JP2000515516A - ニコチン代謝の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害することを含む個体におけるニコチン代謝を調節する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ニコチン代謝の調節方法発明の分野 本発明は、個体におけるニコチン代謝の調節方法；個体におけるニコチン代謝 を調節するための組成物；個体においてニコチン代謝の制御が必要な容態を治療 する方法；個体においてニコチン代謝を調節する物質をスクリーニングする方法 ；及び個体においてニコチン代謝を評価する方法に関する。背景技術 ニコチンは、タバコ依存症が定着し且つ継続するのに重大な役割を果たす、タ バコ中に存在する主なアルカロイドである。幾つかの研究により、喫煙者は、一 定のニコチン血中レベル、従って脳内ニコチンレベルを試み且つ維持しようと自 分たちの喫煙行動を調節することが示されてきた。種々のニコチンを産生する紙 巻き煙草(Finneganら.，1945)、ニコチン置換治療[Lucchesiら.，(静脈注射)，1 967;Jarvikら.，1970(摂食);Kaslowskiら.，1975;Russellら.，1976;Ebertら.， 1984(ニコチンチューインガム)；Levinら.，1994(ニコチンパッチ)]、ニコチン 遮断(Stolermanら.，1973,Nemeth-Coslettら.，1986;Roseら.，1994)、及び尿中 pHの変化(Benowitzら.，1983;1985;Rosenburgら.，1980)を使用する研究は、典 型的な喫煙レベルの血中ニコチン濃度を超えないようにニコチン摂取を制御し得 ることを示した。これらの研究は、ニコチン血中レベルを調節するために喫煙者 による喫煙行動が修正される明白な証拠を提供している。従って、代謝的変化な どの、身体からのニコチンクリアランスにおける変化は、喫煙行動に顕著な影響 を与えることができる。 ニコチン及びその代謝物は、過去数十年間以上、広範囲にわたって研究されて きた。ニコチンは殆ど肝臓(80%)で代謝され、少量が肺及び腎臓で代謝される(Sc hielvelbein，1982;Turner，1975)。ニコチンの主な代謝産物はコチニンである( Benowitzら.，1994)。ニコチンは、主に２段階プロセス(図１)を介してコチニ ンに代謝される。該プロセスの第１段階では、中間体、ニコチン-△-^1'(5')イミ ニウムイオン(Peterson及びCastagnoli，1988，Williamsら.，1990)が産生し、 次いでこれは、肝臓ミクロソーム、Ｏ₂及びNADPHの存在下でサイトゾルのアルデ ヒドオキシダーゼ反応を介してさらに酸化される(Hillら.，1972;Petersonら.， 1987;Brandageら.，1979;Gorrodら.，1982)。 シトクロムP450(CYP)系は、ニコチンの代謝に密接な関係を有していた。ニコ チン代謝におけるCYP関与の証拠はラット肝臓の研究から得られ、該研究では、 再構築された精製CYP及び特異的な抗体がニコチン代謝を阻害することが示され た。特に、ラットの研究から、フェノバルビタール誘導可能なCYP(即ち、CYP類 ；-2B1、-2B2、-2C6、及び-3A2)がニコチン代謝に関連することが示された(Naka yamaら.，1982;Hibberd及びGorrod 1985;Fothら.，1990；Seatonら.，1991及び1 993)。試験された12種類のヒトCYP型の中でも、CYP2B6は、最高のニコチンオキ シダーゼ活性を示したが、CYP2E1及びCYP2C9は、中間レベルを示した(Flammang ら.，1992)。MaCrackenら.，(1992)は、ヒトCYP2B6及びCYP2D6がニコチン〜コチ ニン代謝の高い速度を示したが、CYP2E1のニコチンに対する触媒活性は検出不可 能であることを示した。CYP2E1及びCYP2D6に関するこの結果は、Flammangら.，( 1992)の知見と食い違っている。従って、ニコチンに対するCYPの親和性に関し、 幾つかの両義性が残っている。 CYP2B蛋白質は、全ての動物及びヒトにおいて肝臓中に少量(全肝臓CYP含量の5 %未満)で発現するが、そのレベルは、始原型CYP2Bインデューサーフェノバルビ タールを含む、多くの別種の薬品に暴露することにより高度に誘導することがで きる(Ryanら.，1990;Guengerichら.，l982b)。ヒトCYP2B6酵素は、種々の個体の 中でも種々のレベルで発現される。CYP2B6は、ベンゾピレン、7-エトキシクマリ ン、クマリン、エトキシレソルフィン(ethoxyresorufin)、ペントキシレソルフ イン(pentoxyresorufin)、エチルモルフィン、ベンフェタミン及びアニリンに対 し低い酸化活性を有する(Mimuraら.，1993)。オルフェナドリン、抗-パーキンソ ン症候群薬は、CYP2B6の特異的な阻害剤であることが知見された(Reidyら.，199 2; Changら.，1993)。 cDNA研究は、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6及びCYP2E1に関連するもので、単離した 発現系のニコチン代謝におけるCYP2A6の可能な役割を提供した(Flammangら.，19 92;McCrackenら.，1992)。CYP2A6も遺伝子多形性を示し、これにより特定の個体 は、不活性酵素を含有する(Dalyら.，1994;Fernandez-Salgueroら.，1995)。 これのみではないが、CYP2A6は、ヒトでは有力なクマリン7-ヒドロキシラーゼで ある(Pearceら.，1992)。CYP2A6は植物及びエッセンシャルオイル中の天然化合 物クマリンのヒドロキシル化に触媒作用を及ぼす(Pelkonanら.，1985;Raunioら. ，1988;Yamanoら.，1990;Pearceら．1992)。ヒト及びヒヒなどの霊長類において は、クマリンは代謝されて7-ヒドロキシクマリン(〜80%)になる(Cholertonら．1 992;Shillingら.，1969;Moranら.，1987)。しかしながら、ラット、マウス及び ハムスターなどの齧歯動物においては、3-ヒドロキシクマリンが主な代謝物であ る(Shillingら．1969;Eganら.，1990)。ヒト肝臓ミクロソームにおけるクマリン 7-ヒドロキシラーゼ活性に関する初期の実験では、CYP2A6の発現レベルにおいて 顕著な個体間での違いが示された(Kapitulnikら．1977;Pelkonenら.，1985)。ヒ ト肝臓においてCYP2A6 mRNAの発現レベルで変異性も知見された(Milesら.，1990 ;Yamanoら.，1990;Yunら.，1991)。ヒト肝臓ミクロソーム中で、CYP2A6蛋白質レ ベルは100倍以上変動した(Yunら.,1991)。特にCYP2A6もNNK(Crespiら.，1991)、 アフラトキシンB1(Yunら.，1991）；ヘキサメチルホスホルアミド(Dingら.，198 8)及びニトロソジメチルアミン(Daviesら.，1989;Fernandezら.，1995)などの数 種の前発癌物質を代謝することが知見された。発明の開示 本発明者らは、個体間におけるニコチン代謝の変動は、CYP2A6の種々の発現に よるものであり、CYP2D6によるものではないことを知見した。CYP2A6は、ヒト肝 臓での主なニコチン代謝酵素であることが示された。クマリン、特異的CYP2A6基 質は、試験肝臓において84%±11%までコチニンへのニコチン代謝を特異的且つ選 択的に阻害し、オルフェナドリン(CYP2B6阻害剤)を添加すると阻害が促進される ことが知見された。メトキサレン(9-メトキシ7H-フロール[3,2-g][1]ベンゾピラ ン-7-オン；6-ヒドロキシ-7-メトキシ-5-ベンゾフランアクリル酸δ-ラクトン； 9-メトキシソラレン；8-メトキシ-4',5':6,7-フロ-クマリン；8-メトキシ[フラ ノ-3',2':6,7-クマリン]；アモイジン(ammoidin)；キサントキシン；8-メトキシ ソラレン；8-MOP；8-MP；メラジニン；メロキシン；オキソラレンとしても知ら れる)は、CYP2A6、従ってニコチン〜コチニン代謝の強い阻害剤であることも知 見された。CYP2A6に対して産生したモノクローナル抗体もコチニン形成を阻害す るが;他のCYPに対する抗体は、コチニン形成を顕著に阻害しなかった。ウエスタ ンブロット法により測定したCYP2A6量は、V_max(r=0.83、p<0.001)及びクマリン による阻害(r=0.80．p〈0.001)に対し高度に相関した。このデータは、CYP2A6発 現における変異性がニコチン代謝における個体間の変動を生み出し、順に、多少 の紙巻き煙草を喫煙するなどの行動結果となり得ることを示す。従って、CYP2A6 の選択的且つ特異的な阻害剤をニコチン代謝の調節に使用することができ、及び 特にニコチン代謝を実質的に減少させ、これにより煙草の喫煙に影響を与えるこ とができる。 本明細書中で使用する「阻害剤」及び「阻害」なる用語は、広範な意味を有し 、ニコチンの代謝を触媒作用するためにCYP2A6の活性を阻害するか、またはそう でない場合には調節するためにCYP2A6に直接又は間接的に作用する物質(例えば 、反応性中間体、代謝物などを介して)を包含する。CYP2A6に間接的に作用する 他の物質は、CYP2A6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質 を包含する。 おおまかにいうと、その一態様において、本発明は、CYP2A6を選択的に阻害す ることを含む、個体におけるニコチン代謝を調節する方法に関する。CYP2A6の阻 害は、以下の(i)CYP2A6活性を阻害する物質；または(ii)CYP2A6をコードする遺 伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質の一つ以上を使用して達成すること ができる。CYP2A6は、遺伝子伝達方法を使用してCYP2A6をコードする遺伝子の転 写又は翻訳を干渉することによっても選択的に阻害することができる。 本発明は、選択的に(i)CYP2A6活性を阻害するか；または(ii)CYP2A6をコード する遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質をアッセイすることを含む、 個体におけるコチニンへのニコチン代謝を調節する物質をスクリーニングする方 法も提供する。 本発明は、さらに、CYP2A6を選択的に阻害する物質の有効量、及び／または医 薬的に許容可能なキャリヤ、希釈剤又は賦形剤を含むコチニンへのニコチン代謝 の調節が必要な容態の治療に使用するための医薬組成物を提供する。選択的にCY P2A6を阻害する物質の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるコチニ ンへのニコチン代謝の調節が必要な容態の治療方法も提供する。 本発明は、個体においてコチニンへのニコチン代謝の調節用の薬剤を製造する ためのCYP2A6を選択的に阻害する物質の使用も提供する。 CYP2B6阻害剤は、強い阻害効果を提供するためにCYP2A6の阻害剤と組み合わせ て使用することもできる。従って、本発明は、選択的にCYP2A6を阻害する物質の 有効量とCYP2B6の阻害剤の有効量とを個体に投与することを含む、個体における CYP2A6阻害剤によるニコチン代謝の阻害を促進する方法を提供する。CYP2A6を選 択的に阻害する物質の有効量、CYP2B6の阻害剤の有効量、及び／または医薬的に 許容可能なキャリヤ、希釈剤又は賦形剤を含む、コチニンへのニコチン代謝の調 節が必要な容態の治療に使用するための医薬組成物も提供する。さらに、選択的 にCYP2A6を阻害する物質の有効量、及びCYP2B6の阻害剤の有効量を個体に投与す ることを含む個体におけるコチニンへのニコチン代謝の調節が必要な容態を治療 する方法を提供する。 本発明の医薬組成物及び方法を使用して被験者のニコチンへの欲望を減少させ 、これにより煙草を喫煙するのを止め(改め：alter)させることができる。 本発明の他の目的、特徴及び有利な点は、以下の詳細な記載により明らかにな るだろう。しかしながら、当業者には、本願の詳細な説明から本発明の趣旨及び 範囲内で種々の変更及び修正が明らかであろうが、本発明の好ましい態様を示す 詳細な説明及び特定の実施例は単なる例示にすぎないことは理解すべきである。図面の簡単な説明 本発明は、以下の図面を参照してより理解されるだろう。 図１は、ニコチンからコチニンへの２段階転化を示す。 図２Aは、シトクロムCYP2A6のアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。 図２Bは、シトクロムCYP2B6のmRNA配列を示す。 図３は、K20ヒトミクロソームによる20μｌのラットサイトゾル存在下での100 μＭニコチンからのコチニン産生の蛋白質-時間曲線を示す。 図４は、ニコチン〜コチニン代謝の挿入Eddi-Hofsteeプロットを付した、サン プルMichaelis-Menten曲線（但し、(A)はL29ヒト肝臓に関する単一酵素速度を示 すグラフであり、及び(B)はL30ヒト肝臓に関する多数の酵素の速度を示す）を示 す。 図５は、30ヒト肝臓ミクロソームによるニコチン〜コチニン代謝の見かけのK_m 値を示す棒グラフである。 図６は、30ヒト肝臓ミクロソームによるニコチン〜コチニン代謝の見かけのV_{m ax} 値を示す棒グラフである。 図７は、抗体活性(Gentest Corpからのデータ)を示す（但し、(A)はMAB-2A6抗 体によるクマリン酸化の阻害のグラフであり、(B)は、テストステロン16β-ヒド ロキシル化(CYP2B1)及び抗-CYP2B1抗体によるリドカインメチル-ヒドロキシル化 (CYP2B2)の阻害のグラフである）。 図８は、(以下の)アナリシスの直線性を示すためにプロットした個々の密度に 関する(上記)L64ミクロソーム蛋白質の増加する濃度のウエスタンブロットを示 す。 図９は、30ヒト肝臓ミクロソームによるコチニン形成のクマリン(150μＭ)阻 害を示す棒グラフである。 図１０は、30ヒト肝臓ミクロソームによる150μＭクマリンでのニコチン(100 μＭ)〜コチニン代謝へのパーセント阻害を示す棒グラフである。 図１１は、K27肝臓ミクロソーム中のコチニン形成のクマリン阻害のDixonプロ ットである。 図１２は、CYP2A6酵素を還元するためにアンチセンスオリゴデオキシヌクレオ チド(ASO)の使用を示す棒グラフである。 図１３は、K27ヒト肝臓ミクロソームによるニコチン(100μＭ)〜コチニン代謝 におけるMAB-2A6の効果を示すグラフである。 図１４は、30ヒト肝臓ミクロソームのウエスタンブロットを示す；各ブロット は、個々のブロットが比較できるようにL64ミクロソーム蛋白質の15、30、75及 び100μｇレーンを同伴する。 図１５は、ニコチン〜コチニンV_max値と、30ヒト肝臓による免疫反応性CYP2A6 量との間の相関関係を示すグラフである。 図１６は、CYP2A6媒介コチニン形成と、30ヒト肝臓による免疫反応性CYP2A6量 との間の相関関係を示すグラフである。 図１７は、ニコチン〜コチニンV_max/K_m値と、30ヒト肝臓による免疫反応性CYP 2A6量との間の相関関係を示すグラフである。 図１８は、30ヒト肝臓ミクロソームによるコチニン形成のオルフェナドリン(1 50μＭ)阻害を示す棒グラフである。 図１９は、30ヒト肝臓ミクロソームを使用するオルフェナドリン(150μＭ)に よるコチニン形成のパーセント阻害を示す棒グラフである。 図２０は、K27ヒト肝臓ミクロソームによるコチニン形成における抗-ラットCY P2B1の効果を示すグラフである。 図２１は、30ヒト肝臓ミクロソームによるニコチン代謝におけるクマリン及び オルフェナドリン(各150μＭ)阻害を示す棒グラフである。 図２２は、30ヒト肝臓ミクロソームによるコチニン形成のトロレアンドマイシ ン(150μＭ)阻害を示す棒グラフである。 図２３は、幾つかの代表的なCYP2A6阻害剤の化学構造を示す。 図２４は、ニコチン〜コチニン代謝においてCYP2A6の活性を阻害するためにメ トキサレンを使用する臨床研究の統計結果を示す表である。 図２５は、７人の被験者のニコチン血漿濃度におけるメトキサレンの経時にお ける効果を示すグラフである。 図２６は、７人の被験者のコチニン血漿濃度におけるメトキサレンの経時にお ける効果を示すグラフである。 図２７は、７人の被験者におけるメトキサレンで増加した血漿ニコチン濃度に 付随する顕著な主観的効果の変化をまとめた棒グラフである。 図２８Aは、血漿ニコチン濃度におけるメトキサレンの効果の臨床研究中に関 与した７人の被験者の現在の吐き気(current nausea)の主観的な評価を示すグラ フである。 図２８Bは、血漿ニコチン濃度におけるメトキサレンの効果の臨床研究中に関 与した７人の被験者における紙巻き煙草に対する現在の欲望の主観的な評価を示 すグラフである。 図２８Cは、血漿ニコチン濃度におけるメトキサレンの効果の臨床研究中に関 与した７人の被験者における紙巻き煙草の現在の満足度の主観的な評価を示すグ ラフである。 図２９は、CYP2A6抗体を含む種々の抗体のニコチンからのコチニン形成におけ る阻害効果を示すグラフである。 図３０Aは、種々の化学化合物によるニコチン〜コチニン代謝の阻害を示す表 である。 図３０Bは、種々の化合物によるCYP2A6基質クマリン〜7-ヒドロキシクマリン 代謝の阻害に対するK_i値の表である。 図３０Cは、ニコチンからのコチニン形成における種々の化合物のパーセント 阻害を示す表である。 図３０Dは、種々の化学化合物によるニコチン〜コチニン代謝のパーセント阻 害を示す棒グラフである。 図３１は、K28ヒト肝臓ミクロソーム中のニコチン〜コチニン形成の7-メトキ シクマリン阻害のDixonプロットである。 図３２は、K28ヒト肝臓ミクロソーム中で10分間の前インキュベートしたニコ チン〜コチニン形成のメトキサレン阻害のDixonプロットである。 図３３は、K28ヒト肝臓ミクロソーム中で10分間の前インキュベートしたニコ チン〜コチニン形成のメトキサレン阻害のCornish-Bowdenプロットである。 図３４は、K26ヒト肝臓ミクロソームにおけるニコチン(30μＭ)〜コチニン形 成の阻害におけるメトキサレン(100nM)の前インキュベーション時間の効果を示 すグラフである。 図３５は、K26ヒト肝臓ミクロソームにおいて10分間の前インキュベーション したニコチン形成のナリンゲニン(naringenin)阻害のDixonプロットである。 図３６は、K26ヒト肝臓ミクロソーム中において10分間の前インキュベーショ ンしたニコチン〜コチニン形成のジエチルジチオカルバミン酸阻害のDixonプロ ットである。 図３７は、絶食した朝と絶食しなかった午後のクマリン(C)試験セッションと の間の相関関係を示すグラフである。 図３８は、７人の被験者における１時間のニコチン代謝を示すグラフである。 図３９は、クマリン100mgを与えた被験者の血漿中で検出された全7-ヒドロキ シクマリン濃度の時間推移を示すグラフである。発明を実施するための最適の態様 １．被験者においてニコチン代謝を調節する方法 上述の如く、その態様の一つにおいて、本発明は、CYP2A6を選択的に阻害する ことを含む、個体においてコチニンへのニコチン代謝を調節する方法に関する。 CYP2A6の阻害は、以下の(i)CYP2A6活性を阻害する物質；または(ii)CYP2A6をコ ードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質の一つ以上を使用するこ とにより実施し得る。 CYP2A6活性を阻害する物質としては、CYP2A6に特異的に結合し、それによりそ の活性を阻害する物質が挙げられる。そのような物質の例としては、例えば、Pe arce,R.ら，1992により記載されたモノクローナル抗体及び商業上入手可能な抗 体、例えばGentest Corporation，Woburn，Mass.，U.S.A.により市販のMAB2A6及 びモノクローナルCYP2A6;Xeno Tech LLC，Kansas City，KS，U.S.Aより市販のXe no Tech 2A6並びにResearch Diagnostics，Inc，Flanders，N.J.，U.S.A.より市 販のポリクローナルCYP2A6を含む、CYP2A6に特異的な抗体が挙げられる。 CYP2A6活性を阻害する物質としては、カルボニル酸素を伴ったラクトン構造を 有する物質も挙げられる。これらの物質の非-限定的な例としては、クマリン(Th e Merk Index，第11版，Budavari.S.,編，Merck & Co．Inc.，1989，No.2563)、 フラノクマリン、メトキサレン(The Merk Index，No.5911)、インペラトリン(im peratorin)(The Merk Index，No.4839)、ソラレン(The Merk Index，No.7944)、 α-ナフトフラボン、イソピンピネリン、β-ナフトフラボン、ベルガプテン(ber gapten)(The Merk Index，No.1173)、スホンジン(sphondin)、クマテトラリル(c oumatetralyl)(ラクミン；racumin)、及び(＋)-シス-3,5-ジメチル-2-(3-ピリジ ル)-チアゾリジム-4-オン(SM-12502)(Nunoyaら.，JPET 277:768-774，1996)が挙 げられる。CYP2A6を阻害し、且つ本発明の方法及び組成物中で使用し得る他の物 質としては、ナリンゲニン(naringenin)及び関連するフラボン類、ジエチルジチ オカルバメート、ニコチン(本発明のスクリーニング法で主として有用)、N-ニト ロソジアルキルアミン(例えば、N-ニトロソジエチルアミン(The Merk Index，No .6557)、N-ニトロソジメチルアミン(The Merk Index，No.6558)、ニトロピレン 、メナジオン(The Merk Index，No.5714)、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾー ル(The Merk Index，No.6101)、クロトリマゾール(The Merk Index，No.2412)、 ピロカルピン(The Merk Index，No.7395)、ヘキサメチルホスホルアミド、4-メ チルニトロサミン-3-ピリジル-1-ブタノール、アフラトキシンB(The Merk Index ，No.168))が挙げられる。これらの化学構造及び他の非-限定的な代表的阻害剤 に関しては、図２３A〜２３Cを参照されたい。 これらの物質の誘導体及び類似体も、本発明の方法及び組成物中で使用するこ とができる。例えば、クマリン及びメトキサレンの誘導体としては、カリウム及 びナトリウム塩、及びアミノ酸、炭水化物及び脂肪酸錯体を含む、クマリン及び メトキサレンの医薬的に許容可能な塩、エステル及び錯体が挙げられる。一態様 において、クマリンの好適な類似体は、CYP2A6によるニコチン〜コチニンの代謝 を阻害する活性を含む、クマリンと同様のその官能基をベースとして選択するこ とができる。クマリンの官能基類似体の例としては、7-メトキシクマリン、7-メ チルクマリン及び7-エトキシクマリンが挙げられ、これらの構造は、図２３A、 ２３B及び２３Cに示されている。クマリンの類似体は、クマリンと同様のその三 次元構造、即ち、ラクトン/カルボニル構造をベースとしても選択することがで きる。 CYP2A6を阻害する上記リストの物質は、単なる例示として挙げられたものであ り、本発明の範囲を限定するものではない。CYP2A6活性を阻害する追加の物質も 、本明細書中に記載するスクリーニング法を使用して同定することができる。 CYP2A6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質としては、 転写の通常の方向に対して反転された、CYP2A6遺伝子をコードする核酸配列(図2 A参照、GenBank Accession No．HSU22027)またはその部分(例えば、ヌクレオチ ド790(ATG)及びスプライス部位1237、2115、2499、3207、4257、4873、5577及 び6308のいずれかの側の約20のヌクレオチドである領域)-即ち、アンチセンスCY P2A6核酸分子が挙げられる。そのようなアンチセンス核酸分子は、天然ヌクレオ チドまたは分子の生物学的安定性を増加させたり若しくはCYP2A6 mRNA若しくはC YP2A6遺伝子で形成した二本鎖の物理的安定性を増加させるために設計された種 々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができる。アンチ センス配列は、アンチセンス配列が高効率調節領域の制御下で産生し、その活性 がベクターが導入される細胞型により決定され得る、組み換えプラスミド、ファ ージミド(phagemid)または弱毒化ウイルスの形態で細胞内に導入された発現ベク ターを使用して生物学的に産生することができる。 アンチセンス配列を含む核酸分子は、形質転換、トランスフェクション、感染 などの慣用の方法及び電気穿孔法又はミクロインジェクションなどの物理的な方 法を使用して、被験者の細胞内に導入することができる。リポソームへのDNA包 含及び共沈等の化学的方法を使用してアンチセンス配列を誘導(dellver)するこ とができる。分子は、エーロゾルの形態または洗浄により誘導することもできる 。核酸分子を輸送するための好適なベクター又はクローニングビヒクルは、当業 界で公知である。好適なベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデ ノウイルスベクター及びDNAウイルスベクターが挙げられる。 選択的にCYP2A6を阻害し、コチニンへのニコチン代謝を調節する物質の能力は 、阻害剤をスクリーニングするための本明細書中で記載した方法を使用して確認 することができる。 本発明の一態様においては、CYP2A6阻害剤は、クマリン、メトキサレン、その 誘導体及びその類似体(図２３Ａ参照)を含む群から選択される少なくとも一員で ある。初期のin vitroスクリーニング及び臨床研究から、メトキサレンはCYP2A6 の強力な阻害剤であることが同定されている。 対立遺伝子の置換、挿入失活、または欠失形成を使用するターゲット化遺伝子 突然変異誘発などの遺伝子導入法を使用してCYP2A6をコードする遺伝子の転写を 干渉することにより、本発明の方法において選択的にCYP2A6を阻害することもで きる。例えば、非-複製又は条件付き複製プラスミドを使用する対立遺伝子交換 は、真核生物の突然変異誘発に関して広く使用されている。対立遺伝子交換を使 用して、CYP2A6遺伝子の欠失を作り出すことができる。上述の変形物の製造の例 示的な方法は、Sambrookらにより記載されている(Molecular Coning;A Laborato ry Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laoratory Press，1989)。 CYP2B6阻害剤も強い阻害活性を提供するためにCYP2A6の阻害剤と組み合わせて 使用することができる。CYP2B6の阻害剤としては、以下の(i)CYP2B6活性を阻害 する物質；または(ii)CYP2B6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害 する物質の一つ以上が挙げられる。CYP2B6阻害剤は、個体中でニコチン代謝を阻 害するために単独でも使用することができる。 CYP2B6活性を阻害する物質としては、CYP2B6と特異的に結合し、それによりそ の活性を阻害する物質が挙げられる。そのような物質の例としては、例えば、Ge ntest Corporation，Woburn，Mass.，U.S.A.より市販の抗-CYP2B6などの市販の 抗体を含むCYP2B6に特異的な抗体が挙げられる。 CYP2B6活性を阻害する物質としては、フェニルエチルアミン、ジフェニルバル ビツレート、ジエチル置換バルビツレート及びヒダントインから選択される物質 も挙げられる。特に、オルフェナドリン(The Merk Index，No.6831)を含むジフ ェンヒドラミン及びその誘導体、オルフェナドリンの誘導体又は類似体、並びに 他の抗ヒスタミン類、抗コリン作用性物質(コリン及びその類似体及び誘導体な ど)も、本発明の方法及び組成物の種々の態様中のCYP2B6阻害剤として使用する ことができる。Gentest Corporation，Woburn，Mass.，U.S.A.より市販のポリク ローナルCYP2B1/2、ポリクローナルCYP2B1及びポリクローナルCYP2B6などの抗体 も、CYP2B6活性を阻害するようにCYP2B6に特異的に結合する。 本発明の方法及び組成物中で使用することができるオルフェナドリンの誘導体 としては、カリウム及びナトリウム塩、及びアミノ酸、炭水化物及び脂肪酸錯体 を含むオルフェナドリンの医薬的に許容可能な塩、エステル及び錯体が挙げられ る。一態様においては、オルフェナドリンの好適な類似体は、CYP2B6を阻害する 活性を含む、オルフェナドリンと同様の官能基をベースとして選択することがで きる。オルフェナドリンの類似体は、オルフェナドリンと同様の三次元的構造を ベースとしても選択することができる。 CYP2B6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質としては、 転写の通常の方向に対して反転された、CYP2B6遺伝子をコードする核酸配列(図 ２B参照、CYP2B6のmRNA配列に関するGenBank Accession No．HSP452B6)またはそ の部分(例えば、ヌクレオチド9(ATG)及び部位111、274、424、585、762、904、1 092及び1234ntのいずれかの側にある領域)-即ち、アンチセンスCYP2B6核酸分子 が挙げられる。そのようなアンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載された慣 用法を使用して細胞内に産生又は導入することができる。 CYP2B6は、本明細書中に記載の慣用の遺伝子導入法を使用してCYP2B6をコード する遺伝子の転写を干渉することにより、本発明の方法で選択的に阻害すること もできる。 本発明の好ましい態様において、使用するCYP2B6阻害剤は、オルフェナドリン 及びオルフェナドリンの誘導体又は類似体である。 CYP2A6又はCYP2B6の阻害剤は、酵素のエピトープに特異的な抗体を使用して酵 素にターゲット化することができる。例えば、二方向に特異的な抗体(bispecifi c antlbody)を使用して阻害剤にターゲット化することができる。二方向に特異 的な抗体は、CYP2A6またはCYP2B6の少なくとも一つのエピトープに特異的な抗体 の変異領域及び阻害剤と結合し得る第２の抗体の変異領域を含有する。二方向に 特異的な抗体は、Staerz & Bevan(1986，PNAS(USA)83:1453)及びStaerz & Bevan (1986，Immunology Today，7:241)に記載の如く当業界で公知の方法を使用して 、ハイブリッドハイブリドーマを形成することにより製造することができる。二 方向に特異的な抗体は、Staerzら.，(1985，Nature，314:628)及びPerezら.，(1 985，Nature 316:354)に記載のような慣用方法を使用する化学的手段、または組 み換え免疫グロブリン遺伝子構築物の発現によっても構築することができる。 本明細書中で同定した特定の物質又はその類似体若しくは誘導体の阻害活性は 、実験的モデル系及び臨床研究、例えば、以下に記載する実施例に概説した研究 で確認することができる。 ２．スクリーニング方法 上述の如く、本発明は、選択的に(i)CYP2A6活性を阻害するか、又は(ii)CYP2A 6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害する物質をアッセイするこ とを含む、個体においてコチニンへのニコチン代謝を調節する物質をスクリーン グする方法を提供する。 本発明の方法の一態様において、該方法は、 (a)CYP2A6が基質を反応生成物に転化し得るような条件下、被験物質の存在下でC YP2A6の基質を反応させ； (b)反応生成物、未反応基質又は未反応CYP2A6をアッセイし； (c)被験物質が選択的にCYP2A6を阻害し、それにより個体においてニコチン代謝 を調節し得るかどうかを決定するために対照と比較する ことを含む。 本発明のスクリーニング方法で使用し得るCYP2A6の基質としては、たとえば、 ニコチン、クマリン、その類似体及びその誘導体が挙げられる。ニコチン及びク マリンの対応する反応生成物は、各々コチニン及び7-ヒドロキシクマリンである 。 本発明の方法で使用するCYP2A6は、天然、組み換え又は市販由来のものであり 得る。例えば、CYP2A6は、Nesnow，S.ら.，Mutation Research 1994;324:93-102 により記載のものような組み換え方法により得ることができる。CYP2A6を発現す る細胞又は肝臓ミクロソームも本方法で使用し得る。 反応生成物を形成させ得る条件は、被験物質並びに基質の量及び性質などの因 子を考慮して選択することができる。 反応生成物、未反応基質又は未反応CYP2A6は、塩析、クロマトグラフィー、電 気泳動、ゲル濾過、分画、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集又はそ の組み合わせなどの慣用の単離方法により単離することができる。 反応生成物、未反応基質又は未反応CYP2A6のアッセイをし易くするために、反 応生成物若しくは物質、ラベル化CYP2A6若しくは基質、又はラベル化物質に対す る抗体を使用することができる。抗体、CYP2A6、基質又は物質は、特異的なラベ ル化抗体、蛍光化合物、酵素、ラベル化抗原に対し特異的な抗体及び化学発光化 合物により認識できる放射線活性ラベル、抗原などの検出可能なマーカーでラベ ルすることができる。 本発明の方法で使用する基質は、不溶化することができる。例えば、これを好 適なキャリヤと結合させることができる。好適なキャリヤの例としては、寒天、 セルロース、デキストラン、Sephadex、Sepharose、カルボキシメチルセルロー ス、ポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチッ クチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン-メチルビニルエーテル-マレイン酸コポ リマー、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹 などが挙げられる。キャリヤは、例えば、チューブ、試験プレート、ビーズ、デ ィスク、球などの形状であり得る。 不溶化CYP2A6、基質又は物質は、例えば、臭化シアン結合などの公知の化学的 又は物理的方法を使用して好適な不溶性キャリヤと物質とを反応させることによ り製造することができる。 本発明の別の態様では、 (a)CYP2A6をコードする核酸配列を含む核酸分子と該核酸配列の転写又は翻訳に 必要なエレメントと、場合によりリポーター遺伝子とを含む宿主細胞を被験物質 の存在下で培養し；次いで (b)CYP2A6の発現またはリポーター遺伝子によりコードされた蛋白質の発現のレ ベルと、被験物質の非存在下で、核酸分子でトランスフェクトした対照細胞とを 比較する 段階を含む、CYP2A6をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害すること により個体においてコチニンへのニコチン代謝を調節する物質をスクリーニング する方法を提供する。 本発明の方法で使用する宿主細胞は、CYP2A6をコードする核酸配列を含む核酸 分子で好適な宿主をトランスフェクトすることにより製造することができる。CY P2A6をコードする核酸配列は、当業界で公知の以下の方法によりCYP2A6遺伝子の 配列(図２A)を考慮して構築することができる。好適な転写及び翻訳エレメント は、微生物、真菌、ウイルス、哺乳類又は昆虫遺伝子を含む種々の源から誘導す ることができる。好適な転写及び翻訳エレメントの選択は、選択した宿主細胞に 依存し、一当業者により容易に実施することができる。そのようなエレメントの 例としては、翻訳開始シグナルを含む、転写プロモーター及びエンハンサーまた はRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。更に、選択し た宿主細胞及び使用したベクターに依存して、他の遺伝子エレメント、例えば、 複製の起点、追加のDNA制限部位、エンハンサー及び転写の誘導性を与える配列 を、発現ベクター内に含ませることができる。必須転写及び翻訳エレメントが元 のCYP2A6遺伝子又はそのフランキング配列により供給され得ると好適である。 リポーター遺伝子の例は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ、蛍ルシフェラーゼ若しくは免疫グロブリンなどの蛋白 質、または免疫グロブリン、好ましくはIgGのFc部分などのその一部をコードす る遺伝子である。リポーター遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは蛍ルシフェラーゼ等のリポータ ー蛋白質の濃度を変化させることによりモニターする。これにより、CYP2A6の発 現を明視化且つアッセイし、特にCYP2A6の発現における物質の効果を決定するこ とが可能となる。 好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳類、酵母又は他の真菌、ウイルス、植物 又は昆虫細胞を含む、広範囲の原核生物及び真核生物宿主細胞が挙げられる。 宿主細胞のトランスフェクションに関するプロトコルは当業界で周知である(S ambrookら.，Molecular Cloning A Laboratory Mannual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989参照)。例えば、Nanji，Mら.，(1994)は、バキ ュロウイルス系におけるヒトCYP2A6をコードするcDNAの発現について記載してお り；Nesnow，S.ら.，(1994)及びTiano H.F.ら.，(1993)は、形質転換可能なC3H/ 10T1/2マウス胎児繊維芽細胞におけるレトロウイルスベクター由来のCYP2A6の発 現について記載しており：及びSalonpaa.P.,ら(1993)は、PA317パッケージング 細胞及びLXSNベクターを使用するCYP2A6を含有するアンフォトロピック組み換え レトロウイルスの製造について記載している。 市販の宿主細胞は、本発明の方法でも使用し得る。例えば、Gentest Corporat ionより市販のh2A3(h2A6として知られる)及びh2B6細胞系は、本発明のスクリー ニング法に好適である。 本発明の上述の方法は、脳及び肝臓におけるコチニンへのニコチン代謝の負の 調節物質(native regulator)を同定するのに使用することができ、これによりニ コチン代謝の調節が必要な容態に作用させることができる。そのような調節物質 を同定及び単離することにより、コチニンへのニコチン代謝の調節における調節 物質の役割を研究することができ、これにより調節物質の機能的又は非機能的類 似体などの、この役割を果たす物質を開発することができる。そのような物質は 、本明細書中に記載したようにコチニンへのニコチン代謝を調節するための医薬 品として有用であると評価されるだろう。 本発明の方法により同定された物質の阻害活性は、実験的モデル系及び、以下 に示す実施例中で概説された研究などの臨床研究において確認することができる 。 ３．組成物 選択的にCYP2A6を阻害する本発明の方法を使用して同定した物質又は本明細書 中に詳細にわたって記載したコチニンへのニコチン代謝を阻害する物質は、医薬 組成物中に配合することができる。従って、本発明は、CYP2A6を選択的に阻害す る１種以上の物質の有効量、及び／または医薬的に許容可能なキャリヤ、希釈剤 又は賦形剤を含む、コチニンへのニコチン代謝を調節することが必要な容態の治 療に使用するための医薬組成物を提供する。CYP2A6を選択的に阻害する一種以上 の物質の有効量を被験者に投与することを含む、被験者におけるコチニンへのニ コチン代謝の調節が必要な容態を治療する方法も提供する。 コチニンへのニコチン代謝の調節が必要な状態とは、ニコチン使用疾患−即ち 、依存及び非-依存煙草喫煙、並びにニコチン-誘導疾患−即ち、禁断が挙げられ る。容態は、全ての形態の煙草(例えば、紙巻き煙草、噛み煙草、嗅ぎ煙草、パ イプ及び葉巻)の使用及び処方箋投薬(例えば、ニコチンガム、ニコチンパッチ、 スプレー、肺吸入又は他の形態)により発現させることができる。特に、本発明 の医薬組成物及び治療法は、被験者が喫煙したいと望むのを減少させ、それによ り喫煙行動を除去するのに使用することができる。本発明の医薬組成物及び治療 方法は、中枢神経的に活性組成物の用量を減少させるため、または煙草依存症の 治療でその有効性を高めるために、喫煙行動(例えば、種々の配合物中のブプロ ピオン(Wellbutrinとしても知られる))を修正する、他の中枢神経的に活性な医 薬組成物と共に使用することもできる。 個体中でニコチン代謝を調節することによる本発明の組成物及び治療法は、非 常に有効である。本方法及び組成物は、コチニンへのニコチン代謝を減少させる ことにより喫煙行動成分(behavioural components)を擁護(mantain)し且つそれ らを修正する。本発明の組成物を投与した後でニコチン代謝が減少した個体は、 ニコチンの要求が変化したため、喫煙行動及び煙への暴露を変化させるだろう。 本発明の方法及び組成物は、特にニコチン欠乏を用いるような従来法で得られた ものよりも、減少パターン、より長期の禁煙及びより少ない煙草の煙への暴露を 示す。 喫煙という行動成分は、個体の幾つかの群においては特に重要であり、従って 、行動成分を修正且つ擁護する本発明の方法及び組成物は、これらの個体の喫煙 を減少させるのに特に有用である。例えば、行動成分は、女性による煙草の喫煙 に関して顕著であることが知見された。本発明により、個体及び／または群ベー スで行動学習を育成させることができる。 本発明の組成物及び治療方法は、高レベルのCYP2A6を有する個体又は個体群に おいてニコチン代謝を調節するのに特に適している。例えば、北米のカフカス人 は高レベルのCYP2A6を有する。高レベルのCYP2A6を有する個体又は個体群は、CY P2A6を測定する本出願人らの方法を使用することにより同定することができる。 本発明の組成物及び方法は、治療期間中の個別的配慮及び柔軟性という長所も 有する。本発明の組成物及び治療方法は、ひどい依存症の個体、先の治療で失敗 したもの、完全停止の現在の提案を受容できない個体、再発の治療/予防、また はニコチンパッチなどの他の方法の同時治療に特に好適である。本発明の組成物 及び治療は、必要とされるニコチン置換治療のニコチンパッチ及び他の全ての形 態の用量を減少させるので、煙草依存症の治療におけるその有効性を強化及び／ または治療の効果の期間を長期化させることができると予測される。 ニコチン使用疾患及びニコチン-誘発疾患の個体の治療における本発明の方法 及び組成物は、個体における、例えば、オピオイド関連疾患；増殖性疾患；認識 的、神経学的又は精神学的疾患などのニコチン-関連疾患及び他の薬剤依存症を 含む疾患又は症状の治療及び予防にも有用である。そのような根元的な疾患又は 症状の例としては、悪性疾患、精神病、精神分裂病、パーキンソン病、不安、鬱 病、アルコール中毒症及び阿片剤依存症が挙げられる。 本発明の方法及び組成物は、CYP2A6又はCYP2B6の減少が必要な容態を有する個 体の治療及び予防にも使用することができる。例えば、CYP2A6は、NNK(Crespiら .,1991)、アフラトキシンB1(Yunら.,1991)；ヘキサメチルホスホルアミド(Ding ら.,1988)、及びニトロソジメチルアミン(Daviesら.,1989;Fernandezら.,1995) 等の幾つかの前発癌物質を代謝することが知られている。従って、CYP2A6の阻害 剤は、悪性疾患の治療及び予防に有用である。 本発明の医薬組成物は、本発明の方法を使用して同定した物質又は以下詳細に 記載する選択的にCYP2A6を阻害する物質を含有する。活性物質は、単独で投与す ることができるが、通常、標準的な医薬プラクティス及び選択した投与経路をベ ースとして選択した、医薬キャリヤなど(以下参照)と共に投与される。 投与する用量は、特定の物質の医薬的特徴、投与モード及び経路；個体レシピ エントの年齢、健康及び体重；症状の性質及び程度、同時治療の種類、治療頻度 、及び所望の効果などの公知の因子及び使用に依存して変動する。 幾つかの場合には、化合物の用量を増加させる代わりに、特定の化学化合物に より生成した阻害の速度を、CYP2A6阻害剤の代謝を阻害し得る物質(例えば、酵 素)に対する第２の阻害剤を治療プロトコルに加えることにより変えたりまたは 促進させることができる。そのような第２の阻害剤を添加することにより、CYP2 A6阻害剤の量を保持し、ニコチンの高い血漿濃度を維持する有利な効果を長期化 させることができる。実質的に一定のニコチンレベルを維持し、CYP2A6阻害剤の 速度において局所的に作用することにより、個体の治療を促進するので、そのよ うな第２の阻害剤の使用は非常に有利である。このアプローチを使用することに より、多量の中枢神経的に活性化合物の使用を防ぐことができる。 同様に、阻害物質に個体を前暴露(preexposure)することは、血漿中の薬剤の 存在を長期化させるか、または血漿中の阻害剤の半減期にもかかわらず個体中に 持続効果を有する阻害作用をもたらすことができる。阻害物質の前暴露又は前培 養により生じたこの現象は、物質の用量を投与しなければならない用量間隔の増 大を助長でき、長期間用量の減少またはCYP2A6阻害の増強を助長することができ る。さらに個体を一種の阻害物質に前暴露させておくと、第２の阻害剤の必要用 量を続けて減少させることができる。 CYP2A6を選択的に阻害する物質の好適な用量は、個体の身体に存在するCYP2A6 の量に依存する。この量は、個体が、CYP2A6遺伝子座に２種類の変異対立遺伝子 、１種類の変異対立遺伝子を含有するか又は全く変異対立遺伝子を有さないかに 依存する。実施例７では、本出願人は、そのような変動が個体群の遺伝子物質中 に存在し得ることを確認した。従って、本発明の一態様は、CYP2A6遺伝子の遺伝 子座に２種類の変異対立遺伝子、１種類の変異対立遺伝子を含有するかまたは全 く変異対立遺伝子を含有しない個体において、CYP2A6活性を測定する方法を提供 するものであり、該方法は、 (a)個体がCYP2A6遺伝子座に２種類の変異対立遺伝子、１種類の変異対立遺伝子 を含むか、全く変異対立遺伝子を含まないかを測定するために、個体からデオキ シリボ核酸を含有する身体のサンプル(即ち、"DNA含有身体サンプル")をアッセ イし； (b)個体中に存在するCYP2A6の量を測定し；次いで (c)段階(a)でアッセイした結果と段階(b)のCYP2A6量を相関させて、 (i)選択的にCYP2A6活性を阻害するか、(ii)CYP2A6をコードする遺伝子の転写及 び／または翻訳を選択的に阻害する物質の、個体に対する好適用量を決定する段 階を含む。 個体のレシピエントは、任意の哺乳類の型であり得るが、好ましくはヒトであ る。通常、レシピエントは、酵素の活性形を備えたCYP2A6遺伝子型を有する個体 である。個体のCYP2A6遺伝子型及び個体中の活性CYP2A6酵素の存在は、本明細書 中に記載する方法により測定することができる。例えば、クマリン7-ヒドロキシ ル化を使用してCYP2A6活性を測定した(Cholertonら.，1992;及びRautioら.，199 2)。上述の如く、本発明の方法及び組成物は、高レベルのCYP2A6を含有する個体 若しくは個体群、又は喫煙行動成分が顕著な個体で好ましくは使用することがで きる。 コチニンへのニコチン代謝の調節が必要な容態の治療に使用する為には、一般 的なガイダンスでは、クマリン又はメトキサレンなどの活性成分の１日当たりの 経口用量は、約0.1〜80mg/体重kgであり得、好ましくは0.1〜20mg/体重kgであり 、より好ましくは0.2〜3mg/体重kgであり得る。通常、所望の結果を得るために は、１日１回から複数回、好ましくは１日４回までの分割用量で又は維持放出 形(sustained release form)で、１日当たりクマリン又はメトキサレン0.5〜50m g/kgの用量が有効である。特定のレジメでは、クマリン又はメトキサレンは、1 〜4日間、１日２回投与する。標準的な間隔用量投与を使用するが、本発明の組 成物は、喫煙する危険性の高い時間(例えば、１日の始め及び就労日の終了前)の 前に断続的に投与することができる。 本発明の物質は、経口、局所(topical)、直腸、非経口、局所(local)、吸入ま たは大脳内の使用に投与することができる。本発明の一態様において、物質は、 好適な鼻腔内ビヒクルの局所使用を介して、または当業者に公知の経皮スキンパ ッチの形態を使用する経皮経路を介して、鼻腔内形で投与される。経皮輸送系の 形態で投与するためには、用量投与は、用量レジメ内で断続的よりむしろ継続的 である。物質は、制御又は遅延放出カプセル形及び他の薬剤輸送方法(ドラッグ デリバリー方法)により投与することもできる。 本発明の方法において、本明細書中詳細に記載し且つ本発明の方法を使用して 同定した物質は活性成分を形成し、通常、慣用の医薬プラクティスと一致した、 経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップなどの予定投与形に関して好適に選 択した、好適な医薬希釈剤、賦形剤又はキャリヤと混合して投与する。 例えば、錠剤又はカプセル形で経口投与する場合には、活性物質は、経口の、 非毒性の、医薬的に許容可能な不活性キャリヤ、例えば、ラクトース、スターチ 、蔗糖、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二 カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどと混合すること ができ；液状で経口投与する場合には、経口活性物質は、任意の経口の、非毒性 の、医薬的に許容可能な不活性キャリヤ、例えば、エタノール、グリセロール、 水などと混合することができる。好適なバインダー、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤 も、所望又は必要により投与形内に包含させることができる。好適なバインダー としては、スターチ、ゼラチン、天然糖(例えば、グルコース又はβ-ラクトース )、コーン甘味料、天然及び合成ガム(例えば、アカシア、トラガカント又はアル ギン酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、 ワックスなどが挙げられる。これらの用量形に使用する好適な潤滑剤としては、 オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、 安 息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤 の例としては、スターチ、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタン ガム等が挙げられる。 ゼラチンカプセルは、活性物質及び粉末化キャリヤ、例えば、ラクトース、ス ターチ、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等を含有 し得る。同様のキャリヤ及び希釈剤を圧縮錠剤を製造するのに使用し得る。錠剤 及びカプセルは、経時で活性成分を継続的に放出するために維持放出生成物(sus tained releaseproduct)として製造することができる。圧縮錠剤は、シュガーコ ート若しくはフィルムコートして任意の不快な味を遮蔽し、錠剤を大気から保護 するか、胃腸内管内で選択的に崩壊させるために腸溶性コートすることができる 。経口投与用の液体投与形は、患者の許容性を増加させるために着色剤及びフレ ーバー剤を含み得る。 水、好適なオイル、塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液並びにグリ コール類(例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール)を非経口 溶液用のキャリヤとして使用し得る。そのような溶液は、好ましくは、活性成分 の水溶性塩、好適な安定剤及び、必要により緩衝物質も含み得る。好適な安定剤 としては、単独又はクエン酸及びその塩並びにナトリウムEDTAと混合した、酸化 防止剤(例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸)が 挙げられる。非経口溶液は、防腐剤(例えば、ベンズアルコニウムクロリド、メ チル-又はプロピル-パラベン、及びクロロブタノール)も含み得る。 本明細書中詳細に記載し且つ本発明の方法を使用して同定した物質は、リポソ ーム輸送系(例えば、小さな単層小胞、大きな単層小胞及び多層小胞)の形態でも 投与することができる。リポソームは、種々のリン脂質(例えば、コレステロー ル、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリン)から形成することができ る。 本明細書中詳細に記載し、且つ本発明の方法を使用して同定した物質は、標的 可能な薬剤キャリヤである溶解性ポリマーと結合させることもできる。そのよう なポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒド ロキシプロピルメタクリルアミド-フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパル タミドフェノール、またはパルミトイル残渣で置換したポリエチレンオキシド- ポリリシンが挙げられる。物質は、薬剤を制御放出させるために有用な生分解性 ポリマーと結合させることもできる。好適なポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリ グリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリイプシロンカ プロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポ リジヒドロピラン、ポリシアノアシレート、及びヒドロゲルの架橋若しくは両親 媒性ブロックコポリマーが挙げられる。物質は、剛直ポリマー及び他の構造(例 えば、フラーレンまたはBuckeyball)に付着させることもできる。 投与に好適な医薬組成物は、１単位当たり活性物質約1ミリグラム〜1500ミリ グラムを含有する。これらの医薬組成物中、活性成分は、通常、組成物の全重量 をベースとして、約0.5〜95重量％の量で配合することができる。 医薬用量形を製造する好適な医薬キャリヤ及び方法は、当業界で標準的な参照 テキストである、Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Com panyに記載されている。 本明細書中に詳細に記載し、又は本発明の方法を使用して同定した１より多く の物質を、コチニンへのニコチンの代謝を調節するのに使用することができる。 そのような場合、物質は、同時に投与する個々の別個の用量単位としてまたは、 単一若しくは混合用量単位中の各治療成分の物理的組み合わせのいずれかの薬剤 と共に使用し得る任意の慣用の手段により投与することができる。活性剤は、単 独で投与することができるが、通常、本明細書中に記載した標準的な医薬プラク ティス及び投与の選択経路をベースとして選択した医薬キャリヤと共に投与する 。 CYP2A6阻害剤(例えば、クマリン、メトキサレン)とCYP2B6阻害剤(例えば、オ ルフェナドリン)との組み合わせは、コチニンへのニコチン代謝の阻害を増強す る。従って、本発明の好ましい態様は、コチニンへのニコチン代謝を選択的に阻 害するためにCYP2A6阻害剤の有効量とCYP2B6阻害剤の有効量とを投与することを 含む、コチニンへのニコチン代謝を制御するのが必要な容態を治療するための方 法を提供する。本発明の好ましい態様において、CYP2A6阻害剤はメトキサレン又 はその類似体若しくは誘導体であり、CYP2B6阻害剤は、オルフェナドリンまたは その類似体若しくは誘導体である。本発明の阻害剤は、同時に、別個に又は連続 して投与することができる。CYP2A6阻害剤とCYP2B6阻害剤の用量は、各々、各阻 害剤単独では十分な効果を示さないように選択される。有効用量は、コチニンへ のニコチン代謝の強い阻害に好適な、ほぼ最少用量であるような量である。CYP2 A6及びCYP2B6阻害剤の組み合わせを含有する医薬組成物を、CYP2A6阻害剤を含有 する組成物に関して本発明で記載したように製造し、次いで投与することができ る。医薬組成物は、好ましくは、メトキサレン又はその類似体若しくは誘導体、 及びオルフェナドリンまたはその類似体若しくは誘導体を、各々、1〜1500mg及 び25〜400mgの濃度で含有する。 本発明者らによる、CYP2A6がヒト肝臓における主なニコチン代謝酵素であると いう認識は、煙草依存性が発現する個体の危険性を測定するために、酵素を個体 でアッセイし得ることを示唆する。CYP2A6レベルの測定は、ニコチンパッチ及び ニコチンガムなどの個々の好適な慣用のニコチン置換治療を選択及びモニターす るのにも使用し得る。慣用のニコチン置換治療(例えば、ニコチンガム、ニコチ ンパッチ、スプレー、肺吸入又は他の形態)は、個体が高レベルのCYP2A6を有す る場合には、非常に成功した結果を有する。逆に、個体が非常に低レベルのCYP2 A6を有する場合、高用量でのニコチン投与は、毒性を高め、副作用を与えるだろ う。 以下の非限定的な実施例は、本発明を説明するためのものである。 実施例１ニコチンの代謝におけるＣＹＰ２Ｄ６の役割 実施例１に概説する実験には以下の材料および方法を用いた： 材料および方法： 生物学的試料 ヒト肝臓：この試験に用いたＫ系列肝臓の特性および起源については、先に記 載されている(Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,１９８７；Ｔｙｎｄａｌｅ ｅ ｔ ａｌ．，１９８９)。Ｋ系列肝臓は、トロント大学、Ｄｒ．Ｔ．Ｉｎａｂａ から入手された。Ｌ系列肝臓は、小児病院（カナダ、トロント，ＯＮ）のＤｒ． Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓから入手され、肝ドナーから得た部分肝よりなっていた。 ＣＹＰ２Ｄ６酵母：酵母（ａＨ２２／ｐｅｌｔ１部分）および対照酵母（ＡＨ ２２／ｐＭＡ９１細菌）で発現したＣＹＰ２Ｄ６のミクロソーム調製物は、英国 シェフィールド大学のＤｒ．Ｍ．Ｓ．Ｌｅｎｎａｒｄにより提供された。免疫化 学的アッセイおよび触媒アッセイにより、シトクロムＰ４５０は対照酵母から調 製したミクロソーム中には検出されないこと、およびＣＹＰ２Ｄ６発現酵母から 調製したミクロソームにおける酵素活性は主としてＣＹＰ２Ｄ６によるものであ ることが示された（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ミクロソーム蛋白 質濃度はＢＳＡアッセイキット（パース・ケミカル社、米国イリノイ州ロックフ ォード）により測定された。 薬物および化学物質：臭化水素酸デキストロメトルファン、（Ｓ）−ニコチン 、（Ｓ）−コチニン、キニジン、ケタミン、クメンヒドロペルオキシドおよびＮ ＡＤＰＨは、シグマ社（米国ミズーリ州セントルイス）から得られた。デキスト ロルファン、メトキシモルフィナンおよびヒドロキシモルフィナンは、ホフマン ・ラ・ロッシュ社、ナットリー（米国ニュージャージー州）により提供された。 ブジピンはＢｙｋグルデンファルマツォイティカ（ドイツ国コンスタンツ）から 得られた。 ミクロソーム調製物：３０人から得た部分肝（約２ｇ）を氷上で融解し、次い で２容量の冷１．１５％ＫＣｌ中で細断した。ブラック・アンド・デッカー（Ｂ ｌａｃｋ ａｎｄ Ｄｅｃｋｅｒ）電気ドリルを動力とするテフロン乳棒で１０ 回突くことにより、これらの試料をホモジナイズした。次いでそれぞれの肝ホモ ジネートをソルバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ２−Ｂで４℃において９０００ｇで ２０分間、遠心した。細胞質ゾルおよびミクロソームを含有する上清をデカント し、ソルバル・コンビ・プラス（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｃｏｍｂｉ Ｐｌｕｓ）超遠 心機で４℃において１００，０００ｇで６０分間、遠心した。得られたミクロソ ームペレットを１．１５％ＫＣｌに再懸濁し、再び４℃において１００，０００ ｇで６０分間、遠心した。このミクロソームペレットを１．１５％ＫＣｌ溶液中 に２：１ ｖ／ｗで再懸濁し、フォルマ・サイエンティフィックのフリーザーに −７０℃で保存した。 蛋白質の測定：ミクロソーム試料の蛋白質濃度は、パースＢＳＡ蛋白質アッセ イキット（パース・ケミカル社、米国イリノイ州ロックフォード）により、付属 のウシ血清アルブミン標準液（ＢＳＡ）を用いて測定された。試料（二重）をＢ ＳＡ標準液の範囲の濃度にＨ₂Ｏで希釈した。１００μｌの各試料またはＢＳＡ 標準液を、２ｍｌのパース・ワーキング・リエージェント（Ｐｉｅｒｃｅ Ｗｏ ｒｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）に添加した。この試薬溶液は、１部の試薬Ｂに対 し５０部の試薬Ａを含有していた。試料を渦撹拌し、次いで振とう水浴内で３７ ℃において３０分間インキュベートした。次いで５６２ｎｍでブランクバイアル に対し各試料の吸光度を測定した。 デキストロメトルファンアッセイの分析方法：このアッセイのインキュベーシ ョン条件は、Ｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）から採用された。 デキストロメトルファンからデキストロルファンへの反応速度：デキストロメ トルファンからデキストロルファンへの反応速度を、蛋白質濃度と時間の関数と して測定した。濃度５μＭのデキストロメトルファンを、０．２Ｍリン酸緩衝液 （ｐＨ７．４）中において蛋白質０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０． ３、０．４および０．５ｍｇ／ｍｌで、０．８ｍＭのＮＡＤＰＨと共にインキュ ベートした。インキュベーション混合物は、全容量２５０μｌにつき１２５μｌ のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５０μｌのミクロソーム蛋白質、５０μｌのデ キストロメトルファンおよび２５μｌのＮＡＤＰＨからなっていた。振とう水浴 内で３７℃において３０分間インキュベートし、１０μｌの過塩素酸を添加して 反応停止した。ブジピンを内標準として用いた。次いで試料を３０００ｒｐｍで ５分間遠心し、３０μｌの上清をＨＰＬＣにより分析した。その結果、デキスト ロルファン生成は３０分間のインキュベーション期間中、蛋白質０．０２５ｍｇ ／ｍｌから０．５ｍｇ／ｍｌまで直線的であることが分かった。デキストロメト ルファンを１、２．５、５、１０、５０および７５μＭ濃度で（二重）、ミクロ ソーム蛋白質濃度０．１２５ｍｇ／ｍｌにおいて３７℃で３０分間インキュベー トすることにより、見掛けのＫ_mおよびＶ_max値を測定した。 ＨＰＬＣ：ＨＰＬＣシステム（ヒューレット・パッカード）は、ＨＰ ３３９ ６シリーズＩＩ積分計に接続した１０５０系列のポンプとオートサンプラーから なる。ＣＳＣ−スフェリソルブ−フェニル（ＣＳＣ−Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ−Ｐ ｈｅｎｙｌ）（５μｍ，４．６ｍｍ×２５ｃｍ）カラムと、１ｍＭヘプタンスル ホン酸を含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．８）およびアセトニ トリル（８０：２０ ｖ／ｖ）からなる移動相（流量１．７ｍｌ／分に設定）を 用いた。インキュベーション試料中のデキストロメトルファンおよび種々の代謝 産物をＢｒｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に従って測定し、ただし感度を 高めるために励起および発光波長をそれぞれ１９５ｎｍおよび２８０ｎｍに設定 した。デキストロルファン検量曲線はＯｐｍｏｌから１２０ｐｍｏｌまで直線的 であり、デキストロルファンにつき最小検出量は５ｐｍｏｌであった。日内変動 （ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ−ｄａｙ）係数は、０．２５および０．５ ｎｍｏｌ／ｍｌのデキストロルファン注入につき、それぞれ２．７％および２． ０％（ｎ＝５）であった。日間変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ−ｄ ａｙ）係数は、０．１２５および０．５ｎｍｏｌ／ｍｌのデキストロルファン濃 度につき、それぞれ６．５％および９．６％（ｎ＝６）であった。 ニコチンアッセイのための分析法 インキュベーション：ミクロソームを−７０℃のフリーザーから取り出し、氷 上で融解した。インキュベーション混合物は、一般に１００μｌの（Ｓ）−ニコ チン、１００μｌのＮＡＤＰＨ（最終１ｍＭ）、２００μｌのヒト肝ミクロソー ム（０．５ｍｇ／ｍｌ）、２０μｌのウィスター（Ｗｉａｔｅｒ）ラット肝細 胞質ゾル、２００μｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４、最終４０μＭ）を 含有し、１．１５％ＫＣｌで１ｍｌの最終容量に希釈された。ＮＡＤＰＨを添加 し、試料を３７℃に置くことにより、反応を開始した。混合物をポリプロピレン 製の１０ｍｌ容コニカル試験管中でインキュベートし、次いで３７℃のプレサイ ション・サイエンティフィック振とう浴（５０型）内に４５分間置いた。１００ μｌの２０％Ｎａ₂ＣＯ₃（ｐＨ１１．４）を添加することにより反応を停止した 。ニコチンからコチニンへの反応速度試験は、１、５、１０、５０、１００およ び２００μＭの（Ｓ）−ニコチンを０．５ｍｇ／ｍｌのミクロソーム蛋白質と共 に、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、２０μｌのラット肝細胞質ゾル 、１ｍＭのＮＡＤＰＨの存在下に４５分間インキュベートすることにより実施さ れた。ＮＡＤＰＨの添加により反応が開始した。インキュベーション混合物は、 からなっていた。反応速度パラメーターは、コンピュータープログラム、エンツ フィッター（Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒ）を用いて計算された（Ｒｏｂｉｎ Ｊ．Ｌｅ ａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，１９８７）。データを１部位ミカエリス−メンテン速 度方程式により調整した。 抽出：Ｎａ₂ＣＯ₃で塩基性にした後、１０μｌのケタミン（内標準）を各試料 に添加した。抽出のために酢酸エチル（３ｍｌ）を添加した。試料を５分間激し く渦撹拌し、次いでＧＬＣ−２Ｂ遠心機により３０００ｒｐｍで５分間遠心した 。４００μｌの０．０１Ｎ ＨＣｌを入れた別個の１０ｍｌコニカル試験管に、 有機層（上）をピペットで移した。試料を再び５分間渦撹拌し、３０００ｒｐｍ で５分間遠心した。次いで有機層を廃棄し、残りの水層試料を窒素下に３７℃で ３０分間乾燥させて、残留する有機溶媒を除去した。次いで各試料３０μｌを高 性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析した。 ＨＰＬＣ：ニコチンと代謝産物の分離は、ＣＳＣ−スフェリソルブ−ヘキシル （ＣＳＣ−Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ−Ｈｅｘｙｌ）カラム（１５×０．４６ｃｍ） を用いて行われ、アセトニトリル２０％、および１ｍＭオクタンスルホン酸を含 有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．６）８０％からなる移動相を使 用した。分離は流量１ｍｌ／分の無勾配溶離により実施された。コチニン、ニコ チンおよびケタミンの保持時間は、それぞれ３．５、４．２および７．０分であ った。この系の最小検出限界は、インキュベーション混合物１ｍｌにつきコチニ ン３００ｐｍｏｌであった。日内および日間変動係数は、１０％未満（ｎ＝６） であることが認められた。ＨＰＬＣシステムは、１０５０シリーズＵＶ検出器に 接続したヒューレット・パッカード１０９０溶媒運搬システムからなっていた。 ＵＶ検出器をコチニン検出に最適化するために２１０ｎｍに設定した。 データ分析．ＵＶ吸収データをヒューレット・パッカード、ケムステーション （Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ）に移した。目的とする３つのピークはコチニン、ニ コチンおよびケタミン（内標準）であった。各ピークの高さを用いてピーク高さ 比を判定した。詳細には、ケタミンピーク高さに対するコチニンピーク高さの比 率を測定することにより、コチニンピーク高さ比を判定した。 このピーク高さ比を利用して相対コチニン産生量を分析し、各試料インキュベー ションに際して存在するコチニン比濃度を判定した。これは、各データ採集期間 中に標準曲線を作成することにより達成された。 標準曲線は、種々の濃度のコチニンをＨＰＬＣに注入することにより作成され た。コチニン量には、一般に１．２５、２．５、５．０および１０．０ｎｍｏｌ 濃度を含めた。濃度０．２５ｍｇ／ｍｌのケタミン１０μｌを各試料に添加した 。この標準曲線により、特定の試料から求めた特定のＰＨＲをそのそれぞれのコ チニン濃度（ｎｍｏｌ）に変換できた。 日内変動および日間変動：アッセイの日内変動および日間変動を２種類の濃度 のコチニンにつき計算した。標準溶液は、インキュベーション混合物１ｍｌにつ き２．５ｎｍｏｌおよび５．０ｎｍｏｌのコチニンを含有していた。試料は４０ ｍＭリン酸緩衝液および１．１５％ＫＣｌを含有していた。それらを前記と同様 に抽出および蒸発処理した。２．５ｎｍｏｌおよび５．０ｎｍｏｌ／ｍｌのコチ ニン濃度につき、日内変動係数はそれぞれ３．１％および２．３％であった。日 間変動はそれぞれ７．２％および８．４％であった。１０％未満の変動係数（Ｃ Ｖ）は許容できるとみなされた。 細胞質ゾルアッセイ．４匹の雄ウィスターラットの肝臓から得た細胞質画分を アルデヒドオキシダーゼ源として用いた。ニコチンからコチニンへの代謝はイミ ニウムイオン中間体を伴う２工程反応であるので、シトクロムＰ４５０によるニ コチン酸化を速度決定工程にすることが必要であった。これは、過剰のアルデヒ ドオキシダーゼを添加することにより行われた。ラット細胞質ゾルの添加量が増 加するのに伴って、コチニン産生が増加し、次いでプラトーに達する。アルデヒ ドオキシダーゼ源として２０μｌの細胞質ゾルを用いることに決定した。ラット 細胞質ゾルは固有のニコチンオキシダーゼ活性をもたなかった。 蛋白質−時間アッセイ．Ｋ２０肝ミクロソーム試料からの濃度０．１２５、０ ．２５、０．５および１ｍｇ／ｍｌの蛋白質を、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７ ．４）中で、２０μｌのラット肝細胞質ゾル、１ｍＭのＮＡＤＰＨと共に、３７ ℃において間隔をおいて数回インキュベートした。結果を図３に示す。これらの 結果は、蛋白質濃度０．１２５〜０．５ｍｇ／ｍｌで４５分のインキュベーショ ンにつき、コチニン形成が直線的であることを示す。コチニン形成はＮＡＤＰＨ 濃度にも依存した。１ｍＭのＮＡＤＰＨ濃度が上記の実験条件に最適であると判 定された。 キニジンおよびクマリンによるコチニン形成阻害．ニコチンをＫ２０ヒト肝臓 からのミクロソーム蛋白質０．５ｍｇ／ｍｌと共にインキュベートした。インキ ュベーションは１ｍＭのＮＡＤＰＨ、２０μｌのラット肝細胞質ゾル、４０ｍＭ のリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含み、３７℃で４５分間実施された。インキュ ベーション試験には、１００μＭのキニジン、１００μＭのクマリン、１００μ Ｍのキニジンとクマリンを、６０μＭの（Ｓ）−ニコチンと共に添加することが 含まれていた。 ＣＹＰ２Ｄ６発現酵母中でのニコチンのインキュベーション．クメンヒドロペ ルオキシド（ＣｕＯＯＨ）支持された酵母において発現したＣＹＰ２Ｄ６を用い るインキュベーション条件は、本質的にＺａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８ ）およびＷｕ（１９９３）のものであった。基本的には、まずＣｕＯＯＨ（クメ ロール中８０％、シグマ）をＨ₂Ｏ中５０％メタノール（ｖ／ｖ）に４０ｍＭ 濃度に希釈し、次いで０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に３７５μ Ｍに希釈した。この溶液２００μｌを１００μｌのニコチン（最終１００μＭ） および２０μｌのラット肝細胞質ゾルに添加し、最終容量１ｍｌ（最終ＣｕＯＯ Ｈ濃度７５μＭ）にした。２００μｌの酵母蛋白質（最終０．３ｍｇ／ｍｌ）を 添加してインキュベーションを開始し、室温で２０分間実施した。インキュベー ションは振とう浴内において３７℃で１２０分間行われた。反応はすべて１００ μｌの２０％Ｎａ₂ＣＯ₃（ｐＨ１１．４）を添加することにより停止された。 結果 ヒト肝ミクロソームにおけるデキストロメトルファンからデキストロルファン への代謝：デキストロルファン形成反応速度を非線形最小二乗アルゴリズムによ り測定し、データに代謝速度の逆数を加重し、１または２部位ミカエリス−メン テン反応速度モデルにより調整した。Ｌ１１肝試料は高親和性酵素反応速度を示 し、これに対しＬ３肝試料は高および低親和性酵素反応速度を両方とも示す。低 親和性酵素部位は肝臓１１例中２例にみられ、これに対し残り９例の肝臓は高親 和性酵素部位のみをもち、Ｋ_mおよびＶ_max値（平均±ＳＤ，ｎ＝９）はそれぞれ ５．７９±２．０１μＭおよび１０．０３±６．５３ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／ｈ ｒであった。Ｋ_m値は約５μＭであったので、５μＭ量のデキストロメトルファ ンを３０例のヒト肝ミクロソームとのインキュベーションに用いた。デキストロ ルファン形成速度をＣＹＰ２Ｄ６活性の尺度として採用した。ＰＣＲ試験により 、ＣＹＰ２Ｄ６仲介反応につき２例の貧メタボライザー遺伝子型（ｂ／ｂ）（Ｌ １８およびＬ１９）、４例のヘテロ接合広域メタボライザー（ｗｔ／ｂ：Ｌ２６ 、Ｌ２７、Ｌ６１およびＬ６３）が認められ、残りの肝臓は広域メタボライザー 遺伝子型（ｗｔ／ｗｔ）を示した。 ニコチンからコチニンへの反応速度 ニコチンからコチニンへの反応速度のＫ_mおよびＶ_max値を、３０例すべてのヒ ト肝ミクロソームにつき計算した。ニコチンからコチニンへの反応速度のミカエ リス−メンテン曲線の例を図４に示す。これらのグラフは１部位または多部位 酵素反応速度を呈する肝臓を示す。図５は３０例すべての試料の各Ｋ_m値を比較 したものである。性差を調べるために、これらの図を男女の肝ドナーに区分した 。３０例すべての肝臓の平均Ｋ_m値は６６．６±３１．８ｍＭ（平均±ＳＤ）で ある。Ｖ_maxの結果から、コチニン形成に顕著な個体間変動が認められた（図６ ）。４例のヒト肝臓はきわめて高いコチニン形成速度をもつと思われた。スチュ ーデントのｔ−検定により判定して、男女間のＶ_max値には有意差があったが（ ｐ＝０．０７）、女性４例の高いＶ_max値を除外すれば有意差はなかった（ｐ＝ ０．７８）。Ｌ３２とＬ６０の肝ミクロソーム試料間には、コチニン形成のＶ_{ma x} 値に約３０倍の差がある。３０例すべての肝臓の平均Ｖ_max値は２８．９±２８ ．９ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／ｈｒ（平均±ＳＤ）である。 ＣＹＰ２Ｄ６活性とコチニン形成の相関 デキストロメトルファンからデキストロルファンへの代謝により測定したＣＹ Ｐ２Ｄ６を、３０例のヒト肝臓についてのニコチンからコチニンへのＶ_max値と 比較した。詳細には、デキストロルファン形成速度をＣＹＰ２Ｄ６活性の尺度と して用いた。その結果、ＣＹＰ２Ｄ６活性とコチニン形成の間には相関が認めら れなかった（ｒ＝０．２１，ｐ＝０．２７）。 コチニン形成の阻害 ＣＹＰ２Ｄ６酵素の特異的阻害物質であるキニジンは、コチニン形成に対し若 干の阻害作用をもっていた。１００μＭのキニジン（ＣＹＰ２Ｄ６によるデキス トロメトルファンからデキストロルファンへの代謝の阻害に関するそのＫ_i値よ り１０００倍高い；Kerry他，1994）は、コチニン形成を約２０％阻害した。１ ００μＭクマリンの存在下では、コチニン形成は８０％以上阻害された。キニジ ンをクマリンと組み合わせて添加しても、阻害はほとんど増加しなかった。 ＣＹＰ２Ｄ６発現酵母によるニコチン代謝 ＣＹＰ２Ｄ６発現酵母および対照酵母と共にニコチンをインキュベートしても 、コチニンのピーク高さ比に差が示されなかった。不活性ＣＹＰ２Ｄ６発現酵母 の 可能性を調べた。ＣＹＰ２Ｄ６の基質であるｐ−メトキシアンフェタミン、メタ ンフェタミンおよびデキストロメトルファンはすべて、このＣＹＰ２Ｄ６発現酵 母により酸化された。酵母におけるニコチンインキュベーションを、ｐ−メトキ シアンフェタミンインキュベーションと同時に実施した。 考察： ３０例の貯蔵ヒト肝ミクロソームを用いてデキストロメトルファンおよびニコ チンの代謝を調べた。デキストロメトルファンからデキストロルファンへの代謝 により、典型的なミカエリス−メンテン反応速度が認められ、若干の肝臓は低親 和性部位を示した。見掛けの高親和性Ｋ_m値は５．７９±２．０１（平均±ＳＤ ）であった。したがってそれぞれの肝臓においてＣＹＰ２Ｄ６活性に到達するた めに、５μＭのデキストロメトルファンを３０例のヒト肝ミクロソームと共にイ ンキュベートした。ニコチンからコチニンへの代謝も、同じ３０例のヒト肝臓に おいて調べた。これには前記の新規なアッセイ法を開発する必要があった。ニコ チンからコチニンへの代謝は２工程反応であるので、ＣＹＰ酸化工程が速度決定 工程となるように、過剰量のアルデヒドオキシダーゼを各インキュベーションに 添加した。コチニン形成はミカエリス−メンテン反応速度に従い、見掛けのＫ_m 値およびＶ_max値（平均±ＳＤ）は、それぞれ６６．７±３１．８μＭおよび２ ８．９±２８．９ｎｍｏｌ/ｍｇ蛋白質／ｈｒ（平均±ＳＤ）であった。 デブリソキンのＣＹＰ２Ｄ６貧メタボライザー表現型がニコチン代謝の低さに 対し役割をもつことを示す最近の研究（Ｃｈｏｌｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９９４）があるので、ＣＹＰ２Ｄ６の役割を検討した。最初に設定した実験は、 ３０例のヒト肝ミクロソームにおいてＣＹＰ２Ｄ６活性とニコチンからコチニン への酸化の相関の可能性を見出すことが目標であった。ＣＹＰ２Ｄ６活性に関す る探査薬物としてデキストロメトルファンを用いた。その結果、低いデキストロ ルファン形成速度を示した肝ミクロソームはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型判定試験に密 接に関連することが認められた。デキストロルファン形成速度をニコチンからコ チニンへのＶ_max値に対しプロットした。ＣＹＰ２Ｄ６活性とニコチンからコチ ニンへの代謝の間には相関がみられなかった（ｒ＝．２１，ｎ＝３０）。これは 、 ＣＹＰ２Ｄ６がニコチン代謝に伴う主要な酵素ではないことを示唆する。 相関試験は決定的な形の証拠ではないので、補足試験を行った。特異的なＣＹ Ｐ２Ｄ６阻害物質であるキニジンを、０．１、１．０、１０および１００μＭで 試験した。ＣＹＰ２Ｄ６阻害に特異的な濃度０．１および１．０μＭで、コチニ ン形成阻害はみられなかった。ＣＹＰ２Ｄ６に関するＫ_f値（Ｋ_i約１００ｎＭ； Ｋｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４）より１００〜１０００倍高い１０および １００μＭでは、それぞれ８％および２５％のコチニン形成阻害が起きた。これ に対し、特異的ＣＹＰ２Ａ６基質であるクマリンは、同じ濃度でコチニン形成を ８０％以上阻害した。ニコチン代謝からＣＹＰ２Ｄ６を除外するさらに強力な証 拠は、ｃＤＮＡ発現試験で得られる。ＣＹＰ２Ｄ６を発現している溶解リンパ芽 球またはＣＹＰ２Ｄ６ ｃＤＮＡを発現している酵母ミクロソームと共にニコチ ンをインキュベートしても、両方ともニコチンをコチニンに代謝できなかったが 、ＣＹＰ２Ｄ６基質であるデキストロメトルファン（５μＭ）を代謝することは できた。Ｗｕ，１９９３により、支持する証拠がさらに得られる。彼は、ニコチ ンがヒト肝ミクロソームにおいてＣＹＰ２Ｄ６によるデキストロメトルファン代 謝を阻害しないことを示した。 実施例２ニコチン代謝におけるＣＹＰ２Ａ６およびＣＹＰ２Ｂ６の役割 ＣＹＰ２Ｄ６酵素はニコチンからコチニンへの代謝に関与しないと思われるの で、他のシトクロムＰ４５０の役割を調べた。特にニコチン代謝の個人差への関 与につき、ＣＹＰ２Ａ６の重要性をインビトロで調べた。ヒトの類リンパ芽球に おいて異種発現するＣＹＰ２Ａ６は、ニコチンからコチニンへの変換に際し最も 高い活性をもつもののひとつであり、ＣＹＰ２Ｂ６に次いで２番目である（Ｍｃ Ｃｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 実施例２に概説した実験では以下の材料および方法を用いた： 材料および方法： ヒト肝ミクロソーム．この試験でも実施例１で用いたものと同じ３０例のヒト 肝試料を用いた。 薬物および化学物質．（Ｓ）−ニコチン、（Ｓ）−コチニン、ＮＡＤＰＨ、ト リス−ＨＣｌ、オクタンスルホン酸、トロレアンドマイシン、オルフェナドリン およびケタミンは、シグマ・ケミカル社（米国ミズーリ州セントルイス）から得 られた。７−メトキシクマリン、７−メチルクマリンおよび７−エトキシクマリ ンは、アルドリッチ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。クマリン および酢酸エチルは、カレドン（カナダ国オンタリオ州ジョージタウン）から得 られた。リン酸カリウムはマリンクロット（カナダ国オンタリオ州ミッシソーガ ）から購入された。抗体はジーンテスト社（米国マサチュセッツ州ウーバン）か ら購入された。 化学的阻害試験．広範な化学的阻害試験は、１００μＭの（Ｓ）−ニコチンを １５０μＭ濃度のクマリン、オルフェナドリン、トロレアンドマイシンと組み合 わせて、またクマリンをオルフェナドリンと組み合わせて、３０例すべてのヒト 肝ミクロソームと共に二重試験法でインキュベートすることからなっていた。阻 害を最大にし、かつそれ自身の代謝による損失を少なくするために、特異的阻害 物質それぞれにつき１５０μＭ濃度を採用した。反応速度試験からみて、この阻 害物質濃度はニコチンからコチニンへの代謝に関する平均Ｋ_m値の約２倍である 。ニコチン濃度は１００μＭに設定された。これはコチニン形成に関するＶ_max の濃度に近い濃度であった。各酵素はニコチンに対し異なる親和性をもつと思わ れるので、ニコチン代謝に伴う各シトクロムＰ４５０の寄与を最大にするために 、この濃度を選んだ。インキュベーション条件は、前記の実施例で述べたものと 同様であった。クマリンがニコチン代謝を阻害することが示されたので、クマリ ン類似体をニコチンと共にインキュベートした。高濃度および低濃度（１０およ び１００μＭ）のクマリン、７−メチルクマリン、７−メトキシクマリンおよび ７−エトキシクマリンをＫ２７ヒト肝ミクロソーム中で５０μＭのニコチンと共 にインキュベートした。 免疫化学的阻害試験．免疫阻害試験は、０．５ｍｇ／ｍｌのＫ２７肝ミクロソ ームをＣＹＰ２Ａ６モノクローナル抗体（ＭＡＢ−２Ａ６）およびＣＹＰ２Ｂ１ （抗ラットＣＹＰ２Ｂ１）ポリクローナル抗体と共にインキュベートすることか らなっていた。抗体とミクロソームを氷上で３０分間プレインキュベートし、 続いて２５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液中、１００μＭのニコチン、１ｍＭのＮＡ ＤＰＨおよび２０μｌのラット細胞質ゾルを添加した。抗体濃度は、ジーンテス ト社が提供した免疫阻害情報に基づいて選ばれた。図７に、それぞれの酵素に対 するＭＡＢ−２Ａ６および抗ラットＣＹＰ２Ｂ１の力価および特異性を示す。ジ ーンテスト社は、ＭＡＢ−２Ａ６が抗体０．２５ｍｇ／ミクロソーム蛋白質μｇ で２Ａ６活性を９５％以上阻害したと述べている。彼らは２Ａ６活性の尺度とし てクマリンヒドロキシル化を用いた。彼らは抗ラット２Ｂ１がヒトＣＹＰ２Ｂ６ 酵素と交差反応してその活性を阻害することも示した。 ウェスタンブロット分析．肝ミクロソーム蛋白質（３０μｇ）を１０％ＳＤＳ −ＰＡＧＥゲルに溶解し、エレクトロブロッティング（ウェスタンブロッティン グ）によりニトロセルロースに移した（１２０Ｖ、１８時間、室温）（Ｇｕｅｎ ｇｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８２ａ）。１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭ のトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２ ０に溶解した２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ＴＢＳＴ）により、ブロットを室温で１時 間ブロックした。一次および二次抗体とのインキュベーションをＴＢＳＴ中で１ 時間実施した。一次および二次抗体は、それぞれモノクローナルＣＹＰ２Ａ６抗 体（５ｍｇ／ｍｌ原液の１／２０００希釈；ジーンテスト社）、および抗マウス ＩｇＧ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（１／２０００希釈；アマシャ ム社、イリノイ州アーリントン・ハイツ）であった。ブロットを一次および二次 抗体と共にそれぞれインキュベートした後、ＴＢＳＴで１０分間ずつ３回洗浄し た。化学発光性ＥＣＬ試薬（アマシャム社）で視覚化した。視覚化したバンドの 濃度をＭＣＩＤイメージングシステム（イメージング社）により定量した。ＣＹ Ｐ２Ａ６バンドの検出の直線性を判定した後（図８）、比較のため各肝臓につき ３０μｇ濃度のミクロソーム蛋白質を用いた。 結果： ニコチン代謝におけるＣＹＰ２Ａ６ 特異的かつ選択的なＣＹＰ２Ａ６基質であるクマリンは、平均阻害率８４±１ １％（平均±ＳＤ）でコチニン形成を有意に阻害した（図９および１０）。Ｋ２ ７ヒト肝ミクロソームを用いて、見掛けのＫ_i値が約２．０μＭ（ｎ＝３）と測 定された。Ｄｉｘｏｎプロットの例を図１１に示す。この相互作用の競合性が、 Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎプロット（Ｃｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎ，１９ ７４）を作成することにより確認された。クマリンおよび３種類のクマリン類似 体を、Ｋ２７肝ミクロソーム中で５０μＭニコチンと共にインキュベートした。 クマリン、７−メチルクマリン、７−メトキシクマリンおよび７−エトキシクマ リンにつき、阻害結果および順位を図１２に示す。４種類の化合物のうちクマリ ンがコチニン形成に対し最も強い阻害作用をもっていた。２Ａ６に対し産生され た特異的モノクローナル抗体を用いて免疫阻害実験を行った。その結果、ミクロ ソーム１μｇ当たり０．５μｇのＭＡＢ−２Ａ６を１００μＭのニコチンと共に インキュベートすると、５０％以上のコチニン形成阻害を示した（図１３）。３ ０例のヒト肝ミクロソームそれぞれにおいて、免疫反応性ＣＹＰ２Ａ６を測定し た。各バンドの濃度を利用して、肝臓間のＣＹＰ２Ａ６相対量を比較した（図１ ４）。バンド濃度をそれらそれぞれのブロットの３０μｇＬ６４バンド濃度で割 ることにより、標準化した。ブロット間の個々のバンド濃度を比較できるように これを行った。Ｌ６４標準曲線により判定して直線範囲外にある肝臓については 、３および１０μｇ量でウェスタンブロット分析を繰り返した。ＣＹＰ２Ａ６と ニコチンの相関試験に用いた数値の一覧表を表１に示す。ウェスタンブロットか ら得たバンド濃度を用いて、ＣＹＰ２Ａ６量とコチニン形成のＶ_max値の間に強 い相関（ｒ＝０．９０，ｎ＝３０，ｐ＜０．００１）がみられた（図１５）。こ の相関から４つの高Ｖ_max肝臓を除外すると、このｒ値は０．６０に低下する。 ＣＹＰ２Ａ６免疫活性を１５０μＭ濃度クマリンの存在下での阻害されたコチニ ンの量に対しプロットすると、より強い相関（ｒ＝０．９４，ｎ＝３０，ｐ＜０ ．００１）がみられた（図１６）。４つの高Ｖ_max肝臓を除外すると、このｒ値 は０．６４に低下する。図１７に示したＶ_max／Ｋ_m値は、個々の肝臓がニコチン をコチニンに代謝する効率に関する優れた尺度を与える（すなわち、この数値が 高いほど肝臓は効率的である）。これらのＶ_max／Ｋ_m値をＣＹＰ２Ａ６免疫活性 に対しプロットすると、強い相関（ｒ＝０．９４，ｎ＝３０，ｐ＜０．００１） がみられた（図１７）。４つの高Ｖ_max肝臓を除外しても、この相関は強いまま であった（ｒ＝０．８４）。 ニコチン代謝におけるＣＹＰ２Ｂ６ ＣＹＰ２Ｂ６阻害物質であるオルフェナドリンは、約２０±１６％（平均±Ｓ Ｄ）のやや弱い阻害を示した（図１８および１９）。ラットＣＹＰ２Ｂ１に対し 産生された抗体を含有させた場合、Ｋ２７ヒト肝ミクロソームにおいて３０％の コチニン形成阻害がみられた（図２０）。クマリンとオルフェナドリンの組み合 わせも使用し、これは全体として９２±１１％（平均±ＳＤ）のコチニン形成阻 害を示した（図２１）。 ニコチン代謝におけるＣＹＰ３Ａ４ ＣＹＰ３Ａ阻害物質であるトロレアンドマイシンは、全体としてコチニン形成 阻害を示さなかった。平均阻害率は対照コチニン形成の３％、標準偏差１１％で あった（図２２）。 考察： ＣＹＰ２Ｄ６によるニコチンからコチニンへの代謝は重要性が少ないと結論さ れたので、他のシトクロムＰ４５０の役割を調べた。特にＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ ２Ｂ６の重要性を検討した。これらの酵素は両方ともヒトにおける発現が変動し 、若干のニコチンオキシダーゼ活性を含むことが示されているからである（Ｆｌ ａｍｍａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２；ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。 化学的阻害試験では、特異的ＣＹＰ２Ａ６基質であるクマリンの添加後にコチ ニン産生が有意に阻害された（Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｙａｍ ａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。 ３０例のヒト肝臓につき、クマリンをニコチンの存在下でインキュベートした。 その結果、全体としてコチニン形成阻害が示された。クマリン単独の存在下でニ コチンをインキュベートすると、コチニン形成が８０％以上阻害され、オルフェ ナドリンを添加すると、この数値は９１％に上昇した。特にクマリンとオルフェ ナドリンを組み合わせて用いると、３０例中２３例の肝臓が９０％以上のコチニ ン形成阻害を示した。これらの実験で、クマリンによるニコチン代謝阻害は競合 性で、かつＫ_i値が約２．０μＭでかなり有効であることが認められた。図１２ に、コチニン形成阻害におけるクマリンと３種類の類似体の作用をまとめる。力 価順位は、クマリン＞７−メトキシクマリン＞７−メチルクマリン＞７−エトキ シクマリンであった。７−エトキシクマリンがクマリンより低いニコチン代謝阻 害作用をもつことは注目される。７−エトキシクマリンは多くのヒトシトクロム Ｐ４５０酵素（すなわち、ＣＹＰ １Ａ１、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ８、 ２Ｃ９、２Ｅ１および３Ａ４）の周知の基質だからである（Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。これは、ニコチンとクマリンの代謝が密接に関連するこ とを示唆する。免疫化学的阻害試験では、ヒトＣＹＰ２Ａ６に対し産生されたモ ノクローナル抗体がコチニン形成を６０％阻害することが認められた。ＣＹＰ２ Ａ６の免疫活性もかなり変動し、Ｌ２７とＬ６０ヒト肝臓間で３００倍以上の差 があった。これらの実験条件下で、Ｌ３２肝試料にはこの酵素が検出可能な量で みられなかったことは注目される。おそらくこの個体はＣＹＰ２Ａ６多型に関す る変異体対立遺伝子を保有するのであろう。ウェスタンブロット分析では、ニコ チン代謝がＣＹＰ２Ａ６濃度と高い関連性をもつことが認められた。３０例のヒ ト肝臓において、ニコチンからコチニンへのＶ_max値はＣＹＰ２Ａ６濃度と相関 していた（ｒ＝０．９０，ｐ＜０．００１）。クマリンによる阻害結果を相対Ｃ ＹＰ２Ａ６活性の尺度として利用でき、これにより免疫反応性ＣＹＰ２Ａ６につ きさらに強い相関性（ｒ＝０．９４，ｐ＜０．００１）がみられた。ＣＹＰ２Ａ ６濃度はＶ_max／Ｋ_m値とも強く相関していた（ｒ＝０．９４，ｎ＝３０，ｐ＜０ ．００１）。 図５および６に示すように、３０例のヒト肝ミクロソームによるニコチン代謝 は大きな個体間変動を示した。特に最低と最高の代謝速度間には３０倍の変動が みられた。例外的に高いコチニン形成を伴う４例の肝臓がすべて女性のものであ ったのは注目される。しかしインビボ試験では、ニコチン代謝が女性より男性の 方が速やかであることが示される（Ｂｅｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９７１； Ｂｅｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。コチニン形成と年齢に関しては 相関性がなかった。コチニン形成の差はＣＹＰ２Ａ６酵素の発現の変動性により 説明できる。例外的に高いコチニンオキシダーゼ活性をもつ同じ４例の個体のＣ ＹＰ２Ａ６酵素量も多かった。考えられる説明のひとつは、高いニコチン代謝速 度を示す４例の肝臓がＣＹＰ２Ａ６量を増加させる可能性のある環境内誘因物質 （すなわち、フェノバルビタール）に被曝したというものである。要約すると、 この試験はＣＹＰ２Ａ６がヒト肝でのニコチン代謝にきわめて重要であることを 示す。 ＣＹＰ２Ｂ６については、ヒト肝で構成性発現しないこと、またフェノバルビ タール被曝により誘導されるらしいことが、先の文献で示されている。ある研究 で、ウェスタンブロットにより測定して検出可能な量のこの酵素は５０例中１２ 例の肝臓で発現するにすぎないことが示された（Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。本発明の試験では、ニコチン代謝におけるＣＹＰ２Ｂ６の重要性を 調べるためにオルフェナドリンおよび抗ラット２Ｂ１を用いた。オルフェナドリ ンは抗パーキンソン病薬であり、フェノバルビタール誘導されたミクロソームに おいてのみ、肝ミクロソームで阻害性の中間複合体を形成することが示されてい る（Ｒｅｉｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。化学的阻害試験で１５０μＭのオ ルフェナドリンを用いると、全体として正味２０±１６％（平均±ＳＤ）の阻害 が起きた。２Ｂ１に対し産生された抗体は、ジーンテスト社のヒトＣＹＰ２Ｂ６ 酵素に対し親和性をもつことが示されている。彼らは特異的２Ｂ６仲介反応を阻 害するために、同様な濃度の抗体を用いた。先のｃＤＮＡ試験で、この酵素は知 られているうちで最高のニコチン酸化速度をもつことが示されている（Ｆｌａｍ ｍａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２；ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９ ９２）。したがって、フェノバルビタールなどの環境内誘因物質に被曝する特定 の個体においては、ＣＹＰ２Ｂ６がニコチン代謝に重要な役割をもつ可能性があ る。 ニコチン代謝におけるＣＹＰ３Ａ類の役割を調べるために、数種類のＣＹＰ３ Ａ酵素に対する基質であるトロレアンドマイシンを用いた。ＣＹＰ３Ａ類はヒト 肝でみられる最も多量のＣＹＰであるので（Ｓｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，１ ９９４）、ＣＹＰ３Ａ問題に対する回答を得るのが重要であった。ＣＹＰ３Ａの 発現もフェノバルビタール被曝により誘導される。したがってこれはニコチン代 謝変動の重要な原因である可能性がある。したがって化学的阻害試験で用いたト ロレアンドマイシンは陰性対照として採用された。その結果は、ＣＹＰ３Ａサブ ファミリーがニコチン代謝に関与しないことを示した先の試験と一致する。 ＣＹＰ２Ａ６はニコチン代謝に重要な役割をもつことが示されたので、ＣＹＰ ２Ａ６発現の変動がコチニン形成にみられた高い個体間変動に直接に関係する可 能性がある。ＣＹＰ２Ａ６の遺伝的変動およびＣＹＰ２Ｂ６発現の変動が、ヒト 被験者のニコチン代謝にみられた３倍の変動に関係しているかもしれない（Ｂｅ ｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。フェノバルビタール被曝は、主とし てシトクロムＰ４５０酵素の発現増加により、ニコチン代謝に誘導性の影響を与 えることが示されている（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｈｉｂ ｂｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｆｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｅ ａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｅａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３） 。フェノバルビタールで予備処理したラット潅流肝は、食塩水処理した対照と比 較して１４倍のニコチン排出増加を示した（Ｒｕｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９ ８７）。個体をフェノバルビタールで予備処理したヒト肝細胞試験では、正常よ り高いニコチン酸化速度が示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９ ０）。ある試験で、霊長類のＣＹＰ２Ａ仲介による活性がフェノバルビタール被 曝に伴って上昇することが示された（Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２） 。ＣＹＰ２ＡとＣＹＰ２Ｂの遺伝子サブファミリーは染色体１９上で近接してい る。したがって、ヒト肝においてこれらのサブファミリー内の遺伝子の発現に共 通の因子が影響を与える可能性がある（Ｍｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９， １９９０；Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これは、ＣＹＰ２ Ｂ６と共に、ヒトＣＹＰ２Ａ６発現がフェノバルビタール被曝により影響を受け る可能性を示す。次いでこれが体内からのニコチンの全体的代謝排出に影響を与 えるであろう。数例の研究で、喫煙者はニコチンの血中濃度を調節または維持す るように自分の喫煙挙動を調整することが示されている（ＭｃＭｏｒｒｏｗ ｅ ｔ ａｌ．，１９８３；Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。したがって ニコチン代謝の早い者はニコチン濃度を維持するために喫煙量を増す可能性があ り、このため潜在的に有毒な物質に、より多く被曝する。これは、ＣＹＰ２Ａ６ および ＣＹＰ２Ｂ６仲介による反応を高めることが示されているフェノバルビタールに 個体が被曝した場合に起きる可能性がある。逆に、ニコチン代謝の遅い者は喫煙 量が少なく、したがって有毒なニコチン量に達しないか、またはニコチン関連の 有毒作用のリスクが高い可能性がある。これは、変異／不活性型のＣＹＰ２Ａ６ をもつ個体に起きる可能性がある。 これらの試験で、ニコチン代謝にはＣＹＰ２Ａ６が重要であること、およびニ コチン代謝はヒト肝ミクロソーム個体間でかなり変動することが確認された。こ の変動性は以前の薬物使用の結果である可能性があり、ＣＹＰ２Ａ６の場合は変 異体ＣＹＰ２Ａ６対立遺伝子が存在する可能性がある。 実施例３各種化合物を用いた化学的阻害試験 １０および１００μＭ濃度のクマリン、７−メチルクマリン、７−メトキシク マリンおよび７−エトキシクマリンを、５０μＭのニコチンと共にＫ２７ヒト肝 ミクロソーム中でインキュベートした。さらに、１０、３０および５０μＭ濃度 のニコチンを、Ｋ２７肝ミクロソームを用いて、０、１、２および５μＭ濃度の クマリンの存在下でインキュベートした。メトキサレン、ナリンゲニンおよびジ エチルジチオカルバミン酸など、他の化合物も、それらがＣＹＰ２Ａ６に与える 阻害作用につき試験した。 材料および方法： ミクロソームを−７０℃のフリーザーから取り出し、氷上で融解した。インキ ュベーション混合物は、一般に１００μｌの（Ｓ）−ニコチン、１００μｌのＮ ＡＤＰＨ（最終１ｍＭ）、２００μｌのヒト肝ミクロソーム（０．５ｍｇ／ｍｌ ）、２０μｌのウィスターラット肝細胞質ゾル、２００μｌのリン酸カリウム緩 衝液（ｐＨ７．４、最終４０μＭ）を含有し、１．１５％ＫＣｌで１ｍｌの最終 容量に希釈された。ＮＡＤＰＨを添加し、試料を３７℃に４５分間置くことによ り、反応を開始した。１００μｌの２０％Ｎａ₂ＣＯ₃（ｐＨ１１．４）を添加す ることにより反応を停止した。 抽出：Ｎａ₂ＣＯ₃で塩基性にした後、１０μｌのケタミン（内標準）およ び酢酸エチル（３ｍｌ）を各試料に添加した。試料を５分間激しく渦撹拌し、次 いで３０００ｒｐｍで５分間遠心した。４００μｌの０．０１Ｎ ＨＣｌを入れ た別個の１０ｍｌコニカル試験管に、有機層（上）をピペットで移した。試料を 再び５分間渦撹拌し、３０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで有機層を廃棄し 、残りの水層を窒素下に３７℃で３０分間乾燥させて、残留する有機溶媒を除去 した。次いで各試料３０μｌを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析 した。 ＨＰＬＣ：ニコチンと代謝産物の分離は、ＣＳＣ−スフェリソルブ−ヘキシル カラム（１５×０．４６ｃｍ）を用いて行われ、アセトニトリル２０％、および １ｍＭオクタンスルホン酸を含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ４． ６)８０％からなる移動相を使用した。分離は流量１ｍｌ／分の無勾配溶離によ り実施された。コチニン、ニコチンおよびケタミンの保持時間は、それぞれ３． ５、４．２および７．０分であった。 結果： クマリンおよびクマリン類似体はＣＹＰ２Ａ６によるニコチン代謝を阻害する ことができ、数種類（たとえばクマリン、７−メチルクマリンおよび７−メトキ シクマリン）はそれらが有効な阻害物質であることを示すＫ_i（阻害定数）をも つ。これに関しては図１１、３０Ａ、３０Ｃ、３０Ｄおよび３１を参照されたい 。図１１は、１０、３０および５０μＭ濃度のニコチンを、Ｋ２７肝ミクロソー ムを用いて、０、１、２．５および５μＭ濃度のクマリンの存在下でインキュベ ートした際の、クマリンによるコチニン形成阻害のＤｉｘｏｎプロットを示す。 図３１は、Ｋ２８ヒト肝ミクロソームにおける、７−メトキシクマリンによるニ コチンからのコチニン形成の阻害のＤｉｘｏｎプロットを示す。 Ｄｉｘｏｎプロットに表されるデータは、メトキサレンがＣＹＰ２Ａ６による ニコチン代謝のきわめて有効な阻害物質であることを示す（Ｋ_i＝２０ｎＭ）(図 ３２参照)。図３３のＣｏｒｎｉｓｈ−Ｂｏｗｄｅｎプロットから、阻害機構は 混合しているように思われる。 これらのデータは、メトキサレンによるＣＹＰ２Ａ６阻害がメトキサレンとヒ ト肝ミクロソームのプレインキュベーションによって増すことをも証明する（図 ３４参照）。これは、阻害機構が純粋に競合性でなく、機構ベース型（ｍｅｃｈ ａｎｉｓｍ−ｂａｓｅｄ）または不可逆型の可能性があることを示唆する。臨床 的には、メトキサレンによるＣＹＰ２Ａ６阻害は、この薬物の血漿中での存在が 持続すると期待できる。 図３５のＤｉｘｏｎプロットが示すように、植物や果実中に見出されるナリン ゲニンなどの天然フラボンは、ＣＹＰ２Ａ６によるニコチン代謝を効果的に阻害 する（Ｋ_i＝４．３μＭ）。この阻害機構は不可逆的であり、ＣＹＰ２Ａ６阻害 持続時間はこの物質が血中に存在するより長いと思われる。 最後に、図３６のＤｉｘｏｎプロットにまとめたデータは、ジエチルジチオカ ルバミン酸がヒト肝ミクロソームによるニコチン代謝を高い親和性で阻害するこ とを示す（Ｋ_i＝１４．５μＭ）。ジエチルジチオカルバミン酸は市販薬物ジス ルフィラムの代謝産物である。これは、この薬物がタバコ依存症の治療に有用で あることを示唆する。 実施例４臨床試験 初期臨床試験を行った。これにより、ＣＹＰ２Ａ６を阻害すると、プラシーボ 予備処置と比較してニコチン（３１μｇ／ｋｇ）皮下投与した７人の依存症喫煙 者において、血漿ニコチン濃度曲線下の面積が平均して５４％という有意性の高 い大きな増加を生じたことが証明される（図２４および２５参照）。 材料および方法： 計画の概要： この試験では、依存症喫煙者を８時間禁煙させ、次いでプラシーボまたはメト キサレン（体重当たり２０〜４０ｍｇ）を、３回のニコチン皮下注射（０、＋１ および＋２時間目に投与）のうち第１回の３０分前に経口投与した。メトキサレ ンは有効なＣＹＰ２Ａ６阻害物質であり（図３２参照）、ヒトにおいて約１時間 の半減期をもつ。血漿中のニコチンおよびコチニンの濃度を測定するために６時 間にわたって頻繁に血液試料を採取し、ニコチンの作用を調べた（たとえば脈拍 数；血圧；症状ならびに喫煙欲および喫煙願望）。 試験日計画： 各試験日前の夜中から各被験者にタバコ、食物、飲料（水以外）、および常用 薬物を禁断させ、ただしこのプロトコールで許容される規定薬物（たとえば経口 避妊薬、日常のビタミン）の摂取は続けさせた。ベースライン測定を行う前に、 禁煙順守を評価するために呼吸ＣＯ試料を採取した（エコライザー（Ｅｃｏｌｙ ｚｅｒ））(予想値＜１０ｐｐｍ)。その後の毎日の計画をここにまとめる。測定 はすべて、１時間ごとに３回のニコチン注射のうち第１回を実施した午前８時の ゼロ時に対するものである。ニコチンを０、＋１および＋２時間目に注射した。 生理学的および主観的ベースライン測定を−３０分、＋３０分、そしてその後 ＋５．５時間目まで１時間ごとに行った。これは、各注射後の予想ピーク血漿ニ コチン濃度とほぼ一致する。血液試料を後記のように少なくとも１時間ごと、第 １回と第３回の注射後の予想ピーク付近ではより頻繁に採取した。 第１回の採血と注射の後に標準的な朝食（ただしカフェインなし）をとらせ、 日中に標準的な昼食（ただしカフェインなし）をとらせた。試験終了時にすべて の測定が完了した時点で、被験者を退院のために医学的に評価した。被験者は退 院後まで喫煙を許可されなかった。 メトキサレン／プラシーボカプセルを、第１回のニコチン注射の３０分前に投 与した。 後続試験日の間に１日または２日のウォッシュアウト期間があった。 薬物処置： プラシーボおよびメトキサレンのカプセルを用いた。次表にメトキサレン投与 量を示す。 この試験では製造業者が推奨する投薬計画を採用した。 投与量 体重(kg) １０ ＜３０ ２０ ３１−５０ ３０ ５１−６５ ４０ ６６−８０ ５０ ＞８０ 無菌の二酒石酸ニコチンをシグマ・ケミカルから得た。報告純度は＞９９.５％ である。無菌食塩水中３１μｇ／ｋｇ（塩基として表す）の二酒石酸ニコチン注 射を採用した。これら１日３回の各注射で７０ｋｇの被験者に２ｍｇが投与され 、これは１本のシガレットにより与えられる薬物量に匹敵する。これらの溶液を ウイルスフィルターに通過させて、ウイルスまたは細菌汚染の危険性を除いた。 留置静脈カテーテルを用いて、＋０時間から＋６時間まで１時間ごとに８ｍｌ の血液試料を採取し、注射から２５分目の予想ピーク濃度時間付近での反応速度 を解明するために、第１回と第３回のニコチン注射後１５、２５および４０分目 にさらに血液試料を採取した。直ちに血漿抽出のために遠心することができない 試料は、氷上に最大１時間保存した後に遠心した。 別個の尿試料３例を採集した：ベースライン排尿試料１例および４時間プール 試料２例。 アッセイ法： 血漿（ニコチン、コチニン）と尿のニコチンおよびコチニンをＨＰＬＣイオン 交換カラムアッセイ法により測定した。ニコチンには電気化学的検出器、他の化 合物にはＵＶ検出器を用いた。ニコチンアッセイ感度は＜１ｎｇ／ｍｌ、コチニ ンアッセイ感度は＜５ｎｇ／ｍｌであった。尿中の抱合体はβ−グルクロニダー ゼで加水分解した後に測定された。 クレアチニンを測定することにより、すべての薬物濃度をクレアチニンに対す る他の物質の比率として再表現することができる。これにより、尿希釈の変動性 、または採尿の期間もしくは効率に関するある程度の対照が得られた。 結果： 図２５は、メトキサレンによりニコチン濃度に大きな変化が起きたことを示す 。図２６は、７人の被験者においてメトキサレンが血漿コチニン濃度に与える経 時的影響を示す。図２７および図２８Ａ〜２８Ｃは、これらの血漿ニコチン増加 に伴って悪心、不安、集中困難、収縮期血圧が有意に増大し、喫煙願望や喫煙欲 が有意に低下し、喫煙が快いという期待感が有意に減少することを示す。これら の所見は、喫煙者をＣＹＰ２Ａ６阻害物質で処置すると喫煙の要求が減少するこ と を明瞭に示す。 実施例５ＣＹＰ２Ａ６に対する抗体がニコチン代謝を遮断しうることの証明−−免疫阻害 実験 免疫阻害実験は、０．５ｍｇ／ｍｌのＫ１２肝ミクロソームをＣＹＰ２Ａ６（ モノクローナル抗体）、ＣＹＰ２Ｂ１（ポリクローナル抗体）、ＣＹＰ２Ｅ１（ ポリクローナル抗体）、ＣＹＰ２Ｄ６−ペプチド（ポリクローナル抗体）および ＣＹＰ３Ａ２（ポリクローナル抗体）と共にインキュベートすることからなって いた。ＢＳＡ、ウサギおよびヤギ抗血清を陰性対照として用いた。抗体およびミ クロソームを氷上で３０分間プレインキュベートし、次いで０．０４Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ７．４）中、１００μＭのニコチン、１ｍＭのＮＡＤＰＨおよび２０ μｌのラット細胞質ゾルを添加した。次いで３７℃で４５分間インキュベートし た。 結果： ＣＹＰ２Ａ６抗体はコチニン形成を選択的に阻害し、ＣＹＰ２Ａ６によるニコ チン代謝を＞８０％低下させる（図２９参照）。 実施例６アンチセンス試験 ＣＹＰ２Ａ６酵素を減少させるのにアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド （ＡＳＯ）を使用できるか調べるために、ヒトＣＹＰ２Ａ６遺伝子およびｍＲＮ Ａ配列の異なる４部分に対する４種類のＡＳＯを設計した。ＣＹＰ２Ａ６蛋白質 を減少させる可能性を、異なる２つのヒト細胞系において調べた。第１はジーン テスト社(マサチュセッツ州ウーバン)から市販されているヒトＣＹＰ２Ａ６ ｃ ＤＮＡを含むプラスミド発現系をもつヒトリンパ芽球細胞系（ｈ２Ａ６）、第２ はＣＹＰ２Ａ６を発現するヒト肝細胞系（ＨｅｐＧ２）であった。 ｈ２Ａ６ Ｐ４５０細胞を３×１０⁶細胞になるまで増殖させ、培地を除去し 、５％ウマ血清補充培地１ｍｌ中５μｇのＡＳＯおよび２０μｇ／ｍｌのリポフ ェクチンを添加した。細胞を２４時間増殖させ、ここでさらに４ｍｌの完全培地 (１ ０％ウマ血清)を添加し、細胞をさらに４８時間増殖させた。次いで細胞試料を それぞれリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、ペレット化し、凍結させた。これらの 試料につきウェスタンブロットを実施し、ＡＳＯ＃２３（たとえばエキソン２の ３’プライム末端）のみがＣＹＰ２Ａ６免疫反応性を除くのに有効であると判定 された。次いで、この配列に対するミスセンスオリゴデオキシヌクレオチド（Ｍ ＳＯ）対照を加えてこれらの試験を繰り返した。ＭＳＯ対照は、５および３プラ イム末端において２ヌクレオチドが入れ替わっている。この場合も、ＡＳＯ＃２ ３が未処理対照細胞およびＭＳＯ＃２３処理細胞と比較して効果的にＣＹＰ２Ａ ６量を減少させることが認められた。 ＣＹＰ２Ａ６を発現するヒト肝ＨｅｐＧ２細胞を増殖させ、１．０×１０⁵細 胞に分け、２ｍｌの完全培地（１０％ウシ胎児血清）中で４８時間増殖させた。 ４８時間後、５％ＦＣＳ培地１ｍｌ中２μｇのＡＳＯオリゴおよび１５μｇ／ｍ ｌのリポフェクチンを添加し、２４時間増殖させた。次いで細胞をトリプシン処 理し、ウェスタンブロットのために洗浄し、または免疫細胞化学的試験のために ４％パラホルムアルデヒドで固定した。この場合も、ＡＳＯ＃２３のみがＣＹＰ ２Ａ６蛋白質を減少させうることが認められた。図１２は、ＡＳＯ＃２３で処理 した後、未処理対照細胞およびＭＳＯ＃２３処理細胞と比較してＣＹＰ２Ａ６蛋 白質が著しく減少することを示す。 これらのデータは、ＣＹＰ２Ａ６を分子的方法（この場合はアンチセンス法） で著しく減少させうることを示唆し、ニコチン依存症の治療のためにこれらの方 法を適用するという提唱をさらに支持する。ＣＹＰ２Ａ６ノックダウン実験に用いた アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列 ^*これらの配列はそれらが設計されたエキソンに従って命名されている（たとえ ばＡＳＯ＃２３は３プライム末端のエキソン２中にある）。^** 最初と最後のヌクレオチドの番号は、遺伝子銀行データベースにみられるＣＹ Ｐ２Ａ６ ｍＲＮＡ配列（ＨＵＭＣＰＩＩＡ３Ａ、受託番号Ｍ３３３１８および Ｍ３３３１６）およびＹａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９（５），１３２２−１３２９，１９９０に基づく。 実施例７疫学的試験 タバコ依存症のコーカサス系喫煙者１２６人、および喫煙を試みたがタバコ依 存症喫煙者とはならなかったコーカサス系個体１４３人（たとえば被曝対照）に おいて、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子変異の発生率を調べた。目的は２つであった。第１ は、ＣＹＰ２Ａ６活性を欠如する個体（たとえば無効ＣＹＰ２Ａ６対立遺伝子に 関しホモ接合）の発生率を測定することであった。第２は、無効ＣＹＰ２Ａ６対 立遺伝子をもつためＣＹＰ２Ａ６仲介ニコチン代謝速度が低下していると、タバ コ依存症喫煙者になる機会が少なくなるか否かを判定することであった。 材料および方法： ＰＣＲ遺伝子型アッセイに用いたプライマー： ＣＹＰ２Ａ６遺伝子型 血液試料からルーティン抽出法でＤＮＡを抽出し、定量する。ＣＹＰ２Ａ６遺 伝子型を、入れ子型ＰＣＲおよびＲＦＬＰ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅ ｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）に記載）により判定した。ＣＹＰ２Ａ６遺伝子 特異性である１回目の増幅により、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子に対する特異性を高めた （他のＣＹＰ２Ａ遺伝子に対比して）。２回目の増幅にはエキソン３を用いた。 ＣＹＰ２Ａ６^*２およびＣＹＰ２Ａ６^*３変異型対立遺伝子は両方とも、アミノ酸 の変化をもたらすヌクレオチドの変化を、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のこの領域に含む からである。 １回目の増幅をＸＬ−ＰＣＲキット（パーキン−エルマー社、コネチカット州 ノルウォーク）により行った。０．２μＭのプライマーＦ４およびＲ４、２００ μＭのｄＮＴＰ、０．８ｍＭの酢酸マグネシウム、ならびに２ＵのｒＴｔｈ１ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに４００〜６００ｎｇのゲノムＤＮＡの反応混合物 １００μｌを用いた。この増幅は、ＭＪ ＤＮＡエンジン（ＭＪ ＤＮＡ Ｅｎ ｇｉｎｅ）（ＭＪリサーチ社、マサチュセッツ州ウォータータウン）により９３ ℃で１分、６６℃で６分３０秒、３１サイクル実施された。 ２回目の増幅は、０．５μＭのプライマーＥ３ＦおよびＥ３Ｒ、２００μＭの ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ ギブコＢＲＬ、ライフ・テクノロジーズ、オンタリオ州バーリントン）、ならび に２．５μｌの第１増幅生成物（これが反応の鋳型である）を含有する反応混合 物を用いて行われた。反応条件は以下のとおりであった：９４℃で３分、続いて ３ １サイクルの、９４℃で１分、６０℃で１分および７２℃で１分。 ２回目の増幅で長さ２０１ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、これをＣＹＰ２Ａ６^* ２およびＣＹＰ２Ａ６^*３変異体検出のためにそれぞれＸｃｍ Ｉ（ニュー・イ ングランド・バイオラボズ）およびＤｄｅ Ｉ（ニュー・イングランド・バイオ ラボズおよびファルマシア・バイオテク）で消化した（切断はその変異体の存在 を示す）。酵素およびＰＣＲ生成物の濃度、全容量ならびに消化時間は、最小量 の時間および酵素で最適な切断効率が得られるように、実験により決定された。 Ｘｃｍ Ｉ消化反応は、１Ｘ ＮＥ緩衝液３（１００ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ リス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９、２５℃） 、ｄＨ₂Ｏ、および２ＵのＸｃｍ Ｉを含有する反応混合物３０μｌ中において 、３７℃で２時間行われた。Ｄｄｅ Ｉ消化反応は、Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ （ＯＰＡ）緩衝液（ファルマシア・バイオテク）および２ＵのＤｄｅ Ｉを含有 する反応混合物３０μｌ中において、３７℃で２時間行われた。消化生成物をエ チジウム染色３％アガロースゲルで分析した。 全被験者（ｎ＝２６９）から同意のもとに血液試料を採取した。さらに組織的 質問により、詳細な喫煙歴およびタバコ／ニコチン依存性（ＤＳＭ ＲＩＩＩお よびＩＶ基準）を調べた。ＣＹＰ２Ａ６無効対立遺伝子に関しホモ接合性である 喫煙者（代謝欠乏者）は１％未満であった。これは、ほとんどすべて（＞９９％ ）の喫煙者につきＣＹＰ２Ａ６酵素阻害によりニコチン反応速度が変化し、影響 を受けないのは１％未満であることを証明する。これは、９９％を越える喫煙者 がＣＹＰ２Ａ６阻害を伴うこの新規なタバコ依存症療法の候補者であることを示 す。 喫煙を試みたが依存症にならなかった対照群と比較して、喫煙者の方がＣＹＰ ２Ａ６仲介ニコチン代謝の遅い者（たとえばＣＹＰ２Ａ６無効対立遺伝子に関し ホモ接合性またはヘテロ接合性）が少ないか否かを調べた。 結果： 喫煙者と対比して対照群には２倍のホモ接合性無効（ＣＹＰ２Ａ６完全欠乏） 個体がみられた。さらに、ＣＹＰ２Ａ６ニコチン代謝の遅い者（ＣＹＰ２Ａ６無 効対立遺伝子についてヘテロ接合性）が、喫煙者（１２％）と比較して対照群（ １９％）には約２倍いた。これは、ＣＹＰ２Ａ６に対する無効対立遺伝子を保有 す ることにより、ニコチン依存症に対しある程度の防御が得られることを示唆する 。 実施例８クマリン代謝様式の研究 以下を判定するための試験を行った：（ｉ）クマリン代謝様式（遊離クマリン 、７−ヒドロキシクマリン、および抱合した７−ヒドロキシクマリンの回収率お よび比率）がＣＹＰ２Ａ６遺伝子型（現在の喫煙状態とは無関係に）、ならびに 喫煙者の血液および尿試料から判定したニコチン(ＮＩＣ)代謝を反映するか否か ；(ｉｉ)喫煙者において短期間の喫煙がクマリン代謝に影響を与えるか否か；（ ｉｉｉ）クマリン代謝からのＮＩＣ代謝予測に男女差があるか否か。 材料および方法： あらゆる人種の無投薬かつ健康な同人数の男女であって、現在タバコ依存症で ある者（男女それぞれｎ＝１０）および非喫煙者（男女それぞれｎ＝１０）の遺 伝子型を判定（ＣＹＰ２Ａ６）し、異なる２日間、１日は午前７：００〜９：０ ０、１日は午後２：００〜４：００、クマリン試験を行った。喫煙者は少なくと も８時間の禁煙後、午前試験（最初の喫煙の前、たとえば午前８：００に）、お よび普通の喫煙日に午後試験を受ける必要があった。ＮＩＣおよびコチニン（Ｃ ＯＴ）（遊離および抱合）の分析に使用できる尿および血漿試料を、各クマリン 試験前に採取した。同時に、煙被曝を判定するために呼吸一酸化炭素を採取した 。ＵＶ検出を用い、４−ＯＨクマリンを内標準とするＨＰＬＣにより、クマリン ならびに遊離および全７−ヒドロキシクマリンを分析した（Ｒａｕｔｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）に従って変更）。 尿および血漿試料中の７−ヒドロキシクマリンのＨＰＬＣ分析： （１）試料の調製： 尿または血漿試料（０．５ｍｌ）を０．２５ｍｌのβ−グルクロニダーゼー酢 酸緩衝液（１５ｍｇ／ｍｌの酢酸緩衝液、０．２Ｍ、ｐＨ５．０）により３７℃ で３０分間加水分解する。２ｍｌのエーテルで５分間渦撹拌し、３０００ｒｐｍ で１０分間遠心することによって抽出した。エーテル抽出液（１．２ｍｌ）を清 浄な他の試験管に移し、窒素ガス下で乾燥させる。残留物をＨＰＬＣ移動相（下 記参照）中で再構成し、ＨＰＬＣに注入する。 （２）ＨＰＬＣ： ＨＰＬＣシステムは、ヒューレット・パッカード１０５０ＨＰＬＣシステム( ポンプ、オートサンプラーおよびＵＶ検出器)およびＨＰ ３３９６１１積分計 からなる。ＨＰスフェリソルブ−ＯＤＳ２カラム（１２５×内径４ｍｍ、５μｍ ）でクロマトグラフィー分離を行った。試料を流量１．０ｍｌ／分の移動相アセ トニトリル：水：酢酸 １５０：８５０：２（ｖ／ｖ／ｖ）で溶離し、波長３２ ４ｎｍのＵＶ検出器で監視した。試料を外標準法で定量測定する。 結果： ブランクの尿または血漿試料は、７−ヒドロキシクマリンに対する干渉ピーク を示さなかった。この方法の感度は、尿または血漿１ｍｌにつき１ｎｇ／ｍｌで ある。日内変動および日間変動は１０％未満である。この分析は１０ｎｇ／ｍｌ から４０００ｎｇ／ｍｌまで直線的である。 図３７は、絶食した午前と絶食しない午後のクマリン（Ｃ）試験期間の相関を 示す。図３７の数値は、最初の５ｍｇのクマリンに対する全７−ヒドロキシクマ リン（７−ＯＨＣ）として排出された量の％で表される（ｒ＝０．９，ｐ＜０． ００１）。図３７の記号は、男性喫煙者（Ｍ，Ｓ）、男性非喫煙者（Ｍ，ＮＳ） 、女性喫煙者（Ｆ，Ｓ）、女性非喫煙者（Ｆ，ＮＳ）を表す。図３７に示した結 果を得た試験では、被験者に５ｍｇのクマリンを経口投与し、その後４時間採尿 した。全７−ヒドロキシクマリン排出の日間変動および日内変動を測定するため に、絶食した午前の２期間、絶食しない午後の２期間、試験を行った。図３７の 数値は、最初の５ｍｇのクマリンに対する、４時間以内に７−ヒドロキシクマリ ン）として排出された量の％で表される。午前と午後の数値は被験者ごとに一致 したので、各被験者につき第１午前値と第１午後値を第１点としてプロットし、 第２午前値と第２午後値を第２点としてプロットした。 さらに図３９は、１００ｍｇのクマリンを投与した被験者の血漿中に検出され た全７−ヒドロキシクマリン濃度の時間経過を示すグラフである。図３９には、 ＣＹＰ２Ａ６に対応する遺伝子型に基づく種々の時間経過を示す。 実施例９ＮＩＣ排出および喫煙に及ぼすＣＹＰ２Ａ６阻害のＣ−２短期間作用 Ｂｅｎｏｗｉｔｚは、ジューテリウム標識ＮＩＣ−ｄ２の３０分注入（ＣＯＴ −ｄ４と共に）を用いて、喫煙者および非喫煙者においてＮＩＣの反応速度およ び分画クリアランスを調べた。ジューテリウム化ＮＩＣの反応速度は非標識ＮＩ Ｃのものときわめて類似する。非放射性標識の利点は、ＮＩＣ−ｄ２および生成 ＣＯＴ−ｄ２を喫煙中の喫煙者のＮＩＣ代謝の定量尺度として利用できることで ある。この方法は、ＮＩＣおよびＣＯＴが血漿中より尿中にはるかに高い濃度で みられることを利用して、尿中に検出するのに十分な量のＮＩＣ−ｄ２を投与す ることによりＮＩＣからＣＯＴへの変換を定量的に推定するために採用されるで あろう。予備試験で、２μｇ／ｋｇ／分×３０分を注入された喫煙者がそれぞれ ＞８０および＞６００ｎｇ／ｍｌの尿中ＮＩＣおよびＣＯＴ濃度を示すことが認 められた。したがって、０．２〜０．８ｍｇ程度の少量のＮＩＣ−ｄ２で、尿中 に定量可能なＮＩＣ−ｄ２／ＣＯＴ−ｄ２が得られると推定される。これは、非 喫煙者および喫煙者において０．５μｇおよび２．０μｇ／ｋｇ／３０分のＢｅ ｎｏｗｉｔｚ注入を６分間行うのに相当する。“ニコチン−ｄ２試験”で８時間 にわたって採取した尿のＮＩＣ−ｄ２／ＣＯＴ−ｄ２比により、ＮＩＣからＣＯ Ｔへの変換を直接に推定することができるであろう。この方法は、用量、投与速 度および分析感度を確立するために試験的に用いられるであろう。血漿および尿 中のＮＩＣ、ＣＯＴおよびｔｒａｎｓ−３’−ヒドロキシコチニンならびにそれ らのグルクロニドは、Ｄｒ．Ｊａｃｏｂの実験室で改変した既存のＧＣアッセイ 法（１９８８年のプロトコール）で測定する。抱合体は、アルカリ加水分解（Ｎ ＩＣおよびＣＯＴ）またはβ−グルクロニダーゼ加水分解（３’−ヒドロキシコ チニン）した後、測定されるであろう。定量限界はＮＩＣ １ｎｇ／ｍｌ、ＣＯ Ｔ １０ｍｇ／ｍｌ（５０％以下の検出）である。変動係数はＮＩＣにつき１． １〜７．８％（１〜１００ｎｇ／ｍｌ）である。ＮＩＣ−ｄ２、ＣＯＴ−ｄ２は ＧＣ−ＭＳにより測定されるであろう（１１１）。 実施例２に記載した実験の結果から、ＣＹＰ２Ａ６がＮＩＣ排出に関与する主 なものであり、ＣＹＰ２Ｂ６はわずかな個体（＝１６％）では重要であることが 示される。クマリンはヒト肝ミクロソームにおいてｅｘ ｖｉｖｏでのＮＩＣか らＣＯＴへの代謝の有効な阻害物質である（Ｋ_i＝１．５μＭ）。オルフェナド リンはヒトＣＹＰ２Ｂ６の有効な阻害物質であり（Ｋ_i＝３．８μＭ）、推定半 減期約１４時間をもつ。大部分の喫煙者のＮＩＣ代謝はクマリンで阻害すること ができ、残りはクマリンとオルフェナドリンを適切に組み合わせることにより阻 害できる。このような阻害により喫煙行動が少なくなるであろう。 ＣＹＰ２Ａ６およびＣＹＰ２Ｂ６の阻害物質の組み合わせがインビボでのＮＩ Ｃ代謝および社会的に制御された環境で喫煙行動を変化させる程度を調べる試験 を計画した。ＣＹＰ２Ａ６遺伝子型と判定された現在のタバコ依存症（ＤＳＭ− ＩＶ）個体（ｎ＝６ｗｔ／ｗｔ，ｎ＝６ｗｔ／ｍｕｔ）は、６例につき血漿ＮＩ ＣおよびＣＯＴの測定と共に“クマリン試験”により評価してＣＹＰ２Ａ６活性 をもつであろう。快適な社会的環境試験の場に慣れた後、被験者を各試験日に達 するまで禁煙させ、この時点でベースライン尿（ＮＩＣ／ＣＯＴ）、血漿試料（ ＮＩＣ／ＣＯＴ）、および呼吸ＣＯが得られる。異なる日に３種類のクマリン条 件（プラシーボ、５０ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．または１００ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．）と ２種類のオルフェナドリン条件（プラシーボまたは２００ｍｇ）のすべての組み 合わせを投与する。２種類の有効薬物の２種類の組み合わせを、１〜４日目に個 々の成分に対する耐薬量が確認された後、５日目および６日目に、釣り合いのと れたランダムな順序で投与する。シガレット本数、ＮＩＣ摂取、煙被曝、ならび に血漿（血液）中のＮＩＣおよびＣＯＴの濃度、ならびに尿中への排出の関係を 確立するために、多数の試験を行った。下記の間で最良の結果が得られる：血液 ＮＩＣ（午後４：００，０．７９）、ＣＯ Ｈｂｇ（０．６７）、尿ＣＯＴ ２ ４時間（０．６２）、血液ＣＯＴ（午後４：００，０．５３）。ＣＯＴはその半 減期が長いのでサンプリング時間によって著しく影響されることが少なく、ＮＩ Ｃの１日摂取量を推定するのに利用できる。被験薬物投与の３０分後、トレーサ ー量のニコチン−ｄ２試験１を行う。次いでＮＩＣ−ｄ２３／ＣＯＴ−ｄ２比（ ７時間）とクマリンならびに全および遊離７−ＯＨクマリン測定用に別個に、被 験者から尿を３時間（“クマリン試験”）および４時間採取する。さらに、パル ストレーサー投与を行った０．５時間後（クマリン／７−ＯＨ−クマリン）、３ 時 間後および７時間後（ＮＩＣ／ＣＯＴ）に、血液試料を採取する。呼吸ＣＯを同 時に測定する。この期間、被験者は通常の銘柄のタバコを任意に喫煙し、カフェ イン入り飲料を飲み、ゲームをし、ビデオを見ることなどが許される。喫煙シガ レット本数および吸い殼の重量を記録する。 実施例１０ＣＹＰ２Ａ６の阻害による喫煙減少 ＮＩＣからＣＯＴへの代謝を阻害することにより、喫煙者の血漿ＮＩＣを維持 して煙被曝を少なくし、結果的な禁煙の要素として、二次的な喫煙行動増強を抑 えることができるであろう。ＮＩＣはタバコ依存症における嗜癖性物質であり、 喫煙者は自分の脳ＮＩＣをかなり狭い個体濃度帯域内に調節するので、ＮＩＣか らＣＯＴへの変換を選択的に阻害すると煙被曝（すなわち“喫煙”）が少なくな るはずである。ある個体は、ＮＩＣ代謝を十分に変化させるのに、異なる組み合 わせのＣＹＰ２Ａ６とＣＹＰ２Ｂ６阻害物質を必要とするかもしれない。 ＣＹＰ２Ａ６阻害物質の有効性と安全性を確認し、かつ煙被曝を減らすのにＣ ＹＰ２Ｂ６阻害が必要であることを確認するために、また禁煙に際しての補助と して、予備試験を計画した。 男性または女性のＤＳＭ−ＩＶ依存症喫煙者であって、禁煙を希望する者、Ｎ ＩＣ置換療法を希望せず、少なくとも３回は禁煙を試みて全く成功せず、関与に 対する医学的禁忌がなく、ＣＹＰ２Ａ６ ｗｔ／ｗｔまたはｗｔ／ｍｕｔ遺伝子 型をもつ者は、関与に適しているであろう。試験の前に、クマリン５０または１ ００ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．投与後に安定標識“ニコチンテスド”（ヒト試験Ｃ−１ ）を行ってその個体の尿ＮＩＣ−ｄ２／ＣＯＴ−ｄ２比の変化を評価することに より、ＣＹＰ２Ａ６活性阻害感受性を評価する。この試験の結果に基づいて、各 被験者をＣＹＰ２Ａ６阻害“反応者”群または“低反応者”群に帰属させる。し たがってこの試験は、ＣＹＰ２Ａ６高阻害反応者ではプラシーボ（ｎ＝３０）対 クマリン（ｎ＝３０）の比較、ＣＹＰ２Ａ６低反応者ではクマリン（ｎ＝７）対 クマリン＋オルフェナドリン（ｎ＝８）の比較を２週間行うことであろう。クマ リン用量は１００ｍｇ ｂ．ｉ．ｄ．、オルフェナドリンの用量は１００ｍｇ、 １日１回、経口、であってよい。 日常喫煙日誌カード、遠隔被曝ＣＯ採集バッグに採集した週２回の家庭内一酸 化炭素呼吸試料（午後半ば、午後２：００〜６：００）、週２回の唾液ＣＯＴに より、喫煙行動を監視する。被験者には、治療目的、および一定の支持カウンセ リング、および組織的自助アドバイスに関して、指示を与える。患者に週１回、 午後２：００〜６：００に面会し、このとき血漿ＮＩＣ／ＣＯＴ、呼吸ＣＯを測 定する。 一次依存変数は、２週間にわたって平均した煙被曝（日誌およびＣＯ測定）の 測定値である。このような平均値は、経時消費曲線の下方および左方シフトの両 方に対し感受性である。これらの変数を、高反応群と低反応群に分けて治療関数 として分析する。２群比較に関し１群当たりｎ＝３０は、それらの平均値間の１ Ｓ．Ｄ．の差を検出する能力ほぼ９７％をもつ。 実施例１１喫煙量減少および禁煙におけるＣＹＰ２Ａ６阻害 実施例４に概説した試験に基づき、喫煙量減少および禁煙に際してのＣＹＰ２ Ａ６阻害の有効性を確認するために、二重盲検を行う。薬物の選択および量を、 実施例４に概説した試験法で決定する。陽性対照（たとえばＮＩＣパッチ）を試 験する。 各群ごとにクマリンとプラシーボ（ｎ＝６０）を比較して、喫煙量減少および 禁煙を達成するために１２週間続けられる、プラシーボ対照付き無作為二重盲検 試験に、先の試験（ヒト試験Ｃ−３）に関与したのと同じ患者が参加する。評価 法および手順は、実施例４に概説した試験と同様である。ただし、ＣＹＰ２Ａ６ 阻害物質を実際に投与される者には、有効薬物を２週間投与し、続いて２週間の プラシーボ期間をおく。１２週後の禁煙を目標にして、この４週間のオン／オフ サイクルを３回繰り返す。ＣＹＰ２Ａ６を阻害すると、シガレット本数の減少ま たは喫煙行動の変化により煙被曝が減少するはずである。２週間の“有効”薬物 ／プラシーボ期間それぞれの終了時に、被験者に低喫煙行動を２週間維持するよ うに伝える。この２週の期間が行動変化のひとつである。阻害物質−プラシーボ サイクルを繰り返す。被験者に週１回面会し、このとき被験者の自己報告喫煙日 誌を彼らの前進に沿って考察する（最小補助ケア）。この試験後は、３、６およ び１２か月目に被験者と連絡をとり、禁煙率の維持を判定するために、少なくと も唾液ＣＯＴを得る。呼吸ＣＯ、唾液と血漿のＮＩＣ／ＣＯＴを測定する。禁煙 のための確立された基準を用いる。 実施例１２喫煙行動に対するクマリンの長期効果 仮説：長期クマリン投与により、スリーデイアウト患者パラダイム（３ ｄａ ｙ ｏｕｔ ｐａｔｉｅｎｔ ｐａｒａｄｉｇｍ）で喫煙行動が少なくなるであ ろう。 理論的根拠：内部手がかり（たとえばニコチン濃度）と外部手がかり（たとえ ば最終喫煙後の期間）が矛盾するとき喫煙者が消費量を調節するのを学ぶ必要が ある場合は特に、短期計画ではクマリンの効果は明らかでないことがある。この 計画では、長期クマリン投与が喫煙行動およびニコチン濃度に与える影響を３日 間にわたって調べる。被験者を、あるときはプラシーボ、あるときはクマリンに より、無作為盲検方式で試験する。喫煙本数、ニコチン濃度および得られる行動 指数（傾眠、覚醒、悪心）に与える影響を、普通の生活状態（たとえば普通の３ 日間の活動）で判定する。 計画：シガレット消費量の異なる喫煙者（＞３０，＜３０）に、一定量のクマ リン（効果的にニコチン濃度を変化させる用量のクマリン：プロジェクト１から 求めたもの）またはプラシーボを連続３日間投与する（両方の条件をすべての個 体において調べる）。両遺伝子型の喫煙者を含めるので、安全性（たとえば悪心 ）および有効性（野生型のみに有効か、両群に有効か）を評価できる。シガレッ ト消費量および行動指数、ならびにニコチン、コチニンおよびＣＯ量を１日１回 測定する。シガレット消費量の減少、ニコチン増加、ＣＯ（シガレット被曝）減 少におけるクマリンの有効性を判定する。さらに、大量喫煙者または少量喫煙者 、ならびに１日目、２日目および３日目に与える相対効果を判定する。 実施例１３クマリンが社会的環境での喫煙行動に与える短期効果 仮説：ニコチンを増加させる短期クマリン投与（ニコチン代謝阻害）により、 短期の社会的環境での喫煙行動が少なくなるであろう。 理論的根拠：この物質は、長期投与方式に対比して短期投与方式でも多少とも 有効であろう。短期の高リスクを伴う場合（バーでの夜会、パーティー、他の喫 煙者と同席する場合、大量喫煙群衆のいる場所）に合わせた製品を得るのも有益 であろう。 計画：普段のシガレット消費量の異なる喫煙者に、短期の高リスク“パーティ ー”および宴会の前にクマリンまたはプラシーボを短期投与（１日）する。喫煙 行動、ニコチン、コチニン、クマリンおよびＣＯの濃度、ならびに行動指数を測 定する。これらの試験を両遺伝子型群の個体において行う（実施例７参照）。 実施例１４化学的阻害物質のインビボ試験 インビトロスクリーニングで阻害物質であることが認められた化合物を、ヒト 被験者におけるそれらの治療力価につき効率的かつ効果的にスクリーニングでき る。 （１）ニコチンの代謝阻害試験−ＨＰＬＣ分析法 少なくとも８時間の禁煙期間後に、被験阻害物質の１回投与または複数回投与 による予備処置なしに、および予備処置を行って、二酒石酸ニコチン３１μｇ／ ｋｇ（塩基として表す）を皮下投与し、ニコチン注射の０、２０、３０および６ ０分後に血液試料を採集する。血漿中のニコチンおよびコチニンの濃度を高感度 ＨＰＬＣ法により測定する。 ＨＰＬＣによる血漿中ニコチンおよびコチニン濃度の測定： （ａ）抽出法：各試験管（１２ｍｌ）に、１ｍｌの試料、５０μｌの内基準（Ｎ −エチルノルニコニン）および１ｍｌのトリクロロ酢酸（１０％）をピペットで 入れる。試験管を密栓し、数秒間渦混合し、３０，０００ｇで５分間遠心する。 透明な上清を第２組の清浄な試験管へデカントする。この無蛋白質血漿抽出液に ０．５ｍｌの５Ｍ水酸化カリウム溶液および６ｍｌの塩化メチレンを添加する。 試験管に栓をし、水平振とう機で３０分間撹拌し、遠心して相を分離する。水( 上)相を吸引し、３．０ｍｌの０．５Ｎ塩酸溶液を有機相に添加し、３０秒間渦 混合する。遠心により相を分離し、有機（下）相を分離廃棄する。試験管内に残 った酸性水溶液に０．５ｍｌの５Ｍ水酸化カリウム溶液および５ｍｌの塩化メチ レンを添加し、３０秒間渦混合する。遠心により相を分離し、水（上）相を吸引 し、残った溶液に２００μｌのメタノール性塩酸（メタノール中１０ｍｍｏｌ ＨＣｌ）を添加し、緩和に混合し、窒素下に４０℃の水浴中で有機溶剤を蒸発さ せる。試験管の側面を２００μｌのメタノール性塩酸で洗浄し、この溶液を蒸発 させる。残留物を１００μｌの３０％メタノール中に再構成し、その９０ｐｌを ＨＰＬＣカラムに注入する。 （ｂ）ＨＰＬＣ分析：カラム(スペルコ５−８３４７ ＬＣ−８−ＤＢ，１５０ ×４.６ｍｍ，５μｍ)を用いてクロマトグラフィー分離を行う。０．３４Ｍ Ｋ Ｈ₂ＰＯ₄、１−ヘプタンスルホナート（６７１ｍｇ）およびトリエチルアミン（ ５ｍｌ）を含有する移動相、０．３４Ｍクエン酸緩衝液：アセトニトリル ８０ ０：４５（ｖ／ｖ）により、流量１．３ｍｌ／分で試料を溶離し、λ＝２６０ｎ ｍのＵＶ検出器で監視する。 血漿中のニコチンおよびコチニンの濃度を上記ＨＰＬＣ法で測定した後、阻害 物質を予備投与しない場合および予備投与した場合の、２０、３０および６０分 目の濃度を、存在するベースラインニコチンを差し引いた後に比較する。これら の値の平均または濃度曲線下面積も採用できる。各点の阻害度（または平均もし くは濃度曲線下面積）を、阻害率％＝（阻害物質の存在下での濃度−阻害物質の 不在下での濃度）／（阻害物質の不在下での濃度）×１００、として表す。この 方法は種々の反応速度特性をもつ阻害物質を採用するのに適用でき、その場合は これより長いか、または短いサンプリング期間を用いることができる。たとえば ある阻害物質はきわめて長い半減期をもつかもしれず、その場合はより長い期間 にわたってデータを得ることが望ましいであろう。ただし、その阻害物質の臨床 阻害および治療力価を証明するには、比較的短いスクリーニング試験で十分であ ろう。場合によってはこれらの時点での血漿中のニコチン／コチニン比が有用で あるかもしれないが、治療効率をスクリーニングするためにはコチニン濃度は関 係ないと考える。ニコチン量を２０μｇ／ｋｇ（皮下）に減少させれば、ここに 記載する方法は非喫煙者にも適用できる。 結果： 図３８は、７人の被験者における１時間にわたるニコチン代謝を示すグラフで ある。より詳細には、このグラフはＣＹＰ２Ａ６阻害物質であるメトキサレンの 存在下での経時的な血漿ニコチン濃度変化をプラシーボと対比して示す。 （２）ニコチンの代謝阻害試験−安定標識ニコチンおよびガスクロマトグラフィ ー−質量分析法 普通の状況では上記試験法は広範に利用でき、最も適切である。しかし特殊な 分析装置を利用できる場合は、他の方法も可能である。その方法は本明細書に既 に記載した。簡単に述べると、トレーサー量のニコチン−ｄ２を阻害物質の不在 または存在下で静脈内投与し、前節に示したのと同様な時点でニコチンおよびコ チニンの血漿濃度をＧＣ−ＭＳにより測定し、データを同様に処理する。この方 法は、研究用として、または阻害試験を行うとき患者が喫煙を続けている場合に 阻害試験を実施しなければならないならば、有利である。 実施例１５クマリン表現型判定試験およびＣＹＰ２Ａ６遺伝子型判定試験 Ａ．クマリン試験 クマリンはヒトＣＹＰ２Ａ６に選択的かつ特異的基質であり、下記に使用でき る：（１）ＣＹＰ２Ａ６阻害物質を用いる療法の除外例である可能性がある個体 の確認；（２）初期ＣＹＰ２Ａ６活性レベルに基づく用量細分；ならびに（３） この処置で利益を受けない個体、またはＣＹＰ２Ａ６の阻害物質および基質自体 である物質の毒性を受ける危険性のある個体を確認する際の、危険因子の評価。 クマリン試験Ｉは２つの形がある： （１）尿のみが得られる場合のクマリン試験 絶食した個体に、膀胱残留尿を避けた後、カプセルその他の剤形に配合したク マリン５ｍｇを経口投与する。最初の２時間とその後の６時間、採尿する。尿中 へのクマリン代謝産物７−ヒドロキシクマリン（遊離および抱合）排出量を、尿 中のこれらの代謝産物の濃度を前記実施例に記載したようにＨＰＬＣアッセイ法 で測定することにより判定する。ＣＹＰ２Ａ６の相対活性は個別のサンプリング 期間と合計期間中に排出された７−ヒドロキシクマリンの全量に反映され、活性 はクマリン排出率％、（最初の２時間に排出された量／８時間に排出された量） ×１００、として表すことができる。この排出率は、ＣＹＰ２Ａ６活性をもたな い個体の２０％未満の数値から、高い活性をもつ個体の＞８０％までに及ぶ。こ の試験法は喫煙者および非喫煙者に等しく有効に信頼性をもって適用でき、１日 のいかなる時間でも、その日の喫煙状態や喫煙時間が結果に明らかな影響を与え ることなく利用できる。この試験は、＞０．９の直線的ｒをもつ高い被験者内再 現性を示す。喫煙者および非喫煙者に異なる２日間の午前と午後にクマリンを投 与した試験の結果については、図３７を参照されたい。高い被験者内再現性およ び信頼性が証明される。 （２）血漿試料を採取できる場合のクマリン試験 ある種の臨床状況では血液試料を容易に採取でき、または他の臨床試験の一部 として必要である。この状況で、血漿ベースのＣＹＰ２Ａ６活性試験を開発し、 既知遺伝子型の個体に適用した。個体にクマリン５．０ｍｇを経口摂取させ、４ ５分後に、ヘパリン処理（または他の抗凝固剤を含有する）試験管に血液試料を 採取する。この試料を遠心し、血漿を分離した。血漿をＨＰＬＣにより分析して 、７−ヒドロキシクマリンを定量する（β−グルクロニダーゼインキュベーショ ンにより脱抱合した後の合計）。５．０ｍｇのクマリンを用いるには高い分析感 度が要求される。このような感度が得られない場合、クマリンの用量を５０ｍｇ にまで高めてもよい。 尿および血漿中の７−ヒドロキシクマリンのＨＰＬＣ分析： （１）試料の調製： 尿または血漿の試料（０．５ｍｌ）を、β−グルクロニダーゼー酢酸緩衝液（ 酢酸緩衝液１５ｍｇ／ｍｌ，０．２Ｍ，ｐＨ５．０）０．２ｍｌで３７℃におい て３０分間加水分解する。２ｍｌのエーテルで５分間渦撹拌し、３０００ｒｐｍ で１０分間遠心することによって抽出する。エーテル抽出液（１．２ｍｌ）を他 の清浄な試験管に移し、窒素ガス下で乾燥させる。残留物をＨＰＬＣ移動相（下 記 参照）中に再構成し、ＨＰＬＣに注入する。 （２）ＨＰＬＣ分析： ＨＰＬＣシステムは、ヒューレット・パッカード１０５０システム（ポンプ、 オートサンプラーおよびＵＶ検出器）とＨＰ３３９６ＩＩ積分計からなる。ＨＰ スフェリソルブ−ＯＤＳ２カラム（１２５×内径４ｍｍ，５μｍ）を用いてクロ マトグラフィー分離を行った。試料を流量１．０ｍｌ／分の移動相アセトニトリ ル：水：酢酸 １５０：８５０：２（ｖ／ｖ／ｖ）で溶離し、７−ヒドロキシク マリンについては３２４ｎｍ、クマリンについては２８０ｎｍの波長でＵＶ検出 器により監視した。試料を外標準法で定量測定する。 ＣＹＰ２Ａ６活性を種々の時点（たとえば２０、３０、４５および７５分）の 血漿中の７−ヒドロキシクマリンの濃度として、またはその時点の血漿中のクマ リン／７−ヒドロキシクマリン比として表す。 好ましい使用方式は、クマリン経口投与の２０または３０分後の単一血漿試料 を用い、クマリンと７−ヒドロキシクマリンの両方を定量し、クマリン対７−ヒ ドロキシクマリン比をＣＹＰ２Ａ６活性の指数として用いるものである。 結果： ブランクの尿または血漿試料は、７−ヒドロキシクマリンまたはクマリンに対 する干渉ピークを示さなかった。この方法の感度は、尿または血漿１ｍｌにつき １ｎｇである。日内変動および日間変動は１０％未満である。この分析は１ｎｇ ／ｍｌから４０００ｎｇ／ｍｌまで直線的である。 図３９は、クマリン投与した被験者の血漿中に検出された全７−ヒドロキシク マリン濃度の時間経過を示すグラフである。図３９は、ＣＹＰ２Ａ６に対応する 遺伝子型に基づく種々の時間経過を示す。 Ｂ．ＣＹＰ２Ａ６遺伝子型判定試験 ＣＹＰ２Ａ６遺伝子型判定試験については、個体においてＣＹＰ２Ａ６活性を 低下させる変異型対立遺伝子を、実施例７に記載した材料およびスクリーニング 法でスクリーニングすることができる。 本発明の原理を好ましい態様において図示し、記載したが、本発明の様式およ び詳細をその原理から逸脱することなく変更しうることは当業者に認識されるで あろう。 本明細書に述べたすべての特許および特許出願を全体として援用する。これは 、本明細書に述べた個々の刊行物、特許および特許出願を全体として具体的かつ 個別に援用することと同じである。 本明細書に述べたすべての参考文献を以下に引用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/4174 Ａ６１Ｋ 31/4174 31/4178 31/4178 Ａ６１Ｐ 25/34 Ａ６１Ｐ 25/34 43/00 １７１ 43/00 １７１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害することを含む個体におけるニコチン代謝を 調節する方法。 ２． 以下の（ｉ）ＣＹＰ２Ａ６活性を阻害する物質；または（ｉｉ）ＣＹＰ２ Ａ６をコードする遺伝子の転写および／または翻訳を阻害する物質のうちの１以 上を使用してＣＹＰ２Ａ６が選択的に阻害される、請求項１記載の方法。 ３． カルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の化合物を 個体に投与することによってＣＹＰ２Ａ６が選択的に阻害される、請求項１記載 の方法。 ４． クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、ソラレン、 α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベルガプテン、 スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５−ジメチル− ２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び関連フラボ ン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン、ニトロピ レン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリマゾール、 ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソアミン−３− ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体およびそれらの 誘導体から成る群から選択される少なくとも１種の化合物を個体に投与すること によってＣＹＰ２Ａ６が選択的に阻害される、請求項１記載の方法。 ５． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニト ロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項４ 記載の方法。 ６． （ｉ）ＣＹＰ２Ａ６活性を選択的に阻害、または（ｉｉ）ＣＹＰ２Ａ６を コードする遺伝子の転写および／または翻訳を選択的に阻害する物質をアッセイ することを含む、個体においてコチニンへのニコチン代謝を調節する物質をスク リーニングする方法。 ７． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の物質および薬学的に許容可能な 担体、希釈剤または賦形剤を含む、コチニンへのニコチン代謝の調節を必要とす る状態の治療における使用のための医薬組成物。 ８． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の化 合物を含む、請求項７記載の組成物。 ９． 物質が、クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、ソ ラレン、α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベルガ プテン、スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５−ジ メチル−２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び関 連フラボン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン、 ニトロピレン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリマ ゾール、ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソアミ ン−３−ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体および それらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項７記載 の組成物。 １０． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 ９記載の組成物。 １１． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の物質を被験者に投与すること を含む、個体におけるコチニンへのニコチン代謝の調節を必要とする状態の治療 方法。 １２． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の 化合物である、請求項１１記載の方法。 １３． 物質が、クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、 ソラレン、α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベル ガプテン、スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５− ジメチル−２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び 関連フラボン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン 、ニトロピレン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリ マゾール、ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソア ミン−３−ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体およ び それらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１１記 載の方法。 １４． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 １３記載の方法。 １５． 当該物質の２種以上を含む混合物を個体に投与することを含む、請求項 １２の何れか１項に記載の方法。 １６． 状態が依存性又は非依存性タバコ使用である、請求項１１〜１５の何れ か１項記載の方法。 １７． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の物質、およびＣＹＰ２Ｂ６の 有効量の阻害剤を個体に投与することを含む、個体におけるＣＹＰ２Ａ６阻害剤 によるニコチン代謝の阻害を増強する方法。 １８． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の 化合物である、請求項１７記載の方法。 １９． 物質が、クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、 ソラレン、α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベル ガプテン、スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５− ジメチル−２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び 関連フラボン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン 、ニトロピレン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリ マゾール、ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソア ミン−３−ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体およ びそれらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項１７ 記載の方法。 ２０． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 １９記載の方法。 ２１． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の物質、およびＣＹＰ２Ｂ６の 有効量の阻害剤、および／または薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤 を含む、コチニンへのニコチン代謝の調節を必要とする状態の治療における使用 のための医薬組成物。 ２２． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の 物質を含む、請求項２１記載の組成物。 ２３． 物質が、クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、 ソラレン、α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベル ガプテン、スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５− ジメチル−２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び 関連フラボン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン 、ニトロピレン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリ マゾール、ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソア ミン−３−ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体およ びそれらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項２１ 記載の組成物。 ２４． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 ２３記載の組成物。 ２５． ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の物質、およびＣＹＰ２Ｂ６の 有効量の阻害剤を個体に投与することを含む、個体におけるコチニンへのニコチ ン代謝の調節を必要とする状態の治療方法。 ２６． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の 化合物である、請求項２５記載の方法。 ２７． 物質が、クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、 ソラレン、α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベル ガプテン、スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５− ジメチル−２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び 関連フラボン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン 、ニトロピレン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリ マゾール、ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソア ミ ン−３−ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類緑体および それらの誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項２５記 載の方法。 ２８． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 ２７記載の方法。 ２９． 当該物質の２種以上を含む混合物を個体に投与することを含む、請求項 ２６〜２８の何れか１項に記載の方法。 ３０． 状態が依存性又は非依存性タバコ使用である、請求項２５〜２９の何れ か１項に記載の方法。 ３１． ＣＹＰ２Ａ６遺伝子のための遺伝子座に２個の変異対立遺伝子、１個の 変異対立遺伝子を含むかまたは変異対立遺伝子を含まない個体におけるＣＹＰ２ Ａ６活性を測定する方法であって、 （ａ）個体からのＤＮＡ含有身体試料をアッセイして、個体がＣＹＰ２Ａ６遺 伝子座に２個の変異対立遺伝子、１個の変異対立遺伝子を含むかどうか、または 変異対立遺伝子を含まないかどうかを測定する工程； （ｂ）個体中に存在するＣＹＰ２Ａ６の量を測定する工程；および （ｃ）工程（ａ）のアッセイの結果と工程（ｂ）のＣＹＰ２Ａ６の量とを相関 させて、（ｉ）ＣＹＰ２Ａ６活性を選択的に阻害、または（ｉｉ）ＣＹＰ２Ａ６ をコードする遺伝子の転写および／または翻訳を選択的に阻害する物質のその個 体についての好適な投与量を測定する工程： を含む方法。 ３２． ＤＮＡ含有身体試料が血液試料である、請求項３１記載の方法。 ３３． ＤＮＡ含有身体試料が組織試料である、請求項３１記載の方法。 ３４． 個体におけるコチニンへのニコチン代謝の調節のための医薬の製造のた めのＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する物質の使用。 ３５． 物質がカルボニル成分を有するラクトン構造を有する少なくとも１種の 化合物である、請求項３４記載の使用。 ３６． クマリン、フラノクマリン、メトキサレン、インペラトリン、ソラレン 、 α−ナフトフラボン、イソピンピネリン、β−ナフトフラボン、ベルガプテン、 スホンジン、クマテトラリル（ラクミン）、（＋）−シス−３，５−ジメチル− ２−（３−ピリジル）−チアゾリジム−４−オン、ナリンゲニン及び関連フラボ ン類、ジエチルジチオカルバメート、Ｎ−ニトロソジアルキルアミン、ニトロピ レン、メナジオン、イミダゾール抗真菌薬、ミコナゾール、クロトリマゾール、 ピロカルピン、ヘキサメチルホスホルアミド、４−メチルニトロソアミン−３− ピリジル−１−ブタノール、アフラトキシンＢ、それらの類縁体およびそれらの 誘導体から成る群から選択される少なくとも１種である、請求項３４記載の使用 。 ３７． Ｎ−ニトロソジアルキルアミンがＮ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニ トロソジメチルアミンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項 ３６記載の方法。 ３８．(ａ)ＣＹＰ２Ａ６を選択的に阻害する有効量の第１の物質；および(ｂ)第 １の物質の阻害を調節できる有効量の第２の物質を被験者に投与することを含む 、個体におけるコチニンへのニコチン代謝の調節を必要とする状態の治療方法。