KR100362051B1 - 제릴-린(jeryl-lynn)바이러스균주를함유하는유행성이하선염에대한백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 귀밑샘염 바이러스의 Jeryl-Lynn 균주로부터 유도된 상동 순수 분리균으로 이루어진 새로운 귀밑샘염 백신에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 백신은, 공지된 상업적 백신 보다 더 높은 혈청전환 및 항체 역가를 생성한다.

Description

제릴-린(JERYL-LYNN) 바이러스 균주를 함유하는 유행성 이하선염에 대한 백신
유행성 이하선염은 보통은 경미한 증상만을 나타내는 본질적으로 유년기 질환이다. 그러나, 특정 경우에, 유행성 이하선염 감염의 임상 결과는 심각하다. 예를 들어, 유행성 이하선염은 영국에서 15세 미만의 소아의 수막뇌염의 가장 일반적인 원인이고, 소아의 영구적 감각신경성 난청의 원인이다. 30 내지 40%의 자연적인 유행성 이하선염 감염이 무증상이라 할지라도, 침샘 병발이 불쾌할 수 있고, 성인 집단에서 유행성 이하선염이 처음 3개월 동안의 유산 및 남성의 고환염 뿐만 아니라 상기에서 지적된 신경학적 합병증을 야기할 수 있다는 사실로 인해 많은 나라에서 집단 백신접종 프로그램을 채택하게 되었다.
파라믹소비리대(Paramyxoviridae)에 속하는 유행성 이하선염 바이러스는 마이너스 센스 (minus sense)의 단일 가닥 게놈 RNA로 이루어져 있고, 유전자 순서가 3'N-P-M-F-SH-HN-L5' (N=누클레오캡시드 단백질, P=인단백질, M=매트릭스 단백질, F=융합 단백질, SH= 잠재적으로 작은 소수성 단백질로서 발현됨, HN=해마글루티닌 뉴라미니다아제, L=거대 단백질)인 대략 15.3 kb이다. 다양한 유행성 이하선염 균주 중에서도, 제릴-린(Jeryl-Lynn)(B-레벨)은 F,P,HN,M 유전자의 서열 분석에 의해 특징화된 살아있는 약독된 변종이다.
최근까지, 두 가지 유행성 이하선염 바이러스 균주가 유행성 이하선염에 대한 백신 접종에 승인되었다. 이러한 균주는 우라베 에이엠 9(Urabe Am 9) 및 제릴-린이다. 그러나, 1992년 9월에 우라베 균주는 허용될 수 없는 정도의 부작용의 발생이 보고됨에 따라 철회되었다 [European Journal of Pediatrics (1993) 152:387].
제릴-린 균주는 상표명 "멈프스 박스(Mumps Vax)"로 머크 샴(Merck Sharp) 및 도메(Dohme)에 의해 수 년간 시판되어 왔다. 제릴-린 균주는, 수정된 암탉 알내로 양막 접종함으로써 유행성 이하선염에 걸린 환자의 임상 샘플로부터 수득되었다[참고문헌: Proc. Soc. Exptl. Biol. Med.123(3)(1966)].
최근에, 영국에서 유행성 이하선염 백신에 사용되는 제릴-린 균주가 사실상 두 개의 바이러스, 즉 JL-2 및 JL-5의 혼합물임이 보고되었다[참고문헌: Afzalet al. J. of Gen. Virology 199374917].
다양한 유행성 이하선염 균주 사이에서, SH 유전자 수준에서 실질적인 누클레오티드 서열 변화가 존재할 수 있음이 보고되었다 [Takeuchiet al. Virology (1991)181p364-366].
아프잘(Afzal) 등은 현재 시판중인 백신 "멈프스 박스"가, 세포 뱅크 및 계대배양 제한 (passage limit)을 포함하면서 배치(batch)를 거칠 때마다 두 변종의 비율을 보존시키는 것으로 보이는 신중하게 제어되는 조건하에서 제조됨을 강조하였다. 그러나, 제릴-린 균주의 추가 계대배양과 관련하여, 두 변종 사이의 균형이 유지된다는 보장은 없다. 더욱이, 백신의 임의의 주어진 배치에서 두 변종의 비율을 평가하는 것은 어렵다.
본 발명자들은 놀랍게도 아프잘 등의 JL-2 및 JL-5 둘 모두와는 상이한 분리균(isolate)을 동정하였다. 상기의 차이점은 SH 유전자 및 상기 유전자를 둘러싸고 있는 영역, 더욱 상세하게는 SH 코딩 서열의 3' 및 HN 유전자의 5'의 비번역되는 시스트론 사이의 영역의 누클레오티드 서열 분석에 의해 결정되었다. 이러한 분리균은 임상 실험에서 시판되는 유행성 이하선염 백신에 비해 최고의 기하평균 역가의 유행성 이하선염 항체를 가지며, 더 높은 혈청 전환율을 유도한다.
따라서, 본 발명자들은 제 1 도에 제시되어 있는 누클레오티드 서열을 함유하는 약독된 제릴-린 유행성 이하선염 균주를 제공한다. 이러한 서열은 SH 유전자 및 HN 유전자의 N 말단을 코드화한다. 상기 균주는 본원에서 SBB JL-1으로 언급된다.
제 1 도에는 SH 유전자 코딩 및 SH-HN 유전자간 영역에 걸친 JL-1 유행성 이하선염 바이러스 분리균의 cDNA 서열이 제시되어 있다.
또한 본 발명은 실질적으로 균질한 면역원성 제릴-린 분리균을 포함하는 유행성 이하선염 백신을 제공한다.
"실질적으로 균질한"은 분리균이 상기 제시된 영역의 서열에 의해 확인된 것과는 또 다른 제릴-린 분리균에 의해 10% 넘게, 바람직하게는 5% 미만으로, 가장 바람직하게는 1% 미만으로 오염되지 않음을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 백신은 순수 균질한 제릴-린 분리균, 즉 제 1도에서 제시되는 영역과 상이한 다른 그 밖의 제릴-린 유행성 이하선염 분리균으로 오염되지 않은 분리균을 함유한다.
본 발명의 한 구체예에서, JL-2로 오염되지 않은 균질한 SBB JL-1을 포함하는 백신이 제공된다.
순수한 분리균은 서브스트레인(substrain)의 배치에 걸친 잠재적인 변이의 단점이 없고, 일정한 품질 가이드라인을 층족시킴을 보장하기가 보다 용이한 생성물을 제공해준다.
본 발명에 따른 균질한 제릴-린은 닭 배아 섬유아세포(Chick Embryo Fibroblast: CEF)상에서 시판중인 멈프스 박스를 계대배양시키고, 생성된 분리균의 제한 희석 및 검사 또는 개별적 플라크 분리에 의해 순수 배양물을 선택함에 의해 수득될 수 있다. 그 밖의 적합한 세포주는 베로(Vero) 세포 및 MRC5 세포를 포함한다. 이것은 방법이 집단내의 적은 부분의 공지된 변종 바이러스의 검출에 유용할 수 있을 필요가 있게 한다. 이러한 검사 방법은 약독된 폴리오(polio) 바이러스용으로 츄마코프(chumakov) 등의 문헌[WO 92/07958 및 PNAS 1991,88; 199 - 203]에 제안되어 있는 마프렉(Maprec) 검정, 및 바이러스 플라크의 차별적 하이브리다이제이션 및 바이러스 플라크의 시퀀싱을 포함한다.
본 발명의 백신은 유리하게는, 홍역 및/또는 풍진 감염에 대한 보호를 제공하기 위해 약독된 홍역 바이러스, 및/또는 약독된 풍진 바이러스, 이들의 치사된 형태 또는 서브유닛과 같은 그 밖의 성분들을 함유할 수 있다. 3가의 유행성 이하선염, 홍역 및 풍진 백신은 당해기술분야에 널리 공지되어 있고, 본 발명의 유행성 이하선염 분리균은 이미 시판중인 백신과 유사한 방식으로 3가의 백신으로 포뮬레이션화될 것이다. 추가적으로 또는 다른 방식으로, 본 발명의 백신은바리셀라(Varicella) (수두) 또는 조스터(Zoster) (대상포진)에 대한 보호를 제공하기 위해 살아 있는 바리셀라 조스터(Varicella Zoster) 약독된 바이러스를 함유할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 바리셀라 조스터 바이러스는 하기 문헌에 기재되어 있는 Oka 균주일 것이다 [참고 문헌: Andre F E Postgraduate MED J. (1985) 61 (Suppl. 4), 113-120 또는 Veskari T et al Acta paediatr. Scand. 80 : 1051-1057, 1991]. 바람직하게는, 본 발명의 백신은 4가일 것이고, 유행성 이하선염, 풍진, 홍역 및 수두 대상포진 바이러스에 대한 보호를 제공할 것이다.
또한 본 발명은, 예를 들어 적합한 안정제의 존재하에서 바이러스를 동결 건조시키거나 본 발명에 따른 균주를 적합한 담체 또는 보조제와 혼합시킴으로써 전체 바이러스 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 균주를 리포솜 (liposomes)내에 포뮬레이션화시키거나 담체 입자를 사용하여 포뮬레이션화시키는 것이 유리할 수 있다. 다른 방법으로 또는 추가적으로, 3 데-O-아실 모노포스포릴 리피드 A (Ribi lmmunochem) 또는 사포닌 유도체 QS21 (Cambridge Biotech)과 같은 면역자극제가 포뮬레이션내에 포함될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 사람의 유행성 이하선염 감염을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 면역학적 유효량의 본 발명에 따른 백신을 이를 필요로 하는 사람 피검자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 백신의 투여 방식은 피검자에게 면역보호량의 상기 균주 및 백신의 그 밖의 면역원성 성분을 전달시켜주는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 그러나, 상기 백신은 바람직하게는 근내 또는 심부(deep) 피하 경로를 통하여 비경구적으로투여된다. 또한 경구적 투여 또는 그 밖의 비경구적 경로, 즉, 피내, 비내 또는 정맥내와 같은 그밖의 투여 방식이 요망되는 경우 사용될 수 있다.
이러한 백신의 적합한 면역보호적이면서 비독성인 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 즉, 본 발명의 백신내에 함유되어 있는 본 발명의 균주의 적절한 면역보호적이면서 비독성인 양은 통상의 전체 바이러스 백신내의 항원의 유효량의 범위일 수 있다. 그러나, 임의의 특정한 환자에 대한 특정한 투여 수준은 연령, 전반적인 건강 상태, 성별 및 환자의 규정식; 투여 횟수; 투여 경로; 투여받고 있는 다른 약제와의 상승 효과; 및 요구되는 보호 정도를 포함하여 여러 가지 인자에 의존적일 것으로 이해될 것이다. 물론, 투여는, 필요에 따라, 적합한 간격으로 반복될 수 있다. 통상적으로 1가 제공의 경우, 바이러스는 용량 당 최소한 3.7 log TC1D50, 더욱 일반적으로 4.5 log TC1D50으로 존재할 것이다. 3가의 유행성 이하선염, 홍역, 풍진 백신에서, 유행성 이하선염 성분은 다른 두 가지 바이러스 성분의 간섭을 상쇄하도록 약 4.8 log TC1D50으로 존재할 것이다.
실시예
1) SH 유전자의 최초 시퀀싱
시판중인 멈프스 박스 바이러스를 접종원으로서 약 3.0 log TCID50으로 사용하여 O.5 % 우태아 혈청을 함유하는 dMEM 바이오리치(Biorich) 배지 (50/50 v/v)가 들어있는 25 cm2플라스크에서 성장하는 Vero 세포의 컨플루언트(confluent) 단층상에서 계대배양시켰다. 감염된 세포를 34℃에서 7일간 인큐베이션 후 회수하고, 페레및 가르두노(Garduno)의 방법[참고문헌: Nucleic Acids Research 1989, 17; 2141]에 의해 100℃에서 5분 동안 디에틸피로카보네이트로 처리된 물 100 mcl 내로 RNA를 추출하였다. 상기 추출물 5 mcl을 하기 시약을 첨가시킴으로써 역전사시켰다: RNAsin 40 유니트(독일의 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)), 5배 농축된 역전사효소 완충액 (Bethesda Research Labs) 4 mcl,10 mM에서의 4개의 데옥시누클레오티드 트리포스페이트 혼합물 2 mcl, NH2 올리고누클레오티드 프라이머 10 pmole, 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV) 역전사 효소 1mcl (Bethesda Research Labs, 200 유니트/mcl) 및 최종 부피가 20 mc1이 되도록 해주는 물. 올리고누클레오티드 NH2는 유행성 이하선염 바이러스의 우라베 균주의 F 유전자와 상동성을 지닌다. 상기 혼합물을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션시킨 후, 95℃에서 5분 동안 가열하였다. 그후 cDNA를 프라이머로서 올리고누클레오티드 NH14 및 NH8을 사용하고, 제 2 라운드를 위한 개시 물질로서 제 1 라운드 반응물의 1OOO 배 희석물 1 mcl을 사용하는 연속 2 라운드의 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 각각의 PCR 라운드는 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 72℃에서 1분 가열하는 25 사이클로 이루어진다. SH 유전자에 해당하는 PCR 생성물을, 프라이머로서 NH14 또는 NH8 및 플루오로디데옥시누클레오티드 터미네이터의 존재하에서 추가 PCR 증폭시키고 공급업자 프로토콜 및 권고에 따른 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 자동 (373A DNA 시퀀서) 시퀀서 (sequencer)로 생성물을 분석한 후 양 방향으로 시퀀싱하였다. 서열의 여러 위치에서 암비규티(ambiguity)가 관찰되었고, 양 가닥에서 확인되었다. 수득된 서열은, 지정되지 않은 4 개의 염기를 포함한 361 개의 염기 중17 개의 염기에서 제릴-린에 대한 타케우키(Takeuchi) 등의 서열[참고문헌: Virology 1991, 181; 364 - 366]과 달랐다. 또한, 상기 서열은, 지정되지 않은 4 개의 염기를 포함한 319 개의 염기 중 9 개의 염기에 의해 JL-5 분리균에 대해 아프잘 등에 의해 수득된 서열[참고문헌: J. Gen Virol. 1993, 74; 917-920]과 달랐다. 동일한 영역을, Vero 세포에서의 사전 계대배양 없이 한외원심분리에 의해 회수된 4.0 내지 5.0 log TCID50 Mumps Vax 바이러스로부터 직접 시퀀싱한 경우 및 랜덤 프라이머를 사용하여 바이러스 RNA를 cDNA로 역전사시킨 후 프라이머로서 올리고 누클레오티드 NH30bis 및 NH31bis로 PCR 증폭시킨 후, 암비규티가 또한 관찰되었다.
2) SH 유전자의 클로닝
멈프스 박스 바이러스를 사용하여 Vero 세포를 감염시키고, 전체 RNA를 상기한 바와 같이 준비하였다. RNA를 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사시키고, 프라이머로서 올리고누클레오티드 NH22 및 NH23을 사용하여 PCR 증폭시켰다. (NH22는 프라이머내에 Hindlll 제한 부위를 함유하고 NH23은 프라이머내에 BamHl 제한 부위를 함유하여, 증폭된 DNA 단편의 클로닝을 용이하게 한다). 증폭된 DNA를 Hindlll 및 BamHl 엔도누클레아제로 제한시키고, 벡터 pUC9 내로 클로닝시켰다. 유행성 이하선염 SH 유전자 영역에 해당하는 삽입물을 함유하는 11개의 클론을 회수하였다. 11 개 클론 모두 타케우키 등 (인용문중에)의 서열에 상응하는 서열을 함유하였다. 또한, 5개의 클론은 Ddel 제한 부위를 함유하였지만, 나머지 6 개의 클론은 Ddel 제한 부위를 함유하지 않았다. JL-5 서열에 상응하는 어떠한 삽입물도 회수되지 않았다. 이러한 결과 및 시퀀싱 암비규티는 아프잘 등에 의해 규정된 JL-2 변종 바이러스가 멈프스 박스 바이러스의 상당한 부분 또는 쉽게 검출가능한 부분을 형성함을 제시해주었다.
3) 멈프스 박스로부터의 직접 계대배양
멈프스 박스 바이러스를 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 직접 계대배양시켰다. 세 번째 계대배양에서 동물 주입을 위한 동결 건조된 샘플 MJ05A42를 제조하는데 사용되는 롯(lot) MJ05를 포함하는 5개의 상이한 롯으로부터 바이러스를 회수하였다. 5개의 바이러스 제조물을 사용하여 Vero 세포를 감염시키고, RNA를 회수하고, 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사효소반응을 프라이밍하는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 같이 프라이머 NH8 및 NH14 테이블을 사용하여 증폭시킴으로써 DNA 시퀀싱을 위해 준비하였다. 바이러스의 모든 5 개의 롯은 JL-2 (타케우키 등)와 동일한 서열을 나타내었고, 암비규티는 없었다.
이것을 추가로 조사하기 위해, 바이러스 플라크상에서의 직접 시퀀싱 방법을 상기 기술된 바와 같이 사용하였다. 5개의 롯을 사용하여 베로 세포 배양물을 감염시키고, 프라이머로서 NH30bis 및 NH31bis를 사용하여 시퀀싱을 위해 처리된 플라크를 수득하였다. 5 개의 롯에 대하여 시험된 전체 26개 플라크 중에서, 13개의 플라크가 JL-2 서열에 대한 타케우키 등과 동일한 서열을 나타내었고, 5개의 플라크는 제 2 도에 제시된 바와 같이 위치 270 및 279에서의 2개의 염기 차이를 제외하고는, JL-5와 매우 유사한 서열을 나타내었고, 8개의 플라크는 바이러스 혼합물을 나타내는 암비규티를 지닌 서열을 나타내었다.
4) 바이러스 플라크의 직접 시퀀싱
배지를 제거하고 혈청이 없는 dMEM 바이오리치 50:50 v/v 배지(Biorich)로 세척한 후, 0.5 ml 분취액 당 대략 100, 50 및 10 개의 바이러스 입자를 함유하는 멈프스 박스의 3가지 희석액을 사용하여 5cm 페트리 디쉬내의 Vero 세포의 컨플루언트 단층을 감염시켰다. 바이러스를 34 ℃에서 30 분 동안 흡착되도록 하였다. 그 후, 상기 세포를, O.5 % FCS를 갖는 2.5 ml의 dMEM 바이오리치 배지 및 2.5 ml의 3 % (w/v) 낮은 겔화 온도 아가로오스를 함유하고 42℃에서 유지된 오버레이 (overlay) 아가 5 ml로 덮었다. 고화시킨 후, 아가 층을 0.5 % 우태아 혈청을 갖는 dMEM 바이오리치 배지 3 ml로 덮고, 34℃에서 인큐베이션시켰다. 7일 동안 인큐베이션시킨 후, 표면의 액체 배지를 제거하고, 0.03 % (w/v) 중성의 적색 용액을 첨가하고, 1 시간 동안 확산시킴으로써 바이러스 플라크를 가시화시켰다. 그 후 상기 액체 및 아가를 제거하고, 건조 나일론 필터를 손가락으로 눌러서 디쉬의 바닥에 부착하였다. 그후, 2X SSC 몇 방울로 필터를 적신후, 떼어 내었다. 필터를 2X SSC로 적신 종이에 5분간 두고, 2X SSC, 0.2% (w/v) 나트륨 도데실 술페이트로 적신 종이에 30분간 둔후, 3 내지 5 분 동안 UV 광에 필터를 노출시킴으로써 바이러스를 필터에 고정시켰다. 각각의 20개의 플라크를 나일론 필터로부터 절단해내고, 막의 조각을 물 1OO mcl에 침지시키고, RNAsin (뵈링거 만하임, 40 유니트) 1 mcl을 첨가한 후, 30분 동안 65℃에서 가열하였다. 상기 액체 100 mcl을 새 튜브로 옮기고, 10mcl의 3 M 아세트산 나트륨 및 이어서 250 mcl의 에탄올을 첨가시킴으로써 핵산을 침전시켰다. 상기 혼합물을 -20℃에서 하룻밤 정치시키거나 -70℃에서 1시간 정치시킨후, 원심분리시켰다. 그후 펠릿을 건조시켰다. 그후 상기 물질을 펠릿에 하기 용액을 첨가시킴으로써 역전사시켰다: 4 mc1 5X 농축된 역전사 효소 완충액 (Bethesda Research Labs), 2 mcl의 0.1 M 디티오트레이티올, 데옥시누클레오티드 트리포스페이트의 혼합물 (퍼킨 엘머-세투스(Perkin Elmer-Cetus), 1O mM 농도) 1 mcl, N6 랜덤 프라이머 올리고누클레오티드 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 농도 1OO mcg/ml) 1mcl 및 물 11 mcl. 그후 MMLV 역전사 효소 1 mcl을 첨가시키고, 상기 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 95℃에서 5 분 동안 인큐베이션시켰다. 그후 상기 혼합물 1O mcl을 취하고, 각각의 올리고누클레오티드 프라이머 NH30bis 및 NH31bis 500ng, PCR 완충액 및 1 mcl의 스토펠(Stoffel) DNA 폴리머라아제(퍼킨 엘머-세투스, 100 mcl 최종 부피에 10ug mcl 농도)를 첨가시키고, 상기 혼합물을 95℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 30 사이클 동안 가열시킴으로써 cDNA를 PCR 증폭시켰다. 생성된 단편을 공급업자의 지시에 따라 매직프렙 키트(MagicPrep kit)(프로메가 바이오테크(Promega Biotech) A7170)을 사용하여 정제시켰다. 공급업자의 방법 및 반응물을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈(373A) 자동 시퀀서로 비방사활성 방법에 의해 플루오로디데옥시누클레오티드 터미네이터 및 프라이머로서의 NH30bis 또는 NH31bis를 사용하는 추가의 비대칭 PCR 증폭 후에 시퀀싱을 수행하였다. 멈프스 박스로부터의 20 개의 플라크 중에서, 19개의 플라크가 타케우키 등 (인용문중에서)의 JL-2 서열과 275개의 염기 중 11개의 염기가 다르고, 아프잘 등 (인용문중에서)의 JL-5 서열과는 2개의 염기가 다른 것으로 밝혀졌다. 1개의 플라크는 암비규티를 갖는 서열을나타내었다. 이러한 결과는, 멈프스 박스가 아프잘 등에 의해 발견된 우세한 JL-5 균주와 이러한 영역이 상이한 변종(들)을 함유할 수 있음을 제시해주었다. JL-5와 시퀀싱된 플라크 사이에 차이가 나는 두 개의 염기는 위치 270 및 279에 있으며, SH 및 HN 코딩 영역 사이의 유전자간 영역에 위치한다.
5) 플라크 하이브리다이제이션
멈프스 박스 및 유도체 배양물 중의 JL-5 및 JL-2 타입 변종의 비율을 더욱 직접적으로 결정하기 위해, 플라크 하이브리다이제이션 방법을 사용하였다. 멈프스 박스 바이러스 및 롯 MJO5의 계대배양된 바이러스를 사용하여 Vero 세포 단층을 감염시키고, 플라크를 수득한 후, 나일론 막상에 옮기고, 상기한 바와 같이 핵산을 고정시켰다. 필터를 하기 용액 200 ml중에서 65℃에서 3시간 동안 예비 하이브리다이징시켰다: 5X SSC (SSC는 pH 7.2의 0.15 M 염화 나트륨 0.01 M 시트르산 나트륨이다), 10배 농축된 덴하르츠(Denhardts) 용액 (10배 농축된 덴하르츠 용액: 0.2 % w/v 피콜(Ficoll) 400, 0.2 % 우혈청 알부민, 0.2 % 폴리비닐 클로라이드), 0.1 % (w/v) 나트륨 도데실 술페이트, 연어 정자 DNA 50 mcg/ml. 그후, 상기 필터를 상기와 동일한 조성물이 함유되고 65℃로 예열된 용액 50 ml중에서 65℃에서 2.5시간 동안 천천히 교반시키고 방사성 프로브 및 차가운 경쟁 프로브 용액을 첨가하면서 하이브리다이징시켰다. 변종 특이적 프로브로서 사용된 올리고 누클레오티드는 JL-5 변종과 하이브리다이징되는 BC252 및 JL-2 변종과 하이브리다이징되는 BC253이었다. 올리고누클레오티드를 하기 조성의 용액 중에서 키네이션 (kination)에 의해감마32P-ATP로 표지시켰다: 표지시키려는 올리고누클레오티드 100 ng, 10배 농축된 키나아제 완충액 3 mcl (10배 농축된 키나아제 완충액은 0.5M 트리스-HCl pH 7.6, 0.1 M MgCl2, 50 mM 디티오트레이톨, 1 mM 스페르미딘 (spermidin) 및 1 mM EDTA pH 8.0을 함유한다), 3 mcl의32P-ATP (Amersham International, 300O Ci/nmole, 10 mCl/mcl) 및 2 mcl의 T4 폴리누클레오티드 키나아제 (뵈링거 만하임), 30mcl이 되게 하는 멸균수. 상기 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션시키고, 95℃에서 5 분 동안 가열시킴으로써 반응을 중지시켰다. 그후 차가운 경쟁 올리고누클레오티드를 100 대 1의 비 (w/v)로 첨가하였는데, 즉, 표지된 프로브 1OO ng 마다 1O mcg의 차가운 경쟁 올리고누클레오티드를 첨가한 후, 상기 혼합물을 하이브리다이제이션 용액에 첨가하였다. 하이브리다이제이션 후, 필터를 하이브리다이제이션 용액과 동일한 조성을 지닌 용액 100 ml로 65℃에서 30분 동안 1회 세척한 후, 65℃에서 하기 조성의 용액 100 ml로 두 번 바꾸어 가며 세척하였다: SSC 5X, 0.1 % 나트륨 도데실 술페이트. 그후 상기 필터를 건조시키고, 증감지를 지닌 X-레이 필름에 노출시켰다. 멈프스 박스를 이러한 기술에 의해 검사하였을 때, BC253과 관련하여 발견되는 하이브리다이제이션과 비교하여, 상당히 과량의 플라크가 JL-5 변종에 대해 특이적인 올리고누클레오티드 BC252와 하이브리다이제이션되었다. 롯 MJ05를 검사했을 때, 두 프로브에 하이브리다이징된 플라크의 수가 거의 동일하였더라도, BC252 보다 BC253에 비교적 더 많은 플라크가 하이브리다이제이션되었다.
6) 순수 제릴-린 분리균의 분리
JL-5 및 JL-2 변종의 순수한 분리균을 회수하기 위해, 4 내지 6 log TCID50 감염 유니트의 지정된 역가의 시판중인 멈프스 박스 (1993년 11월 5일에 영국 윌트셔 포톤 다운에 소재하는 퍼블릭 헬스 래버러토리 서비스즈 (Public Health Laboratory Services)에 수탁번호 제릴-린 유행성 이하선염 균주 V93110585로 기탁된, 머크 샤프(Merch Sharp) 및 도메(Dohme)로부터의 롯 92A06의 샘플을 제한 희석시키고, 이를 사용하여 웰 딩 0.1 감염 유니트의 추정 접종원으로 96 웰 마이크로역가판에서 닭 배아 섬유아세포를 감염시켰다. 플레이트를 34℃에서 11 일 동안 인큐베이션시켜서, 바이러스를 성장시켰다. 접종된 전체 192 개의 웰 중 17 개가 바이러스 성장을 나타내는 시포변성 효과를 나타냈으며, 이들을 사용하여 CEF 세포의 추가 배양물을 접종하였다. 상기 바이러스 제조물을 0.8 ㎛ 필터를 통하여 여과시키고, 42,O0O rpm에서 1 시간 동안 원심분리시키고, 10O mcl H2O로 바이러스 펠릿을 재현탁시킴으로써, 약 4.9 log TCID50의 역가를 지니는 이러한 두 번째 계대배양 물질로 분리된 바이러스의 동일성을 측정하였다. RNase 억제제 (뵈링거 만하임, 40 유니트/mcl) 1 mcl을 첨가시키고, 상기 혼합물을 65℃에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 후, 1/10 부피 3 M 아세트산 나트륨 (pH 4.5) 및 이어서 2.5 부피의 에탄올을 첨가하였다. 상기 물질을 -20℃에서 하룻밤 침전시키거나 -70℃에서 1 시간 동안 침전시킨 후, 에펜도르프 벤치-탑(Eppendorf bench-top) 원심분리기에서 4℃ 하에 30 분 동안 원심분리시키고, 펠릿을 건조시켰다.
펠릿에 하기 혼합물 20 mcl을 첨가시킴으로써 회수된 바이러스 RNA를 역전사시켰다. 4 mcl의 5x 코아 RT 완충액 (Bethesda Research Labs), 2 mcl의 10 nM 데옥시누클레오티드 트리포스페이트 혼합물 (Perkin Elmer, Cetus), 1 mcl의 랜덤 프라이머 N6 (Biolabs, 100 mcg/ML), 11 mcl의 H20, 1 mcl의 MMLV 역전사 효소 (Bethesda Research Labs). 상기 혼합물을 37℃에서 1 시간, 이어서 95℃에서 5 분 동안 인큐베이션시켜서, 역전사 효소를 억제시켰다. 그후 10 mcl의 가열된 혼합물을 95℃에서 1 분, 60℃에서 1 분, 72℃에서 1분의 가열 프로그램을 30 사이클 동안 사용하여 프라이머 NH30bis 및 NH31bis로 최종 부피 100 mcl로 PCR 증폭시켰다. 생성된 단편을 제조업자의 프로토콜에 따라 매직 프렙(Promega)에 의해 정제시켰다.
JL-5 프로브와만 반응하는 6개의 분리균을 Vero 세포상에 접종시켜 플라크를 수득하였다. 이것을 나일론 막상에 옮기고, 막을 상기된 바와 같이 키네이션에 의해32P로 표지된 올리고누클레오티드 BC252 및 올리고누클레오티드 BC253과 하이브리다이징시켰다. 50ml 부피의 차가운 경쟁 올리고누클레오티드 1O mcg 및 표지된 올리고누클레오티드 약 1OO ng을 사용하여 65℃에서 2.5시간 동안 5x SSC 중에서 하이브리다이제이션을 수행하였다. 각각의 분리균에 대하여 약 200 개의 플라크를 시험하였고, 어느 것도 JL-2 프로브 (올리고누클레오티드 BC253)와 반응하지 않았다. 모든 플라크는 BC252와 반응하였다.
마이크로역가 플레이트의 웰 9H2A로부터 유래되고, SBB 균주 JL-1으로서 추가 확인된 하나의 바이러스 분리균을 CEF 세포상에서 2회 더 계대배양하여 취했다.마지막 계대배양(본래의 멈프스 박스 물질로부터의 4회 계대배양) 후, 상기 바이러스를 사용하여 Vero 세포를 감염시키고, 플라크를 수득하였다. 이것을 나일론 막 상에 옮기고, 키네이션에 의해32P로 표지된 올리고누클레오티드 BC252 및 BC253과의 하이브리다이징에 의해 시험하였다. 2000개가 넘는 플라크를 JL-2 특이적 프로브 BC253으로 시험하였으나, 어느 것도 이것과 반응하는 것으로 나타나지 않았다. 더 적은 수의 플라크를 올리고누클레오티드 BC252로 시험하였는데, 모두 포지티브 반응을 나타내었다. 바이러스를 원심분리하고, 에탄올 침전시킨 후, 상기 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사시킴으로써 CEF 세포상에서의 4회째 계대배양에서 회수된 JL-1 균주의 바이러스 푸울(pool) 상에서 직접 시퀀싱을 수행하였다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 NH14 및 BC265를 사용하고 하기 가열 프로그램을 이용하는 PCR 반응에 의해 상기 cDNA를 증폭시켰다: 94℃에서 1 분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분, 30 사이클. 생성된 DNA 단편을 공급업자의 지시에 따라 매직프렙 칼럼 (Promega Biotech) 상에서 정제시키고, 프라이머로서 올리고누클레오티드 NH14, BC 265, NH 30bis 및 NH31bis를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템즈 373A 자동 시퀀서로 시퀀싱하였다. 제 1 도에 제시된 서열을 수득하였다. 이러한 서열은 놀랍게도 제 2 도에 제시된 바와 같이 SH 및 HN 코딩 영역 사이의 유전자간 영역의 6개 위치에서 JL-5 분리균에 대한 아프잘 등에 의해 수득된 서열과 달랐다. 따라서, JL-1 분리균은 멈프스 박스 제조물에 존재하는 또 다른 변종 바이러스를 나타낸다.
또한 JL-5 프로브와만 반응하는 10H5F로 확인된 두 번째 바이러스 분리균을, 계대배양 2회 바이러스로 Vero 세포를 감염시키고, 플라크를 나일론 막으로 옮기고, 프라이머로서 NH14 및 BC265 올리고누클레오티드를 사용하여 PCR 증폭시킨 후 시퀀싱을 수행함으로써 시퀀싱하였다. 이렇게 하여 상기 9H2A와 동일하고, 발표된 JL-5 분리균 서열과는 SH-HN 유전자간 영역의 6개 염기가 상이한 서열이 수득되었다.
7) 면역원성
실시예 6으로부터의 JL-1 균주의 면역원성을 원숭이에서 시험하였다. 멈프스 박스로부터의 4회째 계대배양이고 4.2 log TCID50의 용량으로 CEF 세포상에서 34℃에서 6일 동안 성장시킨 후 수집한, MJ11A42라 불리는 동결 건조된 JL-1 바이러스 제조물을 사용하여 피하 주사에 의해 4마리의 아프리카 사바나(Green) 원숭이의 그룹을 면역시켰다. 4 마리 원숭이 중 추가 3마리의 그룹에게 (a) 4.3 log TCID50의 농도에서의 멈프스 박스; (b) 32℃에서 9일간 성장시킨 후 수집되고 CEF 세포상에서의 멈프스 박스의 3회의 직접적 계대배양으로부터 유래된 바이러스로부터 용량 당 4.3 log TCID50의 농도의 동결 건조된 제조물, MJ21A42;(c) 34℃에서 7일간 성장시킨 후 수집되고 CEF 세포상에서의 멈프스 박스의 3회의 직접적 계대배양(계대배양이 MJ21A42 제조물과는 상이함)으로부터 유래된 바이러스로부터 용량 당 4.2 log TCID50의 농도의 동결 건조된 제조물, MJ05A42를 주사하였다.
백신접종 후 0일, 28일 및 42일째에 주입 전에 혈액 샘플을 취하고, 공급업자에 의해 기술된 바와 같이 뵈링(Behringwerke AG, Marburg, Germany)로부터 시판되는 엔지그노스트 안티-파로티티스 바이러스 키트(Enzygnost Anti-Parotitis Virus kit)를 사용하여 유행성 이하선염 바이러스에 대한 lgG 항체의 존재에 대하여 시험하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 순수한 JL-1 균주로부터 유래된 제조물은 Mumps Vax를 포함하는 다른 제조물 보다 동물에게서 더 높은 역가의 항-유행성 이하선염 바이러스 항체를 유도하였다. 또한, 이러한 혈청을 시험 바이러스로서 멈프스 박스를 사용하여 플라크 감소 검정에서 2배 연속 희석물로 시험하였다. 롯 MJ11A42가 주사된 동물로부터의 혈청은 다른 혈청과 비교하여 플라크 수에 있어서 평균 감소치가 컸다.
8) 임상 연구
JL-1 균주를 15개월 된 혈청 반응 음성인 소아에게 임상시험을 수행하였다. 3가의 홍역, 유행성 이하선염 및 풍진 백신을, 유행성 이하선염 성분으로서 순수한 JL-1 균주를 사용하거나 상기 실시예 6에서와 같이 CEF 세포상에서 멈프스 박스를 직접 계대배양시킴으로써 유래된 유행성 이하선염 바이러스를 사용하여 포뮬레이션화시키고, 동결건조시켰다. 또한 머크 앤드 코 인코포레이티드(Merck and Co Inc)에 의해 생산되고, 캐나다 퀴벡 커클랜드에 소재하는 머크 프로스르 인코포레이티드(Merck Frossr Inc)로부터 입수할 수 있는 시판되는 M-M-R?II 백신을 시험에 포함시켰으며; 이것은 유행성 이하선염 성분으로서 제릴-린 (B-레벨) 균주를 함유한다.
3 개의 백신 제조물에서의 유행성 이하선염 바이러스의 역가는 순수 JL-1 균주를 함유하는 백신 롯 번호 MJR111D42에 대하여 4.5 log TCID 용량, 계대배양된 멈프스 박스 바이러스를 함유하는 백신 롯 번호 MJR121C42에 대하여 4.7 log TCID 용량 및 M·M-R?II 백신으로 시판되는 롯 번호 80391 OU에 대하여 4.5 log TCID 용량으로서 측정되었다.
혈액 샘플을 백신 접종전 및 백신 접종후 42일째에 소아로부터 취하였다.
유행성 이하선염 바이러스에 대한 lgG 항체의 존재를 실시예 6에 기술된 시판되는 키트를 사용하여 시험하였다. 표 3에 기재된 바와 같이, 순수한 JL-1 균주 MMR 백신은 최고 혈청 전환율을 유도하면서 3가지 제조물중 가장 높은 기하 평균 역가를 나타냈다.
표 1
표 2
표 3
혈청 반응 음성 피검자내에서 유행성 이하선염 바이러스에 대한 혈청전환 및 기하 평균 역가(GMT)
[서열표]
(1) 일반적 사항
(i) 출원인 : 스미스클라인 비이참 바이올로지칼즈 에스.에이.
(ii) 발명의 명칭 : 백신
(iii) 서열의 수 : 13
(iv) 해당 주소 :
(A) 주소 : 스미스클라인 비이참
코포레이트 인틸렉추얼 프로퍼티
(B) 거리 : 에스비 하우스 엘/5 그레이트 웨스트 로드
(C) 도시 : 브렌트포드
(D) 주 : 미들섹스
(E) 나라 : 영국
(F) 우편 번호 : 티더불유8 9비디
(v) 컴퓨터 판독형태
(A)매체 유형 : 플로피디스크
(B)컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C)작업 시스템 : PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어 : Patentln Release #1.0 버젼 #1.25
(vi) 현재 출원상황 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 대리인/변리사 상황 :
(A) 성명 : 달톤, 마르커스 제이더불유
(ix) 통신처 :
(A) 전화 : 44 181 975 4093
(B) 팩스 : 44 181 975 3688
(2) 서열번호 1에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 393 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : 유행성 이하선염 바이러스
(B) 균주 : 제릴-린(Jeryl-lynn) - 1
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 1 :
(2) 서열번호 2에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 15 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(iii) 추정 서열 : 아니오
(iv) 안티센스 : 아니오
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : nh2
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 2 :
GTAGCACTGG ATGGA 15
(2) 서열번호 3에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 20 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH8
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 3 :
TCTGTGTTGT ATTGTGATCC 20
(2) 서열번호 4에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 21 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH14
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 4 :
GTCGATGATC TCATCAGGTA C 21
(2) 서열번호 5에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 33 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH22
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 5 :
CGGTAGAAGC TTGTCGATGA TCTCATCAGG TAC 33
(2) 서열번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 32 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH23
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 6 :
CGCTGAGGAT CCTCTGTGTT GTATTGTGAT CC 32
(2) 서열번호 7에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 18 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH30
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 7 :
ATCTCCTAGG GTCGTAAC 18
(2) 서열번호 8에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 18 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH31
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 8 :
TTTGGATGCA GCTTGTTC 18
(2) 서열번호 9에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 28 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : NH30BIS
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 9 :
AATCTCCTAG GGTCGTAACG TCTCGTGA 28
(2) 서열번호 10에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 24 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원:
(A) 유기체 : NH31BIS
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 10 :
TTTGAATGCA GCTTGTTCTA GCGT 24
(2) 서열번호 11에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 29 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : BC265
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 11 :
CCGACATTAT GAATAGTTTC GAGGGCTCC 29
(2) 서열번호 12에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 31 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : bc252
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 12 :
ATATCGCACC GCCGTCTTAT AGTTAATAGT C 31
(2) 서열번호 13에 대한 사항 :
(i) 서열의 특성 :
(A) 서열의 길이 : 31 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 형태 : 선형
(ii) 서열의 종류 : DNA (게놈)
(vi) 기원 :
(A) 유기체 : Bc253
(xi) 서열 설명: 서열 번호 : 13 :
ATACCGAACC GCCGTATTAT GGTTAATGGT C 31

Claims (8)

  1. SH 유전자 및 HN 유전자의 N 말단이 제 1도에 기재된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약독된 제릴-린(Jeryl-Lynn) 유행성 이하선염 바이러스 균주.
  2. 제 1항의 제릴-린 분리균인 균질한 면역원성 제릴-린 분리균을 포함하는 유행성 이하선염 백신.
  3. 제 1항에 따른 균질한 면역원성 제릴-린 분리균과, 약독된 홍역 바이러스, 약독된 풍진 바이러스, 치사된 홍역 또는 풍진 바이러스, 또는 이들 바이러스의 서브유닛 중 하나 이상을 포함하는 혼합 백신.
  4. 제 2항 또는 3항에 있어서, 수두 또는 대상포진 감염에 대한 보호용 작용제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  5. 수탁번호 V93110585호의 모든 특징을 포함하는 제릴-린 제조물을 적합한 세포주 상에서 계대배양하고,
    제한 희석 단계(a) 또는 개별적인 플라크 분리 단계(b)를 사용하여 순수한 배양물을 선택하는 것을 포함하여, 제 1항에 따른 균질한 면역원성 제릴-린 분리균을 생성시키는 방법.
  6. 제 2항 또는 제 3항에 따른 유효량의 백신을 사람 이외의 포유 동물에 투여하는 것을 포함하여, 유행성 이하선염 감염에 걸리기 쉬운 사람 이외의 포유 동물에게서 면역성을 유도하는 방법.
  7. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 유행성 이하선염 감염에 걸리기 쉬운 포유 동물에게서 면역성을 유도함을 특징으로 하는 백신.
  8. 제 4항에 있어서, 유행성 이하선염 감염에 걸리기 쉬운 포유 동물에게서 면역성을 유도함을 특징으로 하는 백신.
KR1019960702618A 1993-11-19 1994-11-15 제릴-린(jeryl-lynn)바이러스균주를함유하는유행성이하선염에대한백신 KR100362051B1 (ko)

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GB9323820.2 1993-11-19
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GB9406480.5 1994-03-31

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CA (1) CA2176929C (ko)
CY (2) CY2540B1 (ko)
DE (3) DE69433760T2 (ko)
DK (1) DK0729509T3 (ko)
ES (1) ES2219658T3 (ko)
HK (1) HK1012421A1 (ko)
LU (1) LU91458I2 (ko)
NL (1) NL300336I2 (ko)
NZ (1) NZ276102A (ko)
PT (1) PT729509E (ko)
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WO (1) WO1995014083A1 (ko)

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