JPS58407B2 - インフルエンザウイルスから血球凝集素およびノイラミニダ−ゼ成分の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインフルエンザワクナン、特にインフルエンザ
サブユニットワクナン、およびインフルエンザウィルス
の免疫性成分の選択的可溶化および分離法に関する。

第１図はインフルエンザウィルス粒子を図で示したもの
である。

遺伝性物質であるリボ核酸（ＲＮＡ’）はその群に特有
の核蛋白質と連合して内層は蛋白質、外層は宿主からの
脂質物質からなる二重膜で取巻かれている。

血球凝集素およびノイラミニダーゼの２つの糖蛋白質は
ウィルス外被表面に突起またはスパイク状で存在する。

血球凝集素およびノイラミニダーゼの２つの糖蛋白質が
インフルエンザウィルスの主免疫性成分であって、他の
ウィルス蛋白、核酸および脂質を含む他のすべての成分
は免疫誘導に必須ではないということが確認された。

このような非必須物質がインフルエンザワクチン中に存
在すると、望ましくない副作用の原因となり、ワクチン
の投与量が制限され、達成される免疫レベルにも限界が
ある。

それ故、理想的なインフルエンザワクナンは、ウィルス
粒子の非必須成分を含有しないかまたは実質的に含有せ
ず、血球凝集素およびノイラミニダーゼの２つの必須免
疫素を含有していなければならない。

そこでインフルエンザ免疫素を分離スるために先づ試み
られた方法は、最初の段階で、たとえばデスオキシコー
ル酸ナトリウムまたはドデシル硫酸ナトリウムのような
陰イオン表面界性剤を用いて、ウィルス粒子を実質的に
完全に破壊または可溶化し、ウィルス成分の全部あるい
は大部分を遊離させて免疫素と共に溶液中に移行させる
ものであった。

しかしながら、このような方法では、目的の免疫素を精
製または部分的精製する必要があり、非常な労力を要し
、かつ収率は通常低いものとならざるを得ない。

本発明は血球凝集素およびノイラミニダーゼの分離方法
を提供するものであり、これらの成分を選択的に可溶化
し、他のすべての非必須ウィルス成分を包んだもとのま
ゝの脂質／蛋白膜からなる半ウィルス粒子として残すこ
とが可能である。

可溶化された免疫素および残りの半ウィルス粒子の大き
さまたは密度が違うので、このような物理的性質の差を
利用する常套の分離方法によって容易に免疫素を分離す
ることができる。

本発明者らは、血球凝集素およびノイラミニダーゼ成分
のこれらの選択的可溶化が、インフルエンザウィルスを
陽イオン表面活性剤で処理することによって達成し得る
ことを見出した。

本発明は従って血球凝集素およびノイラミニダーゼをイ
ンフルエンザウィルスから分離する方法を提供するもの
であり、インフルエンザウィルスを水性媒質中で陽イオ
ン表面活性剤で処理してこのような成分を選択的に可溶
化し、得られた可溶化されたこれらの成分を残りの半ウ
ィルス粒子から分離することを特徴とするものである。

本発明方法はＡ型、ＡＩ型、Ａ２型またはＢ型のインフ
ルエンザウィルスまたはそれらの混合物に対して適切に
利用され得る。

用いる株は、勿論遊離される免疫素から望まれる免疫に
よるが、例えば次のようなものが挙げられるニー Ａ２／愛知／６８、ＭＲＣ−２（Ａ２型／イン。

グランド／４２／７２の再結合）、ＭＲＣ−１１（Ａ２
型／ポート・チヤマース（ＰｏｒｔＣｈａｌｍｅｒｓ）
７３の再結合）、Ａ／パスツール／３０℃［ミュータグ
リップＪ （”Ｍｕｔａｇｒｉｐ”）、パスンール研究
所」およびｆ３ ／７ス（Ｍａｓｓ ）／ ６７ 。

株。

処理されるインフルエンザウィルスは常套の方法、例え
ば１１日令の受精鶏卵に接種し、適当な期間適当な温度
に、たとえば２日間３７℃に保温して適当に増殖させる
。

ついで得られた尿膜液を適当に集め、ウィルスを超遠心
分離してから例えばリン酸塩緩衝生理的食塩水に再懸濁
するか、連続流動帯状遠心分離機中で例えばスクロース
・グラジェントのリン酸塩緩衝生理的食塩水を用いて遠
心分離してから適当に生理的食塩水に対して透析するこ
とによりスクロースの含量を例えば５％。

より少くするか、セファデツタスクロマトグラフィーま
たは希釈して適当に濃縮および精製をする。

最初のウィルスの濃度は重要な意味を持つものではなく
、免疫素の目的量によって節節することができる。

ウィルス濃縮液のｐＨは、必要に応じ、陽イオン表面活
性剤を添加する前にリン酸塩緩衝剤のような緩衝剤を用
いて６．５〜８．５に調節するのが適当であり、また濃
縮液は例えばホルムアルデヒドの添加によって不活性化
されてもよい。

つぎに陽イオン表面活性剤をウィルス濃縮液に水溶液の
形で適当に加える。

添加すべき陽イオン表面活性剤の量はその種類にもよる
が、一般に陽イオン表面活性剤と蛋白質の比が１：２か
ら１：１・０、特に１：３から１＝５となるように加え
るのが適当である。

添加した後、混合物を例えば４〜３７℃に３０分〜１６
時間放置する。

温度が高いほど放置時間は短くてよく、好ましくは室温
に３０〜６０分または４℃で一夜放置する。

使用する陽イオン表面活性剤は、血球凝集素およびノイ
ラミニダーゼ成分を可溶化するに十分な活性を有するも
のであって、使用する条件下では全ウィルス粒子を破壊
しないようなものである。

このような陽イオン表面活性剤は、式 〔式中、Ｒ４はアルキルまたはアリール、Ｒ１、Ｒ２お
よびＲ３は同じかまたは異ってアルキルまたはアリール
、またはＲ１およびＲ２は結合する窒素原子と共に５ま
たは６員飽和異項環を形成し、Ｒ３はアルキルまたはア
リール、またはＲ，Ｒ２およびＲ３は結合する窒素原子
と共に窒素原子で不飽和の５または６員異項環を形成し
、Ｘは陰イオンを表わす。

〕で示される化合物から選択されてよい。

式■で示される代表的な化合物は、式 〔式中、Ｘは前記と同意義、Ｒ′４は炭素数８〜２２の
アルキル、Ｒ′１およびＲ′２は何れも同じかまたは異
ってメチルまたは炭素数８〜２２のアルキル、またはＲ
／、がメチルでＲ’）はベンジルを表わす。

〕で示される化合物、特に、式 〔式中、Ｒ′４およびＸは前記と同意義〕または、式 〔式中、Ｒ′４およびＸは前記と同意義〕で示される化
合物を含む。

式Ｉで示される更に代表的な化合物は、式〔式中、Ｘは
前記と同意義、蟹は炭素数１２〜１８のアルキル、Ｒ５
は水素またはメチル、好ましくは水素を表わす。

〕で示されるものである。

炭素数８〜２２のアルキル基の好ましいものは、炭素数
１２〜１８のものである。

炭素数１２〜１８のアルキル基の具体例としては、ラウ
リル、ミリスチル、セチルおよびステアリルが挙げられ
る。

上記式において、Ｘは好ましくはクロリド、プロミド、
サルフェートまたはアセテートのような陰イオン、特に
クロリドまたはプロミドを表わす。

式Ｉａａで示される化合物のうち好ましいものは、ミリ
スチルトリメチルアンモニウム塩およびセチルトリメチ
ルアンモニウム塩、特にクロリドまたはプロミド、更に
特に好ましいのはプロミドである。

式Ｉａｂで示される化合物のうち好ましいものは、ステ
アリルジメチルベンジルアンモニウム塩、特にクロリド
またはプロミド、就中プロミドである。

弐Ｉｂで示される好ましい化合物は、セチルピリジニウ
ム塩、特にクロリドまたはプロミド、更に特に好ましい
のはプロミドである。

使用し得る他の適当な陽イオン表面活性剤としては、ベ
ンズアルコニウムクロリドおよびプロミド、例えばベン
ズエトニウムクロリドまたはメチルベンズエトニウムク
ロリドならびにデカメトニウムクロリドのようなものが
例示される。

本発明方法で用いられる好ましい陽イオン表面活性剤は
セチルトリメチルアンモニウムプロミドである。

上記の処理が終った後、血球凝集素およびノイラミニダ
ーゼ成分を残りのもとのまゝの半ウィルス粒子から、違
った大きさまたは密度の物質を分離するために採用され
ている常套の方法、例えばスクロースまたはグルタミン
酸ナトリウム媒質を用いて傾斜遠心分離を行い、傾斜液
を分別する方法、沈降による方法、分子篩クロマトグラ
フィーまたは超遠心分離機で圧縮する方法によって分離
する。

本発明方法によって得られた免疫素の混合物は、インフ
ルエンザワクチンに用いるのに適している。

このためには、上記のようにして分離した血球凝集素お
よびノイラミニダーゼ成分を常套の希釈剤例えば０．９
％塩化ナトリウム溶液のような生理的等張溶液に、必要
に応じリン酸塩緩衝剤のような緩衝剤を用いて適当に再
懸濁させる。

最初のウィルスの精製からの或いは可溶化した成分の分
離からの残存スクロースは適当に例えば透析によってワ
クチン９５重量％よりも少なくしなければならない。

また、残存陽イオン表面活性剤の含量は、なるべく少く
すべきであり、例えば透析またはゲルクロマトグラフィ
ーによってワクチン中０．０１％以下とする。

所望により、ホルムアルデヒドのような保存剤または不
活性化剤を常套量例えば重量で１０，０００部に対して
１部の割合でワクチンに加えることができる。

本発明のワクチンの免疫性は水酸化アンモニウム塩たは
リン酸アルミニウムのような常套の免疫学的佐楽を、常
套量例えば水酸化アルミニウムを０．２％含めることに
よって増強させてもよい。

本発明方法により製造されたワクチンは前述のようなイ
ンフルエンザウィルスに対するワクチンとして有用であ
る。

例えばそれぞれ３０匹のマウスの群に、血球凝集素含量
が約２８である０、２５ｍ１の全ウィルスワクチンおよ
び本発明のサブユニットワクチンを腹腔内投与し、免疫
後３．４および８週間目に、発病力のあるウィルスを噴
霧適用して感染させ、感染後９日目に死亡率および肺の
病変について感染防御を評価した。

テストを抗原含量の違ったワクチンを用いて繰返したと
ころ、本発明のサブユニットワクチンは感染ウィルスに
対してより持続した免疫が得られるほかは全ウィルスワ
クチンと同様な効果を有することが確認された。

使用に際しての投与量は適宜に変えられてよいが、一般
に、動物の体重のｋｇ当り約９〜４３国際単位を１回投
与することにより満足すべき結果が得られる。

より大きな哺乳動物には６００〜３０００国際単位の１
回投与が適用される。

投与は皮下または筋肉内が適当である。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例 １ 抗原タイプＸ−３１（Ａ２／愛知／６８株の再結合）の
インフルエンザウィルスを受精鶏卵中で２日間３７℃に
保温して増殖させる。

ついで卵を一夜４℃に冷やし、得られた感染尿膜液を集
める。

ウィルスを次に連続流動帯状遠心分離機〔モデルＲＫ、
エレクトローヌクレオニックス（ＭｏｄｅｌＲＫ、Ｅｌ
ｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）で、スクロース・
グラジェントのリン酸塩緩衝食塩水を用いて遠心分離す
ることにより感染尿膜液から濃縮および精整する。

冷時リン酸塩緩衝食塩水に対して透析することによりス
クロース含量を５％より少くした後に得られるウィルス
濃縮物は、血球凝集素力価１：２１７で蛋白質含量は０
．７ｍｇ／ｃｃである。

ウィルス懸濁液に、その容量の１１５０の表面活性剤水
溶液（セチルトリメチルアンモニウムプロミド、１％溶
液）を加えて免疫素を分離させる。

３０〜６０分後（室温）反応混合物をあらかじめ調製し
た直線状スクロース・グラジェントを用いて帯状傾斜遠
心分離で処理し、次に嬬動ポンプでグラジェントを分別
する。

血球凝集素およびノイラミニダーゼは定量的に可溶化さ
れ、グラジェントの上部に存在し、より急速に沈降物と
なるウィルスの残りの粒子から容易に分離される。

実施例 ２ ウィルスの増殖、濃縮および開裂は実施例１に記載した
ように行う。

処理は予め調製したスクロース・グラジェントで平衡遠
心分離して行う。

平衡を調整した後、グラジェントを分別して試験をする
。

血球凝集素およびノイラミニダーゼはグラジェントの軽
い部分に存在し、より密度の大きいウィルスの残りの粒
子から容易に分離される。

実施例 ３ インフルエンザ株ＭＲＣ−２（Ａ２型／イングランド／
４２／７２の再結合）またはＭＲＣ−１１（Ａ２型／ポ
ートナヤルマース／７３の再結合）を用いる以外は実施
例１または２に記載した方法で行う。

実施例 ４ 反応混合物を分子篩クロマトグラフィーで処理する以外
は実施例１または３に記載した方法で行う。

実施例 ５ ホルモルで不活性化されたＡ型／パスツール／３０Ｃ（
「ミューダグリップ」、パスツール研究所）のインフル
エンザウィルスに、最終濃度が０．０２〜０．１％とな
るようにセチルピリジニウムプロミドの水溶液（０，５
％）を加える。

処理は実施例１．２または４に記載したのと同様な方法
で行う。

実施例 ６ インフルエンザ株Ｂ／マス／６７を用いル以外は実施例
１．２．４または５に記載した方法で行う。

実施例 ７ 開裂混合物を超遠心分離機中で圧縮して処理する以外は
実施例１．３．５または６に記載した方法で行う。

これは例えばベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ ）Ｌ−２
−６５Ｂ遠心分離機（ローター６０Ｔｉ。

３５０００ｒ、ｐ、ｍ、、９０分）で行う。

可溶化された免疫素は上澄液分画に存在する。

実施例 ８ セチルトリメチルアンモニウムプロミド溶液の代りに、
ミリスチルトリメチルアンモニウムプロミド、ベンズエ
トニウムクロリド、メチルベンズエトニウムクロリド、
デカメトニウムクロリドまたはステアリルジメチルベン
ジルアンモニウムプロミドの１％溶液を用いて実施例１
〜７の何れかの方法を繰返し、同様な結果が得られる。

実施例 ９ 本発明のインフルエンザワクチンは次のように配合され
る： 免疫素混合物＝７００国際単位 チオメロザール（Ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）： １０
，０００部に１部 リン酸塩緩衝剤添加０．９％加えて０．５ｍｌにする。

生理的食塩水 免疫素混合物は前の実施例の何れかによって製造された
ものであってよく、例えば実施例３でインフルエンザ株
ＭＲＣ−１１（Ａ２型／ポートチヤルマース／７３の再
結合）から製造されたものを使用する。

【図面の簡単な説明】

第１図はインフルエンザウィルス粒子を図示したもので
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ インフルエンザウィルスを水性媒質中、陽イオン表
   面活性剤で処理してその血球凝集素およびノイラミニダ
   ーゼ成分を選択的に可溶化せしめ、可溶化された該成分
   を残余の半ウィルス粒子から分離することを特徴とする
   インフルエンザウィルスから血球凝集素およびメイラミ
   ニダーゼ成分の分離方法。