extrahováno čtyřnásobným přebytkem směsi acetonitrilu a methanolu v poměru 810:75). Po energickém protřepání k usnadnění extrakce antibiotika z buněk byl čirý supematant analyzován vysokotlakou kapalinovou chromatografií na přítomnost avermectinu. V případě, že nebyla přidána alifatická kyselina, nebylo možno prokázat avermectiny typu „a“ při citlivosti nižší než 0,20 mg/1. Za přítomnosti kyseliny 2-methylmáselné bylo možno prokázat avermectiny B2a, A2a, Bia a Ala v množství 0,5,1,3,1,4 a 1,1 mg/1.

Příklad 17

V tomto příkladu bylo fermentační prostředí naočkováno S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) očkovacím materiálem, který byl vypěstován na prostředí AS-7 stejně jako v příkladu 16. Jako příměr byla užita kyselina 2-methylmáselná v koncentraci 0,05 %. V tomto případě bylo získáno při kontrolní fermentaci (bez prekurzorů 0,3, 0,9, méně než 0,2 a méně než 0,2 mg/1 avermectinů B2a, A2a, Bia a Ala, kdežto při přidání alifatické kyseliny bylo možno získat 2,8, 5,0, 4,5 a 2,3 mg/1 těchto látek.

Příklad 18

V tomto příkladu bylo prostředí AP-5 naočkováno S. avermitilis JC 923 (ATCC 53669) z prostředí AS-7 stejně jako v příkladu 17. V tomto případě byla přidána kyselina 2-methylmáselná 48 hodin po naočkování prostředí AP-5 v koncentraci 0,05 %, buňky byly odděleny filtrací, zváženy ke zjištění vlhké hmotnosti a pak extrahovány čtyřnásobným hmotnostním přebytkem z extrakčního rozpouštědla. Při tomto zahuštění je možno dosáhnout větší citlivosti při měření titru avermectinu ve srovnání s případem, kdy bylo extrahováno celé živné prostředí. Pro avermectiny B2a, A2a, Bia a Ala bylo zjištěno množství 2,5, 8,5, 4,5 a 3,5 mg/1 v případě přidání kyseliny 2-methylmáselné, hodnoty v případě kontroly bez přidání uvedené kyseliny měly hodnoty 0,3, 03, 03 a 0,1 mg/1. Tyto nízké hodnoty jsou patrně důsledkem nízkého množství endogenních alifatických kyselin nebo sloučenin, z nichž se tyto kyseliny mohou tvořit v produkčním prostředí AP-5.

Příklad 19

Fermentace byla prováděna obdobným způsobem jako v příkladu 18 stím rozdílem, že místo kyseliny 2-methylmáselné bylo přidáno 0,045 % kyseliny cyklopentankarboxylové. V tomto případě bylo možno prokázat cyklopentyl avermectin A2 v množství 4 mg/1.

Příklad 20

Fermentace celkem 16 lahví byla prováděna při použití S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) v lahvích o objemu 300 ml s obsahem 50 ml prostředí AP-5, inkubace byla prováděna při teplotě 30 °C. Živné prostředí bylo naočkováno 1 ml 24 hodin staré kultury uvedeného kmene

-37CZ 290312 B6 v prostředí AS-7 po inkubaci v lahvi o objemu 300 ml s obsahem 50 ml uvedeného prostředí při teplotě 30 °C. Po 66 hodinách růstu na prostředí AP-5 byla přidána k osmi lahvím kyselina izomáselná v koncentraci 0,1 %. Pak byly obsahy lahví zpracovávány stejným způsobem jako v příkladu 16. V lahvích, jejichž prostředí bylo doplněno, byly koncentrace derivátů B2b, A2b, Blb a Alb 5,6, 45, 45 a 68 mg/1. Jde o průměr ze dvou pokusů. Kultury, které nebyly doplněny, měly hodnoty 0,5, 4,0, 4,5 a až 8,5 mg/1. Mimoto bylo v lahvích, jejich prostředí nebylo doplněno, možno prokázat 1,1, 1,1 nestanovítelné množství a méně než 0,2 mg/1 odpovídajících avermectinů B2a, A2a, Bia, a Ala.

Příklad 21

V tomto příkladu byly prováděny čtyři fermentace kmene S. avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) v prostředí AP-5 v množství živného prostředí 2 ml ve zkumavkách z plastické hmoty o objemu 15 ml. Očkovací materiál byl připraven stejným způsobem jako v příkladu 20 na prostředí AS-7 při teplotě 30 °C, zkumavky pak byly protřepávány v šikmé poloze při teplotě 30 °C. Ke dvěma z těchto zkumavek pak byla po 96 hodinách od naočkování prostředí AP-5 přidána jako prekurzor alifatická kyselina, a to kyselina cyklohexankarboxylová (CHC) v koncentraci 0,045 %. 400 hodin po naočkování živného prostředí AP-5 množstvím 0,05 ml kultury v živném prostředí AS-7 bylo přidáno do každé zkumavky 8 ml extrakčního rozpouštědla, kterým byla směs acetonitrilu a methanolu v poměru 810 : 75 a byl stanoven titr avermectinu v supematantu vysokotlakou kapalinovou chromatografií způsobem, uvedeným v popisné části. Pro avermectiny CHC-B2, CHC-A2, CHC-B1, CHC-A1, A2b, Blb, Alb, A2b a Ala bylo možno prokázat průměrnou koncentraci ze dvou zkumavek 3,5, 6,2, 3,0, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 0,2, méně než 0,2 mg/1. Odpovídající hodnoty pro zkumavky, knimž nebyl přidán prekurzor, byly méně než 0,2, méně než 0,2, méně než 0,2, méně než 0,2, 4,2, 2,9, 9,3, 1,2, 0,3 mg/1. Žádný z ostatních přírodních avermectinů nebylo možno prokázat.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Streptomyces avermitilis postrádající jednu nebo obě z následujících aktivit:

dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo kyseliny s rozvětveným řetězcem, charakterizovaný neschopností svých permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂ z přidané [^,4C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny, a transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, charakterizovaný neschopností růst v médiu postrádajícím L-izoleucin, L-leucin a L-valin.
2. Streptomyces avermitilis postrádající dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo-kyselin s rozvětveným řetězcem charakterizovaný neschopností svých permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂ z přidané [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny.
3. Streptomyces avermitilis ATCC 53567 nebo ATCC 53568.
4. Streptomyces avermitilis postrádající transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem charakterizovaný neschopností růst v médiu postrádajícím L-izoleucin, Lleucin a L-valin.
5. Streptomyces avermitilis ATCC 53669 nebo ATCC 53670.

-38CZ 290312 B6
6. Streptomyces avermitilis neschopný produkovat látku C-076 při fermentaci ve vodném živném médiu obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí za aerobních podmínek, přičemž toto médium je prosté kyseliny obecného vzorce:

R'-COOH nebo sloučeniny převeditelné na tuto kyselinu působením S. avermitilis, přičemž R' znamená izopropylovou skupinu, nebo (S)-sek-butylovou skupinu, ale schopný produkovat látku C-076 při fermentaci v tomto médiu, kdy toto médium obsahuje kyselinu obecného vzorce:

R'-COOH nebo sloučeninu převeditelnou na tuto kyselinu působením S. avermitilis, kde R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu.
7. Streptomyces avermitilis podle nároku 6, přičemž uvedeným S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.
8. Způsob přípravy avermectinu, vyznačující se tím, že zahrnuje aerobní fermentaci za použití kmene Streptomyces avermitilis postrádající jednu nebo obě z aktivit zahrnujících dehydrogenázovou aktivitu 2-oxo-kyseliny s rozvětveným řetězcem a transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, podle některého z nároků 1 až 7, vodného živného média obsahujícího asimilovatelný zdroj dusíku, uhlíku a anorganických kyselin a sloučeniny schopné využití při biosyntéze avermectinu.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sloučeninou schopnou využití při biosyntéze avermectinu je kyselina obecného vzorce:

R-COOH nebo sloučenina převeditelná na uvedenou kyselinu působením S. avermitilis, ve které R má jiný význam než izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že kmenem S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.
11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedenou sloučeninou je sloučenina obecného vzorce

R-COOH ve kterém R znamená skupinu s alfa-rozvětveným řetězcem, jejíž uhlíkový atom, ke kterému je připojena skupina -COOH, je rovněž připojen k přinejmenším dvěma jiným atomům nebo skupinám jiným než atom vodíku, nebo sloučenina převeditelná na uvedenou sloučeninu během fermentačního procesu.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že R znamená alfa-rozvětvenou alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, alkoxyalkylovou skupinu nebo alkylthioalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, cykloalkylaikylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, kde alkylová skupina je alfa-rozvětvená alkylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku nebo cykloalkenylovou skupinu obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, přičemž libovolná z těchto skupin může být případně substituována methylenovou skupinou nebo jednou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů, nebo znamená tříčlenný až

-39CZ 290312 B6 šestičlenný heterocyklický kruh obsahující kyslík nebo síru, který může být nasycen nebo zcela nebo částečně nenasycen, přičemž může být případně substituován jednou nebo více alkylovými skupinami obsahujícími 1 až 4 atomy uhlíku nebo atomy halogenů, nebo sloučenina převeditelná na tuto sloučeninu během fermentačního procesu.
13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedenou sloučeninou převeditelnou na substrát RCOOH je

R-(CH₂)_n-Z ve kterém:

R má stejný význam jako bylo definováno shora, n je 0,2,4 nebo 6, a

Z znamená skupinu -CH₂OH, -CHO, -COOR⁵, -CH₂NH₂ nebo skupinu -CONHR⁶, kde

R⁵ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, a

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu -CH(COOH)CH₂COOH, -CH(COOH)(CH₂)₂COOH nebo -CH(COOH)(CH₂)₂SCH₃, nebo v případě, kdy kmen S. avermitilis postrádá pouze transaminázovou aktivitu aminokyseliny s rozvětveným řetězcem, je sloučeninou převeditelnou na substrát R'-COOH sloučenina

R-CO-Z.
14. Způsobpodlenároku 11, vyznačující se tím,že

R je cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina, cyklohexylová skupina, cykloheptylová skupina,

2- methylcyklopropylová skupina,

3- cyklohexenylová skupina,

1-cyklopentenylová skupina,

1-cyklohexenylová skupina,

3- methylcyklohexylová skupina (cis/trans),

4- methylencyklohexylová skupina, 3-methylcyklobutylová skupina, 3-methylencyklobutylová skupina, 3-cykIopentenylová skupina,

1- cyklopropylethylová skupina, 3-fluorcyklobutylová skupina,

4,4-difluorcyklohexylová skupina, izopropylová skupina, sek-butylová skupina,

2- pentylová skupina,

2,3-dimethylpropylová skupina,

2-hexylová skupina,

2-pent-4-enylová skupina,

2-methylthioethylová skupina,

5- 2-methylpentylová skupina,

-40CZ 290312 B6

R-2-methylpentylová skupina,

2- thienylová skupina,

3- thienylová skupina,

4- tetrahydropyranylová skupina,

3-furylová skupina,

2- chlorthienylová skupina,

3- tetrahydrothienylová skupina,

4- methylthio-2-butylová skupina, 4-tetrahydrothiopyranylová skupina, 4-methoxy-2-butylová skupina nebo

4-methylthio-2-butylová skupina.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že R znamená cyklopentylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu nebo thienylovou skupinu.
16. Způsob podle nároku 12, vyzn ač u j í c í se tí m , že R znamená alfa-rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 3 až 8 atomů uhlíku, a není izopropylová skupina nebo (S)-sekbutylová skupina.
17. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že kmenem S. avermitilis je S. avermitilis s identifikační charakteristikou ATCC 53567, ATCC 53568, ATCC 53669 nebo ATCC 53670.
18. Nový kmen náležící do rodu Streptomyces, který neprodukuje látku C-076 při fermentaci ve vodném živném médiu obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických kyselin za aerobních podmínek, přičemž toto médium je prosté kyseliny obecného vzorce

R'-COOH nebo sloučeniny převeditelné na tuto kyselinu působením S. avermitilis, ve kterém R znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu, ale schopný produkovat látku C-076 při fermentaci v uvedeném médiu, kdy toto médium obsahuje kyselinu obecného vzorce

R'-COOH nebo sloučeninu převeditelnou na tuto kyselinu působením S. avermitilis, ve kterém R' znamená izopropylovou skupinu nebo (S)-sek-butylovou skupinu, kde uvedený kmen se získá procesem zahrnujícím mutaci Streptomyces avermitilis ATCC 31271, ATCC 31272 nebo jejich mutantů a selekci kmenů charakterizovaných neschopností permeabilizovaných buněk produkovat ¹⁴CO₂z přidané [¹⁴C-l]-2-oxoizokapronové kyseliny a/nebo neschopností růst v médiu postrádajícím L-izoleucin, L-leucin a L-valin.