KR100392225B1

KR100392225B1 - 류머티스 관절염 치료용 프로디지오신 조성물

Info

Publication number: KR100392225B1
Application number: KR10-2001-0021191A
Authority: KR
Inventors: 김환묵; 한상배; 이창우; 이기훈; 박세형; 이상한; 김형진; 김영국
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2001-04-19
Filing date: 2001-04-19
Publication date: 2003-07-22
Also published as: KR20020081801A; WO2002085350A1; EP1385510A4; EP1385510A1; US20040127547A1; JP4333901B2; JP2004525978A

Abstract

본 발명은 류머티스 관절염 치료를 위한 프로디지오신의 신규한 용도에 관한 것으로서, 세라시아 마르세센스(Serratia marcescence)에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 함유하는 조성물을 콜라겐-유발 류머티스 관절염 모델동물인 DBA-1 마우스에 투여함으로써 류머티스 관절염의 중요한 병인(病因)인 사이토카인의 체내 생성이 억제되므로 본 발명은 류머티스 관절염에 대하여 뛰어난 치료효과가 있다.

Description

류머티스 관절염 치료용 프로디지오신 조성물{PRODIGIOSIN COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF RHEUMATIC ARTHRITIS}

본 발명은 류머티스 관절염 치료용 프로디지오신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 류머티스 관절염을 치료하기 위한 세라시아 마르세센스에서 분리한 면역억제물질인 프로디지오신의 신규한 용도에 관한 것이다.

류머티스 관절염은 전체 성인 인구의 약 1% 정도가 고통받는 비교적 흔한 질병으로 환자의 90% 이상이 여자이며, 그 증상으로는 양쪽 손목 관절이 뻣뻣해짐을 들 수 있다. 이 질병의 진단은 피검사를 실시하여 류머티스 인자(rheumatoid factor)의 유무를 조사하고, X선 촬영을 실시하여 관절 사이가 좁아졌는지 또는 뼈의 마모가 있었는지를 확인함으로써 가능하다. 그러나, 대부분의 환자들은 장기간의 관절 파괴로 인한 여러 가지 형태의 관절변형이 수반되는데, 특히 손 부위의 관절변형이 가장 심하여 외견상 한눈에 류머티스 관절염임이 진단되는 경우도 있다. 류머티스 관절염은 자가면역질환의 일종으로 그 병인이 명확히 밝혀져 있지 않은 전신질환이다. 이 질병은 여러 관절, 특히 손 관절에 대칭적으로 염증을 일으켜 수 년 내지 수십 년에 걸쳐 관절을 서서히 파괴시키며, 때로는 관절뿐만 아니라 폐, 심장, 눈, 혈관, 신경 등 여러 장기를 침범하기도 한다. 또한, 이 질병은 주로 30대 전후 인생의 활동기에 발병하여 신체 기능에 장애를 유발하여 삶의 질을떨어뜨리고 작업능력을 저하시켜 막대한 경제적 손실을 초래한다.

지난 10년 사이 류머티스 관절염의 치료법에는 중요한 변화와 비약적인 발전이 있었다. 이러한 발전은 가급적 부작용을 최소화하고 관절의 파괴와 질병 자체의 진행을 막아주는 방향으로 이루어지고 있다. 관절염 치료에 흔히 사용되던 종래의 소염진통제는 세포에서 COX(cyclooxygenase)라는 효소를 통하여 프로스타글란딘(prostaglandin) 생성 대사를 억제함으로써 소염진통 효과를 나타낸다. COX 효소에는 2가지 종류가 있는데, COX-1은 염증 부위뿐만 아니라 정상적인 인체 여러 장기와 조직, 즉 위장관 또는 신장 등에서 프로스타글란딘류의 물질을 생성하는데 광범위하게 관여한다. 반면, COX-2는 염증이 있는 부위에서만 작용하는 효소로 알려져 있다. 기존의 시중에서 판매되고 있는 소염진통제들은 COX-1과 COX-2를 동시에 억제하거나, 주로 COX-1를 억제하기 때문에 염증이 있는 조직뿐만 아니라 간, 위장관 또는 신장 등의 기능유지에 필수적인 프로스타글란딘을 동시에 억제하여 많은 부작용을 야기하는 것으로 알려져 있다. 최근 개발되고 있는 선택적 COX-2 억제제(selective COX-2 inhibitor)들은 기존의 소염진통제 효과를 그대로 유지한 채 부작용을 크게 감소시킬 수 있어 현재 그 사용이 증가되고 있는 추세이다.

현재, 류머티스 관절염의 치료제로서 널리 사용되고 있는 소염진통제나 부신피질 호르몬 제제는 효과는 있으나 부작용이 적지 않고 근본적으로 류머티스 관절염의 진행을 막아주지 못한다는 단점이 있다. 이러한 이유로 인하여 항류머티스제를 투여함으로써 류머티스 관절염이 일시적으로 치료되더라도 투약을 중단하지 못하고 일정한 유지량을 계속 투여하여야 하는 불편이 있다. 이러한 환자들이 있어새로운 면역조절제의 도입이 필요하게 되었다. 최근, 미국을 중심으로 레플루노미드(leflunomide), 저용량의 시클로스포린(cyclosporine) 등이 류머티스 관절염 치료를 위한 대표적인 약제로서 그 효과가 입증되었다. 류머티스 관절염이 면역세포의 과도하고 비정상적인 흥분에 의해 발생된다는 것이 알려지면서 면역세포 상호간의 작용을 차단할 경우 치료효과가 있을 것이라는 데에서 착안하여 면역억제제 개발을 시도하게 되었다. 류머티스 관절염은 면역 세포의 이상으로 발병하는 자가면역성 염증질환으로 알려져 있다. 인체 면역반응은 주로 대식세포와 림프구에 의해 이루어진다. 외부 물질 특히 관절염 유발인자(arthritogenic factor)가 인체에 침입하면 항원전달 세포가 처리하여 항원결정인자 단편(펩타이드)을 세포 표면에서 HLA유전자와 결합하여(펩타이드-유전자 복합체) 항원 특이 T 림프구에 그 정보를 전달하게 된다. 류머티스 관절염은 특정 유전인자, 즉 HLA-DR4 또는 DR1을 가진 사람이 이 유전자와 친화력이 강한 외부 물질, 즉 관절염 유발인자와 결합하면 이 항원 특이 T 세포 수용체와 결합하여 면역반응이 비정상적으로 과다하게 일어나 서로를 흥분시키는 신호를 주거나 사이토카인(cytokine)이 분비되어 다른 면역세포를 불러들이고 면역반응이 증폭되어 관절을 공격하게 되는 질병이다. 따라서, 관절염 유발 물질에 대한 특이 면역반응을 억제시키는 면역억제제의 개발은 관절염 치료효과를 영구히 극대화시킬 수 있을 것이다.

스트렙토마이세스(Streptomyces) 또는 세라시아(Serratia) 속 미생물들은 피롤릴피로메텐 골격의 붉은색 물질들을 생산하는데, 이들 물질 중에는 프로디지오신, 메타시클로프로디지오신, 프로디지오센, 데스메톡시프로디지오신, 프로디지오신 25-C 등이 포함되어 있다. 이들 물질들은 항균 효과 및 항말라리아 효과 등이 있음이 알려져 있다. 특히, 프로디지오신 25-C는 면역억제작용이 있음이 알려져 있다.

프로디지오신의 분리방법 및 면역억제 효과는 본 발명자들에 의해 이미 보고되었다(한국특허 제252197호, 등록일 2000. 1. 17 ; International Journal of Immunopharmacology 20, 1-13, 1997). 프로디지오신의 구조를 하기 화학식 1에 나타내었다.

상기 문헌에서, 프로디지오신은 B 세포의 항체생성 및 증식은 억제하지 않고 T 세포의 증식 및 활성만을 강하게 억제하는 T 세포에 선택적인 면역억제제이며, 면역억제가 일어나는 농도에서 독성을 나타내지 않음을 규명하였다. 프로디지오신은 자가이식거부반응 및 제1형 당뇨병에 대한 치료효과가 있는데, 이는 이종이식거부반응 시험계 및 NOD 마우스를 이용한 당뇨병 시험계를 통하여 규명하였다. 본 발명자들은 세라시아 마르세센스에서 분리한 프로디지오신을 이용한 당뇨병 치료 효과를 이미 규명하였다(특허출원 제7139호, 출원일 2000. 2. 15). 상기 문헌에서, 프로디지오신을 10mg/kg의 투여량으로 2일마다 복강투여함으로써 NOD 마우스의당뇨병 발증이 완전히 억제되었다. 또한, 프로디지오신은 췌도(pancreatic islet)로의 면역세포 침윤(Lymphocyte infiltration)을 억제하여 췌도염(insulitis)을 억제시켰다. 한편, 프로디지오신을 10∼30mg/kg의 농도로 16주간 동물에 투여하여도 독성을 나타내지 않았는데, 이 결과로부터 프로디지오신의 면역억제제로의 개발가능성이 매우 높음을 알 수 있었다. 특히, 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과는 아직 보고된 바 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 세라시아 마르세센스에서 분리한 프로디지오신을 유효성분으로 함유하는 조성물의 류머티스 관절염에 대한 치료효과를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 부작용이 없는 류머티스 관절염 치료용 프로디지오신 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 세라시아 마르세센스에서 분리한 프로디지오신을 유효성분으로 함유하는 조성물을 콜라겐-유발 류머티스 관절염 모델동물인 DBA/1 마우스에 발병 초기 또는 발병 이후에 투여한 후 치료효과를 측정하고, 사이토카인의 생성억제능을 조사하여 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 약리기전을 규명함으로써 달성하였다.

도 1은 프로디지오신 10mg/kg을 실험개시 후 29일에서 65일까지 격일로 복강주사한 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 나타낸 그래프,

도 2는 프로디지오신 10mg/kg을 실험개시 후 29일에서 36일까지 격일로 복강주사한 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 나타낸 그래프,

도 3은 프로디지오신 10mg/kg을 실험개시 후 36일에서 64일까지 격일로 복강주사한 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 나타낸 그래프,

도 4는 프로디지오신 10mg/kg을 실험개시 후 29일에서 36일까지 격일로 복강주사한 DBA/1 마우스의 지골간관절(A) 및 무릎관절(B)과 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 지골간관절(C) 및 무릎관절(D)의 현미경 사진도,

도 5는 프로디지오신 10mg/kg을 실험개시 후 29일에서 65일까지 격일로 복강주사한 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스에 대한RT-PCR을 이용한 사이토카인 발현도를 나타낸 도이다.

류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과는 콜라겐-유발 류머티스 관절염 모델동물을 이용하여 검증했다. 관절염의 병태 시작 및 초기증상에 대한 치료효과를 측정하기 위하여 프로디지오신을 발병 초기에만 투여하는 실험을 실시하였으며, 진행성 악화 병태에 대한 치료효과를 측정하기 위하여 프로디지오신을 발병 이후에 투여하는 실험을 별도로 실시하였다. 프로디지오신의 약리기전을 규명하기 위하여 류머티스 관절염을 유발하는 중요한 병인(病因)인 사이토카인의 발현도를 측정하였다.

본 발명에 사용된 프로디지오신은 본 발명자들이 발명한 한국특허 제252197호에 공지된 방법에 따라 세라시아 마르세센스 B-1231 기탁번호 KCTC 0386BP로부터 분리하여 사용하였다. 본 발명에서는 프로디지오신을 10mg/kg의 농도로 2일에 한번씩 복강으로 투여하였으나, 프로디지오신의 투여량, 투여방법 및 투여기간은 관절염 증세에 따라서 조절할 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 콜라겐-유발 류머티스 관절염 모델동물의 준비

일본 Charles River Japan사의 6주령된 수컷 DBA/1 마우스를 8∼12주령까지 순화한 후 실험에 사용하였다. 실험개시 첫째날에 콜라겐/complete freund's adjuvant 100㎕를 DBA/1 마우스 꼬리에 피하주사하였다. 콜라겐/complete freund's adjuvant는 0.05M 아세트산에 2mg/㎖ 농도의 콜라겐(bovine typr II)을 용해시킨후, 동일한 농도의 complete freund's adjuvant를 혼합한 것이다. 실험개시 21일째날 콜라겐 100㎍을 복강주사하였으며, 실험개시 28일째날 리포폴리사카라이드(LPS) 40㎍을 복강주사하여 관절염 발증을 촉진시켰다. 류머티스 관절염의 발증정도는 육안으로 관찰하였으며, 이를 임상수치(clinical index)로 나타내었다. 즉, 0 = 무발증, 0.5 = 발가락이 빨개지며 부운상태, 1 = 경증도의 발증상태, 1.5 = 중증도의 발증상태, 2 이상 = 심한발증 및 관절강직이 나타난 상태를 의미한다. DBA/1 마우스의 네발에 대한 류머티스 관절염 발증도를 검사하였으며 0점에서 8점까지의 관절염 유발정도를 나타내었다. 류머티스 관절염 발병은 실험개시 28일째 복강주사한 LPS에 의해 촉진되어 실험개시 29일째 육안적인 병변이 관찰되었다.

실시예 2 : 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과

본 발명에서는 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과를 확인하기 위하여 10mg/kg의 프로디지오신을 (1)류머티스 관절염 발병시점인 실험개시 29일부터 실험 최종일인 실험개시 65일까지 격일로 복강투여하는 경우, (2)류머티스 관절염 발병시점인 실험개시 29일부터 실험개시 36일까지 격일로 복강투여하는 경우, (3)류머티스 관절염이 진행중인 실험개시 36일부터 실험 최종일인 실험개시 65일까지 격일로 복강투여하는 경우로 구분하여 실험을 실시하였다.

본 실시예 2에서는 상기 실시예 1에서 준비한 류머티스 관절염 DBA/1 마우스에 실험개시 29일부터 실험개시 65일까지 격일마다 프로디지오신 10mg/kg을 복강투여하였다. 상기 방법에 따른 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 도 1에 나타내었다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스는 3 이상의 류머티스 관절염 발증도를 나타냄에 반하여(닫힌원), 프로디지오신을 투여한 DBA/1 마우스는 0.5 이하의 발증도를 나타내었다(열린원). 상기 결과로부터 프로디지오신은 류머티스 관절염의 발증을 강하게 억제하는 치료제임을 알 수 있었다.

실시예 3 : 초기 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과

프로디지오신 투여중지 후의 변화 및 초기 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 영향을 알아보기 위하여 상기 실시예 1에서 준비한 류머티스 관절염 DBA/1 마우스에 실험개시 29일부터 실험개시 36일까지만 격일마다 프로디지오신 10mg/kg을 복강투여하였다. 상기 방법에 따른 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 도 2에 나타내었다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스는 3 이상의 류머티스 관절염 발증도를 나타냄에 반하여(닫힌원), 프로디지오신을 투여한 DBA/1 마우스는 실험개시 38일경까지 0.5 이하의 발증도를 나타내었다(열린원). 따라서, 프로디지오신은 류머티스 관절염의 발병억제 및 치료효과가 있음을 알 수 있었다. 한편, 프로디지오신의 투여를 중지한 후 발증율이 1 정도까지 급격히 증가하였으나, 더 이상의 심각한 증가는 관찰되지 않았다. 상기 결과로부터 프로디지오신은 관절염의 발병시작 및 초기증상을 억제할 뿐만 아니라, 투여중지 후에도 증상이 심하게 악화되지 않음을 알 수 있었다. 이는 프로디지오신에 의해 관절에 대한 자가면역반응이 억제되었음을 의미한다.

실시예 4 : 진행성 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과

류머티스 관절염이 발병되어 진행된 후 프로디지오신의 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 준비한 류머티스 관절염 DBA/1 마우스에 실험개시 36일부터 실험개시 65일까지 격일마다 프로디지오신 10mg/kg을 복강투여하였다. 상기 방법에 따른 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스와 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 콜라겐 주사 후 경과일에 따른 류머티스 관절염 발증도를 도 3에 나타내었다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스는 실험개시 36일경에 2 정도의 발증도를 나타냈으며 그 후에도 지속적으로 증가하여 실험개시 65일경에는 4 정도의 발증도를 보임에 반하여(닫힌원), 프로디지오신을 투여한 DBA/1 마우스는 실험개시 36일경의 2정도의 발증도에서 더 이상 증가하지 않았다(열린원). 이는 프로디지오신에 의해 관절조직에 대한 자가면역반응이 억제되어 류머티스 관절염의 진행이 억제되었음을 의미한다.

실시예 5 : 병리검사 결과

상기 실시예 3의 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스 및 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 지골간관절 및 무릎관절에 대한 병리검사를 실시하였다. 프로디지오신 투여 최종일에 무릎관절과 지골간관절을 분리한 후 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 실시하였다. 그 현미경 사진도를 도 4에 나타내었다. 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스의 지골간관절(A) 및 무릎관절(C)에서는 정상조직이 관찰됨에 반하여, 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 지골간관절(A) 및 무릎관절(C)에서는 류머티스 관절염 병변이 관찰되었다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 지골간관절(B)에서는 관절내로의 면역세포의 침윤(Lymphocyte infiltration)이 관찰되었으나, 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스의 지골간관절(A)에서는 면역세포의 침윤이 관찰되지 않았다. 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 무릎관절(D)에서는 관절의 파괴가 관찰되었으나, 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스의 무릎관절(C)에서는 정상적인 무릎관절이 관찰되었다.

실시예 5 : 프로디지오신에 의한 사이토카인 생성억제

상기 실시예 3의 프로디지오신 투여군 DBA/1 마우스 및 프로디지오신을 투여하지 않은 대조군 DBA/1 마우스의 비장세포를 분리한 후 RNA를 분리하였다. 그후, RT-PCR(Reverse transcriptase polymerase chain reaction)을 이용하여 사이토카인들의 발현도를 측정했다. 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12; Th1 세포 유래의 사이토카인 IL-2, IFN-γ; Th2 세포 유래의 사이토카인 IL-4, IL-10의 발현도를 측정했다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 프로디지오신을 투여함으로써 상기 모든 종류의 사이토카인 발현이 감소되었다. 상기 결과로부터, 류머티스 관절염에 대한 프로디지오신의 치료효과는 류머티스 관절염을 유발하는 중요한 병인(病因)인 사이토카인의 발현을 억제함으로써 달성됨을 알 수 있었다.

이상, 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 세라시아 마르세센스에서 분리한 프로디지오신은 초기 류머티스 관절염 및 진행성 류머티스 관절염을 부작용 없이 치료할 수 있는 류머티스 관절염 치료제이므로, 본 발명은 류머티스 관절염 환자의 질환치료와 관련한 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

세라시아 마르세센스 B-1231 (Serratia marcescenceB-1231, KCTC 0386BP)에서 분리한 하기 화학식 1의 프로디지오신을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 류머티스 관절염 치료용 조성물.

(화학식 1)