DE2500785B2 - Verfahren zur Ablösung und Isolierung von Hämagglutinin und Neuraminidase aus einem Influenzavirus - Google Patents

Verfahren zur Ablösung und Isolierung von Hämagglutinin und Neuraminidase aus einem Influenzavirus

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DE2500785B2
DE2500785B2 DE2500785A DE2500785A DE2500785B2 DE 2500785 B2 DE2500785 B2 DE 2500785B2 DE 2500785 A DE2500785 A DE 2500785A DE 2500785 A DE2500785 A DE 2500785A DE 2500785 B2 DE2500785 B2 DE 2500785B2
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Influenzavakzine, insbesondere Influenza-Subunit-Vakzine, und deren Herstellung durch selektive Ablösung und Isolierung der immunogenen Komponente eines Influenzavirus.
In Abbildung 1 befindet sich eine schematische Darstellung eines Influenzavirusteilchens. Das genetische Material Ribonucleinsäure (RNA) zusammen mit dem gruppenspezifischen Nucloprotein ist von einer doppelten Membran umgeben, die aus einer inneren Proteinschicht und einer äußeren Schicht vom Wirt abstammenden Lipidmaterials besteht. Zwei Glykoproteine, Hämagglutinin und Neuraminidase, erscheinen als Stachel auf der Oberfläche der Virusumhüllung.
Es ist bekannt, daß die zwei Glykoproteine, Hämagglutinin und Neuraminidase, die wichtigsten Komponenten des Influenzavirus sind, während alle anderen Komponenten, inbegriffen andere Virusproteine, Nucleinsäuren und Lipide, für die Entstehung einer Immunität nicht wesentlich sind. Die Anwesenheit dieses nicht wesentlichen Materials in einem Influenzavakzin kann jedoch zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. In jedem Fall werden durch die Anwesenheit des nicht wesentlichen Materials die Menge an Vakzin, das verabreicht werden kann, und dementsprechend auch die Stärke der Immunität, die erreicht werden kann, beschränkt.
Das ideale Influenzavakzin sollte deshalb aus den beiden essentiellen Immunogenen Hämagglutinin und Neuraminidase bei Abwesenheit oder bei substantieller Abwesenheit der nicht wesentlichen Komponenten des Virusteilchens bestehen. Vorhergehende Versuche, die Influenzaiimunogene abzuscheiden, bestanden darin, daß man zunächst versuchte, das Virusteilchen vollständig zu spalten und zu solubilisieren, beispielsweise mit Hilfe von nichtionogenen oder anionischen Detergentien, z. B. ein Tween, ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol, ein Saponin oder Natriumdesocholat [Chem. Abstr. 71 (1969) 76 unter 68074, J. Gen. Virol. 17 (1972) 317--331 und 9 (1970) 179-189, Postgrad. Med. J. 49 (1973) 193-194, J. Hyg. Camb. 68 (1970) 77-80]. Hierbei werden, wie aus dieser Literatur hervorgeht, alle die wesentlichsten Anteile der Viruskomponenten freigesetzt und gehen mit den Immunogenen in Lösung. Wenn dann versucht wird, die imniunogene selektiv zu isolieren, ist das Resultat sehr dürftig, da die Eigenschaften der meisten Viruskomponenten, auf denen die Trennungstechniken beruhen, einschließlich der Teilchengröße dieser Komponenten, wenig verschieden sind und nur mit sehr aufwendigen Techniken verbessert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Hämagglutinin- und Neuraminidase-Immunogene durch selektive Ablösung und Solubilisierung dieser Immunogene, wobei die übrigen Komponenten als subvirale Partikel mit intakten Lipid/Proteinmembranen, die alle anderen nicht wesentlichen Anteile des Virus verschlossen enthalten, zurückbleiben. Der Unterschied in der G"-öße und Dichte der solubilisierten Immunogene und der zurückbleibenden subviralen Partikel erlaubt eine Abtrennung der Immunogene mit
><> Hilfe von üblichen Abtrennungsmethoden, die auf dem Unterschied in den physikalischen Eigenschaften beruhen.
Es wurde nunmehr gefunden, daß diese selektive Solubilisierung der Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten durch Behandlung des Influenzavirus mit einem kationischen Detergens erreicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus Influenzaviruskonzentraten durch Ablösen mittels Detergentien und gegebenenfalls vorheriges Inaktivieren der Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Viruskonzentraten aus Iiifluenzaviren vom Typ A, Ai, A2 oder B oder ein Gemisch von 2 oder mehr dieser Viren in wäßriger Lösung ein kationisches
is Detergens in einem Mengenverhältnis von 1 :2 bis 1 :10 zusetzt und nach gegebener Reaktionsdauer daraus die abgelösten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe bzw. Dichte isoliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßigerweise unter Verwendung von Influenzaviren der Typen A, Ai, A2 oder B oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Viren durchgeführt werden. Der spezifisch verwendete Stamm hängt selbstverständlich von der erwünschten Immunität und den zu isolierenden Immunogenen ab, doch können beispielsweise folgende Stämme erwähnt werden: Stamm A 2/Aichi/68, MRC-2 (Rekombinante der Typen A 2/England/42/72), MRC-11 (Rekombinante der Typen A 2/Port Chalmers/73), A/Pasteur/30C (»Mutagrip«, Institut Pasteur) und B/Mass/67.
Der erfindungsgemäß verwendete Influenzavirusstamm wird zweckmäßigerweise auf an sich bekannte Weise vermehrt, beispielsweise durch Überimpfen auf
γ-, ein 11 Tage altes embryoniertes Hühnerei und durch Inkubation während einer geeigneten Zeit bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise während 2 Tagen bei 37°C. Die erhaltenen Allantoisflüssigkeiten werden anschließend vereinigt und das Virus durch
M) Ultrazentrifugation und nachfolgende Resuspension in einer beispielsweise durch Phosphat gepufferten, physiologischen Kochsalzlösung oder durch Zentrifugation in einer Durchflußzonalzentrifuge unter Verwendung von beispielsweise eines Rohrzuckergradienten in
μ einer durch Phosphate gepufferten physiologischen Kochsalzlösung unter nachfolgender Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes bis beispielsweise weniger als 5%, zweckmäßigerweise durch Dialyse gegen eine physiolo-
gische Kochsalzlösung oder durch Sephadex-Chromatographie oder Verdünnung konzentriert und gereinigt. Die Konzentration des Ausgangsvirus ist nicht kritisch und kann eingestellt werden, abhängig von der erwünschten Menge (Gehalt) des Immunogens.
Der pH-Wert des Viruskonzentrats wird so gewählt, daß das Virus intakt bleibt, und beträgt zweckmäßigerweise von 6,5 bis SJ5, wofür Puffer, wie Phosphatpuffer, verwendet werden können, die vor der Zugabe des kationischen Detergens zugesetzt werden, und das Konzentrat kann ebenfalls, beispielsweise durch Zugabe von Formaldehyd, inaktiviert werden. Danach wird das kationische Detergens zum Viruskonzentrat — zweckmäßigerweise in Form einer wäßrigen Lösung — zugefügt Das verwendete kationische Detergens wird in solche einer Menge zugesetzt, daß das Gewichtsverhältnis von Detergens zum Protein in dem erhaltenen Gemisch von 1 :2 bis 1 :10, insbesondere von 1 :3 bis 1 :5 beträgt Nach Zugabe des Deterjens soll das Gemisch zweckmäßigerweise stehengelassen werden, beispielsweise während 30 Minuten bis 16 Stunden bei Temperaturen, die das Virus nicht aufspalten lassen, beispielsweise bei Temperaturen zwischen 4 und 37°C, wobei die höheren Temperaturen kürzere Zeiten erfordern. Vorzugsweise läßt man das Gemisch während 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur oder während der Nacht bei 4° C stehen.
Das erfindungsgemäß verwendbare kanonische Detergens kann jedes kationische Detergens sein, das genügend aktiv ist, um die Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten zu solubilisieren, jedoch unter den Reaktionsbedingungen nicht genügend aktiv ist, um das ganze Virusteilchen zu zerstören.
Die erfindungsgemäß verwendbaren kationischen Detergenzien können aus einer bekannten Klasse von Verbindungen der Formel I
.R3
ausgewählt werden, worin R4 für Alkyl oder Aryl, Ri, R2 und R.3 gleich oder verschieden sind, und jeweils Alkyl oder Aryl, oder Ri und R2 zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring, und R3 Alkyl oder Aryl bedeuten, oder Ri, R2 und R3 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6gliedrigen heterocyclischen Ring, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, bedeuten, und X für ein Anion steht.
Geeignete Verbindungen der Formel 1 sind die Verbindungen der Formel Ia,
CH3
(Ia)
bedeuten, oder Ri' für Methyl steht, und R/ Benzyl bedeutet, insbesondere jedoch Verbindungen der Formel laa,
worin X obige Bedeutung besitzt, und R4' für Alkyl mit 8 — 22 Kohlenstoffatomen steht, und entweder Ri' und R2' gleich oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8 — 22 Kohlenstoffatomen CH,
(!aal
CH3
worin R4' und X obige Bedeutung besitzen, oder der Formel lab,
(I ab»
C6HjCH2
worin R4' und X obige Bedeutung besitzen.
Weitere geeignete Verbindungen der Formeln I sind diejenigen der Formel Ib,
N - RI
(Ibi
worin X obige Bedeutung besitzt und R4" für eine Alkylgruppe mit 12-18 Kohlenstoffatomen und R5 für Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise jedoch für Wasserstoff stehen.
Unter den Alkylgruppen mit 8 — 22 Kohlenstoffatomen sind diejenigen mit 12—18 Kohlenstoffatomen besonders geeignet, davon insbesondere die Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- und Stearylgruppen.
In den obigen Formeln bedeutet X vornehmlich ein Chlorid-, Bromid-, Sulfat- oder Acetat-, insbesondere jedoch ein Chlorid- oder Bromidanion.
Die geeigneten Verbindungen der Formel laa sind z. B. Myristyltrimethyiammonium- und Cetyltrimethylammoniumsalze, speziell deren Chloride oder Bromide, insbesondere jedoch Bromide. Geeignete Verbindungen der Formel lab sind z. B. Stearyldimethylbenzylammoniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders jedoch Bromide. Geeignete Verbindungen der Formel Ib sind Cetylpyridiniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders Bromide.
Andere kationische Detergentien, die zweckmäßigerweise verwendet werden können, sind Benzalkoniumchloride und -bromide, beispielsweise Benzethoniumchlorid oder Methylbenzethoniumchlorid oder auch solche Agenzien, wie Decamethoniumchlorid.
Das erfindungsgemäß bevoizugte kationische Detergens ist Cetylmethylammoniumbromid.
Nach Beendigung des obigen Verfahrens können die Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten von Qv_n zurückbleibenden intakten subviralen Partikeln auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Diese Abtrennung beruht auf der verschiedenen Größe oder Dichte der zu trennenden Teilchen, und kann beispielsweise mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation unter Verwendung von Rohrzucker- oder Natriumglutamat-
25 OO 785
medien unter nachfolgender Fraktionierung der Gradienten durch Sedimentation durch Molekularsiebchromatographie oder durch Pelletalion in einer Ultrazentrifuge durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäß hergestellte Gemisch von Immunogenen kann zweckmäßigerweise in Influenzavakzinen verwendet werden. Hierfür werden die oben beschriebenen isolierten Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten zweckmäßigerweise in einem üblichen Lösungsmittel resuspendiert, beispielsweise in einer physiologischen isotonischen Lösung, beispielsweise einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die gegebenenfalls beispielsweise mit einem Phosphatpuffer abgepuffert ist. Der Anteil des von der Reinigung des Aüsgangsvirüs oder von der Abtrennung der solubilisierten Komponente zurückbleibenden Rohrzuckers soll zweckmäßigerweise auf weniger als 5 Gew.-% des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse herabgesetzt werden. Der Anteil des zurückbleibenden kationischen Detergens soll gleicherweise stark herabgesetzt werden, beispielsweise auf weniger als 0,01% des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse oder Gelchromatographie.
Falls erwünscht, können Konservierungsmittel oder Inaktivierungsmittel, wie Formaldehyd, den Vakzinen in üblichen Mengen, beispielsweise in einem Gewichtsverhältnis von einem Teil zu 10 000 Teilen zugesetzt werden.
Die immunogene Wirkung der erfindungsgemäßen Vakzine kann zweckmäßigerweise verbessert werden durch Zugabe von üblichen immunologischen Zusätzen, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, in üblichen Mengen. Bevorzugt wird die Zugabe von 0,2% Aluminiumhydroxid.
In einer Testreihe wurde der Schutz der Maus zu verschiedenen Zeiten nach Immunisierung mit Influenza-Subunit-Vakzin und mit Influenza-Ganzvirus bei Belastung mit virulenten Influenza-Virus untersucht. Dieses Modell umfaßt alle spezifischen und unspezifischen Abwehrmechanismen. Gruppen von je 30 Mäusen werden hierbei 0,25 ml Antigen/Maus i. p. appliziert, jeweils 3,4 und 8 Wochen danach wird ein Teii der Gruppe mit Hilfe eines Sprays infiziert und 9 Tage nach der Infektion der Schutz bewertet. Als Bewertungsbasis werden die Reduktion der Mortalität in % und die Reduktion der Lungenläsionen in % herangezogen. Der Test wird wiederholt mit verschiedenen Antigenanteilen in den Vakzinen. Die Resultate zeigen, daß die erfindungsgemäßen Subunitvakzine eine längere Immunität gegen die Virusinfektion zeigen, jedoch andererseits parallele Effekte zu den Ganzvirusvakzinen aufweisen.
Für die obige Anwendung kann die zu verabreichende Dosis verschieden sein. Im allgemeinen bekommt man zufriedenstellende Resultate, wenn man die Vakzine in einer einzigen Dosis von 9 bis 43 internationalen Einheiten per kg Tiergewicht verabreicht Für größere Säugetiere ist eine Einheitsdosis von 600 bis 3000 internationalen Einheiten zu empfehlen.
Die Verabreichung erfolgt zweckmäßigerweise subcutan oder intramuskulär.
Beispiel 1
influenzavirus vom Antigentyp X-31 (Rekombinante des Stammes A2/Aichi/68) wird durch Inkubation in einem embryonierten Hühnerei bei 37° C während 2 Tagen vermehrt. Die Eier werden danach auf 4° C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen. Die erhaltenen infizierten AUantoisflüssigkeiten werden vereinigt. Das Virus wird anschließend aus det Allantoisflüssigkeit durch Zcntrifugation in der Durchflußzonalzentrifuge (Modell RK, Elektro-Nucleonics] unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten in einer durch Phosphat gepufferten Kochsalzlösung konzentriert und gereinigt. Das nach der Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes auf weniger als 5% durch Dialyse gegen eine durch Phosphat gepufferte Kochsalzlösung in der Kälte erhaltene Viruskonzentrat hat einer Hämagglutinationstiter von 1 :217 und einen Proteingehalt von 0,7 mg/ml. Zur Abspaltung der Immunogene wird die Virussuspension mit '/so ihres Volumens einer wässerigen Detergenslösung (Cetyltrimethylammoniumbromid, l%ige Lösung) versetzt Nach 30 bis 6C lviinutcii ^iiuiTicrteiti^eratiir^ wiiu u3S i\€äiitioiisgemisch durch Gradientenzentrifugation aufgearbeitei unter Verwendung eines vorgebildeten linearen Rohrzuckergradienten und nachfolgende Fraktionierung des Gradienten mit einer peristaltischen Pumpe. Hämagglu-
2n tinin und Neuraminidase werden dabei quantitativ solubilisiert und befinden sich im oberen Teil de< Gradienten gut getrennt vom wesentlich rascher sedimentierenden VirusrestpartikeL
Beispiel 2
Vermehrung, Konzentrierung und Spaltung des Virus werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt Die Aufarbeitung erfolgt durch Gleichgewichtszentrifu-
jo gation in einem vorgeformten Rohrzuckergradienten Ein linearer Rohrzuckergradient wird aus 5% (w/w] bzw. 50% (w/w) Rohrzuckerlösung in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt Die Zentrifugation erfolgt z. B. im Rotor SW 27 (Beckmann) bei 10cC, 18 Stunden, 20 000 UpM. Nach Gleichgewichtseir.stellung wird der Gradient fraktioniert und ausgetestet. Hämagglutinin und Neuraminidase befinden sich im leichteren Teil des Gradienten, gut getrennt vom dichteren Viruspartikel.
Beispiel 3
Man verfährt wie in Beispiel 1 oder 2, verwendet aber den Influenzastamm MRC-2 (Rekombinante des Typ; A2/England/42/72) oder MRC-Il (Rekombinante des Ι Typs A2/Port Chalmers/73).
Beispiel 4
Man verfährt wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben arbeitet das Reaktionsgemisch jedoch mittels Molekularsiebchromatographie auf. Zur Molekularsiebchromatographie können z.B. Controlled Pore Glass (CPG 700), Agarose oder Sepharose 4 B oder 2 B verwende! werden. Das Trennmaterial wird z. B. in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung äquilibriert und zu einer Säule gepackt Die Säulenabmessungen betragen z.B. bei einem Probevolumen von 3 ml 1,5 χ 40 cm. Die Elutior erfolgt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Zui Fraktionierung wird in üblicher Weise ein Fraktionensammler (z. B. LKB Ultrovac 7000) verwendet
Beispiel 5
Eine wäßrige Lösung (0,5%) von Cetylpyridiniumbromid wird zum Influenzavirus des Typs A/Pasteur/30 C (»Mutagrip«, Institut Pasteur) zugesetzt, das vorher durch Zusatz von Formaldehyd inaktiviert wurde. Das Detergens wird bis zu einer Endkonzentration von 0,02 bis 0,1% zugesetzt Die Aufarbeitung erfolgt wie in den Beispielen 1,2 oder 4 beschrieben.
Beispiel 6
Man verfährt wie in den Beispielen 1, 2, 4 oder 5, verwendet aber den Influenzastamm B/Mass/67.
Beispiel 7
Man verfährt wie in den Beispielen 1, 3, 5 oder 6, arbeitet jedoch das Spaltgemisch durch Pelletierung in der Ultrazentrifuge auf. Dies kann beispielsweise durch Zentrifugation in der Beckmann L-2-65 B Zentrifuge erfolgen (Rotor 60 Ti, 35 000 UpM, 90 Minuten, 100C). Die solubilisierten Immunogene sind in der überstehenden Fraktion enthalten, die abgegossen oder abfiltriert wird.
Beispiel 8
Man verfährt wie in einem der Beispiele 1 bis 7, verwendet jedoch an Stelle einer Cetyltrimethylammoniumbromidlösung eine l%ige Lösung von Myristyltrimethylammoniumbromid, Benzethoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Decamethoniumchlorid oder Stearyldiemthylbenzylammoniumbromid. Hierbei erhält man vergleichbare Resultate.
Beispiel 9
Ein Influenzavakzin kann wie nachfolgend beschrieben formuliert sein:
Bestandteile
Anteile
Immunogenes Gemisch
Thiomerosal
Phosphatpuffer in 0,9%iger
physiologischer Kochsalzlösung
700 Internationale
Einheiten
! Teil auf 10 000
Teile
bis 0,5 ml
Das immunogene Gemisch kann entsprechend einem der vorhergehenden Beispiele hergestellt werden, beispielsweise wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung des Influenzastammes MRC-11 (Rekombinante des Typs A2/Port Chalmers/73).
Beispiel 10
Mit 32P markiertem Influenzavirus A/Hong Kong/68 in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung 10,45 mg Eiweiß/ml wurde während 30 Minuten bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4° C mit Neodol
ίο 23-6, einem Addukt aus einem Ci2-Cu-linearen primären Alkohol und Aethylenoxid (Abbildung 2) und erfindungsgemäß mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (Abbildung 3), beide in verschiedenen Konzentrationen von 0,002%, 0,02% und 0,2% (in den Abbildungen 2 und 3 die Teile B, C bzw. D) behandelt.
Die erhaltenen Gemische wurden durch Zentrifugieren in einer Durchflußzonalzentrifuge unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten (5—40% Sukrose) in einem Beckmann Rotor SW 40 während 90 Minuten bei 100C und 30 000 UpM zentrifugiert, wobei eine nicht mit Detergens behandelte Kontrollprobe mitlaufen gelassen wurde (in Abbildungen 2 und 3 die Teile A). Die 10 Fraktionen jeder Detergenskonzentration wurden auf Hämagglutinin und Neuraminidase und — an Hand einer 32P-Bestimmung — auf subvirale Partikel untersucht. Die 32P-Radioaktivität befindet sich in den Phosphatgruppen der Ribonucleinsäure und der Phospholipidkomponenten des Virusmembrans und nicht in den Immunogenen.
Einzelheiten des Vergleichsversuchs sind der Nachpublikation Intervirology 5 (1975) 260—272 zu entnehmen.
Aus Abbildung 2 wird ersichtlich, daß es nicht gelingt, mit Neodol 23-6 einerseits das Hämagglutinin und die Neuraminidase und andererseits die restlichen Viruskomponenten voneinander zu trennen.
Aus Abbildung 3, speziell Teil C ist die erfindungsgemäße selektive Abtrennung der Immogene deutlich erkennbar.
Tabelle 1 Abgelöstes und
isoliertes
Hämagglutinin		 Abgelöste und
isolierte
Neuraminidase		 mit MRC-2
mit MRC-Il
Spaltungsresultate 99% 98% mit A/Aichi/68(X-31)
auf Sepharose 4B
chromatographiert
99%
100%		 105%
91%
Beispiele 1 und 2 100% 95%
Beispiel 3
Beispiel 4
Beispiel 5
Beispiel 7
mit Cetyltrimethylammoniumbromid
als Detergens
>100%
100%
100%
Endkonz. Detergens 0,05%
Aufarbeitung durch Gradientenzentrifugation
mit A/Hong Kong/68
(X-31) (H3N2)
Endkonz. Detergens
0,025%
mit A/Asia/57(H2N2)
Endkonz. Detergens0,03%
9 Forlsetzung 25 00 785 10
Beispiel 7
mit Cctyltrimethyl-
iimmoniumbromid
als Detergens		 Abgelöstes unil
isoliertes
Hämagglutinin		 Abgelöste und
isolierte
Neuraminidasc
99%
100%		 92%
95%		 mit A/FM1/47(H1N1)
Endkonz. Detergens
0,025%
mit A/PR 8/34(HONl)
Endkonz. Detergens 0,03%
Beispiel 8 99% 93% mit B/Hong K.ong/72
Endkonz. Detergens 0,02%
75% 81% mit A/Port Chalmers/73
(MRC-Il); Pelletierung
als Aufarbeitung
Detergens:
Myristyltrimethyl-
ammoniumbromid
100% 67% Benzethoniumchlorid
75% 58% Methylbenzethonium-
chlorid
50% 61% Decamethoniumchlorid
100% 85% Stearyldimethvlbenzvl-
ammoniumbromid
Für die Analysemethoden zur Bestimmung der biologischen Aktivitäten wird auf die Nachpublikation Intervirology 5 (1975) 260-272 hingewiesen.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Isolieren von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus Influenzaviruskonzentration durch Ablösen mittels Detergentien und gegebenenfalls vorheriges Inaktivieren der Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Viruskonzentraten aus Influenzaviren vom Typ A, Ai, A2 oder B oder ein Gemisch von 2 oder mehr dieser Viren in wäßriger Lösung ein kationisches Detergens in einem Mengenverhältnis von 10 :2 bis 1 :10 zusetzt und nach gegebener Reaktionsdauer daraus die abgetrennten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe bzw. Dichte isoliert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als kationisches Detergens Cetyltrimethylammoniumbromid eingesetzt wird.
3. Impfstoff zum Vorbeugen gegen Influenza, enthaltend die nach den Ansprüchen 1 und 2 isolierten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile zusammen mit den üblichen Konfektionierungsmittel.
DE2500785A 1974-01-14 1975-01-10 Verfahren zur Ablösung und Isolierung von Hämagglutinin und Neuraminidase aus einem Influenzavirus Granted DE2500785B2 (de)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2829089A1 (de) * 1977-07-13 1979-02-01 Sandoz Ag Subunit-vakzine
JPH0688911B2 (ja) * 1985-06-06 1994-11-09 国立予防衛生研究所長 インフルエンザワクチン及びその製造方法
TW570803B (en) * 1997-04-09 2004-01-11 Duphar Int Res Influenza vaccine
EP0919243A1 (de) 1997-11-25 1999-06-02 Duphar International Research B.V Impfstoff, dessen Adjuvant aus B-Untereinheiten des hitzelabilen Enterotoxins (LTB) von Escherichiacoli besteht
DE19938767C2 (de) * 1999-08-16 2002-10-24 Tad Pharma Gmbh Spaltimpfstoffe
PT2301572E (pt) * 2005-11-01 2014-12-22 Novartis Vaccines & Diagnostic Vacinas virais derivadas de células com níveis baixos de adn celular residual
CN101790381B (zh) * 2007-08-28 2014-08-27 巴克斯特国际公司 生产病毒疫苗的方法
AU2014350370B2 (en) 2013-11-15 2017-04-13 Novartis Ag Removal of residual cell culture impurities

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