CN1681830A - 具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导海洋大型绿藻形态形成和促进海洋大型绿藻生长的新化学物质，涉及一种使用微生物制备该新化学物质的方法，以及包括该新化学物质的、用于培养绿藻的培养基。

Description

具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质
技术领域
本发明涉及由微生物、其衍生物制得的新的类似维生素的活性物质，并涉及其制备方法及其应用。
背景技术
迄今为止已知，使用传统合成培养基在室内培养大型绿藻，如石莼科(Ulvaceae)和礁膜科(Monostromataceae)绿藻的过程中，随着纯化程度的提高，藻类可降解为纤维性或单细胞状态(L.Provasoli，Ulva.Biol.Bull.，1958，114，375；M.Tatewaki，L.Provasoli和I.J.Pintner，J.Phycol.，1983，19，409)。还已知，向已失去形态的藻类中加入新鲜海水、土壤提取物、红藻提取物、褐藻提取物或一些种类的海洋微生物培养液可使其恢复叶状体或促进生长(M.Tatewaki，L.Provasoli和I.J.Pintner，J.Phycol.，1983，19，409)。但是，还未发现这些提取物的活性成分及其类似维生素的活性物质。因此，使用室内无菌培养的大型绿藻，例如石莼科和礁膜科绿藻一直很难进行长期的生理和生态学研究、培养或保存。
发明内容
如果仅使用由已知成分组成的培养基就可长期无菌培养海洋大型绿藻，则此项技术可作为实际的培养技术应用于，例如，制备、维持和处理被培养物种(如食用礁膜科)的种子和幼苗，或用于保存绿藻的种子，此外还可对目标藻类进行生理和生态学研究。基于这种观点，本发明者发现了诱导海洋大型绿藻重建形态和促进生长的微生物(JP-A-2003-189845)。但是，由这种微生物制得的活性成分和类似维生素的活性物质还属未知。
本发明的目的是提供上述的类似维生素的新活性物质及其衍生物。
如上所述，本发明者找到了新的活性成分。结果，本发明者从YM-2-23株的培养液中分离出了活性极强的活性物质(最初收录在高级工业科学和技术国家研究所(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本))的International Patent Organism Depositary上，日期为2001年8月20日，登记号：FERM BP-8417(于2003年6月25日接受按照布达佩斯条约将其由最初收录处转移收录的请求))，Tenacibaculum属YM-1-69株(最初收录在National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的International Patent OrganismDepositary上，日期为2001年8月20日，登记号：FERM BP-8418(于2003年6月25日接受按照布达佩斯条约将其由最初收录处转移收录的请求))，和与上述菌株类似的菌株，并发现这些化合物为新物质。这样就完成了本发明。至今为止，已报道类胡萝卜素类似物，如番茄红素和玉米黄质是由YM-2-23株和/或黄杆菌属、Zobellia属或与YM-1-69株类似的Tenacibaculum属制得的物质。但是，此前并没有成功的实施例，可分离此种可促进大型藻类生长或控制其形态的化合物。因此，这是世界上对其进行的第一次报导。
也就是，本发明包括下列发明。
1.一种新化学物质1，其具有下列物理化学性质：
(i)物质颜色：无色
(ii)分子量：457
(iii)分子式：C24H31N3O4S
质谱分析：FABMS：m/z 456[M-H]-(图1)
高分辨质谱：实测值：456.1960[M-H]-
            计算值：456.193(C24H30N3O4S)
(iv)核磁共振信号：
1)1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，750MHz)：(图2)
δppm  0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0.882(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m)，1.167(1H，m)，1.326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，1.58(1H，m)，1.61(2H，m)，1.52(1H，br d，J＝13Hz)，1.76(1H，br d，J＝14Hz)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd，J＝4，14Hz)，2.291(1H，dd，J＝14，16.5Hz)，7.698(1H，d，J＝7.5Hz)，7.845(1H，d，J＝7.5Hz)
2)13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，125MHz)：(图3)
δppm 15.236(q)，19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25.987(t)，33.381(s)，33.636(q)，37.308(s)，39.590(t)，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d)，56.381(d)，79.096(s)，114.965(s)，124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s)，152.656(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)。
2.一种新化学物质2，其具有下列物理化学性质：
(i)物质颜色：无色
(ii)核磁共振信号：
1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH 9)，500MHz)：(图4)
δppm 0.815(3H，s)，0.834(3H，s)，0.877(3H，s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m)，1.163(1H，m)，1.297(3H，s)，1.35-1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H，br d，J＝14Hz)，2.012(1H，m)，2.1 58(1H，m)，2.299(1H，m)，7.646(1H，d，J＝8.0Hz)，7.769(1H，d，J＝8.0Hz)
3.一种制备新化学物质1或2的方法，其中在培养基中培养可制备根据第1项的新化学物质1的微生物，或在培养基中培养可制备根据第2项的新化学物质2的微生物，新化学物质1或2在培养中产生并累积，并回收产生和累积的新化学物质1或2。
4.根据第3项的制备方法，其中微生物为YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum属YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其类似的菌株。
5.海藻培养基，其包括作为活性成分的根据第1项的新化学物质1，或作为活性成分的根据第2项的新化学物质2。
6.一种新化学物质1的单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物，其通过用三甲基甲硅烷基重氮甲烷处理根据第1项的新化学物质1而获得。
7.一种化合物或其衍生物，其通过用硼氢化钠处理根据第6项的三甲基化衍生物而获得。
下面对本发明进行详细描述。
可使用微生物制备根据本发明的新化学物质1或2。用于制备根据本发明的新化学物质的微生物并不受特别限制，只要其能够制备这种化学物质即可。其例子包括，属于噬纤维菌属-黄杆菌属-类杆菌(cytophaga-Flavoba-Cterium-Bacteriodes)复合体的菌株，例如黄杆菌属、Zobellia，或Tenacubaculum及其变体。其具体例子为YM-2-23株(FERM BP-8417)，Tenacibaculum属YM-1-69株(FERM BP-8418)，及其变体。除了YM-1-69或YM-2-23株，还可使用其类似的菌株。“YM-1-69的类似菌株”的例子包括这样的菌株：具有形成叶状体或促进海洋大型绿藻生长的活性，且在16S rRNA基因中具有V3区，而代表该16S rRNA基因的核苷酸序列中85％或更大部分，且优选95％或更大部分同源于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3区，而代表该gyrB基因的核苷酸序列中72％或更大部分，且优选95％或更大部分同源于SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列。“YM-2-23的类似菌株”的例子包括这样的菌株：其显示有形成叶状体或促进海洋大型绿藻生长的活性，且在16S rRNA基因中具有V3区，而代表该16S rRNA基因的核苷酸序列中85％或更大部分，且优选95％或更大部分同源于SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列，或在gyrB基因中具有V3区，而代表该gyrB基因的核苷酸序列中72％或更大部分，优选80％或更大部分，更优选95％或更大部分同源于SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列。
“YM-1-69的类似菌株”和“YM-2-23的类似菌株”的例子包括YM2-10(MBIC 04671)、YM2-11(MBIC 04672)、YM2-12(MBIC04673)、YM2-13(MBIC 04674)、YM1-66(MBIC 04663)、YM2-24(MBIC 04684)、YM1-51(MBIC 04662)、Zobellia uliginosa(ATCC14397)、YM1-11(MBIC 04693)、T-588(MBIC 05930)、YM2-22(MBIC04682)、YM2-27(MBIC 04687)、YM2-6(MBIC 04669)、YM1-68(MBIC 04664)、YM1-38(MBIC 04661)、YM2-4(MBIC 04667)、YM2-5(MBIC 04668)、YM2-7(MBIC 04670)、YM2-21(MBIC04681)、YM2-1(MBIC 04666)、T-565(MBIC 05877)、T-424(MBIC05876)、噬细胞菌属UP7(MBIC 01484)、T-551(MBIC 05929)、Pedobacter heparinus(IFO 12017)、T-561(MBIC 05879)、海水环状杆菌(Cyclobacterium marinum)(LMG 13164)、噬细胞菌属(MBIC01539)、噬细胞菌属(MBIC 01599)，和Chitinophaga pinensis(DSM2588)。
对于上述菌株，标记为“ MBIC”的菌株可获得自MarineBiotechnology Institute Culture Collection(MBIC)(3-75-1 Heita，釜石，Iwate，日本)(http：//seasquirt.mbio.co.jp/mbic/index.php？page＝top)。标记为“IFO”的菌株可获得自Institute for Fermentation，大阪(IFO)(17-85，Juso-Honmachi 2-chome Ydogawa-ku，大阪，日本)。标记为“ATCC”的菌株可获得自American Type Culture Collection(ATCC)(12301Parklawn Drive，Rockville，马里兰，20852，美国)。标记为“DSM”的菌株可获得自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)(Mascheroder Weg 1b，38124Braunschweig，德国)。标记为“LMG”的菌株可获得自BCCMTM/LMGBateria Collection(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms，Laboratorium voor Microbiologie，Universiteit Gent(RUG)，K.L.Ledegancksfaat 35，B-9000 Gent，布鲁塞尔，比利时)。
上述的类似菌株中，特别优选的是其16S rRNA基因和/或gyrB基因中，V3区的核苷酸序列与YM-1-69或YM-2-23株的相应核苷酸序列相同的菌株。
通常将培养海洋细菌的一般培养技术应用于培养上述微生物。可以使用合成或天然的培养基，只要其包括足够量的微生物可吸收的碳源、氮源、无机物质等物质即可。
碳源的例子包括葡萄糖、淀粉、糊精、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醇和糖浆。其可单独或结合使用。此外，取决于菌株的吸收能力，还可使用糖类、醇类、有机酸等。
氮源的例子包括氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠、尿素、胨、肉汁、酵母抽提物、干酵母、玉米浆、大豆粉和酪蛋白氨基酸。其可单独或结合使用。
此外，还可根据需要加入无机盐，例如氯化钠、氯化钾、硫酸镁、碳酸钙、磷酸二氢钾、八水合磷酸镁、硫酸亚铁、氯化钙、硫酸锰、硫酸锌或硫酸铜。
可加入足量的促进所用菌株生长或促进本发明化学物质的制备的微量元素(如，糖类、氨基酸或无机盐)。
液体培养是最有效的技术，适宜的培养温度约30℃，培养基的pH水平通常为7-9，且优选7.5-8。使用氢氧化钠、盐酸水溶液等调节培养基的pH水平。
当液体培养进行1-4天时，新化学物质1或2在培养液和菌株中产生并累积。当培养产物中产生的新化学物质的量达到最大水平时优选终止培养。最优选在培养开始3天后终止培养。
根据从培养产物中分离和纯化微生物代谢产物的一般技术，从培养产物中分离和纯化新化学物质1或2。其一个实施例中，对培养产物进行过滤或离心以从菌株中分离出培养物滤液，并借助于，例如甲醇水溶液或乙腈水溶液提取菌株。之后，使用旋转蒸发器或其它方式从提取物中减压除去有机溶剂，将此提取物和培养物滤液结合起来，使所得物质在聚苯乙烯等吸收剂(如，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物)上进行吸附。漂洗被吸附的活性物质使其脱盐，并借助于，例如甲醇水溶液或乙腈水溶液对该活性物质进行洗脱。采用冻干法等方法减压浓缩洗脱液，使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法或高效液相色谱法，通过色谱法获得新化学物质1或2。新化学物质2为非常不稳定的化合物。将新化学物质2放置在强碱性水溶液，例如氢氧化钠水溶液和氨水溶液中时，其逐渐转变为新化学物质1。新化学物质1为非常稳定的化合物。
用足够的甲基化试剂(如，三甲基甲硅烷基重氮甲烷)处理新化学物质1可获得新化学物质1的单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物。可调节三甲基甲硅烷基重氮甲烷与新化学物质1的摩尔比，或者可选择适当的反应条件(如，反应温度或pH水平的设定，或在二甲基氨基硫三氟化物(DAST)存在下反应)，从而选择性地获得单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物。
此外，具有下述物理化学性质的Me1H3可通过用硼氢化钠处理上述三甲基化衍生物而获得。而且，改变反应溶剂的极性和反应温度可获得化合物Me1H1，其为Me1H3进一步还原所得的衍生物。甲基化衍生物Me1H1Me或类似的烷基化衍生物可在强碱条件下，由RI(其中R代表C1-6烷基)所代表的烷基碘(如，碘代甲烷)与Me1H1进行作用获得。有关此反应及其产物的信息在，例如，鉴定新化学物质1或2时特别有用。
根据本发明的新化学物质1和2可用作海藻培养基的活性成分。其可单独或结合使用。
上述培养海藻的培养基优选用于培养海洋大型绿藻。海洋大型绿藻的一种形式为属于石莼亚目的海洋藻类，其例子包括绿藻，例如，礁膜科和石莼科。属于礁膜科的海藻的具体例子包括礁膜(monostromanitidum)、尖种礁膜(Monostroma oxyspermum)和袋礁膜(Monostromaangicavo)。属于石莼科的海藻的具体例子包括扁浒苔、肠浒苔、缘管浒苔、蛎莱和孔石莼。
培养海洋大型绿藻的培养基可与常用培养技术中所用的、使海洋大型绿藻不利地成为单细胞的培养基相同，只是该培养基中要包括新化学物质1和/或2作为活性成分。例如，可使用ASP7培养基、PES培养基、PESI培养基，或使用只进行了杀菌的海水。新化学物质1和/或2在培养基中的有效浓度并不受特别限制，只要可诱导叶状体形成即可。优选10-12-10-13μg/ml。
培养温度不受特别限制，只要海洋大型绿藻能在其中存活即可。温度适当为约15℃-25℃。
附图简述
图1为新化学物质1的质谱图。
图2为新化学物质1的1H-NMR谱图。
图3为新化学物质1的13C-NMR谱图。
图4为新化学物质2的1H-NMR谱图。
图5为实施例1的试验中未加入试样时，培养开始5天后，培养的尖种礁膜细胞的照片。
图6为实施例1的试验中已加入试样时，培养开始5天后，培养的尖种礁膜细胞的照片。
图7为Me1的1H-NMR谱图。
图8为Me1的13C-NMR谱图。
图9为Me1B的1H-NMR谱图。
图10为Me1H3的1H-NMR谱图。
图11为Me1H1的1H-NMR谱图。
图12为Me1H1Me的1H-NMR谱图。
图13为实施例5中，培养开始10天后，7-步稀释的照片。
图14为实施例5中，培养开始10天后，6-步稀释的照片。
图15显示了实施例7中，使用孔石莼进行试验所得的结果。
图16显示了实施例7中，使用肠浒苔进行试验所得的结果。
图17为YM-1-69株、YM-2-23株及其类似菌株的gyrB DNA系统树。
图18为YM-1-69株、YM-2-23株及其类似菌株的16S rDNA系统树，以及这些菌株诱导大型绿藻形成形态的具体活性。
图19为新化学物质1的部分结构。
图20为新化学物质1的HMBC光谱分析结果。
图21为Me1的部分结构和相对构型。
图22为Me1的HMBC光谱分析结果。
图23为Me1H3的光谱分析结果。
图24为Me1H3的HMBC光谱分析结果。
图25为Me1H1的光谱分析结果。
图26为Me1H1的HMBC光谱分析结果。
图27为Me1H1Me的光谱分析结果。
图28为Me1H1Me的HMBC光谱分析结果。
本说明书包括日本专利申请号2002-203608的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，该专利申请为本申请的优先权文件。
本发明的最佳实施方式
下面将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述，但本发明的技术范围并不限定于这些实施例中。
【参考实施例1】微生物的分离
按照下述方式分离本发明中使用的菌株。将无菌海水(10ml)加入到约1g收集的新鲜海藻中，并将所得物质剧烈旋转约1分钟。使用无菌海水将上层清液进一步稀释10倍和100倍，将100μL该物质分注到1/10的海琼脂板上，并使用无菌Conradi棒将其分布于整个板上。该板在室温下放置2-3天，将生长的、显示出黄-红色的菌落单独接种在单独的海琼脂板上，并不断进行接种直至获得单一的菌落。将ASP7培养基(1或2ml)分注在24-孔或48-孔微板上，并向每个孔中加入约20个单细胞尖种礁膜细胞。使用无菌接种环或类似物，每次直接将各个分离菌株的菌落接种在2个孔中。该板在19-22℃下培养5天，每天由14小时的光照和10小时的黑暗组成，在倒置显微镜下观察到尖种礁膜叶状体的形成。并按照上述方法对形成叶状体的菌株进行另外的测试，以确定叶状体的形成。经上述筛选步骤，结果YM-1-69和YM-2-23作为显示出形成叶状体活性的物质被分离出来。YM-1-69株分离自仙掌藻(纲：绿藻纲，目：松藻目)，YM-2-23株分离自礁膜(纲：绿藻纲，目：石莼亚目)。
【参考实施例2】微生物的鉴定
确定参考实施例1所得的微生物中，16S rRNA基因和gyrB基因的V3区的DNA核苷酸序列。YM-1-69株的16S rRNA基因和gyrB基因中，V3区的DNA核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3所示。YM-2-23株的16S rRNA基因和gyrB基因中V3区的DNA核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。根据所得序列对数据库(DDBJ-fasta)进行检索。结果，发现这些序列与表1所示微生物的序列高度类似。
                                  表1
  序列   同源性(％)     具有相似序列的有机体   登记号
  1     95.26     Tenacibaculum amylolyticum   AB032505
  2     94.18     Zobellia uliginosa   M62799
  3     84.91     Tenacibaculum amylolyticum   AB032586
  4     78.18     Zobellia uliginosa   AB034224
对YM-1-69和YM-2-23株的物理化学性质进行了考察，考察结果如表2所示。
                             表2
物理化学性质     YM-1-69     YM-2-23
革兰氏反应过氧化氢酶活性氧化酶活性OF试验镁或钙的要求硝酸盐的还原吲哚的生成明胶水解淀粉水解DNA水解Tween 80水解七叶甙水解精氨酸双水解酶活性尿素酶活性β-半乳糖苷酶活性柠檬酸的使用Simmons’培养基Christensen’s培养基     -++O++--++++-----     -++F++--++++--+--
+：阳性，-：阴性
根据表1和2所示的结果，YM-1-69株鉴定为Tenacibaculum属，YM-2-23株鉴定为噬纤维菌属-黄杆菌属-拟杆菌复合体。
【实施例1】培养尖种礁膜的试验
经抗菌素等物质杀菌处理的尖种礁膜失去了叶状体形状，就如在合成培养基，如ASP7培养基中自然观察到的形状，而且其基本上变为单细胞状。
将改性ASP7培养基(1ml)加至第一排中，再将其0.9ml加至第二排及随后的48-孔微板中，进行悬浮培养(Iwaki，下文缩写为“48-MTP”)，将11μl的各个目标活性物质部分加至第一排中，并取100μl所得物质加至下一排中，同时用移液管进行充分搅拌。每一部分重复进行此步骤8-18次。这样就可制得8-18系列的10-倍稀释液。弃去最后一排的剩余物(100μl)。尖种礁膜的培养液稀释至最终浓度时，每ml该溶液中包括10-20个细胞，将该培养液加至48-MTP的每个孔中，每孔加入量为100μl，总量达到1ml。在22℃只有光照的条件下培养该48-MTP 3-5天，并在倒置显微镜下评价叶状体的形成。已形成叶状体的这些试样中，最低试样浓度确定为最小有效浓度(MEC)，认为试样中的活性物质被浓缩到了最低MEC，并将其用作分离的指示器。
图5显示未加入试样时，培养开始5天后培养的尖种礁膜细胞的照片。图6显示加入试样时，培养开始5天后培养的尖种礁膜细胞的照片。如图6所示，当活性物质存在时，观察到了叶状体的形成。
ASP7培养基的组成如下所示。
                表3
改性ASP7培养基(1升，pH：7.8-8.0)
 蒸馏水             950mlNaCl               25gMgSO4·7H2O     9gKCl                700mgCaCl2             840mgTris·HCl          1gNaNO3             50mgNa2-丙三基PO4    20mgNa2SiO3·9H2O  70mg维生素B12          1μg次氮基三乙酸       70mg维生素混合物S3*1  10mlP II金属*2        30mlS2金属*3          5ml
       表4
*1维生素混合物S3
蒸馏水          100ml盐酸硫胺        5mg烟酸            1mg泛酸钙          1mg对氨基苯甲酸    0.1mg生物素          0.01mg肌醇            50mg胸腺嘧啶        30mg叶酸            0.02mg
  表5
*2 PII金属
 蒸馏水            1,000mlNa2-EDTA         1gFeCl3·6H2O     48mgH3BO3           1.13gMnCl2·4H2O     144mgZnCl2            5.2mgCoCl2·6H2O     4mg
   表6
*3 S2金属
 蒸馏水             500mlNa2MoO4·2H2O  63mgNaBr               640mgSrCl2·6H2O     304mgRbCl               14mgLiCl               61mgKI                 0.65mgV2O5            0.18mg
【实施例2】新化学物质1的分离和纯化
使用YM-2-23株(FERM BP-8417)作为种菌。使用海水肉汁(37.4g/l，Difco或按照预定成分将试剂混合起来制得)作为总培养的培养基。30℃下，使用50ml海水肉汁，在100ml锥形烧瓶中振荡-培养(100rpm)该种菌24小时，全部培养产物再接种至含有450ml培养基的1升带挡板锥形烧瓶中，并在相同条件下培养24小时。对于该总培养，于130rpm下在分别含有800ml培养基的16个1升带挡板锥形烧瓶中进行振荡培养，于100rpm下在分别含有450ml培养基的10个1升锥形烧瓶中进行另一组振荡培养。这种培养过程在30℃下进行3天。如此得到的约18升培养液进行离心作用。菌株在提取前保存于-20℃下，而培养物滤出液保存于4℃下。由上述4个分别的总培养过程获得的菌株(约72升)经1,200ml 50％乙腈水溶液提取两次再进行浓缩。浓缩物与约72升的培养物滤出液结合，并使所得物质吸附在2,500ml苯乙烯-二乙烯基苯共聚物甲醛系树脂HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation)上，该树脂用6,000ml 10％乙腈水溶液洗涤脱盐，并用6,000ml 50％乙腈水溶液洗脱，以获得可诱导叶状体形成的部分。使活性部分吸附在Toyopearl DEAE-650(M)(Tosoh)上，用180mM NaCl-20％乙腈洗涤，并用450mM NaCl-20％乙腈水溶液洗脱。洗脱下来的部分经减压浓缩除去乙腈，再使其吸附在500ml甲醛系树脂HP-20(Mitsubishi Chemical Corporation)上，并用1,000ml 10％乙腈水溶液洗涤脱盐。这样，借助于1,000ml 50％乙腈水溶液得到了活性部分。减压浓缩后进行冷冻干燥，以获得诱导叶状体形成的部分。上述培养和分级分离过程重复两次(约140升细菌培养物)并结合起来。所得物质用凝胶过滤色谱(Sephacryl S-100HR，25mm(内径)×1,200mm(长度)，Amersham Bioscience)纯化，该色谱使用100mM NaCl-20mM Na2HPO4-20％乙腈(pH 9)水溶液作为流动相，得到了对促进叶状体形成显示出活性的部分。对所得活性部分进行浓缩、脱盐、冻干、用高效液相色谱(3-ml RESOURCEPRC柱，2根6.4mm(内径)×100mm(长度)的柱子彼此串联，Amersham Bioscience)分离，该色谱柱使用14％-22％乙腈-5g(NH4)2CO3/升的水溶液作为流动相、冻干，然后再用高效液相色谱(3-mlRESOURCE PRC柱，2根6.4mm(内径)×100mm(长度)的柱子彼此串联，Amersham Bioscience)分离，该色谱柱使用5％-25％乙腈/1％NH3水溶液作为流动相纯化。这样，得到了约140μg根据本发明的、具有上述物理化学性质的新化学物质1。
【实施例3】新化学物质2的分离和纯化
已发现，根据实施例2中描述的步骤分离出的新化学物质1是新化学物质2在强碱条件下(由于在最后纯化时使用了5％-25％乙腈-1％NH3水溶液)的修饰衍生物。新化学物质1在纯化前与新化学物质2一起存在于培养物上层清液中。虽然新化学物质2在中性至弱碱性条件下非常不稳定，但碱性条件下形成的新化学物质1相对稳定。如果在实施例2的最后纯化步骤中使用高效液相色谱(3-mlRESOURCE PRC柱，2根6.4mm(内径)×100mm(长度)的柱子彼此串联，Amersham Bioscience)进行分离，且其流动相为17％乙腈-5g(NH4)2CO3+5ml NH3/升的水溶液，则可以得到具有图4所示的1H-NMR谱图的化学物质2。
【实施例4】新化学物质1的甲基化衍生物及其进一步衍生物的制备，以及它们的物理化学性质
将新化学物质1(约140μg)溶解在40μl甲醇中，向其中加入160μl苯和100μl三甲基甲硅烷基重氮甲烷(10％，正己烷溶液，由东京KaseiKogyo有限公司制造)，充分搅拌该混合物，并使所得物质在室温下反应2小时。逐渐加入小部分乙酸直至重氮甲烷的黄色消失，使用蒸发器蒸馏除去溶剂，之后经高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts，4.6mm(内径)×150mm(长度)，Tosoh)分离，该高效液相色谱使用50％-100％乙腈-水作为流动相。结果，基本上定量(产率：约152μg，99％)得到新化学物质1的三甲基化衍生物(下文中缩写为“Me1”)。该三甲基衍生物在NMR光谱的溶剂氘代甲醇中，由于氘代甲氧基(-OCD3)逐渐取代一个甲氧基(-OCH3)而成为Me1B。将Me1(约152μg)溶解在200μl甲醇中，冰浴条件下加入1mg硼氢化钠，并使所得物质还原1小时。反应溶液经高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts，4.6mm(内径)×150mm(长度)，Tosoh)分离，该高效液相色谱使用50％-100％乙腈-水作为流动相。结果，以高产率(产率：约140μg，98％)得到Me1的还原衍生物(下文缩写为“Me1H3”)。将上面获得的全部Me1H3溶解在400μl干燥的乙醚中，室温下向其中加入100μl溶于乙醇的硼氢化钠溶液(20mg/ml)，并使所得物质在室温下反应150分钟。向其中加入饱和氯化钠水溶液(100μl)，所得物质搅拌10分钟，再使用蒸发器蒸馏除去溶剂。用流动相为50％-100％乙腈-水的高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts，4.6mm(内径)×150mm(长度)，Tosoh)分离反应溶液。结果，基本上定量(产率：约123μg，99％)得到高度还原的Me1衍生物(下文缩写为“Me1H1”)。另外，再将上面获得的全部Me1H1溶解在400μl干燥的二甲基亚砜中，向其中加入1mg精细粉碎的氢氧化钠、40μl碘代甲烷，然后使所得物质在室温下反应30分钟。冰浴条件下加入蒸馏水(500μl)以终止反应。此后，再用流动相为50％-100％乙腈-水的高效液相色谱(TSK凝胶ODS-80Ts，4.6mm(内径)×150mm(长度)，Tosoh)分离该反应溶液。结果，基本上定量(产率：约135μg，99％)得到高度还原的Me1H1的甲基化衍生物(下文缩写为“Me1H1Me”)。
如此制得的化合物具有下列物理化学性质。
【Me1的物理化学性质】
1.物质颜色：无色
2.分子量：499
3.分子式：C27H37N3O4S
质谱分析：FABMS：m/z 500【M+H】+
高分辨质谱：实测值：500.2569【M+H】+
            计算值：500.2583(C27H38N3O4S)
4.核磁共振信号：
1)1H-NMR(氘代甲醇，500MHz)：(图7)
δppm 0.916(3H，s)，0.941(3H，s)，0.973(3H，s)，1.086(1H，ddd，J＝3.5，12.5，13.0Hz)，1.136(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz)，1.271(1H，ddd，J＝4.0，13.0，14.0Hz)，1.380(3H，s)，1.47(2H，m)，1.50(1H，m)，1.65(1H，m)，1.69(2H，m)，1.73(1H，m)，1.84(1H，m)，2.130(1H，ddd，J＝3.5，7.0，12.5Hz)，2.34(2H，m)，3.488(3H，s)，3.914(3H，s)，4.034(3H，s)，7.911(1H，d，J＝8.0Hz)，8.258(1H，d，J＝8.0Hz)
2)13C-NMR(氘代甲醇，125MHz)：(图8)
δppm 15.413(q)，19.559(t)，20.797(t)，20.961(q)，21.981(q)，28.416(t)，33.855(q)，34.164(s)，37.928(s)，40.356(t)，41.722(t)，42.996(t)，52.266(q)，53.255(q)，52.255(q)，53.328(d)，57.432(d)，79.291(s)，120.0(s)，127.392(d)，140.407(d)，141.6(s)，1146.659(s)，149.8(s)，164.761(s)，166.027(s)，167.402(s)
5.溶解度：几乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶剂，如50％-100％甲醇水溶液或50％-100％乙腈水溶液中，几乎不溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中。
【Me1B的物理化学性质】
1.物质颜色：无色
2.分子量：502
3.分子式：C27H34D3N3O4S
质谱：FABMS：m/z 503【M+H】+
高分辨质谱：实测值：503.2777【M+H】+
            计算值：503.2772(C27H35D3N3O4S)
4.核磁共振信号：
1)1H-NMR(氘代甲醇，500MHz)：(图9)
δppm  0.916(3H，s)，0.941(3H，s)，0.973(3H，s)，1.086(1H，ddd，J＝3.5，12.5，13.0Hz)，1.136(1H，dd，J＝2.0，12.0Hz)，1.271(1H，ddd，J＝4.0，13.0，14.0Hz)，1.380(3H，s)，1.47(2H，m)，1.50(1H，m)，1.65(1H，m)，1.69(2H，m)，1.73(1H，m)，1.84(1H，m)，2.130(1H，ddd，J＝3.5，7.0，12.5Hz)，2.34(2H，m)，3.488(3H，s)，3.914(3H，s)，7.911(1H，d，J＝8.0Hz)，8.258(1H，d，J＝8.0Hz)
5.溶解度：几乎不溶于水和DMSO，溶解于含水溶剂，如50％-100％甲醇水溶液或50％-100％乙腈水溶液中，几乎不溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中。
【Me1H3的无力化学性质】
1.物质颜色：无色
2.分子量：471
3.分子式：C26H37N3O3S
质谱：FABMS：m/z 472【M+H】+
高分辨质谱：实测值：472.2630【M+H】+
            计算值：472.2634(C26H38N3O3S)
4.核磁共振信号：
1)1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)：(图10)
δppm 0.802(3H，s)，0.810(3H，s)，0.885(3H，s)，0.951(1H，m)，1.01 8(1H，m)，1.150(1H，m)，1.254(3H，s)，1.35(1H，m)，1.36(1H，m)，1.37(1H，m)，1.50(1H，m)，1.54(1H，m)，1.57(1H，m)，1.58(1H，m)，1.688(1H，m)，1.984(1H，m)，2.174(2H，br d，J＝8.5Hz)，3.399(3H，s)，3.741(3H，s)，4.570(2H，br d，J＝5.5Hz)，5.495(1H，br t，J＝5.5Hz)，7.587(1H，d，J＝8.0Hz)，7.722(1H，d，J＝8.0Hz)
2)13C-NMR(氘代甲醇，基于HMBC(异核多重键相关谱)和HSQC(异核单量子相关谱)光谱确定化学位移)：
δppm 14.2(q)，17.7(t)，19.0(t)，20.0(q)，21.1(q)，26.7(t)，33.0(q)，33.3(s)，36.1(s)，38.3(t)，40.1(t)，41.1(t)，51.2(q)，51.2(d)，52.0(q)，55.2(d)，63.7(t)，76.8(s)，119.2(s)，121.8(d)，134.1(s)，138.3(d)，146.2(s)，159.8(s)，162.8(s)，166.2(s)
5.溶解度：几乎不溶于水和100％甲醇，溶解于含水溶剂，如50％的甲醇水溶液或50％的乙腈水溶液中，溶于DMSO，几乎不溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中。
【Me1H1的物理化学性质】
1.物质颜色：无色
2.分子量：415
3.分子式：C24H37N3OS
质谱：FABMS：m/z 416【M+H】+
高分辨质谱：实测值：416.2747【M+H】+
            计算值：416.2735(C24H38N3OS)
4.核磁共振信号：
1)1H-NMR(氘代氯仿，500MHz)：(图11)
δppm 0.842(6H，s)，0.918(3H，s)，0.97(1H，m)，1.04(1H，m)，1.18(1H，m)，1.327(3H，s)，1.36(1H，m)，1.42(1H，m)，1.45(1H，m)，1.55(1H，m)，1.58(1H，m)，1.64(1H，m)，1.667(1H，dd，J＝5.5，12Hz)，1.78(1H，m)，2.02(2H，m)，2.05(1H，m)，3.650(2H，d，J＝12Hz)，4.647(2H，d，J＝14Hz)，4.801(2H，br s)，7.226(1H，d，J＝8.0Hz)，7.474(1H，d，J＝8.0Hz)
2)13C-NMR(氘代氯仿，基于HMBC(异核多重键相关谱)和HSQC(异核单量子相关谱)光谱确定化学位移)：
δppm 15.1(q)，18.4(t)，19.8(t)，20.9(q)，21.5(q)，25.1(t)，33.2(s)，33.3(q)，36.8(s)，39.2(t)，40.7(t)，41.7(t)，52.5(d)，56.0(d)，60.61(t)，62.33(t)，64.73(t)，77.0(s)，106.0(s)，119.8(d)，133.2(s)，139.7(d)，148.0(s)，156.2(s)
5.溶解度：几乎不溶于水，溶解于含水溶剂，如10％-100％的甲醇水溶液或10％-100％的乙腈水溶液中，溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中。
【Me1H1Me的物理化学性质】
1.物质颜色：无色
2.分子量：457
3.分子式：C27H43N3OS
质谱：FABMS：m/z 458【M+H】+
高分辨质谱：实测值：458.3201【M+H】+
            计算值：458.3205(C27H44N3OS)
4.核磁共振信号：
1)1H-NMR(氘代氯仿，500MHz)：(图12)
δppm 0.847(6H，s)，0.921(3H，s)，0.96(1H，m)，1.05(1H，m)，1.18(1H，m)，1.331(3H，s)，1.36(1H，m)，1.41(1H，m)，1.43(1H，m)，1.57(1H，m)，1.59(1H，m)，1.67(1H，m)，1.68(1H，m)，1.77(1H，br d，J＝13Hz)，2.00(1H，m)，2.09(1H，m)，2.16(1H，m)，3.19(3H，br s)，3.45(3H，br s)，3.509(3H，s)，3.564(2H，d，J＝12Hz)，4.41 9(2H，dd，J＝8.5，10.5Hz)，4.644(2H，br s)，7.356(1H，d，J＝7.0Hz)，7.488(1H，d，J＝7.0Hz)
2)13C-NMR(氘代氯仿，确定基于HMBC(异核多重键相关)和HSQC(异核单量子相关)光谱确定化学位移)：
δppm 15.0(q)，18.7(t)，20.0(t)，20.6(q)，21.7(q)，26.2(t)，33.2(s)，33.5(q)，36.9(s)，39.4(t)，41.0(t)，42.0(t)，52.8(d)，56.2(d)，58.4(q)，59.0(q)，59.1(q)，70.2(s)，74.0(s)，75.6(s)，76.9(s)，109.9(s)，120.5(d)，135.1(s)，139.2(d)，145.7(s)，155.1(s)
5.溶解度：几乎不溶于水，溶解于含水溶剂，如30％-100％的甲醇水溶液或30％-100％的乙腈水溶液中，溶于弱极性有机溶剂，如己烷或氯仿中。
【实施例5】新化学物质1最小有效浓度(MEC)的检测
按照与实施例1相同的方式，对在48-MTP上分离和纯化的新化学物质1进行16-步稀释，稀释开始于最终浓度1μg/ml。这种情况下，1ml培养基中约包括20个尖种礁膜细胞。稀释时，随着稀释步骤的进行，移液管末端进行交换。提供了其3个系列的试样，并按照实施例1的情况培养3天。其显示：达到12-步稀释的排同时，尖种礁膜形成了叶状体。这说明新化学物质1的MEC为1μg/ml×10-12＝1ag/ml。当该培养持续进行很长一段时期时，新化学物质1被生长的尖种礁膜消耗，则叶状体开始降解。图13显示了培养开始(新化学物质1的最终浓度：1×10-7μg/ml)10天后，7-步稀释的照片。虽然在某些程度上保持了叶状体的最初形式，但仍观察到了叶状体的降解。图14显示了培养开始(新化学物质1的最终浓度：1×10-6μg/ml)10天后，6-步稀释的照片。叶状体还保持未降解，培养开始10天后的MEC为1×10-6μg/ml＝1pg/ml。在实施例1所述的条件下，尖种礁膜每天约进行两次有丝分裂。如果初始细胞数量为20，则根据计算，3天后的细胞数量为20×(2×2)3＝1,280个细胞，而10天后的细胞数量为20×(2×2)10＝20,971,520个细胞。也就是说，培养开始10天后的细胞数量与培养开始3天后相比，增加至10,000倍或更多，而MEC根据细胞数量和培养天数会发生显著变化。更具体地说，取决于培养天数和细胞生长数量，需要加入充足的新化学物质1。
【实施例6】新化学物质1及其衍生物的活性
按照与实施例5相同的方式，测定新化学物质1及其衍生物的最小有效浓度。得到下面所示的结果。
    表7
最小有效浓度
 新化学物质1     10-12μg/mlMe1             10-4μg/mlMe1H3           10-2μg/mlMe1H1           无活性
当新化学物质1进行了甲基化时，其活性降低至1/108。这说明，如实施例4中所述的，被甲基化试剂，如三甲基甲硅烷基重氮甲烷甲基化的官能团对于活性来说是非常重要的。
【实施例7】培养孔石莼和肠浒苔的试验
利用趋光性，在包括抗菌素混合溶液的ASP7培养基中洗涤源自孔石莼和肠浒苔(收集于Miho、Shimizu、Shizuoka，日本)的游动细胞。将洗涤后的细胞加入到覆盖有无菌盖片的正方形器皿中，然后将细胞杀菌5天。当游动细胞沉积在盖片上并开始生长时，将各个盖片放置在6-MTP的各个孔中，并加入10ml不含抗菌素的ASP7培养基。将新化学物质1以1ng/mg的量加入到试验试样中，而不向对照试样中加入任何物质，按照与实施例1相同的条件培养7天。10天之后，在已加入相同培养基的培养试管中对试验试样和对照试样的盖片进行再次培养，再次培养另外进行7天。图15显示了对孔石莼进行试验的结果，图16显示了对肠浒苔进行试验的结果。由试验试样和对照试样的比较显而易见可知，对照试样中只有假根异常生长，并没有形成正常的叶状体。与之相比较，加入新化学物质1时，沉积后可观察到叶状体的正常生长和形成。
上述包括抗菌素混合溶液的ASP7培养基这样制备：向ASP7培养基中加入2％的抗菌素混合溶液，该抗菌素混合溶液具有下列组成：
      表8
抗菌素混合溶液
蒸馏水    1,000ml青霉素    100mg链霉素    200mg卡那霉素  100mg
【实施例8】促进大型绿藻形态形成的特定活性
按照与实施例5中相同的方式，测定如图17中所示的YM-1-69株、YM-2-23株和类似菌株的最小有效浓度。得到如图18所示的结果。水平轴代表由1μl类似菌株培养物上清液活化的尖种礁膜培养液的量。例如，1μl YM-2-23株的培养物上清液可活化约8,000ml图18中的尖种礁膜培养溶液。
【实施例9】新化学物质1及其衍生物的部分结构的确定
图19所示的局部结构是通过新化学物质1的各种NMR谱图和质谱推断出来的。由这些局部结构的HMBC谱图分析结果推断出图20所示的driman-型萜类化合物结构和四取代苯环结构。如图21所示，基于新化学物质1的三甲基化衍生物，即，Me1的NMR谱图，通过对四取代苯环上一个取代基的局部结构进行分析，以及通过对NOESY光谱的分析，确定了相对构型。如图22所示，基于HMBC谱图确认了上述预测的结构。如图23和24所示，对于Me1H3，在driman部分和苯环之间观察到了NOESY光谱和HMBC光谱的交叉峰。这两个结构通过碳数为11-16和碳数为8-O-21(用以预测局部结构)的原子彼此相连。对于新化学物质1的还原衍生物，即，Me1H1，在苯环24位置的亚甲基和21位置的碳之间观察到了交叉峰。如图25和26所示，确定了四取代苯环的最后一个取代基。如图27和28所示，基于Me1H1的甲基化衍生物，即，Me1H1Me的各个NMR谱图，观察到了苯环、N-甲基和24位置亚甲基之间的相互关系，且确认了上述预测的局部结构。
如实施例4所述，Me1H1Me为新化学物质1通过甲基化、还原和随后的再次甲基化而制得的化合物。因此，新化学物质1具有式1所代表的结构：
如实施例3所述，新化学物质1为新化学物质2经过碱性处理而获得的衍生物。因此，新化学物质2为式2、3或4中任一项所代表的化合物或其混合物，其中式2、3或4为式1所代表化合物的酮形式。
式2：
式3：
式4：
此外，式5代表Me1的结构；式6代表实施例4中所述的、Me1经氘代甲氧基-取代的衍生物，即，Me1B的结构；式7代表Me1的部分还原形式，即，Me1H3的结构；式8代表Me1的还原衍生物，即，Me1H1的结构；式9代表Me1H1再次甲基化的衍生物，即，Me1H1Me的结构。
式5：
Figure A0382149800262
式6：
Figure A0382149800271
式7：
式8：
Figure A0382149800273
式9：
所有本文中引用的出版物、专利和专利申请的全部内容均结合至本文中作为参考。
工业实用性
本发明提供一种利用新化学物质培养海洋大型绿藻，如石莼科和礁膜科绿藻的新技术。该技术使实验室无菌培养或安全维持和处理种子及幼苗成为可能，并使海洋大型绿藻在海中牧场或其它地方稳定生产和生长成为可能。
                     序列表
<110>MARINE BIOTECHNOLOGY INSTITUTE CO.，LTD.
<120>具有形态形成活性和促进生长活性的新化学物质
<130>PH-1841-PCT
<150>JP2002/203608
<151>2002-07-12
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>190
<212>DNA
<213>Tenacibaculum属
<400>1
CCTACGGGAG GCAGCAGTGA GGAATATTGG TCAATGGAGG CAACTCTGAA CCAGCCATGC 60
CGCGTGTAGG AAGACTGCCC TATGGGTTGT AAACTACTTT TATATGGGAA GAAACCCCTC 120
TTACGTGTAG AGGCTTGACG GTACCATAAG AATAAGCACC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG 180
CCGCGGTAAT                                                        190
<210>2
<211>189
<212>DNA
<213>未知
<400>2
CCTACGGGAG GCAGCAGTGA GGAATATTGG ACAATGGGCG GGAGCCTGAT CCAGCCATGC 60
CGCGTGCGGG AAGAAGGCCC TATGGGTCGT AAACCGCTTT TATACGGGAA GAAACCACCC 120
TACGTGTAGG GTACTGACGG TACCGTAAGA ATAAGGACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC 180
CGCGGTAAT                                                         189
<210>3
<211>1173
<212>DNA
<213>Tenacibaculum属
<400>3
GTATCTGGAG GTTTACACGG AGTTGGTGTA TCTTGTGTGA ATGCACTTTC AGATCATTTA 60
AAAGCTACAG TTCACAGAGA AGGTAAAATA TGGGAACAAG AGTATGAACG TGGTAAAACA 120
CTTTATCCTG TAAAAACTGT AGGTGAAACT GATATAACTG GTACAGAAGT AACTTTCTTA 180
CCAGACAAAA GTATTTTCCA ACAAACCACA GAATATAATT ACGAAACGTT AGCTACACGT 240
ATGCGTGAGT TAGCGTATCT TAATAAAGGA ATCACGATTA CGTTAACAGA TAAGCGTAAT 300
AAAGATGATG AAGGAAATTT TATTGCTGAA ACTTTCCACA GTAACGAAGG ATTATCTGAA 360
TTTGTTAAAT ATTTAGATAG TACTCGTACT CCTGTTATTC AGCATGTAAT TTCAATGGAA 420
GGTGAGAAAA ACGGAATTCC TGTTGAGGTT GCAATGATTT ATAATGATTC ATATGCTGAA 480
AATTTACATT CTTATGTAAA TAACATTAAT ACTCACGAAG GAGGAACACA TTTATCAGGA 540
TTTAGAAGAG GTTTAACAAG TACTTTAAAG AAATATGCAG ATACTTCTGG ATTACTAAAG 600
AACGTTAAGT TTGAGATTTC TGGAGATGAT TTCCGTGAAG GTTTAACGGC AATTGTATCT 660
GTAAAAGTAG CTGAACCTCA GTTTGAAGGA CAAACAAAAA CAAAATTAGG AAACAGAGAA 720
GTTACTTCTG CAGTATCGCA AGCTGTAGCA GAAATGTTAA CTGATTATTT AGAGGAAAAT 780
CCTAATGATG CTAAAACGAT TGTACAAAAA GTAATTCTTG CAGCTCAAGC GCGTCACGCA 840
GCTCGTAAAG CAAGAGAAAT GGTGCAACGT AAAACAGTAA TGAGTATTGG AGGTTTACCT 900
GGTAAACTAT CTGATTGTTC TGAAACTGAT CCAGCAGTTT GTGAAATTTT CTTAGTCGAG 960
GGAGATTCGG CAGGTGGAAC TGCAAAACAA GGTCGTGATC GTAATTTCCA AGCAATTTTA 1020
CCCTTACGTG GTAAGATTCT TAACGTAGAA AAAGCGATGC AGCATAAAGT TTTTGAGAAT 1080
GAAGAAATCA AAAACATGTT TACGGCTTTA GGAATCACTA TCGGAACAGA AGAAGATCCA 1140
AGAGCATTAA ACTTATCAAA ATTAAGATAT CAT                              1173
<210>4
<211>1173
<212>DNA
<213>未知
<400>4
GTATCCGGTG GTTTGCACGG GGTAGGTGTT TCTTGTGTGA ACGCCCTTTC CAATCATCTT 60
AAAGCTACCG TACATAGAGA TGGGAAAGTT TGGGAACAGG AATATGAACG GGGTAAATCC 120
CTTTATCCCG TAAAAAGTGT TGGGGAGACC GATGAAACTG GAACCATTGT TACCTTCATA 180
CCAGATGATT CAATCTTTAC CCAAACAACA GAGTATAGTT ATGAGACCCT TGCCAACAGA 240
ATGCGTGAGC TTTCGTTCTT GAACAAAGGG GTTACCATTA GCATTACGGA CAAAAGAGTA 300
AAGGATAAAG AAGGGGAGTA CCTTTCTGAA ACTTTTTATT CCGATGCTGG ACTAAGTGAA 360
TTTGTTAAGT TCTTGGATGG TACCCGTGAA CCTTTGATTC AAGGGGTTAT CGCGATGGAA 420
GGGGAGAAAA ATGGTATCCC TGTGGAAGTG GCAATGGTTT ACAACACCAG TTACACGGAG 480
AATTTACATT CCTATGTGAA TAACATTAAC ACGCACGAAG GGGGTACGCA TCTTTCCGGT 540
TTTAGAAGGG GATTGACCTC TACTTTAAAG AAATACGCAG ATTCTTCTGG AATGCTCGAG 600
AAATTGAAGT TTGAGGTTCA GGGAGATGAT TTCCGTGAAG GACTTACAGC AATTGTTTCC 660
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GTTTCTTCTG CGGTGAGCCA AGCTGTTTCT GAAATGCTCA CGGATTATTT GGAGGAGCAT 780
CCAGATGATG CCAAGGTTAT TGTTCAAAAA GTTATCCTTG CCGCTCAGGC CAGACATGCC 840
GCTACAAAGG CCCGTGAAAT GGTACAGCGT AAGACGGTAA TGAGTATTGG TGGGCTACCT 900
GGAAAATTGT CCGATTGTTC TGAGCAAGAT CCTGCGCAAT GTGAAGTATT TCTTGTAGAG 960
GGAGATTCTG CAGGTGGTAC GGCAAAAATG GGCCGGGACC GAAAATTTCA GGCCATTCTT 1020
CCACTAAGGG GTAAAATCTT GAACGTGGAA AAAGCCATGC AGCACAAGGT TTTTGAAAAT 1080
GAGGAAATAA AGAATATTTA TACGGCCCTA GGGGTTACTA TTGGAACGGA AGAAGATAGT  1140
AAGGCCTTGA ACCTGGAAAA ATTAAGATAT CAT                               1173

Claims (10)

1.一种新化学物质1，其具有下列物理化学性质：
(i)物质颜色：无色
(ii)分子量：457
(iii)分子式：C24H31N3O4S
质谱分析：FABMS：m/z 456[M-H]-(图1)
高分辨质谱：实测值：456.1960[M-H]-
            计算值：456.193(C24H30N3O4S)
(iv)核磁共振信号：
1)1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，750MHz)：(图2)
δppm 0.818(3H，s)，0.837(3H，s)，0.882(3H，s)，0.960(1H，m)，1.058(1H，m)，1.167(1H，m)，1.326(3H，s)，1.37(1H，m)，1.38(1H，m)，1.40(1H，m)，1.58(1H，m)，1.61(2H，m)，1.52(1H，br d，J＝13Hz)，1.76(1H，br d，J＝14Hz)，2.024(1H，m)，2.181(1H，dd，J＝4，14Hz)，2.291(1H，dd，J＝14，16.5Hz)，7.698(1H，d，J＝7.5Hz)，7.845(1H，d，J＝7.5Hz)
2)13C-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，125MHz)：(图3)
δppm 15.236(q)，19.037(t)，20.287(t)，20.955(q)，21.835(q)，25.987(t)，33.381(s)，33.636(q)，37.308(s)，39.590(t)，41.199(t)，42.346(t)，52.769(d)，56.381(d)，79.096(s)，114.965(s)，124.399(d)，139.004(s)，141.232(d)，150.282(s)，152.656(s)，172.081(s)，173.538(s)，174.661(s)。
2.一种新化学物质2，其具有下列物理化学性质：
(i)物质颜色：无色
(ii)核磁共振信号：
1H-NMR(D2O-20mM Na2HPO4(pH9)，750MHz)：(图4)
δppm 0.815(3H，s)，0.834(3H，s)，0.877(3H，s)，0.949(1H，m)，1.048(1H，m)，1.163(1H，m)，1.297(3H，s)，1.35-1.40(3H，m)，1.52-1.63(4H，m)，1.753(1H，br d，J＝14Hz)，2.012(1H，m)，2.158(1H，m)，2.299(1H，m)，7.646(1H，d，J＝8.0Hz)，7.769(1H，d，J＝8.0Hz)
3.一种制备新化学物质1的方法，其中在培养基中培养可制备根据权利要求1的新化学物质1的微生物，新化学物质1在培养中产生并累积，并回收产生和累积的新化学物质1。
4.一种制备新化学物质2的方法，其中在培养基中培养可制备根据权利要求2的新化学物质2的微生物，新化学物质2在培养中产生并累积，并回收产生和累积的新化学物质2。
5.根据权利要求3的制备方法，其中微生物为YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum属YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其类似的菌株。
6.根据权利要求4的制备方法，其中微生物为YM-2-23株(FERMBP-8417)，Tenacibaculum属YM-1-69株(FERM BP-8418)，或其类似的菌株。
7.海藻培养基，其包括作为活性成分的根据权利要求1的新化学物质1。
8.海藻培养基，其包括作为活性成分的根据权利要求2的新化学物质2。
9.新化学物质1的单甲基化、二甲基化或三甲基化衍生物，其通过用三甲基甲硅烷基重氮甲烷处理根据权利要求1的新化学物质1而获得。
10.一种化合物或其衍生物，其通过用硼氢化钠处理根据权利要求9的三甲基化衍生物而获得。
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