Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indaianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku A477 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku ewentualnie w postaci je¬ go farmaceutycznie dopuszczalnych soli, stosowa¬ nych do zwalczania organizmów, wywolujacych próchnice i jako substancje wzrostowe dla kur¬ czat.Sposób wytwarzania nowego antybiotyku ozna¬ czonego symbolem A477 wedlug wynalazku pole¬ ga na hodowli mikroorganizmu Actiinoplanes sp.NRRL 3884 w warunkach aerobowej powierzch¬ niowej fermentacji. Hodowle szczepu, wytwarzaja¬ cego antybiotyk A477, z organizmu Actinoplanes (NRRL 3884) prowadzi sie w warunkach aerobo- wych poSpowierzchniowych na odpowiedniej po¬ zywce do czasu uzyskania przez pozywke hodo¬ wlana istotnej aktywnosci antybiotycznej, przy czym antybiotyk ten jest bezpostaciowa biala sub¬ stancja o skrecalnosci wlasciwej [a]^= —66.6 (c ¦* 1% w 50% wodnym metanolu). Elementarny sklad antybiotyku zblizony jest do nastepujacego: C = 53,06, H = 6,18%, N = 5,79%, O = 31,40% i Cl = 3,39%.Ohlocrowodorek antybiotyku ma postac bialej krystalicznej substancji o temperaturze topnienia 20L—)212°C, rozpuszcza sie w cieplej wodzie i w 50% wodnym roztworze metanolu. Na podstawie miareczkowania potencjometrycznego w 66% wod¬ nym roztworze dwumelyloformamidu stwierdzono, ie ma on 4 grupy dajace sie. zmiareczkowac, z któ- 10 15 20 rych dwie maja wartosc pK 7,0 i 9,7 oraz dwie o wartosci pK wiekszej od 11. Sklad elementarny chlorowodorku antybiotyku jest zblizony do na¬ stepujacego: C = 55,36%, H = 6,02%, N = 5,73%, O = 28,99%, Cl (caly) = 4,52%, Cl (nieograniczo¬ ny) — 1,28%.Jego ciezar czasteczkowy oznaczony przez po¬ miar cisnienia osmotycznego par wynosi okolo 1480. Chlorowodorek antybiotyku w postaci zawie¬ siny w oleju mineralnym ma nastepujace charak¬ terystyczne pasma o widmie absorpcyjnym w pod¬ czerwieni: 3,0, 5,8, 6,02, 6,3, 6,62, 6,68, 7,02, 7,26, 7,32, 7,7, 8,1, 8,27, 8,52, 8,97, 9,35, 9,7, 9,8 i 10,1' mikro¬ nów. Chlorowodrek antybiotyku w wodnym kwa¬ snym roztworze i w roztworze obojetnym daje widmo w naidfioleicie z maksimum absorpcji przy 300 m^ Ej°c°m = 70, zas w wodnym roztworze za¬ sadowym widma w nadfiolecie z maksimum ab¬ sorpcji przy 300 im^ E J§£m = 60 i przy 362 m^ E i% _ 1 cm = 53. Antybiotyk mozna odzyskac za po- 30 moca powszechnie stosowanych i znanych w tej dziedzinie, róznych sposobów wyosobniania i oczyszczania.Antybiotyk A477 jest antybiotykiem zasadowym, zdolnym do tworzenia soli w zwykly sposób z kwasami mineralnymi takimi jak kwas solny, siar¬ kowy, fosforowy itp., a takze z róznymi kwasami organicznymi, jak kwas octowy, propionowy, ma- lanowy, bursztynowy, winowy, maleinowy, pikry- 823963 S2396 4 nowy, .benzoesowy, p-toluenosulfonowy, nikotyno¬ wy itp.Antybiotyk A477 w postaci wolnej zasady jest biala bezpostaciowa substancja o nastepujacym skladzie elementarnym, wyprowadzonym na pod¬ stawie analizy: C = 53,0%, H = 6,18%, N = = 5,79%, O = 31,40% i Cl = 8,39%. Skrecalnosc wlasciwa antybiotyku wynosi — 66,6° przy wyko¬ naniu oznaczenia w temperaturze 25°C w 50% wodnym roztworze metanolu, w którym stezenie antybiotyku wynosi 1% (ciezar/objetosc).Chlorowodorek antybiotyku A477 jest biala kry¬ staliczna substancja o temperaturze 207—212°C.Rozpuszcza sie on w cieplej wodzie i doskonale w cieplym 50% wodnym roztworze metanolu. Jest trwaly w roztworze o zakresie wartosci pH = 1— ^10 w temperaturze do okolo 27°C. Miareczkowa¬ nie potencjometryczne chlorowodorku A477 w wo¬ dzie wskazuje na obecnosc jednej grupy o warto¬ sci pK 6,2 i pieciu lub wiecej grup o wartosci w zakresie 8—10,5. Miareczkowanie potencjometrycz¬ ne chlorowodorku A477 w dwumetyloformamidzie z woda (2:1) wykazuje obecnosc dwóch grup o wartosci pK odpowiednio 7,0 i 9,7 oraz dwóch lub wiecej grup o wartosci pK ponad 11.Oznaczenie ciezaru czasteczkowego metoda po¬ miaru cisnienia osmotycznego par wskazuje, ze minimalny ciezar czasteczkowy chlorowodorku A477 wynosi w przyblizeniu 1480.Srednia z kilku analiz elementarnych wykazala, ze chlorowodorek antybiotyku ma w przyblizeniu nastepujacy sklad: C = 55,36%; H = 6,02%; N = 5,73%; O = 28,99%; Cl (caly) = 4,52% i Cl (nieorganiczny) = 1,28%.Widmo absorpcyjne w podczerwieni chlorowo¬ dorku A477 w próbce w postaci zawiesiny w ole- jiu mineralnym przedstawiono na zalaczonym wy¬ kresie. Zaobserwowano nastepujace wyrózniajace sie maksima absorpci: 3,0, 5,8, $02, 6,3, 6,62, 6,84, 7,02, 7,26, 7,32, 7,7, 8,1, 8,27, 8,52, 8,97, 9,35, 9,7 9,8 i di0,l mikronów.Widmo absorpcyjne w nadfiolecie chlorowodor¬ ku antybiotyku A477 w kwasnym i obojetnym Tablica i Wartosci Rf chlorowodrku antybiotyku w ukla¬ dach chromatografii bibulowej, przy zostosowaniu Bacillus subtilis jako ogranizmu wykrywajacego. 1 Wartosc RF 0,05 0,26 0,84 0,40 0,62 Uklad rozpuszczalników i butanol nasycony woida butanol nasycony woda: 2% kwas IP-toluenosiulfonowy 19 czesci metanolu; 6 czesci ace¬ tonu; 75 czesci wody 3 czesci metanolu, 1 .czesc 0,1 n Ha woda nasycona metyloizobutyloke- tonem; 1% kwas p-toluenosulfo- nowy wodnym roztworze wykazuje maksimum absorpcji przy 283 m^ o wartosci zdolnosci absorpcji Ex %£ = = 70. W roztworze zasadowym chlorowodorek A477 wykazujje maksima absorpcji przy 360 m^ 5 i 362 m^ o wartosciach zdolnosci absorpcji odpo¬ wiednio E i^2_ = 60 i E ^- = 53. lem lem 0 Antybiotyk A477 dziala hamujaco na rozwój nie¬ których mikroorganizmów. Poziom dzialania ha¬ mujacego rozwój przykladowych organizmów ze¬ stawiono w tablicy 2. 5 Tablica 2 Aktywnosc bakteriobójcza chlorowodorku antybio¬ tyku A477 20 Baldany organizm iStaphylococcus' aureus Bacillus subtilis.Mycobaoterium avium Streptococcus1 faecalis Vibrio coli (Iowa 10) Mycoplasma gallisepti- cum Pasteurella multocida Pasteurella foeimoAyltica a) = rozcienczony ag Minimalne stezenie hamujace rozwój iC/^g/ml) 25,0 a) 1,56 a) 25,0 a) 3^12a) 25,0 b) | 50,0 b) 50,0 b) 50,0 b) ar b) = rozcienczony bulion Ostra toksycznosc chlorowodorku A477 badano na mysizach; oznaczona jako dawka smiertelna L.D/50 wynosila 350 mg/kg po wprowadzeniu do otrzewnej. 45 Chlorowodorek A477 po podaniu myszom w za¬ strzyku podskórnym wykazuje in vivo na zakazo¬ nych organizmach dzialanie bakteriobójcze, przy czym wartosci ED50 (dawka skuteczna dla zabez¬ pieczenia 50% izwierzat doswiadczalnych) w przy- 50 kladowych infekcjach, po zastosowaniu 2 dawek sa nastepujace: Staphylocoocuis aureus 3055 83 mg/Kg Streptooooous pyogenes 1,0 mg/Kg Diplococcus pneumoniae 5,1 img/Kg Inna wazna wlasciwoscia antybiotyku A477 jest jego zdolnosc do hamowania wzrostu mikroorga- eo nizmów, powodujacych rozwój choroby próchnicy ozebmej. W badaniu metoda rozeienczen w bulio¬ nie, chlorowodorek A477 w stezeniu 1,0 ^g/ml ha¬ muje wzrost organizmu Odontomyces visoosus, wywolujacego próchnice. w Roztwór chlorowodorku antybiotyku A477 dzia-5 82396 6 la bakteriobójczo na organizm, wywolujacy próch¬ nice, jak. wykazano w nastepujacym sposobie ba¬ dan. Probówki z pozywka, zawierajaca 5% sacha¬ rozy, zaszczepia sie mikroorganizmami, wywolu¬ jacymi próchnice. Kazda probówka wyposazona jest w cienka bagietke szklana, umieszczona w probówce i siegajaca ponizej powierzchni pozywki.Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciagu nocy, na powierzchni bagietek powstaje warstewka zko¬ mórek pierwotnych i dekstranu. Bagietki te prze¬ nosi sie nastepnie do roztworów, zawierajacych rózne stezenia chlorowodorku A477 i pozostawia sie je w zetknieciu z tymi roztworami w ciagu 5, 10 i 15 minut. Po uplywie tego czasu. bagietki splukuje sie woda wyjalowiona i Odjonizowana, po czym inkuibuje sie w niezakazonym podlozu w temperaturze 37°C w ciagu 18—24 gO'dzin. Roz¬ wój sledzi sie przez obserwacje zmiany zabarwie¬ nia wskaznika blekitu bromotymolowego z blekit¬ nego na zólty pod wplywem wytworzonego przez organizm kwasu.Roztwór chlorowodoirku A477 o stezeniu 0,1% dziala na próchnicotwórczy Streptococcus sp., je¬ zeli pozostaje on w kontakcie z komórkami w. cia¬ gu 5 minut. Rozwój innych szczepów próchnico- twórczego Streptococcus zostaje zahamowany przez kontakt komórek z 1% roztworem chlorowodorku A477 w ciagu 5 minut.Metoda rozcienczen w bulionie, chlorowodorkiem A477 o stezeniu 5 ^g/ml hamuje sie rozwój trzech szczepów próchnicotwórczego Streptococcus. Roz¬ wój innego szczepu organizmu, powodujacego próchnice (typu nitkowatych paleczek), hamiowano chlorowodorkiem A477 o stezeniu 1 ^g/ml, stosu¬ jac metode rozcienczen w bulionie.Tnna pozyteczna wlasciwoscia antybiotyku A477 jest jego zdolnosc do pobudzania wzrostu u zwie¬ rzat. Po dodaniu chlorowodorku A477 do pozy¬ wienia kurczat w ilosci 45,4 g/tona, uzyskana po 10 dniach srednia waga wynosila 154,2 g w po¬ równaniu z 147 g w grupie kontrolnej. W prze¬ liczeniu wydajnosc paszy dla kurczat, karmionych chlorowodorkiem A477, wynosila 1,43 podczas gdy dla grupy kontrolnej — 1,35.Z powyzszych wlasciwosci antybiotyku A477 wi¬ dac, ze jest organizmów paltogenmych. I tak na przyklad roz¬ twory o odpowiednim stezeniu antybiotyku mozna stosowac do dezynfekcji narzedzi dentystycznych i chirurgicznych, wyrobów ze szkla itp. Antybio¬ tyk ten mozna stosowac takze w postaci roztwo¬ ru do dezynfekcji scian, podlóg, pokrycia stolów i tym podobnych powierzchni, których utrzymy¬ wanie w warunkach sterylnych ma duze znacze¬ nie, np. w szpitalach, na obszarach przygotowy¬ wania pozywienia itp.Antybiotyk A477 dzieki dzialaniu na organizmy, powodujace próchnice i na organizmy objete etio¬ logia choroby ozebnej, mozna wlaczyc w steze¬ niach, hamujacych ich rozwój, do preparatów uzy-* wanych do higieny ust takich, jak pasty i proszkij do zebów, wody ido ust itp.Zdolnosc antybiotyku do zwiekszania szybkosci przyrost na wadze u zwierzat, czyni go specjial- 10 15 25 30 35 40 45 50 55 60 85 nie uzytecznym w tej dziedzinie. Jezeli stosuje sie antybiotyk jako srodek wzrostowy, to dogodnie jest wlaczyc go w odpowiednim stezeniu do nor¬ malnej porcji pokarmowej dla zwierzat. Mozna tez rozpuszczalna sól antybiotyku rozpuscic w wodzie pitnej dla zwierzat.W kazdym z powyzszych sposobów podawania mozna stosowac antybiotyk badz w postaci wol¬ nej zasady, ewentualnie w postaci farmaceutycz¬ nie dopuszczalnej soli addycyjnej z kwasem, przy ozym wybór dyktowany jest raczej cechami fi¬ zycznymi antybiotyku lub innymi czynnikami, niz aktywnoscia biologiczna, która jest taka sama jak w przypadku wolnej zasady, jak i soli addycyjnej z kwasem.'Mikroorganizmem pomocnym przy wytwarzaniu antybiotyku A477 jest szczep gatunku Actinopla- mes z rodziny Aiotinoplanaiceae. Actinoplanaceae sa niedawno scharakteryzowana rodzina mikroor- ganizimów rzedu Actinomycetales, opisanych pier¬ wotnie przez Couch'a, [Jour. Eliischa Mitchell Sci.Soc, 65, 315—318 (1949); 66, 87—92 (1950); Tranls.Nev York Acad. Sci., 16 315—318 (1954); Jour.Elischa Mitchell Sci. Soc. 71, 148^155 i 269(1955); Bergeyte Manual of Determinative Bacteriológy, 7 wydanie, 825^829 (1957); Jour. Elischa Mitchell Sci Soc, 79, 53—70 (1963)].Hodowla Actinoplanes stosowana do wytwarza¬ nia antybiotyku A477 zostala zdeponowana w zbio¬ rach podstawowych hodowli kolekcji Northern Utilization Research and Development Division, U.S. Dept. of Agriculture, w Peorii, Illinois, gdzie. jest do dyspozycji pod numerem NRRL 3884.Metody, istosowane do badan taksonomicznych szczepu Actinoplaneis, wytwarzaj acego antybiotyk A477, sa podobne do zalecanych przez Internatio¬ nal Streptomyees Project wraz z innymi dodatko¬ wymi badaniami, powszechnie stosowanymi w tak¬ sonomii i(iShirling, E. B. i D. Gdttlieb, 1966. Meto¬ dy charakteryzowania szczepów Streptomyees. In- ternationial Buli. Systemie Bacteriol. 16:313—340).Nazwy kolorów okreslano zgodnie z metoda ISCChNBS i(Ke01y, K.L. i DjB. Judd, ,1955. — The ISCC-NBS Methad of Designating Colors and a Diotionary of Color Names. U.S. Departament óf Gommerce Oircular Numtoer 553, Wiaishington, D.C).Liczby w nawiasach odnosza sie do bloków kolo¬ rów w slowniku Maerz and Paul, Diictionairy of Color, Mc Craw — Hill Book Company, Inc., New York.Morfoloigie mikroskopowa bada sie w nastepu¬ jacy sposób. Grzybnie wegetatywna na pylku Li- auidamber (slodkiego drzewa giumoweigo) baida sie w wodzie. Strzepki palisadowe osiagaja srednio 1,3X13 ii tylko ze sporadycznymi rozgalezienia¬ mi. Powstale zarodnie sa rzadko rozsiane na pyl¬ ku i na srodowisku hodowlanym International Streptomyees Project Nr 3 (iShirling i Gottlieb).^Zarodnie sa koliste, osiagajac przecietnie srednice ;!7,5 fji przy nieregularnej powierzchni. Zarodniki maja ksztalt gruszkowaty, jak zaobserwowano pod mikroskopem elektronowym i sa wieloiwiciowe, ruchliwe i maja wymiary 1,7 X 1$ //.82396 Obserwacji dokonywano po 21 dniach rozwoju w temperaturze 30°C. Oznaczenie ISP odnosza sie do srodowisk hodowlanych International Strepto- myces Project (Shirling i Gottieb). (tab. 3—5).Tablica 3 Cechy hodowlane Tablica 4 Fizjologia Drozdze — agar brzecz- | kowy (ISP No. 2) Agar Czapka Agar z maka owsiana (ISP No 3) Sole nieorga¬ niczne — skrobia (TSP No 4) Gliceryna — asparagina (ISP No 5) Gliceryna — glicyna Srodowisko Benneta Pasta pomido¬ rowa — maka owsiana Agar z tyrozyna Agar v z ekstraktem drozdzowym Glukoza — asparagina Jablczan wapniowy Agar z pozywka Agar \ Emersona Rozwój obfity. Jasno brunatny (13F8).Brak rozpuszczalnego pigmentu Rozwój obfity. Srodowisko po¬ maranczowe (10F7). Brak roz- ' puszczalnego pigmentu.Rozwój dosc doory. Srodowisko pomaranczowozólte (11B7). Brak rozpuszczalnego pigmentu.Rozwój obfity. Brunatnawopo- maranczowy. Pigment jasno- brunatny rozpuszczalny.Rozwój obfity. Srodowisko po¬ maranczowe (10P7). Pigment nierozpuszczalny Rozwój bardzo skapy (rzadki).Brak rozpuszczalnego pigmentu Rozwój dosc dobry Szarawo- n^zerwonawo^pomaranczowy (11A8). Brak rozpuszczalnego pigmentu.Rozwój obfity. Brunatno^poma- ranczowy (12B9). Pigment bru¬ natny rozpuszczalny.Rozwój dosc dobry. Lekko sza- rawo-zóltawo^brunatny (13B3).Brak rozpuszczalnego pigmentu Rozwój sredni. Silny zóltawo- -hrunatny (13H8). Pigment bru¬ natny rozpuszczalny.Rozwój obfity. Blado-pomaran- czowo-zólty (9E7). Brak rozpusz¬ czalnego pigmentu Rozwój bardzo skapy (rzadki).Brak rozpuszczalnego pigmentu Rozwój ubogi. Blado-pomaran- czowo-zólty (12B3). Pigment lek¬ ko brunatny rozpuszczalny.Rozwój sredni. Srodowisko bru¬ natne (7E11). Pigment rozpusz¬ czalny ciemno-czerwono-bru- natny. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Mleko odtluszczone: Redukcja azotanów: Zelatyna z pozywka: Wytwarzanie melaniny: Po 21 dniach nie wystapila ani koagulacja ani klarowanie.Pigment jasno-brunatny. dodatnia calkowite przejscie w stan ciekly po 21 dniach dodatnie na agarze z peptonem i zelazem (ISP No 6) po 24 go¬ dzinach Tablica 5 Wymaganie termiczne Agar z gliceryna i asparagina Rozwój sredni do obfitego w za¬ kresie od 26°—37°C.Brak rozwojiu w temperaturze 43^C.W tablicy 6 zestawiono wyniki z badan przy¬ swajania wegla, przeprowadzone ze szczepem Ac- tinoplanes sp. NRRL 3884, wytwarzajacym anty¬ biotyk A477. Podane w tablicy 6 symbole maja nastepujace znaczenie: -r- = wykorzystanie (+¦) = prawdopodobne wykorzystanie J—) '= watpliwe 'wykorzystanie —» = brak 'wykorzystania Tablici a 6 Wykorzystanie wegla przez Actinoplanes sp.NRRL 3884 Zródlo wegla Ramnoiza Geleibioza Celuloza i-inozytol melezitoza d-fruktoza. d^dekstroza Wska¬ zanie (+) (+) — — — -r- -r* Zródlo wegla Ksyloza mannit rofinoza sacharoza maltoza 1-arabinoiza * laktoza Wska¬ zanie -f- -f- — (-) (+) -7- ~S" Jak wspomniano wyzej, Actinoplanes sp. NRRL 3884 hoduje sie w pozywce hodowlanej w celu wy¬ tworzenia antybiotyku A477. Pozywka hodowlana moze byc którykolwiek z licznych srodowisk, jednakze ze wzgledu na oszczednosc produkcji, maksymalna wydajnosc i latwosc wyosabniania antybiotyku korzysniejsze sa niektóre srodowisika hodowlane. I tak na przyklad lieScstroaa jest jed-aym z najlepszych zródel weglowodanów, a maka sod jest najlepszym zródlem azotu.Nieorganiczne sole odzywcze, które wprowadza sie do srodowiska hodowlanego, to zwyczajne sale, zdolne do dostarczania jonów sodowych, potaso¬ wych, amonowych, wapnliowylch, fosforanowych, chlorkowych, siarczanowych, octanowych, wegla¬ nowych i podobnych. Z korzyscia stosuje sie do¬ datkowe zródla czynników wzrostowych, jak roz¬ puszczalne pozostalosci z destylacji spirytusu zbo¬ zowego i ekstrakty drozdzowe.Nalezy t^kze dodac do pozywki hodowlanej Ac- tinoplaineis sp. N.RRL 3884, jak to konieczne jest dla rozwoju i wzrostu innych mikroorganizmów, podstawowe pierwiastki sladowe. Te pierwiastki sladowe wprowadza sie zwykle w postaci przy- pac&owych zanieczylszczen innych skladników po¬ zywki.Poczatkowa wartosc pH srodowiska hodowlane¬ go moze zmieniac sie w szerokim zakresie. Jed¬ nakze pozadane jest, aby przed wysiewem orga¬ nizmu wartosci pH srodowiska hodowlanego do¬ prowadzic do 6,5—7,3 w zaleznosci od danej po¬ zywki. Koncowa wartosc pH okresla sie co naj¬ mniej czesciowo na podstawie poczatkowej war¬ tosci pH srodowiska, obecnych w srodowisku sub¬ stancji buforowych i okresu czasu, w którym na¬ stepuje rozwój organizmu.W celu wytworzenia pokaznej ilosci antybiotyku A~477 korzystnie prowadzi sie pod^owierzchniowa, aerobowa fermentacje w duzych zbiornikach. Male ilosci antybiotyku otrzymuje sie na drodze hodowli wstrzasanej w kolbkach. Z powodu opóznien w pro¬ dukcji antybiotyku, zwiazanych zwykle z posiewa- ntiem duzych zbiorników zarodnikami organizmu, korzystnie jest stosowac wegetatywny organizm inokululjacy. Otrzymuje sie go przez obsianie ma¬ lej objetosci pozywki hodowlanej zarodnikami lub sfcrzejpkami grzybni organizmu, przy czym powsta¬ je swieza, bujnie rozwijajaca sie hodowla. Na¬ stepnie przenosi isae ten wegetatywny organizm inokulujacy do wiekszego zbiornika, w którym srodowisko jest takie same, jak w duzych zbior¬ nikach, choc stosowac tez mozna inne pozywki ho¬ dowlane.Hodowle organizmu, wytwarzajacego antybiotyk A477, mozna prowadzic w zakresie temperatur 20°—40°C. Optymalna produkcje antybiotyku uzy¬ skuje sie w temperaturze okolo 30°C.Jak to przyjete jest w metodach hodowli aero- bowej podpowierzchniowej, do srodowiska hodo¬ wlanego doprowadza sie wyjalowione powietrze.Najlepszy rozwój hodowlli i wydajnosc antybiotyku uzyskuje sie przez doprowadzenie do zbiornika produkcyjnego powietrza o ilosci 0,1 objetosci na 1 objetosc srodowiska. hodowlanego w ciagu 1 mi- mity.Aktywnosc antybiotyczna mozna sledzic w czasie fermentacji przez prteeprowadzenie badan próbek bulionu fermenitecyjnego na orffainizniach, wrazli¬ wych na ten antybiotyk. Jako wskaznik stosuje sie Bacillus subfciiliJs, a test biologiczny mozna dogod¬ nie przeprowadzic na plytkach agarowych w pró¬ bie z krazkiem bibuly. 10 Ogólnie maksymalna wydajnosc antybiotyku uzyskuje sie po 2—fi dniach fermentacji w caazym zbiorniku lub w kolbie Wstrzasanej. Maksymalna aktywnosc antybiotyku osiaga sie zwykle po 48—49 5 godzinach. lAtnbiotyk A477 mozna odzyskac z srodowiska hodowlanego i oddzielic od innych, ewentualnie ¦obecnych substancji metodaimi ekstrakcji i adsorp¬ cji. Metody adsorpcji do odzyskiwania antybiotyku 10 A477 sa chwilowo korzystniejsze, poniewaz w pro¬ cesach tych nie stosuje sie duzych ilosci rozpusz¬ czalników, jakie wymagane sa przy ekstrakcji. Od¬ powiednim adlsorbentam do wydzielania antybioty¬ ku z przesaczonego bulionu hodowlamego jest we- 15 igiel, chociaz inne powszechnie stolsowane adsor¬ benty daja równiez zadawalajace wyniki. Substan¬ cje antybiotyczna, zwiazana ze srodkiem adsorbu- jacyim, odzyskuje sie przelz zwykle wyeluowanie.Dalsze oczyszczanie antybiotyku A477 przeprowa- 20 dza sie metoda adsorpcji i eluowania, stosujac ma¬ terialy adsorpcyjne, jak zywica poliamidowa, tle¬ nek glinowy, zel filtracyjny itp. Do oczyszczania antybiotyku mozna stosowac takze zywice jonitowe.¦Przytoczone przyklady wyjasniaja wynalazek, nie 25 ograniczajac jego zakresu.Przyklad I.A. fermentacja antybiotyku A477 w kolbie so wstrzateiamej..Hodowle Actinofrlanes sp. NRRL 3084 prowa- idzi sie na sikosie agarowym o nastepujacym skla¬ dzie: 35 40 50 podigotowana maka owsiana drozdze K2HP04 imafberial mineralny Czapka1) aigar woda zdejonizowana 00,0 g 2,5 g 1,0 fi 25,0 g 25,0 g 1 litr i) Material mineralny Czapka ma natetepuiaey sklad: Skladnik 45 KCL MgS04.7H20 FeS04.7H^0 100 g 1100 g 2 g rozpuszctzonie w 2 m (stezonego HO woda zdejonizowana I litr Wartosc pH srodowiska doprowadza sie do 7,3 roztworem wodorotlenku sodowego. Po wyjalo¬ wieniu przez utrzymywanie w autoklawie w tem¬ peraturze 120^C w ciagu 30 minut pod cisnieniem 55 6,795—9,06 kg wartosc pH srodowiska wynosi 6,7.Skos agarowy obsiewa sie Actinojplanes sp.NRRL 3884 i infeubuje w temperaturze 30°C w ciagu 7—10 dni. Porost grzybnidwy pokrywa sie wyjalowiona woda destylowana i pow&eraachnie w skosu zgarnia sie w celu uwolnienia organizmu.Poniewaz w ozalsie hodowli nie powstaja zarodni¬ ki, pozadane jest, aby zmacerowac grzybnie spla¬ szczonymi, zaostrzonymi iglami inokulujacymi w celu powiekszenia liczby potencjalnych osroji- « ków rozwoju. Polowe wytworzonej w ten sposób11 hodowli zuzywa sie ido obsiewu 50 ml srodowiska wegetatywnego o nastepujacym skladzie: 82396 12 glukoza skrobia (maka sojowa drozdze Ca 003 woda wodociagowa 10,0 g 20,0 g 20,0 g 2,0 g 2,0 g 1,1 litra Obsiane srodowisko wegetatywne inkubuje sie w ciagu 72 godzin w temperaturze 30°C na Wstrza- saczu obrotowym o szybkosci obrotów 250/min. 10 ml mieszaniny fermentacyjnej sitosuje sie do obsiewu wegetatywnego srodowiska rozwojowego drugiego stadium o nastepujacym skladzie: glukoza 10 g dekstryna ziemniaczana 20,0 g imakasojowa 20,0 g autolizowane drodze browarniane 3,0 g CaCo3 4,0 g woda wodociagowa 1,1 litra To obsiane srodowisko inkuibuje sie w ciagu 48 godzin w temperaturze 30^C na wstrzasacizu obro¬ towym o szybkosci obrotów 250/min. Srodowisko wegetatywne z itego drugiego stadium stosuje sie do obsiewu 30 ml wyjalowionego srodowiska pro¬ dukcyjnego, umieszczonego w 250 ml kolibie stoz¬ kowej, posiadajacego nastepujacy sklad: dekstroza skrobia mannit (maka sojowa autolizowane drozdze browarniane Ca003 woda wodociagowa do 1 litra l,0°/o 2,0°/o l,0°/o 1,5% 0,1% 0,2% Obsiane srodowisko znajdujace sie w kolbie stozkowej poddaje sie fermentacji w temperaturze 30°C w ciagu 72—120 godzin na Wstrzasaczu obro- towytm o szybkosci obrotów 250/min. Koncowa wantosc pH wynOsi 7,0^7,5.B. Fermentacja antybiotyku A477 w zbiorniku Posteruje sie, jak opisano wyzej, lacznie z wy¬ twarzaniem srodowiska wegetatywnego drugiego stadium. 200 ml tego wegetatywnego srodowiska stosuje sie do obsiewu 25" litrów wyjalowionego srodowiska produkcyjnego o nastepujacym skla¬ dzie: Skladnik dekstroza 1,0% skrobia 2,0% mannit 1,0% makasojowa 1,5% autolizowane drozdze browarniane 0,1% CaCQ3 0,2% srodek przeciwdzialajacy pienieniu 0,02% woda x 25 litrów 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Wartdsc pH srodowiska wynosi 7,3—7,4 po wy¬ jalowieniu przez utrzymywanie w autoklawie w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut pod cis¬ nieniem 6,795—9,06 kg. Obsiane srodowisko pro¬ dukcyjne znajdujace sie w 45 litrowej kadzi fer¬ mentacyjnej pozostawia sie do sfermentowania w temperaturze 30°C na okres 5 dni. Srodowi¬ sko napowietrza sie wyjalowionym powietrzem z szybkoscia pól Objetosci powietrza na objetosc srodowiska hodowlanego w ciagu 1 minuty. Brzecz¬ ke fermentacyjna miesza sie zwyklym mieszadlem o szybkosci Obrotów 500/minute.C. Wyosabnianie antybiotyku A477 Caly bulion fermentacyjny z dwóch 25 litrowych kadzi, w których odbywala sie hodowla z posie¬ wu wyzej opisanym sposobem, laczy sie i dodaje do niego 5 n roztwór wodorotlenku sodowego do¬ prowadzajac wartosc pH bulionu do 10,5. Nastepnie caly bulion przesacza sie przy uzyciu pomocnicze¬ go materialu filtracyjnego i placek filtracyjny z grzybnia zawiesza sie w wodzie i miesza w cia¬ gu 1 godziny. Potem przesacza sie grzybnie i od¬ rzuca placek filtracyjny. Przesacze laczy sie, otrzy¬ mujac w calosci 66,5 litra. Wartosc pH polaczo¬ nych przesaczy doprowadza sie do 8,0 za pomoca 3 n kwasu solnego. Przesacze te przepuszcza sie przez kolumne, zaladowana weglem granulowanym (oczka sita 12X40) w wodzie. Kolumne przemywa sie 15 litrami wody i odcinek odrzuca. Nastepnie przemywa sie ja 20 litrami wodnego roztworu kwasu solnego o wartosci piH=i2,5 i odciek rów¬ niez odrzuca. Potem kolumne eluuje sie 4 litrami roztworu acetonu i wody (1:1), którego wartosc pH doprowadzono do 2,0 za pomoca 3 n kwasu solnego. Wartosc pH eluatu doprowadza sie do 7,5—8,0 za pomoca 5 n roztworu wodorotlenku sodowego. Eluat o aktywnosci antybiotyku A477 zageszcza sie do pojemnosci 1700 ml, po czym za¬ geszczony eluat poddaje sie adsorbcji na kolumnie o rozmiarach 7X60 cm, zawierajacej zywice poli¬ amidowa przemyta woda.Kolumne z zywica poliamidowa eluuje sie 8 li¬ trami wody i zbiera sie eluat w kilku frakcjach.Frakcje o aktywnosci antybiotyku A477 laczy sie i zageszcza do malej objetosci. Do tego koncen¬ tratu dodaje sie 4 objetosci metanolu, po czym taka sama objetosc eteru w celu wytracenia an¬ tybiotyku A477. Odsacza sie go i suszy otrzymu¬ jac 14 g.Dodatkowa ilosc antybiotyku odzyskuje sie przez wymycie kolumny poliamidowej roztworem me¬ tanolu i wody (1:1). Eluaty o aktywnosci antybio¬ tyku A477 laczy sie i zagejszcza do malej objetosci.Do otrzymanego koncentratu dodaje sie 4 objetosci (metanolu i przez dodanie takiej samej objetosci eteru wytraca sie antybiotyk. Odsacza sie go d otrzymuje dodatkowe 3,0 g antybiotyku.Przyklad II. Oczyszczenie antybiotyku A477 przy uzyciu tlenku glinowdgo. Postepuje sie w spo¬ sób podany w przykladzie I czesc C dla wyosab- niania antybiotyku A477 przez eluowanie kolumny z weglem. Wartosc pH eluatu doprowadza sie do 7,5^8,0 za pomoca 5 n roztworu wodorotlenku so-13 dowego, po czym izageszcza sie eluat do objetosci 200 ml. 100 ml tego zageszczonego eluatu o aktywnosci antybiotyku A477 podaje sie do kolumny o wy¬ miarach 2,7X80 cm, zawierajacej przemyty kwa¬ sem tlenek glinowy, upakowany w wodzie. Na¬ stepnie kolumne iprizeimywa sie 2 litrami metanolu i odciek metanolowy odrzuca sie. Frakcje wykazu¬ jace aktywnosc antybiotyku A477 wyeluowane z kolumny wodnym metanolem (1:1) laczy sie i za¬ geszcza do sucha. Sucha pozostalosc rozpuszcza sie w 100 ml wodnego metanolu (1:1) i otrzymany roztwór dodaje sie do 2 litrów acetonu w celu wy¬ tracenia oczyszczonego antybiotyku A477. Wydaj¬ nosc 2,2 g.Przyklad III. Wytwarzanie chlorowodorku antybiotyku A477. 500 mg antybiotyku A477, wy¬ tworzonego wedlug przykladu II, rozpuszcza sie w 20 ml 50% wodnego roztworu metanolu. War¬ tosc pH roztworu doprowadza sie 1 n HC1 do 1,5.Otrzymany roztwór dodaje sie mieszajac do 400 ml acetonu, przy czym wytraca sie chlorowodorek antybiotyku A477. Wytracony osad odzyskuje sie przez odsaczenie i suszy sie go. Otrzymuje sie 420 mg chlorowodorku antybiotyku A477.Przyklad IV. Wytwarzanie pikrynianu anty¬ biotyku A477. Do roztworu 500 mg antybiotyku A477 w 20 ml wody dodaje sie 20 ml nasyconego wodnego roztworu kwasu pikrynowego. Mieszanine odstawia sie na noc w temperaturze 5°C. Powsta¬ je zólty osad, który odsacza sie, otrzymujac 505 mg zóltego pikrynianu antybiotyku A477.Przyklad V. Wytwarzanie chlorowodorku A477 z pikrynianu antybiotyku A477. Do roztworu 505 mg pikrynianu antybiotyku A477 w 25 ml me¬ tanolu dodaje sie 1 n kwas solny do uzyskania wartosci pH roztworu wynosizaceij 1,5. Powstaly kwasny roztwór dodaje sie mieszajac do 500 ml eteru etylowego w celu wytracenia chlorowodorku A477. Powstaly osad odsacza sie i suszy, otrzy¬ mujac 422 mg chlorowodorku antybiotyku A477.Przyklaid VI. Wytwarzanie wolnej zasady antybiotyku A477 z chlorowodorku A477. Roztwór 500 mg chlorowodorku antybiotyku A477 w 20 ml wody przepuszcza sie przez zywice jonitowa (OH), umieszczona w szklanej kolumnie o wymiarach 14 1X10 cm. Odciek zbiera sie i kolumne wymywa woda. Wodne eluaty i poczatkowy odciek laczy sie i odlparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do su¬ cha. Pozostalosc rozpuszcza sie w 20 ml 50% wod- 5 nego roztworu metanolu i mieszajac dodaje do 400 ml acetonu w celu wytracenia wolnej zasady antybiotyku A477. Powstaly osad odsacza sie i su¬ szy, otrzymujac 225 mg antybiotyku A477. 10 Przyklad VII. Wytwarzanie siarczanu anty¬ biotyku A477. Roztwór 500 mg chlorowodorku an¬ tybiotyku A477 w 20 ml wody przepuszcza sie przez kolumne o wymiarach 1 cm X 10 cm, zawie^ raljaca zywice jonitowa w cyklu hydroksylowym. 15 Kolumne przemywa sie woda, laczy frakcje ak¬ tywne i zageszcza je do sucha. Otrzymana sucha pozostalosc rozpuszcza sie w 20 ml 50% roztworu wodnego metanolu. Wartosc pH roztworu dopro¬ wadza sie do 1,5 za pomoca In H2S04 i zakwa- 20 szony roztwór dodaje sie do 400 ml acetonu. Po¬ wstaje osad siarczanu antybiotyku A477, który od¬ zyskuje sie przez odsaczenie. Wydajnosc 331 mg.Przyklad VIII. Wytwarzanie soli oranzu ime- 25 tylowego z antybiotykiem A477. Do roztworu 500 mg antybiotyku A477 w 20 ml wody dodaje sie 20 ml nasyconego roztworu oranzu metylowego w wodzie. Powstaly roztwór pozostawia sie na noc do calkowitego wytracenia sie soli oranzu metylo- 30 weigo z antybiotykiem A477. Odzyskuje sie ja przez odsaczenie, po czym susizy, otrzymujac. 521 mg produktu. PL PL