DE3409029C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Polysaccharid, das aus Reiskleie beliebiger Herkunft durch Extraktion und Reinigung erhältlich ist, ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie ein Antitumormittel, ein Immunomodulierungsmittel und ein Wirts- Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, welche diese Substanz als wirksame Komponente (Wirkstoff) enthalten.

Es sind bereits verschiedene Polysaccharide bekannt, die aus verschiedenen Quellen, beispielsweise aus Basidiomyceten (JP-PS 94 012/1978), aus Bakterien (JP-PS 76 896/1979), aus Schimmelpilzen (JP-PS 59 097/1978), aus Algen (JP-PS 28 923/1977) und aus Getreide (JP-PS 139 713/1978) gewonnen werden.

Aus den US-PS 43 66 308 und 43 57 323 sowie aus "Chem. Abstracts"? Band 97, 61001a (1982), sind Polysaccharide bekannt, die aus Reiskleie durch Heißwasser-Extraktion und Reinigung gewonnen wurden, und in der Hauptkette aus a-1,6-Glucoseeinheiten aufgebaut sind.

Es ist auch bekannt, daß diese Polysaccharide, die an eine α-Glucan-Struktur gebundenes Protein enthalten, eine Antitumoraktivität sowie immunstimulierende Wirkung haben. Bei der Verwendung dieser Polysaccharide als Antitumormittel treten jedoch verschiedene Mängel auf, z. B. weisen sie eine unerwünscht hohe Toxizität auf, sind nur gegen allogene, nicht jedoch gegen synergetische Tumoren wirksam, ihr Herstellungsverfahren ist verhältnismäßig kompliziert und liefert das gewünschte Produkt in geringer Ausbeute.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Polysaccharid zu finden, das eine noch bessere Antitumoraktivität und immunstimulierende Wirkung als die bekannten Polysaccharide aufweist, ohne deren Toxizität zu besitzen, und das sich auf wirtschaftlicher Weise in hoher Ausbeute herstellen läßt.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch ein proteinfreies Polysaccharid, das aus Reiskleie beliebiger Herkunft durch Extraktion und Reinigung erhältlich ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Polysaccharid der eingangs genannten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein Polysaccharid handelt, das

• a) Glucose als einzige Zuckerkomponente enthält und α-1,6-Glucosid-Bindungen in einer Hauptkette sowie ferner α-1,4-Glucosid-Bindungen aufweist und
• b) die folgenden Eigenschaften besitzt:
  • - es passiert eine Dialysemembran nicht,
  • - es ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich,
  • - seine 1%ige wäßrige Lösung ist neutral,
  • - es enthält nicht mehr als 5% Mineralien,
  • - es reagiert positiv in den Molisch-, Anthron-Schwefelsäure-, Tryptophan-Schwefelsäure-, Cystein-Schwefelsäure-, Chromotrop-Schwefelsäure-, Phenol-Schwefelsäure- und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktionen und
  • - es reagiert negativ in den Biuret-, Ninhydrin-, Lowry- Folin-, Elson-Morgan- und Stärke-Jod-Reaktionen,
  • - es weist charakteristische Ultraviolett-Absorptions-, Infrarot-Absorptions- und ¹³C-NMR-Spektren gemäß Fig. 1 bis 3 auf.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid, das kein Protein enthält, sondern ein reines α-Glucan darstellt, weist eine ausgeprägte immun-modulierende Aktivität, eine Wirtsabwehr-Aktivität zusammen mit einer Antitumor-Aktivität, insbesondere eine Antitumor-Aktivität gegen synergetische Tumoren bei oraler Verabreichung auf. Das erfindungsgemäße Polysaccharid ist nicht nur wirksam gegen allogene Tumoren wie die o. g. bekannten Polysaccharide, sondern auch gegen syngene Tumoren bei intraperitonealer und oraler Verabreichung sowie auch gegen homologe Tumoren. Aufgrund seiner Wirksamkeit gegen synergetische Tumoren, die anhand von Tierversuchen nachgewiesen wurden, ist das erfindungsgemäße Polysaccharid eine außerordentlich wertvolle Substanz, die einen therapeutischen Effekt mit sich bringt, der in der Praxis erheblich ins Gewicht fällt und auch für den Fachmann auf diesem Gebiet nicht vorhersehbar war.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Polysaccharids, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in jeweils an sich bekannter Weise
das Polysaccharid aus Reiskleie beliebiger Herkunft mit heißem Wasser extrahiert,
durch Zugabe eines polaren organischen Lösungsmittels oder eines Aussalzungsmittels zu dem wäßrigen Extrakt Niederschläge ausfällt, die das Polysaccharid enthalten,
die Niederschläge isoliert und
die Niederschläge einer Deproteinisierungsbehandlung unterwirft.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert das erfindungsgemäße proteinfreie Polysaccharid auf technisch einfache Weise in hoher Ausbeute.

Gegenstand der Erfindung sind ferner
ein Antitumormittel, welches das erfindungsgemäße Polysaccharid als Wirkstoff enthält,
ein Immunomodulierungsmittel, welches das erfindungsgemäße Polysaccharid als Wirkstoff enthält, und
ein Wirts-Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, welches das erfindungsgemäße Polysaccharid als Wirkstoff enthält.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 ein UV-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharids;

Fig. 2 ein IR-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharids; und

Fig. 3 ein ¹³-C-NMR-Spektrum des erfindungsgemäß hergestellten Polysaccharids.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wird gewonnen bzw. hergestellt aus Reiskleie durch Extraktion und Reinigung. Diese Reiskleie ist ein Nebenprodukt, das bei der Herstellung von poliertem Reis aus unpoliertem Reis erhalten wird, und sie unterliegt keinen Beschränkungen in bezug auf die Art des unpolierten Reises, das Produktionsgebiet und den Grad der Polierrate. Vor der Extraktion und Reinigung des Polysaccharids aus der Reiskleie ist es zweckmäßig, die Reiskleie vollständig zu waschen, um pulverisierten (oder zerkleinerten) Reis und andere Verunreinigungen zu eliminieren. Erfindungsgemäß können auch Reiskleiearten, die bereits für andere Zwecke verwendet worden sind, wie z. B. eine entfettete Reiskleie, die als Rückstand bei der Extraktion von Reiskleienöl aus Reiskleie erhalten wird, verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wird hergestellt durch Zugabe von organischen Lösungsmitteln oder Aussalzungsmitteln zu einem Extrakt, der durch Heißwasser-Behandlung von Reiskleie erhalten worden ist, zur Erzeugung von Niederschlägen und gewünschtenfalls Auflösung der erhaltenen Niederschläge in Wasser, um sie zu reinigen.

Die Reiskleie wird nach der Pulverisierung durch einen Separator, beispielsweise ein Sieb, passiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und, falls erforderlich, mit Wasser gewaschen. Es ist zweckmäßig, die lipidlösliche Fraktion unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Ethylacetat, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Äther, n-Hexan, Benzol, Petroläther, Aceton zu entfernen.

Die Heißwasser-Behandlung der Reiskleie wird durchgeführt durch Einführen der Reiskleie und von destilliertem oder gereinigtem Wasser in einer Menge von etwa dem 5- bis 10- fachen der Menge der Reiskleie in einen Behälter oder einen Druckbehälter, beispielsweise einen Tank aus rostfreiem Stahl, einen emaillierten Tank, einen Glastank, eine Durchfluß-Rohrextraktionsvorrichtung mit oder ohne Rühren unter einem Druck von 0 bis 1,5 MPa, vorzugsweise von 0 bis 0,5 MPa, und bei einer Temperatur von 70 bis 200°C, vorzugsweise von 100 bis 150°C, für einen Zeitraum von 10 min bis 24 h, vorzugsweise von 0,5 bis 5 h. In der Praxis ist es zweckmäßig, die Heißwasser-Behandlung bei einem Druck von 0 bis 0,3 MPa und einer Temperatur von 100 bis 140°C für einen Zeitraum von 1 bis 5 h durchzuführen.

Der bei der Heißwasser-Behandlung erhaltene Extrakt wird verschiedenen Operationen unterworfen, beispielsweise einer Filtration, einer Zentrifugierung, um Feststoffe abzutrennen, und erforderlichenfalls wird er dann auf ein geeignetes Volumen eingeengt durch Anwendung verschiedener Methoden, wie z. B. der Einengung bei vermindertem Druck, der Ultrafiltration, einzeln oder in Kombination miteinander.

Durch Sammeln der Niederschläge, die bei der Zugabe eines wasserlöslichen polaren organischen Lösungsmittels oder eines Aussalzungsmittels zu dem Extrakt gebildet werden, erhält man das rohe Polysaccharid.

Zu polaren organischen Lösungsmitteln, die in diesem Verfahren verwendet werden können, gehören Methanol, Ethanol, Propanol, Aceton. Die Menge des polaren organischen Lösungsmittels, die verwendet wird, wird festgelegt unter Berücksichtigung der Menge der gewünschten Substanz, die in dem Extrakt enthalten ist. So kann beispielsweise im Falle von Ethanol dieses in einer solchen Menge zugegeben werden, daß die Ethanolkonzentration 30 bis 50 Vol.-% beträgt. Die gebildeten Niederschläge werden vorzugsweise mit dem organischen Lösungsmittel wie vorstehend angegeben, beispielsweise mit Ethanol, gewaschen.

Zu den Aussalzungsmitteln, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, gehören Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und Kaliumchlorid. Das Aussalzungsmittel wird in der Regel zugegeben, bis der Grad der Sättigung 0,5 bis 1 erreicht hat, um dadurch Niederschläge zu erzeugen.

Die Deproteinisierung und Reinigung des Polysaccharids können entweder vor der Zugabe des organischen Lösungsmittels oder des Aussalzungsmittels zu dem Extrakt oder nach der Bildung der Niederschläge durch die Zugabe des organischen Lösungsmittels oder des Aussalzungsmittels und die anschließende Auflösung der Niederschläge in Wasser durchgeführt werden.

Zur Durchführung der Reinigungs- und Deproteinisierungsbehandlung können verschiedene bekannte Verfahren angewendet werden. Beispielsweise wird ein amylolytisches Enzym und/ oder ein proteolytisches Enzym einer das Polysaccharid enthaltenden Lösung zugegeben, um die darin enthaltenen Verunreinigungen, wie z. B. Stärke, Protein in Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht umzuwandeln. Diese Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht werden in einer nachfolgenden Reinigungsstufe entfernt.

Als derartige Enzyme können ein amylolytisches Enzym, beispielsweise α-Amylase, iso-Amylase und Pululanase, ein proteolytisches Enzym, beispielsweise Papain, Pepsin, Trypsin und Pronase, und erforderlichenfalls andere Enzyme verwendet werden. Bei dieser Enzymbehandlung ist es bevorzugt, daß das Enzym in einer Menge (Verhältnis) von 1/1000 bis 1/5000 des Substrats zugegeben wird und daß die Behandlung 0,5 bis 24 h lang, vorzugsweise 1 bis 15 h lang, durchgeführt wird.

Zusätzlich können die folgenden Reinigungs- und Deproteinisierungsverfahren angewendet werden: ein Verfahren, bei dem eine anorganische oder organische Säure, wie z. B Eisessig, Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Gerbsäure, Trichloressigsäure, einer wäßrigen Lösung, welche das oben beschriebene Polysaccharid in einem Mengenanteil von etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-%, vorzugweise von etwa 3 bis etwa 5 Gew.-% enthält, zugesetzt wird. Wenn Niederschläge gebildet werden, werden sie durch Operationen, wie Filtrieren, Zentrifugieren entfernt und anschließend werden die zurückbleibenden Säuren, anorganischen Ionen und niedermolekularen Fraktionen 1 bis 3 Tage lang gegen fließendes Wasser oder destilliertes Wasser unter Verwendung einer semipermeablen Membran, wie z. B. einer Cellophan-Membran, einer Collodion-Membran, dialysiert; ein Ionenaustauschverfahren, bei dem ein Kationen- oder Anionenaustauscher, wie z. B. Dowex®, Amberlite®, Duolite® oder Diaion® verwendet wird; ein Ultrafiltrationsverfahren, bei dem eine Membran mit einem fraktionellen Molekulargewicht von 1000 bis 100 000 verwendet wird; die Gelfiltration; die Zentrifugierung; die Behandlung mit Aktivkohle; die Einengung (Konzentration) und eine Kombination davon. Außerdem kann das Polysaccharid unter Verwendung von Säuren und/oder einigen Enzymen bis auf Molekulargewichte von 1 000 000 bis 10 000 hydrolysiert werden unter Aufrechterhaltung der biologischen Aktivitäten. Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren kann eine große Menge Protein aus dem Polysaccharid entfernt werden. Eine geringe Menge Protein, das chemisch an das Polysaccharid gebunden ist, kann jedoch nicht vollständig entfernt werden. In diesem Falle ist es möglich, das Protein aus dem Polysaccharid nach einem Verfahren, wie z. B. dem Sevag-Verfahren, vollständig zu entfernen.

Diese Reinigungsverfahren können einzeln oder in Kombination miteinander angewendet werden und diese Kombinationen und die Reihenfolge, in denen sie angewendet werden, unterliegen keinen Beschränkungen.

Durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen einer das hochmolekulare Polysaccharid enthaltenden wäßrigen Lösung, die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist, kann ein weißes Polysaccharid in Form eines Pulvers erhalten werden.

Das auf diese Weise erhaltene Polysaccharid hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
Diese Substanz passiert eine Dialysemembran nicht und ist in organischen Säuren oder organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Eisessig, Alkoholen, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äthern unlöslich, jedoch in Wasser löslich;
eine 1%ige wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen Substanz ist neutral;
die erfindungsgemäße Substanz hat keinen Schmelzpunkt und wird bei 220°C braun und bei 280°C schwarz (Verkohlung bzw. Carbonisierung);
die Elementaranalyse zeigt, daß die in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 1 erhaltene erfindungsgemäße Substanz 38,10% Kohlenstoff, 6,27% Wasserstoff, 50,73% Sauerstoff und 4,90% Asche enthält;
eine 1%ige wäßrige Lösung der erfindungsgemäßen Substanz reagiert positiv bei den folgenden Farbreaktionen:
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure- Reaktion, Carbazol-Schwefelsäure-Reaktion, Tryptophan- Schwefelsäure-Reaktion, Cystein-Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion und Molisch-Reaktion, und sie reagiert negativ bei den folgenden Farbreaktionen:
Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion, Elson-Morgan-Reaktion und Stärke-Jod-Reaktion;
die spezifische Drehung der in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen Substanz beträgt [α] = +142 bis 145° (H₂O).

Es wurde bestätigt, daß die Aschekomponente Si, P, K, Na, Ca, Mg enthält, und aufgrund der Tatsache, daß das Polysaccharid bei der Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose CL-6B® im Ablaufvolumen eluiert wird, wird angenommen, daß die obengenannten Elemente nicht unabhängig voneinander in Form eines Elements oder einer Verbindung davon in den Polysaccharid vorliegen, sondern daß sie in einem Zustand vorliegen, in dem sie an ein Grundgerüst des Polysaccharids gebunden sind; die überstehende Flüssigkeit, die erhalten wird bei einem Verfahren, das die Hydrolyse des Polysaccharids mit 1 n Schwefelsäure bei 100°C für 3 Stunden und die anschließende Zugabe von Bariumcarbonat zur Neutralisation umfaßt, reagiert positiv bei den folgenden Farbreaktionen: Molisch-Reaktion, Anthron-Reaktion, Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion, Cystein- Schwefelsäure-Reaktion, Chromotrop-Schwefelsäure-Reaktion, und sie reagiert negativ bei den folgenden Farbreaktionen: Biuret-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion, Lowry-Folin-Reaktion; in dem obigen Hydrolysat wurde durch Dünnschichtchromatographie- Analyse stets Glucose nachgewiesen. Beim Entwickeln mit den nachstehend angegebenen vier Lösungsmitteln bei der Dünnschichtchromatographieanalyse der Produkte, die durch vollständige Hydrolyse des Polysaccharids mit Ameisensäure und Schwefelsäure erhalten wurden, konnten keine Flecken mit Ausnahme des einen als Glucose identifizierten nachgewiesen werden:

• 1) Ethylacetat : Methanol : Essigsäure : Wasser (65 : 15 : 10 : 10)
• 2) Ethylacetat : Isopropanol : Wasser (65 : 23 : 12)
• 3) Isopropanol : Pyridin : Wasser : Essigsäure (8 : 8 : 4 : 1)
• 4) n-Butanol : Pyridin : Wasser (6 : 4 : 3). Daraus kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäße RDP-Substanz ein Polysaccharid ist, das im wesentlichen aus Glucose als alleiniger Zuckerkomponente besteht.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid hat ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, ein Infrarot-Absorptionsspektrum, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und ein ¹³C-NMR-Spektrum, wie es in Fig. 3 dargestellt ist. Aufgrund des Infrarot-Absorptionsspektrums und der spezifischen Drehung wird angenommen, daß in dem Polysaccharid eine α-Bindung vorliegt.

Aufgrund der vorstehend beschriebenen Daten wird angenommen, daß die erfindungsgemäße Substanz ein Polysaccharid ist, das Glucose als alleinige Zuckerkomponente enthält.

Darüber hinaus verbrauchte die erfindungsgemäße Substanz bei der Perjodat-Oxdidation 1,7 Mol Natriumperjodat und setzte 0,85 Mol Ameisensäure pro Glucoserest frei. Das Smith-Abbau-Verfahren dieser Substanz ergab Glyzerin, nachgewiesen durch Papierchromatographieanalyse. Die Methylierungsanalyse dieser Substanz ergab 2,3,4-Tri-O-methyl- D-glucose zusammen mit einer geringen Menge an Tetramethyl- und Dimethylglucosederivaten.

Aufgrund der vorstehend angegebenen Daten wird angenommen, daß die erfindungsgemäße Substanz ein Polysaccharid ist, das eine α-1,6-Glucosid-Bindung als Hauptkette aufweist. Außerdem zeigte die ¹³C-NMR-Analyse der erfindungsgemäßen Substanz die Anwesenheit von α-1,6-gebundenen Glucose- Resten und einer viel geringeren Menge von α-1,4-gebundenen Glucose-Resten.

Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid verschiedene biologische Aktivitäten, beispielsweise eine Antitumor-, Immunomodulations- und Wirts- Abwehr-Aktivität gegen Infektionserkrankungen, aufweist. Die Methoden und Ergebnisse der Bestimmung dieser biologischen Aktivitäten des in Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Polysaccharids wird nachstehend näher beschrieben.

1) Antitumor-Aktivitäten a) Effekt der intraperitonealen Verabreichung des Polysaccharids gegen einen syngenetischen Tumor Meth-A

Auf 50 sechs Wochen alte weibliche BALB/C-CRJ-Mäuse (durchschnittliches Gewicht 20 g) wurden intraperitoneal Tumorzellen (1 × 10⁵ Zellen/Maus) transplantiert, die vorher eine Woche lang intraperitoneal in einer Maus des gleichen Stammes gezüchtet worden waren. Diese Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe zu 20 Mäusen als Kontrollgruppe und drei Gruppen zu 10 Mäusen jeweils als Testgruppen. An fünf aufeinanderfolgenden Tagen, vom Tage nach der Transplantation der Tumorzellen ab gerechnet, wurde das Polysaccharid, aufgelöst in einer Salzlösung, (physiologische Kochsalzlösung), intraperitoneal in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg pro kg (mg/kg) an die Testgruppen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung (physiologische Kochsalzlösung) in der gleichen Weise verabreicht. Die Überlebenszeit (Tage) wurde bestimmt und die Verlängerung des Lebens wurde nach der folgenden Gleichung errechnet:

a) Effekt der oralen Verabreichung des Polysaccharids gegen einen syngenetischen Tumor Meth-A

Auf 50 sechs Wochen alte weibliche BALB/C-CRJ-Mäuse (durchschnittliches Gewicht 20 g) wurden subkutan im Achselbereich Tumorzellen (1 × 10⁴ Zellen/Maus) transplantiert, die eine Woche lang intraperitoneal in einer Maus des gleichen Stammes gezüchtet worden waren. Diese Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe zu 20 Mäusen als Kontrollgruppe und drei Gruppen zu 10 Mäusen jeweils als Testgruppen. An 10 aufeinanderfolgenden Tagen, vom Tage nach der Transplantation der Tumorzellen ab gerechnet, wurde das Polysaccharid, gelöst in einer Salzlösung, oral in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg/kg an die Testgruppen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. 35 Tage nach der Transplantation der Tumorzellen wurden die Mäuse getötet und der Tumor, der sich entwickelt hatte, wurde herausgeschnitten und gewogen. Die Inhibierungsrate wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:

Die Antitumor-Aktivitäten des Polysaccharids, wie sie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren (a) und (b) bestimmt wurden, sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

Tabelle I

Aus den Ergebnissen der Tabelle I ist zu ersehen, daß das Polysaccharid eine starke Antitumor-Aktivität aufweist bei einer optimalen Dosis von etwa 30 mg/kg sowohl bei der intraperitonealen als auch bei der oralen Verabreichung.

Außerdem wurde bestätigt, daß das Polysaccharid auch wirksam ist gegenüber dem Lewis-Lungencarcinom, dem Melanoma B-16, dem Sarcome 180 und dem Ehrlich-Ascites-Carcinom innerhalb eines Dosisbereiches von 10 bis 100 mg/kg bei intraperitonealer oder oraler Verabreichung, mit dem Ergebnis, daß die Tumorinhibierungsrate 30 bis 70% betrug. Außerdem war das Polysaccharid nicht toxisch, wie nachstehend näher beschrieben. Es wird angenommen, daß das Polysaccharid als sehr wirkungsvolles Antitumormittel verwendet werden kann.

2) Immunomodulierungsaktivitäten a) Kohlenstoff-Entfernungs-Test (CCT)

Dieser Test wird angewendet zur Bestimmung des Effekts des Polysaccharids in bezug auf die Verstärkung der phagocytischen Aktivität von Makrophagen unter den Immunomodulierungswirkungen.

Das in einer Salzlösung gelöste Polysaccharid wurde intraperitoneal an eine Testgruppe von sechs vier Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen (durchschnittliches Gewicht 20 g) 2 Tage lang verabreicht. Andererseits wurde an die Kontrollgruppe nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am dritten Tage wurden 0,25 ml einer Kohlenstofflösung (hergestellt durch Verdünnen einer Druckerschwärze mit einer Salzlösung auf das 5fache) in die Schwanzvene injiziert. Unmittelbar nach der Injektion und auch 10 min nach der Injektion wurden 0,025 ml Blut aus dem Venenplexus der Augenhöhlenrückwand der Maus gesammelt, in 3,5 ml einer 0,01 M Natriumcarbonatlösung suspendiert und es wurde die Extinktion (Absorption) (OD₆₅₀) bei 650 nm gemessen, um die Rate der Abnahme der Konzentration des Kohlenstoffs in dem Blut zu bestimmen. Dies wird durch einen Phagocytose- Index angezeigt, der durch die folgende Gleichung definiert ist:

worin C₁ eine Extinktion (OD₆₅₀) zum Zeitpunkt T₁ und C₂ eine solche zum Zeitpunkt T₂ bedeuten.

Bei den Tumor tragenden Mäusen wurden Sarcoma 180-Zellen in den Muskel des Hinterbeins der Mäuse (1 × 10⁷ Zellen/ Maus) 7 Tage vor dem Beginn der Verabreichung des Polysaccharids transplantiert und danach wurden die Mäuse auf die gleiche Weise wie oben getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Aus den Ergebnissen der Tabelle II ist zu ersehen, daß sowohl bei den normalen als auch bei den Tumor tragenden Mäusen die Verabreichung des Polysaccharids in einer Menge von 10 bis 100 mg/kg, insbesondere in einer Menge von 30 mg/kg, die Funktion des Reticuloendothel-Systems der Mäuse verstärkte (verbesserte) und die Phagocytose-Aktivität der Macrophagen erheblich verstärkte.

b) Plaque-Bildungs-Zellen-Test (PFC)

Dieses Verfahren wird angewendet zur Bestimmung des Effekts des Polysaccharids auf die Verstärkung (Verbesserung) der Antikörper-Bildungsfähigkeit als Folge der Aktivierung von B-Zellen des Wirts unter den Immunomodulierungswirkungen.

Das Polysaccharid, gelöst in einer Salzlösung, wurde intraperitoneal an eine Testgruppe von sechs 4 Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen (durchschnittliches Gewicht 20 g) an drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am vierten Tage und auch am 11. Tage wurden rote Schafs-Blutkörperchen in die Schwanzvene (4 × 10⁸ Zellen/Maus) injiziert, um die Mäuse zu sensibilisieren. 4 Tage nach der Injektion wurde das Plaque-Bildungsvermögen der Milzzellen der Mäuse bestimmt nach dem Verfahren von Cunningham. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Aus den Ergebnissen der Tabelle III ist zu ersehen, daß die Verabreichung des Polysaccharids in einer Dosis von 10 bis 100 mg/kg die Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern erheblich verstärkte (verbesserte).

c) Hypersensibilisierungsreaktion vom verzögerten Typ

Dieses Verfahren wird angewendet zur Bestimmung des Effekts des Polysaccharids in bezug auf die Verstärkung der Wirkung der durch Zellen vermittelten Immunität als Folge der Aktivierung von T-Zellen des Wirts unter den Immunomodulierungswirkungen.

Das Polysaccharid, gelöst in einer Salzlösung, wurde oral an eine Testgruppe von sechs 8 Wochen alten ICR-CRJ-Mäusen (weiblich, durchschnittliches Gewicht 27 g) an acht aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde andererseits nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise verabreicht. Am vierten Tage nach der Verabreichung wurde eine 5%ige Ethanollösung von Picrylchlorid auf den Abdominalbereich aufgetragen, der rasiert worden war, um eine primäre Sensibilisierung zu erzielen. Am 11. Tage wurde eine 1%ige Olivenöllösung von Picrylchlorid auf die Vorderseite und die Rückseite jedes Ohrs der Maus aufgetragen, um eine sekundäre Sensibilisierung zu erzielen. 24 Stunden später wurde eine Zunahme der Dicke des Ohrs mittels eines Meßinstruments (Lehre) gemessen; d. h., die Zunahme der Dicke des Ohres wurde durch Messung des Unterschieds der Dicke vor dem Aufbringen und nach dem Aufbringen bestimmt. Andererseits wurde im Falle der Tumor-tragenden Mäuse Sarcoma 180 (1 × 10⁵ Zellen/Maus) intraperitoneal transplantiert vor der Verabreichung des Polysaccharids und danach wurde das gleiche Verfahren wie oben wiederholt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV

Aus den Ergebnissen der Tabelle IV ist zu ersehen, daß das in einer Dosis von 30 bis 500 mg/kg oral verabreichte Polysaccharid die durch Zellen vermittelte Immunität sowohl bei den normalen als auch bei den Tumor-tragenden Mäusen sehr verstärkte (verbesserte).

Aus den Ergebnissen der vorstehend beschriebenen Tests (a), (b) und (c) ist zu ersehen, daß das Polysaccharid verschiedene Immunitätswirkungen mit verschiedenen Mechanismen stark verbessert. Das Immunomodulierungsmittel kann in den Fällen verwendet werden, in denen die Immunitätsfunktion abnimmt oder die Erkennungsfunktion gegenüber dem Fremd-Antigen gering ist. Es wird daher angenommen, daß das Polysaccharid Verwendung finden wird beispielsweise als therapeutisches Mittel oder als therapeutisches Hilfsmittel oder als Mittel zur Verhinderung oder als Mittel zur Beschleunigung der Erholung nach der Operation bei Infektionserkrankungen und bösartigen Tumoren.

Zusätzlich zum vorstehend beschriebenen Immunitätsaktivierungs- oder -erholungsvermögen kann das Immunomodulierungsmittel manchmal dazu verwendet werden, die abnorm stimulierte Immunitätsreaktion zu normalisieren; es kann beispielsweise auf Autoimmunerkrankungen, wie z. B. Rheumatismus, Collagenerkrankungen und Allergie, angewendet werden.

3) Wirts-Abwehraktivität

Es ist bekannt, daß die Wirts-Aktivitäten von Lebewesen gegenüber bakteriellen Infektionserkrankungen auf folgenden Prinzipien basieren: eine wird als sogenannte Humoral- Immunität bezeichnet, die von der Bildung von Antikörpern gegen die eingedrungenen Bakterien abhängt, und eine andere wird als sogenannte Zellen-vermittelte Immunität bezeichnet, in der Makrophagen und T-Zellen die eingedrungenen Bakterien bekämpfen. Im allgemeinen weist der lebende Körper ausreichende eigene Abwehr-Aktivitäten gegenüber dem Eindringen dieser Fremd-Bakterien auf. Es ist jedoch bekannt, daß im Tumor-tragenden Zustand, insbesondere im späteren Krebsstadium, diese Aktivitäten stark abfallen, weshalb eine schwerwiegende Schädigung schon durch einige nicht-pathogene Bakterien hervorgerufen wird, die in der Regel in dem Wirt existieren.

Um zu bestimmen, ob das Polysaccharid die Wirts-Abwehr- aktivitäten des Wirts gegenüber durch solche Bakterien hervorgerufenen Infektionserkrankungen verstärkt (verbessert), wurde die Inhibierungs-Aktivität des Polysaccharids gegenüber der Infektion durch Escherichia coli, einem typischen Infektions-Mikroorganismus, an der, wie angenommen wird, die Humoral-Immunität teilnehmen kann, und gegenüber der Infektion durch Listeria monocytogenes, an der, wie angenommen wird, die durch die Zellen vermittelte Immunität teilnehmen kann, untersucht.

7 Wochen alte ICR-CRJ-Mäuse (weiblich, durchschnittliches Gewicht 26 g) wurden in vier Gruppen zu jeweils 20 Mäusen aufgeteilt. Das Polysaccharid, gelöst in einer Salzlösung, wurde subkutan in den Rücken der Mäuse in einer Dosis von 10, 30 oder 100 mg/kg an drei Tagen und einem Tag vor der Infektion injiziert. Der Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung auf die gleiche Weise injiziert.

Dann wurden im Falle von E. coli die Mäuse mit 2 × 10⁷ Zellen/Maus subkutan in den Rücken infiziert und im Falle von L. monocytogenes wurden die Mäuse mit 2 × 10⁷ Zellen/ Maus intraperitoneal infiziert. Nach 1 Woche wurde die Anzahl der Überlebenden verglichen. Der Schutzeffekt wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:

Die Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Aus den Ergebnissen der Tabelle V ist zu ersehen, daß die Verabreichung des Polysaccharids in einer Dosis von 10 bis 100 mg/kg vor der Infektion sehr starke Wirts-Abwehr- Aktivitäten gegenüber der Infektion durch E. coli und auch signifikante Aktivitäten gegenüber der Infektion durch L. monocytogenes hervorrief.

Im Hinblick darauf, daß das Polysaccharid untoxisch ist, ist zu erwarten, daß diese Substanz ein sehr wertvolles Wirtsabwehrmittel gegen Infektionserkrankungen ist.

Die akute Toxizität des Polysaccharids wird nachstehend näher beschrieben.

10 fünf Wochen alte SD-CRJ-Ratten (männlich, Gewicht 120 bis 150 g) wurden in der Kontrollgruppe bzw. in der Testgruppe verwendet. Das Polysaccharid wurde einmal in der physikalisch maximalen Dosis von 15 g/kg an die Testgruppe verabreicht und an die Kontrollgruppe wurde nur eine Salzlösung verabreicht. Keine Ratte starb. Die Zunahme des Gewichts der Testgruppe war gleich derjenigen der Kontrollgruppe. Außerdem wurde sowohl in bezug auf das Aussehen als auch in bezug auf die Nekropsie keine Abnormität festgestellt. Es wird daher angenommen, daß die LD₅₀ der erfindungsgemäßen Substanz größer als 15 g/kg ist und daß die Substanz keine akute Toxizität aufweist.

Erfindungsgemäß kann das Polysaccharid, das, wie vorstehend beschrieben, eine verbesserte Antitumor-, Immunomodulierungs- und Wirts-Abwehraktivität gegenüber Infektionserkrankungen aufweist, in großer Menge hergestellt werden, wie die später unten beschriebenen Beispiele zeigen werden, durch eine Kombination von verhältnismäßig einfachen Verfahrensmaßnahmen. Die vorliegende Erfindung hat daher einen sehr hohen praktischen Wert auf dem Gebiet der kommerziellen Herstellung eines Polysaccharids aus Reiskleie mit ausgezeichneten biologischen Aktivitäten.

Da das erfindungsgemäße Polysaccharid außerdem, wie festgestellt wurde, eine Interferon induzierende Fähigkeit hat, ist anzunehmen, daß sie einen Verhinderungs- oder Behandlungseffekt gegenüber Viruserkrankungen, wie z. B. Herpes und Influenza, hat.

Da das Polysaccharid sowohl oral als auch nicht-oral verabreicht werden kann, stellt es ein sehr wertvolles Antitumor-, Immunomodulierungs- oder Infektionserkrankungen- Verhinderungs- oder -Behandlungsmittel dar.

In der praktischen Form eines Arzneimittels kann das Polysaccharid einzeln oder in Kombination mit Adjuvantien (wie z. B. Wasser, einer Salzlösung, Polyethylenglykol, Glycerogelatine, Stärke, Dextrin, Lactose in Form beispielsweise eines flüssigen Arzneimittels, in Form von Pellets, Tabletten, eines Pulvers und Suppositorien, formuliert werden.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

125 l Leitungswasser wurden zu 25 kg handelsüblicher Reiskleie zugegeben, die von Reisbruchstücken durch Passieren durch ein Sieb abgetrennt worden war. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 120°C und 5 Stunden lang bei 100°C unter konstantem Rühren extrahiert.

Dann wurde die Mischung filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf 40 l eingeengt. Das auf diese Weise eingeengte Filtrat wurde mit Natriumhydroxid auf pH 6,7 eingestellt und danach wurden 500 mg einer handelsüblichen α-Amylase zugegeben und es wurde eine Enzymbehandlung eine Stunde lang bei 70°C durchgeführt. Nach der Enzymbehandlung wurde das Enzym durch Erhitzen bis auf 100°C inaktiviert und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Bis zur Endkonzentration von 30 Vol./Vol.-% wurde Ethanol zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt. Dieser Niederschlag wurde in Wasser wieder aufgelöst, um die unlöslichen Bestandteile zu entfernen. Der lösliche Teil wurde lyophilisiert und man erhielt 508 g eines hellgelben Pulvers. 4 g dieses Pulvers wurden in mit einem Ionenaustauscher behandeltem Wasser wieder aufgelöst und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Der lösliche Teil wurde einer Gelfiltration unter Verwendung von Sepharose CL-6B® unterworfen und die in das Leervolumen eluierten Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1 g eines weißen Pulvers enthielt. Dieses weiße Pulver wurde in 100 ml mit Ionenaustauscher behandeltem Wasser wieder aufgelöst und zusammen mit 20 ml Chloroform und 4 ml n-Butanol in einen Scheidetrichter gegeben. Die Mischung wurde 60 min lang geschüttelt und dann bei einer niedrigen Geschwindigkeit zentrifugiert, wobei eine weiße Schicht von denaturiertem Protein zwischen einer Wasserschicht und einer Chloroformschicht gebildet wurde. Der Wasserschichtanteil wurde aus dem Scheidetrichter entnommen. Es wurde eine Chloroform/- n-Butanol-Mischung in dem gleichen Verhältnis wie oben zugegeben und die resultierende Mischung wurde geschüttelt. Diese Operation wurde etwa 30mal wiederholt, bis keine weiße Schicht des denaturierten Proteins mehr auftrat. Der Wasserschichtanteil wurde lyophilisiert, wobei man 800 mg eines weißen deproteinisierten Pulvers erhielt.

Beispiel 2

25 kg handelsübliche Reiskleie wurden durch Erhitzen unter Rückfluß mit 100 l Hexan entfettet und dann getrocknet. Die entfettete Reiskleie wurde dann auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man 450 g eines hellgelben Pulvers erhielt. 4 g dieses Pulvers wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man 750 mg eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 3

3 kg handelsübliche entfettete Reiskleie wurden mit 20 l Wasser gemischt und die Mischung wurde dann 2 Stunden lang unter konstantem Rühren bei 120°C extrahiert. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck eingeengt, wobei man 5 l einer konzentrierten Lösung erhielt. Dann wurden 0,3 g einer α-Amylase zu der Lösung zugegeben und diese wurde 5 Stunden lang bei 60°C gehalten. Danach wurde die Mischung auf 100°C erhitzt und zentrifugiert, wobei man 4,9 l einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Zu der Endkonzentration von 40 Vol.-/Vol.-% wurde Ethanol zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt und dann lyophilisiert, wobei man 88 g eines hellgelben-braunen Pulvers erhielt. 4 g dieses Pulvers wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 behandelt, wobei man 720 mg eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 4

20 kg handelsübliche Reiskleie wurden durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,60 mm passiert, um Verunreinigungen, wie z. B. Reisbruchstücke, zu entfernen, und dann wurden sie mit 100 ml Wasser, das mit einem Ionenaustauscher behandelt worden war, gewaschen. Danach wurden 50 l destilliertes Wasser zu der gewaschenen Reiskleie zugegeben und die Mischung wurde 3 Stunden lang unter konstantem Rühren bei 110°C extrahiert. Die Mischung wurde filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und zentrifugiert, wobei man 10 l einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Dann wurden 250 mg einer α-Amylase zugegeben und 24 Stunden lang bei 65°C gehalten. Die Mischung wurde auf 100°C erhitzt. Dann wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 30 Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt. Dieser Niederschlag wurde in 3 l Wasser aufgelöst und die unlöslichen Anteile wurden entfernt und erneut auf 1 l eingeengt und zentrifugiert, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhielt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde 2 Tage lang in fließendem Wasser dialysiert und zentrifugiert, wobei man 1 l einer überstehenden Flüssigkeit erhielt. Eine Mischung von 200 ml Chloroform und 40 ml n-Butanol wurde zu 1 l der überstehenden Flüssigkeit zugegeben. Danach wurden eine Deproteinisierung und eine Lyophilisierung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man 402 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 5

1 l einer überstehenden Flüssigkeit, wie sie durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 1 erhalten worden war, wurden unter Verwendung von CM Sepharose®, einem Kationenaustauschergel, und DEAE Sepharose®, einem Anionenaustauschergel, einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen. Die nicht adsorbierten Fraktionen wurden gesammelt und auf 1 l eingeengt. Danach wurden eine Deproteinisierung und eine Lyophilisierung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei man 358 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 6

10 g Aktivkohle wurden zu 1 l einer überstehenden Flüssigkeit zugegeben, die durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 1 erhalten worden war. Nach 30 min wurde die Mischung zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 4 unterworfen, wobei man 365 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 7

Eine 20 ml-Portion von 1 l einer überstehenden Flüssigkeit, wie sie durch Dialyse und Zentrifugieren in Beispiel 4 erhalten worden war, wurde unter Verwendung von Sepharose CL-6B® einer Gelfiltration unterworfen und die Lehrvolumen- Fraktionen wurden gesammelt zur Auffüllung auf 100 ml. Diese Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 1 unterworfen, wobei man 70 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 8

Der durch die Ethanol-Ausfällung nach einer α-Amylasebehandlung in Beispiel 1 erhaltene Niederschlag wurde in 10 l Wasser wieder aufgelöst. Die Lösung wurde einer Ultrafiltration unterworfen, um den niedermolekularen Teil mit einem Molekulargewicht von weniger als 80 000 zu entfernen, und auch um eine Einengung auf 3 l zu erzielen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt, wobei man 2,8 l überstehende Flüssigkeit erhielt. Diese überstehende Flüssigkeit wurde der gleichen Deproteinisierungs- und Lyophilisierungsbehandlung wie in Beispiel 1 unterworfen, wobei man 400 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 9

Der Lösung, die der α-Amylasebehandlung und der anschließenden Inaktivierung des Enzyms bei 100°C für 1 Stunde in Beispiel 1 unterworfen worden war, wurde Aceton bis auf eine Endkonzentration von 40 Vol./Vol.-% zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde in 10 l Wasser gelöst. Danach wurde das gleiche Verfahren einschließlich der Behandlung unter Verwendung eines Ultrafilters wie in Beispiel 8 angewendet, wobei man 412 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 10

Der Lösung, die der α-Amylasebehandlung und der anschließenden Inaktivierung des Enzyms bei 100°C für 1 Stunde in Beispiel 1 unterworfen worden war, wurde Ammoniumsulfat bis zu einem Grad der Sättigung von 70% zugesetzt, um eine Aussalzung zu erzielen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 3 l Wasser gelöst und gegen fließendes Wasser 2 Tage lang dialysiert. Der Lösung wurde Trichloressigsäure bis zu einer Konzentration von 7% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde erneut gegen fließendes Wasser 2 Tage lang dialysiert. Das dabei erhaltene Dialysat wurde lyophilisiert, wobei man 503 g eines hellgelben Pulvers enthielt. 4 g des Pulvers wurden in Wasser, das mit einem Ionenaustauscher behandelt worden war, gelöst und über eine Sepharose CL-6B-Säule laufen gelassen. Die Leervolumenfraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 1,5 g eines weißen Pulvers enthielt.

Beispiel 11

Die der α-Amylasebehandlung in Beispiel 1 unterworfene Lösung wurde auf 40°C abgekühlt und dann wurden 600 mg einer handelsüblichen Proteinase (Pronase E) zugegeben und 24 Stunden lang reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang auf 100°C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 30 Vol./Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und dann in 10 l Wasser gelöst. Danach wurde das gleiche Verfahren einschließlich der Behandlung unter Verwendung eines Ultrafilters wie in Beispiel 8 angewendet, wobei man 413 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 12

Zu 3 l der überstehenden Flüssigkeit, die durch die Behandlung unter Verwendung eines Ultrafilters in Beispiel 8 erhalten worden war, wurde eine Mischung von Chloroform und n-Butanol in dem gleichen Verhältnis wie in Beispiel 1 zugegeben zur Durchführung einer Deproteinisierungsbehandlung. Ein wasserlöslicher Anteil wurde sprühgetrocknet, wobei man 420 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 13

Zu dem wasserlöslichen Anteil, wie er bei Anwendung der Deproteinisierungsbehandlung in Beispiel 12 erhalten worden war, wurde Ethanol bis auf die Endkonzentration von 40 Vol./Vol.-% zugegeben. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, gewaschen und 3mal mit Ethanol entwässert und dann im Vakuum getrocknet, wobei man 405 g eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 14

Zu 2 g eines weißen Pulvers, wie es in Beispiel 5 erhalten worden war, wurden 100 ml einer Mischung von 2% Schwefelsäure und Ameisensäure zugegeben und 4 Stunden lang bei 60°C gehalten, um es zu hydrolysieren. Die Lösung wurde durch Zugabe von Bariumcarbonat neutralisiert und zentrifugiert und es wurde eine überstehende Flüssigkeit erhalten.

Eine Hälfte des Volumens der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Sepharose CL-2B® aufgegeben und die Fraktion F₁ (Molekulargewicht <20 000 000), die in das Leervolumen eluiert wurde, und die Fraktion F₂ (Molekulargewicht etwa 1 000 000) wurden gesammelt. Eine weitere Hälfte des Volumens der überstehenden Flüssigkeit wurde auf Sephadex G-200® aufgegeben und die Fraktion F₃ (Molekulargewicht etwa 100 000) und die Fraktion F₄ (Molekulargewicht etwa 10 000) wurden gesammelt. Durch Lyophilisieren jeder Lösung erhielt man weiße Pulver: F₁: 412 mg, F₂: 248 mg, F₃: 295 mg und F₄: 263 mg.

Die biologischen Aktivitäten jeder Fraktion wurden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens getestet. Alle vier Fraktionen zeigten ebenso starke Aktivitäten wie das Polysaccharid vor der Hydrolyse. Die Ergebnisse sind nachstehend im Detail wiedergegeben.

1) Antitumoraktivitäten

Die Aktivitäten gegenüber einem syngenetischen Tumor, Meth-A, bei oraler Verabreichung sind in der Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

2) Immunomodulierungsaktivitäten a) Kohlenstoff-Entfernungs-Test (CCT)

Die Aktivitäten unter Verwendung von Tumor-tragenden Mäusen sind in der folgenden Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII

b) Plaque-Bildungs-Zellen-Test (PFC)

Die Aktivitäten bei Verwendung von normalen Mäusen, die am 4. Tage durch rote Schafs-Blutkörperchen sensibilisiert wurden, sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VIII

c) Hypersensibilisierungsreaktion vom verzögerten Typ (DHR)

Die Aktivitäten bei Verwendung von Tumor-tragenden Mäusen sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.

Tabelle IX

3) Wirts-Abwehr-Aktivitäten gegen Infektionserkrankungen

Die Aktivitäten bei subkutaner Verabreichung einen Tag vor der Infektion sind in der folgenden Tabelle X angegeben.

Tabelle X

Claims (5)

1. Polysaccharid, das aus Reiskleie beliebiger Herkunft durch Extraktion und Reinigung erhältlich ist, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Polysaccharid handelt, das

• a) Glucose als einzige Zuckerkomponente enthält und α-1,6-Glucosid-Bindungen in einer Hauptkette sowie ferner α-1,4-Glucosid-Bindungen aufweist und
• b) die folgenden Eigenschaften besitzt:
  • - es passiert eine Dialysemembran nicht,
  • - es ist in Alkohol, Aceton, Hexan, Benzol, Ethylacetat, Dimethylsulfoxid, Ligroin, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform und Äther unlöslich und in Wasser löslich,
  • - seine 1%ige wäßrige Lösung ist neutral,
  • - es enthält nicht mehr als 5% Mineralien,
  • - es reagiert positiv in den Molisch-, Anthron-Schwefelsäure-, Tryptophan-Schwefelsäure-, Cystein-Schwefelsäure-, Chromotrop-Schwefelsäure-, Phenol-Schwefelsäure- und Carbazol-Schwefelsäure-Reaktionen und
  • - es reagiert negativ in den Biuret-, Ninhydrin-, Lowry- Folin-, Elson-Morgan- und Stärke-Jod-Reaktionen,
  • - es weist charakteristische Ultraviolett-Absorptions-, Infrarot-Absorptions- und ¹³C-NMR-Spektren gemäß Fig. 1 bis 3 auf.

2. Verfahren zur Herstellung des Polysaccharids gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in jeweils an sich bekannter Weise
das Polysaccharid aus Reiskleie beliebiger Herkunft mit heißem Wasser extrahiert,
durch Zugabe eines polaren organischen Lösungsmittels oder eines Aussalzungsmittels zu dem wäßrigen Extrakt Niederschläge ausfällt, die das Polysaccharid enthalten,
die Niederschläge isoliert und
die Niederschläge einer Deproteinisierungsbehandlung unterwirft.

3. Antitumormittel, enthaltend das Polysaccharid gemäß Anspruch 1.

4. Immunomodulierungsmittel, enthaltend das Polysaccharid gemäß Anspruch 1.

5. Wirts-Abwehrmittel gegen Infektionserkrankungen, enthaltend das Polysaccharid gemäß Anspruch 1.