DE2500785C3 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Influenzavakzine, insbesondere Influenza-Subunit-Vakzine, und deren Herstellung durch selektive Ablösung und Isolierung der immunogenen Komponente eines Influenzavirus.

In Abbildung 1 befindet sich eine schematische Darstellung eines Influenzavirusteilchens. Das genetische Material Ribonucleinsäure (RNA) zusammen mit dem gruppenspezifischen Nucloprotein ist von einer doppelten Membran umgeben, die aus einer inneren Proteinschicht und einer äußeren Schicht vom Wirt abstammenden Lipidmaterials besteht Zwei Glycoproteine, Hämagglutinin und Neuraminidase, erscheinen als Stachel auf der Oberfläche der Virusumhüälung.

Es ist bekannt, daß die zwei Glykoproteine, Hämagglutinin und Neuraminidase, die wichtigsten Komponenten des Influenzavirus sind, während alle anderen Komponenten, inbegriffen andere Virusproteine, Nucleinsäuren und Lipide, für die Entstehung einer Immunität nicht wesentlich sind. Die Anwesenheit dieses nicht wesentlichen Materials in einem Infiuenzavakzin kann jedoch zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. In jedem Fall werden durch die Anwesenheit des nicht wesentlichen Materials die Menge an Vakzin, das verabreicht werden kann, und dementsprechend auch die Stärke der Immunität, die erreicht werden kann, beschränkt.

Das ideale Influenzavakzin sollte deshalb aus den beiden essentiellen Immunogenen Hämagglutinin und Neuraminidase bei Abwesenheit oder bei substantieller Abwesenheit der nicht wesentlichen Komponenten des Virusteilchens bestehen. Vorhergehende Versuche, die Influenzaiimunogene abzuscheiden, bestanden darin, daß man zunächst versuchte, das Virusteilchen vollständig zu spalten und zu solubilisieren, beispielsweise mit Hilfe von nichtionogenen oder anionischen Detergentien, z. B. ein Tween, ein Alkylphenoxypolyäthoxyäthanol, ein Saponin oder Natriumdesocholat [Chem. Abstr. 71 (1969) 76 unter 68074, J. Gen. Virol. 17 (1972) 317-331 und 9 (1970) 179-189, Postgrad. Med. J. 49 (1973) 193-194, J. Hyg. Camb. 68 (1970) 77-80]. Hierbei werden, wie aus dieser Literatur hervorgeht, alle die wesentlichsten Anteile der Viruskomponenten freigesetzt und gehen mit den Immunogenen in Lösung. Wenn dann versucht wird, die IiEmunogene selektiv zu isolieren, ist das Resultat sehr dürftig, da die Eigenschaften der meisten Viruskomponenten, auf denen die Trennungstechniken beruhen, einschließlich der Teilchengröße dieser Komponenten, wenig verschieden sind und nur mit sehr aufwendigen Techniken verbessert werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Hämagglutinin- und Neuraminidase-Immunogene durch selektive Ablösung und Solubilisierung dieser Immunogene, wobei die übrigen Komponenten als subvirale Partikel mit intakten Lipid/Proteinmembrauen, die alle anderen nicht wesentlichen Anteile des Virus verschlossen enthalten, zurückbleiben. Der Unterschied in der Größf und Dichte der solubilisierten Immunogene una der zurückbleibenden subviralen Partikel erlaubt eine Abtrennung der Immunogene mit Hilfe von üblichen Abtrennungsmethoden, die auf dem Unterschied in den physikalischen Eigenschaften beruhen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß diese selektive Solubilisierung der Hämagglutinin- und Neuraminidase-

2-i komponenten durch Behandlung des Influenzavirus mit einem kationischen Detergens erreicht weiden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus Influenzaviruskonzentraten durch Ablösen mittels Detergentien und gegebenenfalls vorheriges Inaktivieren der Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Viruskonzentraten aus Influenzaviren vom Typ A, Ai, A₂ oder B oder ein Gemisch von 2 oder mehr dieser Viren in wäßriger Lösung ein kationisches

j) Detergens in einem Mengenverhältnis von 1 :2 bis 1 :10 zusetzt und nach gegebener Reaktionsdauer daraus die abgelösten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe bzw. Dichte isoliert.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßigerweise unter Verwendung von Influenzaviren der Typen A, Ai, A₂ oder B oder einem Gemisch von zwei oder mehreren dieser Viren durchgeführt werden. Der spezifisch verwendete Stamm hängt selbstverständlich von der erwünschten Immunität und den zu isolierenden Immunogenen ab, doch können beispielsweise folgende Stämme erwähnt werden: Stamm A 2/Aichi/68, MRC-2 (Rekombinante der Typen A 2/England/42/72), MRC-11 (Rekombinante der Typen A 2/Port Chalmers/73),

ίο A/Pasteur/30C (»Mutagrip«, Institut Pasteur) und B/Mass/67.

Der erfindungsgemäß verwendete Influenzavirusstamm wird zweckmäßigerweise auf an sich bekannte Weise vermehrt, beispielsweise durch Überimpfen auf ein 11 Tage altes embryoniertes Hühnerei und durch Inkubation während einer geeigneten Zeit bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise während 2 Tagen bei 37° C. Die erhaltenen Allantoisflüssigkeiten werden anschließend vereinigt und das Virus durch

bn Ultrazentrifugation und nachfolgende Resuspension in einer beispielsweise durch Phosphat gepufferten, physiologischen Kochsalzlösung oder durch Zentrifugation in einer Durchflußzonalzentrifuge unter Verwendung von beispielsweise eines Rohrzuckergradienten in -< einer durch Phosphate gepufferten physiologischen Kochsalzlösung unter nachfolgender Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes bis beispielsweise weniger als 5%, zweckmäßigerweise durch Dialyse gegen eine physiolo-

gische Kochsalzlösung oder durch Sephadex-Chromatographie oder Verdünnung konzentriert und gereinigt Die Konzentration des Ausgangsvirus ist nicht kritisch und kann eingestellt werden, abhängig von der erwünschten Menge (Gehalt) des Immunogens.

Der pH-Wert des ViruskonzentraCa wird so gewählt, daß das Virus intakt bleibt, und beträgt zweckmäßigerweise von 6,5 bis 8,5, wofür Puffer, wie Phosphatpuffer, verwendet werden können, die vor der Zugabe des kationischen Detergens zugesetzt werden, und das Konzentrat kann ebenfalls, beispielsweise durch Zugabe von Formaldehyd, inaktiviert werden. Danach wird das kationische Detergens zum Viruskonzentrat — zweckmäßigerweise ir. Form einer wäßrigen Lösung — zugefügt Das verwendete kationische Detergens wird in solche einer Menge zugesetzt, daß das Gewichtsverhältnis von Detergens zum Protein in dem erhaltenen Gemisch von 1 :2 bis 1 :10, insbesondere von 1 :3 bis 1 :5 beträgt Nach Zugabe des Deterjens soll das Gemisch zweckmäßigerweise stehengelassen werden, beispielsweise während 30 Minuten bis 16 Stunden bei Temperaturen, die das Virus nicht aufspalten lassen, beispielsweise bei Temperaturen zwischen 4 und 37⁰C, wobei die höheren Temperaturen kürzere Zeiten erfordern. Vorzugsweise läßt man das Gemisch während 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur oder während der Nacht bei 4⁰C stehen.

Das erfindungsgemäß verwendbare kationische Detergens kann jedes kationische Detergens sein, das genügend aktiv ist, um die Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten zu solubilisieren, jedoch unter den Reaktionsbedingungen nicht genügend aktiv ist, um das ganze Virusteilchen zu zerstören.

Die erfindungsgemäß verwendbaren kationischen Detergenzien können aus einer bekannten Klasse von Verbindungen der Formel I

ausgewählt werden, worin R4 für Alkyl oder Aryl, Ri, R₂ und R3 gleich oder verschieden sind, und jeweils Alkyl oder Aryl, oder Ri und R2 zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6gliedrigen gesättigten heterocyclischen Ring, und R3 Alkyl oder Aryl bedeuten, oder Ri, R2 und R3 zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen 5- oder 6gliedrigen heterocyclischen Ring, der am Stickstoffatom ungesättigt ist, bedeuten, und X für ein Anion steht.

Geeignete Verbindungen der Formel I sind die Verbindungen der Formel Ia,

(Ia)

worin X obige Bedeutung besitzt, und R₄' für Alkyl mit 8 — 22 Kohlenstoffatomen steht, und entweder Ri' und R2' gleich oder verschieden sind und jeweils Methyl oder eine Alkylgruppe mit 8-22 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder Ri' für Methyl steht, und R₂' Benzyl bedeutet, insbesondere jedoch Verbindungen der Formel Iaa,

CH₃ CH₃

N X

/ \
CH₃ R^

(Iaa)

worin R₄' und X obige Bedeutung besitzen, oder der Formel lab,

CH₃ CH₃

N X

(lab)

/
C₆H₅CH₂

worin R₄' und X obige Bedeutung besitzen.

Weitere geeignete Verbindungen der Formeln I sind diejenigen der Formel Ib,

(Ib)

worin X obige Bedeutung besitzt, und R₄" für eine Alkylgruppe mit 12—18 Kohlenstoffatomen und R5 für j5 Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise jedoch für Wasserstoff stehen.

Unter den Alkylgruppen mit 8 — 22 Kohlenstoffatomen sind diejenigen mit 12-18 Kohlenstoffatomen besonders geeignet, davon insbesondere die Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- und Stearylgruppen.

In den obigen Formeln bedeutet X vornehmlich ein Chlorid-, Bromid-, Sulfat- oder Acetat-, insbesondere jedoch ein Chlorid- oder Bromidanion.

Die geeigneten Verbindungen der Formel Iaa sind z. B. Myristyltrimethylammonium- und Cetyltrimethylammoniumsalze, speziell deren Chloride oder Bromide, insbesondere jedoch Bromide. Geeignete Verbindungen der Formel lab sind z. B. Stearyldimethylbenzylammoniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, 3d ganz besonders jedoch Bromide. Geeignete Verbindungen der Formel Ib sind Cetylpyridiniumsalze, insbesondere deren Chloride oder Bromide, ganz besonders Bromide.

Andere kationische Detergentien, die zweckmäßigerweise verwendet werden können, sind Benzalkoniumchloride und -bromide, beispielsweise Benzethoniumchlorid oder Methylbenzethoniumchlorid oder auch solche Agenzien, wie Decamethoniumchlorid.

Das erfindungsgemäß bevorzugte kationische Deterbo gens istCetylmethylammoniumbromid.

Nach Beendigung des obigen Verfahrens können die Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten von dei zurückbleibenden intakten subviralen Partikeln auf an sich bekannte Weise abgetrennt werden. Diese _h<-, Abtrennung beruht auf der verschiedenen Größe oder Dichte der zu trennenden Teilchen, und kann beispielsweise mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation unter Verwendung von Rohrzucker- oder Natriumglutamat-

medien unter nachfolgender Fraktionierung der Gradienten durch Sedimentation durch Molekularsiebchromatographie oder durch Pelletation in einer Ultrazentrifuge durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäß hergestellte Gemisch von Immunogenen kann zweckmäßigerweise in Influenzavakzinen ver vendet werden. Hierfür werden die oben beschriebenen isolierten Hämagglutinin- und Neuraminidasekomponenten zweckmäßigerweise in einem üblichen Lösungsmittel resuspendiert, beispielsweise in einer physiologischen isotonischen Lösung, beispielsweise einer 0,9%igen Natriumchloridlösung, die gegebenenfalls beispielsweise mit einem Phosphatpuffer abgepuffert ist. Der Anteil des von der Reinigung des Ausgangsvirus oder von der Abtrennung der solubilisierten Komponente zurückbleibenden Rohrzuckers soll zweckmäßigerweise auf weniger als 5 Gew.-% des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse herabgesetzt werden. Der Anteil des zurückbleibenden kationischen Detergens soll gleicherweise stark herabgesetzt werden, beispielsweise auf weniger als 0,01% des Vakzins, beispielsweise durch Dialyse oder Gelchromatographie. Falls erwünscht, können Konservierungsmittel oder Inaktivierungsmittel, wie Formaldehyd, den Vakzinen in üblichen Mengen, beispielsweise in einem Gewichtsverhältnis von einem Teil zu 10 000 Teilen zugesetzt werden.

Die immunogene Wirkung der erfindungsgemäßen Vakzine kann zweckmäßigerweise verbessert werden durch Zugabe von üblichen immunologischen Zusätzen, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, in üblichen Mengen. Bevorzugt wird die Zugabe von 0,2% Aluminiumhydroxid.

In einer Testreihe wurde der Schutz der Maus zu verschiedenen Zeiten nach Immunisierung mit Influenza-Subunit-Vakzin und mit Influenza-Ganzvirus bei Belastung mit virulenten Influenza-Virus untersucht Dieses Modell umfaßt alle spezifischen und unspezifischen Abwehrmechanismen. Gruppen von je 30 Mäusen werden hierbei 0,25 ml Antigen/Maus i. p. appliziert, jeweils 3,4 und 8 Wochen danach wird ein Teil der Gruppe mit Hilfe eines Sprays infiziert und 9 Tage nach der Infektion der Schutz bewertet Als Bewertungsbasis werden die Reduktion der Mortalität in % und die Reduktion der Lungenläsionen in % herangezogen. Der Test wird wiederholt mit verschiedenen Antigenanteilen in den Vakzinen. Die Resultate zeigen, daß die erfindungsgemäßen Subunitvakzine eine längere Immunität gegen die Virusinfektion zeigen, jedoch andererseits parallele Effekte zu den Ganzvirusvakzinen aufweisen.

Für die obige Anwendung kann die zu verabreichende Dosis verschieden sein. Im allgemeinen bekommt man zufriedenstellende Resultate, wenn man die Vakzine in einer einzigen Dosis von 9 bis 43 internationalen Einheiten per kg Tiergewicht verabreicht Für größere Säugetiere ist eine Einheitsdosis von 600 bis 3000 internationalen Einheiten zu empfehlen.

Die Verabreichung erfolgt zweckmäßigerweise subcutan oder intramuskulär.

Beispiel 1

Influenzavirus vom Antigentyp X-31 (Rekombinante des Stammes A2/Aichi/68) wird durch Inkubation in einem embryonierten Hühnerei bei 37° C während 2 Tagen vermehrt Die Eier werden danach auf 4° C abgekühlt und über Nacht stehen gelassen. Die erhaltenen infizierten Allantoisflüssigkeiten werden vereinigt. Das Virus wird anschließend aus dei Allantoisflüssigkeit durch Zentrifugation in der Durchflußzonalzentrifuge (Modell RK, Elektro-Nucleonics] unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten in einer durch Phosphat gepufferten Kochsalzlösung konzentriert und gereinigt. Das nach der Herabsetzung des Rohrzuckergehaltes auf weniger als 5% durch Dialyse gegen eine durch Phosphat gepufferte Kochsalzlösung in der Kälte erhaltene Viruskonzentrat hat einen

ίο Hämagglutinationstiter von 1 :2¹⁷ und einen Proteingehalt von 0,7 mg/ml. Zur Abspaltung der Immunogene wird die Virussuspension mit ¹Ao ihres Volumens einer wässerigen Detergenslösung (Cetyltrimethylammoniumbromid, l%ige Lösung) versetzt. Nach 30 bis 60 Minuten (Zimmertemperatur) wird das Reaktionsgemisch durch Gradientenzentrifugation aufgearbeitet unter Verwendung eines vorgebildeten linearen Rohrzuckergradienten und nachfolgende Fraktionierung des Gradienten mit einer peristaltischen Pumpe. Hämagglutinin und Neuraminidase werden dabei quantitativ solubilisiert und befinden sich im oberen Teil des Gradienten gut getrennt vom wesentlich rascher sedimentierenden Virusrestpartikel.

Beispiel 2

Vermehrung, Konzentrierung und Spaltung des Virus werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt Die Aufarbeitung erfolgt durch Gleichgewichtszentrifugation in einem vorgeformten Rohrzuckergradienten. Ein linearer Rohrzuckergradient wird aus 5% (w/w) bzw. 50% (w/w) Rohrzuckerlösung in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Die Zentrifugation erfolgt z. B. im Rotor SW 27 (Beckmann) bei 10° C, 18 Stunden, 20 000 UpM. Nach Gleichgewichtseinstellung wird der Gradient fraktioniert und ausgetestet Hämagglutinin und Neuraminidase befinden sich im leichteren Teil des Gradienten, gut getrennt vom dichteren Viruspartikel.

Beispiel 3

Man verfährt wie in Beispiel 1 oder 2, verwendet aber den Influenzastamm MRC-2 (Rekombinante des Typs A₂/England/42/72) oder MRC-Il (Rekombinante des Typs A₂/Port Chalmers/73).

Beispiel 4

Man verfährt wie in Beispiel 1 und 3 beschrieben, arbeitet das Reaktionsgemisch jedoch mittels Molekularsiebchromatographie auf. Zur Molekularsiebchromatographie können z. B. Controlled Pore Glass (CPG 7001 Agarose oder Sepharose 4 B oder 2 B verwendet werden. Das Trennmaterial wird z. B. in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung äquilibriert und zu einer Säule

gepackt Die Säulenabmessungen betragen z. B. bei einem Probevolumen von 3 ml 1,5 χ 40 cm. Die Elution erfolgt mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Zur Fraktionierung wird in üblicher Weise ein Fraktionensammler (z. B. LKB Ultrovac 7000) verwendet

Beispiel 5

Eine wäßrige Lösung (0,5%) von Cetylpyridiniumbromid wird zum Influenzavirus des Typs A/Pasteur/30 C (»Mutagrip«, Institut Pasteur) zugesetzt, das vorher durch Zusatz von Formaldehyd inaktiviert wurde. Das Detergens wird bis zu einer Endkonzentration von 0,02 bis 0,1 % zugesetzt Die Aufarbeitung erfolgt wie in den Beispielen 1,2 oder 4 beschrieben.

25 OO 785

Beispiel 6

Man verfährt wie in den Beispielen 1, 2, 4 oder 5, verwendet aber den Influenzastamm B/Mass/67.

Beispiel 7

Man verfährt wie in den Beispielen 1, 3, 5 oder 6, arbeitet jedoch das Spaltgemisch durch Pelletierung in der Ultrazentrifuge auf. Dies kann beispielsweise durch Zentrifugation in der Beckmann L-2-65 B Zentrifuge erfolgen (Rotor 60 Ti, 35 000 UpM, 90 Minuten, 10⁰C). Die solubilisierten Immunogene sind in der überstehenden Fraktion enthalten, die abgegossen oder abfiltriert wird.

Beispie! 8

Man verfährt wie in einem der Beispiele 1 bis 7, verwendet jedoch an Stelle einer Cetyltrimethylammoniumbromidlösung eine l°/oige Lösung von Myristyltrimethylammoniumbromid, Benzethoniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid, Decamethoniumchlorid oder Stearyldiemthylbenzylammoniumbromid. Hierbei erhält man vergleichbare Resultate.

Beispiel 9

Ein Influenzavakzin kann wie nachfolgend beschrieben formuliert sein:

Bestandteile

Anteile

Immunogenes Gemisch
Thiomerosal

Phosphatpuffer in 0,9%iger
physiologischer Kochsalzlösung

700 Internationale

Einheiten

1 Teil auf 10 000

Teile

bis 0,5 ml

Das immunogene Gemisch kann entsprechend einem der vorhergehenden Beispiele hergestellt werden, beispielsweise wie in Beispiel 3 beschrieben, unter Verwendung des Influenzastammes MRC-11 (Rekombinante des Typs A₂/Port Chalmers/73).

Beispiel 10

Mit ³²P markiertem Influenzavirus A/Hong Kong/68 in einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung 10,45 mg Eiweiß/ml wurde während 30 Minuten bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4°C mit Neodol

ίο 23-6, einem Addukt aus einem Q₂-C|₃-Iinearen primären Alkohol und Aethylenoxid (Abbildung 2) und erfindungsgemäß mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (Abbildung 3), beide in verschiedenen Konzentrationen von 0,002%, 0,02% und 0,2% (in den Abbildungen 2 und 3 die Teile B, C bzw. D) behandelt

Die erhaltenen Gemische wurden durch Zentrifugieren in einer Durchflußzonalzentrifuge unter Verwendung eines Rohrzuckergradienten (5—40% Sukrose) in einem Beckmann Rotor SW 40 während 90 Minuten bei 1O⁰C und 30 000 UpM zentrifugiert, wobei eine nicht mit Detergens behandelte Kontrollprobe mitlaufen gelassen wurde (in Abbildungen 2 und 3 die Teile A). Die 10 Fraktionen jeder Detergenskonzentration wurden auf Hämagglutinin und Neuraminidase und — an Hand einer ³²P-Bestimmung — auf subvirale Partikel untersucht. Die ³²P-Radioaktivität befindet sich in den Phosphatgruppen der Ribonucleinsäure und der Phospholipidkomponenten des Virusmembrans und nicht in den Immunogenen.

Einzelheiten des Vergleichsversuchs sind der Nachpublikation Intervirology 5 (1975) 260—272 zu entnehmen.

Aus Abbildung 2 wird ersichtlich, daß es nicht gelingt, mit Neodol 23-6 einerseits das Hämagglutinin und die

j5 Neuraminidase und andererseits die restlichen Viruskomponenten voneinander zu trennen.

Aus Abbildung 3, speziell Teil C ist die erfindungsgemäße selektive Abtrennung der Immogene deutlich erkennbar.

Tabelle 1	Abgelöstes und isoliertes Hämagglutinin	Abgelöste und isolierte Neuraminidase	mit MRC-2 mit MRC-Il
Spaltungsresultate	99%	98%	mit A/Aichi/68(X-31) auf Sepharose 4B chromatographiert
	99% 100%	105% 91%	Endkonz. Detergens0,05% Aufarbeitung durch Gra- dientenzentrifugation
Beispiele 1 und 2	100%	95%	mit A/Hong Kong/68 (X-31MH3N2) Endkonz. Delergens 0,025%
Beispiel 3	>100%	88%
Beispiel 4	100%	97%
Beispiel 5
Beispiel 7 mit Cetyltrimethyl ammoniumbromid als Detereens

100%

mit A/Asia/57(H2N2)
Endkonz. Detergens 0,03%

<;	9	Fortsetzung	25	00 785	10
	Abgelöstes und	Abgelöste und
Beispiel 7	isoliertes	isolierte
mit Cctyltrimcthyl-	Hämagglutinin	Neuraminidase	mit A/FM1/47(HIN1)
ammoniumbromid	99%	92%	Endkonz. Detergens
als Detergens			0,025%
			mit A/PR 8/34(HONl)
	100%	95%	Endkonz. Detergens 0,03%
			mit B/Hong Kong/72
99%	93%	Endkonz. Detergens 0,02%

Beispiel 8

75%

100%

75%

50% 100%

81%

67% 58%

b\% 85%

mit A/Port Chalmers/73 (MRC-Il); Pelietierung als Aufarbeitung Detergens:

Myristyltrimethylammoniumbromid

Benzethoniumchlorid

Methylbenzethoniumchlorid

Decamethoniumchlorid

Stearyldimethylbenzylammoniumbromid

Für die Analysemethoden zur Bestimmung der biologischen Aktivitäten wird auf die Nachpublikation Intervirology 5 (1975) 260—272 hingewiesen.

Hierzu 3 Blau Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Isolieren von Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteilen aus !nfluenzaviruskonzentration durch Ablösen mittels Detergentien und gegebenenfalls vorheriges Inaktivieren der Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Viruskonzentraten aus Influenzaviren vom Typ A, Ai, A2 oder B oder ein Gemisch von 2 oder mehr dieser Viren in wäßriger Lösung ein kationisches Detergens in einem Mengenverhältnis von 10 :2 bis 1 :10 zusetzt und nach gegebener Reaktionsdauer daraus die abgetrennten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe bzw. Dichte isoliert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als kationisches Detergens Cetyltrimethylammoniumbromid eingesetzt wird.

3. Impfstoff zum Vorbeugen gegen Influenza, enthaltend die nach den Ansprüchen 1 und 2 isolierten Hämagglutinin- und Neuraminidasebestandteile zusammen mit den üblichen Konfektionierungsmittel.