PT86582B - Processo para a producao de avermectinas e culturas para esse fim - Google Patents
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Description
processo de produção das referidas avermectinas consiste em se proceder à fermentação, sob condições aeróbicas, de uma estirpe de Streptomyces avermi tilis, desprovidas de uma ou de ambas as actividades 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e aminoácido de cadeia ramificada-transaminase, num meio nutritivo aquoso constituído por uma fonte assimilável de azoto, carbono e sais inorgânicos, e um composto susceptível de ser emprega do na biossíntese de uma avermectina.
I presente invento refere-se a estir pes de Streptomyces avermitilis desprovidas da acção de desidrogenase em 2-ceto-ácidos de cadeias laterais e/ou de acção de transaminase em amino-ácidos de cadeias laterais, e se refere a processos para a preparação das referidas S. avermitilis na síntese de avermectinas naturais e não-naturais .
Descrição da Técnica anterior
As patentes norte-americanas nos. 4.310.519 e 4.429.042 descrevem avermectinas, um complexo de compostos afins, de poderosa acção antiparasitária, e a sua preparação por meio de fermentação aeróbia de estirpes de Streptomyces avermitilis; ou seja, S_. avermitilis ATCC nos. 31267, 31271 e 31272. As últimas duas estirpes citadas um frasco congelado e um tubo liofilizado, contendo respectivamente uma cultura obtida por irradiação com raios UV de S.. avermitilis ATCC 31267.
EP 214.731, publicada em 18 de Março de 1987, a patente europeia correspondente ao requerimento da patente norte-americana n2 886.867, depositado em 16 de Julho de 1986, revela uma série :de compostos (que, no presente invento, serão denominados avermectinas não-naturais), relacionados com as avermectinas naturais ou:conhecidas, mas que apresentam um novo grupo substituinte na posição 25, bem como se refere a um processo para a preparação, median te fermentação, de um organismo capaz de produzir avermectinas, na presença de determinados ácidos carboxílicos especificados, ou para a preparação dos seus derivados ou compostos precursores.
Os organismos de S,. avermitilis que se empregam para a preparação das referidas novas avermectinas com substituição na posição 25, são ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121. Este último microorganismo, descrito na patente europeia EP 214.731, deriva de £. avermitilis ATCC 31271. Quando cultivado num meio semi-definido, este organismo fornece as novas avermectinas C-25 substituídas em melhores rendimentos. Cada uma das estirpes ATCC 31267, 31271, 31272 e NCIB 12121 poderá igualmente produzir, para além do novo derivado C-25-substituido, quantidades variáveis das avermectinas conhecidas (naturais), em que o subs_ tituinte na posição 25 representa isopropilo ou um grupo (Sj-sec.-butil (1-metil-propilo).
A estrutura carbonada das avermectinas (representada na fórmula (I) adiante ilustrada) baseia-se em acetatos e propionatos e o substituinte C-25 das avermec tinas naturais deriva da L-isoleucina (R= (S_)-sec.-butilo) ou L-valina ( R = isopropilo) /Fischer and Mrozik, Macrolide Antibiotics, Academic Press (1984) Ch. 14/.
Entendem-se por avermectinas conheci^ das ou naturais aguelas avermectinas que são produzidas por S^. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271 e ATCC 31272, em que o substituinte na posição 25 representa isopropilo ou (S_) -sec. -butilo (1-metilpropilo) .
As avermectinas, em que o substituinte na posição 25 não representa o grupo isopropilo ou sec.-bu tilo (forma S) serão designadas doravante avermectinas novas ou não-naturais.
As estirpes de S_. avermilitis indica das nas referidas patentes norte-americanas são capazes de | produzirem uma classe de substâncias que se designam, geralmente, por compostos C-076. Esta classe compreende 8 compostos diferentes, mas infimamente relacionados, e descritos como sendo C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a e B2b. A série a de compostos refere-se às avermectinas | naturais, em que o substituinte na posição 25 é (S)-sec.-butilo, e a série b refere-se àquelas, em que o substi·^ tuinte na posição 25 representa isopropilo. As designações A eB referem-se a avermectinas, em que o substituinte na posição 5 representa metoxi ou hidroxi, respectivamente. Por último, o algarismo 1 refere-se a avermectinas, em que existe uma ligação dupla na posição 22-23; e o algaI rismo 2 denota avermectinas contendo um átomo de hidrogé nio na posição 22 e um grupo hidroxi na posição 23.
No presente requerimento de patente não se empregam quaisquer destas referências em relação ao substituinte C-25 das avermectinas não-naturais. Conserva. F ram-se as referências Al, A2, BI, B2 a fim de assinalar as avermectinas não-naturais que apresentem as características estruturais correspondentes às inerentes às avermectinas naturais, atrás mencionadas.
| A formação de mutantes destituídos de qualquer actividade de desidrogenase em alfa-ceto-ácidos de cadeias laterais tem sido descrita em relação ao Bacillus subtilis, Willecke e Pardee, J. Biol. Chem. 246, 5264-72 (1971) e em relação à Pseudomas pútrida, Martin et al., J. Bacteriology, 115, 198-204 (1973), mas não foi indicada qualquer produção mediante Streptomyces.
avermitilis Agly-1, uma estirpe mu tante, que praticamente só produz avermectina-agliconas Ala e A2a, vem referida por Schulman et al.,J. Antibiot. 38 (11), 1494-1498 (1985). Descreve-se também a fermentação de avermitilis Agly-1 na presença de sinefungina, que resultou numa formação aumentada de componentes de avermectina-agliconas B. De igual modo, S_. avermitilis 08, uma estirpe de elevada capacidade de produzir avermectinas, quando submeti da a fermentação na presença de sinefungina como agente in£ bitório das transferases de O-metilo na aglicona, no átomo de carbono 5 (C-5) e na parte do dissacárido oleandrose.
A patente norte-americana n2 4.378.353 descreve a preparação de compostos relacionados com C-076 por meio de culturas de MA-5218, uma estirpe mutante de £. avermitilis ATCC 31272, obtida desta mediante radiações ultravioletas. A estirpe mutante designa-se por ATCC 31780. Os compostos relacionados com as substâncias C-076, produzidos pela referida estirpe mutante, não apresentam o anel de furano de C-076. Além disso, em certos compostos referi_ dos, uma ou duas partes do açúcar oleandrose foram clivadas, ao passo que em outros compostos, o grupo na posição 5 foi oxidado para um grupo cetónico.
Três classes de mutantes com O-metil-transferase de SL avermitilis capazes de produzirem averme£ tinas desprovidas de grupos O-metilo, foram descritas por Ruby et al., 6th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, Debrecen, Hungary, August 26-30 (1985) e por Schulman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31, 744-7 (1987).
A primeira categoria produz sobretu do avermectinas B, devido à sua incapacidade de metilar o hidroxilo no C-5 do anel macrocíclico de lactona. A segun da classe produz 3'-0, 3''-O-bis-desmetil-avermectinas (aver mectinas que não contêm o substituinte O-metilo na posição 3 de ambos os radicais mono-sacarídeos de oleandrose), e que são designadas por desmetil-avermectinas. A terceira •classe é incapaz de metilar em qualquer posição.
Schulman et al., Fed. Proc. 44, 931 (1985) revelam uma produção aumentada de avermectinas B pe la fermentação de S .avermitilis na presença de substâncias tais como sinefungina, S-adenosiletionina e S-adenosil-homo-císteína, que inibem a metilação do grupo hidroxi em C-5, na parte de aglicona, através da enzima avermectina B-O-metil-transferase. Revelam-se ainda mutantes de S. avermitilis que não exercem qualquer actividade de O-metil-transfe rase e que produzem quantidades aumentadas de componentes de avermectina B, Schulman et al., in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 29, 620-624 (1986).
A produção mutagénica de S. avermili tis dá origem a estirpes mutadas (mutantes) desprovidas da acção de desidrogenases em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais ou da acção de transminação em amino-ácidos de cadeias laterais. A mutagénese das estirpes mutantes assim produzidas, de bloqueio simples, dá origem a estirpes mutantes que estão destituidas tanto da acção de desidrogenases em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais como da acção de transanri nases em amino-ácidos de cadeias laterais.
As estirpes mutantes já não têm a ca pacidade de produzirem quantidades significativas das avermectinas naturais na ausência de um composto adicionado RCOOH, em que R representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo, ou de um composto que possa ser transformado em RCOOH duran ί te o processo de fermentação. No entanto, descobriu-se de maneira surpreendente e inesperada de que as estirpes mutan tes são capazes de produzirem avermectinas, naturais e não-naturais, quando submetidas a fermentação na presença de um composto adicionado RCOOH, em que R representa isopropilo ou (SJ-sec.-butilo, ou um outro grupo indicado no presente ί invento, ou na presença de um composto percursor do referi- j do composto de fórmula RCOOH. j i
E ainda mais surpreendente de que as
I mutantes aqui referidas, que apenas estão destituídas da ac 1 ção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais, e que são incapazes de decompor a L-isoleucina ou L-valina, sejam também capazes de integrarem uma larga gama de compo£ tos na via de biossíntese de avermectinas, com produção de avermectinas não-naturais isentas da presença de avermectinas naturais.
i z
E ainda igualmente surpreendente o facto de as estirpes mutantes desprovidas da acção de trans_ aminação em amino-ácidos de cadeias laterais, que são incapazes de decompor L-isoleucina, L-leucina ou L-valina, e que necessitam destes 3 amino-ácidos para o seu crescimento, serem também capazes de assimilarem outros compostos, produ zindo avermectinas não-naturais isentas da presença de aver mectinas naturais.
Tal como já se referiu, as avermectinas naturais são produzidas sob a forma de uma mistura complexa de 8 compostos diferentes, mas estreitamente rela cionados; fórmula (I), R = isopropilo e (S)-sec.-butilo. Embora tenham sido obtidos sob uma forma bastante pura (cf. a patente norte-americana n° 4.429.042), os processos para a sua obtenção são bastante intrincados. A produção de avermectinas não-naturais segundo o processo descrito na patente europeia EP 214.731, poderá também dar origem à formação de algumas avermectinas naturais em quantidades variáveis, devido à presença de desidrogenase de 2-oxo-áci. dos de cadeias laterais e dos amino-ácidos L-valina e L-iso. -leucina na célula dos microrganismos de S_. avermitilis em pregados para a sua produção.
Assim, constituiria um objectivo desejável poder escolher entre a preparação de avermectinas naturais ou não-naturais com o fim de reduzir ao mínimo o número e a complexidade dos produtos obtidos, e, deste modo, aumentar a pureza de uma dada avermectina, simplifican do os processos de separação.
As estirpes de S_. avermilitis despro vidas da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais ou da acção de transaminação em amino-ácidos de cadeias laterais podem ser produzidas por mutação das estir pes, capazes de produzirem avermectinas, de S_ avermilitis e, em especial, por mutação de avermilitis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 ou NCIB 12121. A mutação ulterior de qualquer uma das referidas estirpes incompletas (defei·^ tuosas) resulta na formação de estirpes desprovidas de ambas as actividades enzimáticas. As mutantes são incapazes de sintetizar as avermectinas naturais, excepto no caso em que o ácido gordo, ou um dos seus compostos percursores, contendo o grupo isopropilo ou (S)-sec.-butilo, seja adicio nado ao meio em que as mutantes estão a ser fermentadas. Elas conseguem produzir avermectinas naturais e não-naturais quando submetidas a fermentaeSo em condições aeróbicas aquosas, num meio nutritivo contendo um ácido activador apropriado (catalisante) ou um composto convertível neste, durante o processo de fermentação.
As estirpes mutantes caracterizadas pela carência da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais, são isoladas das colónias mutadas median 14 te um ensaio com C02. De acordo com este processo, a au sência de desprendimento de 14CO2 por uma colónia permeabilizada, a partir de um substrato de ácido /~^4C-17-2-oxo-isocapróico ou ácido Γ ^4C-17-2-oxo-3-metil-valérico ou ácido Γ l4C-l_7_2-oxo-3-metil-butírico, indica a falta da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais.
Aquelas estirpes mutantes que se caracterizam pela falta da acção de transaminase em aminoácidos são seleccionadas das colónias mutadas com base na sua incapacidade de crescerem num meio desprovido de L-isoleucina, L-leucina e L-valina. Na prática, colónias individuais que se desenvolvem num meio de ágar-ágar de sais de M9, baseado em glucose, e completado com todos os aminoácidos que se encontram nos casamino-ácidos serão transferidas para um meio semelhante, que, no entanto, não contém a L-iso-leucina.
As estirpes mutantes referidas na pre. sente memória descritiva, e que estão desprovidas apenas da acção da transferase de aminoácidos de cadeias laterais, são capazes de utilizar 2-oxo-ácidos como substratos percur sores para a produção de avermectinas.
Foi uma circunstância surpreendente e inesperada de que as referidas mutantes desprovidas da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeias laterais e/ou da acção de transaminase em aminoácidos de cadeias la terais, conservassem a capacidade de produzirem avermectinas, nomeadamente avermectinas não-naturais. A incapacida. de das mutantes de produzirem os derivados de acil-CoA de ácidos gordos naturais quando cultivadas num meio convencional poderia ter sido uma mutação letal se a integridade da membrana celular dependesse dos referidos derivados, ou se a acumulação do 2-oxo-ácido pela estirpe mutante anterior levasse a uma acção citotóxica.
Além disso, não se esperava de que qualquer uma das estirpes mutantes fosse capaz de sintetizar acetil-CoA e propionil-CoA a partir das vias de degradação metabólica da L-isoleucina e da L-valina, dado que este processo requer as acções enzimáticas que faltam às mutantes. Os pressupostos, nestes derivados de acil-CoA, para a produção de avermectinas, atrás referida, fazia recear que as mutantes vissem gravemente prejudicada a sua capacidade de produzirem avermectinas não-naturais, o que, surpreendentemente, não era o caso.
A ausência da acção de desidrogenase em 2-xo-ácidos de cadeias laterais, nas mutantes atrás refe ridas, resulta no impedimento da síntese de acil-CoA de ácidos gordos, de cadeias ramificadas, por degradação da L-iso-leucina, L-leucina e L-valina e, deste modo, da síntese de avermectinas naturais. De igual modo, as mutantes de S_. avermitilis, desprovidas da acção de transaminação em aminoácidos de cadeias ramificadas, mostram também esta falta característica de síntese de acil-CoA de ácidos gordos ramificados, e, assim, apresentam a incapacidade de produzirem avermectinas naturais. Esta ausência de acil-CoA de ácidos gordos deve-se a duas razões.
Em primeiro lugar, estas mutantes sem transaminases não conseguem sintetizar 2-oxo-ácidos ramificados a partir de iso-leucina, leucina e valina, fornecidas num meio de cultura, por via da transaminação normal. Em segundo lugar, nestes?mutantes de transaminases, a prepara ção de 2-oxo-ácidos ramificados através da via biossíntét£ ca celular de aminoácidos ramificados é impedida pela inclusão necessária desses amino-ácidos nõ meio de cultura pa ra a fermentação. A presença destes aminoácidos impede a viabilidade desta via da biossíntese ( e a produção dos 2-oxo-ácidos intermediários) através dos bem-conhecidos meca nismos de repressão enzimática e inibição por retro-acção pelos referidos aminoácidos, produtos finais desta via de biossíntese. A ineficácia ou ausência destes 2-oxo-ácidos, que são o substrato para a enzima activa desidrogenase de 2-oxoácidos ramificados, impede efectivamente a síntese de acil-CoA de ácidos gordos ramificados.
Assim, o presente invento abrange a utilização destas mutantes desprovidas da acção de desidrc) genase em 2-oxo-ácidos e da acção de transaminação e de mu tantes em que se combinam tanto a mutação destituída da acção de transaminase em aminoácidos de cadeias ramificadas, como a da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos.
presente invento refere-se igualmen te a qualquer microrganismo, independentemente do seu aspe£ to ou comportamento fisiológico, que possa ser multiplicado mediante processos de transformação, transdução, recombina
ção genética ou qualquer outro processo genético, utilizan dó um ácido nucleico ou um composto equivalente das espécies descritas no presente invento, e adquirindo, assim, a característica das estirpes mutantes aqui descritas.
termo avermectina ou avermecti. nas adoptado nesta memória descritiva, refere-se a compo£ tos correspondentes à fórmula (I), adiante representada, mas em que o substituinte em C-25 (R) poderá ser qualquer grupo susceptível de ser assimilado, na referida posição, pelas S_. avermitilis de acordo com o presente invento.
As referidas estirpes mutadas (mutan tes) são altamente valiosas para a produção de avermectinas não naturais por meio dos processos revelados e exemplificados neste invento. Elas são especialmente úteis pa ra a preparação de avermectinas preferidas, isto é, compo£ tos em que o substituinte em C-25 representa C^-C^-cicloalquilo ou C^-Cg-cicloalcenilo, eventualmente substituido por um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono; 1-metil-tioetilo, ou um grupo hetero-cíclico, pentagonal ou hexagonal, contendo oxigénio ou enxofre, em especial 3-tienilo ou 3-furilo.
A mutação de um organismo da espécie Streptomyces avermitilis, capaz de produzir avermectinas, realiza-se de acordo com processos conhecidos, lançando mão de uma série de fenómenos e processos mutantes, tais como a irradiação com raios X, irradiação com raios ultra-viol£ tas, N-metil-N1-nitro-N-nitroso-guanidina, sulfonato de etilmetano, ácido nitroso e as mostardas de azoto, por ex., N-metil-bis-(2-cloro-etil)-amina, ou processos relacionados.
A formação de estirpes mutadas poderá efectuar-se com esporos ou mediante uma cultura vegetativa (cultura nutritiva) de £. avermitilis, capaz de produ zirem avermectinas naturais, por ex., £. avermitilis ATCC
31272.
Segundo processos bem conhecidos dos técnicos do ramo, seleccionam-se colónias mutadas quanto à ausência da acção de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada, com base num método de ensaio bioquímico, que permita a detecção de grandes quantidades de colónias bacterianas, aleatoriamente mutadas, em virtude do des14 r-14 prendimento de CO^ a partir de / C-l /-2-oxo-acidos (Tabor et al., J. Bact. 128, 485-486, 1976).
processo consiste na multiplicação das colónias mutantes nos receptáculos de uma placa de micro-titulação, num meio nutritivo apropriado, na permeabili, zação das membranas celulares mediante tolueno, seguida da adição do Γ ^^C-l 7-2-oxo-ácido (por ex., o ácido 2-oxo-isocapróico) a cada cavidade da placa e na verificação da atmosfera acima da área de fermentação, para descobrir o desprendimento de C02.
De acordo com um processo de alternei tiva, podem utilizar-se o ácido /~^^C-1 7-2-oxo-3-metilvalé , — 14 — .
rico, ou o acido / C-l/-2-oxo-3-metilbutirico em lugar z r- 14 z do acido Γ C-l/-2-oxo-isocaproico. Verifica-se o des14 prendimento de C02 de modo adequado, colocando papel filtrante húmido, saturado com Ba(OH)2, por cima das placas, a fim de captar qualquer CO? libertado e verifica-se o des Z prendimento de Ba CO^, se houver, mediante autorradiografia.
As mutantes que não apresentam a acção de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada, emi^ tirão autoradiografias sensivelmente iguais às estirpes-testemunhas; isto é, as mutantes não provocam o despren14 dimento de Ba CO^.
As mutantes assim obtidas são depois submetidas a mutações adicionais, adoptando-se qualquer um dos processos de mutação atrás referidos. Seleccionam-se as colónias mutadas de acordo com a sua carência de acção de transferase de aminoácidos de cadeia ramificada, com base na sua incapacidade de se desenvolverem em placas mínimas de M9/glucose, a não ser na presença de L-iso-leucina L-leucina e L-valina (ILV). Para que se verifique qualquer crescimento devem estar presentes todos os 3 -aminoácidos. Além disso, ficou demonstrado de que as referidas mutantes desprovidas de transaminases não crescem em meios de cultu ra complementados com todos os 3 ceto-ácidos que servem de substrato para as reacções de transaminação. Assim, uma única enzima de transaminase é capaz de catalisar a transa minação de cada um dos 3 ceto-ácidos (ácido 2-oxo-3-metil-valérico, ácido 2-oxo-isocapróico, ácido 2-oxo-isovalérico) .
As mutantes duplamente bloqueadas, ou seja, aquelas desprovidas tanto da acção de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeia lateral e da acção de transamin£ se em aminoácidos de cadeia lateral, são especialmente úteis, uma vez que praticamente não há o perigo delas se transformarem de novo em culturas (meios de cultura) capazes de produzirem as avermectinas naturais.
Em determinadas circunstâncias, as mutantes apenas bloqueadas numa dessas acções enzimáticas poderão novamente converter-se em culturas capazes de produzirem avermectinas naturais.
Para além da produção de alelos des£ jados de uma determinada estirpe de microrganismos por mutação, a fusão de protoplastos permite a introdução de alelos desejados, produzidos/identifiçados numa estirpe, no cromossoma de uma outra estirpe bacteriana. Assim, por ex., uma estirpe de S_. avermitilis desprovida da acção enzimática de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramifi_ cada e da acção enzimática de transaminase em aminoácidos de cadeia ramificada, poderá, por meio da fusão de protoplastos com uma estirpe de £. avermitilis que contenha as referidas acções enzimáticas, produzir uma estirpe de S_, avermitilis apenas desprovida da acção enzimática de transa minase em aminoácidos de cadeia ramificada.
Como vão compreender facilmente os técnicos do ramo, a técnica da fusão de protoplastos possi^ bilita a combinação de alelos desejados a partir de linhagens divergentes de selecção, fundindo-os numa única estir_ pe. A £. avermitilis JC-923 (ATCC 53669), descrita na presente memória, uma estirpe desprovida da acção de transa minase em aminoácidos de cadeia lateral, foi obtida através desta técnica de fusão de protoplastos.
Geralmente, as características em ter mos de morfologia e de cultura das mutantes de acordo com o presente invento são tal como se revelam na patente norte· -americana n° 4.429.042. A feição distintiva das mutantes de acordo com o presente invento reside na sua falta de acção enzimática de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e/ou da acção enzimática de transaminase em ami. noácidos de cadeia lateral, características essas que vêm determinadas de acorodo com as indicações atrás dadas. A ausência das referidas actividades enzimáticas resulta na incapacidade das mutantes de produzirem as avermectinas na turais, quando multiplicadas num meio definido, essencialmente isento de ácidos gordos (RCOOH), em que R representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo, ou de compostos convertíveis no referido RCOOH, durante o processo de fermentação.
A pesquisa taxonómica realizada pela Colecção de Tipos de Cultura Americana, veio confirmar de que as características de duas estirpes mutantes 1-3 e
HL-026, seleccionadas pelo ensaio com COg atras indicado, apresentam uma íntima relação com aquelas da estirpe ATCC 31272 progenitora, referida na patente norte-americana n° 4.429.042, embora com certas excepções. Assim, a estirpe mutante 1-3 (ATCC 53567) forma significativamente menores números de filamentos de esporos do que a ATCC 31272, e a estirpe mutante HL-026 (ATCC 53568) não apresenta, pratica^ mente, quaisquer esporos e micélios aéreos (adventícios), mas o exíguo número de filamentos de esporos que produz assemelham-se aos da ATCC 31272.
Além disso, a estirpe mutante HL-026 parece não ser totalmente capaz de utilizar a rafinose como única fonte de carbono, ao passo que a estirpe ATCC 31272 e a estirpe mutante 1-3 são bem capazes de assimilar a rafinose. (Em ensaios realizados pelos requerentes da presen te invenção, a rafinose parecia não sustentar o crescimento de qualquer uma destas estirpes).
Mais uma característica da estirpe mutada HL-026 foi a de produzir menor quantidade de pigmen to de melanina do que as restantes duas estirpes e não pro duziu nenhuma melanina quando cultivada num meio de ágar-ágar de tirosina. Por último, contrariamente à descrição dada para ATCC 31272 na patente norte-americana nQ 4,429.042 não conseguimos observar qualquer crescimento das mutantes ou de ATCC 31272 quando se usa a sucrose como única fonte de carbono. As mutantes 1-3 e HL-026 só não apresentam a actividade de desidrogenase no 2-oxo-ácido de cadeia ramificada. A mutante duplamente bloquada nas referidas actividades enzimáticas, PGS-119 (ATCC 53 670), produzida por mutagénese ulterior da estirpe mutada 1-3 (ATCC53 567), e JC-923 (ATCC 53 669), obtida por meio de fusão de protopla£ tos, apresentam uma relação taxonómica similar ATCC 31 272, tal como se verifica no caso da estirpe mutada 1-3.
As estirpes de Streptomyces avermitilis 1-3, HL-026, PGS-119 e JC-923 foram depositadas, nos termos do Tratado de Budapeste, na Colecção de Culturas Americana, Rockville, Maryland, uma instituição depositaria reconhecida, que garante a continuidade das culturas depositadas e o rápido acesso às culturas, por parte do público, no C£ so de ser concedido o privilégio de patente de invenção ao presente requerimento de patente. As referidas estirpes foi atribuída a designação de Streptomyces avermitilis ATCC 53 567, ATCC 53 568, ATCC 53 670 e ATCC 53 669, respectiva mente.
Enquanto o presente requerimento de patente estiver pendente, os referidos depósitos ficam ao dispor de uma entidade determinada pelo Comissário da Repar
tição da Propriedade Industrial dos EUA, ao abrigo das dis. posições 37 CFR 1.14 e 35 USC 122, e nos termos da respectiva legislação sobre patentes estrangeiras nos países onde tiver sido depositado um duplicado do presente requerimentos ou dos requerimentos suplementares.
Todas as restrições quanto ao acesso do público aos microorganismos depositados serão irrevogávelmente levantadas logo após a concessão da patente.
Cada uma das estirpes de S. avermitilis ATCC 31267, ATCC 31271, ATCC 31272 e NCIB 12121, é capaz de sintetizar as avermectinas naturais de fórmula (I)
em que a linha tracejada na posição 22-23 representa uma ligação dupla facultativa; e em que
R·' representa hidroxi, estando só presente na ausência da ligação dupla;
R representa 41-(alfa-L-oleandrosil)-alfa-L-oleandrosilo xi de fórmula
I
CH3 | ch3 0-7 | 7 | -o ’ | |
--- U \ | ||||
)—7 CH3O | ch3o |
R representa hidrogénio ou metilo; e
R representa iso-propilo ou (S)-sec.-butilo.
A patente norte-americana n° 4.285.963 revela uma avermectina de fórmula (I), em que na posição 25 há substituição por um grupo metilo e etilo; R repre- senta hidroxi e R representa metilo.
Nas avermectinas não-naturais referidas na presente memória descritiva, R representa um substi tuinte diferente de isopropilo ou (S)-sec.-butilo , e corresponde à definição dada mais adiante.
Os compostos gue são essencialmente para a biossíntese de compostos de fórmula I ocorrem na célula de S_. avermitilis. Pensa-se de que estes compostos L-valina, L-leucina e L-iso-leucina, intervêm na biossínte se das avermectinas através da sua transformação em 2-ceto-ácidos e da descarboxilação do ácido assim transformado pela acção da desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada, com acoplamento simultâneo do produto ao coenzima A. (Co-A). A sua presença explica a preparação simul_ tânea dos compostos de iso-propilo e de (S)-sec.-butilo de fórmula I. Esta circunstância levanta, naturalmente, problemas devido à separação dos derivados de iso-propilo dos derivados de (S)-sec.-butilo.
Quando submetidos à fermentação num meio nutritivo contendo o composto activador apropriado (primer), as mutantes do presente invento são capazes de dar origem a um composto de fórmula I, ou mais frequentemente, a uma mistura de dois ou mais compostos de fórmula I, em que R corresponde ao composto activador utilizado. Pode ser preparado um número máximo de 4 compostos finais, que se designam, por convenção e de acordo com uma nomenclatura trivial, R-avermectina Al, A2, B1, e B2, de acordo com as designações adoptadas na patente norte-americana n2 4.429.042. Como é obvio, o grupo R refere-se ao substituinte em C-25. Assim, por ex., quando R representa ciclo -pentilo, as 4 possíveis avermectinas serão:
Nome Trivial | R1 | R3 |
Ciclopentilavermectina Al | ligação dupla | metilo |
Ciclopentilavermectina A2 | hidroxi | metilo |
Ciclopentiloavermectina B1 | ligação dupla | hidrogénio |
Ciclopentiloavermectina B2 | hidroxi | hidrogénio |
Nas avermectinas não-naturais, o sub£ tituinte R em C-25, na fórmula I é qualquer grupo, excep to iso-propilo ou (S)-sec.-butilo.
De acordo com uma via de biossíntese alternativa, os compostos de fórmula I, em que está presen te a ligação dupla e OH está ausente, poderão ser preparados a partir do correspondente composto de fórmula I, em que R representa OH e a ligação dupla está ausente devido a uma reacção de desidratação.
A reacção realiza-se, protegendo-se primeiro, de modo selectivo, os grupos hidroxi nas posições 5 e 4', por ex., sob a forma do derivado de t-butildimeti^L sililoxi, e, em seguida, procedendo a uma reacção com um haleto de tiocarbonilo substituído, tal como cloreto de (4-metilfenoxi)-tiocarbonilo, seguida de aguecimento, num dissolvente de elevado ponto de ebulição, por ex., triclorobenzeno, para se realizar a referida desidratação. Por último, o produto obtido será desprotegido (desbloqueado), dando origem ao composto insaturado. Estas etapas reaccio nais, juntamente com os reagentes e condições reaccionais apropriados vem referidos na patente norte-americana nP 4. 328.335.
Os compostos de fórmula I, em que R representa hidrogénio, podem também ser preparados, median te desmetilação, a partir dos correspondentes compostos, em que R representa metilo. Esta reacçao consiste em tr£ tar o composto de 5-metoxi, ou um dos seus derivados, apr£ priadamente protegidos, com acetato mercúrico, e na hidrólise do éter enólico de 3-acetoxi resultante com ácido di_ luido, obtendo-se o composto 5-cetónico. Este composto é depois reduzido, utilizando-se, por ex., borohidreto de s<5 dio, para se formar o derivado de 5-hidroxi.
I
I i Os reagentes e as condições reaccionais apropriados para as referidas etapas reaccionais estão indicados na Patente Norte-Americana N2 4.423.209.
Os compostos de fórmula I, em que R1 re presenta hidrogénio a ligação dupla ausente, podem ser pre parados a partir co composto correspondente, em que está presente a ligação dupla e R está ausente, mediante hidro genação selectiva, catalítica, utilizando um catalisador conveniente.
Assim, por ex. , a redução poderá conseguir-se, utilizando cloreto de tris-(trifenilfosfina)-ródio-(I), tal como se refere na Publicação do Requerimento de Patente Europeia N2 0001689 e Patente corresponden te Norete e Norte-Americana N2 4.199.569, de 22 de Abril de 1980.
Os compostos de fórmula I, em que R re presenta hidrogénio, são preparados a partir dos corres2 pondentes compostos, em que R representa 4'-( U-L-oleandrosil)- ^-L-oleandrosiloxi, pela pela remoção do grupo 4'-(Λ -L-oleandroxil)-.y-L-oleandrose , mediante hidrólise moderada, com um ácido, num dissolvente orgânico aquoso, obtendo-se a aglicona com um grupo OH na posição 13, em seguida, esta é halogenada, por ex., mediante reacção com um haleto de benzenossulfonilo, para se formar o derivado de 13-desoxi-13-halogénio, que, por fim, é submetido a redu ção selectiva, por ex., mediante hidreto de tributil-estanho.
Para se eviterem quaisquer reacções secundárias indesejadas é conveniente proteger quaisquer outros grupos hidroxi, eventualmente presentes, por ex., mediante um grupo terc.-butildimetilsililo.
Este grupo protector será depois prontamente removido, após a etapa da halogenação ou redução mediante tratamento com etanol contendo vestígios de um ácido. Todas as operações, juntamente com os reagentes e condições reaccionais apropriados para a sua realização vêm referidos na Publicação do Requerimento de Patente Europeia N2 0002615.
Os compostos que as S,. avermitilis do presente invento pode utilizar na biossintese das avermectinas, naturais e não-naturais, são compostos de fórmula (II-A).
R-COOH (II-A) inclusive compostos que podem transformar nos compostos de fórmula II-A durante o processo de fermentação.
Na presente Memória descritiva, os referidos compostos serão denominados compostos activadores (primers). Na fórmula II-A, R representa um grupo ramificado em posição alfa, cujo átomo de carbono, ao qual está lifado o grupo -COOH, encontra-se também ligado a pelo menos dois quaisquer outros grupos ou átomos, excepto hidrogénio .
Como é evidente, esta defenição abrange cíclicos e aciclicos, saturados e insaturados, inclusive aqueles que, eventualmente, contêm um hetero-átomo de enxofre ou oxigénio como componente de cadeia aciclica ou do anel ciclico.
Mais especificamente R, que passa a ser o substituinte em C-25, poderá representar um grupo Cg-Cg -alquilo 61 -ramificado, Cg-Cg-alcenilo λ-ramificado Cg-Cg-alcinilo -A -ramificado alcoxi-alquilo ou alquiltioalquilo, um gritante grupo de Cg-Cg-ciclo-alquilo-alquilo, em que o grupo alquilo representa um grupo C2~Cg-alquilo,-A-ramificado, um grupo C^-Cg-cicloalquilo ou um grupo Cg-Cg-cicloalcenilo, cada um dos quais poderá estar eventualmente sub£ tituido por metileno ou um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio (fluor, cloro, iodo ou bromo), ou um anel heterociclico trigonal a hexagonal, contendo oxigénio ou enxofre, evenbtualmente saturado, ou total ou parcialmente insaturado e que poderá evetualmente ser e estar subs tituido por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomo de hidrogénio, e halogénio.
Compostos convertiveis em RCOOH, isto é, compostos precurssores no processo de fermentação, são compostos de fórmula II-B, em que R tal como atrás se defina :
R-(CH_) -Z (II-B) z n e onde n é igual aO,2,4ou6eZ representa CH-OH, -CHO -CH?NH„, -C00R3 ou -CONHR0, onde R representa hidrogénio r
ou (C]L g)-alquilo; R representa hidrogénio, (C^ ^-alquilo, ou o radical de um amino-ácido, em especial do ácido aspártico ácido glutâmico e da metionina, por ex., -ch(cooh)ch2cooh, -ch(cooh)(ch2)2cooh e -ch(cooh(ch2)2sch3 respectivamente.
-26Quando se empregam estirpes de S.avermitilis que só carecem da actividade de transaminase em amino-ácidos ramificados os 2-ceto-ácidos poderão também ser vir de compostos percursores. Assim, para as referidas estirpes, ácidos de fórmula (II-C)
R-CO-Z (II-C) em que R e Z são tal como atrás se define, podem ser utilizados pelas referidas S_. avermitilis na biossintese das avermectinas .
presente invento abranfe igualmente as formas isómeras do composto de fórmula (II-A), e os com postos que se podem transformar nestes compostos, durante o processo de fermentação, bem como inclui as avertmectinas isómeras, em C-25, que resultam da sua utilização no proce£ so aqui referido.
processo de acordo com o presente invento realiza-se através da fermentação, em condições, aeróbias, de uma estirpe de avermitilis desprovida da actividade de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeia laterais e/ou da actividade de 'transaminase de amino-ácidos de cadeias ramificadas, num meio nutritivo, aquoso, constituído por uma fonte assimilável de azoto, carbono, sais inorgânicos, e de um composto de fórmula RCOOH, ou de um composto convertivel no referido composto (isto é, um composto percursor), durante o processo de fermentação.
ácido ou o composto que se pode trans formar neste ácido, pode ser adicionado à cuba de fermentação
quer na altura de inoculação quer em várias alturas, durante o processo de fermentação.
Quando se utilizar uma estirpe mutada desprovida da actividade de transminase, o meio nutritivo deverá conter L-isoleucina, L-leucina, e L-valina, para que a mutante possa desenvolver-se.
processo de preparação das averct£ nas finais poderá ser verificda continuamente pela remoção de amostras a partir da cuba de fermentação, extracção com um dissolvente orgânico, e análise do aspecto do produto obtido medianet cromatografia, por ex., lançando mão da cromatografia liquida elevado rendimento.
Continua-se a incubação até se conseguir o rendimento máximo do produto, o que se verifica geralmente, dentro de um período de 4 a 15 dias.
De preferência, as porções que se ad£ cionam de cada vez dos compostos activadores (primers) (ácido carboxilico ou um composto transformável neste) oscilam entre 0,05 e 3,0 gramas por cada litro. O composto utilizado para iniciar a reacção desejada (primer) poderá ser adicionado de forma continua, intermitente ou de uma só vez, à cuba de fermentação ácido (RCOOH) adiciona-se como tal ou sob a forma de um sal, tal como o sal de sódio, litio ou sal amónio do ácido, ou sob a forma de um composto con vertivel no ácido, tal como atrás se define.
Caso o ácido seja um sólido, será preferentemente dissolcido num dissolvente apropriado, tal como água ou álcoois alquilicos de 1 a 4 átomos de carbono.
Os meios nutritivos, empregados para a fermentação, podem em especial quando o substituinte em C-25 foi iso-propilo ou (S)-sec.-butilo- ser meios habituais contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e oli_ go-elementos. Caso o substituinte em C-25 seja um grupo não-natural, ou seja, quando representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo, o meio de fermentação será um meio em que os componentes escolhidos estarão destituídos de ou apenas conterão quantidades minimas dos compostos activadores (primera), em que R representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo.
A seguir a uma fermentação de vários dias e durante um primeiro periodo a uma temperatura que oscila, de preferência, entre 24 e 33° C a mistura de fermentação é centrifugada ou filtrada e a massa prensada de micélios pode ser extraída, de preferência mediante acetona ou metanol.
extracto dissolvido é depois concentrado e, em seguida, o produto desejado é extraído num dissolvente orgânico imiscível com a água, tal como o cloreto de metileno, acetato de etilo, clorofórmio, butanol ou metil-isobutil-cetona.
extracto diluido é concentrado e o produto em bruto é purificado mais exaustivamente, de acor do com as necessidades, mediante cromatografia, por ex., por meio de cromatografia liquida de elevado rendimento, em fase invertida, em escala preparativa.
Geralmente o produto é obtido sob a forma de uma mistura dos compostos de fórmula (I), em que
R representa 4' -L-oleandrosil)-^ -L-oleandrosiloxi ,
1 R representa OH e nao existe qualquer ligaçao dupla ou R não existe e a ligação dupla será e está presente, e R representa H ou CH^, no entanto, as respectivas proporções poderão variar consoante a mutante especifica utilizada, o I composto activador escolhido e as condições reaccionais adoptadas.
A procedência do grupo R, isto é, a . sua origem directa do RCOOH ou indirecta, através de um r qualquer dos compostos percusores atrás referidos , ou de um outro composto precursos, não afecta a preparação das avermectinas. Uma premissa critica do processo do invento para a preparação de avermectinas reside no facto de o desejado grupo R ser adicionado às estirpes de £. avermitilis do invento durante o processo de fermentação.
i Compostos apropriados incluem os compostos seguintes:
ácido 2,3-dimetilbutirico, z k acido 2-metilhexanoico, ácido 2-metilpent-4-enoico, ácido 2-ciclopropil-propionico,
I sal de litio do ácido 4,4-difluorociclohexano-carboxilico, ácido 4-metilenociclohexanocarboxilico, ácido 3-metilciclohexanocarboxilico (cis/trans),
-30ácido 1-ciclopentenocarboxilico, ácido 1-ciclohexanocarboxilico, ácido tetrahidropirano-4-carboxilico, ácido tiofen-2-carboxilico, ácido 3-furoico, ácido 2-clorotiofen-4-carboxilico, ácido ciclobutanocarboxilico, ácido ciclopentanocarboxilico, ácido ciclohexanocarboxilico, ácido cicloheptanocarboxilico, ácido 2-metilciclopropanocarboxilico, ácido 3-ciclohexen-l-carboxilico, ácido 2-metiltiopropionico, ácido 2-metil-4-metoxibutirico, ácido tiofen-3-carboxilico, hidroximetilciclopentano,
3-tiofeno-carboxaldeido, ácido 3-ciclohexilpropiónico,
ácido 3-ciclopentilpropiónico, hidroximetilciclobutazno, ácido tetrahidrotiofen-3-carboxilico,
3- ciclopentil-l-propanol, sal de litio do ácido 3-metilciclobutanocarboxilico, ácido 3-fluorociclobutanocarboxilico, sal de litio do ácido 3-metilenociclobutanocarboxilico, ácido 2-metil-4-metiltiobutirico, ácido tetrahidrotiopiran-4-carboxilico, ciclobutilmetilamina, ciclobutanocarboxilato de etilo,
4- hidroximetilciclopentano,
2-(3-tiofenocarbonil)-propionato de etilo, ácido (S)-2-metilpentanoico, ácido (R)-2-metilpentanoico.
Estirpes mutadas de O-metil-transferase podem obter-se a partir das referidas mutantes desprovidas de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeias ramificadas e/ou de mutantes desprovidfos de transaminase de amino-ácido de cadeias ramificadas.
As estirpes mutadas, em que uma mutação para a actividade de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e/ou para a actividade de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada está associada com ) uma ou ambas das mutações de O-metil-transferase, dão origem a estirpes de S.avermitilis que, após adição de compostos de RCOOH ou de compostos convertiveis em RCOOH durante o processo de fermentação, irão produzir sobretudo B-avermectinas, desmetil-avermectinas ou compostos B de F desmetil-avermectinas.
Estas mutantes obtêm-se por mutação das referidas estirpes mutadas que não apresentem a actividade de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramifica da e/ou a actividade de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada, por meio de irradiação com luz ultra-violeta, e/ou agentes mutzagénicos quimicos, tais como N-metil-N-nitrosouretano, nitroso-guanidina, sulfonato de etilmetano ou outros produtos, tais como aqueles que se mencionaram atrás.
| Segundo um processo de alternativa, as mutantes que apresentam a desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e/ou mutantes que apresentam a actividade de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada, e que ambos carecem de uma ou de duas O-metil-transferases, podem ser mutadas mediante tratamento com luz ultra-violeta ou um agente mutagénico, para se obter as eq tirpes mutadas desprovidas de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e/ou de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada.
As avermectinas não-naturais produzi^ das pelas referidas mutantes estão caracterizadas pela presença de grupos hidroxi na posição C-5 da parte de agli_ cona e/ou na posição C-3' e/ou C-3 1 ' da parte de oleandrose.
As mutantes atrás mencionadas podem ser identificadas segundo os métodos referidos por Schulman et al. , Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 29, 620-624 (1986). Estas estirpes mutadas podem ser aproveitadas para os mesmos fins e da mesma maneira que as avermectinas conhecidas .
De acordo com um processo alternativo, maiores quantidades das B-avermectinas, incluindo aquelas sem grupos metilo na parte do dissacarídeo oleandrose, podem ser obtidas pela fermentação das estirpes mutadas de acordo com o invento, e que carecem da actividade de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e/ou da actividade de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada, na presença de uma substância, tal como sinefungina,
S-adenosil-etionina ou S-adenosil-homo-cisteína, que inibe a acção de O-metil-transferases.
Os compostos do presente invento são agentes antiparasitários altamente activos, que podem ser utilizados especialmente sob a forma de preparados anti-helmínticos, ecto-parasiticidas, insecticidas e acaricidas.
-34I
Assim, os compostos mostram a sua eficácia no tratamento de uma série de estados patológicos provocados por endo-parasitas, incluindo, em especial, a helmintíase, que é causada, muitas vezes, por um grupo de vermes parasitas designados por nemátodes e que provocam importantes perdas económicas na criação de suínos, ovelhas, cavalos e gado vacum, bem como afectam animais domés_ ticos e aves de capoeira. Os referidos compostos são tam bém eficazes em relação a outros nemátodes que parasitam várias espécies de animais, incluindo, por ex., Dirofilaria que parasita cães, e outros parasitas que poderão infectar seres humanos, incluindo parasitas do aparelho gastro-inte£ tinal, tais como Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloi des, Trinchinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius e pa_ rasitas que se encontram no sangue de outros tecidos e órgãos, tais como as filarias e os estádios extra-intestinais de Strongyloides e de Trichinella.
Os compostos do presente invento são também úteis no tratamento de infecções causadas por acto-parasitas, incluindo, em especial, ecto-parasitas artrópo des de animais e pássaros, tais como carrapatos, ácaros, pulgas, piolhos, moscas varejeiras, insectos roedores e larvas de dípteros migrantes, que poderão afectar o gado vacum e cavalos.
Os compostos do invento mostram-se também activos como agentes insecticidas em relação a pra gas domésticas, tais como as baratas, traças, escaravelho do tapete e a mosca doméstica, sendo também úteis era rela ção a insectos que parasitam os cereais armazenados e as plantas de cultivo, tais como Metatetranychus ulmi (ácaro vermelho), áfides, lagartas, e em relação a ortópteros mi grantes, tais como gafanhotos.
Os compostos de fórmula I são adminis trados sob a forma de uma fórmula apropriada à utilização específica em vista, e às espécies de animais hospedeiros que se pretendem tratar, bem como à natureza do:parasita ou insecto implicado.
Para a sua aplicação como preparado anti-helmíntico, os compostos poderão ser ministrados por via oral, sob a forma de cápsulas, bolus, comprimidos ou poção líquida, ou, alternativamente, eles podem ser administrados por injecção ou sob a forma de um implante (inoculo). Estas fórmulas são preparadas de maneira usual, se gundo processos habituais da medecina veterinária. Assim, as cápsulas, bolus ou comprimidos podem ser obtidos pela misturação do composto activo com um diluente ou veículo, finamente dividido, apropriado, e que poderá conter ainda um agente desintegrante e/ou ligante, tal como amido, lacto se, talco, estearato de magnésio, etc. Uma formulação sob a forma de poções poderá ser preparada, dispersando o composto activo numa solução aquosa, em conjunto com dispersan tes ou humectantes etc., e formulações injectáveis podem ser preparadas sob a forma de uma solução esterilizada, que poderá conter ainda outras substâncias, por ex., uma quant£ dade suficiente de sais ou de glucose, para se obter uma solução isotónica relativamente ao sangue.
A natureza destas formulações irá v£ riar quanto à concentração de composto activo em função da espécie do animal hospedeiro que se pretende tratar, da gravidade e tipo da infecção e do peso corporal do animal-hospedeiro. De uma maneira geral, e para uma administração por via oral, uma dose de cerca de 0,001 e 10 mg/kg de peso
corporal do animal, administrada sob a forma de uma dose única ou em várias doses fraccionadas, durante um período de 1 a 5 dias, será suficiente, embora possa haver casos que necessitem de uma posologia maior ou menor, casos esses que estão abrangidos pelo presente - invento.
Como alternativa, os compostos podem ser ministrados juntamente com as rações dos animais e, para esta finalidade, pode preparar-se um aditivo concentra do ou premix que se juntará à ração normal dos animais.
Para a sua aplicação como preparados insecticidas e para o tratamento de pragas agrícolas, os compostos do invento são aplicados sob a forma de misturas pulverizáveis, pós, emulsões, e preparados semelhantes, de acordo com a prática habitual no domínio da agricultura.
Preparação de S_. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) desprovida de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada.
Etapa 1
A multiplicação de S_. avermitilis
ATCC 31272 fez-se sob a forma de um tapete confluente, num meio nutritivo (New Patch Agar Médium), durante 12 dias, a 30°C. 0 meio nutritivo compreendia:
Sumo V-8+ | 200 ml |
CaCOg | 3 g |
Agar-ágar | 15 g |
f^O para perfazer | 1000 ml |
Caldo nutriente | 1,0 g/L |
acetato de sódio. 31^0 | 1,4 g/L |
ácido iso-valérico | 50 mg/L |
ácido iso-butírico | 50 mg/L |
ácido 2-metilbutírico | 50 mg/L |
Iso-leucina | 250 mg/L |
Leucina | 250 mg/L |
Valina | 250 mg/L |
solução de oligo-elementos++^ | 1 ml/L |
+ )
Uma mistura de 8 diferentes sumos de legumes (tomate, ce noura, aipo, beterraba, ou nabos, salsa, alface, agrião e espinafre) + sal, ácido ascórbico e ácido cítrico e aromati^ zantes naturais. Fabricante:Campbell Soup Company,Camden,N.J.
++)
Composição da solução de oligo-elementos:
FeClo.6Ho0 3 2 | 2,7 |
MnSO4.H2O | 4,2 |
CuSO4.5H2O | 0,5 |
CaCl2 | n,o |
H3BO3 | 0 ,62 |
CoC12.6H2O | 0,24 |
ZnCl2 | 0,68 |
Na2Mo04 | 0,24 |
Dissolvem-se os compostos atrás refe_ ridos em 1 litro de HC1 O,1N.
Procedeu-se à colheita de esporos em 3 desta placas ou pratos, que se suspenderam em 20 ml de um tampão de ácido tris-maleico 0,05M (pH = 9,0).
Etapa 2 ml da suspensão de esporos foram adicionados a um frasco contendo 10 mg de N-metil-N'-nitro so-guanidina (NTG). O frasco foi incubado e agitado, a 28°C, durante 60 minutos e, em seguida, os esporos foram lavados abundantemente com uma solução de NaCl, a 1%.
Etapa 3
Os esporos lavados foram suspensos em NaCl, a 1%, e misturados com um volume igual de etileno glicol, a 80%. A suspensão obtida foi conservada a -2(Pc e foi utilizada como fonte de células susceptível de ver£ ficação quanto à existência de estirpes mutadas. Rendeu um número aproximado de 10 de colónias/ml aquando da ge£ minação.
Esta suspensão-stock de esporos foi espalhada sobre placas YPD, dando origem a cerca de 100 colónias por placa (o meio YPD contém, respectivamente, )
g/1 de extracto de leveduras, peptona de Bacto e dex trose; e 15 g/1 de ágar-ágar de Bacto , ajustado a pH = = 6,9, antes da introdução na autoclave). Os ingredientes assinalados com um asterisco podem ser adquiridos à Difco Lab., Detroit, Michigan 48238.
Etapa 4
Colónias individuais foram retiradas das placas, passadas 2 a 3 semanas de multiplicação, a 28°C, e colocadas nos compartimentos de uma placa de micro-titulação standard 96. de igual modo, uma pequena par te da colónia foi repicada para um novo meio de ágar-ágar para poder servir de fonte de células viáveis aquando da identificação das mutantes.
Etapa 5
Juntou-se a cada compartimento cerca de 75 jul de um meio líquido de sais M9, contendo 1% de glucose, 0,1% de casamino-ácidos e 0,01%, respectivamente, de ácido isovalérico, isobutírico e 2-metilbutírico. Pa£ sados vários dias de incubação a 28°C, procedeu-se à análise das células quanto à presença de desidrogenase de 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada. (Cada litro demeio líquido de sais M9 contém 6 g de ^2^0^, 3 g de Kf^PO^, 0,5 g de NaCl e 1 g de NH^Cl. O meio é introduzido numa autoclave e, em seguida, juntam-se 1 ml de 1M MgSO^ e 1 ml de 0,lM CaCL^ esterilizados, em condições assépticas).
Etapa 6
Preparou-se uma micro-suspensão de tolueno, a 5%, no meio de sais M9, submetendo a mistura imiscível à acção de ultrasons (sonication). Juntaram-se, a 25 ml desta suspensão, 1,2 ml de uma solução conten do ácido Γ *C-1 7-2-oxo-isocapróico, com actividade radie? activa de 2,5 jtiCi/ml e de 10,0 ;uCi/jumole. 50 jul desta mis.
tura glcbal foram adicionados aos compartimentos das placas de micro-titulação contendo as colónias que se preten diam submeter a verificação.
Etapa 7
O CO2 libertado a partir de cada compartimento foi captado e visualizado através do proces. so descrito por Tabor et al., J. Bacteriol. 128 485-486
(1976), intitulado Método apropriado para a detecção de em amostras múltiplas: a sua aplicação ao rastreio rápido de mutantes. As estirpes mutadas desprovidas de desidrogenase activa em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada não produzem qualquer Ba CO^ para alem do que se observa nas amostras-testemunhas.
Um método mais apurado, que melhora o contraste entre um ensaio positivo para Co2 , assinalado por uma mancha negra no autoradiograma, em consequência da formação de Ba CO^ , e um ensaio negativo, assinalado pela ausência de qualquer mancha ou pela presença de apenas uma mancha muito ténue, abrange a seguinte análise de screening (detecção).
Colónias individuais (cf. a etapa 4, acima) foram repicadas do meio de ágar-ágar após um perío do de crescimento de 7 a 14 dias ( de preferência a um p£ ríodo de 2 a 3 semanas, e à análise directa, tal como nas etapas 6 e 7, acima). Omite-se a etapa 5 do processo de análise atrás referido.
Um método de análise ainda mais perfeito, de carácter quantitativo em relação à libertação de 14
C02, consiste em fazer crescer as mutantes, detectadas pelas análises atrás referidas (screens), sobre um meio apropriado, composto de um meio de sais M9 com glucose, a 1% e Syncasa-bcaa, a 0,1% (uma mistura sintetizada de L-amino-ácidos, com a composição aproximada de casamino-ácidos comerciais, mas sem a presença de L-valina, L-iso leucina e L-leucina., cf. mais adiante).
Depois de um período de crescimento em que atingiram uma elevada densidade celular (populaci£ nal) , as células foram lavadas num meio de sais de M9 e foram de novo suspensas no meio de sais M9, frio, contendo 1% de tolueno, que tinha sido submetido à acção de ultra-sons a fim de se obter uma dispersão leitosa do tolu£ no. A suspensão de células/tampão/tolueno foi incubado durante 40 minutos, a 30°C, a fim de se conseguir a permeabilizaação das células. Em seguida, as células perme£ bilizadas foram purificadas nos sais do meio M9 e, por fim novamente suspensas em 1/5 do volume original do tampão (?eio M9). Por cada análise (assay) foram utilizados 180 ul desta suspensão.
Um comun volume de 300 jul continha as células adicionadas de tolueno, pirofosfato de tiamina (TPP), 0,4 mM, a coenzima A (Co-A), 0,11 mM, o dinucleotido de nicotinamida-adebina (NAD), 0,68 mM, ditioreitol (DTT), 2,6 mM, MgCl„, 4,1 mM, tris-HCl, 60 mM, tris-HCl, 60 mM, pH=7,5 e Γ d C-1_7-jà -ceto-isocaproato, 6.000 cpm de /íCi por /imole.
A eficácia da contagem elevava-se a 73%. a reacção foi realizada em frascos de cintilação de 15 ml de capacidade, contendo quadrados de papel de Whatman + 4, de 2 x 2 cm, introduzidos na tampa roscada do frasco.
papel contém 30 /11 de 1M Hyamine-Hidróxido (solução 1M, de hidróxido de metilbenzetónio, em metanol, fabricante: Sigma Chemical Co. , St. Louis, Mo 14
63178),que serve para imobilizar (captar) o CC^ que se desprende durante a reacção.
Após um período de incubação de 2 horas, os quadrados de papel são mergulhados em 10 ml de Beckman Aquasol II (universal LSC, contador de cintilação liquido), que pode ser adquirido a New England Nuclear Research Products , Boston, Ma 02118) e a radioactividade é determinada mediante um contador de cintilação liquido após equilíbrio, neste solvente, durante 4 horas ou mais. Uma reacção-testemunha, em branco, (isto é, sem células), forne_ ce cerca de 50 a 300 cpm.
A mutante 1-3 e outras semelhantes registaram que eram mais ou menos iguais a ou inferiores às contagens emitidas na reacção-tetemunha, em branco, ao passo que a estirpe progenitora apresentou contagens (densidades) que eram várias vezes mais elevadas que os valores obtidos na reacção-testemunha, em branco.
Isolamento do derivado Hl-026 (ATCC 53568) de S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567)
S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi repicada sobre placas de ágar-ágar nutriente. Surgiram com uma frequência relativamente elevada variantes (mutantes) espontanes, algumas das quais careciam de micélio aereo a seguir a um período de incubação de 4 dias, a 30°C.
Isolaram-se várias destas mutantes e submeteram-se a ensaios para examinar a sua capacidade de produzirem avermectinas não-naturais, quando fermentadas num meio AP-5, ao qual tinha sido adicionado ácido ciclopentano-carboxilico.
De entre estas estirpes isoladas, muitas das quais produziram avermectinas não-naturais isen tas de avermectinas naturais, uma estirpe que rendeu titulosmais elevados de avermectinas, em experiência em frascos , do que a sua estirpe progenitora S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi desiganda HL-026 (ATCC 53568) (Número de identificação), Preparação de S.avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) desprovida de desidrogenase em 2-oxo-ácidos de cadeia ramificada e de transaminase em amino-ácidos de cadeia ramificada.
Etapa 1.
Cerca de 100 mg de S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567), cultivadas numa placa de ágar-ágar SAMM fres co, durante 4 dias, foram inoculados num frasco de 300 ml de capacidade, contendo 50 ml do meio SCM (pH = 7,2). Em seguida, o frasco foi agitado, a uma velocidade de 200 r.p.m., e a.30° C, durante 24 horas (pH final = 8,2).
Etapa 2.
O frasco foi retirado do dispositivo agitador e 10 ml do caldo inteiro foram centrifugados, num tubo esterilizado, durante 5 minutos, a uma velocidade de 2000 r.p.m. Em seguida, as células foram de novo suspensas em 50 ml do meio SCM, em balões de Erlenmeyer esterilizados, de 300 ml de capacidade e os balões foram agitados num dispositivo rotativo, durante 2 horas a 30° C.
Etapa 3.
ml da suspensão foram introduzidos num tubo de ensaio esterilizado.
Etapa 4.
Juntaram-se ao balão 250 ul de sulfo nato de etilmetano (numa chaminé bem arejada), a mistura foi enérgicamente agitada e, em seguida, deitada num balão de 30 ml de capacidade, esterilizado, e o balão foi agitado mediante um dispositivo agitador, rotativo, durante 3 horas, a 30° C.
Etapa 5.
Adicionou-se ao balão o meio SCM esterilizado fresco (40 ml) e continuou-se a agitação durante um periodo total de 70 horas, também a 30° C.
Etapa 6.
Removeu-se o balão, o conteúdo do ba Ião foi centrifugado a uma velocidade de 8000 r.p.m., durante 10 miutos, a 20° C. As células foram lavadas por no va suspensão em meio de SCM, novamente centrifugadas e de novo suspensas em 10 ml do meio SCM.
Etapa 7.
Removeram-se as células e examinaramse as células, por meio do processo de replicagem de sub-culturas, com cerca de 150 colónias/placa, quanto à sua capacidade de crescerem sobre placas minimas de M9/glucose na presença ou ausência de L-leucina, L-isoleucina, L-vali na e uma combinação de qualquer um dos referidos amino-áci dos. As células mutadas que interessavem só cresciam num meio suplementado de L-leucina, L-isoleucina e L-valina.
Estes derivados de S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567), desprovidos de acção de transaminação em anã noácidos de cadeia ramificada, também não cresceram sobre meios nutritivos adicionados de um ou mais dos três 2-oxo-ácidos (ácido 2-oxo-isocaproico, ácido 2-oxo-3-metilvalérico e ácido 2-oxo-isovalérico), que servem de percursores para L-leucina, L-isoleucina e L-valina. Este comportamento ccntrasta nitidamente com o apresentado por S.avermi tilis 1-3 (ATCC 53567), que cresceu bem sobre os referidos meios nutritivos. Assim, uma única enzima transaminase catalisa a transaminação dos 2-oxo-ácidos mencionados.
Meio Nutritivo SCM | |||
Autolisato < | de leveduras | 10 | g/1 |
Extracto de | carne de vaca | 5 | g/i |
Hidrolisato | enzimático de caseína | 10 | g/i |
MgSO4 1M K2HPO4 1M; | pH = 7,0 (HC1) | 3 100 | g/i g/i |
Placa de ágar-ágar SAMM | |
g/L | |
NaHPO. 4 | 6,0 |
KH2PO4 | 3,0 |
NaCl | 0,5 |
NH .Cl 4 | 1,0 |
1M MgSO4 | 1,0 |
O,1M CaCl2 | 1,0 |
Dextrose | 8,0 |
Casamino-ácidos | 20,0 |
Ágar-ágar | 20,0 |
Composição de Syncasa L-alanina
L-arginina
L-ácido-aspartico
L-cistina
L-ácido glutâmico glicina
L-histidina
L-lisina
L-metionina
L-fenilalanina
L-prolina
L-serina
L-treonina
L-tirosine
L-triptofano bcaa , Concentrado cêntúplo g/i
O pH da mistura é ajustado a um valor de 7 e a misturaé esterilizada, por filtração. Junta-se 1 volume do concentrado a 99 volumes do meio para se obterem concentrações-standard.
Preparação de S.avermitilis JC-923 (ATCC 53669) por meio de fusão protoplástica de uma estirpe resistente à espectf nomicina de S.avermitilis ATCC 31272 e de S.avermitilis
PGS 119 (ATCC 53670)
S.avermitilis ATCC 31272, resistente à espectinomicina, é uma mutante espontânea de S.avermitilis ATCC 31272. Foi isolada a partir de populações de micélios vegetativos de ATCC 31272 replicadas sobre placas de ágar-ágar AS-1, contendo 50 pg/ml de espectiomicina. Os esporos da estirpe mutada, germinados num meio enriquecido, são resistentes a 50 pg/ml de espectinomicina, contrastando com os esporos isogénicos da linhagem progenitora, que não conseguem germinar nas referidas condições. Este mar cador dominante selectivo foi utilizado com êxito para isolar estirpes isoladas de ATCC 31272, desprovidas de trans aminases em amino-ácidos de cadeia ramificada.
Agar-ágar AS-1 (Meio enriquecido de repigem de culturas para Streptomyces)
Extracto de Leveduras | 1 | g |
L-alanina | 0,2 | g |
b-arginina | 0,2 | g |
L-asparagina | 0,5 | g |
Amido solúvel | 5 | g |
NaCl | 25 | g |
Na2SO4 | 10 | g |
Agar-ágar | 20 | g |
Agua destilada | 1 litro |
Ajusta-se o pH a um valor de 7,5.
Introduz-se a mistura numa autoclave, onde permanece duran te 15 minutos, a 121° C. Deita-se a mistura (em porções de 30 a 35 ml) em caixas de Petri esterilizadas, de material (100 x 15 mm).
PROCESSOS PARA PRODUZIR PROTOPLASTOS VlAVEIS DE ESTIRPES DE
AVERMITILIS DE STREPTOMYCES
A. Esporos como material inoculado
1) Obtiveram-se preparações de esporos por meio de pro cessos habituais o núero de esporos viáveis foi estimado espalhando-se diluições sobre ágar-ágar nutritivo para ger minações e partes aliquotas foram congeladas, a -70° C, em glicerol, a 40 %.
2) Antes de serem utilizados, os esporos armazenados foram centrifugazdos, a 1000 G, durante 10 minutos, e nova mente suspensos num volume igual de cloreto de sódio, a 0,85 %.
3) Cerca de 10 esporos foram inoculados em 30 ml de um meio nutritivo (caldo) modificado de extracto de levedura-extracto de malte (YEME), contendo 0,5 % de glicina (cf. mais adiante), num balão de 300 ml de capacidade, mu nido de 3 a 4 divisórias.
B. Micélios congelados, submetidos a ultra-sons utilizados como material inoculado.
1) Culturas de micélios de PGS-119 foram cultivadas num caldo de soja de Tripticase (TSB) até se atingir numa turvaçao de 2 a 9, a 9000 nm. A cultura foi homogeneizada 10 vezes, mediante incluir um triturador de vidro para tecidos.
2) Os micélios homogeneizados foram diluidos (diluição dupla) em TSB, juntando-se 20 ml a um tubo de ensaio de polipropileno esterilizado, para centrifugando. Uma sonda de ultra-sons foi mergulhada no liquido até a uma profundidade de 1 a 2 cm, e a amostra foi submetida à acção de ultra-sos, a uma intensidade de 50 %, durante 10 segundos. A aplicação de ultra-sons dispersou as massas de micélios em várias unidades celulares, individuais ou duplas, que mostraram um crescimento rápido, exponencial, quando da sua repicagem (sub-culturas).
3) As preparações de micélios tratados com ultra-sons foram diluidas até a uma concentração final de glicerol, a 40 % transferidas para balões por meio de pipetas, e congeladas a -70° C.
4) Partes aliquotas foram descongeladas, à temperatura ambiente, congorme as necessidades, para serem inoculadas no meio YEME, tal como se refere na etapa A.3.
C. Colónias em meio nutritivo de ágar-ágar como material inoculado
1) 6 colónias maduras de PGS-119, que cresceram sobre meios de ágar-ágar YPD-2 ou TSA, foram introduzidas, mediante um lOOp (programa ciclico ou sem circuito fechado) em 200 jul de água esterilizada contida num tubo de ensaio para micro-fusões.
2) A mistura de micélios foi homogeneizada mediante um pilão (almofariz) de uso único.
3) As colónias homogeneizadas foram adicionadas ao meio YEME, tal como se descreve na etapa A.3.
D. Preparações de protoplastos a partir de micélios multiplicados em glicina
I
1) Incubaram-se culturas, num banho de água mantido em agitação, a 29° C, no escalão 8, durante cerca de 65 horas.
i
I I
2) Os micélios foram observados ao microscópio (amplificação 40 x, fase 2) e colhidos para um tubo de ensaios de polipropileno para centrifugação, a cerca de 1475 G, durante 10 minutos, a 20° C.
3) a solução sobrenadannte foi desprezada e o prensado de micélios foi novamente suspenso em 10 ml de um tampão de protoplasto (P) (cf. mais adiante). A massa de micélios foi homogeneizada, 5 a 10 vezes, mediante um dispos£ tivo triturador para tecidos, formando-se grumos dispersos. ;
I
4) A amostra obtida foi centrifugada, a cerca de 1000 G durante 10 minutos. A solução que sobrenadava foi e despre zada e o prensado de micélios foi cuidadosamente re-sus-
I penso em 10 ml do tampão P.
5) Repetiu-se a operação de lavagem atrás descrita.
6) A massa de micélios foi novamente suspensa em 10 ml de uma solução de lisozima fresca de 1,0 mg/ml, num tampão P, que tinha sido filtrada e esterilizada, aquando da sua passagem através de um filtro de malhas de 0,22 u.
7) a mistura de micélios foi incubada, em banho-maria a 37° C, sob agitação moderada, durante 60 minutos, de 15 em 15 minutos, as amostras foram de novo suspensas na solução de lisozima. Observaram-se as amostras ao microscópio, sob iluminação de fases (40 x), para detectar a presença de protoplastos.
8) As preparações de micélios foram triturados, 3 vezes com uma pipeta de 5 ml de capacidade, a fim de desembaraçar os protoplastos da sua membrana celular.
9) As preparações foram filtradas através de lã de vidro ou de algodão não-absorvante.
10) Os protoplastos foram induzidos à sedimentação por meio de centrifugação, a cerca de 1000 G, durante 7 minutos e, em seguida, foram novamente suspensos, com cuidado em 5 ml de tampão P, e observados ao microscópio, com amplificação de fase de 40 x.
11) Procedeu-se à sedimentação dos protoplastos da maneira atrás referida, e à sua nova suspensão em 1,0 ml do tampão P. Desta suspensão efectuaram-se diluições no tam pão P eagua destilada, após o que as diluições obtidas foram espalhadas sobre um meio regenerativo. As colónias que proviram de preparações de protoplastos diluidas em água destilada consideravam-se como derivados de unidades miceliais com protoplastos incompletos ou sem protoplastos.
12) Os protoplastos foram congelados em gelo em partes aliquotas de 200 - 300 ul a -70° C. Passadas 18 a 24 horas os protoplastos foram removidos do gelo.
I
FUSÃO DE PROTOPLASTOS COM POLIETILENO
GLICOL (PEG) 1000
1) Todas as experiências aqui descritas foram realizadas r com um único lote de PEG 1000 (Sigma Chemical Co., ST Louis
MO 63 178), que provocou pouca toxicidade aparente quando manipulada nos nossos laboratódios.
| 2) Partes aliquotas de 1,0 g de PEG, em frascos de vidro foram introduzidas numa autoclave, juntou-se 1,0 ml do tam pão P e o PEG foi dissolvido, aquecendo o frasco até 55°C !
ou pesou-se o PEG, dissolvendo-o depois em tampão P e submetendo-o a filtração esterilizante, imediatamente antes
I deser utilizado. As solução de PEG empregaram-se às respectivas temperaturas ambientes.
3) Procedeu-se à preparação de protoplastos frescos ou pro toplastos conservados a -70° C foram rapidamente derretidos expondo-os ao jorro de água corrente. Números aproximadamente iguais de protoplastos de cada genótipo foram transferidos, mediante pipetas, com cuidado, para um tubo de
I ensaio de poli-carbonato para centrifugações. Em relação a preparações de protoplastos recentemente obtidas mediram-se as respectivas turvações (densidades), procedendo-se à fusão de várias concentrações distintas. Pela adição do tampão P, o volume em cada tubo de ensaio foi ajustado a ) 5,0 ml.
4) A mistura em fusão foi centrifugada a cerca de 1000 G durante 7 minutos.
5) A solução sobrenadante foi cuidadosamente decantada.
A massa de protoplasto foi de novo suspensa, suavemente, a um volume final de 200 pl, com tampão P.
6) 800 jul de PEG, a 50%, foram rapidamente adicionados à mistura em fusão, a preparação foi misturada, aspirando-a para uma pipeta de Pasteur e esvaziando-a desta, seguidamente. A mistura em fusão foi incubada durante 2 minutos à temperatura ambiente. Para diluir o PEG juntaram-se 9 ml do tampão P. as operações de fusão subsequentes foram realizadas por via serial, de modo a garantir a uniformidade dos intervalos de incubação.
7) As misturas em fusão foram centrifugadas, tal como se descreve na etapa 4, a solução sobrenadante foi decantada cuidadosamente e os protoplastos fundidos, lavados, foram de novo suspensos em 1,0 ml de tampão P.
8) a mistura em fusão foi diluída por via serial, numa e£
-1 -2 cala de 10 e 10 , no tampao P.
9) em cada experiência foram realizados de cada estirpe individual e replicadas sobre as placas, tal como nas experiências-testemunhas .
10) Diluições de cada preparação de protoplasto (contagens de amostras viáveis) foram repicadas (espalhadas), para se determinar o número de protoplastos regenerantes, viáveis de cada estirpe utilizada no processo de fusão.
REGENERAÇÃO DOS PROTOPLASTOS
1) Suspensões de protoplastos, misturas em fusão ou fusões espontâneas foram diluídas segundo as necessidades, em tam pão P, e, em partes alquitas de 100 ul, foram espalhadas (repicadas) sobre meios nutritivos de ágar-ágar, de regeneração mediante uma técnica de dispersão suave. A disseminação ou repidagem dos protoplastos fundidos em camadas adicionais de ágar-ágar mole não melhorou de forma signifi. cativa a sua capacidade de regeneração.
2) Sempre que estivesse indicado, lançou-se mão do processo descrito em D.11.
3) As placas regenetivas foram incubadas, com o seu lado direito levantado, em sacos de material plástico, a 29-30θΟ e a uma humidade de cerca de 95%.
4) Para as fusões de protoplastos, nas quais a resistência a espectiomicina foi adoptada como caracteristica dominante de marcador selectivo, os protoplastos regenerativos f£ ram recobertos, passados 18 horas, de 3,5 ml de 100 ug/ml de espectinomicina, em ágar-ágar macio ou diluído (cf. mais adiante), introduzidos numa autoclave, e adicionados aos sacos de plástico, a cerca de 45° C.
5) Os protoplastos foram incubados durante um periodo de a 10 dias.
MEIOS NUTRITIVOS MEIOS DE REGENERAÇÃO E PROTOPLASTOS-TAMPÃO
Meio regenerativo completo (Alterado segundo Hopwood, et al., 1985. Manipulação genética de Streptomyces: Um manual para o laboratório, a pág. 235).
Solução de base:
Sucrose
205 g k2so4
MgCl2.6H2O
Glucose
0,25 g
10,12 g g
Casamino-ácidos da Difco
0,1 g
Extracto de leveduras da Difco
5,0 g
Agar-ágar de farinha de aveia da difco
3,0 g
Bacto-ágar-ágar da Difco
22,0 g
Agua destilada para aumentar o volume para 955 ml
Introduz-se numa autoclave e deixa-se reagir durante 25 minutos, a 121°C.
Em seguida, juntam-se volumes-stock esterilizados de:
ml
KH2PO4 (a 0,5%)
CaCl2.2H2O | 5 | ml | |
L-proplina (a | 20%) | 15 | ml |
Tampão MES (1 | ,0 M) | 10 | ml |
Solução de um | elemento marcador (tracer)+^ | 2, | 0 ml |
NaOH (IN) | 3, | 0 ml | |
Ajusta-se o pH a 6,5, | aumenta | -se o | |
volume para 1 | litro. | ||
+) Solução de | elementos marcadores (tracers) | (por litro) | |
ZnCl2 | 40 | mg | |
FeCl3.6H2O | 200 | mg | |
CuC12.2H2O | 10 | mg | |
MnCl2.4H2O | 10 | mg | |
Na2B4O?.10H2O | 10 | mg | |
(NH ) MO 0 «2° | 10 | mg |
Camadas adicionais de espectinomicinas em ágar-ágar diluido
Meio regenerativo completo, tal como se especifica atrás, excepto:
Âgar-ágar 4,10 g
Faz-se reagir numa autoclave da maneira atrás referida. Juntam-se 100 mg de espectinomicina reparte-se por partes aliquotas de 5 ml de volume, em tubos de ensaio fechados, para culturqs. Cogela-se introduz-se de novo numa autoclave, imediatamente antes de utilizar a mistura.
Tampão de protoplastos modificado (P)
Sucrose205 g
K2SO40,25g
MgCl2.6H2O2,02g
Agua destilada para aumentar o volume para 997 ml
Faz-se reagir numa autoclave durante minutos, a 121° C.
Após a reacção na autoclave, adicionam-se, na ordem de sequência indicada, volumes-stock esterilizados de:
KH2PO4 (a 0,5%) | 1 | ml | |
Solução de elementos | marcadores | 2 | ml |
CaCl2.2H2O (3,68%) | 10 | ml | |
Tampão MES (l,0M) | 10 | ml | |
Ajusta-se o pH a | 6,5 aumenta | -se o | |
lume para 1 litro. | |||
Composição da | solução de | lestos |
elementos traçadores: composição idêntica atrás indicada.
Meio modificado de extracto de malte-extracto de leveduras | ||
YEME Solução de base: Extracto de leveduras da Difco | 3 | g |
Bacto-peptona da Difco | 5 | g |
Caldo de Bacto-extracto de malte da Difco | 3 | g |
Glucose | 10 | g |
Sucrose | 300 | g |
Agua destilada para aumentar o volume para | 973 | ml |
Faz-se reagir numa autoclave duran- | ||
te 25 minutos, a 121° C. | i |
Após a reacção na autoclave, juntam-se:
MgCl2.6H2O (2,5 M)
Glicina (a 20%) ml ml
Aumenta-se o volume para 1 litro.
Descrição dos desenhos anexos.
Figura 1: Diagrama de UV (240 nm) em função do tem po (minutos) de cromatogramas de HPLC, de fracçoes solubilizadas provenientes da extracção, com solventes, de células de S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567), após o seu crescimento sobre um meio nutritivo isento de ácidos gordos (WPM SynA, 40 : 40). Pico em 13,12 representa a oligomicina A.
Figura 2: Gráfico com raiso UV, a 240 nm, de cromatografias de HPLC de fracçoes solubilizadas obtidas da extracção, com solventes, de células de S.avermitilis (ATCC 31272), após o seu crescimento sobre um meio isento de áci dos gordos (WPM Suna 40 : 40). Os produtos obtidos constituem avermectinas naturais.
Figura 3: Gráfico com raios UV, a 240 nm, de cromatograf ias de HPLC de fracçoes solubilizadas da extracção, com solventes, de células de S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567) após o seu cresciento sobre um meio contendo ácidos ciclopentilocarboxilico (cf. o exemplo 1).
Os desenhos anexos são representações exactas de curvas cromatográficas de HPLC dos compostos referidos atrás.
Apresenta-se seguidamente as composições dos meios utilizados nos seguintes exemplos práticos. Todos os pesos moleculares foram obtidos mediante bombardeamento nuclear de alta energia num espectrómetro de ma£ sa, realizado num modelo VG 7070E do espectrómetro de mas sas, utilizando como amostra de base (matrix) trietileno | z I glicol, com cloreto de sódio sólido.
í I , ,+ . 1
Determinou-se (M + Na) . Realizou-se 1 a espectrómetria de massas por bombardeamento de electrões, ' no modelo de espectrómetro de massas VG 7070F, com o fim de se obterem valores m/e. Registam-se apenas os valores j dos picos correspondentes aos fragmentos principais (iões). |
Meio AS-7 | g/i |
3 ) Amido diluido | 20 |
Ardamine pH | 5 |
c) Pharmamedia | 15 |
CaCO-j | 2 |
a) |
Preparado por meio de hidrólise de amido mediante íx-ami lase obtida de Bacillus licheniformis (fabricante: Novo Enzymes, Wilton, CT. comercializado sob a designação (mar ca registada) de Termamyl), até a um equivalente de dex trose de 40% í 5%.
-64b)
Fabricante: Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012
c)
Fabricante: | Traders Proteins., Memphis. TN, 38108. |
Ajusta-se a um pH de 7,2 pela adição | |
de hidróxido de sódio (NaOH). | |
Meio AP-5 | |
g/i | |
amido diluido | 80 |
Ardamine pH | 5 |
k2hpo4 | 1 |
MgSO4.7H2O | 1 |
NaCl | 1 |
CaCO^ | 7 |
FeSO2.7H2O | 0,01 |
MnCl2.7H2O | 0,001 |
ZnSO4,7H2O | 0,001 |
Ρ-2000 (agente | anti-espuma) 1 ml/1 |
Ajusta-se o pH a 6,9 pela adição de |
NaOH, a 25%
g/1 de água destilada ί
I
Amido diluido fécula de batata solúvel ácido glutâmico arginina cistina histidina leucina lisina metionina fenilalanina treonina triptofano tirosina k2hpo4
MgSO4<7H2O
1,0
0,168
0,084
0,069
0,798
0,297 ,108
0,168
0,174
0,048
0,192
1,0
1,0
WPM Syn A, 40 : 40 g/1 de água destilada
NaCl | 1,0 |
CaCO^ | 3,5 |
FeSO..7Ho0 4 2 | 0,01 |
MnCl2.4H2O | 0,001 |
ZnSO4.7H2O | 0,001 |
i
Ajusta-se o pH a um valor de 6,8 - 7,0 agita-se durante 30 minutos, a 121°C.
WPM Syn B, 40 : 40 g/1 de água destilada
Fécula de batata solúvel40 amido diluido s40 ácido glutâmico0,390 arginina0,168 cistina0,084 histidina0,069 lisina.HCl0,297 metionina0,108 fenilalanina0,168
I treonina0,174 tritofano0,048 tirosina0,192
K2HPO41
MgSO4.7H2O1
NaCl
WPM Syn B, 40 : 40
CaCOg
FeSO4.7H2O
MnCl2.4H2O
ZnSO4.7H2O g/1 de água destilada
3,5
0,01
0,001
0,001
Ajusta-se o pH a um valor de 6,8 - 7,0 e agita-se durante 30 minutos.
Processos gerais para a realização de cromatografia líquida de alto rendimento (HPLC)
Fase móvel:
150 ml de água ml de acetonitrilo
Aumenta-se o volume para 1 litro, pela adição de metanol.
Coluna:
Ultrasphere ODS, 25 cm, (Beckman Instruments,
Fullerton, CA 92634-3100)
Débito: 0,75 ml/minuto
Detecção: raios UV, a 240 nm
Afinação(atenuação): próximo de 6.
Diluente Xamostra) (D) :
ml de acetonitrilo + 390 ml de metanol.
Padrões:
1) Pesa-se 0,5 mg de avermectina A2A para den tro de um balão de 10 ml de capacidade e aumenta-se até ao volume indicado pela adi. ção de metanol.
2) Pesam-se 0,5 mg do composto de ensaio, in troduz-se num balão de 10 ml de capacidade e aumenta-se até ao volume indicado pela adição de metanol.
1) e 2) são soluções-stock dos padrões, para a solução pa drão a utilizar no processo, adopta-se o seguinte método:
Introduzem-se 100 /11 de (1) e 100 /11 de (2) num balão e juntam-se 800 /11 da fase móvel.
Amostras:
1) Retira-se 1 ml do caldo bem agitado; sed£ menta-se por centrifugação.
2) Remove-se a maior quantidade possível do material que flutua sem agitar a massa se dimentada (pellet).
3) Juntam-se 100 /11 de água para HPLC à massa sedimentada e centrifuga-se para se obterem grânulos dispersos.
4) Adicionam-se 2 ml de diluente (D) e mistura-se bem.
5) Procede-se à filtração da mistura resultan te e realiza-se a HPLC.
As avermectinas naturais foram subme tidas ao referido processo de cromatografia HPLC e o tempo de retenção dos picos correspondentes às várias avermectinas foram divididos pelo tempo de retenção registado para a oligomicina A presente, e que serve de padrão interno para uma dada determinação por HPLC.
A oligomina A observa-se quase sempre na HPLC sob a forma de produto secundário obtido nas fermentações de S. avermitilis e é o único composto observado na HPLC que é produzido pelas estirpes mutantes aqui descritas, quando estas forem multiplicadas num meio nutri^ tivo isento de ácidos de fórmula geral RCOOH, em que R re_ presenta um grupo atrás definido, ou num meio isento de compostos convertíveis nos ácidos de fórmula RCOOH, em que R é tal como atrás se define.
Geralmente, o tempo de retenção para a oligomicina A é de 12,5 - 14 minutos. A relação dos tempos de retenção (RT) fornece um termo de comparação mais útil quanto à identificação e rendimento dos produtos finais (avermectinas).
Na HPLC, a ordem de sequência geral em que aparecem as avermectinas finais é a seguinte: B2, A2, B1 e Al (figura 2).
Avermectina natural
B2b
B2a
A2b
A2a
Blb
Bla
Alb
Ala
RT/RT (oligomicina A)
0,70 ,84
0,90
1,09
1,40
1,83
1,83
2,42
-72I
Avermectina não-natural
Ciclopentilo-B2
Ciclopentilo-A2
Ciclopentilo-Bl
Ciclopentilo-Al
RT/RT (oligomicina A)
0,94
1,23
1,99
2,62
Na Figura 2, as relações respectivas foram determinadas para as avermectinas naturais (note-se de que Bla e Alb não apresentam resolução individualizada) e na figura 3, as respectivas razões foram determinadas pa_ ra as avermectinas não-naturais. Os tempos de retenção va riam em 1 a 2 minutos, em dias diferentes; geralmente, a oligomicina A tem um tempo de retenção próximo de 12,5 - 14 minutos.
Nos seguintes exemplos, as avermecti. nas foram caracterizadas através do processo de HPLC atrás referido.
EXEMPLO 1
Ciclopentilo-Avermectina A2
A estirpe de £. avermitilis 1-3 (ATCC 53567) foi multiplicada, a 28 - 30°C, no meio nutritivo AS-7, sob agitação durante 24 horas. Usou-se uma porção de 5 ml para a inoculação do conteúdo de um frasco de 500 ml de capacidade, contendo 100 ml de meio AS-7 e a incubação foi efectuada, nas mesmas condições, durante 24 horas.
Em 1 ml desta cultura foi inoculado o meio AP-5 (40 ml con tidos num frasco de 300 ml de capacidade), sendo posterior mente (decorridas 24 horas) adicionados 0,4 g/1 de ácido ciclopentano-carboxílico (sob a forma do sal de sódio).
Os frascos contendo o produto foram elaborados, sob agitação, a 28 - 30°C. Decorridas 240 hç> ras, obtiveram-se 35 mg/1 de ciclopentilo-avermectina A2, ao passo que o correspondente título em A2a, natural, foi de 0 (zero). Obtiveram-se também outras avermectinas sub£ títuidas por ciclopentilo.
EXEMPLO 2
Ciclopentilo-Avermectina A2
Utilizou-se um frasco congelado contendo S. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) para inocular 100 ml de meio AS-7, contido num frasco de 500 ml de capacidade .
crescimento seguia o decurso da incubação, a 28 - 30°C, sob agitação durante 24 horas. Usou-se uma parte alíquota de 1 ml para inocular dois fra£ cos adicionais de 500 ml de capacidade, contendo 100 ml do meio AS-7, e estes frascos, passadas 18 horas de incubação, foram utilizados para a inoculação de um meio AP-5 (sem NaCl) num volume de 10 litros.
A seguir a um período de incubação de 24 horas, a 28°C, juntaram-se 0,4 g/1 de ácido ciclopen tilcarboxílico ao meio nutritivo. Manteve-se uma agitação suficiente para manter o oxigénio dissolvido a um nível de 20% acima do ponto de saturação. Os títulos em ciclopentilo-A2 elevaram-se a 16, 40, 65, 88 e 110 mg/1, decorridas, respectivamente, 120, 168, 216, 264, e 312 horas. Em contrapartida, o título correspondente em avermectina A2a natural foi de 0 (isto é, impossível de detectar) nas referidas amostras.
EXEMPLO 3
Ciclopentilo-Avermectina A2
Neste ensaio, enriqueceu-se o meio nutritivo, realizando-se adições múltiplas de ácido cicl£ pentilcarboxílico a fim de aumentar os títulos em ciclopentilo-avermectina. As condições para a formação do mate rial inoculado e para a fermentação eram idênticas às des critas no exemplo 2, exceptuando-se os seguintes pormeno-750 meio AP-5 continha ainda mais 5 g/1 de Ardamine pH (perfazendo uma quantidade total de 10 g/1), juntando-se 0,4, 0,2 e 0,2 g/1 de ácido ciclopentilcarboxí lico nas horas 30, 172 e 220, respectivamente. Nas horas
120, 168, 216, 264 e 312, os títulos em ciclopentilo-aver-
mectinas A2 elevaram-se, respectivamente, a 1,2, 11, 78,
137 e 214 mg/1.
EXEMPLO 4
Ciclopentilo-Avermectinas
Utilizou-se um frasco congelado contendo S^. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) para a inoculação de 100 ml do meio AS-7, contido num balão com divisórias, de 500 ml de capacidade, que foi incubado durante 24 - 28 horas, a 28 - 30°C. Em seguida, 1 ml desta cultura foi uti_ lizado para inocular um frasco de 300 ml de capacidade, contendo 40 ml de um meio AP-5 (sem NaCl, mas contendo 0,6 g/1 de ácido glutâmico).
Após um período de incubação de 96 horas, a 28 - 30°C, sob agitação, juntaram-se 0,4 g/1 de ácido ciclopentilcarboxílico (sob a forma de sal de sódio). A cromatografia de HPLC de uma amostra retirada após 216 ho_ ras, apresentou as ciclopentilo-avermectinas B2, A2, B1 e Al com tempos de retenção de 12,32; 15,86; 25,28; e 32,96 minutos, respectivamente.
Ciclopentilo-Avermectina A2
Neste ensaio, estirpes de SL avermitilis 1-3 (ATCC 53567) e de S_. avermitilis HL-026 (ATCC 53568) foram cultivadas em condições idênticas. Utilizaram-se 3 meios nutritivos (AP-5, WPM Syn A, 40 : 40, e WPM Syn B, 40 : 40). Uma cultura congelada de cada organismo foi utilizada para inocular 100 ml de meio AS-7, contidos em balões munidos de divisórias, de 500 ml de capacidade, que, em seguida, foram incubados durante 24 - 26 horas, a 28 - 30°C.
Seguidamente, usou-se 1 ml de cada cultura para inocular frascos de 300 ml de capacidade, con tendo cada um dos frascos 40 ml de um dos três meios nutri, tivos. Para cada balão foram realizadas 2 operações-répl/ cas. Passadas 24 horas de incubação, a 28°C, sob agitação, juntou-se a cada balão 0,4 g/1 de ácido ciclopentilcarboxílico (sal de sódio) e, após um total de 192 horas de in cubação, determinaram-se os títulos do produto principal, ciclopentilo-avermectina A2. (tabela I).
TABELA I
Meio Nutriente | Linhagem de S. avermitilis | Ciclopentilo- Avermectina A2 mg/1 | |
AP-5 | ATCC 53567 | 29 | |
ATCC 53568 | 67 | ||
WPM Syn A 40 : | 40 | ATCC 53567 | 35 |
ATCC 53568 | 115 | ||
WPM Syn B 40 : | 40 | ATCC 53567 | 38 |
ATCC 53568 | 36 |
EXEMPLO 6
Ciclohexilo-Avermectinas
Neste ensaio, decorridas 96 horas, juntaram-se 0,2 g/1 de ácido ciclohexilcarboxílico em vez do ácido ciclopentil-carboxílico, mantendo-se as restantes condições idênticas às indicadas no exemplo 4. No cromato grama de HPLC identificaram-se 4 ciclohexilo-avermactinas, numa amostra retirada depois de 240 horas de incubação. Os tempos de retenção para as ciclohexilo-avermectinas B2, A2, BI, e Al elevaram-se a 14,84; 19,26; 31,46; e 41,14 mi. nutos, respectivamente.
EXEMPLO 7
3-Ciclohexenilo-Avermectinas
Neste ensaio, juntaram-se 0,2 g/1 de ácido 3-ciclohexenil-carboxílico, decorridas 96 horas, em lugar do ácido ciclopentil-carboxílico, mantendo-se as restantes condições experimentais idênticas às indicadas no exemplo 4. Identificaram-se várias avermectinas substituídas por ciclohexenilo no cromatograma de HPLC de uma amostra retirada da cultura após 312 horas.
Os respectivos tempos de retenção são de 12,88 (B2); 16,39 (A2); 27,37/28,36 (isómeros B1) e de 35,80/37,13 (isómeros Al) minutos.
EXEMPLO 8
3-Tienilo-Avermectinas
No decurso desta experiência adicio naram-se 0,05 g/1 de ácido tiofeno-3-carboxílico, passadas 96 horas, em vez do ácido ciclopentilcarboxílico, man tendo-se as restantes condições idênticas às descritas no exemplo 4. Identificaram-se 4 3-tienilo-avermectinas no cromatograma de HPLC de uma amostra retirada, decorridas 312 horas. Os tempos de retenção correspondentes às 3-tie nilo-avermectinas B2, B1 e Al elevaram-se a 6,96; 8,76; 13,8; e 23,5 minutos, respectivamente.
EXEMPLO 9
1-Metiltioetilo-Avermectinas
Neste ensaio, adicionaram-se 0,4 e 0,2 g/1 de ácido 2-metiltiopropiónico, decorridas 24 e 96 horas do ensaio, em lugar do ácido ciclopentilcarboxílico, mantendo-se as restantes condições idênticas às referidas no exemplo 4. Identificaram-se 2 l-metiltioetilo-avermecti_ nas no cromatograma de HPLC de uma amostra de 240 horas.
Os respectivos tempos de retenção correspondentes às 3-tienilo-avermectinas A2 e BI elevaram-se a 9,30 e 13,06 minutos .
Pensa-se que o pico, com um tempo de retenção calculado de cerca de 7,2 minutos, aparecendo na frente do patamar do pico observado após 7,55 minutos, representa o composto B2 e pensa-se que o composto Al se encontre abrangido pelo pico de 17,22 minutos.
EXEMPLO 10
2-Pentil-Avermectinas
No presente exemplo, adicionaram-se
0,2 g/1 de ácido 2-metil-valérico, decorridas 96 horas, em vez do ácido ciclopentilcarboxílico, mantendo-se as restan tes condições idênticas às referidas no exemplo 4. Ident£ ficaram-se 4 2-pentilo-avermectinas no cromatograma de HPLC de uma amostra de 312 horas.
Os tempos de retenção correspondentes às 2-pentilo-avermectinas B2, A2, B1 e Al ascenderam a 12,88, 15,68, 31,90 e 41,92 minutos correspondentes.
EXEMPLO 11 l-Metil-3-butenilo-Avermectinas
Neste exemplo, juntaram-se, passadas 96 horas, 0,2 g/1 de ácido 2-metil-4-pentenoico em vez do ácido ciclopentilcarboxilico, mantendo-se inalteradas todas as restantes condições descritas no Exemplo 4. Identificaram-se 4 avermectinas substituidas por l-metil-3-bu tenilo no cromatograma de HPLC de uma amostra de cultura retirada após 312 horas. Os respectivos tempos de retenção correspondentes às l-metil-3-butenil-avermectinas B2, A2, BI e Al eram de 11,13, 14,78, 22,10 e 28,92 minutos.
EXEMPLO 12
1-Metil-l-butenilo-Avermectinas
Neste ensaio, adicionaram-se 0,2 g/1 de ácido 2-metil-2-pentenoico, decorridas 96 horas, em vez do ácido ciclopentil-carboxilico, mantendo-se inalteradas todas as restantes condições referidas no Exemplo 4. Identificaram-se 4 1-metil-l-butenil-avermectinas no cromatograma de HPLC de uma amostra retirada após 312 horas de fermentação. Os tempos de retenção respectivos, correspondentes às 1-metil-l-butenilo-avermectinas B2, A2, B1 e Al eram de 11,59, 14,93, 25,29 e 33,18 minutos.
EXEMPLO 13
Neste exemplo, demonstra-se a utiliza^ ção da estirpe mutante para a preparação das avermectinas naturais derivadas de L-valina, na ausência das avermect^ nas derivadas de L-isoleucina. 0 conteúdo de um balão congelado, contendo a estirpe S.avermitilis 1-3 (ATCC 53567), foi introduzido num balão de 500 ml de capacidade munido de divisórias, contendo 100 ml de meio AS-7. Decorrido mais ou menos um dia, a 28-30° C, sob agitação (cerca de 200 r.p.m.), utiliza-se 1 ml da cultura para inocular 40 ml do meio WPM Syn A, 40 : 40, nylon num fras co de 300 ml de capacidade, que, em seguida, é incubado, a 28-30° C, durante a4 e mais 20 horas, sob agitação.
Nesta altura, juntam-se 4 ml de uma so lução filtrada e esterilizada de ácido isobutirico (neutralizado para um pH de 6-7 pela adição de NaOH), numa concentração de 4 mg/ml, e continua-se a incubação, nas condições referidas atrás, durante um periodo total de 8 dias. A análise mediante HPLC revelou 4 picos principais (com excepção de oligomicina). (Em ensaios semelhantes com ácido 2-metilbutirico, em substituição do ácido isobu tirico, observaram-se os 4 picos secundários de avermecti^ nas derivadas de L-isoleucina).
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I
EXEMPLO 14
Repetiu-se o processo do Exemplo 1,j
I no entanto, empregaram-se os seguintes compostos catalisan I tes (primers) em substituição do ácido ciclopentilcarbo-í xilico. Representam-se igualmente as avermectinas (compostos de fórmula I, em que R representa a parte do dis- sacárido oleandrose e R, R e R são tal como atrás defei nidos) que foram identificados após a conclusão de umaj dada fermentação.!
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Indicam-se seguidamente outras caracte risticas fisico-quimicas correspondentes e determinados compostos atrás enumerados.
Composto Constantes fisico-quimicas (A2) Pó branco; p.f. 135-140°C., peso molecular =925; m/e 596, 454, 321, 303, 275, 237, 219
209, 191, 179, 167, 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
(Al) Pó branco; p.f. 120-124°C.,peso molecular =907; m/e 578, 303, 275, 257, 219,191
167, 145, 127, 113, 111, 95 e87.
(B2) Pó branco; p.f.110-112°C.,peso molecular =911; m/e 321, 303, 261, 257, 247,219,
209, 191, 179, 167, 145, 127, 113,111 e 87.
(Bl) Pó branco;p.f. 135-138°C;.peso molecular =893; m/e, 303, 261, 257, 219, 191, 167 145, 127, 113, 111, 95 e 87.
(A2) Pó branco;p.f. 112-117°C.,peso molecular = 953; m/e 624, 482, 349, 349, 331,275,
265, | 247, | 237, | 219 , | 207, | 195 , | 179, 145 |
127, | 113, | ui, | 95 e | 87. | ||
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=951; | m/e | 624, | 480, | 347, | 329, | 275, 263, |
245, | 235, | 217, | 205, | 193, | 179, | 145, 127, |
113, | Hl, | 95 e | 87. |
-8712 (Α2)
Pó branco;p.f 167°C., peso molecular =953; m/e 349, 331, 275, 265, 257, 247, 237, 219, 195, 145, 127, 113, 95 e 87.
EXEMPLO 15
Recuperação de ciclopentilo-avermectina A2
O presente exemplo pretende demonstrar um processo para a recuperação das avermectinas semelhantes a A2-avermectinas formadas do composto precursor de ácido ciclopentilcarboxilico. Procedeu-se à filtração do caldo total (obtido de uma fementação similar à referida no exem pio 2) e extraiu-se a massa de células miceliais, duas ve zes, com acetona (3 volumes).
extracto de acetona foi concentrado até se formar um óleo aquoso, o óleo foi extraido com cloreto de metileno e a solução de cloreto de metileno foi concentrada até se formar um óleo castanho-escuro. Este óleo foi seguidamente dissolvido em metanol/água ( 4 : 1 ) e a solução resultante foi extraída com hexano para se removerem os ácidos gordos e lipidos presentes.
A evaporação da mistura de metanol/água deu origem a um óleo acastanhado contendo cerca de 10% de ciclopentilo avermectina A2 (peso/peso). Em seguida, óleo da avermectina em bruto foi diluido com clorofórmio (3 ml de CHClg por cada g de óleo), juntaram-se carvão vegetal activo (0,35 g/g de óleo) e silica-gel (1 g/g de óleo), e a mistura resultante foi agitada durante 1 hora e, em seguida, foi filtrada.
filtrado foi concentrado e o óleo obtido foi diluido com éter isopropilico (1 ml de éter isopropilico por g do óleo). Seguidamente, a solução obtida foi lentamente deitada num grande volume de hexano (25 ml de hexano/g de óleo), o que resultou na precipitação de um pó branco, de avermectinas, em bruto.
A primeira fracção foi isolado median te filtração e, em seguida, o filtrado foi arrefeido até cerca de 5°C para provocar a precipitação de uma segunda fracção do produto. As fracções em bruto foram precipita das mais exaustivamente por meio de HPLC preparativa obtendo-se um produto purificado.
As fracções em bruto foram dissolvidas (4,1 ml de solvente por grama do produto em bruto) em éter isopropilico/acetato de etilo/hexano/ácdo acético (25/25/ /252 /50/0,125). As amostras foram injectadas numa coluna preparativa de silica-gel (41,4 mm x 25 cm) e foram elui_ das com o dissolvente atrás indicado, a uma velocidade de 30 ml/minuto, recolhebdo-se o pico contendo o produto desejado .
as fracções colhidas foram concentradas e diluidas com MeOH/H2O (86/14) de forma tal que 1 ml contivesse cerca de 50 mg de produto final. Em seguida as amostras foram injectadas numa coluna preparativa C-18 (dimensões idênticas às da coluna de silica-gel) e eluidas a uma velocidade de 18-20 ml/minuto, com MEOH/H2O (275 ml de água para 2 litros de MeOH).
As fracções foram de novo concentradas aplicadas mais uma vez a coluna preparativa C-18. A evaporação das frações contendo o produto final, até à se cagem deu origem ao produto puro mencionadoem epigrafe.
Recuperam-se as correspondentes cicl£ pentilo-avermectinas B2, Al e BI pela recolha das fracções apropriadas obtidas durante as operações de HPLC atrás re feridas.
EXEMPLO 16
Utilizaram-se os micélios de S.avermitilis JC 923 (ATCC 53669) obtidos de um meio de ágaquilo e ágar-ágar YPD-2, para inocular 50 ml do meio AS-7, con tidos num balão munodo de tubuladuras, de 300 ml de capaci_ dade, mentendo-se uma agitação (a 220 r.p.m.) a 30° C, durante 24 horas. Em seguida, inoculou-se em cada um dos dois balões de 300 ml (sem divisórias), contendo 50 ml do meio AP-5, 1 ml da referida cultura.
UM balão continha ácido 2-metilbutiri^ co (a 0,1%) e o segundo balão continha ácido 2-metilbutirico.
Procedeu-se à fermentação, a 30° C, durante 11 dias, sobagitação. O conteúdo de cada balão foi tratado de maneira igual. Todo o caldo foi extraido com um volume (excesso quadruplo) de acetonitrilo: metanol (810 : 75). A seguir a uma agitação energica para facilitar a extracção do antibiótico das células flutuantes clarificado foi examinado quanto à presença de avermectinas (HPLC).
Sem adição de compostos percursores (ácidos gordos), não detectaram quaisquer avermectinas (tipo a) (sensibilidade de detecção 0,2 mg/1). Em pre_
sença do ácido 2-metilbutirico, detectaram-se avermectinas
B2a, A2a, Blae Ala nas respectivas concentrações de 0,5, 1,3, 1,4 e 1,1 mg/1.
EXEMPLO 17
Neste exemplo, procedeu-se à fermentação da estirpe de S.avermitilis Jc 923 (ATCC 53669), ob tida a partir do meio de cultura AP-5, com o auxilio de material inoculado precedente do meio AS-7, tal como se descreve no Exemplo 16.
O composto catalisante (ácido 2-metil butirico) estava presente numa concentração de 0,05 %. Neste caso, o material dafermentação de controlo, sem suplemento (sem adição do ácido gordo precursor) forneceu valores de 0,3, 0,9, 0,2 e 0,2 mg/1 de avermectinas B2a, A2a, Bla e Ala, respectivamente, ao passo que das fermentaçãoes com adição do ácido gordo percursor se obtiveram os valores de 2,8, 5,0, 4,5 e 2,3 mg/1, respectivamente.
EXEMPLO 18
Neste exemplo, procedeu-se à fermentação de S.avermitilis JC 923 (ATCC 53669), obtida a partir do meio AP-5, com o auxilio do material inoculado procedente do meio AS-7 (cf. o exemplo 17). Adicionou-se ago ra o ácido 2-metilbutirico a 0,05%, 48 horas a seguir à inoculação do meio AP-5, e as células foram colhidas mediante filtração, pesadas (peso húmido) e extraida com um
excesso ponderai quadruplo do solvente para extracção.
Esta operação com um determinado concentração do material possibilita uma maior sensibilidade (exactidão) na determinação dos titulos de avermectinas em relação aos casos anterores, em que se extraíram globalmente os caldos celulares.
No presente exmplo, determinaram-se concentrações de boas B2a, A2a, Bla e Ala de 2,5, 8,5,
4,5 e 3,5 mg/1 para o produto fermentado com suplemento de ácido 2-metildutirico, enquanto para as amostras-te£ temunhas sem suplemento se registaram niveis de 0,3, 0,3, 0,3 e 01, respectivamente. Provávelmente, estes baixos niveis de avermectinas são devidos às baixas concentrações de ácidos gordos endogenos presentes no meio de cultura AP-5 em bruto.
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EXEMPLO 19
As fermentações realizaram-se da maneira descrita no Exemplo 18, com a excepção de que se utilizou o ácido ciclopentil-carboxilico a uma concentração de 0,045% em vez de simples suplemento de ácido 2-metilbutirico. Registou-se uma concentração de 4 mg/1 da ciclopentil-avermectina A2.
EXEMPLO 20
A fermentação de S.avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) (16 fermentaçõees) efectuaram-se, em balões de 300 ml de capacidade (sem divisórias), contendo 50 ml do meio AP-5, a incubação foi efectuada a 30° C. 0 meio foi inoculado com 1 ml de uma cultura de 24 horas da referida estirpe no meio AS-7, incubado a 30° C, em balões de 300 ml (com divisórias) com 50 ml do meio corresponden te.
Após um periodo de multiplicação de horas no meio AP-5 juntou-se ácido isobutirico, numa concentração de 0,1%, a 8 dos referidos balões. Lançando mão do processo de tratamento adoptado no Exemplo 16, estes balões suplementados renderam concentrações de 5,6 45, 45 e 68 mg/1 (valores médios de 2 ensaios) correspondentes, e respectivamente, às avermectinas B2b, A2b, Blb e Alb. As culturas sem suplemento registaram valores de 0,5, 4,0, 4,5 e 8,5 mg/1, respectivamente. Além disso em relação à última fermentação, registaram-se valores de 1,1, 1,1, ---- (valor não determinado), e 0,2 mg/1 correspondentes às avermectinas B2a, Bla e Ala.
EXEMPLO 21
Neste ensaio, realizaram-se 4 fermen tações (meio utilizado AP-5) de S.avermitilis PGS-119 (ATCC 53670) em culturas de 2 ml, introduzidas em tubos de ensaio de material deplástico (15 ml de capacidade). Os materiais para inoculação foram preparados tal como se refere no Exemplo 20, no meio AS-7, a 30° C e sob agitação dos tubos de ensaio mantidos numa posição inclinada de 30°.
horas após a inoculação de AP-5, o percursor de ácido gordo, o ácido ciclohexilcarboxilico (CHC), numa concentração de 0,045% foi adicionado a dois dos tubos de ensaio 400 horas a seguir à inoculação de AP-5 com 0,05 ml de cultura AS-7, 8 ml do dissolvente da extracção (acetonitrilo : metanol, 810 : 75) foram adicionados a cada balão e os titulos de avermectinas foram determinados nos materi_ ais flutuantes mediante análise porHPLC tal como se descreve no texto. Em relação às avermectinas (CHC-B2, CHC-A2 CHC-B1, CHC-A1, A2b, Blb, Alb, A2b e Ala), as concentrações registadas correspondiam a (valores médios de 2 tubos de ensaio) 3,5, 6,2, 3,0, 1,4, 0,2, 0,2, 0,4, 02, e 0,2 mg/1, respectivamente. Os correspondentes valores para dois tubos de fermentação, aos quais não foram adicionados quaisquer compostos ácidos precursores, elevaram-se a 0,2 igual ou menor a 0,2, igual ou menor a 0,2, igual ou menor a 0,2, 4,2, 2,9,9,3, 1,2, 0,3 mg/1, respectivamente. Todas as restantes avermectinas naturais escaparam, práticamente à capacidade de detecção do método adoptado.
Claims (4)
- REIVINDICAÇÕES11. - Streptomyces avermitilis, caracterizada por estar desprovida de uma qualquer das seguintes actividades:
- 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase, aminoácido de cadeia ramificada-transaminase.21. - Streptomycse avermitilis desprovida de actividade enzimática de 2-oxo-ácido de cadeia lateral-desidrogenase caracterizada por as suas células14 permeabilizadas serem incapazes de produzir C0„ a par- , 14 z tir do acido / C-l 7-2-oxo-isocaproico adicionado.31. - Streptomyces avermitilis, carac terizada por apresentar as caracteristicas de identificação de ATCC 53567 ou ATCC 53568.41. - Streptomyces avermitilis, carac terizada por ser ATCC 53567 ou ATCC 53568.51. - Streptomyces avermitilis, desprovida da actividade de aminoácido de cadeia lateral-transaminase caracterizada por ser incapaz de crescer em meios nutritivos isentos de L-iso-leucina, L-leucina e L-valina.6â. - Streptomyces avermitilis, caracterizada por apresentar as caracteristicas de identificação de ATCC 53669 ou ATCC 53670.7-· ~ Streptomyces avermitilis, caracterizada por ser ATCC 53669 ou ATCC 53670.8â. - Streptomyces avermitilis, caracterizada por ser essencialmente incapaz de produzir C-076 quando submetida à fermentação num meio nutritivo, constituído por uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânicos, sob condições aeróbias, em que o referido meio nutritivo está essencialmente isento de um áci do de fórmulaR-COOH ou de um composto convertivel no referido ácido, por avermitilis EM QUE R representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo, mas ser capaz de produzir C-076 quando submetida à fermentação no referido meio nutritivo, desde que este meio contenha um ácido de fórmula RCOOH, ou um composto convertivel no referido ácido por S.avermitilis, e em que R representa isopropilo ou (S)-sec.-butilo.9§. - Strepmyces avermitilis, de acor do com a reivindicação 8, caracterizado por apresentar as caracteristicas de identificação de ATCC 53567, ATCC 53568 ATCC 53669 ou ATCC 53670.10^. - Streptomyces avermitilis, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referi, da S.avermitilis ser S.avermitilis ATCC 53567, ATCC 53568ATCC 53669 ou ATCC 53670.115. - Processo para a produção de uma avermectina, caracterizado por se proceder à fermentação sob condições aeróbias, de uma estirpe de Streptomyces avermitilis, desprovida de uma ou ambas as actividades 2-oxo-ácido de cadeia ramificada-desidrogenase e aminoácido de cadeia ramificada-transaminase, num meio nutritivo aquoso, constituído por uma fonte assimilável de azoto, a carbono e sais inorgânicos, e um composto susceptivel de ser empregado na biossintese de uma avermectina.125. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o composto susceptivel de ser empregado na biossintese de uma avermectina ser um ácido de fórmulaR-COOH ou um composto convertivel no referido ácido por S. avermitilis em que R é diferente de isopropilo ou (S)-sec.-butilo.IIII131. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a S.avermitilis ter as caracteristicas de identificação de ATCC 53567, ATCC53568, ATCC 53669 ou ATCC 53670.141. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o composto apresentar a fórmulaR-COOH em que R representa um grupo de cadeia ramificada na posição alfa, cujo o átomo de carbono aoqual se encontra ligado o grupo -COOH, está também ligado pelo menos dois outros átomos de ou grupos, diferentes de hidrogénio; ou ser um composto convertivel no referido composto durante o processo de fermentação.151. - Proceso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por R representar um grupo ramificado na posição alfa, Cg-Cg-alquilo, C^-Cg-alcenilo Cg-Cg-alcinilo, Cg-Cg-alcoxi-alquilo ou Cg-Cg-alquiltioalquilo; um grupo Cg-Cg-cicloalquil-alquilo, em que o grupo alquilo representa um grupo C2-Cg-alquilo, ramif icíà do na posição alfa um grupo Cg-Cg-cicloalquilo ou C5-Cg-cicloalcenilo, cada um dos quais pode estar facultativamen te substituído por metileno ou por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio; ou um anel heterociclico de 3 a 6 membros, contendo oxigénio ou enxofre que pode ser saturado, ou total ou parcialmente insaturado e que pode estar facultativamente substituido por um ou mais grupos C^-C^-alquilo ou átomos de halogénio; ou um composto convertivel no referido composto durante o processo de fermentação.16a. _ Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o composto convertivel no substracto R-COOH serR-(CH„) -Z z n em que R é como préviamente definido; n é igual a 0, 2, 4 ou 6; e Z representa -CH2OH, -CHO, -COOR5, -CH2NH2 ou -CONHrG, onde significa H ou (C^ g)-alquilo; R6 representa hidrogénio (C1_4)-alquilo, -CH(COOH)CH2COOH, -CH(COOH)(CH2)2-COOH ou -CH(COOH)(CH2)2SCH3 ou, se a estirpe de S.avermitilis só for desprovida de acrtividade de aminoácido de cadeia ramificada-transaminase o composto convertivel no substracto R-COOH ser R-CO-Z.17â. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por R representar ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo , 2-metilcicloproplo, 3-ciclo-hexenilo, 1-ciclopentenilo, 1-ciclo-hexenilo, 3-metilciclo-hecilo (cis/trans) 4-metilenociclo-hexilo, 3-metilciclobutilo, 3-metilenociclobutilo,
- 3-ciclopentenilo, 1-ciclopropiletilo, 3-fluorociclobutilo, 4,4-difluorociclo-hexilo, isopropilo, sec.-butilo, 2-pentilo, 2,3-dimetilpropilo, 2-hexilo, 2-penten-4-ilo,2-metiltioetilo, £-2-metilpentilo, R-2-metilpentilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 4-tetra-hidropiranilo, 3-furilo, 2-clorotienilo, 3-tetra-hidrotienilo, 4-metiltio-2-butilo,
- 4-tetra-hidrotiopiranilo, 4-metoxi-2-butilo ou 4-metiltio-2-butilo.18B. - Processo de acordo com a reivin dicação 17, caracterizado por R representar ciclopentilo ciclo-hexilo ou tienilo.19a. _ Processo de acordo com a reivin dicação 15, caracterizado por na hipótese de R representar um grupo Cg-Cg-alquilo ramificado na posição alfa, este grupo não representar isopropilo ou (S)-sec.-butilo.20§. - Processo de acordo com a reivin dicação 15, caracterizado por a estirpe de S.avermitilis ser S.avermitilis ATCC 53567, a ATCC 53568, ATCC 53669 ou ATCC 53670.21a. _ Estirpe pertencente ao genero de Streptomyces, carcaetrizada por ser essencialmente incapaz de produzir C-076 quando submetida a fermentação nitro e num meio nutritivo aquoso constituido por uma fonte assimilável de carbono, azoto e sais inorgânçicos, sob condições aeróbias, mas em que o referido meio nutritivo é substancialmente isento de um ácido de fórmulaR-COOH-100ou de um composto convertivel no referido ácido por S.aver mitilis, em que R representa isopropilo ou (Sj-sec.-butilo, mas ser capaz de produzir C-076 quando submetida a fermentação no referido meio nutritivo, desde que o meio contenha um ácido de fórmula R-COOH ou um composto conver tivel no referido ácido por S.avermitilis, em que R repr£ senta isopropilo ou (>S )-sec.-butilo, em que a referida e£ tirpe é obtida por um processo que compreende a mutação de Streptomyces avermitilis ATCC 31271, ATCC 31272 ou dos seus mutantes.
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