DE19938767A1

DE19938767A1 - Spaltimpfstoffe

Info

Publication number: DE19938767A1
Application number: DE19938767A
Authority: DE
Inventors: Leopold Doehner; Dietmar Becher; Salah Salim
Original assignee: TAD Pharma GmbH
Current assignee: TAD Pharma GmbH
Priority date: 1999-08-16
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2019-08-17
Also published as: DE19938767C2

Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von Spaltimpfstoffen, bei dem die Lipidhülle von Viruspartikeln in Untereinheiten aufgespalten, von unerwünschten Bestandteilen befreit und dann als Impfstoff eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Spaltung die Lipidhülle eine Fettsäure R-COOH, deren Rest R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2-17 Kohlenstoffatomen ist, oder Salze davon verwendet werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Spaltimpfstoffen und die damit hergestellten Impfstoffe.

Als Spaltimpfstoffe oder Spaltvakzine bezeichnet man Impfstoffe, die statt des nativen Antigens dessen durch Spaltung gewonnene immunogene Untereinheiten enthalten. Virusspaltimpfstoffe werden aus der immunogenen Lipidhülle von mit einer Hüllmembran umgebenen Viren gewonnen. Zur Herstellung des Impfstoffes wird zuerst das Virus in einer geeigneten Zellkultur oder einem geeigneten Medium in an sich bekannter Weise gezüchtet. Die Viruspartikel werden dann durch Maßnahmen wie Zentrifugation mit Gradienten, Filtration und/oder Adsorption/Elution an geeigneten Adsorbentien aufkonzentriert und gereinigt. Anschließend wird die Hüllmembran aufgebrochen und die Bruchstücke werden gewonnen. Bei den bisher bekannten Verfahren erfolgte die Spaltung der Virus partikel bzw. der Hüllmembran durch oberflächenaktive Substanzen mit dem Ziel, die Reaktogenität der Impfstoffzubereitung zu vermindern. So ist ein Ver fahren bekannt, bei dem Tween 80® in Verbindung mit Ethylether verwendet wird. Die Verwendung von Ether wirft jedoch sicherheitstechnische Probleme bei der Produktion auf.

Weiterhin ist aus US-Patent Nummer 3 962 421 die Verwendung einer Kombi nation aus Tween 80® mit Tri-(n-butyl)-phosphat bekannt. Bekannt ist auch die Verwendung von Desoxycholsäure (DE OS 16 17 288, DD 21 144), von Cetylammoniumbromid (DE 25 00 785), Triton N 101® (DE 24 49 530), sowie Triton X100® (US PS 4 327 182, EP 0 041 880, EP 0 776 362, DE 30 14 189). Die Detergenzien müssen dazu in einer Konzentration von mindestens 0,5% verwendet werden. Gleichzeitig darf die Viruskonzentration nicht zu hoch sein, da sonst die Spaltung unvollständig erfolgt. Mehr als 1 mg/ml Viruskonzentration ist für diese Verfahren nicht geeignet.

All diese Verfahren haben den Nachteil, daß für eine Verwendung als Impfstoff die Detergenzien entfernt werden müssen und die Beseitigung der zur Viruspaltung eingesetzten Detergenzien mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden ist. Die Schwierigkeiten beruhen auf der sehr niedrigen kritischen Micellenkonzentration dieser Substanzen, die extreme Dialysebedingungen oder Fällungsoperationen für eine hinreichende Verminderung ihrer Konzentration erfordern. So liegt die kritische Micellenkonzentration für Triton X100 bei 0,24 mM, für Tween 20 bei 0,06 mM und für Tween 80 sogar bei nur 0,012 mM.

Die Erfinder haben sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Virusspaltimpfstoffe in einem einfachen, reproduzierbaren Verfahren hergestellt werden können, ohne daß aufwendige Reinigungsschritte zur Entfer nung von Detergenzien durchgeführt werden müssen.

Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren zur Herstellung von Spaltimpf stoffen, bei dem die Lipidhülle von Viruspartikeln in Untereinheiten aufgespalten, die Bruchstücke von unerwünschten Bestandteilen befreit und dann als Impfstoff eingesetzt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Spaltung der Lipidhülle eine Fettsäure R-COOH, deren Rest R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2-17 Kohlenstoff atomen ist, oder Salze davon verwendet werden.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Verwendung einer Fettsäure oder eines Fettsäuresalzes eine sehr effektive Aufspaltung der Lipidhülle bewirkt. Dabei werden sowohl die Hülle als auch das Capsid aufgebrochen. Durch die Aufspaltung werden sowohl Hämagglutinin als auch Neuraminidase freigesetzt und können in einfacher Weise ohne Anwendung extremer Bedingungen von den unerwünschten Bestandteilen, z. B. den Lipidbestandteilen abgetrennt werden. Durch die Behandlung erfolgt außerdem eine Ablösung der Capsomeren von der RNA oder DNA, so daß die dann schutzlos vorliegende Nucleinsäure von den ubiquitär vorhandenen RNasen bzw. DNasen schnell und weitgehend zerstört wird. Das Nucleoprotein der Capsomeren kann, soweit es nicht in aggregierter Form vorliegt, durch Filtration entfernt werden. Damit kann erfindungsgemäß Hämagglutinin und Neuraminidase in guter Ausbeute in einfacher Weise gewonnen werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Viruspartikel behandelt, die in an sich bekannter Weise, wie oben ausgeführt, gewonnen wurden. Das erfindungs gemäße Verfahren ist zur Herstellung von Impfstoffen von Viren, z. B. DNA- oder RNA-Viren, geeignet, die eine Hüllmembran aufweisen. Als Beispiele können Influenza- und Herpesviren genannt werden. Die Viren werden in an sich bekannter Weise gezüchtet. So erfolgt die Züchtung von Influenzaviren beispielsweise bevorzugt in der Allantoisflüssigkeit embryonierter Hühnereier.

Die Viruspartikel werden mit der Fettsäure oder mit dem Fettsäuresalz in Kontakt gebracht. Entweder wird eine Viruspartikelsuspension mit der erfindungsgemäß verwendeten Fettsäure oder dem Fettsäuresalz in Kontakt gebracht und dann eine Auftrennung der aufgebrochenen Lipidhülle bewirkt. Ebenso kann die Fett säure oder das Fettsäuresalz einer Viruspartikelsuspension zugegeben werden, während diese durch Zentrifugation mit einem Gradienten behandelt wird. Wich tig ist nur der Kontakt der Fettsäure oder des Fettsäuresalzes mit der Lipidhülle der Viruspartikel. Die Behandlung der Virussuspension sollte bei neutralen, leicht sauren oder leicht basischen pH-Werten stattfinden, da stark saure oder stark basische pH-Werte zu unerwünschten Nebenreaktionen führen können. Bevor zugt wird der pH-Wert in einem Bereich zwischen 6 und 8,5 eingestellt.

Wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung einer Fettsäure oder eines Fettsäuresalzes, um die Lipidhülle aufzuspalten. Als Fettsäure wird eine Säure der Formel R-COOH verwendet, deren Rest R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2 bis 17 Kohlenstoffatomen ist, oder ein Salz davon. Wesentlich ist, daß die Fettsäure auf die Lipidhülle einwirken kann. Als besonders geeignet haben sich Fettsäuren mit einer ungeraden, gesättigten Alkylgruppe erwiesen, wobei die Alkylgruppe besonders bevorzugt 3 bis 11 Kohlenstoffatome, insbesondere 5 bis 11 Kohlen stoffatome aufweist. Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden mit Carprylsäure oder einem Carprylsäuresalz erzielt.

Als Salze der Fettsäure kommen vor allem aufgrund ihrer Verfügbarkeit die Al kali- und Ammoniumsalze in Betracht, die außerdem auch leicht abzutrennen sind und physiologisch keine nachteiligen Wirkungen hervorrufen. Aufgrund seiner Verfügbarkeit und der physiologischen Eigenschaften ist das Natriumsalz besonders bevorzugt.

Um die Lipidhülle der Viruspartikel zu spalten wird die Fettsäure oder das Fett säuresalz in einem hierzu geeigneten Anteil eingesetzt. Als geeignet hat sich ein Anteil von 0,01 bis 1 M/l erwiesen. Bevorzugt wird die Fettsäure oder das Fettsäuresalz mit einem Anteil von 0,05 bis 0,3 M/l eingesetzt.

Damit das Verfahren wirtschaftlich durchgeführt werden kann, sollte die Konzen tration der Viruspartikelsuspension nicht zu gering sein. Andererseits sollte die Konzentration nicht zu hoch sein, um eine quantitative Reaktion zu gewährlei sten. Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik kann erfindungs gemäß eine Konzentration bis zu 6 mg/ml eingesetzt werden, und trotzdem eine praktisch vollkommene Spaltung erreicht werden. Bevorzugt wird eine Viruspartikelsuspension eingesetzt, die 0,2 bis 6 mg/ml an Viruspartikeln enthält.

Die Spaltung der Membranhülle erfolgt bevorzugt bei Temperaturen in einem Bereich von 4° bis 30°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur, d. h. bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 25°C. Die Fettsäure oder das Fettsäure salz wird solange einwirken gelassen, bis Bruchstücke der Hüllmembran erhalten werden. Dies ist in der Regel nach 5 Minuten bis 12 Stunden, vorzugsweise nach 30 Minuten bis zu 2 Stunden der Fall.

Das erfindungsgemäße Verfahren kommt völlig ohne die Verwendung der im Stand der Technik verwendeten Detergenzien aus. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird jedoch der Viruspartikelsuspension während oder nach der Auf spaltung mit einer Fettsäure oder einem Fettsäuresalz eine geringe Menge eines Detergenz zugesetzt, um eine Reaggregation der Spaltprodukte zu verhindern. Für diesen Zweck ist eine Menge von weniger als 0,3 Gew.-% eines Detergen zes ausreichend. Als Detergenzien geeignet sind z. B. Triton X100, Triton N101, Tween 80 oder Tween 20.

Zur Herstellung der Virusspaltimpfstoffe wird in einer bevorzugten Ausführungs form eine in an sich bekannter Weise gereinigte Viruspartikelsuspension mit Fettsäure oder einem Fettsäuresalz bis zu einer Konzentration von 0,3 M/l bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 versetzt, wobei eine sehr effektive Aufspaltung der Viren in ihre Untereinheiten erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Viruspartikelsuspen sion auf einen Saccharosegradienten zusammen mit einer Fettsäure oder einem Fettsäuresalz in einem Anteil von 0,3 M/l aufgegeben und in einem Zonalrotor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation können dann die Fraktionen, die die Ober flächenantigene des Virus enthalten, gesammelt werden. Dieses Verfahren kann bis zu einer Viruskonzentration von 10 mg/ml durchgeführt werden.

Bei beiden Varianten wird nach der Spaltung eine Aufreinigung des Präparates durchgeführt. Dazu wird die antigenhaltige Suspension durch Tangentialfiltration unter Verwendung von Membranen, die bevorzugt Proteinmoleküle mit einer Größe von 100 kD und mehr zurückhalten, gereinigt. Insbesondere sollen durch diese Filtration die Fettsäure oder das Fettsäuresalz und gegebenenfalls Detergenzien entfernt werden. Diese Tangentialfiltration (Diafiltration) erfolgt unter Durchsatz des 10 bis 20-fachen Volumens an PBS. Auf diese Weise können sehr reine Präparate von Hüllmembranbruchstücken erhalten werden, die daher auch wenig Nebenwirkungen erzeugen. Anschließend kann dann noch die Hämagglutininkonzentraion eingestellt werden und in der Regel schließt sich dann noch eine Endsterilfiltration durch Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm an.

Unter Umständen kann es erwünscht sein, daß in dem Spaltimpfstoffpräparat nicht nur Bruchstücke der Hüllmembran enthalten sind, sondern auch ein kleiner Anteil von gespaltenen Nucleoproteinen, um die T-Zell-Antwort weiter zu stimulieren. In dieser besonderen Ausführungsform wird die Tangentialfiltration bevorzugt unter Verwendung von Membranen durchgeführt, die Proteinmoleküle einer Größe von ≧ 50 kD zurückhalten.

Die erfindungsgemäß hergestellten Spaltimpfstoffe haben einen hohen Gehalt an Hämagglutinin und sind daher aufgrund ihrer hohen Immunogenität gut als Impf stoffe geeignet.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Ausführungsbeispiel 1

Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus A/Sydney VR 108 (H3N2) verwen det, das in 11 Tage vorbebrüteten embryonierten Hühnereiern während 72 Stunden bei 35°C angezüchtet worden war. Die Allantoisflüssigkeit wurde durch Filtration und Zentrifugation geklärt und anschließend durch Tangentialfiltration unter Verwendung einer Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 kD und größer zurückhält, 20-fach konzentriert. Anschließend erfolgte eine Virusreinigung im Saccharosegradienten (10-60%) im Zonalrotor. Die Fraktionen, die dem Viruspeak entsprachen, wurden einer Tangentialfiltration zur Reduktion der Saccharose unter 5% unterworfen und erneut über einen Saccharosegradienten im Zonalrotor gereinigt.

Die virushaltigen Hauptfraktionen, insgesamt 300 ml, wurden mit einer 4,8-fach konzentrierten Spaltlösung versetzt, so daß eine Endkonzentration von Octanoat von 0,3 M, von Triton X100 von 0,25% und von Tween 80 von 0,02% resul tierte. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei Zimmertemperatur wurde das Lysat durch Tiefenfilter mit einer Durchlaßfähigkeit von bis zu 0,65 µm fil triert und anschließend durch Tangentialfiltration über eine Membran, die Pro teinmoleküle der Größen von 100 kD und größer zurückhält, von unerwünschten Komponenten (Octanoat, Saccharose, Triton X100, Tween 80) soweit erforder lich befreit. Nach Einstellung des Antigengehaltes auf 100 µg Hämagglutinin pro ml, Formaldehydbehandlung (0,01%) und Sterilfiltration resultierte ein Monobulk. Die Ausbeute an Hämagglutinin betrug 42,6 mg aus 12 Liter Rohallantoisflüssig keit.

Ausführungsbeispiel 2

Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus B/Harbin/7/94 verwendet, das in 11 Tage vorbebrüteten embryonierten Hühnereiern während 72 Stunden bei 33°C angezüchtet worden war. Die Aufarbeitung erfolgte in der gleichen Weise wie in Ausführungsbeispiel 1.

Es resultierte ein Monobulk mit insgesamt 43,2 mg Hämagglutinin aus 12 Liter Rohallantoisflüssigkeit.

Ausführungsbeispiel 3

Als Ausgangsmaterial wurde Influenzavirus A/Sydney VR 108 (H3N2) verwen det, das in 11 Tage vorbebrüteten Hühnerembryonen während 72 Stunden bei 35°C angezüchtet worden war. Die Allantoisflüssigkeit wurde durch Filtration und Zentrifugation geklärt und anschließend durch Tangentialfiltration unter Verwendung einer Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 KD und größer zurückhält, 20-fach konzentriert. Anschließend erfolgte eine Virusreini gung im Saccharosegradienten (10-60%) im Zonalrotor. Die Fraktionen, die dem Viruspeak entsprachen, wurden einer Tangentialfiltration zur Reduktion der Saccharose unter 5% unterworfen und im Durchlaufverfahren auf einen 10- 60%-igen Saccharosegradienten Im Zonalrotor aufgetragen. Dieser enthielt im Bereich der 50%-igen bis 30%-igen Saccharosekonzentration eine Endkonzentra tion von Octanoat von 0,3 M, von Triton X100 von 0,25% und von Tween 80 von 0,02%. Nach Beendigung der Zentrifugation wurde der Gradient fraktioniert und die hämagglutininhaltigen Fraktionen wurden durch Tangentialfiltration über eine Membran, die Proteinmoleküle der Größen von 100 kD und größer zurück hält, von unerwüschten Komponenten (Octanoat, Saccharose, Triton X100, Tween 80) soweit erforderlich befreit. Nach Einstellung des Antigengehaltes auf 100 µg Hämagglutinin pro ml, Formaldehydbehandlung (0,01%) und Sterilfiltra tion resultierte ein Monobulk, Die Ausbeute an Hämagglutinin betrug 50,1 mg aus 12 Liter Rohallantoisflüssigkeit.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Spaltimpfstoffen, bei dem die Lipidhülle von Viruspartikeln in Untereinheiten aufgespalten, von unerwünschten Bestandteilen befreit und dann als Impfstoff eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Spaltung die Lipidhülle eine Fettsäure R- COOH, deren Rest R eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 2-17 Kohlenstoffatomen ist, oder Salze da von verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R der Fettsäure 3-11 Kohlenstoff atome aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure Caprylsäure ist.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure oder das Fettsäuresalz in ei nem Anteil von 0,05 bis 0,3 M pro Liter verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung bei einem pH-Wert von 6 bis 8,5 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Viruspartikel auf 0,2 bis 6 mg/ml eingestellt wird.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Detergenz verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergenz in einer Konzentration von ≦ 0,3 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtlösung, verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergenz Triton X100, Triton N101®, Tween 80© oder Tween 20° verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltung mit der Fettsäure oder dem Salz davon in einem Saccharosegradienten in einem Zonalrotor durchge führt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure oder deren Salz vorwiegend in den Zonen der Saccharosekonzentration auf 30 bis 50% vorhanden ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach Durchführung des Spaltens die Dis persion durch Filtration und/oder Diafiltration von unerwünschten Sub stanzen befreit wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß für die Filtration Filter mit einer Porengröße von 0,6 bis 0,3 µm verwendet werden und für die Diafiltration gegen das 10 bis 20-fache Volumen an PBS über Membranen mit einer Ausschluß grenze von ≦ 100 kD durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Diafiltration mit einer Membran mit einer Ausschlußgrenze ≦ 60 kD durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Virus Influenza-Virus verwendet wird.

16. Viraler Spaltimpfstoff, der mit einem Verfahren nach einem der Ansprü che 1 bis 15 erhalten wurde.