DE2500785A1 - Verfahren zur isolierung von haemagglutinin- und neuraminidasebestandteilen aus einem influenzavirus - Google Patents

Verfahren zur isolierung von haemagglutinin- und neuraminidasebestandteilen aus einem influenzavirus

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DE2500785A1 DE19752500785 DE2500785A DE2500785A1 DE 2500785 A1 DE2500785 A1 DE 2500785A1 DE 19752500785 DE19752500785 DE 19752500785 DE 2500785 A DE2500785 A DE 2500785A DE 2500785 A1 DE2500785 A1 DE 2500785A1
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Description

NACHGEREICHT
8AN0OZ-PATENT-GMBH Case 9O0-9102/A
0 Lörrach . .
Verfahren zur Isolierung von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus einem Influenzavirus
Die vorliegende Erfindung betrifft Influenzavakzine, insbesondere Influenza-Subunit-Vakzine,und deren Herstellung durch selektive Ablösung und Isolierung der inariunogenen Komponente eines Influenzavirus.
In Abbildung 1 befindet sich eine scheir.atische Darstellung eines influenzavirusteilchens„ Das crenetische Material Ribo-nucleinsäure (RMA) zusammen mit dein gruppenspezifischen Kucloprotein ist von einer doppelten Membran, umgeben, die aus einer inneren Proteinschicht und einer äusseren Schicht vom Wirt abst«irr.enden Lipidmaterials besteht. Zwei Giykopro-. "teine Kämagglutinin und Keuraminiäass erscheinen als Stachel auf der Oberfläche der Virusumhüllung.
Es ist bekannt, dass die zwei" Glycoproteine, Hänsggiutinin ur.c Keuraminidase, die wichtigsten Komponenten des- Influenzavirus sind, während alle anderen Komponenten, inbe-
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griffen andere Virusproteine, Nucleinsäuren und Lipide für die Entstehung einer Immunität nicht wesentlich sind. Die Anwesenheit dieses nicht wesentlichen Materials in einem Influenzavakzin kann jedoch zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. In jedem Fall v/erden durch die Anwesenheit des nicht wesentlichen Materials die Menge an Vakzin, das verabreicht werden kann, und dementsprechend auch die Stärke der Immunität, die erreicht werden kann, beschränkt.
Das ideale Influenzavakzin sollte deshalb aus den beiden essentiellen Immunogenen Hämagglutinin und Neuraminidase bei Abwesenheit oder bei substantieller Abwesenheit der nicht wesentlichen Komponenten des Virusteilchens bestehen. Vorhergehende Versuche, die Influenzaimmunοgene
abzuscheiden, bestanden darin, dass man zunächst versuchte das Virusteilchen vollständig zu spalten oder zu solubilisieren, beispielsweise mit Hilfe von anionischen Detergenzien, wie Natriumdesoxycholat oder Natriumdodecylsulfat. Hierbei werden alle oder die wesentlichsten Anteile der Viruskomponenten freigesetzt und gehen mit den Immunogenen in Lösung, üeberdies ist eine nachfolgende Reinigung oder teilweise Reinigung der erwünschten Immunogene notv/endig, die sehr viel Aufwand erfordert, und die erhaltenen Ausbeuten sind üblicherweise niedrig.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Hämagglutinin- und Neuraminidaseimmunogene durch selektive Solubilisierung dieser Komponenten, Wobei die übrigen subviralen Partikel, die-aus intakten Lipid/Proteinmembranen bestehen, die alle anderen nicht wesentlichen Anteile des Virus enthalten, zurückbleiben. Der unterschied in der Grosse und Dichte des. solubilisierten Immunogens und der zurückbleibenden subviralen Partikel erlaubt eine Abtrennung der Immunogene" mit Hilfe von üblichen Abtrennmethoden, die auf dem Unterschied in den physikalischen Eigenschaften beruhen.
Es wurde nunmehr gefunden, dass diese selektive Solubilisierung der Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten durch Behandlung des Influenzavirus mit einem kationischen Detergens erreicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Hänagglutinin- und Neuraminidasekcmponenten aus dem Influenzavirus durch Behandlung, des Influenzavirus in einem wässerigen Medium mit einem kationischen Detergens zwecks selektiver Solubilisierung dieser Komponenten und Abtrennung der so-erhaltenen solubilisierten Komponenten von den verbleibenden subviralen Partikeln.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann zweckmässlgerweise unter Verwendung von Influenzaviren der Typen A, Al, A2 oder B oder einem Gemisch von zwei oder mehreren
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dieser Viren durchgeführt werden. Der spezifisch verwendete Stamm hängt selbstverständlich von der er- ' wünschten Immunität und den zu isolierenden Immunogenen ab, doch können beispielsweise folgende Stämme erwähnt werden: Stamm A2/Aichi/68, MRC-2 ( Rekombinante der Typen A2/England/42/72), MRC-Il ( Rekombinante der Typen A2/ Port Chalmers/73), A/Pasteur/30C ("Mutagrip", Institut Pasteur) und B/Mass/67.
Der erfindungsgemäss verwendete Influenzavirusstamm wird zweckmässigerweise auf an sich bekannte Weise vermehrt, beispielsweise durch Ueberimpfen auf ein 11 Tage altes embryoniertes Hühnerei und durch Inkubation während einer geeigneten Zeit bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise während 2 Tagen bei 37° C. Die erhaltenen-Allantoisflüssigkeiten werden anschliessend vereinigt und das Virus durch Ultrazentrifugation und nachfolgende Resuspension in einer beispielsweise durch Phosphat gepufferten, physiologischen Kochsalzlösung oder durch Zentrifugation in einer Durchflusszonalzentrifuge unter Verwendung von beispielsweise eines Rohrzuckergradienten in einer durch Phosphate gepufferten physiologischen Kochsalzlösung unter nachfolgender Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes bis beispielsweise weniger als 5 %, zweckmässigerweise durch Dialyse gegen eine physiologische Kochsalzlösung oder durch Sephadex-Chromatographie oder Verdünnung konzentriert und gereinigt. Die Konzentration
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des Ausgangsvirus ist nicht kritisch und kann eingestellt werden abhängig von der erwünschten Menge (Gehalt) des Immunogens.
Der pH-Wert des Viruskonzentrats soll zweckmässigerweise von 6,5 bis 8,5 betragen, wofür Puffer, wie Phosphatpuffer, verwendet werden können, die vor der Zugabe des kationischen Detergens zugesetzt werden, und das Konzentrat kann ebenfalls, beispielsweise durch Zugabe von Formaldehyd inaktiviert werden. Danach wird das kationische Detergens zum Viruskonzentrat zweckmässigerweise in Form einer wässerigen Lösung zugefügt. Die benötigte Menge des kationischen Detergens, das zugefügt werden soll, hängt beispielsweise vom verwendeten Detergens ab. Im allgemeinen soll jedoch das verwendete kationische Detergens in solch einer Menge zugesetzt werden, dass das Gewichtsverhältnis von Detergens zum Protein in dem erhaltenen Gemisch von 1:2 bis 1:10, insbesondere von 1:3 bis 1:5 beträgt. Nach Zugabe des Detergens soll das Gemisch zweckmässigerweise stehen gelassen werden, beispielsweise während 30 Minuten bis 16 Stunden bei einer Temperatur von beispielsweise 4 bis 37° C. Höhere Temperaturen erfordern kürzere Zeiten. Vorzugsweise lässt man jedoch das Gemisch während 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur oder während der Nacht bei 4° C stehen.
Das erfindungsgemäss verwendbare kationische Detergens kann jedes kationische Detergens sein, das genügend
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- 6 - . 900-91C2 /A
aktiv ist, um die Hämagglutinin- und Neuraminidasekompo nenten zu solubilisieren, jedoch unter den Reaktionsbedingungen nicht genügend aktiv ist, um das ganze Virusteilchen zu zerstören.
Die erfindungsgemäss verwendbaren kationischen Detergenzien können aus einer bekannten Klasse von Verbindungen der Formel I
R{ R4
ausgewählt v;erden, worin R. für Alkyl oder Aryl, R , R und R- gleich oder verschieden sind, und jeweils Alkyl oder Aryl,oder R1 und R_ zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring, und R Alkyl oder Aryl bedeuten, oder R., R„ und R zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, bedeuten, und X für ein Anion steht.
Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind die Verbindungen der Formel Ia,
R. '
1X
CH
NX la
X3 V
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worin X obige Bedeutung besitzt, und R4 1 für Alkyl mit 8-22 Kohlenstoffatomen steht, und entweder R1' und R3 1 gleich oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder R1 1 für Methyl .steht, und" R* Benzyl bedeutet, insbesondere jedoch Verbindungen der Formel Iaa,
CH:
CH.
Iaa
R.'
worin R4 1 und X obige Bedeutung besitzen, oder der Formel lab,
CHi\@/CH3
lab
worin R4 1 und X obige Bedeutung besitzen.
Weitere bevorzugte Verbindungen der Formeln I sind die jenigen der Formel Ib, .
-R" 4
Ib
worin X obige Bedeutung besitzt, und R " für eine Alkylgruppe mit 12-18 Kohlenstoffatomen und R5 für Wasserstof: oder Methyl, vorzugsweise jedoch für Wasserstoff stehen.
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Unter den Alkylgruppen mit 8-22 Kohlenstoffatomen sind diejenigen mit 12-18 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Bevorzugte Alkylgruppen mit 12-18 Kohlenstoffatomen sind insbesondere die Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- und Stearylgruppen.
In den obigen Formeln bedeutet X vorzugsweise ein Chlorid-, Bromid-, Sulfat- oder Acetat-, insbesondere jedoch ein Chlorid- oder Bromidanion.
Die bevorzugten Verbindungen der Formel Iaa umfassen insbesondere Myristyltrimethylammonium-und Cetyltrimethylammo-■niumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders jedoch Bromide. Bevorzugte Verbindungen der Formel lab umfassen Stearyldimethylbenzylammoniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders jedoch Bromide. Die bevorzugten Verbindungen der Formel Ib umfassen Cety!pyridiniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders Bromide.
Andere kationische Detergenzien, die zweckmässigerweise verwendet werden können, sind Benzalkoniumchloride und -bromide beispielsweise Benzethon'iumchlorid oder Methylbenzethoniumchlorid oder auch solche Agenzien, wie Decamethoniumchlorid.
Das erfindungsgemäss bevorzugte kationische Detergens ist Cetyltrimethylammoniumbromid.
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Nach Beendigung des obigen Verfahrens können die Hämagglu- tinin- und Neuraminidasekomponenten von den zurückbleibenden intakten subviralen Partikeln auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Diese Abtrennung beruht auf der verschiedenen Grosse oder Dichte der zu trennenden Teilchen, und kann beispielsweise mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation unter Verwendung von Rohrzucker- oder Natriumglutamatmedien unter nachfolgender Fraktionierung der Gradienten durch Sedimentation durch Molekularsiebchromatographie oder durch Pelletation in einer Ultrazentrifuge durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäss hergestellte Gemisch von Immunogenen kann zweckitiässigerweise in Influenzavakzinen verwendet v/erden. Hierfür v/erden dieoben beschriebenen isolierten Hämagglutinin- und Neuraminidasekcmponenten zweckmässigerweise in einem üblichen Lösungsmittel resusperidiert, beispielsweise in einer physiologischen isotonischen Lösung, beispielsweise einer 0,9 %-igen Natriumchloridlösung, die gegebenenfalls beispielsweise mit einem Phosphatpuffer abgepuffert ist. Der Anteil des von der Reinigung des Ausgangsvirus oder von der Abtrennung der solubilisierten Komponente zurückbleibenden Rohrzuckers soll zweckmässigerweise auf weniger als 5 Gew.-% des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse herabgesetzt werden. Der Anteil des zurückbleibenden kationischen Detergens soll gleicherweise stark herabgesetzt werden, beispielsweise auf weniger als 0,01 % des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse oder Gelchromatographie.
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Falls erwünscht, können Konservierungsmittel oder Inaktivierungsmittel, wie Formaldehyd den Vakzinen in üblichen Mengen, beispielsweise in einem Gewichtsverhältnis von einem Teil zu 10.000 Teilen zugesetzt v/erden.
Die immunogene Wirkung der erfindungsgemässen Vakzine kann zweckmässigerweise verbessert werden durch Zugabe von üblichen immunologischen Zusätzen, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat in üblichen Mengen. Bevorzugt wird die Zugabe von 0,2 % Aluminiumhydroxid.
In einer Testreihe wurde der Schutz der Maus zu.verschiedenen Zeiten nach Immunisierung mit Influenza-Subunit-Vakzin und mit Influenza-Ganzvirus bei Belastung mit virulenten Influenza-Virus untersucht. Dieses Modell umfasst alle spezifischen und unspezifischen Abwehrmechanismen. Gruppen von je 30 Mäusen werden hierbei 0,25 ml Antigen/Maus i.p. appliziert, jeweils 3,4 und 8 Wochen danach wird ein Teil der Gruppe mit Hilfe eines Sprays infiziert und 9 Tage nach der Infektion der Schutz bewertet. Als Bewertungsbasis werden die Reduktion der Mortalität in % und die Reduktion der Lungenläsionen in % herangezogen. Der Test wird wiederholt mit verschiedenen Antigenanteilen in den Vakzinen. Die Resultate zeigen, dass die erfindungsgemässen Subunitvakzine eine längere Immunität gegen"die Virusinfektion zeigen, jedoch andererseits parallele Effekte zu den Ganzvirusvakzinen aufweisen.
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Für die obige Anwendung kann die zu verabreichende Dosis verschieden sein. Im allgemeinen bekommt man zufriedenstellende Resultate, wenn man die Vakzine in einer einzigen Dosis von 9 bis 43 internationalen Einheiten per kg Tiergewicht verabreicht. Für grössere Säugetiere ist eine Einheitsdosis von 600 bis 3000 internationalen Einheiten zu empfehlen.
Die Verabreichung erfolgt zweckrr.ässigerweise subcutan oder intramuskulär.
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Beispiel 1;
Influenzavirus vom Antigentyp X-31 ( Rekombinante des Stammes A„/Aichi/68) wird durch Inkubation in einem embryonierten Hühnerei bei 37° C während 2 Tagen vermehrt. Die Eier werden danach auf 4° C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen. Die erhaltenen infizierten Allantoisflüssigkeiten v/erden vereinigt. Das Virus wird anschliessend aus der Allantoisflüssigkeit durch Zentrifugation in der Durchflusszonalzentrifuge (Modell RK, Elektro-Nucleonics) unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten in einer durch Phosphat gepufferten Kochsalzlösung konzentriert und gereinigt. Das nach der Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes auf weniger als 5 % durch Dialyse gegen eine durch Phosphat gepufferte Kochsalzlösung in der Kälte erhaltene Viruskonzentrat hat einen
17
Häiuagglutinationstiter von 1:2 und einen Proteingehalt von 0,7 mg/ml. Zur Abspaltung der Immunogene wird die Virussuspension mit 1/50 ihres Volumens einer wässerigen Detergens- lösung (Cetyltrimethylammoniumbromid, 1 %-ige Lösung) versetzt. Nach 30 bis 60 Minuten (Zimmertemperatur) wird das Reaktionsgemisch durch Gradientenzentrifugation aufgearbeitet unter Verwendung eines vorgebildeten linearen Rohrzuckergradienten und nachfolgende Fraktionierung des Gradienten mit einer .peristaltischen Pumpe. Hämagglutinin und Neuraminidase werden dabei quantitativ solubilisiert und befinden sich im oberen Teil des Gradienten gut getrennt vom wesentlich rascher sedimentierenden Virusrestpartikel.
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Beispiel 2:
Vermehrung, Konzentrierung und Spaltung des Virus werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgt durch Gleichgewichtszentrifugatxon in einem vorgeformten Rohrzuckergradienten. Nach Gleichgewichtseinstellung wird der Gradient fraktioniert und ausgetestet. Hämagglutinin und Neuraminidase befinden sich im leichteren Teil des Gradienten gut getrennt vom dichteren Virusrestpartikel.
Beispiel 3:
Man verfährt wie in Beispiel 1 oder 2, verwendet aber den Influenzastamm MRC-2 (Rekonfoinante des Typs A2/England/ 42/72) oder MRC-Il (Rekombinante des Typs A„/Port Chalmers/ 73).
Beispiel 4:
Man verfährt wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben, arbeitet das Reaktionsgemisch jedoch mittels Molekularsiebchromatographie auf,
Beispiel 5:
Eine wässerige Lösung (0,5 %) von Cetylpyridiniumbromid wird zum Influenzavirus des Typs A/Pasteur/30 C ("Mutagrip",
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Institut Pasteur) zugesetzt, das vorher durch Zusatz von. Formaldehyd inaktiviert wurde. Das Detergens wird bis zu einer Endkonzentration von 0,02 bis 0,1 % zugesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt wie in den Beispielen 1, 2 oder 4
beschrieben.
Beispiel 6;
Man verfährt wie in den Beispielen 1, 2, 4 oder 5, verwendet aber den Influenz as tairtm B/Mass/6 7.
Beispiel 7:
Man verfährt wie in den. Beispielen 1, 3, 5 oder 6, arbeitet jedoch das Spaltgemisch durch Pelletierung in der Ultrazentrifuge auf. Dies kann beispielsweise durch Zentrifugation in der Beckmann L-2-65 B Zentrifuge erfolgen (Rotor 60 Ti, 35 000 U.p.M. 90 Minuten). Die solubilisierten
Immunogene sind in der überstehenden Fraktion enthalten.
Beispiel 8;
Man verfährt wie in einem der Beispiele 1 bis 7, verwendet jedoch anstelle von einer Cetyltrimethylamraoniumbromidlösung eine 1 %-ige Lösung von Myristyltriraethylammoniumbrcmid, Benzethoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Decamethoniumchlorid oder Stearyldimethylbenzylanunoniumbromid. Hierbei erhält man vergleichbare Resultate.
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Beispiel 9:
Ein Influenzavakzin kann wie nachfolgend beschrieben formuliert sein:
Bestandteile Anteile
Immunogenes Gemisch 700 Internationale Einheiten
Thiomerosal . 1 Teil auf 10.000 Teile
Phosphatpuffer in 0,9 %-iger
physiologischer Kochsalzlösung bis 0,5 ml
Das immunogene Gemisch kann entsprechend einem der vorhergehenden Beispiele hergestellt werden, beispielsweise wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Vervrendung des Influenzastammes MRC-Il ( Rekombinante der Type A2/Port Chalmers/73).
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Claims (16)

  1. - 16 - 900-9102/A
    Patentansprüche
    f$\ Verfahren zur Isolierung von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus einem Influenzavirus dadurch gekennzeichnet, dass man ein Influenzavirus in wässeriger lösung mit einem kationischen Detergens zwecks selektiver Solubilisierung dieser Komponenten behandelt und die so erhaltenen solubilisierten Komponenten von den verbleibenden Subvirusteilchen abtrennt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man als Influenzavirus einen Influenzavirus vom Typ A, A-, A oder B, oder ein Gemisch von 2 oder mehr dieser Viren verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass man als Influenzavirus die Stamme A2/Aichi/68, MRC-2 (Rekombinante des Typs A /England/42/72), MRC-Il (Rekombinante des Typus A3/Port Chalmers/73), A/Pasteur/ 3OC (Mutagrip) oder B/Mass/67 verwendet.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass man das kationische Detergens zu einem Viruskonzentrat, das einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5 besitzt, zusetzt.
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  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass das Viruskonzentrat vorgängig der Zugabe eines kationischen Detergens mit Formaldehyd inaktiviert wurde.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass man das kationische Detergens in Form seiner wässerigen Lösung verwendet.
  7. 7. Verfahren nach einem, der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Detergens in solchen Anteilen zugesetzt wird, dass im erhaltenen Gemisch das Gewichtsverhäitnis- von Detergens zum Prote'in von 1:2 bis 1:10 beträgt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass das Gev/ichts verhältnis von 1:3 bis 1:5 beträgt.
  9. 9» Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass nach der Zugabe des kationischen Detergens das erhaltene Gemisch während 30 Minuten bis 16 Stunden bei 4 bis 37° C stehen gelassen wird.
  10. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass man ein kationisches Detergens die Formel I
    R4
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    - 18 - · S00-9102/A
    verwendet, worin R4 für Alkyl oder Aryl, R,, R? und R gleich oder verschieden sind und für Alkyl oder Aryl stehen, oder R1 und R- zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- bis 6-gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring bilden, und R Alkyl oder Aryl bedeutet, oder R1 , R_ und R zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, und X für ein Anion steht.
  11. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das kationische D.etergens die Formel Ia
    ®/ θ
    N χν Ia
    R3^ R4'
    besitzt, worin X die im Anspruch 10 angegebene Bedeutung besitzt, und R ' eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeutet, und entweder R ' und R ' gleich oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatome:
    und R0 1 für Benzyl stehen.
    mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder R ' für Methyl
  12. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Detergens die Formel Iaa
    509831/0778
    900-9102/A
    CH
    Iaa
    besitzt, worin R.1 and X die im Anspruch 11 angegebene Bedeutung besitzen.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Detergens die Formel lab
    CH
    '6 5 2
    CH.
    lab
    besitzt, worin R ' und X die im Anspruch 11 angegebene Bedeutung besitzen.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Detergens die Formel Ib . ■
    Ib
    besitzt, worin X die im Anspruch 10 angegebene Bedeutung besitzt, R4 1' eine Alky!gruppe mit 12-18 Kohlenstoffatomen und R5 Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise Wasserstoff, bedeuten.
    509831/0778
    > - 900-9102/A
  15. 15. Ein Influenzavakzin bestehend aus einem Gemisch von Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten eines Influenzavirus bei substanzieller Abwesenheit anderer Komponenten des Influenzaviruspartxkels zusammen mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel.
  16. 16. Ein Vakzin nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass dieses 600 bis 3000 internationale Einheiten des Gemisches der Hämagglutinin- und NeuraminidasekoinpoRenten auf 0,5 ml des Vakzins enthält.
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