DK150497B - Fremgangsmaade til fremstilling af vandoplaeselige glycoproteiner med betaendelseshaemmende og immunostimulerende virkning - Google Patents

Description

i 150497

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte vandopløselige glycoproteiner som nærmere angivet i krav l's indledning.

Fra fransk patentskrift 2.043.475 og det tilsvarende 5 USA patentskrift nr. 3.855.197 kendes langsomme ot- og glycoproteiner opnået ved, at lysater af mikroorganismer af slægterne Pneumococcus, Micrococcus, Streptococcus Neisseria, Staphylococcus, Klebsiella eller Haemophilus underkastes de-lipidering og deproteinering efterfulgt af fældning af de 10 tilstedeværende glycoproteiner ved tilsætning af et oxygen-holdigt organisk opløsningsmiddel, der er blandbart med vand, og rensning af de udvundne glycoproteiner.

Disse kendte glycoproteiner indeholder 10% biuretogene stoffer. Biuretreaktionen giver en farvning, som er propor-15 tional med mængden af peptider og proteiner. Desuden er disse glycoproteiner karakteriseret ved et forhold mellem hexoserne og proteinstofferne på 7:1.

Disse kendte glycoproteiner har en immuniserende effekt og en vis betændelseshæmmende virkning.

20 Det har nu vist sig, at man opnår hidtil ukendte vand opløselige clycoproteiner med, som det vil fremgå af eksemplerne, bemærkelsesværdige betændelseshæmmende og immunosti-mulerende egenskaber og med en god tolerance ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i krav 25 l's kendetegnende del anførte.

Glycoproteinerne opnået ifølge den foreliggende opfindelse indeholder 40-50% biuretogene stoffer. Følgelig ligger forholdet mellem hexoserne og proteinstofferne allerhøjst på 2 for glycoproteinerne fremstillet ved fremgangs-30 måden ifølge den foreliggende opfindelse.

2 150497

Den tilsyneladende molekylvægt er molekylvægten bestemt ved hjælp af en porøs gel, som er standardiseret ved hjælp af kendte makromolekylære opløsninger. Blandt de standardiserede porøse geler, som tjener til bestemmelse af molekylvægten, 5 skal nævnes de geler, som går i handelen under betegnelsen "Sepharose" (indregistreret varemærke) og navnlig "Sepharose 6B".

Fordelagtige udførelsesformer er angivet i krav 2a og b og i krav 3. Ved det i krav 2b anførte opnår man at eliminere 10 lipiderne og pigmenterne. Den bør udføres under kraftig omrøring af lysatet med det eller de organiske opløsningsmidler i flere timer.

De kalibrerede porøse membraner med en tærskel for tilbageholdelse af stoffer med molekylvægt på eller over 300.000 15 kan med fordel udgøres af de membraner, som går i handelen under betegnelsen X M 300 fra Romicon og Amicon (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts 0 2713, USA).

De kalibrerede porøse membraner med en tærskel for tilbageholdelse af stoffer med molekylvægt på eller over 300.000 20 kan foreligge i form af hule fibre. Blandt disse skal især nævnes de hule fibre, som sælges under betegnelsen HIP 100 fra firmaet Amicon.

De ved fremgangsmåden ifølge oprindelsen fremstillede glycoproteiner er svagt beigefarvede, lugtfrie, neutrale og 25 vandopløselige indtil en koncentration på 25 mg/ml. De er derimod uopløselige i sådanne opløsningsmidler som ethanol, methanol, acetone, ether eller benzen.

Ved chromatografi på "Sepharose 6. B" konstaterer man, at molekylvægten af de opnåede produkter er over 1 million.

30 150497 3 TJ.V. absorptionsspektret viser en absorption ved de korte bølgelængder (maksimum ved ca, 215 ιημ), som er karakteristisk for peptidbindingen, og en svagere absorption ved ca. 260 ι&μ, som er karakteristisk for nucleinsyrerne og proteinerne.

5 I.R, absorptionsspektret bekræfter produkternes partielt peptidiske karakter.

Reaktionerne til karakterisering af sukker (orzinol- og carbazolreaktion) er positive.

Reaktionerne til karakterisering af peptidbindinger (biuret-10 reaktion, Lowry’s reaktion og ninbydrinreaktion) er ligeledes positive.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede glyco-proteiner er ikke dialyserbare, de er farmakologisk stabile i varmen (1 time ved 105°C) og ved ekstreme pH-værdier (pH 5 og pH 10 i 15 15 timer ved 4°C), og de modstår indvirkningen af et proteolytisk enzym såsom pronase (24 timer ved 37°C).

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produkter har meget interessante farmakologiske egenskaber. De har navnlig en bemærkelsesværdig betændelseshæmmende og immunostimule-20 rende effekt samt en meget god tolerance.

Disse egenskaber er illustreret nedenfor i den eksperimentelle del.

Disse egenskaber retfærdiggør anvendelsen af de omhandlede glycoproteiner som medikamenter.

25 De omhandlede medikamenter finder f.eks. anvendelse i behand lingen af betændelse af huden og slimhinderne og som kløemodvirkende middel, i dermatologien, i otorhinolaryngologien, i oftalmologi-en, i proctologien eller i gynækologien samt ved behandlingen af kroniske eller akutte tarminfektioner såsom colibacillose, ved be-30 handlingen af levnedsmiddelinfektioner med Salmonella og entero-toksiske stafylokokker, ved behandlingen af dysenterisyndrom af mikrobiel oprindelse såsom shigellose, ved behandlingen af digestiv candidose og ved behandlingen af urinære infektioner me<$ Proteus og Pseudomonas.

35 Den normale dosis, som varierer efter det benyttede produkt, den. behandlede patient og den pågældende lidelse, kan f.eks. være 4 150497 fra 0,5 mg til 20 mg om dagen ad oral vej hos mennesker.

De hidtil ukendte glycoproteiner kan anvendes til fremstilling af farmaceutiske præparater,.der indeholder disse glycoproteiner som aktiv bestanddel.

5 Som medikamenter kan glycoproteinerne indgives ad fordøjel sesvejen eller parenteralt eller lokalt.

De tilsvarende farmaceutiske præparater kan f.eks. være faste eller flydende og foreligge i de i den humane medicin gængs benyttede farmaceutiske former såsom f.eks. uoversukrede eller over-10 sukrede tabletter, gelatinekapsler, granulater, opløsninger, sirup, stikpiller, injektionspræparater, ovuler, creme, pomade, lotioner, dråber, øjendråber. De fremstilles efter de gængse metoder. Den eller de aktive bestanddele kan inkorporeres deri sammen med de i farmaceutiske præparater normalt benyttede tilsætningsstoffer såsom 15 talkum, gummi arabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, kakaosmør, vandige eller ikke-vandige bærestoffer, fedtstoffer af animalsk eller vegetabilsk oprindelse, paraffinderivater, glycoler og diverse fugte-, dispergerings- eller emulgeringsmidler samt konserveringsmidler.

20 Nedenstående eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge op findelsen.

5 150497

Eksempel 1«

Trin A: Dyrkning.

Man fremstiller et dyrkningsmilieu efter følgende recepts - kødekstrakt 690 g 5 - natriumchlorid 690 g - caseinpepton 690 g - gærautolysat 690 g - d ikaliumphos phat 483 g - monokaliumphosphat 207 g 10 - glucose 4.104 g - s o j apapainpe pt on 2.760 g - destilleret vand ad 138 liter

Man fremstiller dyrkningsmilieuet, idet man successivt blander kødekstrakt, natriumchlorid, caseinpepton, gærautolysat, di-15 kaliumphosphat og monokaliumphosphat i ca, 20 liter destilleret vand. Man indstiller pH-værdien på ca. 7»

Man steriliserer milieuet ved 120°C i 40 minutter. Opløsningerne af glucose og s o ;j apapainpe pt on indføres i dyrkningsmilieuet på tidspunktet for podningen efter forudgående sterilisering.

20 Stammen af Hafnia (Pasteur-instituttet nr. 5.731), der er dyrket på gelosemilieu, podes i 50 ml dyrkningsmilieu. Denne opløsning, der tjener som podemateriale, indføres i resten af dyrknings-bouillonen. Man indstiller det totale rumfang af dyrkningsmilieuet på 138 liter ved tilsætning af sterilt destilleret vand.

25 Dyrkningsmilieuet holdes ved 37°C, og pH-værdien indstil les automatisk på 7 ved tilsætning af en ammoniakopløsning eller ved tilsætning af saltsyre.

Væksten af kimene vurderes ved hjælp af fotometer· Antallet af kim beregnes i afhængighed af den optiske tæthed, som bestemmes 30 ved sammenligning med en standardkurye.

Efter fuldstændig udvikling, dvs. efter ea. 7 timers forløb, indeholder milieuet ca. 1 milliard kim pr. ml.

Trin Bi Dyse.

Til 138 liter dyrkningsbouillon fremstillet i trin A oven-35 for sætter man en vandig opløsning af hydrochlorid af lysozym (steriliseret ved filtrering på milliporemembran 0,22 μ) til opnåelse af en slutkoncentration på 160 γ hydrochlorid af lysozym pr. ml dyrkningsmilieu.

Man lader henstå i kontakt i 1 time ved 56°C i nærværelse 40 af 0,25 g EDTA pr. liter bouillon, 862,5 mg natriummercurothiolat 6 150497 og 80 g polysorbat ("Tween 80", indregistreret varemærke) pr, liter cl yrkningsbouillon.

Man fortsætter lysen i 7 dage ved 37°C under sterile betingelser, 5 Man får lysatet, homogeniserer ved omrøring og lyofiliserer.

Der fås 7900 g af et brunt pulver.

Trin C: Behandling, a) Med acetohe.

Alt det i trin B ovenfor opnåede pulver suspenderes i 138 10 liter kold acetone, hvorpå man omrører kraftigt i 3 timer ved 3500 omdrejninger pr, minut.

Efter 3 timers forløb filtreres suspensionen på sintret glas. Der fås et gult pulver, som man hurtigt suger fra.

15 b) Med methanol.

Det ovenfor opnåede pulver (7295 g) suspenderes i 138 liter koldt methanol og omrøres kraftigt i 3 timer ved 1500 omdrejninger pr, minut.

Efter 3 timers forløb dekanteres den opnåede suspension, den 20 største del af den overliggende væske fjernes med hævert, og resten af opløsningen filtreres på sintret glas.

Det frasugede pulver tørres ved stuetemperatur under vakuum i 24 timer. Der fås da 3988 g af et lyst beigefarvet pulver.

Trin D: Diafiltrering.

25 I 6 x 10 liter destilleret vand indeholdende 1 g/liter mer- v - thiolat opløser man 6 x 600 g pulver opnået i trin C ovenfor.

Man holder opløsningen under omrøring ved 4°C i 24 timer og centrifugerer i 2 timer ved 4000 omdrejninger pr. minut og derefter ved 90.000 G i en kontinuerlig ultracentrifuge med en afgi-30 velse på 6 liter pr. time.

Man samler opløsningen, som man kompletterer til 10 liter med destilleret vand, der er filtreret på milliporemembran 0,22 μ. Man indfører den opnåede opløsning i et diafiltreringsapparat med porøse membraner, hvis tærskel for tilbageholdelse er på 300.000 35 og den tilsyneladende diameter af porerne ca. 2 λ (membraner fra Amicon eller Bomicon med betegnelsen XM 300).

I apparatet lader man cirkulere 50 rumfang destilleret vand eller et rumfang på 500 liter.

Varigheden af operationen er ca, 48 timer.

40 Den diafiltrerede opløsning samles og centrifugeres konti- 7 150497 nuerligt ved 90.000 0 med en afgivelse på 6 liter pr, time.

Der fås 9*5 liter af en opløsning, som man lyofiliserer.

Der fås endelig 105 g glycoproteiner i form af et hvidbeige vatagtigt og meget hygroskopisk pulver.

5 Analyse: tø 37,9 tø 6 tø 7,5 Indhold af: 10 - vand 9 - phosphor 0,01 - chlor 0 $> - proteiner - biuret 51 # - sukker - orcinol 29 # (neutrale hexoser) 15 - carbazol 1,5 # (uronsyrer) U.V.spektrums Et maksimum ved 216 ηιμ et maksimum ved 258 mp I.E.spektrum: Bekræfter den delvis peptidiske karakter af produkterne* 20 Hydrolyse med 6 N saltsyre ved 110°C i 24 timer af de oven for opnåede glycoproteiner efterfulgt af en ehromatografi på celluloseplade med et af følgende systemer af opløsningsmidler: n-butanol : eddikesyre : vand (60:30:30), isopropanol : ammoniak (2/3:1/3) eller methanol : pyridin : eddikesyre : vand (18:50:4:28) viser fra-25 været af diaminopimelinsyre i disse hydrolysater. Dette fravær af diaminopimelinsyre i hydrolysaterne viser den ikke-membranære oprindelse af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede glycoproteiner.

Undersøgelse af kurven for optisk tæthed ved 280 ιημ af elua-30 tet fra ehromatografi på "Sepharose 6 Bn af de i eksempel 1 opnåede glycoproteiner i afhængighed af Ve/Yo viser, at disse har en molekylvægt over 1 million.

(Vo svarer til et elueringsrumfang af et dextran med molekylvægt over 1 million, som helt udelukkes på "Sepharose 6 B", hvis 35. molekylvægtudelukkelsesgrænse er på 1 million.

Ve svarer til elueringsrumfanget for de opnåede Hafnia-gly-ooproteiner.) 40 8 150497

Eksempel 2.

Trin A og B:

Idet man arbejder som i trin A og Bi eksempel 1^ fremstiller man 90 liter lysat, som man lyofiliserer.

5 Der fås 4570 g af et brungult pulver.

Trin Ci Behandling.

a) Med acetone.

Man ekstraherer det ovenfor opnåede pulver ved hjælp af 90 liter kold acetone som angivet i trin C a) i eksempel 1.

10 b) Med methanol.

Man ekstraherer det ovenfor opnåede produkt ved hjælp af 90 liter koldt methanol som angivet i trin C b) i eksempel 1. Man tørrer i kulden under vakuum og får 1765 g af et beigefarvet polls ver'

Trin D: Diafiltrering.

Man suspenderer 600 g af det i trin C ovenfor opnåede pulver i 15 liter destilleret vand, omrører ved 4°C i 15 timer og centrifugerer opløsningen ved 4000 omdrejninger pr. minut i 2 timer 20 og derefter kontinuerligt ved 90.000 0 med en afgivelse på 6 liter pr. time.

Der fås 14 liter opløsning, som man indfører i et diafiltreringsapparat med porøse membraner, hvis tærskel for tilbageholdelse er 300,000, og hvis tilsyneladende porediameter er ca, 2 Å (membra-25 ner fra Amicon eller Romicon med betegnelsen XM 300). De 14 liter opløsning vaskes med 40 rumfang destilleret vand.

Varigheden af operationen er ca. 48 timer.

Den endelige opløsning centrifugeres ved 90.000 G· og lyofi- liseres.

30 Der fås 55,6 g af et hvidbeige vatagtigt og meget hygrosko pisk pulver.

Analyse: tø 40,3 B[fo 6 35 tø 8,3

Indhold af: - vand 10 $ - phosphor 0,025 $ - chlor 0 $> 40 - proteiner - biuret 41 i» - sukker - orcinol 26 $ (neutrale hexoser) 9 1 150497 U.V.spektrum: Maksima ved 215 og 257 *|i I.R.spektrum: Bekræfter den delvis peptidiske karakter af produkterne .

- Fravær af diaminopimelinsyre.

5 - Molekylvægt på "Sepharose 6 B" over 1 million*

Eksempel 3.

Man fremstiller tabletter efter recepten: - glycoproteiner fremstillet i eksempel 1 5 mg 10 - tilsætningsstof til opnåelse af 1 tablet på 200 mg (enkeltheder vedrørende tilsætningsstof: lactose, talkum, stivelse, magnesiumstearat)

Eksempel 4* 15 Man fremstiller en pomade efter recepten: - glycoproteiner fremstillet i eksempel 2 200 mg - tilsætningsstof ad 100 g

Farmakologisk undersøgelse* 20 a) Betændelseshæmmende virkning.

Den betændelseshæmmende virkning af produkterne undersøges på hanrotter ved teknikken med ødem i foden fremkaldt af carraghenin (Winter, Risley, Nuss) Proo* Soc. Exp. Biol. Med. 1961, 111, 544-7. Dyrene modtager i vristleddet på en bagpote 0,05 ml af en 25 l$'s suspension af carraghenin. Det undersøgte produkt indgives ad intraperitoneal vej i doser på 10 γ/kg og på 100 γ/kg 1 time før indsprøjtningen af carraghenin.

Rumfanget af den behandlede pote måles ved hjælp af et plethysmometer før samt 3 timer efter indsprøjtningen af carraghenin. 30 Resultaterne udtrykkes i procent aftagen af ødemet i forhold til kontroldyr.

De opnåede resultater fremgår af følgende tabel 1*

Tabel 1*

Procent formindskelse af ødem 35 Produkt 10 γ/kg 100 γ/kg

Ifølge eksempel 1 64# 79,5$ ifølge eksempel 2 . 59# 75 $ b) Undersøgelse af cellulær appel.

De i eksempel 1 fremstillede glycoproteiner indgives ad 40 intraperitoneal vej på hold af marsvin i doser på 50 og 100 γ/kg.

10 ' 150497

En tælling af de peritoneale celler foretages 48 timer efter indsprøjtningen af glycoproteinerne.

En sammenligning af denne optælling med en optælling foretaget på ubehandlede dyr viser, at der ikke er nogen cellulær appel.

5 c) Undersøgelse af tolerance.

Indgift ad subkutan vej på mus af de i eksempel 1 og 2 fremstillede glycoproteiner i doser på 250 γ/kg og 1000 γ/lcg i et rumfang på 0,2 ml fremkalder ikke nogen lokal eller generel intolerance .

10 Der konstateres ikke noget betændelsestegn i det subkutane væv.

d) Generel præventiv antibakteriel virkning.

Glycoproteinerne indgives i doser på 1000 γ/kg og 5000 γ/kg ad intraperitoneal vej på hold på 20 mus 6 dage og 48 timer før ind-15 sprøjtning ad samme vej af kim af en stamme af Klebsiella pneumoniae svarende til henholdsvis 100 og 500 gange den letale dosis 50, DI^q.

Dødeligheden iagttages i de 7 dage, som følger efter indsprøjtningen af kimene af Klebsiella pneumoniae, og sammenlignes med dødeligheden hos et hold kontroldyr, som har modtaget fysiolo-20 gisk serum i stedet for det undersøgte produkt.

Resultaterne udtrykt i procent beskyttelse af de behandlede dyr (for produkterne ifølge eksempel 1 og 2) fremgår af nedenstående tabel 2.

Tabel 2.

25 _Em_

Dosis i γ/kg PI»50 x 100 DL5Q x 500 1000 40 70 5000 40 20 e) Stimulering af det uspecifikke forsvar.

30

Denne stimulering undersøges ved prøven med clearance ved hjælp af kul på mus, idet man gør brug af teknikken ifølge Halpern (C.R. Soc. Biol. 148, 1954, 431).

Denne stimulering viser sig ved en forøgelse af den fagocytære aktivitet efter indsprøjtning af produktet ad intraperitoneal 35 __ * vej.

Glycoproteinerne ifølge eksempel 1 og 2 giver en forøgelse på henholdsvis 77,5# og 88# ved en dosis på 250 γ/kg og på 31# og 86# ved en dosis på 100 γ/kg i tiden 30 minutter.

f) Udvikling af vægten af milten.

40 To indsprøjtninger af intraperitoneal vej på mus med 48 ti- η 150497 mers mellemrum af glycoproteinerne ifølge eksempel 1 og 2 i doser på 100, 250 og 500 γ/kg forøger ikke på signifikant måde miltens vægt.

g) Akut toksicitet, bestemmelse af DL·^.

5 Den letale dosis 50, DI^-q, ad intraperitoneal vej på mus bestemmes efter metoden ifølge Behrens og KSrber.

Værdien er 50 mg/kg f0r de i eksempel 1 fremstillede glyco-proteiner.