KR870000248B1 - 항생물질 a39079 인자 s-1의 제조방법 - Google Patents

항생물질 a39079 인자 s-1의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 A39079 인자 S-1의 제조방법
본 발명은 일반식(1)의 구조를 갖는 리파마이신 계통의 신규한 항생물질 A 39079 인자 S-1에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서,
R 및 R'는 둘다 -OH이거나 또는 둘다 =0이다.
또한 본 발명은 신규한 균종 스트렙토마이세스 스페로이드스(Streptomyces spheroides)(기탁번호 : KFCC-10116; 기탁기관 : 한국 종균협회; 기탁일 : 1984.10.12) 및 이들 신규한 균종을 호기성 발효 조건하에서 미생물억제 활성의 거의 대부분이 나타날때까지 배양시켜 A39079 인자 s-1, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드(액티 디온), 액티페놀(actiphenol) 및 셉타시딘(septacidin)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 인자s-1, 클로르암페니콜, 사이클로-헥시미드, 액티페놀, 또는 셉타시딘 산성 브로스 여액(acidified broth filtrate)을 극성 유기 용매로 추출하고, 추출, 크로마토그라피 및/또는 결정화 공정이 의해 더욱 정제할수 있다.
본 발명은 신규한 항생물질에 관한 것이다. 특히 본 발명은 일반식(1)의 신규한 리파마이신-양(like) 항생물질 A39079인자 s-1("인자s-1)" 및 그의 C2-C18-아실 에스테르 유도체에 관한 것이다.
인자 s-1에는 일반식(Ia) 화합물(R 및 R' 모두가 하이도록시인 환원형) 및 일반식(Ib) 화합물(R 및R' 모두가 =0인 산화성)모두가 포함된다.
Figure kpo00002
화합물(Ia) 및(Ib)모두가 인자 s-1이 존재하지만, 화합물(Ib)(산화형)가 대부분의 제제에서 우세한 인자이다.
신규의, 개량된 항생물질에 대한 요구가 끊임없이 저속되고 있다. 수의과 분야에서 뿐아니라, 인체 질병을 치료하기 위해 더 나은 항생물질이 필요하다. 효능의 증가, 살균 범위의 확장, 생체내에서의 효능증가, 및 약제학적 특성 좀더 큰 경구 흡수, 보다 높은 혈액 또는 조직 농도, 생체내에서의 좀더 긴 반감기, 및 보다 이로운 배설경로 또는 속도 및 대사속도 또는 패턴과 같은)의 개선이 개량된 항생제를 개발하는 목적이다.
신규한 항생물질을 개발함에 있어서, 공지 항생물질의 구조 변형이 가능한 경우는 언제든지 시도되고 있다. 그러나 이 시도는 목적하는 활성을 유지하는 유도체로 제한된다. 리파마이신 계통의 항생제를 포함한 많은 항생제들은 구조가 복잡하여 약간 변형시키는 것도 화학적으로 어려울 수 있다. 따라서, 발효 공정에의해서 생산되는 신규한 항생물질의 발견이 아주 중요한 것으로서 계속되고 있다.
일반식(1)의 인자 s-1은 리파마이신 그룹의 항생제 중에서는 새롭게 발견된 것이다. 이들 그룹의 구성원에는 리파마이신 s(참조, 예, 미합중국 특허 제4,353,826호)가 포함된다.
본 발명에 따라, 본 명세서에 액침 호기성 발효 조건하어 탄소, 질소 및 무기염의 동화할 수 있는 공급원을 함유하는 배양 배지중에서 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116) 또는그의 인자 S-1-생성변이주, 돌연변이주 또는 재조합체를 배양함을 특징으로 하여 항생물질 A39079 인자S-1을 제조하는 방법이 제시되어 있다.
인자 S-1외에도, 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)는 또한 클로르암페닐콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀 및 셉타시딘을 생성한다. 따라서, 본 명세서에는 액침 호기성 발효조건하에서 탄소, 질소 및 무기염의 동화할 수 있는 공급원을 함유하는 배지중에서 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC 10116) 또는 그의 변이주, 돌연변이주 또는 재조합체를 배양함을 특징으로 하여 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀 또는 셉타시딘을 제조하는 방법이 제시되어있다.
또한, 본 발명은 한가지 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 항생물질 A39079 인자 S-1, 또는 약제학적으로 허용되는 그의 에스테르를 활성물질로서 함유하는, 공지 방법으로 제조된 약제학적 제제에 관한 것이다.
A-39079 인자 S-1은 메탄올, 아세토니트릴 및 아세톤과 같은 용매에는 용해되나 물에서는 조금밖에 녹지않는 비결정의 노랑색 분말이다. 산화형(Ib)의 인자 S-1의 실험식은 C26H43NO12이고 분자량은 약 681이다. 인자 S-1은 다음의 생리적 특성을 갖는다.
1) IR 분석 : 3420,3163,1672,1642,1621,1599,1412,1182, 1136 및 1072cm-1에서 뚜렷한 피크가 나타남.
2) UV 분석 : 중성 및 산성 메탄올 중에서는305nm(ε=16,000),272nm(ε=30,000) 및 208nm(ε=24,000)에서, 염기성 메탄올 중에서는 312nm(ε=30,000) 및 250nm(ε=37,000)에서 최대 흡수를 보인다.
3) 적정 : 66% 수성 디메틸포름아미드중에서 : pka 8.0
4) 질량 분석 : 가장 빠른 원자 충격형에서, 다음의 결과가 얻어졌다 :
Figure kpo00003
5. 핵자기 공명 분석(NMR) :
a)13C NMR을 중수소화된 클로로포름, 테트라듀테로메탄올 또는 헥사듀테로 아세톤중에서 찍어 보았다. 양자화된 탄소 원자의 공명은 단일 주파주의 데커플링법(decoupling technigues)에 의해서 배당된다. 다른 탄소 원자 주파수의 배당은 완전히 커플링된 스펙트럼 및 리파마이신 에스의 문헌에 실린 값과의 비교에 의해 이루어진다. 36 불연속 탄소주파수는 고 단리 질량 스펙트럼 윈소 분석 데이타와 동일한 것으로 알려져 있다. A39079 인자 S-1의13C데이타의 리피마이신 에스의13C데이타와의 비교로 일반식 2 및 3의 치환패턴에 있어 3개가 달라졌음을 알 수 있다.
Figure kpo00004
A39079 인자 S-1(2) :
Figure kpo00005
리파마이신 S(3) : H CH3CH3
b) 양자 NMR은 테트라듀테로메탄올, 듀테로클로로포름 및 헥사듀테로아세톤중에서 기록하였다. 양자 NMR 데이타를 리파마이신 S와 비교한 결과, 탄소 3,16 및 27의 치환이 다른 것으로 나타났다. NMR스펙트럼은 공지의 데커플링법을 이용하여 360MHz 빛 270MHz기구상에서 측정하였다. 데커플링 데이타로 16및 27위치에서(R2및 R3) 통상의 리파마이신중의 그와 같은 체인과는 다른 ansa체인(즉, 기본 골격 구조만이 리파마이신과 공통인)이 존재함을 알 수 있었다.13C스펙트럼 중의 방향족 메틸 그룹과 커플링된 환(R1)상에서 3위치의 양자의 부재로 C-3이 메틸 그룹이 존재함을 알 수 있었다.
6) 안정성;메탄올 수용액중의 인자 S-1에 관한 안정성 연구는 pH 2,5,7 및 9와 온도 4℃, 25℃, 및 37℃에서 수행하였다. 이 연구에서, 인자 S-1은 강산성용액(pH=2)보다 약산성 중성 및 염기성 용액에서 더 안정하고, 4℃에서 가장 안정하며 25℃에서 덜 안정하고 37℃에서 가장 불안정한 것으로 나타났다.
7) 크로마토그라피;
a) 고압액체 크로마토그라피(HPLC) :
칼럼 : 1/4"×12.5cm
팩킹 : 조르박스(Zorbax) ODS (6μ, 이. 아이. 듀퐁)
용매 : 아세토니트릴;물;트리플루오로아세토산(56 : 43.996 : 0.004), pH=4.6
공급율 : 1ml/min
검출 : 264nm에서 UV로
정량 : 데이타 팩키지가 장치된 마이크로메리틱스 740 마이크로프로세서(마이크로메리틱스 코포레이숀)
S-1의 저류 시간 : 5.6분(k'=3.74)
b) 박층 크로마토그라피(TLC)
흡착대 : 실리카겔(Whatman LKDSF 평판)
용매 : 클로로포름 : 메탄올 : 수산화암모늄(90 : 9.5 : 0.5)
검출 : 스타필로코쿠스 아우레우스에 대한 UV 및 바이오오오토그래피
그 분야 전문가들이면 A39079 인자 S-1이 아실 에스테르 유도체를 생성할 수 있음을 이해할 것이다. 그와 같은 유도체는 분리, 정제 및 인자 S-1을 투여함에 있어 유용하다. 약제학적으로 허용되는(즉. 정온-동물의 화학 요법에 유용한)인자 S-1의 아실 에스테르는 특히 본 발명의 유용한 화합물이다. 바람직한 에스테르 유도체는 아세토산, 부티르산, 발레르산, 도데카노산, 페닐-아세토산, 타타르산, 말레산, 스테아르산, 살리실산 및 소르브산과 같은 탄소수 2 내지 18의 모노 또는 디-카복실산으로 부터 유도되는 것들이다.
A39079 인자 S-의 아실 에스테르 유도체는통상의 방법을 이용하여 인자를 아실화제로 처리하여 제조할수 있다. 이 반응에 적합한 유기 용매는 피리딘 및 트리에틸 아민이다. 통상의 아실화제에는 아실 무수물, 아실 할라이드(통상적으로 산 스캐빈저와 혼합되어 있음), 및 유기산의 활성 에스테르가 포함된다. 또한 유기산 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드와 같은 탈수제의 혼합물을 사용하여 아실화를 수행할 수 있다.에스테르화는 목적하는 반응이 요구되는 시간을 결정하기 위하여 TLC와 같은 표준기법을 사용하여 모니터할 수 있다. 일단 생성되면, 목적하는 에스테르 유도체를 공지 방법으로 분리, 정제할 수 있다.
본 발명은 또한 액침 호기성 발효 조건하에서 거의 완전한 항균 활성이 나타날때까지 신종의 스트렙토마이세스 스페로이드스(기탁번호 : KFCC-10116)를 배양하여, 인자 S-1, 클로르 암페니콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀 및 셉타시딘을 제조하는 방법이 관한 것이다. 클로르암페니콜은 공지의 시판되고 있는 항생제이다. 사이클로헥시미드(참조 미합중국 특허 제2,574,519호) 및 셉타시딘은 유용한 항 진균제이다. 따라서, 에스. 스페로이드스(기탁번호 : KFCC-10116)배양으로 이들 화합물의 각각을 제조하는 방법이 본 발명의 또 다른 이점이다.
항생물질 A39079 인자 S-1의 생성에 유용한 스트렙토마이세스 스페로이드스(기탁번호 : KFCC-10116)배양물은 ATCC에 기탁되었으며(1983.9.8)기탁번호 NRRL 15600으로서 일반적으로 이용이 가능하다.
스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)은 벤쿠버, 브리티쉬 콜롬비아, 캐나다로 부터 채취한 토양 샘플에서 분리하였다. 이들 미생물을 왈릭 등은 균주 스트렙토마이세스 스페로이드스로서 분류하였다. 이들 분류는 에스. 스페로이드스(기탁번호 : KFCC-10116) 및 다른 유사한 균종의 공개된 특징의 비교뿐만 아니라[참조 R.E. Buchanan and N.E. Gibbsons, Eds., "Berjerjs Manual of Determinative Bacteriology, " 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974 ; E. B. Shirling aend D. Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces, " Int. J. Syst. Bacterial 18(4) : 279-399(1968); 및 H. Wallick, D.A. Harris, M.A. Reagan, M. Ruger, 및 H.B. Woodruff,"Discovery and Antimicrobial Properties of Cathomycin, A New Antibiotic Produced by Streptomyces Spheroides N.sp.," Antibiotics Annual 1955-1966 : 909-917(1956)] 동시에 실험 비교를 기본으로 하였다.
미생물의 분류에 있어서, 스트렙토마이세스 균종의 특징에 관한 국제 스트렙토마이세스 프로젝트에 의해 제기된 방법을[E. B. Shirling and D. Gottlieb, "Methods of Characterization of Streptomyces species "Int. J. Syst. Bacteriol 16(3), 313-340(1966)] 어떤 보충 실험에 따라 수행하였다.
탄소 이용은 필터-멸균된 탄소원이 최종농도 1.0% 가해진 ISP N0.9염기성 배지로 측정하였다. 평판을 30℃에서 배양시키고 14일 후에 관찰하였다.
멜라닌 색소 생성(chromogenicity)은 ISP No.1(트립톤-효모 추출 브로스), ISP No.6(펩톤-효모 추출철 한천). ISP No.7(타이로신 한천) 및 변형된 ISP No.7(타이로신을 제거한 것)으로 측정하였다.
전분 가수분해는 ISP No.4(무기염-전분 한천)평판상에서 요오드로 전분의 존재를 실험해봄으로써 측정되었다(참조 : D.J. Blazevic and G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Micro-biology," John Wiley and Sons, Inc., New York,1975, p.136).
형태는 광학 현미경으로 관찰하였다. 주사 전자 현미경을 사용하여 포자 표면을 관찰하였다. NaCl 내성은 NaCl을 목적하는 농도와 동일하게 ISP No.2 한천에 첨가함으로써 측정하였다.
ISCC-NBS 센트로이드 칼라 차트, 표준 샘플 No.2106(U.S. Department of Commerce, National Buerau of Standards,1958) 및 칼라 하모니 메뉴얼(제4판, 칼라 스탠다드 데파트먼트, 콘테이너 코포레이숀 오브 어메리카, 일리노이스,1958)을 사용하여 칼라 명칭을 붙었다.
모든 세포의 가수분해물중의 디아미노피벨산(DAP) 이성체의 존재 및 카보하이드레이트의 존재는 각각 벡커등 및 레케발리어의 크로마토그래피성 방법으로 확인되었다[참조 : B. Becker, M.P. Lechevalier, R. E. Gordon 및 H.A. Lechevalier, "Rapid Differentiation Between Nocardia 및 Streptomyces by paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates, "App1. Microbiol.11 : 421-423(1964); 및 M.P.Lechevalier, "Identification of Aerobic Actinomycetes of Clinical Importance," "J. Lab. Clin. Med. 71 : 934-944(1968)]
유사계수는방정식S=[Ns++Ns-]/[Ns++Ns-+Nd]×100(여기에서, Ns+는+유사성의 수이고, Ns-는-유사성의 수이며, Nd는 상이성의 수이다)으로 부터 산출되었다[참조 : W. Kunylowicz, A. Paszkiewicz,W. Woznicka, W. Kurzatkowski,. "Numerical Taxonomy of Streptomycetes, " Polish Medical Publis-hers Warsaw,1975].
[배양의 특성]
배양은 여러가지 배지상에서 생성되는 풍부한 공기 및 생장 증식으로 특징지어 진다. 포자체는 노랑색(Y)칼라 계통이 우세하다. 가장 근사한 색인표는 2ba연노랑색이다[H.D. Tresner H.D. 및 E.J. Backus, ""System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy,"App1. microbiol.11;335-338(1956)]. 이것은 글리세롤-아스파라긴 한천(ISP No.5)상에서 가장 잘 관찰된다. 이 칼라는 일정하지 않고 변화한다.
이 배양물의 반대쪽에는 뚜렷한 색소가 없다. 그것은 옐로우(Y)-브라운이고 pH에 영향을 받지 않는다. SP No.2 및 ISP No.3 한천 배지상에서 성장하는 경우에 아주 밝은 브라운 색소가 나타나는 것을 제외하고는 용해 색소가 나타나지 않는다.
배양물은 안정한 균질 분리물로 나타난다. 배양 정보를 표 I 에 요약한다.
[표 I] : 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : 10116) 및 에스. 스페로이드스의 배양특징α
Figure kpo00006
Figure kpo00007
αG＝증식, R＝리버스, Am＝호기성 균사, Sp＝용해 색소
[형태학적 특성]
배양물은 단축 분지된 잘-발달된 비단편성 균사를 생성한다. 포자는 5개 이상의 코일을 갖는 긴 개(開)나선으로 배열되어 있다. 스포란지아(sporangia), 스크레로티아(sclerotia), 또는 운동 포자는 관찰되지 않았다. 이 배양물을 프리드함등의 스피란(S)섹션중에 놓는다. [참조 : T.G. 프리드함, C.W. Hesseltime, 및 R.C. Benediet, "A Gude for the Classification of Streptomycetes According to Selected Groups, "App1. MIcrobiol.6 : 52-79(1951)].
나선의 형태는 호기성 균사(hyphae)가 형성되는 모든 배지상에서 관찰된다. 그것은 ISP.No.5 한천 배지상에서 특히 잘 발달된다. 성숙포자 체인은 50개 이상의 포자를 함유한다.
포자 형태는 타원형이다. 포자 크기는 주사 전자 현미경으로 측정하는 경우, 길이가 1.0 내지 1.4μM이고.폭이 0.6 내지 0.8μM이다. 포자 표면은 평평하다.
[생리학적 특징]
총 세포 가수분해물에는 메조 및 하이도록시 이성체가 존재하지 않은 LL-디아미노 피멜산(DAP)이 포함된다. 총 세포 가수분해물중에 존재하는 슈가는 글루코즈, 만노즈, 리보즈 및 람노즈이다. 이들은 타입 I 세포벽 및 NC 또는 비특징적 슈가 패턴(상기의 레케발리어를 참조할 것)을 나타낸다. 주 세포벽 성분의 이들 혼합물이 스트렙토마이세스 속의 표시이다.(참조 : 상기의 Buchanan et al. 및 Lechevalier).
배양을 위한 탄소-이용 패턴은 다음과 같다 : D-글루코즈, D-아라비노즈, 셀로비오즈, D-프럭토즈,D-갈락토즈, 말토즈, D-만니톨, L-람노즈, 리보즈, 살리신 및 D-크실로즈가 증식이 이용되며 : L-아라비노즈, i-이노시톨, 락토즈, 멜리비오즈, 라피노즈 및 수크로즈는 증식을 지지하지 못한다. 이 데이타를 표Ⅱ에 요약한다.
[표 Ⅱ] : 탄소의 이용
스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL l5600(기탁번호 : KFCC-10116) 및 에스, 스페로이드스에 의한 화합물
Figure kpo00008
－ 이용되지 않음
＋ 이용됨
± 이용여부가 불확실함
배양물은 카탈라제를 생성하고, 카제인 및 에스쿨린을 분해하며 젤라틴을 액체화하고, 특히 질소화합물을 감소시키며 전분을 가수분해한다. 배양물은 NaCl 1%까지를 견딜 수 있으며 15 내지 37℃에서 증식한다. 배양물은 하이포그산틴, 타이로신 및 크산틴을 분해하지 못하며 멜라노이드 색소를 생성하지 못하고 탈지밀크와 여러가지 반응을 할 수 있다. 배양물은 클로로 마이세틴, 린고마이신,날리딕산, 리팜핀, 및 설파메톡사졸 트리메토프림에 내성이 있으나, 바시트라신, 세파로틴, 에리스토마이신, 겐타마이신, 네오마이신, 노브바이오신, 페니실린 G, 폴리믹신 B,스트렙토마이신, 설파다이아진, 테트라사이클린, 및 반코마이신에는 민감하다.
[종의 결정]
배양, 형태학적 및 생리학적 특징이 문헌[Buchanan et al., 상기 참조;Kurylowicz et al., 상기참조 ; Ebcrhard Kuster "Simple Working key for the Classification Identification of Named Taxa Includedinthe International Streptomyces Project, Int. J.Syst.Bacteriol. 22(3) : 139-148(1972); Hideo Nonomura, "Key for Classification and Identification of 458 Species of the Streptomyces Included in ISP,"J. Ferment. Technol. 52(2); 78-92(1974); I.M.Szabo,et al., "A Diagnostic Key for the Identification of "Species" of Streptomyces 및 Streptoverticillium Include in the International Streptomyces Project, "Acta Botania Academia Scientiarium Hungaricae 21(3-4),387-418(1975); 및 S.A. Waksman,"The Actinomycetes Vol. Ⅱ, "The William 및 Wilkins Co.,1961, Baltimore]에 공개된 특성과 유사한 균종을 선택, 이용하였다. 다음의 7가지 스트렙토마이세스 종은 이 배양물과 아주 유사하며 동시의 비교 실험에 이용하였다.
스트렙토마이세스 알름퀴스티α
스트렙토마이세스 크레스토마이세티쿠스b
스트렙토마이세스 롱기스포루스 플라부스c
스트렙토마이세스 니베우스d
스트렙토마이세스 슈도그리세오루스C
스트렙토마이세스 란구운α
스트렙토마이세스 스페로이드스C
αE.B. Shirling and D Gottlieb, "Cooperative Description of Type Cultures of Streptomyces" Int. : J.Syst. Bacteriol.19(4) : 375-390(1969) .b
E.B. Shirling and D. Gottlieb, ibid.22(4) : -265-394(1972)
cE.B. Shirling and D. Gottlieb, ibid.19(4) : 279-399(1968)
dE.B. Shirling and D. Gottlieb, ibid.18(2) : -69-189(1968) .
이들 배양물은 나선(S)포자형태, 평평한 포자 표면을 갖는 노랑색(Y) 또는 백색(W)칼라 계열에 속하며 멜라닌 색소를 생성하지 않고 탄소-이용 패턴을 가지며 NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)배양물과 배양 특징이 유사한 것으로 문헌에 보고되어 있다.
1. 스트렙토마이세스 알름퀴스티 및 에스. 란구운 : 거의 모든 비교 실험에서 이들 두 배양물은 동일한 결과를 나타냈다. 배양 특징은 구별되지 않는다. 에스· 알름퀴스티과 에스. 란구운의 유사 계수는 95이다. 이들 배양물이 동일 균주임은 의심의 여지가 없다. 이 결론은, 두 균주 모두가 ATCC균주 계보에 스트렙토마이세스 알부스의 균주로서 기록된 사실에 의해 확실해졌다. 따라사 알름퀴스티 및 란구운은 부적당한 균주명칭이며 더이상 이 명칭을 사용하지 않아야 한다. NRRL 15600 (기탁번호 KFCC-10116)배양물은 배양적으로, 형태학적으로, 및 생리학적으로 이들 에스. 알부스 배양물과는 다르다. 배양적으로는 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물은노랑색계열에 더 가까운 반면에 에스·알부스는 백색 계열이다. 형태학적으로 5개 이상 코일의 긴 개(開)나선형태인 NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)배양물과 촘촘한 코일형태인 에스. 알부스는 서로 아주 다르다. 에스. 아우레스 균주의 항생물질 민감도, 탄소이용도, 하이포크산틴 및 크산틴 분해도; NaCl내성, 질소화물 환원, 전분가수분해, 온도 범위, 및 탈지우유 반응도 NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)의 그것과는 전혀 다르다. NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)배양물을 에스. 알부스 균주로서 생각할 유사성은 전혀 없다.
2. 스트렙토마이세스 크레스트마이세티쿠스 : 이 배양물과 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물 사이의 배양적 및 생리학적 차이는 그들을 서로 다른 균종으로서 분리하기에 충분하다. 항생물질 민감성 및탄소-이용 패턴에도 큰 차이가 있음이 밝혀졌다. 또한 여러가지 기질의 분해, NaCl내성, 은도범위 및 탈지우유 반응도 달랐다. 에스. 크레스토마이세티쿠스의 포자는 나선형이기는 하지만, NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)의 코일보다 더 작은 코일수를 갖는다.
3. 스트렙토마이세스 롱기스포루스플라부스 : 이 배양물은 배양적으로 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)과는 다르다. 이 배양물은 호기성 균사의 형성이 매우 빈약하고;형성하는 경우에도, 균사는 NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)균사와 다르다. 이 배양물은 용해 색소를 생성하나, NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)그렇지 못하다. 포자가 존재하는 경우에, 그 형태는 NRRL 15600 (기탁번호 : KFCC-10116)포자의 형태와 유사하다. 에스. 롱기스포루스플라부스는 자펙스 용액 한천(Czapek's solution ager)상에서 분생자(coremia)를 생성한다. 이 두 배양물은 생리학적 특성이 현저히 다르다. 항생물질 민감도, 탄소 이용도, 하이포크산틴 및 크산틴 분해 NaCl내성, 온도범위, 탈지 우유상에서의 작용도 다른 것으로 관찰되었다. 에스. 롱기스포루스플라부스 및 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물 사이의 유사성은 그들을 동일 균종으로 생각할 수 있을 만큼 충분치 못하다.
4. 스트렙토마이세스 슈도그리세오루스 : 이 배양물은 실험조건하에서 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물과 현저히 다르다. 이 배양물들은 서로 다른 항생물질 민감도 및 탄소-이용 패턴을 갖는다. 타이로신, 하이포크산틴 및 크산틴은 에스. 슈도그러세오루스에 의해서 분해되나 NRRL 15600 (기탁번호 : K.FCC-10116)에 의해서는 분해되지 않는다. 에스. 슈도그리세오루스는 질소화물을 감소시키지 못한다. 에스슈도그리오세루스는 9% NaCl에 내성을 나타내며 10 내지 45℃온도 범위에서 증식하는 반면 : NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물은 1% NaCl에서만 내성을 나타내며 15 내지 37℃온도 범위에서 증식한다. 에스. 슈도그리세오루스는 그레이(GY)칼라 계열인 풍부한 호기성 균사를 생성한다. 에스. 슈도그리세오루스의 포자 표면은 가시 모양이다. 여러개의 배지상에서 특별한 리버스 색소가 관찰된다. 이들 배양적 및 생리학적 차이로 이들 균종은 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물과 구별된다.
5. 스트렙토마이세스 니베우스 및 에스. 스페로이드스 : 거의 모든 비교 실험에서, 이들 배양물은 동일한 결과를 보였다. 117특징에 대한 유사 계수는 95.7이다. 또한, 그 둘은 모두 노보바이오신을 생성한다. 이들 배양물이 동일한 것인지는 의문으로 남아있다.
NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)배양물은 배양적으로 형태학적으로 및 생리학적으로 에스. 스페로이드스와 유사하다. 이 둘은 모두 노랑색 계열에 속한다. 이것은 ISP 배지 Nos.5 and 7상에서 괸찰된다. 둘은 모두 에머슨즈 한천상에서 백색의 호기성 칼라를 나타낸다. 반대측은 근본적으로 엘로우 브라운이다.
형태학적으로 그들은 동일하다. 포자는 5개 이상의 코일의 긴 개(開)나선이다. 둘다 평평한 타원형 포자이다. 항생물질 민감도패턴, 하이포크산틴 및 크산틴 분해, NaCl의 내성, 질소화물의 감소, 및 온도범위는 일치하지 않는다. 탄소 이용 패턴은, 동일하지는 않지만, 거의 일치한다. 에스쿨린, 카제인의 분해, 전분의 가수분해, 젤라틴의 액화, 및 타이로신 분해불능 또는 멜라닌 색소 생성불능은 두 배양물에서 동일하다. NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)과 에스. 스페로이드스와의 유사 계수는 78이다. 이들 유사점과 차이점을 표Ⅲ 및 Ⅳ에 요약한다.
[표 Ⅲ] : NRRL 15900(기탁번호 : KFCC-10116)과 스트렙토마이세스 스페로이드스의 비교
Figure kpo00009
[표Ⅳ] : 스트렙토마이세스 스페로이드스(기탁번호 : 10116)과 에스. 스페로이드스 특징의 비교
Figure kpo00010
Figure kpo00011
이들 비교로 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)이, 에스. 스페로이드스와 동일하지는 않지만, 아주 유사함을 알 수 있다. 그 차이는 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)을 별개의 군주로서 구별할 만큼 충분치 못하다. 따라서 배양물을 스트렙토마이세스 스페로이드스(웰렉, 해리스, 레이건, 루커 및 우드러프 1956, ATCC 23965, NRRL 2449로서 분류한다. 에스. 스페로이드스는 어프루브드 리스트 오브 박테리얼 네임즈[V.B.D. Skernnn, et al. "Approved Lists of Bacterial Names, " Int. J.Syst. Bacteriol 30(1 : 255-420(1980)]에 실려 있으며, 결론적으로, 정당하게 공인된 균종이다.
다른 유기체와 마찬가지로, 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : 10116)의 특징은 변형시킬 수 있다. 예를들어 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)균주의 인위적 변이주 및 돌연변이주는 자외선, x-선, 고주파, 방사선 및 화학처리와 같은 여러가지 공지 돌연변이물질(mutagen)로 처리함으로써 얻어질 수 있다. 모든 천연 및 인공 변이주, 돌연변이주 및 인자 S-1의 특징을 보유한 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC 10116)의 제조합체가 본 발명에 이용될 수 있다.
인자 S-1, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀 및 셉티시딘은 완전한 항생물질 활성이 나타날때까지 적절한 배양 배지중의 함침된 호기성 조건하에서, 이들 화합물물을 생성하는 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : 10116), 또는 그의 변이주, 돌연변이주 또는 재조합체를 배양함으로써 제조된다. 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)의 증식에 이용되는 배양 배지는 다수의 배지중의 어느것일 수 있다. 그러나 제조의 경제성, 최적 수율, 및 생성물 분리의 용이성에 관한한, 몇가지 배양 배지가 바람직하다. 따라서, 예를들면, 대규모 발효중의 바람직한 탄소원에는 글리세롤 및 감자 덱스트린과 같은 함수 탄소가 포함된다. 바람직한 질소원에는 카제인의 효소 분해물, 면실 가루,거칠게 탄 콩가루, 프로테인 팹톤등이 포함된다. 배양 배지중에 넣을 수 있는 영양 무기염 중에는, 예를들어, 철, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 염화물, 탄산염, 황산염, 및 질산염 이온을 생성할 수 있는 통상의 용해염이 있다.
또한 미생물의 증식 및 발달에 필요한 필수 미량원소를 배양 배지중에 첨가할 수 있다. 그와 같은 미량원소는 미생물의 증식에 필요한 충분량으로 배지중에 존재하는 다른 성분중에서 통상 불순물로서 존재한다.
기포가 문제가 될 경우에는, 폴리프로필렌 글리콜(분자량 약 2000)과 같은 소량(즉 0.2ml/L)의 소포제를 대규모 발효 배지에 첨가하는 것이 바람직 할 수 있다.
인자 s-1, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀, 및 셉티시딘의 완전한 양의 생성을 위하여, 탱크중의 액침 호기성 발효가 바람직하다. 이들 화합물의 소량은 진탕-플라스크 배양물로 부터 얻어진다. 미생물의 포자 형을 거대한 탱크에 접종하는 통상의 항생물질 생성에 있어서 시간의 지연때문에, 식물성 접종원을 사용하는 것이 바람직하다. 식물성 접종원은, 신선하고, 활성이 있는 미생물의 증식 배양물을 얻기위하여 미생물의 포자형 또는 균사 단편을 소(小)용적의 배양 배지에 접종시킴으로서 제조된다. 이어서 식물성 접종원을 커다란 탱크에 옮긴다. 식물성 접종원용에 사용되는 배지는 보다 큰 발효용에 사용되는 배지와 동일할 수 있으나, 다른 배지를 또한 사용할 수 있다.
에스. 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)은 약 15 내지 37℃온도에서 증식할 수 있다. 최적의 항생물질은 약 30℃의 온도에서 얻어진다. 통상적으로 호기성의 함침된 배양공정에서와 같이, 멸균공기를 배양 배지중에 통해준다. 탱크중에서 효과적으로 항생물질을 생성하기 위해서 용해산소치는 30% 또는 그 이상의 공기 포화도로 유지되어야 한다(30℃ 및 1대기압에서).
항생물질 생성은 이들 항생물질에 민감한 미생물에 대한 브로스의 실험 샘플에 의한 발효동안에 얻어질수 있다. 유용한 검정 미생물의 하나가 스타필로코쿠스 아우레우스 ATCC 9144이다. 생물 검정은 자동화비탁법(turbidimetric method)에 의해서 편리하게 이루어 진다. 또한 항생물질 생성은 UV검출과 함께 HPLC에 의해서 쉽게 모니터할 수 있다.
액침 호기성 발효 조건하에서 생성됨에 따라 인자 s-1은 공지방법에 의해 발효 배지로 부터 회수할 수있다. 회수 공정에 있어서 먼저 통상적으로 발효 브로스를 여과하여 균사를 제거한다. 이어서 여과된 브로스를 더욱 정제하여 목적하는 항생물질을 얻을 수 있다. 이 정제에는 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 여과된 브로스의 정제에 바람직한 기술에는 브로스를 약 pH 2로 맞추고, 이 브로스를 고 다공성 마크로레티클라 폴리머(macroreticular polymer)와 같은 적절한 흡착대에 흡수시키고, 아세토 니트릴과 같은 용매로흡착제로 부터 입자를 용출시킨 다음, 용출물을 농축시키고, 다시 에틸 아세테이트와 같은 적절한 용매로 추출한다. 그 이상의 정제에는 추출, 크로마토그라피 및/또는 침전등의 기술이 포함된다.
또한, 배지 조성 및 균사를 포함하는 배양고체를 추출 또는 분리없이, 바람직하지는 물을 제거한 후에 인자 s-1의 공급원으로서 이용할 수 있다. 예를들어, 인자 s-1 항생물질 활성의 생성후에, 모든 발효 브로스 또는 브로스 여액을 동결건조, 드럼-건조, 또는 공비 증류 및 건조에 의해서 건조시킬 수 있다. 이어서 건조된 모든 브로스 또는 건조된 브로스 여액을 직접 공급된 예비 혼합물과 혼합할 수 있다.
A39079 인자 s-1은 광범위의 병원성 세균, 특히 그람-양성 세균의 증식을 억제한다. 표V는 표준 한천-희석 검정에 의해 측정한 것으로서 인자 s-1이 어떤 미생물을 억제하는 최소 발육 저지 농도(MIC)를 요약한 것이다. 표V에서, 인자 s-1의 활성은 리팜핀의 활성과를 비교한 값이다.
[표 V] : 인자 s-1 시험관내 활성
Figure kpo00012
Figure kpo00013
a 실험하지 않음.
표V의 데이타는 광범위한 미생물에 대한 인자 s-1의 강력한 항생물질 활성을 나타낸다. 따라서 본 발명의 다른 면에 있어서, 화학요법적으로 유효한 양의 A39079 인자 s-1, 또는 약제학적으로 허용되는 그의 에스테르를 정온동물에 투여함을 특징으로 하여 이 동물의 미생물 감염을 치료 또는 억제하는 방법을 제시해준다.
인자 s-1의 또 다른 중요한 특성은 반추동물에서 사료-이용률을 증가시킬 수 있다는 점이다. 발달된 반추기능을 가진 동물은 먼저 함수탄소물(주요 영양 부분)을 피루베이트로 분해함으로써 사료를 이용한다. 피루베이트는 더욱 대사되어 휘발성 지방산(VFA)유도체가.되며, 이것에는 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트가 포함되어 있다. 그 분야의 전문가들 이면, 동물의 반추부분을 자극하여 아세테이트 또는 부티레이트 화합물보다 프로피오네이트 화합물을 생성하도록 하는 처리에 의해 반추동물의 함수 탄소물의 이용율을 증가시킬 수 있음을 이해할 것이다. 또한 사료 이용율은 메탄생성을 억제함으로서도 증가할 수 있다. 반추위에서 생성되는 메탄가스는 일반적으로 트림을 통해 제거된다. 메탄생성을 억제함으로써 에너지 손실이 극소화될 수 있다.
사료이용율은 벡커등의 미합중국 특허 제4,333,923호(참조 : 특허 칼럼 6-7)에 기술된 방법을 이용하여 반추위에서의 프로피오네이트 화합물의 생성 및 농도를 관찰함으로써 모니터할 수 있다. 표Ⅵ은 이 실험에서 대조 플라스크중의 휘발성 지방산(VFA)농도에 대한 인자 s-1-처리된 플라스크중의 VFA농도비를 나타낸다.
[표Ⅵ] : 인자 s-1의 반추성 사료 이용활성
대조그룹에 대한 치료그룹의 비 몰 mMoles/일
Figure kpo00014
대조그룹에 대한 치료그룹의 비 몰 %
Figure kpo00015
따라서, 본 발명의 한 방법에는 프로피오네이트-증가 또는 메탄-억제량의 일반식 1화합물을 발달된 반추기능을 갖는 반추동물에 경구 투여하는 것이 포함된다. 프로피오네이트 생성에 있어서의 증가 및 메탄생성의 억제는 통상적으로 동일한 투여로 가능하다.
이 방법으로 투여할 수 있는 화합물의 양은 통상으로 일일 체중 kg 당 약 0.10 내지 4.0mg/kg/day이다. 바람직한 범위는 약 0.25mg/kg/day 내지 약 2.75mg/kg/day이다.
인자 s-1의 또 다른 중오한 특성은 하나의 위를 가전 동물에서 사료-이용율을 증가시키는 것이다. 상업적으로 중요한 하나의 위를 갖는 동물에는 닭과 돼지가 포함된다. 또한, 어린 반추동물, 특히 아직 이유를 하지 않는 동물은 하나의 위를 가진 동물처럼 행동한다. 하나의 위를 가진 동물에 있어서, 세균 및 숙주는 소화과정에서 영양소와 경쟁한다. 세균이 유효하지 않은 물질을 사용하도록 하고, 글루코즈와 같이 보다 유용한 물질은 숙주동물이 존재하도록 해주는 제제는 숙주동물의 사료-이용율을 증가시킨다. 인자 s-1은 그와같은 효과를 가지며, 즉, 하나의 위를 가진 소화계에 통상적으로 존재하는 세균에 의해 글루코즈가 소비되는 것을 막아준다.
따라서, 본 발명의 다른 방법에는 일반식 1화합물의 글루코즈-소비억제량을 하나의 위를 가진 동물에 경구적으로 투여하는 방법이 포함된다. 이 목적으로 투여하는 화합물의 양은 통상적으로 일일체중 kg 당 약0.1mg 내지 약 15.0mg/kg/day의 범위이다. 바람직한 범위는 약 0.6 내지 약 6.0mg/kg/day이다.
동물 사육분야의 전문가들이면 이들의 최적 투여비가 동물의 상태, 연령, 먹는 사료 및 동물을 유치하는 목적에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다.
반추동물에 있어서, 일반식 1화합물은 반추위에 존재하도록 투여해야 한다. 이렇게 하기 위한 한가지 방법은, 특히 방목중인 동물에 있어서, 화합물을 서 방출성 보루스(bolus)의 형태로 투여하는 것이다. 그와같은 보루스는 정제로서 만들어 질 수 있으며, 이상적으르는 화합물이 지연기간 이상으로 용해가 연장되도록 하는 것이다. 보루스는 화합물이 장시간 이상, 심지어 100일 이상 계속해서 방출되도록 제조할 수 있다. 그와같은 보루스릍 제조하기 위해서 다수의 폴리머성 물질이 이용되었다. 특히 유용한 폴리머는 폴리락트산 및 폴리글리코산의 코폴리머이다. 보루스가 소화관으로 부터 이탈되지 않도록 반추위에 유지시키는 것이 필요하다. 이것은 금속입자를 조성물중에 혼합시키거나, 또는 반추위의 여는 속도를 바르게 하거나 보루스를 아주 크게 만들어서 동물의 겹주름위(반추동물의 제3위)의 열린 구멍으로 들어가지 못하도록 하는 등의 방법과 같이 고밀도의 보루스를 만들므로서 가능할 수 있다. 그와 같은 보루스는 일일 체중 kg당 약 0.1내지4mg/kg/day, 바람직하게는 약 0.25내지 약 2.75mg/kg/day를 방출해야 한다. 방목된 동물에는 특히 화합물의 미네랄 덩어리로 투여하는 것이 바람직하다. 통상의 덩어리는 일반적으로 인산염, 탄산염, 할라이드, 캄슘염, 미량원소(예, 아연, 코발트, 망간 등), 비타민, 스테로이드, 및 활제 및 결합을 보조해 주는 보조제가 포함된 약제학적으로 허용되는 염 및 영양물질의 고도로 압축된 형태이다. 덩어리에 약 200mg/kg(0.2%) 내지 약 500mg/kg(0.05%), 바람직하게는 약 400mg/kg(0.04%)내지 약 1500mg/kg(0.15%)의 화합물을 가해주어야 한다.
또한 본 화합물을 동물에 투여하기 위해 프로테인 덩어리와 혼합할 수 있다. 그와 같은 덩어리는 공지되어 있으며 임의로 가해진 다른 프로테인 공급원뿐만 아니라 당일 및 요소의 혼합물로 이루어져 있고, 언제나 마음내키는 대로 먹을 수 있는 반추동물이 공급된다. 본 발명의 화합물을 함유하는 프로테인 덩어리는약 200mg/kg(0.02%)내지 약 7,000mg/kg(0.7%), 바람직하게는 약 400mg/kg(0.04%) 내지 3000mg/kg(0.3%)을 함유해야 한다.
또한 본 발명에 의해 얻어지는 화합물은 정제, 캅셀제등과 같은 약제학적 제형으로 경구적으로 투여할 수 있다. 그러나 이들 조성물은 다소 비싸며 복용하기에 불편하다.
본 발명의 화합물은 동물사료에 첨가하여 두여하는 것이 가장 바람직하다. 따라서 일반식 1화합물을 함유하는 사료 조성물이 본 발명의 중요한 구체적인 용도이다.
동물-사료 조성물은 통상적으로 단계적으로 얻어진다. 먼저, 화합물을 불활성 성분과 혼합하여 사료, 예비혼합물을 만든다. 예비혼합물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 약 1내지 약 90%의 화합물을 함유한다. 사료, 예비혼합물의 불활성 성분은 특별히 지정되어 있지 않으며 통상적으로 사용되는 생리학적으로 허용되는 담체의 어느 것일 수 있다. 액체 담체에는 예를들어 여러가지 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌글리콜과 같은 글리콜 및 식물유 및 정제광물유를 포함한 불활성오일 및 에탄올과 같은 생리학적으로-허용되는 알코올이 포함된다. 고형 예비혼합물 담체에는, 예를 들어, 풍화한 흑운모(Vermiculite), 규조토, 애터펄자이트 및 몬모릴로 나이트와 같은 생리학적으로 허용되는 점토, 및(맷돌등에) 탄 옥수수, 거친 콩가루. 알팔파, 쌀겨, 분사된 옥수수속대, 탄 밀 또는 귀리 및 탈곡하는 과정에서 얻어지는 다른 물질과 같은 과립화된 또는 분말화된 사료성분이 포함된다. 고형의 사료 예비혼합물의 그와같은 성분은 자주 과립화, 환화 또는 사료 예비혼합물을 티끌이 아니고 균질하게 보존하기 위하여 더스팅오일로 처리하는 것과 같은 다른방법으로 처리한다.
다음의 실시예는 본 발명의 전형적인 사료 예비 혼합 조성물을 나타내며, 본 발명을 제한하지 않는다.
[Ⅰ]
Figure kpo00016
[Ⅱ]
Figure kpo00017
동물사료를 만드는 공정의 제2단계는 사료, 보충 또는 농축이다. 그와 같은 보충물은 활성화합물이 무기질, 무기염, 미량원소 및 비타민과 같은 영양물질과 혼합된 조성물이다. 보충물은 자주 사료, 예비혼합물을 다른 구성성분으로 희석하여 혼합한다. 보충물은 일반식 1화합물을 함유하는 완전히 혼합된 사료, 조성물의 제조공정에 사용되거나 단순히 사료통이나 사료창고에 있는 섞이지 않은 사료에 부을 수도 있다. 보충물중의 화합물의 용도는 각각의 동물에 먹일 보충물의 양에 따라 광범위하게 변화될 수 있다. 일반적으로, 완전히 혼합된 사료중의 용도는 약 0.0005내지 약 0.01%, 바람직하게는 약 0.002 내지 0.0075%이다. 일반적으로 사료통 또는 사료 창고중의 섞이지 않은 사료위에 부어줌 보충물의 농도는 약 0.001 내지 약 0,5% 바람직하게는 약 0.03% 내지 약 0.3%이다. 본 발명에 따른 사료 보충 조성물의 몇가지 실시예는 다음과 같다 :
Figure kpo00018
[Ⅱ]
Figure kpo00019
동물 사육 분야의 전문가들이면 동물사료의 통상의 성분을 알고 있을 것이다. 그와 같은 사료는 일반적으로 기본적인 곡물로 이루어져 있으며 비타민, 미네랄, 무기염 및 다른 중요한 영양물질이 보충되어 동물에 적절한 영양원이 된다. 사료에는 화합물 밀리온(ppm)당 약 10내지 110부(또는 약 20 내지 100g/ton)를 함유해야 한다. 바람직하게는, 사료는 약 25 내지 약 70ppm(또는 30 내지 60g/ton)의 화합물을 함유해야 한다. 다음은 본 발명에 따른 사료조성물을 나타내고 있으며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
[Ⅰ]
Figure kpo00020
[Ⅱ]
Figure kpo00021
Figure kpo00022
A39079인자 s-1을 항생제로서 사용할 경우에 투여할 활성 항생제의 양은 치료해야 할 질병의 정도 또는치료받아온 내역에 따라 광범위하게 변화된다. 그러나 통상적으로, 화합물을 동물체 중의 약 0.5 내지 50mg/kg의 용량으로, 더 바람직하기는 약 1 내지 20mg/kg의 용량으로 투여한다. 그와 같은 양을 일일 1회 또는 2회, 또는 질병이 따라, 치료받아온 내역에 따라 더 자주 투여할 수 있다. 통상적으로 1일 상용량은 약200 내지 600mg이다.
약제학적 조성물이 또한 본 발명의 양태이다.
본 발명의 조성물에는 본 발명의 활성 항생물질 약 0.1 내지 95중량%이 약제학적으로-허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 혼합되어 있다. 통상의 조성물에는 약 10 내지 60중량%, 더 바람직하게는 약20 내지 50중량%의 활성화합물이 함유되어 있다.
투여의 편의상, 화합물은 경구 제제에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제 및 담체의 어느것과 혼합되어 정제, 환제, 트로키제, 또는 젤라틴 캅셀제로 제제화될 수 있다. 통상적으로 사용되는 담체, 희석제 및 부형제에는 감자전분, 옥수수전분, 수크로즈, 덱스트로즈, 미세결정 셀룰로즈, 인산 이칼슘염, 알긴산, 아카시; 마그네숨 스테아레이트와 같은 활제; 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 및 페퍼민트유, 체리 또는 딸기향, 윈터그린유와 같은 방향제 등이 포함된다. 또한 화합물을 지방유, 메틸 또는 프로필파라벤, 적절한 염료 및 방향제와 같은 통상의 희석제를 사용하여 시럽 또는 엑릭실제로 제형화 할 수 있다. 화합물을 또한 기대 기간 이상의 서방출성 구강정, 로젠즈 또는 다른 적합한 형태와 같은 제제로 제형화할 수 있다.
그 분야 전문가들은, 이외에도 제제를 제조하는 다른 방법을 알고 있을 것이며 이들을 본 발명의 범위내에 포함시킨다.
다음 실시예는 본 발명을 더욱 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다.
[실시예 1]
A. 인자 s-1, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 셉타시딘, 및 액티페놀을 제조하기 위한 에스·스페로이드스(기탁번호 : KFCC-10116)의 진탕-플라스크 발효
스트펩로마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116)의 동결건조된 펠릿(pallet)을 1.2ml의 멸균수에 분산시킨다. 이용액(＜0.1ml)을 사용하여 다음 조성의 사면 한천에 접종한다.
Figure kpo00023
멸균전 : pH=6.2;NaOH로 pH 7.0까지 맞춤.
멸균후 : pH=6.9.
접종된 사면 한천은 30℃에서 약 7일동안 인큐베이트시킨다. 증식된 사면 배양물을 멸균 피펫 또는 루프로 채취하여 포자를 흩어 놓는다. 흩어 놓은 포자의 약 1/4을 하기 조성의 50ml식물성 배지에 접종시킨다.
Figure kpo00024
멸균전 pH=5.6 : NaOH로 pH 6.5로 맞춤 :
멸균후 pH=6.8.
접종된 식물성 배지를 250RPM, 2인치 (5.08cm)궤도를 선회하는 진탕기상에서 약 96시간동안 30℃에서, 250ml의 주둥이가 넓은 에르렌메이어 플라스크중에서 인큐베이트시킨다.
이 인큐베이트된 식물성 배지(0.4ml)를 사용하여 하기 조성을 갖은 50ml의 생성물 배지에 접종한다.
Figure kpo00025
αO.M. 펩톤, 암버 라보라토리즈, 주뉴, 비스 53039((Amber Laborataries, Tuneau, wis)멸균전-및 멸균후 pH=6.2(조절하지 않음)
접종된 발효 배지는 250RPM에서 2-인치 궤도를 선희하는 진탕기상에서 약 5 내지 6일 동안 30℃의 250ml 주둥이가 넒은 에르렌 메이어플라스크중에서 인큐베이트 시킨다.
B. 인자 s-1, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 셉타시딘 및 액티페놀을 생성하는 에스. 스페로이드스.(기탁번호 : KFCC-10116)의 탱크 발효.
거대 용적의 접종을 하기 위해서, A단원에서 기술한 방법과 유사한 방법으로 제조된 10ml의 인큐베이트된 식물성 배지를 사용하여, 이 식물성 배지의 조성과 동일한 조성을 가진 400ml의 제2단계의 식물성 증식배지에 접종하였다. 이 제2단계의 식물성배지를 250RPM에서 2-인치 궤도를 선회하는 진탕기상, 30℃에서 약 48시간 동안 2l플라스크중에 인큐베이트 시킨다.
이렇게 만들어진 인큐베이트된 제2단계의 배지(800ml)를 사용하여 A단원에서와 동일한 조성을 갖는 100l의 멸균 생성물 배지에 접종하였다.
접종된 생성물 배지를 30℃의 165l 탱크에서 5 내지 7일 동안 발효시킨다. 발효배지는 멸균공기에 쐬어서 용해 산소치를 약 30 내지 60%로 유지하고 200RPM에서 통상의 교반기로 교반한다.
[실시예 2]
인자 s-1, 클로르암페니콜 및 사이클로헥시미드의 분리
실시예 1, 단원 B와 유사한 방법으로 제조된 브로스(100l)를 필터 보조기(Hyflo Supercel, Johns-Man-ville Corp.)를 이용하여 여과한다. 여과된 브로스(86/)는 5N염산으로 pH 2로 맞추고 이어서 에틸 아세테이트( 1/2용적)로 2회 추출한다. 에틸 아세네이트 추출물을 진공하에서 농축시켜 오일성 잔사(49g)을 수득한다. 이 잔사를 메탄올에 용해시키고 10-L 디아이온 Hp-20칼럼(itsubishi Industries)상에 놓는다. 이 칼럼을 물(500ml)로 세척하고 아세토니트릴 : 물(3 : 7의 30L, 이 어서 3 : 2의 50L) 및 아세토니트릴로 용출한다. 용출은 100ml/min의 속도에서 수행하고, 4l의 분획을 모은다. 분획으로 마이크로코구스 루테우스, 에스케리치아 콜라이 및 뉴로스포라 크라사에 대한 항균활성을 실험한다.
엔. 크라사에 대해 활성인 사이클로헥시미드는 초기 3 : 7분회중에 용출된다. 이. 콜라이에 활성인 클로르암페니콜은 3 : 2분획중에 용출된다. 인자 s-1을 함유하는 분획을 혼합하고 진공하에서 농축하여 오일성잔사(7.65g)를 수득한다.
이 잔사를 1.9L실리카겔 칼럼(grade 62, Matheson, Coleman 및 Bell)상에서 크로마토그라피시킨다. 이 칼럼을 20mlmin의 속도에서 클로로포름 : 메탄올 : 암모늄 하이드록사이드(90 : 9.5 : 0.5 : 2.5L)으르 용출시킨다. 분획을 칼라(노랑색 및 적색) 및 엠· 루테우스에 대한 활성을 기준으로 모은다. 적색 밴드로 부터의 분획을 진공하에서 농축하여 오일을 얻는다. 이 오일을 테트라하이드로푸란(100ml)중에 용해시키고; 이 용액을 헥산(15용적)에 가하여 생성물을 침전시킨다. 이 침전물을 분리하여 1.2g의 인자 s-1을 수득한다.
인자 s-1을 메탄올중에 용해시키고 이 용액을 조르박스 ODS(12μ)(E.I. dupont)로 충진된 1"×30cm칼럼상에서 크로마토시킴으로써 200mg 분획중에서 더욱 정제한다. 이 칼럼을 0.01%트리플루오로 아세트산(400ml)중의 45% 아세토니트릴로 10ml/min에서 용출시키고 이어서 400ml구배의 0.01%트리플루오로아세트산중의 45% 내지 100%아세토니트릴로 용출시킨다. 264nm에서의 UV 흡수 및 엠. 루테우스에 대한 디스크 생물검정에 의해 분획을 체크한다. 인자 s-1만을 함유하는 분획을 혼합하고, 농축, 동결건조시켜 탈수한다. 다른 물질과 함께 인자 s-1을 함유하는 분획은 농축하고 예비된 HPLC칼럼상에서 재크로마토그라피시킨다. 100L의 발효 브로스로부터 약 800mg의 정제된 인자 s-1이 수득된다.

Claims (6)

  1. 액침 호기성 발효 조건하에서 탄소, 질소 및 무기염의 동화할 수 있는 공급원을 함유하는 배양 배지중에 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(Streptomyces spheroides) (기탁번호 : KFCC-10116 : 기탁기관 : 한국종균협회 : 기탁일 : 1984. 10. 12) 또는 그의 인자 s-1 생성 변이주, 돌연변이주 또는 재조합체를 배양시키고, 경우에 따라, 그 생성물을 에스테르화 시킴을 특징으로 하여, 일반식(1)의 항생물질 A39079인자S-1 및 그의 C2-C18아실 에스테르를 제조하는 방법.
    Figure kpo00026
    상기 일반식에서, R 및 R'는 모두 -OH이거나 또는 모두=0이다.
  2. 제1항에 있어서, R 및 R'가 모두 하이드록시인 일반식(1)의 환원형 항생물질 A39079 인자 s-1, 또는 그의 에스테르를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, R 및 R'가 모두=0인 일반식(1)의 산화형 항생물질 A39079 인자 s-1, 또는 그의 에스테르를 제조하는 방법.
  4. 제1내지 3항중의 어느 하나에 있어서, 배양배지로 부터 항생물질 A39079 인자 s-1을 분리하고, 경우에 따라, 이 생성물을 에스테르화 시키는 공정이 포함된 방법.
  5. 액침 호기성 발효조건하에서 탄소, 질소 및 무기염의 동화할 수 있는 공급원을 함유하는 배양배지중에 스트렙토마이세스 스페로이드스 NRRL 15600(기탁번호 : KFCC-10116) 또는 그의 변이주, 돌연변이주 또는 재조합체를 배양시킴을 특징으로 하여, 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드, 액티페놀 또는 셉다시딘을 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 배양 배지로 부터 클로르암페니콜, 사이클로헥시미드 또는 셉타시딘을 분리하는 공정이 포함된 방법.
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