CN107667175A

CN107667175A - 基于重组腮腺炎病毒jeryl lynn 2的疫苗

Info

Publication number: CN107667175A
Application number: CN201680024849.XA
Authority: CN
Inventors: 赖因哈德·格吕克; 维维亚娜·詹尼诺; 戈拉夫·古普塔
Original assignee: Cadila Healthcare Ltd
Current assignee: Zydus Lifesciences Ltd
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-28
Publication date: 2018-02-06
Also published as: HUE047571T2; EP3274447B1; PL3274447T3; CA2980847C; KR101970428B1; AU2016242460A1; SG11201707904XA; WO2016157208A1; JP2020074792A; AR104271A1; SI3274447T1; EP3274447A1; LT3274447T; RS59774B1; CA2980847A1; DK3274447T3; PT3274447T; MX2017012389A; JP2018510642A; ES2764677T3

Abstract

本发明提供了由高度免疫原性rMuV^JL2构成的针对腮腺炎的新疫苗(基于重组腮腺炎病毒Jeryl Lynn2)。此外，在本发明中描述了开发所述免疫原性组合物的方法。根据本发明的疫苗是安全的、成本效益好的、高度有效的并且在生产率方面稳定且一致的。

Description

基于重组腮腺炎病毒JERYL LYNN 2的疫苗

技术领域

背景技术

腮腺炎是特征在于发热和腮腺肿胀的急性病毒性疾病，其通常影响幼儿并可导致并发症例如睾丸炎、卵巢炎、胰腺炎和脑膜脑炎。然而，约一半受感染的个体发生典型的疾病。腮腺炎病毒(Mumps virus，MuV)是副黏病毒科(paramyxoviridae family)、副黏病毒亚科(subfamily Paramyxovirinae)和腮腺炎病毒属(genus Rubulavirus)的成员，其仅感染人[Hviid等，2008]。MuV具有由15,384个核苷酸组成的单链负义RNA基因组。该基因组编码两种表面糖蛋白：融合(F)和血细胞凝集素-神经氨酸酶(HN)；四种核心蛋白：核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)和大蛋白(L)以及膜相关的小疏水(SH)蛋白。

在历史上，认为腮腺炎是儿童疾病，但在过去二十年中，在常规使用腮腺炎免疫接种的国家中它已经影响到大龄儿童和成年人。尽管疫苗接种覆盖率很高，但在包括美国、英国、加拿大、摩尔多瓦共和国和荷兰的多个国家中已报道了腮腺炎的再度出现[Bernard等，2008；Brockhoff等，2010；CDC，2010；Whelan等，2010；Yung等，2010]。在印度，可获得的有关腮腺炎流行病学、其发病率和抗体普及率(antibody prevalence)的数据很少。已报道，来自喀拉拉邦和马哈拉施特拉邦(States of Kerala and Maharashtra)的几起腮腺炎暴发[Geeta和Kumar，2004；John，2004；Ghatage和Kakade，2007]。对12个月龄或月龄更大的儿童给予腮腺炎疫苗以及麻疹和风疹疫苗。在英国，疫苗中已经使用了两种活的减毒腮腺炎病毒毒株，即通过在卵羊膜中传代而从野生型日本分离株获得的Urabe毒株和通过野生型美国分离株的组织培养传代而获得的Jeryl Lynn毒株。未获得除了基于活减毒病毒毒株的那些之外的疫苗用于腮腺炎。

Jeryl Lynn(JL)腮腺炎病毒(MuV)疫苗含有两种不同的组分毒株，MuVJL5和MuVJL2，其在其核苷酸序列方面显著不同(Amexis等，2002)。

已报道MuVJL疫苗是来自于单个临床分离株(Afzal等，1993)，其通过病毒在非人宿主细胞中传代而转化成活减毒疫苗。已报道MuVJL5和MuVJL2的完整核苷酸序列(Clarke等，2000；Amexis等，2002)，并示出414个核苷酸变化，这导致MuVJL5与MuVJL2之间87个氨基酸变化。这种变异水平与MuV的基因型之间的差异水平相同。MuVJL5与MuVJL2之间存在生物学差异。例如，MuVJL2在含胚卵(embryonated egg)中比MuVJL5生长得更好(Amexis等，2002)。MuVJL5和MuVJL2二者在大鼠神经毒力试验中均是非神经毒性的(Rubin等，1999，2000，2003)。

已知MuV生长是毒株以及宿主细胞依赖性的[Afzai等，1990]。还已报道MuV毒株与Vero细胞培养物特异性相互作用的强固有特征导致非常不同形式的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。在细胞的病毒感染期间，病毒复制循环伴随着细胞内的许多生物化学和形态学变化，其通常以细胞死亡而结束。这些形态学变化被称为病毒细胞病变效应(CPE)。CPE可以具有数种形式，例如合胞体形成、细胞变圆、定向障碍(disorientation)、溶胀或收缩、与表面脱离、总细胞裂解等。CPE的形式取决于病毒及其生长的细胞二者[Vaccine 28(2010)1887-1892]。

在Amexis等，2002中提到，MAPREC(在多种Jeryl Lynn制备物中确定Jeryl Lynn亚毒株比例的分子方法)数据证实了来自克隆实验的结果，即通过在Vero细胞中Merck MVL的首次传代，JL2的百分比从20％降低至2％，并且在随后的传代中没有检测到，然而，在含胚的鸡卵(embryonated chicken egg，ECE)中，Jeryl Lynn毒株的传代导致JL2的迅速积累(超过90％)以及JL1的损失，这表明JL2在ECE中具有很强选择优势。

作者进一步得出结论，如通过克隆和MAPREC所检测到的，在Vero和CEF细胞中病毒传代期间JL2的迅速消失表明JL2在Vero和CEF细胞培养物中复制不良，或者可需要JL1的存在作为帮手。

从上述公开内容中很好地理解，通过接近Vero细胞或CEF作为宿主细胞的JL2毒株的拯救(rescue)模型开发难以进一步开发疫苗。在开发针对Jeryl Lynn腮腺炎病毒的免疫原性组合的情况下，若干因素例如细胞病变效应、宿主细胞、病毒毒株、病毒毒株和宿主细胞的组合等均会起作用。

在本发明中，发明人已经开发了基于JL2毒株的免疫原性组合物，其可进一步与合适的稳定剂一起配制用于疫苗接种目的。根据本发明的这样的免疫原性组合物具有较高的免疫原性，不含外来蛋白质和其他试剂，并且最终为用于开发针对腮腺炎之疫苗的良好候选物。此外，这样的疫苗比常规疫苗更稳定，这可能是由于毒株的遗传同质性(genetichomogenicity)较高。

出乎意料的是，本发明的发明人能够通过使用Vero细胞作为宿主细胞来开发所述稳定的免疫原性组合物。尽管，认为Vero细胞不是JL2毒株开发的良好候选物，但出乎意料的是本发明的发明人已经使用哺乳动物细胞(例如Vero细胞或MRC-5细胞或HEK 293T细胞)开发了针对腮腺炎病毒的新免疫原性组合物。

发明目的

在第一方面，本发明提供了可用于生产针对腮腺炎之疫苗的稳定Jeryl Lynn 2(在下文中称为JL2)毒株。

在一个优选的方面，描述了含有分离的JL2毒株的全长基因组的载体。

在第二方面，本发明提供了JL2毒株在不同宿主细胞中传播的JL2毒株的拯救过程。此处，宿主细胞可以是在质量(quality)和生产率(productivity)方面稳定且一致的合适哺乳动物细胞。

在一个优选的方面，本发明提供了用于重组腮腺炎病毒JL2毒株的拯救组合物。

在第三方面，本发明提供了在哺乳动物细胞中以高产率增殖的JL2毒株。这样的哺乳动物细胞可以是Vero细胞、MRC-5细胞、HEK 293T细胞等。

在其中一个方面，本发明提供了保护免受腮腺炎病毒的新免疫原性组合物。

在另外的方面，根据本发明的免疫原性组合物含有来自于Jeryl Lynn毒株的遗传同质性腮腺炎病毒。

在第五方面，本发明提供了包含保护免受腮腺炎病毒的所述免疫原性组合物的稳定疫苗。

这样的疫苗可与麻疹、风疹和/或水痘疫苗组分组合以制备组合疫苗。

在第六方面，本发明提供了用于开发所述免疫原性组合物的方法。

发明概述

本发明提供了可保护免受腮腺炎病毒的来自于Jeryl Lynn2毒株的稳定免疫原性组合物。这样的免疫原性组合物通过使用反向遗传学方法获得。

通过使用多种哺乳动物细胞作为宿主制备这样的免疫原性组合物以开发针对腮腺炎病毒的稳定疫苗。

此外，本发明提供了用于开发所述高度免疫原性且稳定的组合物的方法。

附图详述

图1描绘了在琼脂糖凝胶上分离的腮腺炎病毒Jeryl Lynn毒株的基因组的化学合成片段。有涵盖了全长腮腺炎病毒减毒JL2毒株基因组的六种片段。此处，示出了1+2、3+4和5+6片段的组合。这表明片段在限制性消化后适当地获得。

图2描绘了pMuV^JL2的限制性图谱。

图3描绘了P0传代后Vero细胞中的合胞体形成。

图4描绘了a)未感染的MRC5细胞(对照)b)用rMuV^JL2FL感染的MRC5细胞。

图5描绘了在UV光下通过结晶紫着色来染色的通过TCA固定的Vero细胞，其中A和B示出了rMuV^JL2合胞体。

序列概述

序列1是使用限制性位点NotI和RsrII通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段1的位置为全长DNA基因组的第1至3576位核苷酸。(SEQ IDNO.1)

序列2是使用限制性位点RsrII和AvrII通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段2的位置为全长DNA基因组的第3576至6258位核苷酸。(SEQ IDNO.2)

序列3是使用限制性位点AvrII和XhoI通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段3的位置为全长DNA基因组的第6258至8438位核苷酸。(SEQ IDNO.3)

序列4是使用限制性位点XhoI和KpnI通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段4的位置为全长DNA基因组的第8438至10498位核苷酸。(SEQ IDNO.4)

序列5是使用限制性位点KpnI和XmaI通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段5的位置为全长DNA基因组的第10498至13950位核苷酸。(SEQ IDNO.5)

序列6是使用限制性位点XmaI和NarI通过限制性消化获得的第一片段的核苷酸序列。通过消化获得的片段6的位置为全长DNA基因组的第13950至15440位核苷酸。(SEQ IDNO.6)

序列7是载体pMuV^JL2的完整核苷酸序列。(SEQ ID NO.7)

序列8是经拯救的重组腮腺炎病毒rMuV^JL2FL的完整核苷酸序列。(SEQ ID NO.8)

序列9是编码腮腺炎病毒的核蛋白(NP)的核苷酸序列。(SEQ ID NO.9)

序列10是编码腮腺炎病毒的磷蛋白(P)的核苷酸序列。(SEQ ID NO.10)

序列11是编码腮腺炎病毒的大(L)蛋白的核苷酸序列。(SEQ ID NO.11)

序列12是腮腺炎病毒的核蛋白(NP)的氨基酸序列。(SEQ ID NO.12)

序列13是腮腺炎病毒的磷蛋白(P)的氨基酸序列。(SEQ ID NO.13)

序列14是腮腺炎病毒的大蛋白(L)的氨基酸序列。(SEQ ID NO.14)

序列15是编码T7RNA聚合酶的pSC6-T7的核苷酸序列。(SEQ ID NO.15)

发明详述

在其中一个实施方案中，本发明提供了可用于生产针对腮腺炎之疫苗的稳定的基于JL2毒株的免疫原性组合物。分离的JL2毒株具有遗传同质性和高度免疫原性。本文中所公开的分离的JL2毒株在针对腮腺炎病毒的抗体生产方面是安全且高效的。

在另一个实施方案中，本发明提供了从JL2毒株的逆转录m-RNA产生的JL2毒株的全长基因组。全长JL2基因组以六种不同的片段化学合成，以覆盖腮腺炎病毒的总基因组长度(15,384bp)。可使用合适的质粒载体(中间载体)来扩增这样的化学合成的基因组片段。可使用限制性消化法以少于或多于本文中举例说明的六种片段合成全长基因组。

在一个实施方案中，本发明提供了在合适的载体中克隆JL2基因组的化学合成片段的方法。将腮腺炎病毒的反式作用病毒蛋白NP(核蛋白)、P(磷蛋白)和L(大蛋白)编码基因和编码T7RNA聚合酶的基因克隆到辅助质粒中。

反式作用病毒蛋白可被定义为对于病毒衣壳化(encapsidation)、转录和翻译所必需的病毒蛋白。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的反式作用病毒蛋白包含如SEQ ID NO.9至11中所示核苷酸序列。

在一个更优选的实施方案中，根据本发明的反式作用病毒蛋白包含如SEQ IDNO.12至14中所示氨基酸序列。

在另一个实施方案中，根据本发明的含T7RNA聚合酶的载体包含如SEQ ID NO.15中所示核苷酸序列。

在另一个实施方案中，根据本发明，载体可选自：pBluescript、pBluescript II、pBluescript II SK(+)、pUC19、pCA、pSC6等。这些载体是市售的并且是本领域技术人员已知的。

在第二个实施方案中，描述了含有分离的JL2毒株的全长基因组的载体。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了通过使用pBluescript II SK(+)作为最终转录载体逐步克隆JL2基因组的化学合成片段以构建包含JL2(pMuV^JL2)全长基因组的质粒的方法。

转录载体包含可操作地连接的转录单位，所述转录单位包含在表达中具有调节作用的遗传元件的组合体(assembly)，例如启动子、结构基因或转录成腮腺炎RNA的编码序列，以及适当的转录起始和终止序列。本发明的所有克隆操作基本上如Sambrook和Russel(2001)所述。

在第三实施方案中，本发明提供了用于拯救JL2毒株的方法，其中JL2毒株在合适的宿主细胞中增殖。此处，宿主细胞可以是在质量和生产率方面稳定且一致的合适哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。已经知道Jeryl Lynn毒株在含胚鸡卵(ECE)中的传代导致JL2的迅速积累(超过90％)和JL1的损失，这表明JL2在ECE中具有强选择优势。但是，ECE细胞是不一致且不可重现的原代细胞。因此，变得难以使用这样的原代细胞来保持所期望的JL2毒株滴度。

在另一个实施方案中，本发明仅通过使用哺乳动物细胞提供了免疫原性组合物的生产。这样的哺乳动物细胞可选自Vero细胞、MRC-5细胞、HEK 293T细胞和其他类似的二级或三级细胞系并且可使用非哺乳动物细胞(例如大肠杆菌(E.coli)等)。在生产水平上稳定且具有足够免疫原性的免疫原性组合物在本领域中不可得。因此，使用如此提及的可用于针对腮腺炎病毒的疫苗制备物之宿主的免疫原性组合物在市场上不可得。预期本发明满足目前的需求。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了使用含有全长腮腺炎JL2基因组(pMuV^JL2)的质粒和含有编码反式作用病毒蛋白NP、P、L的辅助质粒和含有T7聚合酶基因的质粒转染合适的哺乳动物宿主细胞。将转染的细胞进行孵育以允许合胞体形成。

在一个更优选的实施方案中，根据本发明，使用表示为p_N^JL2的编码核蛋白(NP)的辅助质粒、表示为p_P^JL2的编码磷蛋白(P)的辅助质粒、表示为p_L^JL2的编码大蛋白(L)的辅助质粒以及表示为pSC6-T7的编码T7聚合酶的质粒(SEQ ID NO.15)。

用于与pMuV^JL2一起用于共转染宿主细胞的表达反式作用病毒蛋白和T7聚合酶的质粒可定义为辅助质粒。这些是病毒衣壳化、转录和翻译所必需的。

合胞体可定义为通过病毒蛋白表达介导的由经感染细胞与相邻细胞融合而产生的多核增大细胞。

这些合胞体用于感染不同的哺乳动物宿主细胞以进行病毒增殖(P0代)。病毒后代在P0代后被拯救(rMuV^JL2FL)。传代可定义为在宿主细胞中亚培养经拯救的病毒。第一次传代后，用P0代感染新鲜的哺乳动物细胞以进行后续的传代(P1和P2)。在最后的传代后，经拯救的病毒作为病毒原液(原种)储存。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含以下要素的拯救组合物：

a.包含JL2毒株全长基因组的转录载体。

b.表达载体，其包含编码反式作用蛋白的分离的基因，其中反式作用蛋白选自NP蛋白、P蛋白、L蛋白及其组合。

c.用于适当地转录JL2毒株全长基因组的RNA聚合酶。

此处，根据本发明，RNA聚合酶优选为T7RNA聚合酶。

在另一个实施方案中，在本发明中，经拯救的病毒通过本领域中已知的测序方法表征，更优选引物步移测序法。

在第四实施方案中，本发明提供了新的、稳定的且高度免疫原性的组合物，其包含可用于开发针对腮腺炎病毒之疫苗的分离的JL2毒株。

这样的免疫原性组合物包含遗传同质性JL2毒株。根据本发明的稳定免疫原性组合物不含作为针对腮腺炎病毒之常规疫苗一部分的MuVJL5组分毒株。因此，本发明提供了稳定的纯的且高度免疫原性的组合物，其可保护免受使用JL2和JL5毒株的组合常规保护的腮腺炎病毒抗原。

在一个优选的实施方案中，宿主细胞选自Vero细胞和MRC-5细胞。

如先前所讨论，已知常规JL2毒株在来自于原代鸡胚的细胞中生长良好。使用含胚卵细胞的缺点在于来自于残留卵的蛋白质和其他未知的外来物质(包括其他病毒)的风险。这样的来自于残留卵的蛋白质可以是在经疫苗接种个体中引起不期望变态反应的原因。此外，未知的其他病毒的存在可引起疫苗的其他风险。本发明的发明人已使用可用于开发针对腮腺炎病毒之稳定疫苗的Vero细胞和MRC-5细胞开发了稳定、同质且纯的分离的JL2毒株和包含所述毒株的组合物。

在第五实施方案中，本发明提供了包含遗传同质性且热稳定性的JL2毒株的稳定疫苗。

在另一个实施方案中，本疫苗提供了含有麻疹、风疹、水痘和其他活病毒疫苗毒株以及本发明的Jeryl Lynn疫苗的组合疫苗。

在第六实施方案中，本发明提供了使用常规反向遗传学方法开发所述免疫原性组合物的方法。其包括开发腮腺炎病毒JL2毒株全长基因组的克隆方法。这样的JL2毒株全长基因组从分离的Jeryl Lynn毒株的原始m-RNA逆转录。作为来自本发明的经逆转录JL2毒株的细胞病变效应的结果，将发生稳定的合胞体形成。从本发明的分离的JL2毒株获得的这样的合胞体是遗传同质性且高度免疫原性的。这样的免疫原性疫苗毒株可使用不同的哺乳动物细胞系在生产细胞培养物中培养。发明人发现与典型Jeryl Lynn疫苗中使用的CEF原代细胞相比，细胞基质(例如Vero细胞、MRC-5细胞或HEK 293T细胞)在多次传代的细胞增殖中更好，具有更低的生产成本。

使用所提及的哺乳动物细胞系获得的免疫原性组合物在质量和易感性方面是一致的以产生所期望的JL2毒株滴度，而在CEF原代细胞的情况下不可重现。

此外，根据本发明的免疫原性组合物通过使用不是任何原代细胞情况的合适的稳定的二级细胞系来帮助避免来自细胞基质的新外来物质(adventitious agent)污染的风险。这意味着本文中所述的免疫原性组合物在商业上是可行的。

开发根据本发明的所述免疫原性组合物的方法包括克隆策略，其包括使用合适的载体来转染合适的宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了用于生产重组腮腺炎病毒的方法，其包括以下步骤：

a.化学合成腮腺炎病毒减毒JL2的基因组序列片段；

b.将每种所获得的基因片段克隆到用于其扩增的中间载体中；

c.通过将每种基因片段连接到单载体中来构建腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长DNA基因组的克隆以获得pMuVJL2载体；

d.用pMuVJL2和包含编码反式作用蛋白的分离的基因的表达载体共转染宿主细胞以进行腮腺炎病毒负链拯救，其中反式作用蛋白选自：NP蛋白、P蛋白和L蛋白；

e.任选地，将经拯救的腮腺炎病毒传代到用于其扩增的宿主细胞中。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫原性组合物以及合适的可药用载体或赋形剂的药物组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了包含具有合适缓冲剂、稳定剂、张力剂(tonicity agent)、表面活性剂和冷冻保护剂的免疫原性组合物的药物组合物。

在一个实施方案中，缓冲剂可选自：磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、精氨酸缓冲剂、磷酸缓冲盐水、氨丁三醇缓冲剂等，优选磷酸盐缓冲剂。

在其中一个实施方案中，稳定剂可选自：氨基酸、糖、多元醇及其组合。

在其中一个实施方案中，氨基酸可选自：精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸/胱氨酸及其合适的组合。

在本发明中，糖可选自：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脱氧核糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖及其合适的混合物，优选海藻糖或山梨糖醇或甘露糖醇。

此外，多元醇可选自：甘露糖醇、山梨糖醇、葡聚糖、甘油、阿拉伯糖醇、丙二醇、聚乙二醇及其合适的组合，优选山梨糖醇。

在其中一个实施方案中，合适的张力剂可选自用于所述药物组合物的糖、盐及其组合。

在其中一个实施方案中，合适的盐可选自张力剂，例如NaCl或KCl等。

在本发明中，表面活性剂可选自：聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和十二烷基硫酸钠(SDS)及其组合。

此外，冷冻保护剂可选自糖等。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有合适佐剂的重组JL2(rMuVJL2FL)的免疫原性组合物。

佐剂可定义为添加至疫苗以提高身体对所述疫苗之免疫应答的物质。

根据本发明的佐剂可选自：铝盐、单磷酰脂质(Mono Phosphoryl Lipid，MPL)类似物(例如GLA(吡喃葡萄糖基脂质佐剂))、monatide、细胞因子诱导剂和基于角鲨烯的佐剂、亲脂性佐剂等。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了针对Jeryl Lynn的含有本发明免疫原性组合物的疫苗。这些疫苗可以以常规途径和剂量施用。

本发明中使用的分析方法

1.RT-PCR：逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)是用于通过逆转录RNA来合成和扩增互补DNA的方法。RT-PCR使用逆转录酶和引物来使所期望的RNA序列退火并延伸。如果存在RNA，则逆转录酶和引物将与所述RNA序列退火并转录DNA的互补链(cDNA)。然后用引物和Taq聚合酶复制该链，随后进行标准PCR方案。该方案在少量时间内将单链DNA拷贝数百万次以生产显著量的DNA。然后用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物(cDNA链)。

2.琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学中的凝胶电泳法，用于在琼脂糖基质中分离混合的DNA或蛋白质群体。

3.引物步移测序法：引物步移是选择用于对大DNA片段进行测序的测序方法。片段太长而无法使用链终止法在单个序列读取中测序，该方法通过将长序列分为数个连续的短序列来运转。术语“引物步移”用于其中主要目的是对基因组进行测序的情况。

4.多重序列分析：多重序列分析是用于分析生物学序列以确定进行比对分析的序列之间具有相似性和差异之区域的方法。

实施例

以下非限制性实施例描述了从共转染至合适哺乳动物细胞的基因组质粒和结构质粒中拯救JL2。此外，下文中描述了通过使用有限稀释法分离纯的且遗传同质性的JL2毒株。应理解，可制备具有不同宿主细胞的另一些免疫原性组合物，并且这样的免疫原性组合物在本领域技术人员的范围内，并且将包括在本发明的范围内。

实施例1：构建腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长DNA基因组的克隆产生腮腺炎JL2的全长cDNA

化学地合成(GeneArt-Thermo Fisher Scientific)六种基因组序列片段以覆盖腮腺炎病毒的总基因组长度(15,384bp)。随后，通过特异性限制性内切核酸酶(NewEngland Bio Labs)切割每种基因组片段和载体，并克隆到中间载体中。通过在如图1中所示琼脂糖凝胶上将其分离验证每个片段。限制性消化后获得的片段已描述如下：

片段1：第1至3576位NotI-RsrII(SEQ ID NO.1)；

片段2：第3576至6258位RsrII-AvrII(SEQ ID NO.2)；

片段3：第6258至8438位AvrII-XhoI(SEQ ID NO.3)；

片段4：第8438至10498位XhoI-KpnI(SEQ ID NO.4)；

片段5：第10498至13950位KpnI-XmaI(SEQ ID NO.5)；

片段6：第13950至15440位XmaI-NarI(SEQ ID NO.6)

在本实施例中提及的限制性位点是本领域技术人员公知的。本领域技术人员可根据其需求使用替代的限制性位点。

将所获得的片段克隆到转录载体中并将片段连接

使用经修饰的pBluescript II SK(+)作为最终载体，通过逐步克隆操作将化学合成的和经限制性内切核酸酶处理的片段并入质粒中。通过相容性黏性末端将片段彼此逐个连接产生最终的pMuV^JL2质粒。pMuV^JL2质粒的载体图已经在图2中描绘。质粒pMuV^JL2具有如SEQ ID NO.7中所示核苷酸序列。通过在合适的载体中克隆，产生含有腮腺炎病毒结构蛋白的基因的辅助质粒和含有T7RNA聚合酶基因的质粒。此处，pSC6载体已被用于克隆编码反式作用蛋白和T7RNA聚合酶的基因。如本申请中所述的克隆已经如Sambrook和Russel(2001)中所述进行。

实施例2：减毒腮腺炎Jeryl-Lynn 2病毒的拯救

通过pMuV^JL2与辅助质粒p_N^JL2、p_p^JL2、p_L^JL2和pSC6-T7一起转染市售的HEK 293T细胞。将HEK 293T细胞接种到35mm孔中，以在被转染时达到～50-70％汇合。汇合是通常用作对培养皿或瓶中贴壁细胞数量的估计的术语，指的是由细胞单层覆盖的表面的比例。转染前4小时，用含有10％FCS的3ml DMEM更换培养基。根据QIAGEN质粒制备试剂盒制备所有重组质粒。用于DNA的Ca²⁺磷酸盐共沉淀的试剂盒来自Invitrogen。

用以如下的终浓度的质粒共转染细胞：

将在H2O中稀释的所提及质粒添加到含有2M CaCl₂的Eppendorf管中，在摇动条件下将混合物添加至含有HEPES缓冲液的另一个Eppendorf管，并在室温(RT)下孵育30分钟。将共沉淀物逐滴添加至培养物，并在37℃和5％CO₂下进行转染持续约18小时。随后，用3.0ml不含FCS的DMEM更换转染培养基。T7聚合酶的瞬时表达允许T7启动基因的高效蛋白质表达，最终导致腮腺炎病毒负链拯救。监测经转染细胞约15天，直到合胞体形成。来自单个噬菌斑的合胞体形成已在图3中示出。挑选单个合胞体来感染WHO批准的Vero细胞以建立病毒的第0代(P0)。

经拯救的重组减毒病毒命名为rMuV^JL2FL。rMuV^JL2FL的核苷酸序列如SEQ ID NO.8中所示。

经拯救的腮腺炎病毒的分析测序

转染后约15天，一旦出现第一个合胞体，则在显微镜下吸取单个克隆，并随后用于表征。通过对经拯救的rMuV^JL2FL病毒基因组的测序进行表征。来自经rMuV^JL2FL感染的Vero细胞的病毒RNA已经按照Qiagen RNeasy Mini试剂盒制备。从2.0μl所提取病毒RNA开始，按照Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒说明书依次地进行逆转录和扩增。

已经设计了覆盖全长基因组序列(15,384bp)的34对引物以扩增重叠的PCR片段。按照引物步移测序操作已对经纯化PCR进行测序。

已经组装了值读取序列(Value Read sequence)，其覆盖整个rMuV^JL2FL病毒基因组。相对于原始质粒pMuV^JL2的序列，已在经拯救的rMuV^JL2FL的L基因中检测到6个点突变，并通过多重序列分析证实。

表1：经拯救的rMuV^JL2FL的L基因中的点突变和氨基酸变化

实施例3：经拯救腮腺炎JL2病毒的扩增

将经拯救rMuV^JL2FL病毒的P0代在WHO批准的Vero细胞中增殖。Vero细胞在补充有5％FBS的DMEM中保持单层，并且当汇合达到70-80％时，已经使用在5.0mL总体积的OPTIMEM中的0.5-1.0mL的经拯救病毒通过经拯救rMuV^JL2FL病毒的P0代感染Vero细胞。将细胞在37℃和5％CO₂下孵育1小时。孵育后，用DMEM+5％FBS更换接种物。经感染的细胞在2天后分开，感染5天(5-dpi)后观察到90-100％的合胞体形成。已经收集无细胞(cell-free，CF)和细胞相关(cell-associated，CA)级分以获得实验室规模的病毒原液，其达到在所收集的无细胞级分(CF)中1×10⁴pfu/mL至在所收集的细胞相关级分(CA)中1×10⁶pfu/mL的滴度。

实施例4：经拯救腮腺炎JL2病毒的原细胞库(master cell bank)的制备和单病毒收获物的生产

来自P0代的经拯救腮腺炎病毒在Vero细胞中进一步传代至第2代(P2)，以获得足够的原种(master seed)。

在Vero细胞中每次传代后获得的滴度如下给出：

P0代：滴度为1×10³pfu/mL(CF，无细胞级分)至1×10⁴pfu/mL(CA，细胞相关级分)。

P1代：滴度为1×10⁴pfu/mL(CF，无细胞级分)至5×10⁴pfu/mL(CA，细胞相关级分)。

P2代：滴度为1×10⁴pfu/mL(CF，无细胞级分)至1×10⁶pfu/mL(CA，细胞相关级分)。

这样的原种在-150℃至-196℃的温度下储存。该原种将用于生产用于制备人用商业疫苗的工作种(working seed)。从原种获得的工作种用于在Vero细胞中生产单病毒收获物。从原种获得的工作种可用于在MRC5细胞中生产单病毒收获物。MRC5细胞中单病毒收获物的生产也在下文中举例说明。

MRC5细胞中单病毒收获物的生产

细胞的增殖

移除培养基，并用MEM EBS培养基清洗细胞，并以1ml/T75cm2和10ml/RB 850cm2添加TrypLE溶液(胰蛋白酶替代品)，并在35±2℃下孵育。细胞分离后在新鲜培养基中重悬，并接种到新的培养瓶和滚瓶中。根据批量大小，分别在T 75、T 175和RB 850滚瓶中将完全汇合的T75烧瓶按1∶4至1∶16的比例分开。细胞每周分开一次，并且是在达到充分汇合之后。随后，将细胞用于病毒接种。

单病毒收获物生产

单病毒收获物通过用工作病毒种感染MRC-5细胞并在33±2℃下孵育60至120分钟用于病毒吸附生产腮腺炎病毒。吸附后，每个经感染的滚瓶用250至300mL的Creek基本培养基(Creek’s Minimal Medium，CMM)补充，并在滚筒设备中在33±2℃下以0.5rpm培养40至70小时。孵育完成后，观察所有滚瓶的澄清度和单层脱离。用普通MEM培养基清洗单层，并用100至200mL普通MEM介质补充。在滚筒设备中将瓶在33±2℃下以0.5rpm再次孵育5至13天。在孵育结束时，观察所有滚瓶的澄清度和细胞病变效应的存在，并从在单个容器中的所有滚瓶收集收获物。人血清白蛋白用作所收集病毒收获物的稳定剂。然后将所述收获物分配在单个预灭菌PETG瓶中作为单收获物。使由此获得的批次(bulk)澄清并稀释至所需浓度以生产腮腺炎疫苗。未感染的MRC5细胞(对照)和用rMuV^JL2FL感染的MRC5细胞在图4中分别示为(a)和(b)。

测试所生产腮腺炎疫苗(JL)的效力，并发现通过细胞培养法测试其为10^4.12/ml至10^4.57/ml CCID₅₀(感染50％的培养细胞之细胞培养物感染剂量)。

实施例5：通过噬菌斑测定和原位免疫荧光鉴定和定量腮腺炎JL2毒株通过噬菌斑测定的病毒滴定

使用OPTIMEM连续十倍稀释病毒制备物至最终体积为0.5ml。将每种稀释液添加到35mm Vero细胞培养物上。病毒吸附1小时后，取出接种物，并用含有5％FCS和1％低熔点琼脂糖(LMP琼脂糖)的2.0ml DMEM覆盖经感染细胞。在37℃和5％CO₂下孵育5天后，用1ml的10％TCA将培养物固定1小时，然后UV交联30分钟。在去除琼脂糖覆盖物后，用溶于4％乙醇的结晶紫对细胞单层进行染色，用水清洗，并在倒置显微镜下对噬菌斑进行计数。显微图像如图5中所给出。

原位免疫荧光

在含有2％FBS(胎牛血清)的MEM(最低极限培养基)培养基中，从原种病毒中制备原种的多种十倍稀释液。随后，在0.15至0.20百万/mL的浓度范围制备Vero细胞悬液。将该细胞悬液倒入96孔板中上述病毒稀释液的上方，并在37℃、5％CO₂下保持。将板在相同条件下孵育10天。十天后，弃去来自板的细胞上清液，并用PBS(磷酸缓冲盐水)清洗。用丙酮甲醇固定缓冲液固定板中的细胞。以1∶50的工作稀释度添加与FITC(异硫氰酸荧光素)缀合的抗腮腺炎IgG抗体。通过使用Spearman Karber公式在荧光显微镜下对经染色细胞进行计数确定病毒滴度。

Spearman-公式：

x0＝(所有孔为阳性的最低稀释度的log10)d＝稀释步骤的log10，在该情况下为1，ni＝重复数，在该情况下为6，ri＝阳性孔数

实施例6：免疫原性组合物的制剂

计算腮腺炎疫苗的单收获物所需量以获得1000CCID₅₀的靶滴度。类似地，计算原料(稳定剂)的所需量以根据成品的组成来配制所期望批量大小的疫苗。按照计算量将稳定剂176(明胶山梨糖醇和其他氨基酸的组合混合物)和M199(稀释剂)转移到无菌容器中，并添加计算量的单收获物的腮腺炎疫苗并混合。

最终的制剂如下所述：

材料名称	单剂量Qty./剂量	用作
			单收获物腮腺炎病毒	≥1000CCID₅₀	抗原
稳定剂176	0.25ml	稳定剂
			培养基-M199	Q.S.	稀释剂

将最终制剂以0.5ml/小瓶填充，半塞住并用标准循环冷冻干燥，其中快速冷冻至-60℃，初始干燥在-40℃下进行，并在37℃下二次干燥。发现圆形完整的块状物(cake)，其在少于1分钟内重构，且水份测试结果低于1.6％-2％。

已测试了所生产的腮腺炎疫苗(JL)疫苗的效力，发现通过细胞培养法测试的其范围为10³/剂量至10^3.57/ml CCID₅₀。

通过标准免疫测定法测试本发明的免疫原性组合物以确定经拯救的腮腺炎病毒的免疫原性。这样的免疫测定方法的实例是ELISA(酶联免疫吸附测定)和用于确定腮腺炎病毒中和抗体的其他标准方法。这样的测定可用于确定非灵长类或灵长类中经拯救病毒的免疫原性。此类研究可用于确定所述疫苗的最佳剂量和剂量方案。发现具有经拯救的腮腺炎病毒的本发明免疫原性组合物适用于进一步的疫苗制备。根据本发明的用于生产经拯救腮腺炎病毒的方法不涉及使用来自任何其他病毒或非病毒致病性实体的任何要素。因此，经拯救的腮腺炎病毒是稳定且同质性的，并且因此没有腮腺炎病毒以外的病原颗粒。因此，根据本发明的经拯救腮腺炎病毒是用于疫苗开发的合适候选物。

Claims

1.分离的腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长基因组，其包含具有SEQ ID NO.8的多核苷酸序列。

2.载体，其包含如权利要求1所述的多核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的载体，其选自：pUC19、pBluescript、pBluescript II、pBluescript II SK(+)、pCA或pSC6.

4.宿主细胞，其包含如权利要求2所述的载体。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其选自哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞.

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中哺乳动物细胞选自HEK 293T细胞、Vero细胞或MRC-5细胞，并且非哺乳动物细胞选自细菌细胞或酵母细胞.

7.腮腺炎病毒疫苗，其包含如权利要求1所述的腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长基因组.

8.免疫原性组合物，其包含如权利要求1所述的腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长基因组、以及合适的药物赋形剂。

9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述药物赋形剂选自：缓冲剂、稳定剂、张力剂、表面活性剂、佐剂、冷冻保护剂或其组合.

10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中

(a)缓冲剂选自：磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、精氨酸缓冲剂、磷酸缓冲盐水、氨丁三醇缓冲剂及其混合物；

(b)稳定剂选自：氨基酸、糖、多元醇或其组合；

(c)张力剂选自：糖、盐或其组合；

(d)表面活性剂选自：聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合；

(e)佐剂选自：铝盐、例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂的单磷酰脂质类似物、monatide、细胞因子诱导剂、基于角鲨烯的佐剂、亲脂性佐剂或其组合；并且

(f)冷冻保护剂是糖.

11.如权利要求10所述的免疫原性组合物，其包含选自氨基酸、糖、多元醇或其组合的稳定剂，缓冲剂或盐。

12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其中

-缓冲剂选自：磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、精氨酸缓冲剂、磷酸缓冲盐水、氨丁三醇缓冲剂及其混合物；

-氨基酸选自：精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸/胱氨酸及其合适的组合；

-糖选自：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脱氧核糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖及其合适的混合物，优选海藻糖或棉子糖；

-多元醇选自：甘露糖醇、山梨糖醇、葡聚糖、甘油、阿拉伯糖醇、丙二醇、聚乙二醇及其合适的组合；

-盐选自NaCl或KCl。

13.拯救组合物，其包含以下要素：

a.包含如权利要求1所述多核苷酸序列的转录载体；

b.表达载体，其包含编码反式作用蛋白的分离的基因，其中反式作用蛋白选自：NP蛋白、P蛋白、L蛋白及其组合；

c.用于适当地转录如权利要求1所述多核苷酸序列的RNA聚合酶。

14.用于生产重组腮腺炎病毒的方法，其包括以下步骤：

化学合成腮腺炎病毒减毒JL2的基因组序列片段；

将每种所获得的基因片段及其组合克隆到用于其扩增的中间载体中；

c.通过将从步骤b获得的每种基因片段连接到单转录载体中来构建腮腺炎病毒减毒JL2毒株全长DNA基因组的克隆以获得pMuV^JL2载体；

d.用pMuV^JL2和包含编码反式作用蛋白的分离的基因的表达载体共转染宿主细胞以拯救腮腺炎病毒的负链，其中反式作用蛋白选自：NP蛋白、P蛋白和L蛋白以及RNA聚合酶；

15.编码如权利要求13和14所述的反式作用蛋白的基因选自SEQ ID NO.9至11。

16.如权利要求13至15所述的反式作用蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO.12至14。

17.编码如权利要求14所述的RNA聚合酶的载体如SEQ ID NO.15所示。

18.如权利要求14所述的生产重组腮腺炎病毒的方法，其中

-转录载体或中间载体选自：pUC19、pBluescript、pBluescript II、pBluescript IISK(+)、pCA或pSC6；

-宿主细胞选自HEK 293T细胞、Vero细胞或MRC-5细胞，并且非哺乳动物细胞选自大肠杆菌(E.coli)或合适的酵母细胞。