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Mumps
ist im wesentlichen eine Krankheit in der Kindheit, die sich normalerweise
mit nur geringen Symptomen manifestiert. Jedoch sind in manchen
Fällen
die klinischen Konsequenzen einer Mumpsinfektion ernsthaft. Z.B.
ist Mumps die häufigste
Ursache für
Meningoenzephalitis bei Kindern im Alter von weniger als 15 Jahren
in Großbritannien
und eine Ursache für
permanente sensorineurale Taubheit in der Kindheit. Obwohl 30 bis
40 % der natürlichen
Mumpsinfektionen ohne Symptome verlaufen, hat gerade die Tatsache,
daß die Beteiligung
der Speicheldrüse
unangenehm sein kann, und daß in
der erwachsenen Bevölkerung
Mumps Aborte im ersten Drittel der Schwangerschaft und Orchitis
beim Mann sowie die oben genannten neurologischen Komplikationen
verursachen kann, in vielen Ländern
zur Aufnahme von Massenimpfungsprogrammen geführt.
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Das
Mumpsvirus, das zu den Paramyxoviridae gehört, besteht aus einer einsträngigen genomischen RNA
des Minus-Sinnes und ist ca. 15,3 kb lang mit der Gen-Reihenfolge
3'N-P-M-F-SH-HN-L5' (N = Nukleokapsidprotein,
P = Phosphoprotein, M = Matrixprotein, F = Fusionsprotein, SH =
potentiell exprimiert als kleines hydrophobes Protein, HN = Hämagglutinin-Neuraminidase, L
= großes
Protein). Unter den verschiedenen Mumpsstämmen ist der Jeryl-Lynn-Stamm
(B-Level) eine abgeschwächte
Lebendvariante, die durch Sequenzanalyse der F,P,HN,M-Gene charakterisiert
wurde.
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Bis
vor kurzem waren zwei Mumps-Virusstämme für die Impfung gegen Mumps zugelassen.
Dieses sind Urabe Am 9 und Jeryl-Lynn. Jedoch wurde im September
1992 der Urabe-Stamm im Anschluß an
einen Bericht über
das Auftreten eines inakzeptablen Maßes von Nebenwirkungen zurückgezogen
[European Journal of Pediatrics (1993) 152:387].
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Der
Jeryl-Lynn-Stamm wird von Merck Sharp und Dohme seit vielen Jahren
unter der Marke "MumpsVax" kommerziell verkauft.
Der Jeryl-Lynn-Stamm
wurde aus einer klinischen Probe eines Patienten, der an Mumps litt,
durch Fruchtwasserimpfung in angebrütete Hühnereier erhalten (Proc. Soc.
Exptl. Biol. Med. 123 (3) (1966)).
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Afzal
et al. berichteten kürzlich
(J. of Gen. Virology 1993, 74, 917), daß der in Impfstoffen in Großbritannien
verwendete Jeryl-Lynn-Stamm tatsächlich
eine Mischung aus zwei Viren ist, und zwar JL-2 und JL-5.
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Takeuchi
et al., Virology (1991), 181, S. 364–366, berichten, daß es unter
verschiedenen Mumpsstämmen
eine substantielle Nukleotidsequenzvariation auf dem Niveau des
SH-Gens geben kann.
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Afzal
et al. haben betont, daß der
derzeit kommerziell erhältliche
Impfstoff "MumpsVax" unter sorgfältig kontrollierten
Bedingungen hergestellt wird, einschließlich einer Zellbank und Passagebeschränkungen,
die sehr wahrscheinlich das Verhältnis
der zwei Varianten von Charge zu Charge bewahren. Jedoch gibt es
beim weiteren Passagieren des Jeryl-Lynn-Stammes keine Garantie,
daß dieses
Gleichgewicht zwischen den zwei Varianten beibehalten werden wird.
Außerdem
ist es schwierig, das Verhältnis
der zwei Varianten in einer gegebenen Charge von Impfstoff zu bewerten.
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Die
vorliegenden Erfinder haben überraschend
ein weiteres Isolat identifiziert, das sich sowohl von JL-2 als
auch von JL-5 von Afzal et al. unterscheidet. Der Unterschied wurde
durch Nukleotid-Sequenzanalyse des SH-Gens und der dieses umgebenden Regionen
bestimmt, insbesondere der nichttranslatierten intercistronischen
Region 3' zur SH-codierenden
Sequenz und 5' zum
HN-Gen. Dieses Isolat induziert in klinischen Versuchen eine höhere Nullumwandlung
und besitzt einen höheren
geometrischen Mittelwert des Mumps-Antikörper-Titers als der kommerziell
erhältliche
Mumpsimpfstoff.
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Entsprechend
stellen die vorliegenden Erfinder einen abgeschwächten Jeryl-Lynn-Mumpsstamm
bereit, der die wie in 1 dargestellte Nukleotidsequenz
enthält.
Diese Sequenz codiert das SH-Gen und den N-Terminus des HN-Gens.
Der Stamm wird hier als SBB JL-1 bezeichnet.
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In 1 wird
die cDNA-Sequenz des JL-1-Mumpsvirus-Isolats über die das SH-Gen codierenden
und intergenischen SH-HN-Regionen gezeigt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls einen Mumpsimpfstoff bereit,
der ein immunogenes Jeryl-Lynn-Isolat umfaßt, wobei das Isolat mit nicht
mehr als 10 % und bevorzugt weniger als 5 % und am meisten bevorzugt
weniger als 1 % eines anderen Jeryl-Lynn-Isolats, wie durch die
Sequenz der oben angegebenen Region definiert, kontaminiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung enthält
der Impfstoff ein reines homogenes Jeryl-Lynn-Isolat, das heißt ohne
jegliche Kontamination mit anderen Jeryl-Lynn-Mumpsisolaten, die sich innerhalb
der in 1 dargestellten Region unterscheiden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, der homogenes SBB
JL-1 ohne Kontamination mit JL-2 umfaßt.
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Das
reine Isolat leidet nicht an den Nachteilen einer potentiellen Variation
von Charge zu Charge zwischen Unterstämmen und stellt ein Produkt
bereit, für
das leichter sicherzustellen ist, daß es konstante Qualitätsrichtlinien
erfüllen
wird.
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Homogenes
Jeryl-Lynn gemäß der Erfindung
kann durch Passagieren von handelsüblichem MumpsVax an Hühner-Embryofibroblasten-(CEF)-Zellen
und Selektieren reiner Kulturen durch Grenzwertverdünnung und
Untersuchung der resultierenden Isolate oder durch individuelle
Plaque-Isolierung erhalten werden. Andere geeignete Zellinien schließen Verozellen
und MRC5-Zellen ein. Dies erfordert, daß Verfahren zum Nachweis kleinerer
Anteile einer bekannten Virusvariante innerhalb einer Population
verfügbar
sind. Solche Untersuchungsverfahren schließen den von Chumakov et al.
für abgeschwächtes Poliovirus
vorgeschlagenen Maprec-Test (WO 92/07958 und PNAS 1991, 88; 199-203) und die direkte
Sequenzierung von viralen Plaques und differentielle Hybridisierung
von viralen Plaques ein.
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Der
Impfstoff der Erfindung kann vorteilhaft andere Komponenten enthalten,
wie z.B. abgeschwächtes Masernvirus
und/oder abgeschwächtes
Rötelnvirus,
abgetötet
oder Untereinheiten davon, zum Bereitstellen von Schutz gegen Masern-
und/oder Rötelninfektionen.
Trivalente Mumps-, Masern- und
Rötelnimpfstoffe
sind allgemein fachbekannt, und das vorliegende Mumpsisolat würde in einem
trivalenten Impfstoff in einer analogen Weise zu den bereits verfügbaren Impfstoffen
formuliert werden. Zusätzlich
oder alternativ kann der Impfstoff der Erfindung ein abgeschwächtes Varicella
Zoster-Lebendvirus
zur Bereitstellung von Schutz gegen Varicella (Windpocken) oder
Zoster (Gürtelrose)
enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Varicella
Zoster-Virus der Oka-Stamm sein, wie er offenbart wird von F.E.
Andre, Postgraduate MED J. (1985) 61 (Suppl. 4), 113–120, oder
T. Veskari et al., Acta paediatr. Scared. 80: 1051–1057, 1991.
Bevorzugt wird der Impfstoff der Erfindung quadrivalent sein und
Schutz gegen Mumps, Röteln,
Masern und Varicella Zoster-Viren bereitstellen.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Vollvirus-Impfstoffs
bereit, z.B. durch Gefriertrocknen des Virus in Gegenwart geeigneter
Stabilisatoren oder Vermischen des erfindungsgemäßen Stammes mit einem geeigneten
Träger
oder Hilfsstoff. Es kann ebenfalls vorteilhaft sein, den Stamm der
Erfindung in Liposomen oder mit Trägerpartikeln zu formulieren.
Alternativ oder zusätzlich
können
Immun stimulantien wie 3-Des-O-acylmonophosphoryl-Lipid A (Ribi Immunochem)
oder das Saponin-Derivat QS21 (Cambridge Biotech) in der Formulierung
eingeschlossen werden.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung
von Mumpsinfektionen im Menschen bereit, wobei das Verfahren das
Verabreichen einer immunologisch wirksamen Dosis des erfindungsgemäßen Impfstoffs
an einen menschlichen Patienten umfaßt, der dessen bedarf.
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Der
Verabreichungsmodus des Impfstoffs der Erfindung kann jeder geeignete
Weg sein, der eine immunprotektive Menge des Stammes und anderer
immunogener Komponenten des Impfstoffs auf den Patienten überträgt. Jedoch
wird der Impfstoff bevorzugt parenteral über die intramuskulären oder
tiefen subkutanen Wege verabreicht. Andere Verabreichungsmodi können nach
Wunsch ebenfalls eingesetzt werden, wie z.B. die orale Verabreichung,
oder über
andere parenterale Wege, d.h. intradermal, intranasal oder intravenös.
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Die
geeignete immunprotektive und nicht-toxische Dosis eines solchen
Impfstoffs kann leicht durch die Fachleute bestimmt werden, d.h,
die angemessene immunprotektive und nicht-toxische Menge des Stammes dieser
Erfindung, die im Impfstoff dieser Erfindung enthalten ist, kann
im Bereich der wirksamen Mengen von Antigen in herkömmlichen
Vollvirus-Impfstoffen sein. Es wird jedoch selbstverständlich sein,
daß das
spezifische Dosisniveau für
jeden Patienten von einer Vielzahl von Faktoren abhängen wird,
die das Alter, die allgemeine Gesundheit, das Geschlecht und die
Ernährung
des Patienten einschließen;
die Verabreichungszeit; den Verabreichungsweg; synergistische Wirkungen
mit etwaigen anderen, verabreichten Wirkstoffen; und den gewünschten
Schutzgrad. Natürlich
kann die Verabreichung in geeigneten Intervallen nach Bedarf wiederholt werden.
Typischerweise werden in einer monovalenten Darreichung wenigstens
3,7 log TCID50 des Virus und allgemeiner 4,5 log TCID50 pro Dosis
vorhanden sein. In einem trivalenten Mumps-, Masern-, Röteln-Impfstoff wird
die Mumpskomponente mit ca. 4,8 log TCID50 vorhanden sein, um die
Beeinträchtigung
der anderen zwei viralen Komponenten auszugleichen.
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Beispiele
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1) Erstsequenzierung des
SH-Gens
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Kommerzielles
MumpsVax-Virus wurde an konfluenten Monoschichten aus Vero-Zellen
passagiert, gezüchtet
in 25 cm2-Kolben mit dMEM Biorich-Medium
(50150, V/V) mit 0,5 % fötalem
Kälberserum
unter Verwendung von ca. 3,0 log TCID50 als Inoculum. Die infizierten
Zellen wurden nach 7 Tagen Inkubation bei 34°C gewonnen und die RNA durch
das Verfahren von Ferré und
Garduno (Nucleic Acids Research 1989, 17; 2141) in 100 μl Wasser
extrahiert, das für
5 Minuten bei 100°C
mit Diethylpyrocarbonat behandelt wurde. 5 μl dieses Extrakts wurden revers
transkribiert durch Zugeben der folgenden Reagenzien: RNAsin 40
Einheiten (Boehringer Mannheim, Deutschland), 4 μl 5-fach konzentrierter reverser Transkriptasepuffer
(Bethesda Research Labs), 2 μl
einer Mischung aus den vier Desoxynukleotidtriphosphaten mit 10
mM, 10 pmol NH2-Oligonukleotidprimer, 1 μl murine Moloney-Leukämievirus-(MMLV)-reverse Transkriptase
(Bethesda Research Labs, 200 Einheiten pro μl) und Wasser auf ein Endvolumen
von 20 μl.
Das Oligonukleotid NH2 besitzt Homologie zum F-Gen des Urabe-Stammes
des Mumpsvirus. Die Mischung wurde für 45 min bei 37°C inkubiert
und dann für 5
min auf 95°C
erwärmt.
Die cDNA wurde dann durch zwei aufeinanderfolgende Durchgänge der
PCR-Reaktion unter Verwendung der Oligonukleotide NH8 und NH14 als
Primer und unter Verwendung von 1 μl einer 1000-fachen Verdünnung der
Reaktion des ersten Durchgangs als Ausgangsmaterial für den zweiten
Durchgang amplifiziert. Jeder PCR-Durchgang bestand aus 25 Cyclen aus
Erwärmen
auf 94°C
für 1 min,
53°C für 1 min
und 72°C
für 1 min.
Das dem SH-Gen entsprechende PCR-Produkt wurde in beiden Richtungen
sequenziert, nach weiterer PCR-Amplifikation in Gegenwart von Fluordidesoxynukleotid-Terminatoren
und entweder NH8 oder NH14 als Primer und Analyse der Produkte an
einem Applied Biosystems Sequenzautomaten (373A DNA-Sequenzer) gemäß Herstellerprotokoll
und -empfehlungen. Unklarheiten wurden an einer Anzahl von Positionen
in der Sequenz beobachtet und an beiden Strängen bestätigt. Die erhaltene Sequenz
unterschied sich von derjenigen von Takeuchi et al. (Virology 1991,
181; 364–366)
für Jeryl
Lynn an 17 aus 361 Basen, einschließlich 4 nicht zugeordneter
Basen. Die Sequenz unterschied sich ferner zum Teil von derjenigen,
die von Afzal et al. (J. Gen. Virol. 1993, 74; 917–920) für ihr JL-5-Isolat
erhalten wurde, durch 9 aus 319 Basen, einschließlich 4 nicht zugeordneter
Basen. Unklarheiten wurden ebenfalls beobachtet, wenn die gleiche
Region direkt aus 4,0 bis 5,0 log TCID50 MumpsVax-Virus, das durch
Ultrazentrifugation gewonnen wurde, ohne vorherige Passage an Vero-Zellen
und nach reverser Transkription der viralen RNA zu cDNA mit Zufallsprimern gefolgt
von PCR-Amplifikation
mit den Oligonukleotiden NH30bis und NH31bis als Primer sequenziert
wurde.
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2) Klonierung des SH-Gens
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Das
MumpsVax-Virus wurde verwendet, um Vero-Zellen zu infizieren, und
Voll-RNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Die RNA wurde unter
Verwendung von Zufallsprimern revers transkribiert und unter Verwendung
der Oligonukleotide NH22 und NH23 als Primer PCR-amplifiziert. (NH22
enthält
eine HindIII-Restriktionsstelle innerhalb des Primers, und NH23
enthält
eine BamHI-Restriktionsstelle innerhalb des Primers, um die Klonierung
des amplifizierten DNA-Fragments zu erleichtern). Die amplifizierte
DNA wurde mit HindIII- und BamHI-Endonukleasen beschränkt und
in den Vektor pUC9 kloniert. 11 Klone, die ein der Mumps-SH-Gen-Region
entsprechendes Insert enthielten, wurden gewonnen. Alle 11 besaßen eine
Sequenz, die derjenigen von Takeuchi et al. (loc. cit.) entsprach.
Zusätzlich
besaßen
5 Klone eine DdeI-Restriktionsstelle, die in den sechs anderen Klonen
fehlte. Kein der JL-5-Sequenz entsprechendes Insert wurde gewonnen.
Dieses Ergebnis und die Sequenzierungsunklarheiten legen nahe, daß die von
Afzal et al. definierte Variante des JL-2-Virus einen substantiellen
oder leicht detektierbaren Anteil des MumpsVax-Virus bildet.
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3) Direktes Passagieren
aus MumpsVax
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MumpsVax-Virus
wurde ebenfalls direkt an Hühner-Embryofibroblasten-(CEF)-Zellen passagiert.
Das Virus wurde in der dritten Passage aus 5 unterschiedlichen Chargen
gewonnen, einschließlich
der Charge MJ05, die zur Herstellung der lyophilisierten Probe MJ05A42
zur Injektion in die Tiere verwendet wurde. Die 5 Viruszubereitungen
wurden verwendet, um Vero-Zellen zu infizieren, und RNA wurde gewonnen
und für
die DNA-Sequenzierung durch Amplifikation mit Primern NH8 und NH14
wie oben beschrieben vorbereitet, außer daß Zufallsprimer verwendet wurden,
um die reverse Transkriptase-Reaktion
zu primen. Alle 5 Chargen des Virus zeigten eine Sequenz, die identisch
mit derjenigen von JL-2 (Takeuchi et al.) und ohne Unklarheiten
war.
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Zur
weiteren Untersuchung wurde das direkte Sequenzierungsverfahren
an viralen Plaques wie oben beschrieben verwendet. Die 5 Chargen
wurden verwendet, um Vero-Zellkulturen zu infizieren und Plaques
zu erhalten, die zur Sequenzierung unter Verwendung von NH30bis
und NH31bis als Primer verarbeitet wurden. Von insgesamt 26 Plaques,
die für
die 5 Chargen getestet wurden, ergaben 13 eine Sequenz, die identisch
mit Takeuchi et al. für
die JL-2-Sequenz war, 5 ergaben eine Sequenz, die sehr ähnlich zu
JL-5 war, ausgenommen zwei Basenunterschiede an den Positionen 270
und 279, und 8 Plaques ergaben Sequenzen mit Unklarheiten, die eine
Mischung von Virus anzeigen.
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4) Direkte Sequenzierung
viraler Plaques
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Drei
Verdünnungen
von MumpsVax, die abgeschätzt
100, 50 und 10 Viruspartikel pro 0,5 ml Teilmenge enthielten, wurden
zur Infektion konfluenter Monoschichten aus Vero-Zellen in 5 cm
Petrischalen nach Entfernung des Mediums und Waschen mit dMEM-Medium
Biorich 50:50 V/V (Biorich) ohne Serum verwendet. Man ließ das Virus
während
30 min bei 34°C
adsorbieren. Die Zellen wurden dann mit 5 ml von Überschichtungsagar
bedeckt, der auf 42°C
gehalten wurde und 2,5 ml dMEM Biorich-Medium mit 0,5 % FCS und
2,5 ml von 3%iger (G/V) Agarose mit niedriger Gelierungstemperatur
enthielt. Nach der Verfestigung wurde die Agarschicht mit 3 ml dMEM
Biorich-Medium mit 0,5 % fötalem
Kälberserum
bedeckt und bei 34°C
inkubiert. Nach 7 Tagen Inkubation wurden die viralen Plaques durch
Entfernung des oberflächlichen
flüssigen
Mediums und Zugabe von 0,03 % (G/V) Neutralrot-Lösung und Diffundieren für 1 Stunde
visualisiert. Die Flüssigkeit
und der Agar wurden dann entfernt und ein trockener Nylonfilter
auf den Boden der Schale unter Fingerdruck aufgebracht. Der Filter
wurde dann mit einigen Tropfen 2X SSC benetzt und abgehoben. Das
Virus wurde an den Filter fixiert, indem er auf Papier, das in 2X
SSC getränkt
war, für
5 min und dann auf Papier, das in 2X SSC und 0,2 % (G/V) Natriumdodecylsulfat
getränkt
war, für
30 min gegeben wurde und die Filter dann UV-Licht für 3 bis
5 Minuten ausgesetzt wurden. 20 individuelle Plaques wurden aus
den Nylonfiltern geschnitten, und das Membranstück wurde in 100 μl Wasser
getaucht, und 1 μl
RNAsin (Boehringer Mannheim, 40 Einheiten) wurde hinzugegeben, bevor
für 30
Minuten auf 65°C
erwärmt
wurde. Die 100 μl
Flüssigkeit
wurden in ein frisches Röhrchen überführt und
die Nukleinsäuren
durch Zugabe von 10 μl
3 M Natriumacetat gefolgt von 250 μl Ethanol ausgefällt. Die
Mischung wurde über
Nacht bei –20°C oder für 1 Stunde
bei –70°C vor dem
Zentrifugieren gehalten. Das Pellet wurde dann getrocknet. Das Material
wurde dann revers transkribiert, indem die folgenden Lösungen zum
Pellet gegeben wurden: 4 μl
5-fach konzentrierter reverser Transkriptasepuffer (Bethesda Research
Labs), 2 μl
0,1 M Dithiothreitol, 1 μl
einer Mischung aus Desoxynukleotidtriphosphaten (Perkin Elmer-Cetus,
10 mM Konzentration), 1 μl
N6 Zufallsprimer-Oligonukleotide
(New England Biolabs, Konzentration 100 μg pro ml) und 11 μl Wasser.
1 μl von
MMLV reverser Transkriptase wurde dann hinzugegeben und die Mischung
für 1 Stunde
bei 37°C
und dann für
5 min bei 95°C
inkubiert. Die cDNA wurde dann PCR-amplifiziert, indem 10 μl der obigen
Mischung genommen und 500 ng von jedem der Oligonukleotidprimer
NH30bis und NH31bis, PCR-Puffer und 1 μl Stoffel-DNA-Polymerase (Perkin
Elmer-Cetus, Konzentration 10 μg/μl in 100 μl Endvolumen)
hinzugegeben und die Mischung für
30 Cyclen von 1 min bei 95°C,
1 min bei 60°C
und 1 min bei 72°C
erwärmt
wurde. Das resultierende Fragment wurde unter Verwendung eines MagicPrep Kits
(Promega Biotech A7170) gemäß Herstelleranweisungen
gereinigt. Die Sequenzierung erfolgte nach einer weiteren asymmetrischen
PCR-Amplifikation unter Verwendung von entweder NH30bis oder NH31bis
als Primer und Fluordidesoxynukleotid-Terminatoren durch ein nicht-radioaktives
Verfahren an einem Applied Biosystems-Sequenzautomaten (373A) unter
Verwendung der Verfahren und Reaktanden des Lieferanten. Von den
20 Plaques aus MumpsVax wurde gefunden, daß sich 19 durch 11 aus 275
Basen von der JL-2-Sequenz von Takeuchi et al. (loc. cit.) und durch
2 Basen von der JL-5-Sequenz von Afzal et al. (loc. cit.) unterschieden.
Eine Plaque ergab eine Sequenz mit Unklarheiten. Dieses Ergebnis
legte nahe, daß MumpsVax
eine Variante oder Varianten enthalten kann, die sich in dieser
Region von dem dominanten JL-5-Stamm
unterscheiden, der von Afzal et al. gefunden wurde. Die zwei Basen,
die sich zwischen JL-5 und den sequenzierten Plaques unterscheiden,
befinden sich an den Positionen 270 und 279 und befinden sich in
der intergenischen Region zwischen den SH- und HN-codierenden Regionen.
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5) Plaque-Hybridisierung
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Zum
Versuch der direkteren Bestimmung des Verhältnisses der Varianten vom
JL-5- und JL-2-Typ in MumpsVax und abgeleiteten Kulturen wurde ein
Plaque-Hybridisierungsverfahren verwendet. Das MumpsVax-Virus und
das passagierte Virus der Charge MJ05 wurden verwendet, um Monoschichten
aus Vero-Zellen zu infizieren und Plaques zu erhalten, die dann
auf Nylon-Membranen übertragen
und die Nukleinsäuren
wie oben beschrieben fixiert wurden. Die Filter wurden für 3 Stunden
bei 65°C
in 200 ml der folgenden Lösung
vorhybridisiert: 5X SSC (SSC ist 0,15 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumcitrat,
pH 7,2), 10-fach konzentrierte Denhardts-Lösung (10-fach konzentrierte
Denhardt-Lösung
ist: 0,2 % G/V Ficoll 400, 0,2 % Rinderserumalbumin, 0,2 % Polyvinylchlorid),
0,1 % (G/V) Natriumdodecylsulfat, Lachssperma-DNA 50 μg pro ml.
Die Filter wurden dann unter vorsichtigem Bewegen für 2,5 Stunden
bei 65°C
in 50 ml einer Lösung
mit der gleichen Zusammensetzung wie oben hybridisiert und auf 65°C vorerwärmt und
unter Zugabe der radioaktiven Sondenlösung und der Sondenlösung mit
kaltem Konkurrenten. Die als variantenspezifische Sonden verwendeten
Oligonukleotide waren BC252, das mit JL-5-Varianten hybridisiert,
und BC253, das mit JL-2-Varianten hybridisiert. Die Oligonukleotide
wurden mit gamma-32P-ATP durch Kinaseeinwirkungen in einer
Lösung
der folgenden Zusammensetzung markiert: 100 ng des zu markierenden
Oligonukleotids, 3 μl
von 10-fach konzentriertem Kinasepuffer (10-fach konzentrierter
Kinasepuffer enthält:
0,5 M Tris-HCl pH 7,6, 0,1 M MgCl2, 50 mM
Dithiothreitol, 1 mM Spermidin und 1 mM EDTA pH 8,0), 3 μl 32P-ATP (Amersham International, 3000 Ci/nmol,
10 mCi/μl)
und 2 μl
T4-Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim), aufgefüllt auf
30 μl mit
sterilem Wasser. Diese Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert
und die Reaktion durch Erwärmen
für 5 Minuten
auf 95°C
beendet. Kaltes Konkurrenz-Oligonukleotid wurde dann in einem Gewichtsverhältnis von
100:1 hinzugegeben, d.h. 10 μg
kaltes Konkurrenz-Oligonukleotid
wurden auf jeweils 100 ng der markierten Sonde hinzugegeben, bevor
die Mischung zur Hybridisierungslösung gegeben wurde. Nach der
Hybridisierung wurden die Filter einmal für 30 Minuten bei 65°C in 100
ml einer Lösung
mit der gleichen Zusammensetzung wie die Hybridisierungslösung gewaschen
und dann bei 65°C
in zwei Austauschungen von 100 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung
gewaschen: SSC 5X, 0,1 % Natriumdodecylsulfat. Die Filter wurden
dann getrocknet und mit Röntgenfilm
mit einem Intensivierungsschirm in Kontakt gebracht. Als MumpsVax
durch diese Technik untersucht wurde, hybridisierte ein großer Überschuß der Plaques
mit dem Oligonukleotid BC252, das spezifisch für die JL-5-Variante ist, verglichen
mit der gefundenen Hybridisierung mit BC253. Als die Charge MJ05
untersucht wurde, hybridisierten relativ mehr Plaques mit BC253
als mit BC252, obwohl es eine etwa gleiche Anzahl von Plaques gab,
die mit beiden Sonden hybridisierten.
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6) Isolierung von reinen
Jeryl-Lynn-Isolaten
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Zur
Gewinnung reiner Isolate der JL-5- und JL-2-Varianten wurde eine
Probe des kommerziellen MumpsVax (Charge 92A06 von Merck, Sharp
und Dohme, hinterlegt bei Public Helth Laboratory Services, Porton
Down, Wiltshire, UK unter der Eingangsnummer Jeryl-Lynn Mumps Strain:
V93110585 am 5. November 1993) mit einem angegebenen Titer von 4–6 log TCID50
infektiösen
Einheiten grenzwertverdünnt
und zur Infektion von Hühner-Embryofibroblastenzellen
(CEF) in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einem abgeschätzten Inoculum
von 0,1 infektiösen
Einheiten pro Vertiefung verwendet. Die Platten wurden 11 Tage bei 34°C inkubiert,
um die Entwicklung des Virus zu erlauben. 17 Vertiefungen von insgesamt
192 geimpften zeigten eine cytopathische Wirkung, die Viruswachstum
anzeigt, und diese wurden verwendet, um weitere Kulturen von CEF-Zellen
zu impfen. Die Identität
des isolierten Virus wurde an diesem Material der zweiten Passage, das
einen Titer von ca. 4,9 log TCID50 hatte, durch Filtrieren der Viruszubereitungen
durch einen 0,8 μm-Filter, Zentrifugieren
für 1 Stunde
mit 42 000 U/min und Resuspendieren des viralen Pellets mit 100 μl H2O bestimmt. 1 μl RNase-Inhibitor (Boehringer Mannheim, 40 Einheiten
pro μl)
wurde hinzugegeben und die Mischung für 30 Minuten bei 65°C vor der
Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Na-Acetat (pH 4,5) gefolgt von 2,5 Volumina
Ethanol inkubiert. Man ließ das
Material über
Nacht bei –20°C oder für 1 Stunde
bei –70°C ausfällen, bevor
für 30 Minuten
bei 4°C
in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert und das Pellet
getrocknet wurde.
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Gewonnene
virale RNA wurde durch Zugabe von 20 μl der folgenden Mischung zum
Pellet revers transkribiert. 4 μl
von 5x Kern-RT-Puffer (Bethesda Research Labs), 2 μl von 10
nM Desoxynukleotidtriphosphat-Mischung
(Perkin Elmer, Cetus), 1 μl
Zufallsprimer N6 (Biolabs, mit 100 μg/ml), 11 μl H2O,
1 μl MMLV
reverse Transkriptase (Bethesda Research Labs). Diese Mischung wurde
für 1 Stunde
bei 37°C
gefolgt von 5 Minuten bei 95°C
inkubiert, um die reverse Transkriptase zu inhibieren. 10 μl der erwärmten Mischung
wurden dann der PCR-Amplifikation in 100 μl Endvolumen mit den Primern
NH30bis und NH31bis unter Verwendung des folgenden Erwärmungsprogramms
für 30
Cyclen unterworfen: 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 60°C, 1 Minute
bei 72°C.
Die resultierenden Fragmente wurden durch MagicPrep (Promega) gemäß dem Herstellerprotokoll
gereinigt.
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Die
sechs Isolate, die nur mit der JL-5-Sonde reagierten, wurden auf
Vero-Zellen zum Erhalt von Plaques übergeimpft. Diese wurden auf
Nylon-Membranen
abgehoben und die Membranen mit dem Oligonukleotid BC252 und mit
dem Oligonukleotid BC253 hybridisiert, die beide mit 32P
durch Kinaseeinwirkung wie zuvor beschrieben markiert waren. Die
Hybridisierung erfolgte in 5x SSC bei 65°C für 2,5 Stunden unter Verwendung
von ca. 100 ng der markierten Oligonukleotide und 10 μg von kaltem
Konkurrenzoligonukleotid in einem Volumen von 50 ml. Ca. 200 Plaques
wurden für
jedes Isolat untersucht, und keine reagierte mit der JL-2-Sonde
(Oligonukleotid BC253). Alle Plaques reagierten mit BC252.
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Ein
Virusisolat, das aus Vertiefung 9H2A der Mikrotiterplatte stammte
und weiter als SBB-Stamm JL-1 identifiziert wurde, wurde durch zwei
weitere Passagen an CEF-Zellen geführt. Nach der letzten Passage
(4 Passagen ab dem ursprünglichen
MumpsVax-Material) wurde das Virus zur Infektion von Vero-Zellen und zum Erhalt
von Plaques verwendet. Diese wurden auf Nylon-Membranen abgehoben und durch Hybridisierung
mit den Oligonukleotiden BC252 und BC253 getestet, die mit 32P durch Kinaseeinwirkung markiert worden
waren. Über
2000 Plaques wurden mit der JL-2-spezifischen Sonde BC253 getestet,
und es wurde festgestellt, daß keine
damit reagierte. Eine geringere Anzahl von Plaques wurde mit dem
Oligonukleotid BC252 getestet, und alle ergaben eine positive Reaktion.
Die Sequenzierung wurde direkt am Virusreservoir des JL-1-Stamms durchgeführt, der
in der vierten Passage an CEF-Zellen durch Zentrifugieren und Ethanolfällung des
Virus gefolgt von reverser Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern
wie oben beschrieben gewonnen wurde. Die cDNA wurde durch PCR-Reaktion
unter Verwendung der Oligonukleotide NH14 und BC265 als Primer und mit
dem folgenden Erwärmungsprogramm
amplifiziert: 1 Minute bei 94°C,
1 Minute bei 60°C,
1 Minute bei 72°C für 30 Cyclen.
Das resultierende DNA-Fragment wurde an einer MagicPrep-Säule (Promega
Biotech) gemäß den Herstelleranweisungen
gereinigt und an einem Sequenzierungsautomaten Applied Biosystems
373A gemäß den Herstelleranweisungen
und unter Verwendung der Oligonukleotide NH14, BC265, NH30bis und NH31bis
als Primer sequenziert. Die in 1 gezeigte
Sequenz wurde erhalten. Diese Sequenz unterscheidet sich überraschend
von derjenigen, die von Afzal et al. für ihr JL-5-Isolat erhalten
wurde, an sechs Positionen in der intergenischen Region zwischen
den SH- und HN-codierenden
Regionen. Das JL-1-Isolat stellt daher eine weitere Virusvariante
dar, die in der MumpsVax-Zubereitung vorhanden ist.
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Eine
zweites, als 10H5F identifiziertes Virusisolat, das ebenfalls nur
mit der Jl-5-Sonde reagierte, wurde durch Infektion von Vero-Zellen
mit Virus der zweiten Passage, Abheben einer Plaque auf eine Nylon-Membran
und Durchführen
der Sequenzierung nach PCR-Amplifikation unter Verwendung von NH14-
und BC265-Oligonukleotiden als Primer sequenziert. Dies ergab eine
Sequenz, die identisch mit derjenigen für 9H2A oben war und sich von
der veröffentlichten
JL-5-Isolat-Sequenz durch 6 Basen in der SH-HN-intergenischen Region
unterschied.
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7) Immunogenität
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Die
Immunogenität
des JL-1-Stammes aus Beispiel 6 wurde in Affen getestet. Eine als
MJ11A42 bezeichnete, lyophilisierte JL-1-Viruszubereitung in der
vierten Passage aus MumpsVax, geerntet nach 6 Tagen Wachstum bei
34°C auf
CEF-Zellen und mit einer Dosis von 4,2 log TCID50, wurde zur Immunisierung
einer Gruppe von vier afrikanischen Grünen Meerkatzen durch subkutane
Injektion verwendet. Drei weiteren Gruppen von vier Affen wurde
injiziert: (a) MumpsVax mit einer Konzentration von 4,3 log TCID50;
(b) eine lyophilisierte Zubereitung, MJ21A42, mit einer Konzentration
von 4,3 log TCID50 pro Dosis aus Virus, das nach 9 Tagen Wachstum
bei 32°C
geerntet wurde und aus drei direkten Passagen von MumpsVax an CEF-Zellen stammte; (c)
eine lyophilisierte Zubereitung, MJ05A42, mit einer Konzentration
von 4,2 TCID50 pro Dosis aus Virus, das nach 7 Tagen Wachstum bei
34°C geerntet
wurde und aus drei direkten Passagen von MumpsVax an CEF- Zellen stammte, wobei
sich die Passagen von denjenigen für die MJ21A42-Zubereitung unterschieden.
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Blutproben
wurden vor der Injektion am Tag 0 und an den Tagen 28 und 42 nach
der Impfung abgenommen und auf Gegenwart von IgG-Antikörpern gegen
das Mumpsvirus unter Verwendung des kommerziellen Enzygnost Anti-Parotitisvirus-Kits
von Behring (Behringwerke AG, Marburg, Deutschland) wie vom Hersteller
beschrieben getestet. Wie in Tabelle 1 gezeigt wird, induziert die
aus dem reinen JL-1-Stamm stammende Zubereitung einen höheren Titer
von Anti-Mumpsvirus-Antikörpern
in den Tieren als die anderen Zubereitungen, einschließlich MumpsVax.
Diese Seren wurden ebenfalls mit zweifachen Reihenverdünnungen
in einem Plaque-Reduktionstest unter Verwendung von MumpsVax als
Testvirus untersucht. Die Seren aus den Tieren, denen die Charge
MJ11A42 injiziert wurde, ergab eine höhere durchschnittliche Reduktion
der Anzahl von Plaques im Vergleich zu den anderen Seren.
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8) Klinische Untersuchungen
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Der
JL-1-Stamm wurde weiter in einem klinischen Versuch mit seronegativen
Kindern im Alter von ca. 15 Monaten getestet. Trivalente Masern-,
Mumps- und Röteln-Impfstoffe
wurden unter Verwendung entweder des reinen JL-1-Stammes als Mumpskomponente
oder mit Mumpsvirus, das aus dem direkten Passagieren von MumpsVax
an CEF-Zellen wie in Beispiel 6 oben stammte, formuliert und lyophilisiert.
Der von Merck and Co. Inc. hergestellte und von Merck Frossr Inc.
Kirkland, Quebec, Kanada erhältliche
kommerzielle M-M-R®II-Impfstoff wurde ebenfalls
im Versuch eingeschlossen. Er enthält den Jeryl-Lynn (B-Level)-Stamm
als Mumpskomponenten.
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Die
Titer des Mumpsvirus in den drei Impfstoffzubereitungen wurden als
4,5 log TCID-Dosen für
die Impfstoff-Chargennummer MJR111D42, die den reinen JL-1-Stamm
enthielt, 4,7 log TCID Dosen für
die Impfstoff-Chargennummer MJR121C42, die das passagierte MumpsVax-Virus
enthielt, und 4,5 log TCID-Dosen für die Chargennummer 80391 OU,
den kommerziellen M-M-R®II-Impfstoff, gemessen.
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Blutproben
wurden den Kindern vor der Impfung und 42 Tage nach der Impfung
abgenommen.
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Die
Gegenwart von IgG-Antikörpern
gegen das Mumpsvirus wurde unter Verwendung des gleichen, oben in
Beispiel 6 beschriebenen kommerziellen Kits getestet. Wie in Tabelle
3 gezeigt wird, induzierte der reine JL-1-Stamm MMR-Impfstoff sowohl die höchste Serokonversionsrate
als auch ergab er den höchsten
geometrischen Mittelwert des Titers der drei Zubereitungen.
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Tabelle
2 Verwendetes
Oligonukleotid
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Tabelle
3 Serokonversion
und geometrischer Mittelwert des Titers (GMT) gegenMumpsvirus in
seronegativen Patienten
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