DE2039184A1 - Neues Antibioticum und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

BIi Lilly and Qonrpany« Indianapolis. Indiana. V.St.A Neues Antibioticum und Verfahren zu aeiner Herstellu:"

Die Erfindung betrifft das neue Antibioticum A 16884 und seine Salze mit antibakterieller und anthelmintischer Aktivität und ihre Herstellung durch Fermentation von Streptömyces lipmanii NRRL 3584*

Antibioticum A 16884 ist ein neues Antibioticum, das durch Fermentation eines bisher nicht beschriebenen Antibioticum A 16884 produzierenden Stamms von Streptomyces lipmanii erzeugt wird. Die Salze von A 168°4 sind leicht durch Umsetzung von A 16884 mit einer geeigneten Säure oder Base erhältlich. Antibioticum A Ίόββφ und seine Salze weisen antibakterielle und anthelmintisehe Aktivität auf. .Die antibakterJeLle Aktivität besteht sowohl gegen gramnegative.als auch grampositive Organismen sowie gegen pflanzenpathogene Organismen.

Gegenstand der Erfindung ist Antibioticum A 16884 oder ein SaIs davon, dessen Monoammoniumsalz durch folgende Eigenschaften ausgezeichnet ist: weiße amorphe Substanz, zersetzt sich bei etwa 180 Grad C, sehr löslich in Wasser, löslich in Dimethyleulfoxid, achwach löslich in niederen Alkanolen und unlöslich in Afce>bnitril·;

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BADORiGlMAl,

amphoter, vier titrierbare Gruppen vom PK¹B₁ = 3,9; pK^fa₂ = 5,3; PlCa₃ = 9,2 und PK¹B₄ = 10,5

bei Titration in 66 #-igem Dimethylformamid bei einem Anfangs-pH-Wert von 5,8; ein aus Titrationswerten ermitteltes scheinbares Molekulargwicht von etwa 435; ungefähre Zusammensetzung: 44,01 # Kohlenstoff, 5,73 $> Wasserstoff, 10,65 # Stickstoff, 31,27 $> Sauerstoff, 6,86 i* Schwefel; spezifischer optischer Drehwert £KJ _D =

\ +140,9° (C = 1 ^ Gew./Vol. in Wasser) als Mineralölsuspension folgende unterscheidbare Banden in seinem Infrarotabsorptionsspektrum bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron: 3,18 (breite Bande), 5,66, 6,26, 6,57 6,89, 7,15, 7,23, 7,40, 7,73, 8,00, 8,14, 8,79, 9,24, 9,65, 9,79 und 10,40; positive Testreaktionen mit Ninhydrin-, Pan Dutscher-, Benedict-, Molisch-, Jodin- und Dansylchlorid-Reagens und negative Restreaktionen mit Fehling-, Perrichlorid-, Biuret- und Sakaguchi-Reagens. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von wie oben definiertem Antibioticum A 16884, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Antibioticum A 16884 produzierenden Stamm von Streptomyces lipmanii NRR13582

I in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen

für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Bedingungen züchtet, bis eine beträchtliche Menge A 16884 von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium produziert worden ist.

Antibioticum A 16884 ist ein schwefelhaltiges Peptidantibioticum mit einem amphoteren Molekül.

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".'ie bei vielen Antibiotica produzierenden Kulturen i'ührt .iie. Fomentation eines Antibioticur A 16884 produzierender. Stamms von Streptomyces 1 ipmanii zur Bildung nehrerer ontibiotiacher Substanzen. Anti-Viotin-.ir. A 16.?34 ist eine dieser Substanzen. Die anderen Substanzen-" sind entweder verhältnisnU3ig unbeständig oicT nur in sehr kleinen Kengen vorhanden.

Antibioticum A 15664 kann als solches oder als Salz, 2Uir. Beispiel als Säureadditionraalz oder als Salz mit einer« Kation, angewandt werden. Bei Salzen mit einem 'Ki.tion kann das 3alz entweder ein Kono- oder ein Lisalz seir.. KMufir wird e;s bevorzugt, Salze direkt in Reini- £ur.--svürfahren hernustellen, so daS das Antibioticum so, -vie es isoliert wird, in'Sal-ifori^ vorliegt. Antibioticum A 1G884 ist in dic-por Weise isoliert worden und wird uue dieser. Grund hierin als !ionoanmoniumsalz iden-

Dae I'.or.oarr.oriiunsCilz von Anwibioticun: A 16884 ist ein weiter anorpher Feststoff, zereetst sich bei etwa IFC CJrad C, ist sehr löslich in 'Vasser, löslich in Uir.othylsul:'oxid (D:*3C)_f schwach löslich in niederen Alkanolen und-pra>:t⁴.-ch ur.lr.-lich in Acetonitril und anderen organischer. Lösun^rr^ittcln. Ter oben angegebene "ort für den spezifischer, optischen Drehwert er. arr.r.oniur.salzes von Antibioticur. A 16894 bezieht siah auf r*.as coi F.aurtenperatur ir. Vaktjun: über wasserfreier. Calciumchlorid etwa 15 Stunden lang getrocknete Salz.

Die elektronetrische Titration des I'onoaowoniucsalzes von Antibioticum A 15664 in einer 66 "J-i DiiaetV^lforraanid-Wasser-Löeung bei einem Anfanps-

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pH-Wert von 6,6 ergab die Anwesenheit von vier titrierbaren Gruppen: .

PlCa₁ ■ 3,5; pK«a₂ = 5,2; und pK'a, = 9,2; und pK'a = 10,3.

bei einer ähnlichen, jedoch mit einem Anfangs-pH-Wert von 5,8 durchgeführten Titration einer jüngeren Probe betrugen die entsprechenden Werte :

PlCa₁ = 3,9; pK'a₂ = 5,3; PlCa₃ = 9,2; und PlCa₄ = 10,5.

Wenn das Monoamraoniumsalz von Antibioticum A 16884 in die Säureform übergeführt wird, verschwindet der pK'a-Wert bei 9»2. Das aus den Titrationswerten berechnete Molekulargewicht des Monoammoniumsalzes beträgt etwa 435.

Die Elementaranalyse des im Vakuum bei etv/a 80 Grad C über Phoophorpentoxid getrockneten Konoair<monlumsalzea von A 16884 lieferte folgende Werte:

Element 1»

Kohlenstoff 44,01

Wasserstoff 5,73

Stickstoff 10,65

Sauerstoff 31,27

Schwefel 6,86

Die Analyse liefert einen Methoacylgehalt von 6,64 # und einen Acetylgehalt von 9,23 %> und ein Van-Slyke-Test auf Aminostickstoff ergibt 5»09 %.

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·■■■;. - 5 -

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Monoammoniumsalzes von Anti"bioticum A 16884 in einer Mineralölsuspension ist in Figur 1 der "beigefügten Zeichnung dargestellt. Die unterscheidbaren Banden des Infrarotspektrums im Bereich von 2,0 "bis 15,0 Mikron sind wie oben angegeben.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16884 in wässriger Lösung zeigt Absorption smaxima bei 242(EJj_n = 126) und 625 ψ .(E^J_n* 158). Der Circulardichroismus wurde ebenfalls in wässriger lösung gemessen und ergab einen positiven Cotton-Effekt bei 263Mi und einen negativen Gotton-Effekt bei 236 rau .,

Die Papierchromatographie des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16884 auf Whatman-Papier Nr. 1 ergab einen R^-Wert von 0,79 in einem Lösungsmittelsystem aus Propanol, Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis 1 : 1 : 1. Bioautogramme wurden durch Auflegen des Papierchromatogramms auf Agarplatten erhalten, die mit empfindlichen Organismen, zum Beispiel Salmonella gallinarum, als Testorganismen beimpft waren.

Das MR-Spektrum von A16884 in DgO wies folgend© Charakteristica auf : 5,16 ppm.(1H,Singulett); 4,86, 4,68 ppm. (2H, AB Quartett, J = 12,5 Hz); 3,9-3,7 ppm. (1H, Multiplett); 3,67, 3,29 ppm. (2H, AB Quartett, J 18 Hz); 3,53 ppm. (3H, Singulett); 2,6-2,3 (2H, Multiplett); 2,10 ppm. (3H, Singule tt); 2,1-1,6 ppm. (4H, Multiplett).

Eine Papierchromatographie des Monoammoniumsalzes

wurde auch in anderen Lösungsmittelsystemen mit folgenden

Ergebnissen durchgeführt:

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Solvent-Syatem R^- "/ert

ÄthanoliWasser (80:20) mit 1,5 i* Natriumchlorid, Papier mit 1n Natriumsulfat imprägniert . 0,58

Methanol:PropanolsWasser (6:2:1), Papier mit 0,75 » Kaliumphosphat» pH 4,0,

gepuffert 0,21

. Propanol:PyridineEssigsäure:Acetonitril:

* Wasser (45:30:9:40:36) 0,40

tert.-Amylalkohol:Aceton:Wasaer (2:1:2) 0,40

Äthylacetat:Essigsäure:Wasser (3:1:1) 0,36

^K Methyläthylketon:Wasser (92:8)_£ Papier mit

\ 0,1 η Hatriumacetatj, pH 4*6₉ gepuffert keine Wanderung

Propanol j Wasser (70:30) 0,30

mit Wasser gesättigtes Butanol keine Wanderung

mit Wasser gesättigtes Butanol plus 2 %

p-Toluolsulfonsäure 0,60

Bei Dünnschichtchromatographie des Monoammoniumsalses von A 16884 auf Kieselaäuregelplatten in 70 $-igem wässrigem Acetonitril unter Anwendung einer Ninhydrinsprühung als Nachweismittel weist es einen R_f-Wert von etwa 0,47 auf.

Auf Celluloseplatten in 70 #~igem wässrigem AcetonitriLmit

der gleichen Hachweismethode wird ein H^-Wert von 0,45

ι X

gefunden.

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«— 7 «· ■■■■■■-.."

Sine nach der Spacknian-Moore-Stein-Technik durchgeführte Anino8aureenaly.ee eines Säurehydrolysats von Antibioticum A 16834 ergibt zwei ninhydrinreaktive Banden, von denen eine nit Glycin identisch.'eluiert wurde (0'_f'758yüMol/mg) und die andere unmittelbar vor Glycin eluiert und als alpha-Arinöadipinsäure identifiziert wurde (2,39 »Mol/mg). Bei einer ähnlichen Analyse r.it einer späteren Probe betrugen die gefundenen Werte 0,49juMol/og bzw. 1,2yuAiol/mg.

V.iX dem Antibioticum A 16F?84 wurden verschiedene qualitative chemische Testreaktionen durchgeführt. Antibioticum A 16884 ergibt eine positive sestreaktion mit Ninhydrin-, Pan-Dutscher-, Benedict-, Molisch-, Jod- und Daneylchlorid-Reagens, jedoch nicht mit Fehling-, Ferriehloria-, Biruet und Sakaguchi_Reagen8.

Das !.'onoasEoniunsalz von Antibioticum A 16884 ist bei pt- 3.bis 9 bei 5 Grad C 8 Tage beständig, bei pH 3 bis 9 bei 25 Grad C verhältnismäßig beständig (4 Tage) und bei verschiedenen pH-Vi'erten bei 100 Grad C unbeatänMg (innerhalb 5'-Kinuten;). Die biolocische Aktivität geht bei pH 3 bis 9 bei einer Temperatur von 37 Grad 0 langsam verloren, wobei die Hälfte der Aktivität nach 4Tagen verschwunden

ist.: ^: ;..■■ ^: ■■■■■■■ ^:

Antibioticun A 16884 hat hemmende Wirkung auf das Wachstum von grannnpositiven und graErirtegativen Bakterien. Die liengen, in denen partiell gereinigtes Konoammoniumsalz von Antibioticum A 16884 inhibierende Wirkung auf das Wachstum von beispielhaften Organismen zeigt, sind in Tabelle I angegeben. Die Hemmkonsentrationen wurden nach dem Agarveräünnun5stest odernach dem Brüheverdünnungetest (in der Tabelle durch die Buchetaben "a.d·" bbw. "b.d·¹·

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- 8 bezeichnet) ermittelt»

. Bei dem Agarverdünnungstest wird der Testorganismus auf eine Reihe von Agarplatten aufgestrichen, die verschiedene Konzentrationen des Monoammoniumsalzes von Antibioticum A 16 884 enthalten, um die minimalen Konzentrationen in mcg/ml (Micrograma pro Milliliter) im Agarsubstrat. die das V/achstum des Organismus für eine Zeit von 48 Stunden ( bei den pflanzenpathogenen Organismen Stunden) hemmen, zu ermitteln«

Bei dem BrüheverdUnnungstest wird eine Reihe von Reagensgläsern, die Nährbrühe mit verschiedenen Konzentrationen des Ammoniumsalzes von Antibioticum A 16884 enthalten, mit dem Testorganismus inokuliert, us die minimale Konzentration dea Monoammoniumsalzes von A 16884 in der Brühe in mcg/ml zu ermitteln, die das Wachstum der Organismen für eine Zeit von etwa 20 Stunden hemmt.

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a bell e

Testorganismus

Escherichia coli EC 0127 Proteus PR6
Proteus PR4

Salmonella typhimuriura Salmonella typhosa T63 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3150 Pseudomonas aeruginosa X239 Salmonella flexneri SH3 Klebsiella aerobacter Kl Klebsiella aerobacter KA14 Mycobacterium avium X85 Streptococcus pyogenes C203. Bacillus subtilis X12,1 Neurosp'ora sp. M45-846 Sarcina lutea X186 Sscherichia coli EC0127 Klebsiella aerobacter KA14 Salmonella typhosa SA12

Hemmkonzentration	a,d.
mcg/ml	a.d.
6,25	a.d*
1,56	a.d.
3,12	a.d.
3,12	a.d.
1,56	a.d.
50,00	a.d.
>50,00	a.d.
>50,00	a.d.
6,25	a.d.
6,25	a.d.
1,56	a.d.
>50,00	a.d.
3,12	a.d.
3,12	a.d.
>50,00	b.d.
6,25	b.d.
7,80	b.d.
.15,60
31,20

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Bei keinem dieser Tests wurde eine Bindung durch
Pferdeserum festgestellt.

V/ie aus der vorstehenden Tabelle zu ersehen ist, weist Antibioticum A16884 als Monoamraoniumsa3z Aktivität
gegen grampoaitive und gramnegative Bakterien auf.

Ferner wurde höher gereinigtes Monoammoniumsalz von Antibioticum A 16884 auf antibakterielle Aktivität in einem Test unter Anwendung der oben beschriebenen Brüheverdünnungsmethode geprüft. Die Ergebnisse, angegeben als Mindestmenge in Mikrogramm pro Milliliter, die für eine Inhibierung erforderlich ist, sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Organismus 12 Stunden 24 Stunden

Streptococcus pyogenes C203 64 ' 128

Staphylococcus aureiis 3053 128 ^128

Escherichia coll ECH 8 8

Klebaiella aerobacter sp KA14 8 16

Proteus sp. P16 HD* 8

Proteus sp. PR17 2 8

Salmonella typhosa SA12 ND* 4

Salmonella typhimurlum S4 MfD* 4

Pasteurella multooida P3 HD* 2

Shigella sonnia I SH1O HD* 16

*HD ■ - nicht bestimmt

Antibioticum A16884 und seine Salze zeichnen sich ferner durch Aktivität in vivo gegen eine Reine der oben genannten Organismen aus und sind daher zur Bekämpfung von Infektionen, die von solchen Organismen in tierischen Wirten verursacht werden, vorteilhaft. Partiell gereinigtes Antibioticum

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* til

■■■■■- -. IT - - ;

A1-6884 als i'onoaniRoniumsalz weist einen EDcQ-V/ert von 23 Eg/kg in Mäusen, die nit Proteus PR6 infiziert sind, und einen 2DcQ-Y«ert von 33,8 mg/kg in Mäusen, die mit Shigella SH3 infiziert sind, auf. Höher gereinigtes A 16884 als I.'onoamsoniunsalz weist einen EDcQ-Wert von 3,64 mg/kg in I'äuaen, die mit Escherichia coli ECI4 infiziert sind, einen 'SBrQ-Vr'ert von 23 mg/kg in Mäusen, die mit Salmonella typhosa GA12infiziert sind, und einen EDcQ-Wert von 93»4 rag/kg in Zäunen, die mit Klebaiella pneumoniae Kl. infiziert sind, auf. Die Verabreichung erfolgte auf subkutanem Wege.

• ■ ■ . .

".'ie oben erwähnt ,zeigta! Antibioticum A 16804 und seine Salze außer anibakterieller Aktivität anthelmintisehe Aktivität. Daher können Antibioticum A 16884 oder Salze davon an Warmblüter zur Bekämpfung verschiedener innerer Parasiten, besonders Kagen und DarmwUrr.ern, zum Beispiel Aeoaris lumbricoides ver. suum, Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera, Syphacia obvelata und dergleichen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf oralem ■Wege., beispielsweise durch Zusatz von Antibioticum A 16884 oder eines Salzes davon zu Tierfutter, durch Verabreichung von Tabletten, "ranken und dergleichen, die A 16884 oder ein Salz davon enthalten, oder durch andere KaSnahmen. Im allgemeinen sind Dosierungen von 1 bis 500 mg pro kg Körnergewicht oder mehr bei Verabreichung in Sinzeldosen wirksam. Wenn Antibioticum A 16684 oder ein Salz davon als Bestandteil eines normalen Putters zugeführt wird, liefern Konzentrationen von 0,0001 bis 0,05 £ oder mehr gute Ergebnisse. Ein bevorzugter Konr.entrationsbereich für Antibioticum A 16884 oder ein Salz davon in Futtermitteln beträgt 0,01 bis 0,05 ?t.

Die anthelmintische Aktivität von Antibioticum A 16884 wird durch folgende Teste erläutert:

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In einem ersten Test wurde Antibioticum A 16884-Monoammoniumsalz als Einzeldoais mit einer Schlundsonde an je zwei Mäuse ve·abreicht, die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata (Madenwürmer) infiziert waren. Die Dosis betrug 500 mg Antibioticum A 16884-Monoammoniumsals pro kg Körpergewicht des einzelnen Tiers und wurde als Suspension in physiologischer Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,125 i<> Methylcellulose als Sucpendiermittel verabreicht. Bei dem Test wurde ferner eine Kontrollgruppe aus Mäusen , die mit Aspiculuris tetraptera und Syphacia obvelata infiziert waren, verwendet. Beide Gruppen wurden nach Verabreichung der Dosis an die behandelte Gruppe 48 Stunden unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurden alle Mäuse getötet und auf Gegenwart und Zahl von Madenwürmern untersucht. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

Tabelle III

Zahl von Madenwürmern pro Tier

Aspiculuris Syphacia

I tetraptera obvelata

Kontrolle 26 52

500 mg/kg Antibioticum

A 16884 Monoammonium-

salz 0 2,5

In einem anderrn Test wurde Antibioticum A 16884-Monoammoniumsalz mit Standard-lläusefutter zu mehreren behandelten Futtermitteln vermischt, die Antibioticum

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A 16884-Monoammoniumsalz in Konzentrationen von - 0,005, 0,01 und 0,05 Gewichtsprozent enthielten. Die Futtermittel wurden als Nahrung für getrennte Gruppen von Mäusen mit jeweils 5 Mäusen pro Gruppe verwendet« Etwa 24 Stunden nach der ersten Verfütterung wurden die Mäuse mit Ascaris lumbricoides var,·suum ova infiziert. Eine weitere Gruppe von 5 Mäusen wurde als Kontrollgruppe mit dem Putter ohne Wirkstoff gefüttert, jedoch zur gleichen Zeit ebenfalls mit Ascaris lumbricoides var. suum in-" fiziert. Alle Gruppen wurden 10 Tage lang mit ihrem jeweiligen Futter gefüttert und unter normalen Laboratoriumsbedingungen gehalten. Dann wurde allen Mäusen das Futter entzogen. Am 11. Tag wurden sämtliche Mäuse abgetötet, und die lungen wurden auf Gegenwart und, falls vorhanden, die Zahl von Lungenverletzungen durch Ascaris lumbricoides var. suum. untersucht.

Die Menge an Antibioticum A 16884-Monoammoniumsalz im Futter und die durchschnittliche Zahl von Lungenverletzungen pro Tier in jeder Gruppe sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Tabelle IV

Gruppe durchschnittliche Zahl von Lunpenschäden pro Gruppe

Kontrolle . 2,2

0,005 $ Antibioticum A 16884 Monoammoniumsalz 0 5

0,01 fo Antibioticum A 16884 Monoammoniumsalz q 4.

■0,05 fi Antibioticum A 16884 Monoammoniumsalz 0 4

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Antibioticum A 16884 kann durch Züchten eines neu aufgefundenen und bisher nicht beachriebenen Mikroorganiamenatarama, der aus Bodenproben isoliert wurde, die aus Südamerika stammten, erzeugt werden.

Der Mikroorganismus wurde aus diesen Bodenproben folgendermaßen isoliert: Anteile der Bodenproben wurden in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspensionen wurden auf Nähragar aufgestrichen. Die angeimpften Nähragarplatten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 35 Grad C inkubiert. Nach beendeter Inkubationsdauer wurden Kolonien des Antibioticum A 16884 produzierenden Mikroorganismus mit einer sterilen Platinschlinge auf Agar-Schrägkulturen .überfuhrt. Die Agarschrägkulturen wurden dann zur Gewinnung geeigneter Mengen Inokulum für die Produktion von Antibioticum A 16884 inkubiert·

Der Actinomycetentstamm» der erfindungegemäfl zur Produktion von Antibioticum A 16884 verwendet wird, wurde als Stamm von Streptctmyces lipmanii Waksman und Curtis klassifiziert.

Der neue Mikroorganismus, der Antibioticum A 16884 zu bilden vermag, wurde ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe bei der Kulturensammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (früher Northern Regional Research laboratories), Peoria, Illinois 61604 ständig hinter-

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legt und ist von dort für jedermann unter der Kultur-Nummer NRRL 3584 erhältlich.

Die charakteristischen Merkmale von Streptonyceo lipmanu-NRRL 3584 sind in den folgenden Tabelle angegeben. Es wurden die Methoden, die für das International Streptomyces Project (Shirling et al., »»Methode for Characterization of Streptomyces Species"/Intern. Bull. Systematic Bacteriol. 16: 313-340 /"|966_7 für die Charakterisierung von Streptomyces-Species empfohlen wurden, zusammen ir.it einigen zusätzlichen Teste angewandt. Farbna^en wurden nach der ISCC-NBS-Methode erteilt, die von Kelly et al. in "The ISCC-NBS-Metnod of Designating Colors and a Dictinoary of Color Names" (U.S. Department of Commerce Giro. 553_t Washington, D.H.- 1955) beschrieben wurde. Buchstaben in runden Klammern beziehen sich auf die Parbreihe nach Tfeener und Backus color series (Tresner at al., "System of Color Wheels for Streptoayce8 Taxonor.y ", Appl. Microbiol. 11: 335-338/~1963_7, Parbplättchen-Bezeichnungen eind unterstrichen. Die Parbblocks nach Maerz un3 Paul .("Kao-rs! et al., Dictionary of Color (KcGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950) sind in eckige Klammern gesetzt. Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen 14 Tage bei 30 Grad C wachsen gelassen.

109809/ 2 2 A 2-

beobachtete Eigenschaft Morphologie

Kiiturcharakteristica auft

ISP No. 2 (Hefe-Kalzextrakt-Agar)

ISP No. 3 (Hafermehl-Agar)

ISP No. 4 (anorganische Salze und lösliche Stärke-Agar)

ISP No. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar)

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Tabelle V Charakteristica von A 16884

Sporophoren sind gewöhnlich gerade bis gewellt mit gelegentlicher Hakenbildung; Sporen sind kurz, cylindrisch, 0,5-1,5yu x 1,0-2,5yu , und treten gewöhnlich in Ketten von^/3-10 und gelegentlich 10-50 auf. Sporenoberfläche glatt (im Electronenmicroscop).

Wachstum mäßig, Revers dunkel-grau-braun /~8H9_7 ; Luftmycel blaßgelb (Y) 2db*

Wachstum mäßig, Revers dunkel-grau-gelb /~~1354~~7» Luftmycel mäßig weiß (W) 13ba bis blaßgelb (Y) 2db.

Wachstum mäßig, Revers bräunlichgrau /~7C7""7; Luftmycel mäßig, blaßgelb (Y) 2db.

Wachstum reichlich, Revers hell-gelblich-braun

{~1317_7 » Luftmycel reichlich, grau-gelblich-rosa R) 5 de.

Wachstum reichlich, Revers grau-gelblichbraun /"15E8 7; Luftmycel reichlich, gelblichgrau · \\2i) 2ac.

Kulturcharacteristica auf: Emmerson-Agar

Bennett-Agar

Ta b e 1 le V (Forts.)

Characteristica von A 16884

Wachstum mäßig, Revere dunkel-grau gelblichbraun /~829_7i Luftmyeel und Sporen fehlen.

Wachstum reichlich, Revers mittel-gelblichbraun £" 14B7_7;Luftmycel reichlich, graugelb (R) 3ec.

Czapek-Agar Glucose-Asparagin-Agar

Tyrosin-Agar Nähr-Agar

Calciummalat-Agar Wachstum spärlich, weiß, spärliches Luftmycel (W) 13ba.

Wachstum reichlich, Revers graugelb /"12D4.J7; Luftmycel reichlich, gelblichgrau (GY)2ac.

Wachstun mäßig, Revers hell-gelblichbraun /"12C5...7; Luftmycel· reichlich, graugelb (R) 3ec.

Wachstum mäßig, Revers blaßgelb /""11C\J\ kein Luftmycel.

Wachstum mäßig, Revers schwarz 2f*56Cl_p_7; sehr epärliches Luftmycel,

Physiologie Wirkung auf Milch Nitratreduktion Melaninproduktion Pepton-Eisen-Agar Trypton-Hefeextrakt-Brühe

Temperaturanforderungen auf Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Reaktion von vegetativer Farbe auf pH-Änderung

0.05N HCl 0,05N NaOH

Tabelle V (Ports.)

Characteristiea von A 16884 Cmogulation, Peptonisierung· poeitiv

negativ negativ reichliches Wachstum und Sporulation bei 26°C und 30° Cj schwaches Wachstum bei 37⁰Ci kein Wachstum bei 43⁰C

bräunlich-graues Pigment wird rot. keine Änderung

Gelatineverflüssigung

In dor folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Kohlenstoffverwertungsteets angegeben, die mit dem Mikroorganismus NRRL 3584 durchgeführt wurden. In der Tabelle werden folgende Symbole verwendet!

J- » Wachstum und Verwertung

- « kein Wachstum, keine Verwertung.

T a b e 11 β VI

Kohlenstoffverwertungsspektrum für HRRL 3584 · Verbindung Wachstumsreaktion

L-Arabinose - Saccharose -

D-Xylose . x

D-Fructose -

Glucose a

Rhamnose -

Raffinose «

i-Inosit -

Kontrolle (kein Kohlenstoff) -

Wie oben erwähnt, kann Antibioticum A 16884 durch Züchtung von NRRL 3584 erzeugt werden. Ale Kulturmedium für die Erzeugung von Antibioticum A 16884 durch Züchtung · des oben beschriebenen Mikroorganismus können verschiedene Medien verwendet werden, da der Mikroorganismus verschiedene Energiequellen verwerten kann, wie aus den oben beschriebenen Verwertungstests hervorgeht. Zur Erzielung einer wirtschaftlichen Produktion, einer maximalen Auebeute an

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Antibioticum und einer leichten Isolierung des Antibioticums werden jedoch einige verhältnismäßig einfache Nährquellen bevorzugt. Beispielsweise enthalten die Medien, die zur Produktion des Antibioticums geeignet sind, eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, zum Beispiel Glucose, Stärke Glycerin, Melasse, Dextrin und dergleichen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose. Ferner enthalten verwendbare Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, zum Beispiel Sojabohnenmehl, Maisquellwasserfeststoffe, Hefe, Baumwollsamenmehl, Rindfleichextrakt, Peptone (aus Fleisch oder Soja), Casein, Aminosäurengemische und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl und Aminosäurengemische. Zu den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingebracht werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen und ähnliche Ionen liefern können.

Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum und eine optimale Entwicklung dee für die Erzeugung von Antibioticum A 16884 verwendeten Mikroorganismus erforderlich sind, können ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die zur Befriedigung des Wachstumsbedarfs des erfindungsgemäß verwendeten Actinomyceten ausreichen.

Dar Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann schwanken. Ee wurde jedoch gefunden, daß der Anfangs-pH-Wert dee Mediums zweckmäßig 6,5 bis 7,2 beträgt. Wie schon bei

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anderen Aotinomyceten beobachtet wurde, nimmt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumeperiode des Mikroorganismus, während das Antibioticum erzeugt wird, allmählich zu und kann einen Wert von 6,7 bie 7,5 oder darüber erreichen, wobei der End-pH-Wert wenigstens zum Teil von dem Anfangs-pH-Wert des Mediums, den in dem Medium vorhandenen Puffern und der Zeitdauer, während der der Organismus wachsen gelassen wird, abhängt·

Submers aerobe Kulturbedingungen sind die Bedingungen der Wahl für die Produktion von Antibioticum A 16884. Zur Erzeugung verhältnismäßig kleiner Mengen können Schüttelkolbenkultüren und Oberflächenkulturen in Flaschen angewandt werden. Zur Herstellung großer Mengen wird dagegen eine submers aerobe Kultur in sterilen Tanks bevorzugt. Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension Inokuliert werden.

Wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum beobachtet wird, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. Indem so die Wachstumsverzögerung vermieden wird, wird die Fermentationsvorrichtung besser ausgenutzt. Es ist daher zweckmäßig, zuerst durch Inoculieren einer verhältnismäßig kleinen Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Mikroorganismus ein vegetatives Inoculum zu erzeugen, und, wenn dann ein junges aktives vegetatives Inoculum erhalten worden ist, das vegetative Inoculum aseptisch in den großen Tank zu überführen. Das Medium, in dem das vegetative Inoculum erzeugt wird, kann entweder das gleiche Medium oder ein anderes als das Medium sein, das für die Produktion von Antibioticum A 16884 in großem Maßstab verwendet wird.

1 098öS/22U

Der Mikroorganismus, der Antibioticum A 16884 produziert, wächst in einem weiten Temperaturbereich von 25 bis 37 Grad C. Optimale Produktion von A 16884 findet offenbar bei Temperaturen von 26 bis 30 Grad C statt. Im allgemeinen erfolgt eine maximale Produktion des Antibioticums in etwa 36 bis 72 Stunden nach Inoculieren des Kulturmediums.

Wie es bei submers aeroben Kulturverfahren üblich iat, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Das Luftvolumen, das bei der Tankproduktion von A 16884 zur Erzielung eines vorteilhaften Wachstums des Mikroorganismus und einer wirksamen Produktion von Antibioticum A 16884 angewandt wird, beträgt 0,2 bis 0,4 Volumenteile Luft pro Minute und Volumenteil Kultur. Das bevorzugte Volumen beträgt 0,40 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium,

Die Konzentration an Antibioticumaktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums bezüglich ihrer hemmenden Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die in Gegenwart von Antibioticum A 16384 inhibiert werde^ verfolgt werden. Ea wurde gefunden, daß die Mikroorganismen Sarcina lutea und Salmonella gallinarum für diesen Zweck brauchbar sind, Die Prüfung der Proben kann nach der allgemein bekannten turbidometrischen Methode oder Agardiffusionsmethode durchgeführt werden.

Im allgemeinen findet eine maximale Produktion von A 16884 bei submers aerober Kultur oder Schüttelkolbenkultur in 1 bis 3 Tagen nach Inoculieren dee Kulturmediums statt.

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Die während der Fermentat ion von A 1(5884 erzeugte antibiotisehe Aktivität findet eich in dem '"flüssigen Anteil der Fermentationsmiechung. Daher eind die bei der Produktion von A 16884 angewandten Isolier-.- ' methoden so ausgelegt, daß sie eine maximale Gewinnung des Antibioticum.8; aus der Brühe ermöglichen. So werden beispielsweise Mycel und ungelöste Feststoffe aus der Permentatlonsbrühe durch übliche Maßnahmen, zum BeΙο piel durch Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt, und Antibioticum A. 16884 kann aus der filtrierten oder zentifugierten Brühe durch Anwendung einer Extraktionsoder Absorptionstechnik gewonnen werden.

Für die Gewinnung von A 16884 durch Absorptionsmethoden können verschiedene Adeorbentien, zum Beispiel Kohle, Kieselsäuregel oder Aluminiumoxid, und Ionenaustauschharze verwendet werden. Antibioticum A 16884, wie es aus der Fermentation erhalten wird, kann je nach den Fermentationsbedingungen entweder in amphoterer Form oder in Salzform vorliegen. Unabhängig von seiner Form kann es auf einem der oben genannten oder ähnlichen Adsorbentien aus einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel adsorbiert .,erden. Das adsorbierte Antibioticum A 16884 oder Salz kenn dann von dem Adsrobens durch geeignete Elutionsmethoden, zum Beispiel durch Waschen des Adsorbens, auf demdas Antibiotlcums A 16884 oder ein Salz davon adsorbiert ist, mit einem Lösungsmittel, eluiert werden. Wenn das Eluieren durch Waschen mit einer Lösung von beispielsweise Ammoniumformiat oder Natriumacetat durchgeführt wird, wird Antibioticum A 16884 als Ammonium- bzw. Natriumsalz eluiert· Solche Salze lassen sich leicht durch übliche Methoden wieder in Antibioticum A 16884 überführen. In dem oben beschriebenen

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Gewinnungsverfahren kann auch mikrokristalline Cellulose als Aderobens verwendet werden.

Andere Salze von Antibioticum A I6S84 als Ammonium- oder Alkalimetallsalz werden vorzugsweise durch übliche Umsetzung von Antibioticum A 16884 in unmodifizierter amphoterer Form mit der betreffenden Säure oder Base hergeptellt. So wird zur Herstellung von Säureadditionssalzen Antibioticum A 16884 mit einer anorganischen oder organischen Säure umgesetzt. Zu geeigneten Säuren gehören beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Benzoesäure, Sulfaminsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure und Glycolsäure.

Antibioticum A 16884 bildet ferner Salze mit Kationen bei Umsetzung von A I6884 in unmodifizierter amphoterer Form mit anorganischen und. organischen Basen und Salzen, Beispielhaft für diese Salze sind Ammoniumsalze und substituierte Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, zum Beispiel mit Natrium, Kalium, Lithium, Cäsium und Rubidium, Erdalkalimetallsalze, zum Beispiel mit Calcium, Strontium und Barium, und Salze mit anderen Metallen, zum Beispiel Aluminium, Kupfer, Zink, Magnesium und Silber. Bei organischen Basen kommt es nicht auf die verwendete Base an, jedoch wird im allgemeinen eine Baße mit einem pH-Wert von 3,0 oder darüber in Wasser bevorzugt. Zu Beispielen für geeignete organische Basen gehören Benzylamin, Methylamin, Diäthylamin, Triäthylamin, Procain, Diieopropylamin, Äthanolamin, Cyclohexylamin, Dicyclohexylamin, Diphenylamin, Di-n-butylamin, Chinolin und Pyridylamin.

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Die pharmazeutisch annehmbaren Salze von Antibioticum A 16884 werden im allgemeinen bevorzugt. Alle Salze

sind Jedoch ale Zwischenprodukte bei der Produktion/ Abtrennung und Reinigung von Antibioticum A 16884 brauchbar. Pur therapeutische Zwecke sind kationische oder anionische pharmazeutisch annehmbare Salze dem Antibioticum A 16884 im allgemeinen gleichwertig. Manch mal werden jedoch bestimmte Salze wegen einer vorteilhaften Eigenschaft, zum Beispiel Jöslichkeit,die sie durch die Salzbildung erhalten, bevorzugt. .

i «

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

Beispiel 1 Schüttelkolbenproduktion von Antibioticum A 16884

Eine sporulierte Kultur von Streptomyces lipmaniiHRSL 3584 wird erzeugt, indem man den Mikroorganismus auf einer Nähragarschrägkuitur mit folgender Zusammensetzung wachsen läßt: ! ■ I ■..·■■

Dextrin ; TO₁OOg

Hefeextrakt · ' ' 1,00 g.

hydrolysiertes Casein ("N-Z Amine-Type A,"

Sheffield Chemical . .

Company) . ₄ i,00 g

Rindfleischextrakt . 1,00 g

Jfeer-Agar (dreimal geh)

feerAga waschen) 4eionisiertee Wasser

20,00 g v 1 Liter

Der pH-Wert des Mediums wird durch Zuaata von Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt.

Das Schrägagarmedium wird mit Sporen von Streptomyces lipmanii NRHI 3584 inoouliert und 6 Tage bei 30 Grad 0 inoubiert» J)ann wird die Agar-Schrägkultur mit sterilem destilliertem Wasser bedeckt und gelinde abgeschabt, um die Sporen und Zellen als wässrige Suspension zu entfernen. 1 »1 der erhaltenen Suspension wird zum Inooulieren von jeweils 100 ml eines vegetativen Mediums mit folgender Zusammensetzung verwendet!

Glucose	15,00	&
Sojabohnenmehl	15,00	6
Maisquellwaseerfeet-
stoffe	5,00	&
Calciumcarbonat	2,00	S
Natriumchlorid	5,00	&
deionisiertes Wasser	1 Liter

Der pH-Wert des vegetativen Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 6„7 eingestellt.

Das vegetative Inoculum wird 36 Stunden bei 30 Grad C auf einer Hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") bei 1o8 UpM geschüttelt. Das so erzeugte Inoculum wird dann wie folgt für die Produktion von A 16884 verwendet«

Es wird ein Produktionsmedium mit folgender Zusammensetzung bereitet!

24-4

Sojabohnenmehl ' 15,00g

Casein 1,00 g

Natriumnitrat «. 3,00 g Glucoseslrup ·

(50 5t Glucose) 20,00 g

Leitungswasser 1 Liter

Jeweils 100 ml des Produktionsmediuma werden in 500 ml Erlenmeyerkolben gegeben, die 30 Minuten bei 120 Grad C eterilieiertf werden. Nach Abkühlen wird jeder Kolben nit einem 5 '/—igen vegetativen Inoculum inoouliert. Der Formentationoanoate wird 72 Stunden bei 30 Grad 0 auf . einer RotationeachUttelvorrichtung geschüttelt, die mit 250 UpM betrieben wird. Während der Fermentation wird das Medium mit steriler Luft belüftet, die mit 0,4 VcLAol./Kin. zugeführt wird. Di« Isolierung wird im wesentlichen so durchgeführt, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist·

Beispiel 2

Antibioticum A 16884 wird nach der Arbeiteweise von Bei· spiel 1, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediums mit folgender Zusammensetzung, erzeugt:

Distillers·■ Solubles (Hadrlsol) Sojabohnenmehl (Nutrieoy 200D) Erdnußmehl Melasse ( wie zur Herstellung von

dunklem Likör "Blackstrap")

Hafermehl

Glycerin

Leitungswasser

5,00	g
5,00	g
5,00	g
5,00	g
5,00	g
10,00	g
1 Liter

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Ferner wird statt einer Rotationeschüttelvorrichtung eine hin- und hergehende Schüttelvorrichtung verwendet, die mit 108 Ausschlägen pro Minute · . betrieben wird.

Beispiel 3

Antibioticum A 16884 wird nach der Arbeitsweise von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Produktlonsmediums folgender Zusammensetzung, erzeugt:

Hafermehl 20,00 g

Glycerin 10,00 g

Leitungswasser 1 Liter

Beispiel 4

Antibioticum A 16884 wird' nach der Arbeitsweise von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Produktionsmediume folgender Zusammensetzung, erzeugt:

Baumwollsamenmehl	20,00 g
Glycerin	10,00 g
Glucose	5,00 g
Leitungswasser	1 Liter

Beispiel 5

Antibioticum A 16884 wird nach der Arbeitsweise von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung eines Produktions·

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mediums folgender Zusammensetzung, erzeugt:

Glucose , 20,00 g

lösliche Stärke 10,0O g

Pepton (Wilson's 159) 30,00 g

hydrolysiertes Casein

("N-Z amine-type A,^M

Sheffield Chemical Co.) 4,00g

Magnesiumsulfat-

heptahydrat 5,00 g

Natriumcarbonat 2,00 g

leitungswasser 1100 ml

B e i s ρ i e 1 6

Eine weitere sporulierte Kultur von Streptomyces lipmahii NRRI 3584 wird durch Züchtung des Mikroorganismus auf einer Nähragarsehrägkultür erzeugt. Das Medium hat in diesem Fall folgende Zusammensetzung:

Dextrin	10,00 g
Baumwollsamenmehl .	10,00 g
Hefeextrakt .	1,00 g
Meer-Agar ,	25,00 g
Deionisiertes Wasser	1000 ml

Der pH-Wert des Mediums wird durch Zugabe von Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt.

Das Sohrägagarmedium wird mit Sporen von Streptomyces lipmanii NRRL 3584 inoculiert und 7 Tage bei 30 Grad C incubiert. Dann werden die Schrägagarkultüreii abgeschabt,

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um Sporen zu entfernen, die zu 2,0 ml eterilem Rinder-8erum gegeben werden. In eine eterile Gefriertrocknungsampulle werden dann 0,1 ml der erhaltenen Serumaporenauspension überführt und zu Pellets gefriergetrocknet.

Die so erhaltenen gefriergetrockneten Pelleta werden zum. Inooulieren eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Glucose	5,00	g
Dextrin	10,00	S
Bacto-trypton	5,00	g
Hefeextrakt	5,00	g
Magnesiumsulfat«
heptahydrat	2,00	g
Deioniaiertes Wasser	1 liter

Der pH-Wert des Mediums beträgt 6,7 und wird nicht anders eingestellt·

Beispiel 7 Pilotproduktion von Antibioticum A 16884

In einem 40 Liter-Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl werden 24 Liter eines Mediums ait folgender Zusammensetzung gegeben:

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Antifoam A (ein Entschäumer der Firma Dow Corning) 0,20 g

Glucose . 5,00 g

Dextrin 700 50,00 g

Sojabohnenschrot 25,00 g Melasse (Blackstrap) 3,00g Kaliumblphosphat 0,25 g Calciumoarbonat 2,50g

kaltes Leitungswasser auf 25 Liter

Der Anfangs-pII-Wert beträgt 6,5 und wird nicht eingestellt. Das Medium wird 30 Minuten bei 120 Grad C sterilisiert, abgekUhlt und dann mit einem wie in Beispiel 6 erzeugten 5 jt-lgen vegetativen Inoculum in-.-oculiert. Die Fermentation wird 66 Stunden bei 30 Grad C unter Belüftung mit steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,35 VoI,Aol./Min. und Durchmischen durch einen mechanischen Rührer, der mit 420 UpIf betrieben wird, durchgeführt. Der ind-pH-Wert betragt 7,5.

A 16864 wird aus der Brühe nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Isolierverfahren gewonnen.

Be is pi el 8

Isolierung von rohem Antibioticum A 16884 als Monoammonium-

ealz

. ■·.■■■■

Etwa 60 Liter wie in Beispiel 7 erhaltener Brühe werden mit Hilfe von HyfIo Super-cel (eine Diatoeeenerde der Firma Johns-Manville -Produkte Corporation) filtriert.

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Das FiItrat wird liber eine 9_t6 χ 150 cm-Kolonne mit Kohlefüllung (Pittsburgh CaI. 12 χ 40, von der Firma Pittburgh Activated Carbon Co.) geleitet. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bia der Abfluß farblos ist, und die an der Kohle adsorbierte Aktivität wird durch Durohleiten von 50 5^-igem wässrigem Aceton durch die Kolonne entfernt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden vereinigt, zur Entfernung des Acetone im Vakuum eingeengt und auf eine 5,9 x 104 cm-Kolonne aufgegeben, die mit IRA-68 Harz (Formiat-Form) (ein Ani_ onenauetauschharz der Firma Rohm and Haas Co.,das zur Umwandlung des Harzes in die Formiat-Form mit Ameisensäure gewaschen ist) gefüllt ist. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß klar und farblos ist, und die Aktivität wird durch Waschen mit 0,1 m. Ammo- , niumformiatlöeung entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine 4,3 χ 72 cto-Kolonne mit Kohlefüllung (Pittsburgh 12 χ 40) aufgegeben. Die Kolonne wird mit dem 6-fachen Kolonnenvolumen Wasser gewaschen, und die Aktivität wird mit 30 #-igem wässrigem Acetonitril eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung von Acetonitril im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 25 bis 30 g Feststoff. Das gefriergetrocknete Präparat wird in der Mindestmenge Wasser gelöst und auf eine 7,2 χ 60 cm-Kolonne mit einer Füllung aus einem mikrokristallinen Celluloeeprodukt (Avicel der FMC Corporation), das in 70 ^-igern wässrigem Acetonitril suspendiert und vor Zugabe der aktiven Probe mit Acetonitril gewaschen wurde, aufgegeben. Nach Auftrag der Probe wird die Kolonne mit einem Kolonnenvolumen Acetonitril gewaschen, und die Aktivität wird mit Methanol eluiert· Die aktiven Fraktionen werden

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vereinigt und auf etwa 200 ml eingeengt. Bei Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton fällt die Aktivität aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute beträgt 9 bis 12 g.

20 g Material ·, daa in der oben beschriebenen Weise erhalten' wurde, werden in der Mindestmenge Wasser gelöst und auf eine 7,2 χ 60 cm-Kisselgelkolonne aufgegeben. Das Kjsselgel (Sorte 950, Erzeugnis der Firma Davison Chemical), wurde vorher mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und zur Füllung der Kolonne in -70 $-igem Acetonitril suspendiert. Nach Auftrag der Probe wird die Kolonne mit einem Kolonnenvolumen Acetonitril gewaschen, und die Aktivität wird mit 70 jS-igem Ace/fconitril eluiert. Die aktivsten Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum zur Trockne eingeengt und in Methanol gelöst. Die Aktivität wird mit 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuumrgetrocknet. Die Ausbeute beträgt 8 g. Weniger aktive Fraktionen liefern weitere 6 g. _t ' · ,■■■■;

Beispiel 9 Reinigung von A 16884-Monoammoniumsalz

1 g eines gefriergetrocknetes wie in. Beispiel 8 hergestellten Präparats wird in 4 ml Wasser gelöst und auf ...'■ eine 2 χ 60 cm-Kolonne aufgegeben, die mit 175 ml Kieselgel Sorte 950 in .'80 #-igem wässrigem Acetonitril gefüllt wurde. Die Kolonne wird mit Acetonitril/Wasser (4:1) eluiert. Die Elution wird durch Testproben

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und Fapierchromatographie verfolgt· Als Ergebnis der Elution wird eine Vielzahl von Fraktionen erhalten. Die Fraktionen, die Antibioticum A 16884 als Monoammoniumsalz enthalten, werden vereinigt, zur Trockne eingeengt, in einem kleinen Volumen Dimethylsulfoxid dann in mehreren ml Äthanol gelöst, und die Aktivität wird durch Zugabe von viel Äther abgeschieden. Der Niederschlag wird zentrifugiert und im Vakuum getrocknet. ¹He Ausbeute an Antibioticum A 16884 Monoammoniumsalz beträgt 91 mg«

Beispiel 10 Herstellung der Säureform von Antibioticum A 16884

200 mg des Monoammoniumsalzee von A 16884 werden in 30 ml Wasser gelöst, und es werden 6 ml Dowex 50 jt-'12 (H+) Harz (Erzeugnis der Fä^Dow Chemical Co.) zugesetzt. Die Mischung wird 30 Minuten lang gerührt, anschließend filtriert, das Harz wird auf dem Filter mit Wasser gewaschen, und die Filtrate werden vereinigt. Das vereinigte Filtrat hat einen pH-Wert von 2,7. Das FiItrat wird im Vakuum auf etwa 1 ml eingeengt, 4 ml Methanol werden zugesetzt, und die Säure wird durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet, wodurch 35 mg Antibioticum A 16884 in der Säureform erhalten werden. Das Produkt weist bei Titration in 66 #-igem Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 4,5 pK'a Werte von 3,5» 5,2 und 10,3 auf.

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Be i β ρ ie 1 11 Herstellung des Dinatriumsalzes von A 16884

180 mg A 16884-Monoammoniumsalz werden in etwa 2 ml Wasser gelöst, und'der pH-Wert wird mit 1 η NaOH «auf 10 eingestellt. Die Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, 4 ml Methanol werden zugesetzt, und das Dinatriumealz wird durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt. Das Salz wird abzentrlfugiert und in Vakuum getrocknet. Es weist bei Titration in 66 jC-igem Dimethylformamid mit· einem Anfangs-pH-Wert von 10,4 pK'a-Werte von 3»9, 5,2 und 10,5 auf und ergibt bei Analyse durch Atomabsorptinsanalyae 6 jC Natrium.

Beispiel 12

Herstellung von Antibioticum A 16884-hydrochlorld

200 mg A 16884 Monoammoniumsalz werden In Z ml Wasser gelöst und mit 1 η HGl auf pH 2,0 eingestellt. Dann wird die Reaktionsmischung mit 5,0 ml Methanol verdünnt und zur Abscheidung de^ gewünschten AntibioticumsA 16884-Hydrochloridsxait 5« al Aceton versetzt. Der Niederschlag wird, abzentrixugiert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Analyse ergibt 5*74 i> Chlor, und bei elektrometrischer Titrationin 66 jUigem Dimethylformamid mit einem Anfanga-pH-Wert von 5,0 ' werden titrierbare Gruppen bei 3_t9# 5*2 waA 10,4 gefunden.

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Beispiel 13

Isolierung von rohem Antibioticum A 16884 als Mono-

natriumealz

Etwa 60 liter wie in Beispiel 7 erhaltene Brühe werden mit Hilfe von Hyflo-Super-cel. filtriert. Das Filtrat wird über eine 9,6 χ 150 cm-Kolonne mit Kohlefüllung (Pittsburgh CaI. 12 χ 40) geleitet. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß farblos ist, und die absorbierte Aktivität wird durch überleiten von 50 #-igem wässrigem Aoeton über die Kolonne entfernt. Die Fraktionen, die die Aktivität enthalten, werden vereinigt, zur Entfernung des Acetone im Vakuum eingeengt und auf eine 5,9 x 104 cm-Kolonne mit IRA-68_Püllung (Acetatform) aufgegeben. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen, bis der Abfluß klar und farblos ist, und die Aktivität wird durch Waschen mit 0,1 m Natriumacetat entfernt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und über eine 4,3 x 72 ca-Kolonne geleitet, die mit Pittsburgh CaI. (12 χ 40)Kohle gefüllt ist. Die Kolonne wird mit dem 6-fachen Kolonnenvolumen Wasser gewaschen, und die Aktivität wird mit 30 #-igem wässrigem Aoeton elulert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zur Entfernung des Acetons im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 20 bie 30 g. Die Analyse ergibt . 2,5 i» Hatrium.

Antibioticum A 16884 als Monoammoniumsalz wird auf seine Wirksamkeit zur Bekämpfung von pflanzenpathogenen Bakterien geprüft. Bei dieser Prüfung wird Antibioticum A 16884-Monoammoniumsal2 als wässriges Sprühmittel mit einer Konzentration von 400 Teilen pro Million, bezogen auf das Gewicht dee fertigen Mittels, zubereitet. Für die Prüfung werden 30 Tage alte Tomatenpflanzen mit

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2 Pflanzen pro Topf verwendet. Pflanzen in einem Topf werden mit der oben beschriebenen Lösung behandelt, an der Luft trocknen gelassen und dann mit einem Medium inoculiert, das ein aktives Wachstum von Pseudomonas solanacearum aufrechterhält· Die Pflanzen in dem anderen Topf werden mit einer wässrigen Sprühlösung besprüht, die mit der oben beschriebenen Behandlungslösung identisch ist, in der jedoch das Antibioticum fehlt, und dienen als Kontrolle. Die Kontrollpflanzen werden ebenfalls anschließend inoculiert. Alle Pflanzen werden 24 Stunden in einer feuchten Kammer gehalten, dann herausgenommen und 7 Tage unter guten AgrikulturbedingURgen gehalten, Nach Ablauf dieser 7 Tage werden alle Pflanzen auf das Vorliegen, und, falls vorhanden, das Ausmaß der Infektion untersucht. Die Pflanzen, die mit Antibioticum A 16884-Monoammoniumsalz behandelt wurden, grind von Symptomen der Krankheit, die durch Pseudomonas solanacearum verursacht wird, vollständig frei, während di,e Kontrollpflanzen etarke durch Peeudomonas solanacearum hervorgerufene Symptome aufweisen.

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Claims (4)

1. Antibioticum A 16884 oder ein Salz davon, deesen I'onoammoniumsalz durch folgende Merkmale gekennzeichnet ist: weiße amorphe Substanz, Zersetzung bei etv/a 18C Grad G, sehr löslich in V/asser, löslich in Dimethylsulfoxid, schwach löslich in niederen Alkanolen und unlöslich in Acetonitril; amphoter, bei Titration in 66 -/S-igem

P Dimethylformamid mit einem Anfangs-pH-Wert von 5,8, vier titrierbare . Gruppen mit

a₁ = 3,9; pK'a₂= 5,3; pK'a₅ = 9,2 und pK'a₄ = 10,5

aus Titrationswerten ermitteltes scheinbares Molekulargewicht von etwa 435, ungefähre Zusammensetzung 44,01 "fa Kohlenstoff, 5,73 % Wasserstoff, 10,65 i> Stickstoff, 31,27 # Sauerstoff, 6,86 $> Schwefel; spezifischer optischer Drehwert £dj |⁵ = +140,9° (0=1^ Gew./Vol. in Wasser); in seinem Infrarotabsorptionsspektrum einer Mineralölsuspension davon folgende unterscheidbare Banden bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron: 3,18 (breite Bande), 5,66, 6,26, 6,57, 6,89, 7,15, 7,28, 7,40, 7,73, 8,00, 8,14, 8,79, 9,24, 9,65, 9,79 und 10,40; positive Reaktion mit Ninhydrin-, Pan Dutscher-, Benedict-, Molisch-, Jod- und Dansylchloridreagens und negative Reaktion mit Fehling-, Perrichlorid-, Biuret- und Sakaguchi-Reagens.

2. Verfahren zur Herstelluni; /on Antibioticum A 16884 nach Anspruch 1, dadurch geks^-i/e Lehne t, daß man einen Antibioticum A 16884 produaierer len 3 ta an /m Str pto~ myces lipmanii NRRL 3584 in ^^a Kult urine i nisi, Ί&ώ

BAD ORtGINAL

assimilierbare¹ Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersaeroben Bedingungen züchtet, bis von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium eine beträchtliche Menge A 16ΒΘ4 produziert worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1_f dadurch gekennzeichnet, daß man das Kulturmedium bei einer Temperatur von etwa 25 Grad C bis etwa 37 Grad G hält und die Züchtung des Mikroorganismus etwa 36 bis 72 Stunden lang durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Kulturmedium Antibioticum A 16884 isoliert.

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