KR20010081515A - 프로디지오신의 당뇨병 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)에서 분리한 프로디지오신의 신규한 용도에 관한 것으로, 프로디지오신은 부작용이 없이 당뇨병 예방 또는 치료할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

프로디지오신의 당뇨병 예방 및 치료용 조성물{Novel use of prodigiosin for treating diabetes mellitus}

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)로부터 분리한 프로디지오신의 당뇨병 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

당뇨병 및 그의 합병증은 암, 신장순환기 질환과 더불어 전세계적으로 높은 사망률을 나타내는 질환이다. 미국의 당뇨병 협회의 보고에 따르면 현재에도 사망률이 지속적으로 증가하고 있다고 한다. 건강한 정상인에 비해 당뇨병에 걸린 환자는 안 질환, 신장질환, 심장질환 등의 합병증에 걸릴 위험성이 높다는 보고도 있다. 현재 인슐린 치료법에 의해 당뇨병의 급성증상 또는 치명적인 증상이 경감하고 있으나 장기간에 걸쳐 나타나는 증상에 대해서는 뚜렷한 효과를 나타내지 못하고 있다. 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병과 인슐린 비의존형 당뇨병으로 구분된다. 인슐린 의존형 당뇨병은 제 1 형 당뇨병으로 불리며 인슐린 비의존형 당뇨병은 제 2 형 당뇨병으로 불린다. 인슐린 의존형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장의 베타세포가 심하게 파괴되어 인슐린의 감소 및 hyperglycemia로 되는 특징을 가지고 있다.

인슐린 의존형 당뇨병은 수 년 동안 증상이 나타나지 않으며 이기간 동안 베타 세포는 파괴된다. 이기간 동안에는 혈중에서 인슐린에 대한 항체가 검출되며 베타 세포에 대한 항체도 검출된다. 이와 같은 결과로 인해 인슐린 의존형 당뇨병은 자가면역질환으로 간주되고 있으며 NOD 마우스 및 BB 랫드 등의 실험으로 확인되었다. 이 동물들은 인슐린 의존형 당뇨병을 자발적으로 일으키며 인간의 인슐린 의존형 당뇨병과 유사한 양상을 나타낸다. NOD 마우스는 자연적으로 인슐린 의존형 당뇨병을 나타내는 동물로서 12 내지 14 주령부터 발증을 시작하여 20 내지 24 주령에는 80% 이상의 발증을 나타낸다. 아직 밝혀지지 않은 원인에 의해 면역세포는 활성화되고 이들 세포는 췌도(pancreatic islet)로 침윤한다. 췌도에서 면역세포는 인슐린을 만드는 베타세포를 파괴하여 당뇨병을 유발하게 된다. 인슐린은 근육세포, 간세포, 지방세포 등에 작용하여 당대사를 촉진시키고 혈중 당농도를 낮추는 기능을 하는 물질이다. 그러나 베타 세포의 파괴에 의해 혈중 인슐린 양이 감소되면 근육세포나 지방세포의 당대사가 낮아져 당뇨가 유발된다. 많은 연구에 의해 베타 세포 항원(beta cell antigen), 대식세포(macrophages), Th 세포(helper T cells), 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells, CTLs) 등이 NOD 마우스의 당뇨발병에 관여하고 있다고 알려져 있으며, 면역세포에서 분비되는 사이토카인이나 유리기(oxygen free radical) 등이 베타 세포의 파괴에 관여하고 있다고 보고되었다.

스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 세라시아(Serratia) 속의 미생물들은 피롤릴피로메텐골격의 붉은색 물질들을 생산하는데 이들 중에는 프로디지오신, 메타사이클로프로디지오신, 프로디지오센, 데스메톡시프로디지오신, 프로디지오신 25-C등이 포함되어 있다. 이들 물질들은 항균제 및 항말라리아 등의 효과와 특히 프로디지오신 25-C는 면역억제작용이 있다는 것이 일부 알려져 있다. 프로디지오신의 분리법에 대해서는 본 발명자들에 의해 이미 보고하였다(특허출원 제 47869, 1997.9.20). 전라남도 목포지역의 갯벌 토양 시료를 증류수에 단계적으로 희석하여 미생물 분리배지 (Yeast extract 0.1%, polypeptone 0.5%, K₂HPO₄0.05%, KH₂PO₄0.05%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.02%, Agar 1.5%, pH 7.2)를 이용하여 균주를 분리했다. 분리배지에는 항생제(colistin 5㎎/ℓ 증류수)와 Nalidixic acid(10㎎/ℓ 메탄올)를 배지 1ℓ당 1㎖씩 넣어 만들었다. 분리한 균주를 세라시아 마르세센스 B-1231로 명명하고 1997년 9월 19일 생명공학연구소 유전자원센터에 기탁하였다(KCTC 0386BP). 면역억제물질을 생산하기 위하여 세라시아 마르세센스 B-1231을 1리터 용량 삼각 플라스크에 생산배지(가용성 전분1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘0.1%, 염화나트륨 0.3%, 초기 pH 7.0) 100 미리리터를 가하고 28℃에서 62시간 배양하였다. 활성물질을 추출하기 위하여 발효액과 동량의 에틸아세테이트를 가하여 30분간 교반한 후 유기용매층을 모아 감압하에서 농축하여 유상의 적색물질을 얻었으며, 그 후 실리카겔 컬럼에서 클로로포름:메탄올용액을 용매구배방법을 이용하여 활성물질을 분리정제하였으며, 실리카겔 박층 크로마토그라피를 이용하여 프로디지오신을 순수 분리 정제하였다(도 1).

인슐린 의존형 당뇨병의 연구는 예방 및 치료 분야에 집중하고 있다. 췌도염 방지 및 당뇨병 치료를 위한 연구가 NOD 마우스 등의 질환모델 동물을 중심으로 이루어지고 있으며, 대부분의 당뇨병 치료전략은 베타 세포 파괴를 방지하기 위한 면역반응 억제 및 조절에 집중하고 있다. 자가면역질환인 인슐린 의존형 당뇨병은 비정상적인 면역기능의 증강에 기인한다. 췌장의 베타 세포 파괴를 방지하기 위한 면역치료법이 다양하게 시도되고 있다. 신생아 흉선 제거법(neonatal thymectomy)은 T 세포를 제거하여 NOD 마우스에서 당뇨발병을 억제할 수 있다. 또한 T 세포에 대한 항체를 처리하여 T 세포를 제거하거나 대식세포를 제거해도 당뇨발병을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 면역세포에서 분비되는 NO 등의 유리기(free radical)의 생성 및 작용을 항 산화제를 사용하여 억제하여 당뇨를 억제할 수 있다는 보고가 있으며 니코틴아미드(nicotinamide), 비타민 E(vitamin E), 프로부콜(probucol), MDL29311, U78518F 등의 항 산화제가 보고되었다.

면역억제제를 사용하는 치료법은 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나 클루코코르티코이드(glucocorticoid)나 시클로포스파미드 (cyclophosphamide)를 이용한 당뇨병 치료는 유의한 효과를 나타내지 못하고 있으며, 최근 시클로스포린 A (cyclosporin A), 리파마이신(rapamycin), FK506을 이용한 당뇨병의 치료가 가능성을 제시하고 있지만 그 결과는 아직 확실하지 않다. 면역억제제를 사용한 치료법은 과도한 면역억제로 인해 2차 감염, 신장독성, 간 독성 등을 야기 시켜 당뇨병치료제로서의 사용에는 아직도 많은 문제점을 가지고 있다. 또한 장기간 투여에 의한 치료 시에는 암을 유발하는 경우도 있다. 최근 부작용을 나타내지 않고 인슐린 의존형 당뇨병을 치료할 수 있는 물질을 개발하려는 노력이 지속적으로 이루어지고 있는 실정이다. 당뇨병은 면역억제제를 사용하여 치료할 수 있지만 현재까지 알려진 면역억제제는 과도한 면역억제, 신장 독성, 간 독성 등의 부작용을 나타낸다.

본 발명자들은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)에서 분리한 프로디지오신이 상기와 같은 부작용이 없으면서 자가면역질환을 치료할 수 있는 새로운 면역억제제로 당뇨병 예방 및 치료효과를 규명하므로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 프로디지오신을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)로부터 분리한 프로디지오신을 NOD 마우스에 투여하여 당뇨병 예방 및 치료효과를 규명하고 사이토카인 생성억제능을 조사하여 프로디지오신의 당뇨병 억제 효과는 면역반응을 조절하므로써 이루어지는 것임을 확인하므로써 달성하였다.

도 1은 프로디지오신의 구조이다.

도 2는 프로디지오신 처리에 의한 당뇨병 예방 및 치료효과를 나타낸다. 뇨당(urine glucose)을 측정하여 당뇨병 마우스를 선발했으며 전체 마우스(10마리)에 대한 비율로 표시했다. 열린원(○)은 대조군의 NOD 마우스이고 닫힌원(●)은 프로디지오신 투여군의 NOD 마우스이다.

도 3은 프로디지오신 처리에 의한 혈당(blood glucose)의 감소를 나타낸다. NOD 마우스에서 플라즈마를 분리한 후 혈액 생화학분석기(Cibacorning, USA)를 이용하여 혈당을 측정했다.

도 4는 프로디지오신 처리에 의한 췌도염(insulitis)의 감소를 나타낸다.

도 5는 프로디지오신 처리에 의한 췌도염의 감소를 나타낸다. 대조군 NOD 마우스(A)는 심한 췌도염을 보이며, 프로디지오신을 처리한 NOD 마우스(B, C, D)에서는 췌도염이 감소했다.

도 6은 프로디지오신 처리에 의해 면역세포의 사이토카인 발현 양상이 변화되었음을 나타낸다. A는 당뇨발증이 없는 6 주령의 NOD 마우스의 결과이고, B는당뇨발증이 나타나는 11 주령의 NOD 마우스의 결과이고, C는 프로디지오신을 투여한 11 주령 NOD 마우스의 결과이다.

도 7은 프로디지오신이 부작용이 없음을 나타낸다. 프로디지오신을 처리한 NOD 마우스는 사망하지 않았으며 체중감소도 나타나지 않았으며(A), 신장독성도 나타나지 않았다(B).

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)로부터 분리한 프로디지오신을 NOD 마우스에 복강투여 하고 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 NOD 마우스의 뇨당과 비교하여 본 발명 프로디지오신이 당뇨병 발병 억제효과가 있음을 확인하는 단계; 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스와 투여하지 않은 NOD 마우스의 췌장에서 췌도염의 유발 정도를 측정 비교하여 본 발명 프로디지오신이 췌도염 억제효과가 있음을 확인하는 단계; 본 발명 프로디지오신은 NOD 마우스에 격일로 복강 투여하고 비장 세포를 분리하여 사이토카인 mRNA의 발현도를 측정하여 본 발명 프로디지오신이 면역세포의 사이토카인 생성을 조절하여 당뇨병 발병을 억제하는 효과가 있음을 확인하는 단계; 본 발명 프로디지오신을 투여하지 않은 NOD 마우스의 비장세포를 NOD.Scid 마우스에 이식하고 당뇨발병 양상을 측정하여 본 발명 프로디지오신이 면역반응을 조절하므로써 당뇨발병을 억제하는 효과가 있음을 확인하는 단계 및; 프로디지오신의 투여에 의한 NOD 마우스의 부작용을 몸무게 측정 및 사망율을 측정하여 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명자들은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)에서 분리한 프로디지오신을 이용하여 당뇨병 치료 효과를 규명하였다. 프로디지오신의 투여량은 10 mg/kg/day로 2일에 한번씩 복강으로 투여했다. 그러나 프로디지오신의 투여량, 투여방법 및 투여기간은 일정하지 않으며 당뇨병 증세에 따라서 조절할 수 있다.

프로디지오신은 NOD 마우스의 당뇨 발증을 완전히 억제하였다. 프로디지오신의 당뇨병 예방 및 치료효과는 뇨당량 및 혈당량을 측정하여 규명했다. 프로디지오신은 췌도(pancreatic islet)로의 면역세포의 침윤(Lymphocyte infiltration)을 억제하여 췌도염(insulitis)을 억제시켰다.

자가면역질환에는 T 세포 및 대식세포의 활성화가 중요한 역할을 한다. IL-2 및 IFN-gamma는 Th1 세포가 만드는 사이토카인으로 당뇨병을 유발하는데 중요한 기능을 한다. IL-2는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells, CTLs)을 활성화 시켜 베타세포의 파괴를 촉진시킨다. IFN-gamma는 대식세포를 활성화시킬 수 있으며 활성화 된 대식세포는 T 세포로의 항원제시기능(antigen presenting function)을 증폭시켜 당뇨병을 유발하며, 대식세포의 활성산소 등의 유리기 생산을 증가시켜 베타세포 파괴를 증가시킨다. IL-10 및 IL-4는 Th2 세포가 분비하는 사이토카인으로 이들 사이토카인의 발현이 증가하면 Th1 세포의 기능이 억제되어 궁극적으로 당뇨병을 약화시킬 수 있다. IL-6 및 IL-12는 대식세포가 발현하는 사이토카인이다. 특히, IL-12는 Th1 세포를 자극하여 IL-2 생성을 증가시키는 사이토카인으로 당뇨병을 유발하는데 중요한 기능을 한다. 프로디지오신은 NOD 마우스에서 당뇨병 발병에 중요한 기능을 하는 IL-2, IFN-gamma, IL-6, IL-12등의 발현을 억제했다으며 이것이 당뇨병발병억제의 주요한 원인으로 사료된다.

본 발명자들이 시험한 결과 프로디지오신은 부작용이 없이 당뇨병을 치료하는 효과가 증명되었다. NOD 마우스는 당뇨병에 의해 체중이 감소하고 당뇨발증 후 2주안에 사망한다. 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스는 체중감소를 나타내지 않았으며 사망동물이 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과는 프로디지오신이 당뇨병을 치료하여 동물의 사망을 방지하였고, 또한 프로디지오신 자체도 동물에 부작용을 나타내지 않았음을 나타낸다. 또한 프로디지오신은 신장독성, 간독성, 폐 독성 등을 전혀 나타내지 않았다.

NOD 마우스는 사람의 인슐린 의존형 당뇨병을 연구하는데 가장 좋은 질환모델동물이다. NOD 마우스는 자연적으로 당뇨병을 유발하며 당뇨병 증상이 사람의 경우와 매우 유사하다. 프로디지오신의 당뇨병 예방 및 치료효과는 NOD 마우스를 이용하여 증명하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정된 것은 아니다.

실시예 1. 프로디지오신 투여에 의한 당뇨병 예방 및 치료효과

프로디지오신은 8 주령부터 24 주령까지 10 mg/kg의 농도로 복강으로 투여했으며, 뇨당(urine glucose)은 유로페이퍼(EIken Chemical Co. Ltd., 일본)를 이용하여 매주 측정했다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군의 NOD 마우스는 15 주령부터 뇨당이 검출되기 시작하여 24 주령에서는 80%의 NOD 마우스에서 뇨당이 검출되었다(도 2). 프로디지오신을 투여한 실험군의 NOD 마우스에서는 뇨당이 검출되지 않아 당뇨병 발병을 완전히 억제했음을 알 수 있었다. 25 주령 째에 NOD 마우스의 안와 정맥에서 채혈한 후 플라즈마(프로디지오신asma)를 분리했으며 혈당량을 측정했다. 프로디지오신을 투여하지 않은 NOD 마우스의 평균 혈당양은 500 mg/dl로 당뇨가 발병하였음을 알 수 있었고, 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스의 평균 혈당량은 100 mg/dl로 정상수준의 혈당량임을 알 수 있었다(도 3). 이와 같은 결과는 프로디지오신이 NOD 마우스의 당뇨병을 예방 및 치료했음을 나타낸다.

실시예 2. 프로디지오신에 의한 췌도염(insulitis) 억제

인슐린 의존형 당뇨병에서는 면역세포의 췌도로의 침윤(lymphocyte infiltration) 및 이에 의한 베타세포의 파괴로 췌도염이 유발된다. 대식세포 및 T 세포가 주로 침윤을 하며 이들 면역세포는 베타 세포를 파괴한다. 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스와 투여하지 않은 NOD 마우스의 췌장을 분리하여 포르말린으로 고정했으며 조직표본을 만들었다. 헤마토자일렌/에오신을 이용하여 염색하였으며 면역세포의 침윤정도를 측정했다. 췌도염이 25, 50, 75% 유발되었을 때를 각각 1, 2, 3점으로 계산하여 평균 췌도염을 구하였다(도 4). 프로디지오신을 투여하지 않은 NOD 마우스의 췌도염은 2 이상으로 50% 이상의 침윤도를 보였으나 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스의 경우 췌도염이 1 정도로 25%의 침윤도를 나타냈다. 이와 같은 결과로부터 프로디지오신은 췌도로의 면역세포 침윤을 억제하여 췌도염을 감소시켰음을 알 수 있었다. 도 5에서는 병리검사 결과를 보여주고 있다. A는 약물을 투여하지 않은 NOD 마우스의 췌도염을 나타내는 것으로 면역세포가 대부분의 췌도에 침윤해 있음을 보여주고 있다. B, C, D는 프로디지오신 처리에 의해 면역세포 침윤이 감소되어 있음을 보여주고 있다. 이와 같은 결과는 프로디지오신이 췌도염을 억제하여 당뇨병 발병을 억제하였음을 나타낸다.

실시예 3. 프로디지오신에 의한 사이토카인 생성억제

당뇨병의 발병에는 Th 세포 및 대식세포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 알려지지 않은 기전에 의해 대식세포가 활성화되고 이 세포는 IL-12를 생성하게 된다. IL-12는 Th1 cell을 활성화 시켜 IL-2, IFN-gamma 생성을 촉진시키게 되며 이들 사이토카인은 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells, CTLs) 및 대식세포를 활성화시킨다. 활성화된 CTLs 과 대식세포는 베타 세포를 공격하여 파괴시키며 인슐린 생성을 감소시켜 당뇨병을 유발하게 된다. 이와 같이 다단계의 다양한 기전에 의해 베타세포는 파괴된다. 이와 같은 면역반응에서 사이토카인은 중요한 역할을 하고 있으며 사이토카인 생성을 조절하면 당뇨병을 치료할 수 있을 것으로 생각되고 있다. 도 6은 프로디지오신에 의한 면역세포의 사이토카인 발현 양상의 변화를 보여주고 있다. 프로디지오신은 NOD 마우스에 8 주령부터 격일로 복강 투여했다. 11주령 마우스에서 비장세포를 분리하여 사이토카인 mRNA 발현도를 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 측정했다. A는 6주령 NOD 마우스 경우이고, B 는 11 주령 NOD 마우스의 경우이고, C는 프로디지오신을 투여한 11 주령 NOD 마우스의 사이토카인 발현양상을 보여주고 있다. 6 주령 NOD mouse는 당뇨증상 및 췌도염이 없는 정상적인 상태이고, 11 주령은 췌도염이 시작되는 시점이다. 다시 말해서 11 주령 NOD 마우스는 면역기능이 비정상적으로 활성화되고 침윤이 시작되는 시점이다. 면역기능이 활발한 시점인 11 주령에 비장세포의 면역기능을 측정했으며 프로디지오신에 의한 조절양상을 측정했다. 11 주령 NOD 마우스에서 IL-2, IL-10, IL-6 mRNA 발현이 강하게 증가했다. 프로디지오신 처리에 의해 IL-2, IFN-gamma, IL-10, IL-4, IL-6, IL-12의 발현이 강하게 억제되었다. 이와 같은 사이토카인 발현의 감소는 베타 세포에 대한 자가면역반응을 억제시킬 수 있으며 당뇨병을 치료할 수 있다. 이상의 결과로부터 프로디지오신은 면역세포의 사이토카인 생성을 조절하여 당뇨병 발병을 억제하고 있음을 알 수 있다.

실시예 4. 프로디지오신의 부작용

프로디지오신을 8 주령부터 24 주령까지 투여한 NOD 마우스에서 약물의 부작용을 검사했다(도 7). 프로디지오신 투여에 의해 NOD 마우스의 몸무게는 감소하지 않았으며 이는 프로디지오신이 NOD 마우스에 부작용을 나타내지 않음을 나타낸다(도 7A). 프로디지오신을 투여한 NOD 마우스에서 신장, 간, 폐 등을 적출하여 헤마토자일렌/에오신 염색을 실시하여 병리검사를 실시했다. 도 7B에 나타난 바와 같이, 사구체 및 신세관은 정상이었으며 프로디지오신은 신장에 독성을 나타내지 않았음을 알 수 있다.

상기의 실시예를 통하여 프로디지오신은 자가면역반응을 억제하여 베타 세포의 파괴를 방지할 수 있는 당뇨병 예방 및 치료제임을 알 수 있었다.

이상의 실시 예에서 설명한 바와 같이, 세라시아 마르세센스에서 분리한 프로디지오신은 부작용이 없이 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있는 당뇨병치료제임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명은 당뇨병 환자의 질환치료과 관련한 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 세라시아 마르세센스에서 분리한 하기와 같은 구조식을 갖는 프로디지오신을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물.