DE2803001A1 - Neue aus hafnia isolierte glykoproteine, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents

Neue aus hafnia isolierte glykoproteine, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen

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Description

ROUSSEL-UCLAF, Paris/Frankreich
Neue aus Hafnia isolierte Glykoproteine, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue aus Hafnia isolierte wasserlösliche Glykoproteine.
In der Literatur werden zahlreiche Präparate mikrobischen Ursprungs beschrieben, die aus lysierten mikrobischen Körpern bestehen, wie z.B. in den BSM-PatentSchriften 5488 M (Canadian Patents and Development Limited), 6495 M (Institut de Recherches Scientifiques) und 6513 M (Institut de Recherches Scientifiques),
Diese mikrobischen Lysate dienen allein oder in Assoziation mit einem Antibiotikum dazu, eine rasche Immunisierungsreaktion einzuleiten oder die Abwehrkräfte des Organismus gegenüber einem mikrobischen Angriff zu erhöhen. Diese Lysate stammen im allgemeinen von einer bestimmten mikrobischen Species und führen zu einer eher spezifischen als allgemeinen Immunisierung.
Sie besitzen den Nachteil, im allgemeinen allergenisch zu sein. Ihre -wiederholte Verwendung kann daher nicht empfohlen werden.
In der FR-PS 2 043 475 wird eine Glykoproteinfraktion, die aus einem oder mehreren Saprophyten-Stärnmen oder pathogenen Stämmen isoliert wurde und eine immunitäre Wirkung und eine gewisse anti-inflammatorische Wirkung besitzt, beschrieben.
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Die Anmelderin hat seitdem versucht, neue Glykoprotein-Extrakte mit anti-inflammatorischen und immunostimulierenden Eigenschaften herzustellen, die auch eine gute Toleranz aufweisen.
Die vorliegende Anmeldung betrifft somit neue in Wasser lösliche Glykoproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus lysierten mikrobischen Körpern von Hafnia extrahiert sind und daß sie ein scheinbares Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 besitzen.
Das scheinbare Molekülargewicht ist das Molekulargewicht Y das unter Verwendung eines mit Hilfe von bekannten makromolekularen Lösungen geeichten porösen Gels bestimmt wird. Unter den geeichten porösen Gelen, die zur Bestimmung des Molekulargewichts dienen, kann man auch die Gele, die unter der Bezeichnung Sepharose (polymerisiertes hydrophiles Gel der Agarose) im Handel erhältlich sind, und insbesondere auf die Gele Sepharose 6 B zurückgreifen.
Unter den erfindungsgemäßen Glykoproteinen greift man insbesondere auf die Glykoproteine zurück, die ein scheinbares Molekulargewicht entsprechend oder höher als 1 000 000 besitzen.
Unter den erfindungsgemäßen Glykoproteinen greift man insbesondere auf Glykoproteine zurück, wie sie vorstehend definiert sind, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie 40 bis 50 % an Substanzen mit biuretogener Wirkung und 25 bis 35 % an neutralen Ösen aufweisen, die frei sind von Diaminopimelinsäure, und Absorptionsmaxima im ultravioletten Bereich von ca. 215 bis 260 mu besitzen.
Als Substanzen mit biuretogener Wirkung bezeichnet man die Proteine, die die Färbereaktion des Biurets ergeben.
Als neutrale Ösen bezeichnet man insbesondere die neutralen Hexosen, wie Glucose, Galaktose oder Mannose.
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— ο —
Die Abwesenheit von Diaminopimelinsäure in den vorstehend definierten Glykoproteinen ist ein Zeichen dafür, daß diese nicht der Membran entstammen.
Unter den erfindungsgemäßen Glykoproteinen, wie sie vorstehend definiert sind, greift man insbesondere auf die Glykoproteine zurück, die aus dem Stamm Hafnia extrahiert sind, der im Institut Pasteur in Paris unter der Nr. 5731 hinterlegt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von neuen wasserlöslichen Glykoproteinen, wie sie vorstehend definiert sind, v/obei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf festem oder flüssigen Milieu einen mikrobischen Stamm von Hafnia kultiviert, nach der vollständigen Entwicklung die mikrobischen Körper gewinnt, diese letzteren einer Lyse unterzieht, das Lysat gewinnt, dieses letztere mit Hilfe von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln behandelt, das erhaltene Rohprodukt gewinnt, es in wäßrige Lösung bringt, diese letztere einer Diafiltration an einer geeichten porösen Membran unterzieht, die eine Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 besitzt, und die so erhaltene Lösung lyophilisiert.
Die Hafnia-Stämme können insbesondere in flüssigen Milieu1s, die unter aeroben Bedingungen gerührt werden, kultiviert werden.
Die verwendeten Kulturmilieu1s sind für derartige Stämme üblich. Diese Milieu's können beispielsweise Fleischextrakte, Caseinpepton, papainisches Sojapepton, HefeautoIysate, Zuk— ker, mineralische Elemente und destilliertes Wasser enthalten.
Die Lyse der mikrobischen Körper kann physikalisch, chemisch oder enzymatisch sein.
Die physikalische Lyse kann vorteilhafterweise mit Hilfe von Ultraschall oder mit einer eindringenden Bestrahlung oder auch durch Erwärmen erfolgen.
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Die chemische Lyse kann vorteilhafterweise durch Hinzufügen eines oberflächenaktiven Mittels, wie Polyäthylenglykolsorbat, oder mit Hilfe einer antiseptischen Organoquecksilberverbindung, wie Natriummercurothiolat, oder sogar mit Hilfe einer Mineralsäure oder organischen Säure, wie Trichloressigsäure, durchgeführt werden.
Die enzymatische Lyse wird vorteilhafterweise mit Hilfe eines Enzyms, wie Lysozym, Trypsin, Pronase, Papain und oc-Chymotrypsin, durchgeführt.
Die Lyse, ob sie nun physikalisch, chemisch oder enzymatisch erfolgt, muß vorzugsweise während einer Dauer von 7 bis 60 Tagen durchgeführt werden.
Das erhaltene Lysat kann lyophilisiert werden.
Die Behandlung des Lysats mit Hilfe von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln wird vorteilhafterweise mit Hilfe von zv/ei organischen Lösungsmitteln durchgeführt, die in der angegebenen Reihenfolge Aceton und Methanol sein können. Diese Behandlung soll bewirken, daß die Lipide und die Pigmente eliminiert werden. Sie soll durchgeführt werden, indem man kräftig und während mehrerer Stunden das Lysat mit dem oder den organischen Lösungsmittel(n) rührt.
Die geeichten porösen Membranen, die eine Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 besitzen, können in vorteilhafter Weise aus Membranen bestehen, die im Handel unter der Bezeichnung X M 3,00 von der ROMICON- und AMICON-Gesellschaft (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts 02713/uSA) erhältlich sind.
Die geeichten porösen Membranen mit einer Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 können in der Form von Hohlfasern vorliegen.
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Unter diesen letzteren kann man insbesondere auf die Hohlfasern zurückgreifen, die unter der Bezeichnung HIP 100 von der vorstehend genannten AMICON-Gesellschaft erhältlich sind.
Gemäß einer Variante des Verfahrens kann man vorteilhafterweise eine vorangehende Diafiltration mit Hilfe einer geeichten porösen Membran mit einer Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 300 000 durchführen.
Hierfür kann man beispielsweise Membranen mit einer Retentionsschwelle von 100 000 verwenden, wie die Membranen, die unter" der Bezeichnung XM 100 über die vorgenannte AMICON-Gesellschaft im Handel erhältlich sind.
Unter den bevorzugten Bedingungen für die Durchführung der Erfindung ist das vorstehend beschriebene Herstellungsverfahren dadurch gekennzeichnet, daß
a) die Lyse der mikrobischen Körper eine enzymatische Lyse ist;
b) die Behandlung des Lysats unter Verwendung von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln sukzessive mit Hilfe von Aceton und Methanol durchgeführt wird und
c) die geeichte poröse Membran mit einer Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 eine Membran ist, die im Handel unter der Bezeichnung XM 300 von der AMICON- oder ROMICON-Geseilschaft erhältlich ist.
Die erfindungsgemäß verwendbaren Membranen HIP 100, XM 1OO und XM 300 sind allgemein bekannt und bestehen aus biologisch inerten synthetischen Polymeren,die sich nicht von der Cellulose ableiten.
Unter den enzymatischen Lysen, wie sie vorstehend definiert wurden, greift man insbesondere auf die Lysen zurück, die mit Hilfe von Lysozym durchgeführt werden. Die erfindungsgemäßen Glykoproteine sind leicht beige gefärbt, geruchlos, neutral und bis zu einer Konzentration von 25 mg/ml wasserlöslich. Sie sind im Gegensatz hierzu in Lösungsmitteln, wie Äthanol, Methanol, Aceton, Äther oder Benzol, unlöslich.
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Auf Grund der Chromatographie an Sepharose 6 B hat man festgestellt, daß das Molekulargewicht der erhaltenen Produkte höher ist als 1 000 000.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt eine Absorption bei den kurzen Wellenlängen (Maximum bei ca. 215 mp), die für die peptidische Bindung charakteristisch ist, und eine schwächere Absorption bei ca. 260 mu, die für Nucleinsäuren und Proteine charakteristisch ist.
Das Infrarot-AbsorptionsSpektrum bestätigt die zum Teil peptidische Natur der Produkte.
Die Reaktionen zur Charakterisierung der Zucker (Reaktion mit Orcin und Carbazol) sind positiv.
Die Reaktionen zur Charakterisierung von peptidischen Bindungen (Biuret-Reaktion von Lowry und die Reaktion mit Ninhydrin) sind gleichfalls positiv.
Die Glykoproteine der vorliegenden Anmeldung sind nicht dialysierbar, sie sind in der Wärme (1 Stunde bei 105°C) und bei extremen pH-Werten (pH 3 und pH 10, 15 Stunden bei +4°C) pharmakologisch stabil. Sie halten der Einwirkung eines proteolytischen Enzyms, wie der Pronase (24 Stunden bei +37 C) stand.
Die vorliegende Anmeldung betrifft auch ein Verfahren wie vorstehend definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den beim Institut Pasteur in Paris unter der Nr. 5731 hinterlegten Hafnia-Stamm verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Glykoproteine, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften. Sie sind insbesondere mit bemerkenswerten anti-inflammatorisehen, immunostimulierenden
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Eigenschaften sowie mit einer sehr guten Toleranz ausgestattet.
Diese Eigenschaften v/erden nachstehend im experimentellen Teil veranschaulicht.
Diese Eigenschaften rechtfertigen die Verwendung der anmeldungsgemäßen Glycoproteine als Arzneimittel.
Unter den erfindungsgemäßen Arzneimitteln greift man insbesondere auf die Arzneimittel zurück, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus den neuen wasserlöslichen Glykoproteinen bestehen, die ausgehend von dem beim Institut Pasteur unter der Nr. 5731 hinterlegten Hafnia-Stamm erhalten wurden.
Unter den erfindungsgemäßen Arzneimitteln greift man auch auf diejenigen zurück, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus solchen Glykoproteinen bestehen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden.
Diese Arzneimittel finden beispielsweise Anwendung bei der Behandlung von Entzündungen der Haut und der Schleimhäute und als juckstillende Mittel in der Dermatologie, in der Oto-Rhino-Laryngologie, in der Ophthalmologie, in der Proktologie oder in der Gynäkologie sowie bei der Behandlung von chronischen oder akuten intestinalen Infektionen, wie von Kolibazillosen, bei der Behandlung von alimentären Toxiinfektionen durch SaI-monellen und enterotoxische Staphylokokken, bei der Behandlung von dysenterischen Syndromen mikrobischen Ursprungs, wie der Shigellosen, bei der Behandlung von Candidosen des Verdauungstrakts und bei der Behandlung von Infektionen der Harnwege mit Proteus und mit Pseudomonas.
Die übliche Dosis, die gemäß dem verwendeten Produkt, dem zu behandelnden Patienten und der zur Rede stehenden Erkrankung variiert, kann beispielsweise 0,5 mg bis 20 mg je Tag bei der oralen Verabreichung an den Menschen betragen.
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Die Erfindung betrifft schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die die anmeldungsgemäßen Glycoproteine als Wirkstoff enthalten.
Als Arzneimittel können die erfindungsgemäßen Glykoproteine über den Verdauungstrakt, auf parenteralem Weg oder auf lokalem Weg verabreicht werden.
Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise fest oder flüssig sein und in pharmazeutischen Formen vorliegen, die üblicherweise in der Humanmedizin verwendet werden, wie beispielsweise einfache oder dragierte Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Lösungen, Sirupe, Suppositorien, injizierbare Präparate, Ovula, Cremes, Salben, Lösungen, Tropfen und Augenwasser bzw. -tropfen. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die Wirkstoffe können hierbei Excipienten einverleibt sein, die üblicherweise in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, wie Talk, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht-wäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschiedene Netz-, Dispergier- oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Man ,stellt ein Kulturmilieu der folgenden Formulierung her:
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Fleischextrakt 690 g
Natriumchlorid ■ 690 g
Caseinpepton 69Og
Hefeautolysat 690 g
Bikaliumphosphat 483 g
■ Monokaliumphosphat 207 g
Glucose 4104 g
papainisches Sojapepton 2760 g destilliertes Wasser quantum satis für 138 Liter
Man stellt das Kulturmilieu her, indem man nacheinander den Fleischextrakt, das Natriumchlorid, das Caseinpeptin, das Hefeautolysat, das Bikaliumphosphat und das Monokaliumphosphat in ca. 20 1 destilliertem Wasser mischt. Man stellt den pH auf ca. 7 ein.
Man sterilisiert das Milieu bei 120°C während 40 Minuten. Die Lösungen der Glucose und des papainischen Sojapeptons werden in das Kulturmilieu zum Zeitpunkt des Ansetzens der Kultur, nachdem sie zuvor sterilisiert worden sind, eingebracht.
Der auf dem Gelose-Milieu kultivierte Hafnia-Stamm (Institut Pasteur Nr. 5731) wird in 50 cm Kulturmilieu angesetzt. Diese Lösung, die als Inoculum dient, wird in den Rest der Kulturbrühe eingebracht. Man stellt das Gesamtvolumen des Kulturmilieus auf 138 1 durch Zugabe von sterilem destillierten VJasser ein.
Das Kulturmilieu wird bei 37 C gehalten und der pH automatisch auf 7 eingestellt (durch Zugabe einer Ammoniaklösung oder durch Zugabe einer Chlorwasserstoffsäurelösung).
Das Wachstum der.Stämme wird photometrisch verfolgt. Die Anzahl der Stämme wird in Abhängigkeit von der bestimmten optischen Dichte im Vergleich zu einer Eichkurve ermittelt.
Nach der vollständigen Entwicklung, d.h. nach etwa 7 Stunden, enthält das Milieu ca. 1 Milliarde Stämme im cm .
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Stufe_B_: Lyse
Zu 138 1 der in der vorstehenden Stufe A erhaltenen Kulturbrühe fügt man eine wäßrige Lösung von Lysozym-hydrochlorid (sterilisiert durch Filtrieren über einer Milliporen-Membran von 0,22 u), um eine Endkonzentration von 160 v· an Lysozymhydrochlorid je cm des Kulturmilieus zu erhalten.
Man beläßt 1 Stunde bei 56°C in Anwesenheit von 0,25 g EDTA je 1 Brühe, 862,5 mg Natriummercurothiolat und 80 g Polysorbat (im Handel unter der Bezeichnung Tween 80 erhältlich) je 1 Kulturbrühe in Kontakt.
Man setzt die Lyse während 7 Stunden bei 37°C unter sterilen Bedingungen fort.
Man gewinnt das Lysat, homogenisiert durch Rühren und lyophilisiert danach.
Man erhält 7900 g eines braunen Pulvers.
a) Mit Aceton
Man bringt das gesamte in der vorstehenden Stufe B erhaltene Pulver in 138 1 kaltem Aceton in Suspension und rührt danach kräftig während 3 Stunden bei 3500 UpM.
Nach 3 Stunden wird die Suspension über einer Glasfritte filtriert. Man gewinnt ein gelbes Pulver, das man rasch absaugt.
b) Mit Methanol
Man bringt das vorstehend erhaltene Pulver (7295 g) in 138 1 kaltem Methanol in Suspension und rührt kräftig während 3 Stunden bei 1500 UpM.
Nach 3 Stunden wird die erhaltene Suspension abdekantiert, der überwiegende Teil der überstehenden Flüssigkeit durch
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Heberwirkung abgezogen und der Rest der Lösung über einer Glasfritte filtriert.
Das abgesaugte Pulver wird bei Raumtemperatur unter Vakuum 24 Stunden getrocknet. Man erhält so 3988 g eines hellbeigen Pulvers.
Stufe_D£ Diafiltration
Man bringt 6 χ 600 g des in der vorstehenden Stufe C erhaltenen Pulvers in 6 χ 10 1 destilliertem Wasser, das 1 g/l Merthiolat enthält, in Lösung.
Man beläßt die Lösung 24 Stunden bei +4 C unter Rühren, zentrifugiert 2 Stunden bei 4000 UpM und danach bei 90 000 g in einer Zentrifuge kontinuierlich mit einem Durchsatz von 6 l/stunde.
Man gewinnt die Lösung, die man auf 10 1 mit filtriertem destillierten Wasser (über einer Milliporen-Membran von 0,22 ii) ergänzt. Man bringt die erhaltene Lösung in eine Diafiltrationsvorrichtung ein, die mit porösen Membranen ausgestattet ist, deren Retentionsschwelle bei 300 000 liegt und deren scheinbarer Porendurchmesser ca. 2 A beträgt (unter der Bezeichnung XM 300 im Handel erhältliche Membranen der AMICON-Gesellschaft oder der ROMICON-Gesellschaft).
Man läßt in der Vorrichtung 50 Volumina destilliertes Wasser, entsprechend einem Volumen von 500 1, zirkulieren.
Die Arbeitsdauer beträgt etwa 48 Stunden.
Die diafiltrierte Lösung wird gewonnen und danach kontinuierlich bei 90 000 g mit einem Durchsatz von 6 l/stunde zentrifugiert.
Man erhält 9,5 1 einer Lösung, die man lyophilisiert.
Man gewinnt schließlich 105 g Glykoproteine in Form eines weißbeigen Pulvers, das flockig bzw.wollig und sehr hygroskopisch ist.
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Analyse: C 3 7,9 H 6 N 7,5 %
Gehalt an: 9 01
Wasser o,
Phosphor 0
Chlor 51
Proteinen - Biuret 29 5
Zucker - Orein 1,
-Carbazol
UV-Spektrum:
(neutrale Hexosen)
ein Maximum bei 216 πιμ ein Maximum bei 258 ΐημ
IR-Spektrum: bestätigt die zum Teil peptidische Natur der Produkte.
Die Hydrolyse mit 6n-Chlorwasserstoffsäure bei 110 C während 24 Stunden der vorstehend erhaltenen Glykoproteine und die anschließende Chromatographie an einer Celluloseplatte mit einem der folgenden Lösungsmittelsysteme: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (60/30/30), Isopropanol/Ammoniak (§/j) oder Methanol/Pyridin/ Essigsäure/Wasser (I8/50/4/28) zeigt die Abwesenheit von Diaminopimelinsäure in diesen HydroIysäten. Diese Abwesenheit der Diaminopimelinsäure in den Hydrolysäten zeigt an, daß die erfindungsgemäß erhaltenen Glykoproteine nicht der Membran entstammen.
Die Untersuchung der Kurve der optischen Dichten bei 280 my des Eluats der Chromatographie an Sepharose 6 B der in Beispiel 1 erhaltenen Glykoproteine in Abhängigkeit der Ve/Vo zeigt, daß diese ein Molekulargewicht von höher als 1 000 besitzen.
(Vo entspricht dem Elutionsvolumen eines Dextrans mit einem Molekulargewicht von höher als 1 000 000t das an Sepharose 6 B, dessen Molekulargewichtsgrenze für die Zurückhaltung 1 000
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- 16 beträgt, vollständig zurückgehalten wird.
Ve entspricht dem EIutionsvolumen der erhaltenen Hafnia-Glyko proteine.)
Beispiel 2
Indem man wie bei den Stufen A und B von Beispiel 1 arbeitet, stellt man 90 1 Lysat her, das man lyophilisiert.
Man erhält 45 70 g eines gelb-braunen Pulvers.
a) Mit Aceton
Man extrahiert das vorstehend erhaltene Pulver mit 90 1 kaltem Aceton wie in Stufe C a) von Beispiel 1 angegeben.
b) Mit Methanol
Man extrahiert das vorstehend erhaltene Produkt mit 90 1 Methanol wie in Stufe C b) von Beispiel 1 angegeben. Man trocknet unter Vakuum in der Kälte und erhält 1765 g eines beigefarbenen Pulvers.
Stufe D: Diafiltration
Man bringt 600 g des vorstehend in Stufe C erhaltenen Pulvers in 15 1 destilliertem Wasser in Suspension, rührt 15 Stunden bei +40C und zentrifugiert die Lösung bei 4000 UpM während 2 Stunden und danach kontinuierlich bei 90 000 g mit einem Durchsatz von 6 l/stunde.
Man erhält 14 1 Lösung, die man in eine Diafiltrationsvorrichtung einbringt, die mit porösen Membranen ausgestattet ist, deren Retentionsschwelle 300 000 beträgt und deren scheinbarer Porendurchmesser ca. 2 A beträgt (im Handel unter der Bezeichnung XM 300 von der AMICON-Gesellschaft und von der ROMICON-Gesellschaft erhältliche Membranen). Man wäscht die 14 1 Lösung mit 40 Volumina destilliertem Wasser.
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- 17 Die Arbeitsdauer beträgt ca. 48 Stunden.
Die Endlösung wird bei 90 000 g zentrifugiert und danach lyophilisiert. Man erhält 55,6 g eines weiß-beigen flockigen und sehr hygroskopischen Pulvers.
Analyse; C 40,3 H 6 N 8,3 %
Gehalt an:
Wasser 10 %
Phosphor 0,025 %
Chlor 0 %
Proteinen - Biuret 41 %
Zucker - Orcin 26 % (neutrale Hexosen)
UV-Spektrum: Maximum bei 215 und 257 mp
IR-Spektrum: bestätigt die zum Teil peptidische Natur der Produkte.
Abwesenheit von Diaminopimelinsäure.
Molekulargewicht an Sepharose 6 B von höher als 1 000 000.
Beispiel 3
Man stellte der folgenden Formulierung entsprechende Tabletten her:
in Beispiel 1 erhaltene Glykoproteine 5 mg
Excipient quantum satis für eine Tablette mit einem
Endgewicht von 200 mg
(Bestandteile des Excipienten: Lactose, Talk, Stärke, Magnesiumstearat)
Beispiel 4
Man stellte eine der folgenden Formulierung entsprechende Salbe her:
in Beispiel 2 erhaltene Glykoproteine 2OO mg
Excipient quantum satis für -1 ' 100 g
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Pharmakoloqische Untersuchung
a) Anti-inflammatorische Aktivität
Die anti-inflammatorische Aktivität der Produkte wurde an männlichen Ratten nach der Technik des podalen Ödems mit Karragheenin [Winter, Risley, Nuss, Proc.Soc.Exp'.Biol.Med. , 111 (1961) 544-547] untersucht.
Die Tiere erhalten in das obere Sprunggelenk einer Hinterpfote 0,05 ml einer 1%-igen Karregheenin-Suspension.
Das zu untersuchende Produkt wird auf intraperitonealem Weg in Dosen von 10*-/kg und 100 »-/kg 1 Stunde vor der Injektion des Karragheenins verabreicht.
Man mißt das Volumen der behandelten Pfote mit Hilfe eines Plethysmometers vor und 3 Stunden nach der Karragheenin-Injektion.
Die Ergebnisse werden in prozentualer Regression des Ödems im Bezug auf die Vergleichstiere ausgedrückt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben.
Tabelle^I
Produkt von
Beispiel		 Dosis in
rAg 		Prozentuale Verminderung
des Ödems
1 10 64 %
2 100 .79,5 %
10 59 %
100 75 %
809831/074*
b) Untersuchung des zellularen Appells
Die in Beispiel 1 erhaltenen Glycoproteine werden auf intraperitonealem Weg an Gruppen von Meerschweinchen in Dosen von 50 und 100 v/kg verabreicht.
Man nimmt 48 Stunden nach der Injektion der Glykoproteine eine Zählung der peritonealen Zellen vor.
Der Vergleich dieser Zählung mit der an nicht-behandelten Tieren durchgeführten zeigt, daß kein zellularer Appell vorliegt.
c) Untersuchung der Toleranz
Die Verabreichung der in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Glykoproteine auf subkutanem Weg an Mäuse in Dosen von 250 r/kg und 1000 *-/kg in einem Volumen von 0,2 ml ruft keine lokale oder allgemeine Intoleranz hervor.
Es wurde kein Zeichen einer Entzündung in dem subkutanen Gewebe beobachtet.
d) Allgemeine präventive antibakterielle Aktivität
Die Glykoproteine werden in Dosen von 1000 i"/kg und 5000^~/icg auf intraperitonealem Weg an Gruppen von 20 Mäusen 6 Tage und 48 Stunden vor der Injektion auf dem gleichen Weg von Keimen eines Stammes von Klebsiella pneumoniae entsprechend dem 100- bzw. 500-fachen der LD50 (zu 50 % letale Dosis) verabreicht.
Man verfolgt die Mortalität während 7 Tagen im Anschluß an die Injektion von Keimen von Klebsiella pneumoniae und vergleicht mit derjenigen einer Vergleichsgruppe von Tieren, die physiologisches Serum anstelle des zu untersuchenden Produkts erhalten haben.
Die in prozentualem Schutz der behandelten Tiere ausgedrückten Ergebnisse (für die Produkte der Beispiele 1 und 2) sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben.
809831/0748
Tabelle II
^v1. Keime
Dosen ν.
in f/kg ^\^		 χ 100 χ 500
IOOO 40 70
5000 40 20
e) Stimulierung der nicht-spezifischen Abwehrkräfte
Diese Stimulierung wurde anhand des Tests der Clearence an Kohle bei der Maus untersucht, wobei man die Technik von Halpern [CR. Soc.Biol. 148 (1954) 43l] befolgte.
Diese Stimulierung äußert sich in einer Erhöhung der phagozytären Aktivität nach der Injektion des Produkts auf xntraperitonealem Weg.
Die Glykoproteine der Beispiele 1 und 2 ergeben eine Erhöhung um 77,5 % bzw. 88 % bei einer Dosis von 250 ^f /kg und von 31 % bzw. 86 % bei einer Dosis von 100 >~/kg während einer Zeit von 30 Minuten.
f) Gewxchtsentwicklung der Milz
Zwei Injektionen auf xntraperitonealem Weg an Mäuse in einem Abstand von 48 Stunden der in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen Glykoproteine in Dosen von 100, 250 und 500 ν/kg erhöhen nicht in signifikanter Weise das Gewicht der Milz.
g) Akute Toxizität - Bestimmung der
Die zu 50 % letale Dosis '(LDg0) auf xntraperitonealem Weg bei Mäusen wurde nach der Methode von Behrens und Kärber bestimmt.
Sie beträgt 50 mg/kg für die im Beispiel 1 erhaltenen Glykoproteine.
.809831/0748

Claims (12)

Dr. F. Zumstein sen. Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-ing. F KJingswisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE 800O München 2 BräuhausstraGe 4 - Telefon Sammel-Nr. 22 5341 · Telegramme Zumpat ■ Telex 529979 14/9 O/N Cas 1777 D Patentansprüche
1. Neue wasserlösliche Glykoproteine, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus lysierten mikrobischen Körpern von Hafnia extrahiert sind und daß sie ein scheinbares Molekulargewxcht entsprechend oder höher als 300 000 besitzen.
2. Glykoproteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein scheinbares Molekulargewxcht entsprechend oder höher als 1 000 000 besitzen.
3. Glykoproteine gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie 40 bis 50 % Substanzen mit biuretogener Wirkung und 25 bis 35 % neutrale Ösen enthalten, die frei sind von Diaminopimelinsäure und Absorptionsmaxima im ultravioletten Bereich bei ca. 215 bis 260 mu besitzen.
4. Glykoproteine gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Hafnia-Stamm der an dem Institut Pasteur in Paris unter der Bezeichnung Nr. 5731 hinterlegte Stamm ist.
5. Verfahren zur Herstellung von neuen wasserlöslichen GIykoproteinen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf festem oder flüssigem Milieu einen mikrobischen Stamm von Hafnia kultiviert, nach der vollständi-
8 0 9 8 3 1 / 0 7 L 8 ORIGINAL INSPECTED
gen Entwicklung die mikrobischen Körper gewinnt, diese letzteren einer Lyse unterzieht, das Lysat gewinnt, dieses letztere mit Hilfe von einem oder mehreren organischen Verdünnungsmitteln behandelt, das erhaltene Rohprodukt gewinnt, dieses in eine wäßrige Lösung überführt, diese letztere einer Diafiltration an einer kalibrierten porösen Membran unterzieht, die eine Retentionsschwelle für Substanzen aufweist, deren Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 ist, und die so erhaltene Lösung lyophilisiert.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
a) die Lyse der mikrobischen Körper eine enzymatisch^ Lyse ist;
b) die Behandlung des Lysats mit Hilfe von einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln sukzessive mit Hilfe von Aceton und Methanoi durchgeführt wird und
c) die kalibrierte poröse Membran, die eine Retentionsschwelle für Substanzen mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als 300 000 besitzt, eine unter der Bezeichnung XM 300 von der Gesellschaft AMICON oder ROMICON im Handel erhältliche Membran ist.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Lyse mit Hilfe von Lysozym durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Hafnia-Stamm verwendet, wie er in Anspruch 4 definiert ist.
9. Glykoproteine, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 6, 7 oder 8.
10. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest eines der Glykoproteine, wie sie gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 definiert sind, enthalten. 8 0 9 8 31/0748
11. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest eines der Glykoproteine, wie sie in Anspruch 4 definiert sind, enthalten.
12. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest eines der Glykoproteine, wie sie in Anspruch 9 definiert sind, enthalten.
a 0 9 8 3 1 /Ρ7ύ8
DE19782803001 1977-01-27 1978-01-24 Neue aus hafnia isolierte glykoproteine, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen Granted DE2803001A1 (de)

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