JP2020074792A - 組換え流行性耳下腺炎ウイルスJeryl Lynn2系ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】高度に免疫原性であるrMuVJL2(組換え流行性耳下腺炎ウイルスJeryl Lynn2系)で構成される流行性耳下腺炎に対する新規ワクチンの提供。【解決手段】特定のポリヌクレオチド配列を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株の単離された全長ゲノムであって、ここで、JL2株が、HEK293T細胞、Vero細胞及びMRC−5細胞から選択される宿主細胞において増殖する、前記単離された全長ゲノム。該全長ゲノムを含む流行性耳下腺炎ウイルスワクチン。係るワクチンは、安全であり、費用対効果が高く、非常に有効かつ安定であり、生産性の点で一貫している。【選択図】なし
Description
本発明は、高度に免疫原性のrMuVJL2(組換え流行性耳下腺炎ウイルスJeryl Lynn2系)で構成される流行性耳下腺炎に対する新規なワクチンを提供する。さらに、上記免疫原性組成物を開発する方法は、本発明に記載されている。本発明によるワクチンは、安全で、費用対効果が高く、非常に有効で安定し、生産性の点で一貫している。
流行性耳下腺炎は、急性のウイルス性疾患であり、典型的には幼児に影響を及ぼし、睾丸炎、卵巣炎、膵炎および髄膜炎などの合併症を引き起こすことがある耳下腺(単数又は複数)の発熱および腫脹を特徴とする。しかしながら、感染した個体の約半数が古典的な病気を発症する。流行性耳下腺炎ウイルス(MuV)は、ヒトにのみ感染するパラミクソウイルス科、パラミクソウイルス亜科、およびルブラウイルス属の一員である[Hviidら、2008]。 MuVは、15,384ヌクレオチドからなる一本鎖のマイナスセンスRNAゲノムを有する。ゲノムは、2つの表面糖タンパク質;融合(F)及び赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ(HN)、4つのコアタンパク質;核タンパク質(NP)、ホスホ(P)、マトリックス(M)およびラージタンパク質(L)、および膜関連小疎水性(SH)タンパク質をコードする。
歴史的に、流行性耳下腺炎は、小児期の疾患と考えられていたが、過去20年間にわたり、流行性耳下腺炎の予防接種が日常的に行われている国の高齢の子供や成人に影響を与えた。ワクチン接種率が高いにもかかわらず、流行性耳下腺炎の再発は、米国、英国、カナダ、モルドバ共和国、オランダなどいくつかの国で報告されている[Bernard et al、2008;Brockhoffら、2010;CDC、2010;Whelan et al、2010;Yung et al、2010]。インドでは、流行性耳下腺炎の疫学、その発生率、抗体有病率などのデータが入手可能である。KeralaとMaharashtraの州からいくつかの流行性耳下腺炎の流行が報告されている[Geeta and Kumar、2004;John、2004;Ghatage and Kakade、2007]。流行性耳下腺炎ワクチンは、12カ月またはそれ以降の麻疹ワクチンおよび風疹ワクチンと一緒に小児に与えられる。生きた弱毒化流行性耳下腺炎ウイルスの2つの菌株が、英国においてワクチンで使用され、すなわち、卵羊膜における継代による野生型の日本分離株に由来するウラベ株、及び野生型の米国分離株の組織培養継代に由来するJeryl Lynn株である。生きた弱毒化ウイルス株に基づくもの以外のワクチンは、流行性耳下腺炎には利用できない。
Jeryl Lynn(JL)流行性耳下腺炎ウイルス(MuV)ワクチンには、ヌクレオチド配列において顕著に異なるMuVJL5とMuVJL2の2種類のコンポーネント菌株が含まれる(Amexis et al、2002)。
MuVJLワクチンは、非ヒト宿主細胞におけるウイルスの継代によって生きた弱毒化ワクチンに変換された単一の臨床分離株(Afzalら、1993)に由来することが報告されている。MuVJL5とMuVJL2の完全なヌクレオチド配列が報告されており(Clarke et al、2000;Amexis et al、2002)、MuVJL5とMuVJL2の間に87個のアミノ酸変化をもたらす414個のヌクレオチド変化を示す。この変化レベルは、MuVの遺伝子型間の差異と同じレベルにある。MuVJL5とMuVJL2の間には生物学的な違いがある。例えば、MuVJL2は、MuVJL5よりも発育した卵でよりよく増殖する(Amexisら、2002)。MuVJL5とMuVJL2の両方は、ラットの神経毒性試験において非神経毒性である(Rubinら、1999,2000,2003)。
MuVの増殖は、宿主細胞依存性と同様に菌株依存性であることが知られている[Afzalら、1990]。また、Vero細胞培養と特異的に相互作用するMuV株の強力な固有の特徴は、非常に異なる形態の細胞変性効果(CPE)をもたらすことも報告されている。細胞のウイルス感染の間、ウイルスの複製サイクルは、通常細胞死で終わる細胞内での多数の生化学的および形態学的変化を伴う。これらの形態学的変化は、ウイルス細胞変性効果(CPE)と呼ばれる。CPEは、いくつかの形態、例えば、合胞体形成、細胞球形化、方向転換、腫脹または収縮、表面からの剥離、全細胞溶解などを取ることがある。CPEの形態は、ウイルスと、ウイルスが増殖する細胞の両方に依存する[Vaccine 28(2010)1887−1892]。
Amexisら、2002には、MAPREC(様々なJeryl Lynn調製物中のJeryl Lynnの亜種の比を決定するための分子的方法)データがクローニング実験からの結果を確認したこと、Vero細胞上のMerL MVLの最初の継代によって、 JL2の割合が20%から2%に減少し、その後の継代において検出できず、一方、胚鶏卵(ECE)におけるJeryl Lynn株の継代は、JL2の急速な蓄積(90%以上)とJL1の喪失をもたらし、これは、JL2がECEにおいて強い選択優位性を有することを示唆することが言及されている。
さらに、この著者は、クローニングとMAPRECによって検出されたVeroおよびCEF細胞におけるウイルス継代中のJL2の急速な消失は、JL2がVeroおよびCEF細胞培養ではほとんど複製しないこと、またはJL1がヘルパーとして存在する必要があることを示唆していると結論付けている。
上記の開示から、宿主細胞としてVero細胞またはCEFを接近させることによるJL2株のレスキューモデルの開発は、ワクチンのさらなる開発にとっては困難であることが十分に理解される。細胞変性効果、宿主細胞、ウイルス株、ウイルス株と宿主細胞の組み合わせなどのいくつかの因子は、Jeryl Lynn流行性耳下腺炎ウイルスに対する免疫原性組成物の開発の場合に影響を及ぼす。
本発明において、本発明者らは、ワクチン接種の目的で適切な安定剤と共にさらに製剤化することができるJL2株ベースの免疫原性組成物を開発した。本発明によるこのような免疫原性組成物は、より高い免疫原性を有し、外来性タンパク質および他の薬剤を含まず、最終的には流行性耳下腺炎に対するワクチンの開発のための良好な候補である。さらに、このようなワクチンは、おそらく、その菌株のより高い遺伝的均質性のために、従来のワクチンよりも安定である。
驚くべきことに、本発明者らは、Vero細胞を宿主細胞として使用することにより上記の安定な免疫原性組成物を開発することができる。Vero細胞は、JL2株の開発のための良好な候補ではないことが知られているが、驚くべきことに、本発明の発明者ら、Vero細胞またはMRC−5細胞またはHEK293T細胞などの哺乳動物細胞を用いて、流行性耳下腺炎ウイルスに対する新規な免疫原性組成物を開発した。
第1の態様において、本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチンを生成するために使用され得る安定なJeryl Lynn2(本明細書において、以下、JL2とする)株を提供する。
好ましい態様において、単離されたJL2株の全長ゲノムを含むベクターが記載される。
第2の態様において、本発明は、JL2株が異なる宿主細胞中で増殖するJL2株のレスキュープロセスを提供する。ここで、宿主細胞は、品質および生産性の点で安定で一貫した適切な哺乳動物細胞であり得る。
好ましい態様において、本発明は、組換え流行性耳下腺炎ウイルスJL2株のためのレスキュー組成物を提供する。
第3の態様において、本発明は、哺乳動物細胞において高収率で増殖するJL2株を提供する。このような哺乳動物細胞は、Vell細胞、MRC−5細胞、HEK 293T細胞または他のものであり得る。
これらの態様の1つでは、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスを防御する新規な免疫原性組成物を提供する。
さらなる局面において、本発明による免疫原性組成物は、Jeryl Lynn株に由来する遺伝的に均一な流行性耳下腺炎ウイルスを含む。
第5の態様において、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスに対して防御する上記免疫原性組成物を含む安定なワクチンを提供する。
このようなワクチンは、麻疹、風疹および/または水痘ワクチン成分と組み合わせて、混合ワクチンを作製することができる。
第6の態様において、本発明は、上記免疫原性組成物の開発方法を提供する。
本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスを防御することができるJeryl Lynn2株由来の安定した免疫原性組成物を提供する。このような免疫原性組成物は、逆遺伝学的方法を用いて誘導される。
このような免疫原性組成物は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する安定なワクチンを開発するために、様々な哺乳動物細胞を宿主として使用して作製される。
さらに、本発明は、上記高度に免疫原性で安定な組成物の開発方法を提供する。
配列の概要
配列1は、制限部位NotIおよびRsrIIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片1は、全長DNAゲノムの1〜3576ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号1)。
配列1は、制限部位NotIおよびRsrIIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片1は、全長DNAゲノムの1〜3576ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号1)。
配列2は、制限部位RsrIIおよびAvrIIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片2は、全長DNAゲノムの3576〜6258ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号2)。
配列3は、制限部位AvrIIおよびXhoIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片3は、全長DNAゲノムの6258〜8438ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号3)。
配列4は、制限部位XhoIおよびKpnIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片4は、全長DNAゲノムの8438〜10498ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号4)。
配列5は、制限部位KpnIおよびXmaIを用いた制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片5は、全長DNAゲノムの10498〜13950ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号5)。
配列6は、制限部位XmaIおよびNarIを用いて制限消化によって得られた第1の断片のヌクレオチド配列である。消化から得られた断片6は、全長DNAゲノムの13950〜15440ヌクレオチド位の位置を有する(配列番号6)。
配列7は、ベクターpMuVJL2の完全なヌクレオチド配列である(配列番号7)。
配列8は、救済された組換え流行性耳下腺炎ウイルスrMuVJL2FLの完全なヌクレオチド配列である(配列番号8)。
配列9は、流行性耳下腺炎ウイルスの核タンパク質(NP)をコードするヌクレオチド配列である(配列番号9)。
配列10は、流行性耳下腺炎ウイルスのリンタンパク質(P)をコードするヌクレオチド配列である(配列番号10)。
配列11は、流行性耳下腺炎ウイルスの大きな(L)タンパク質をコードするヌクレオチド配列である(配列番号11)。
配列12は、流行性耳下腺炎ウイルスの核タンパク質(NP)のアミノ酸配列である(配列番号12)。
配列13は、流行性耳下腺炎ウイルスのリンタンパク質(P)のアミノ酸配列である(配列番号13)。
配列14は、流行性耳下腺炎ウイルスの大きなタンパク質(L)のアミノ酸配列である(配列番号14)。
配列15は、T7 RNAポリメラーゼをコードするpSC6−T7のヌクレオチド配列である(配列番号15)。
発明の詳細な説明
実施形態の1つにおいて、本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチンを製造するために使用され得る安定なJL2株に基づく免疫原性組成物を提供する。単離されたJL2株は、遺伝的に均質であり、高度に免疫原性である。本明細書に開示された単離されたJL2株は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する抗体産生に関して安全かつ効率的である。
実施形態の1つにおいて、本発明は、流行性耳下腺炎に対するワクチンを製造するために使用され得る安定なJL2株に基づく免疫原性組成物を提供する。単離されたJL2株は、遺伝的に均質であり、高度に免疫原性である。本明細書に開示された単離されたJL2株は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する抗体産生に関して安全かつ効率的である。
さらなる実施形態では、本発明は、JL2株の逆転写されたm−RNAから発生したJL2株の全長ゲノムを提供する。全長のJL2ゲノムは、流行性耳下腺炎ウイルスの全ゲノム長(15,384bp)をカバーするために、6つの異なる断片で化学的に合成された。このように化学的に合成されたゲノム断片は、適切なプラスミドベクター(中間ベクター)を用いて増幅することができる。全長ゲノムは、制限消化法を用いて、ここに示される6つ以下の断片または6つ以上の断片で合成することができる。
この実施形態の1つでは、本発明は、JL2ゲノムの化学的に合成された断片を適切なベクターにクローニングする方法を提供する。流行性耳下腺炎ウイルスの遺伝子およびT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子をトランス作用性ウイルスタンパク質NP(核タンパク質)、P(リンタンパク質)およびL(ラージタンパク質)をヘルパープラスミドにクローニングする。
トランス作用性ウイルスタンパク質は、ウイルスのキャプシド形成、転写および翻訳に本質的に必要とされるウイルスタンパク質として定義することができる。
好ましい実施形態では、本発明のトランス作用性ウイルスタンパク質は、配列番号9〜11に記載されるヌクレオチド配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明によるトランス作用性ウイルスタンパク質は、配列番号12〜14に記載のアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、本発明によるT7 RNAポリメラーゼ含有ベクターは、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む。
さらに別の実施形態において、本発明によれば、ベクターは、pBluescript、pBluescript II、pBluescript II SK(+)、pUC19、pCA、pSC6および他のものから選択することができる。これらのベクターは市販されており、当業者に公知である。
第2の実施形態では、単離されたJL2株の全長ゲノムを含むベクターが記載される。
好ましい実施形態では、本発明は、最終転写ベクターとしてpBluescript II SK(+)を使用して、JL2ゲノムの化学的に合成された断片を段階的にクローニングすることにより、JL2(pMuVJL2)の全長ゲノムを含むプラスミドを構築する方法を提供する。
転写ベクターは、発現に調節的役割を果たす遺伝子エレメント(単数又は複数)、例えば、プロモーター、流行性耳下腺炎RNAに転写される構造遺伝子またはコード配列、および適切な転写開始および終止エレメントの組み立てを含む作動可能に連結された転写単位を含む。 本発明の全てのクローニング手順は、基本的には、Sambrook and Russel(2001)によって記載されている通りである。
第3の実施形態では、本発明は、JL2株が適切な宿主細胞内で増殖するJL2株の救済のプロセスを提供する。ここで、宿主細胞は、品質および生産性に関して安定で一貫性のある適切な哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞であり得る。孵化鶏卵(ECE)におけるJeryl Lynn株の継代は、JL2の急速な蓄積(90%以上)およびJL1の喪失をもたらし、JL2がECEにおいて強い選択優位性を有することを示唆していることは既に知られている。しかし、ECE細胞は、一貫性がなく、再現性のない初代細胞である。したがって、このような初代細胞を用いて所望の力価のJL2染色を維持することは困難になる。
さらなる実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞を専ら使用する免疫原性組成物の製造を提供する。このような哺乳動物細胞は、Vero細胞、MRC−5細胞、HEK293T細胞および他の類似の二次または三次細胞系、および大腸菌などの非哺乳動物細胞から選択することができる。産生レベルにおいて安定で十分な免疫原性である免疫原性組成物は、当該技術分野において利用可能ではない。したがって、流行性耳下腺炎ウイルスに対するワクチン調製に使用することができるこのような宿主を用いた免疫原性組成物は、市販されていない。本発明は、現在の要求を満たすことが期待される。
好ましい実施形態では、本発明は、全長流行性耳下腺炎JL2ゲノムを含むプラスミド(pMuVJL2)、およびトランス作用性ウイルスタンパク質NP、P、Lをコードする遺伝子を含むヘルパープラスミド、及びT7ポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを使用する、適切な哺乳動物の宿主細胞のトランスフェクションを提供する。トランスフェクトされた細胞をインキュベートして、合胞体形成を可能にする。
より好ましい態様では、本発明によれば、p NJL2として示される核タンパク質(NP)、p PJL2として示されるリンタンパク質(P)、p LJL2として示されるラージタンパク質(L)をコードするヘルパープラスミド、およびpSC6−T7(配列番号15)として示されるT7ポリメラーゼをコードするプラスミドが使用される。
pMuVJL2とともに宿主細胞を同時トランスフェクトするために使用されるトランス作用性ウイルスタンパク質およびT7ポリメラーゼを発現するプラスミドは、ヘルパープラスミドとして定義することができる。これらは、ウイルスのキャプシド形成、転写および翻訳に必須である。
合胞体は、感染細胞と、ウイルスタンパク質の発現によって媒介される隣接細胞との融合から生じる多核拡大細胞として定義することができる。
これらの合胞体は、ウイルス増殖(継代P0)に関して、異なる哺乳動物宿主細胞に感染させるために使用される。ウイルスの子孫は、P0継代後に救済される(rMuVJL2FL)。継代は、宿主細胞上で救済されたウイルスの継代培養として定義することができる。最初の継代後、新鮮な哺乳動物細胞は、継代(P1およびP2)のために継代P0に感染される。最後の継代後、救済されたウイルスは、ウイルスストック(マスターシード)として保存される。
別の実施形態において、本発明は、以下の要素を含むレスキュー組成物を提供する:
a.JL2株の全長ゲノムを含む転写ベクター。
b.NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質およびそれらの組み合わせから選択されるトランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクター。
c.JL2株の完全長ゲノムの適切な転写のためのRNAポリメラーゼ。
a.JL2株の全長ゲノムを含む転写ベクター。
b.NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質およびそれらの組み合わせから選択されるトランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクター。
c.JL2株の完全長ゲノムの適切な転写のためのRNAポリメラーゼ。
ここで、本発明によれば、RNAポリメラーゼは、T7RNAポリメラーゼであることが好ましい。
さらに別の実施形態では、本発明において、救済されたウイルスは、当該技術分野で公知の配列決定法、より好ましくはプライマーウォーキング配列決定法により特徴付けられる。
第4の実施形態では、本発明は、流行性耳下腺炎ウイルスに対するワクチンの開発に使用することができる単離されたJL2株を含む、新規の安定であり高度に免疫原性の組成物を提供する。
このような免疫原性組成物は、遺伝的に均質なJL2株を含む。本発明による安定な免疫原性組成物は、流行性耳下腺炎ウイルスに対する従来のワクチンの一部であるMuVJL5成分株を含まない。したがって、本発明は、JL2株およびJL5株の組み合わせを使用して従来保護されている流行性耳下腺炎ウイルス抗原に対して防御することができる、安定で純粋であり、高度に免疫原性の組成物を提供する。
好ましい実施形態では、宿主細胞は、Vero細胞およびMRC−5細胞から選択される。上述したように、従来のJL2株は、初代ニワトリ胚由来細胞において良好に増殖することが知られている。孵化卵細胞を使用することの欠点は、残りの卵由来タンパク質および他の未知の外来物質(他のウイルスを含む)のリスクに置く。このような残留卵由来タンパク質は、ワクチン接種された個体において望ましくないアレルギー反応を引き起こす原因となり得る。さらに、未知の他のウイルスの存在は、ワクチンのさらなるリスクを誘発する可能性がある。本発明者らは、流行性耳下腺炎ウイルスに対する安定なワクチンの開発に用いることができるVero細胞およびMRC−5細胞を用いて、安定した、均質で純粋な単離されたJL2株およびそれを含む組成物を開発した。
第5の実施形態では、本発明は、遺伝的に均質であり、熱安定性のJL2株を含む安定なワクチンを提供する。
さらなる実施形態では、本ワクチンは、本発明のJeryl Lynnワクチンとともに、麻疹、風疹、水痘および他の生ウイルスワクチン株を含む組み合わせワクチンを提供する。
第6の実施形態において、本発明は、従来の逆遺伝学的方法論を用いて上記免疫原性組成物を開発する方法を提供する。それは、流行性耳下腺炎ウイルスのJL2株の全長ゲノムを開発するためのクローニング法を含む。このようなJL2株の完全長ゲノムは、単離されたJeryl Lynn株の元のm−RNAから逆転写される。安定した合胞体形成は、本発明の逆転写されたJL2株から得られる細胞変性効果として起こる。本発明の単離されたJL2株から得られたそのような合胞体は、遺伝的に均質であり、高度に免疫原性である。そのような免疫原性ワクチン株は、異なる哺乳動物細胞系を用いて、産生細胞培養で増殖させることができる。本発明者らは、古典的なJeryl Lynnワクチンに使用されるCEF初代細胞と比較して、Vero細胞、MRC−5細胞またはHEK293T細胞などの細胞基質が、より低い生産コストで複数の継代においてより良好な細胞増殖を示すことを見出した。
上述の哺乳動物細胞株を用いて得られた免疫原性組成物は、JL2染色の所望の力価を生成する品質および感受性に関して一貫しているが、CEF初代細胞の場合には再現性がない。
さらに、本発明による免疫原性組成物は、任意の初代細胞の場合ではない適切な安定な二次細胞株を使用することによって、細胞基質からの新規の外来物質の汚染のリスクを回避するのに役立つ。本明細書に記載の免疫原性組成物が商業的に実行可能であることを意味する。
適切なベクターを使用して適切な宿主細胞をトランスフェクションすることを含むクローニングストラテジーを含む、本発明による上記免疫原性組成物を開発する方法が提供される。
この実施形態の1つでは、本発明は、以下の工程を含む、組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生するための方法を提供する:
a.流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたJL2のゲノム配列断片の化学合成;
b.増幅用の中間ベクターへの得られた各遺伝子断片のクローニング;
c.単一ベクターへの各遺伝子断片の連結を介して、pMuVJL2ベクターを得るために、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたJL2株の完全長DNAゲノムのクローンの構築。
d.流行性耳下腺炎ウイルスレスキューのマイナス鎖に対して、トランス作用性タンパク質がNPタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質から選択される、トランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクターとpMuVJL2の宿主細胞の同時トランスフェクション;
e.場合により、救済された流行性耳下腺炎ウイルスをその拡大のために宿主細胞に継代すること。
a.流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたJL2のゲノム配列断片の化学合成;
b.増幅用の中間ベクターへの得られた各遺伝子断片のクローニング;
c.単一ベクターへの各遺伝子断片の連結を介して、pMuVJL2ベクターを得るために、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化されたJL2株の完全長DNAゲノムのクローンの構築。
d.流行性耳下腺炎ウイルスレスキューのマイナス鎖に対して、トランス作用性タンパク質がNPタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質から選択される、トランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクターとpMuVJL2の宿主細胞の同時トランスフェクション;
e.場合により、救済された流行性耳下腺炎ウイルスをその拡大のために宿主細胞に継代すること。
さらなる実施形態では、本発明は、適切な医薬として許容される担体または賦形剤を伴う免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
実施形態の1つでは、本発明は、適切な緩衝剤、安定化剤、等張剤、界面活性剤および凍結保護剤を伴う免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。
実施形態の1つでは、緩衝液は、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液などから選択することができ、好ましくはリン酸緩衝液である。
実施形態の1つでは、安定化剤は、アミノ酸、糖、ポリオールおよびそれらの組み合わせから選択することができる。
実施形態の1つでは、アミノ酸は、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、システイン/シスチンおよびそれらの適切な組み合わせから選択することができる。
本発明において、糖は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ラフィノースおよびそれらの適切な混合物から選択することができ、好ましくはトレハロースまたはソルビトールまたはマンニトールである。
さらに、ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な組み合わせから選択することができ、好ましくはソルビトールである。
実施形態の1つでは、適切な張性剤は、上記医薬組成物のための糖、塩およびそれらの組み合わせから選択することができる。
実施形態の1つでは、適切な塩は、等張剤、例えば、NaClまたはKClなどから選択することができる。
本発明において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ならびにそれらの組み合わせから選択することができる。
さらに、凍結防止剤は、糖などから選択することができる。
さらなる実施形態では、本発明は、適切なアジュバントと共に組換えJL2(rMuVJL2FL)を含む免疫原性組成物を提供する。
アジュバントは、ワクチンへの身体の免疫応答を増加させるためにワクチンに添加される物質として定義することができる。
本発明によるアジュバントは、アルミニウムの塩、モノホスホリルリピド(Mono Phosphoryl Lipid)類似体、例えば、GLA(グルコピラノシル脂質アジュバント)、モナチド、サイトカイン誘導物質、およびスクアレン系アジュバント、親油性アジュバントなどから選択することができる。
好ましい実施形態では、本発明は、Jeryl Lynnに対する本発明の免疫原性組成物を含有するワクチンを提供する。これらのワクチンは、従来の経路および用量で投与することができる。
本発明において使用される分析方法
1.RT−PCR:逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)は、RNAを逆転写することによって相補的DNAを合成および増幅するために使用される方法である。RT−PCRは、逆転写酵素およびプライマーを用いて、所望のRNA配列をアニールおよび伸長させる。RNAが存在する場合、逆転写酵素およびプライマーはRNA配列にアニーリングし、DNAの相補鎖(cDNA)を転写する。次いで、この鎖をプライマーおよびTaqポリメラーゼで複製し、標準PCRプロトコールに従う。このプロトコールは、一本鎖DNAを少ない時間量で何百万回もコピーして、相当量のDNAを生成する。次いで、PCR産物(cDNA鎖)をアガロースゲル電気泳動で分離する。
1.RT−PCR:逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)は、RNAを逆転写することによって相補的DNAを合成および増幅するために使用される方法である。RT−PCRは、逆転写酵素およびプライマーを用いて、所望のRNA配列をアニールおよび伸長させる。RNAが存在する場合、逆転写酵素およびプライマーはRNA配列にアニーリングし、DNAの相補鎖(cDNA)を転写する。次いで、この鎖をプライマーおよびTaqポリメラーゼで複製し、標準PCRプロトコールに従う。このプロトコールは、一本鎖DNAを少ない時間量で何百万回もコピーして、相当量のDNAを生成する。次いで、PCR産物(cDNA鎖)をアガロースゲル電気泳動で分離する。
2.アガロースゲル電気泳動:アガロースゲル電気泳動は、アガロースのマトリックス中のDNAまたはタンパク質の混合集団を分離するための生化学、分子生物学、遺伝学および臨床化学において用いられるゲル電気泳動の方法である。
3.プライマーウォーキング配列決定法:プライマーウォーキングは、大きなDNA断片を配列決定するための最適な配列決定方法である。単一の配列において長すぎて配列決定されない断片は、チェーン・ターミネーション法を用いて読み取られる。この方法は、長い配列をいくつかの連続する短い配列に分割することによって機能する。用語「プライマーウォーキング」とは、主な目的がゲノムを配列することである場合に使用される。
4.多重配列分析:多重配列分析は、生物学的配列の分析に用いられ、分析のために整列された配列間の類似および相違の領域を決定するための方法である。
以下の非限定的な例は、適切な哺乳類細胞へのゲノムおよび構造的プラスミドの同時トランスフェクションからのJL2の救済を記載する。さらに、限界希釈法を用いた純粋で遺伝的に均質なJL2株の単離を本明細書において以下に記載する。異なる宿主細胞を有する他の免疫原性組成物を調製することができ、このような免疫原性組成物は当業者の範囲内であり、本発明の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例1:流行性耳下腺炎ウイルスを弱毒化したJL2株の完全長DNAゲノムのクローンの構築
流行性耳下腺炎JL2の全長cDNAの作製
6つのゲノム配列断片を流行性耳下腺炎ウイルスの全ゲノム長(15,384bp)をカバーするように化学合成した(GeneArt−Thermo Fisher Scientific)。続いて、各ゲノム断片およびベクターを特異的制限エンドヌクレアーゼ(New England Bio Labs)で切断し、中間ベクターにクローニングした。各断片は、図1に示すようにアガロースゲル上でそれらを分離することによって確認した。制限消化後に得られた断片を以下に記載する。
断片1:1〜3576位 NotI−RsrII(配列番号1);
断片2:3576〜6258位 RsrII−AvrII(配列番号2);
断片3:6258〜8438位 AvrII−XhoI(配列番号3);
断片4:8438〜10498位 XhoI−KpnI(配列番号4);
断片5:10498〜13950位 KpnI−XmaI(配列番号5);
断片6:13950〜15440位 XmaI−NarI(配列番号6)
流行性耳下腺炎JL2の全長cDNAの作製
6つのゲノム配列断片を流行性耳下腺炎ウイルスの全ゲノム長(15,384bp)をカバーするように化学合成した(GeneArt−Thermo Fisher Scientific)。続いて、各ゲノム断片およびベクターを特異的制限エンドヌクレアーゼ(New England Bio Labs)で切断し、中間ベクターにクローニングした。各断片は、図1に示すようにアガロースゲル上でそれらを分離することによって確認した。制限消化後に得られた断片を以下に記載する。
断片1:1〜3576位 NotI−RsrII(配列番号1);
断片2:3576〜6258位 RsrII−AvrII(配列番号2);
断片3:6258〜8438位 AvrII−XhoI(配列番号3);
断片4:8438〜10498位 XhoI−KpnI(配列番号4);
断片5:10498〜13950位 KpnI−XmaI(配列番号5);
断片6:13950〜15440位 XmaI−NarI(配列番号6)
本実施例において言及される制限部位は、当業者に周知である。当業者は、その要求に従って代替の制限部位を使用することができる。
得られた断片の転写ベクターへのクローニングおよび断片の連結
化学的に合成され、制限エンドヌクレアーゼで処理された断片は、最終ベクターとして改変されたpBluescript II SK(+)を用いて、段階的なクローニング法によりプラスミドに組み込まれた。相補的な凝集末端を介して断片を互いに進行的に連結することにより、最終的なpMuVJL2プラスミドが得られた。pMuVJL2プラスミドのベクターマップが図2に示されている。プラスミドpMuVJL2は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する。適切なベクターにクローニングすることにより、流行性耳下腺炎ウイルスの構造タンパク質の遺伝子を含むヘルパープラスミド、およびT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製した。ここで、pSC6ベクターは、トランス作用性タンパク質およびT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングに使用されている。本出願に記載のクローニングは、Sambrook and Russel(2001)に記載されているように行った。
化学的に合成され、制限エンドヌクレアーゼで処理された断片は、最終ベクターとして改変されたpBluescript II SK(+)を用いて、段階的なクローニング法によりプラスミドに組み込まれた。相補的な凝集末端を介して断片を互いに進行的に連結することにより、最終的なpMuVJL2プラスミドが得られた。pMuVJL2プラスミドのベクターマップが図2に示されている。プラスミドpMuVJL2は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を有する。適切なベクターにクローニングすることにより、流行性耳下腺炎ウイルスの構造タンパク質の遺伝子を含むヘルパープラスミド、およびT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製した。ここで、pSC6ベクターは、トランス作用性タンパク質およびT7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子のクローニングに使用されている。本出願に記載のクローニングは、Sambrook and Russel(2001)に記載されているように行った。
実施例2:弱毒化された流行性耳下腺炎Jeryl−Lynn 2ウイルスのレスキュー
市販のHEK293T細胞は、ヘルパープラスミドp NJL2、p PJL2、p LJL2およびpSC6−T7と一緒にpMuVJL2によりトランスフェクトされた。HEK293T細胞は、35mmウェルに播種され、トランスフェクションしたとき、50〜70%のコンフルエンスに達した。コンフルエントは、培養皿またはフラスコ中の接着細胞の数の推定値として一般に使用される用語であり、細胞単層によって覆われる表面の割合を指す。トランスフェクションの4時間前に、培地を10%FCSを含む3mlのDMEMと置換した。全ての組換えプラスミドは、QIAGENプラスミド調製キットに従って調製された。DNAのCa2+リン酸塩共沈殿のためのキットは、Invitrogenから入手した。
市販のHEK293T細胞は、ヘルパープラスミドp NJL2、p PJL2、p LJL2およびpSC6−T7と一緒にpMuVJL2によりトランスフェクトされた。HEK293T細胞は、35mmウェルに播種され、トランスフェクションしたとき、50〜70%のコンフルエンスに達した。コンフルエントは、培養皿またはフラスコ中の接着細胞の数の推定値として一般に使用される用語であり、細胞単層によって覆われる表面の割合を指す。トランスフェクションの4時間前に、培地を10%FCSを含む3mlのDMEMと置換した。全ての組換えプラスミドは、QIAGENプラスミド調製キットに従って調製された。DNAのCa2+リン酸塩共沈殿のためのキットは、Invitrogenから入手した。
細胞は、以下の最終濃度でプラスミドと同時トランスフェクトされた。
p NJL2 0.5μg、
p PJL2 0.1μg、
p LJL2 0.5μg、
pSC6−T7 1.0μg、
pMuVJL2 5.0μg
p NJL2 0.5μg、
p PJL2 0.1μg、
p LJL2 0.5μg、
pSC6−T7 1.0μg、
pMuVJL2 5.0μg
H2Oで希釈した上記のプラスミドを2M CaCl2を含むエッペンドルフチューブに添加し、混合物を振とう条件下でHEPES緩衝液を含む別のエッペンドルフチューブに添加し、室温(RT)で30分間インキュベートした。共沈殿物を培養液に滴下し、37℃、5%CO2で約18時間トランスフェクションを行った。続いて、トランスフェクション培地を、FCSを含まないDMEM 3.0mlと置換した。T7ポリメラーゼの一過性発現は、T7促進遺伝子の効率的なタンパク質発現を可能にし、最終的に流行性耳下腺炎救済のマイナス鎖に導いた。トランスフェクトされた細胞を合胞体形成まで約15日間モニターした。単一のプラークからの合胞体形成が図3に示されている。ウイルスの継代0(P0)を確立するために、WHOが承認したVero細胞に感染するために単一の合胞体が拾われた。
救済された組換え弱毒化ウイルスは、rMuVJL2FLと命名される。rMuVJL2FLのヌクレオチド配列は、配列番号8に記載される。
救済された流行性耳下腺炎ウイルスの解析的配列決定
トランスフェクションの約15日後、最初の合胞体が出現するとすぐに、単一クローンを顕微鏡下で吸引し、続いて特徴付けに使用した。特徴付けは、救済されたrMuVJL2FLウイルスゲノムの配列決定によって行った。rMuVJL2FL感染したVero細胞からのウイルスRNAは、Qiagen RNeasy Miniキットに従って調製した。2.0μlの抽出されたウイルスRNAから出発して、Qiagen OneStep RT−PCRキットの指示に従って、逆転写および増幅を順次行った。
トランスフェクションの約15日後、最初の合胞体が出現するとすぐに、単一クローンを顕微鏡下で吸引し、続いて特徴付けに使用した。特徴付けは、救済されたrMuVJL2FLウイルスゲノムの配列決定によって行った。rMuVJL2FL感染したVero細胞からのウイルスRNAは、Qiagen RNeasy Miniキットに従って調製した。2.0μlの抽出されたウイルスRNAから出発して、Qiagen OneStep RT−PCRキットの指示に従って、逆転写および増幅を順次行った。
重複するPCR断片を増幅するために、全長ゲノム配列(15,384bp)をカバーする34のプライマー対が設計されている。精製されたPCRは、プライマーウォーキング配列決定手順に従って配列決定されている。
バリュー・リード配列は、rMuVJL2FLウイルスゲノム全体をカバーして組み立てられている。元のプラスミドpMuVJL2の配列に対して、救済されたrMuVJL2FLのL遺伝子において6点突然変異が検出され、多重配列分析によって確認された。
実施例3:救済された流行性耳下腺炎JL2ウイルスの拡大
救済されたrMuVJL2FLウイルスのP0継代は、WHO承認のベロ細胞で増殖した。Vero細胞は、5%FBSを補充したDMEM中で単層として維持され、コンフルエンスが70〜80%に達したとき、救済されたrMuVJL2FLウイルスのP0継代により、全体積が5.0mLのOPTIMEM中で5.0〜1.0mLの救済されたウイルスを用いて感染された。細胞を37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。インキュベーション後、接種材料をDMEM+5%FBSで置換した。感染した細胞は2日後に分裂し、5−dpi後に90〜100%の合胞体形成が観察された。回収した無細胞画分(CF)の1×104pfu/mLと回収された細胞関連画分(CA)の1×106pfu/mLの間に力価を達するように、無細胞(CF)および細胞関連(CA)画分を回収し、ラボスケールのウイルスストックを得た。
救済されたrMuVJL2FLウイルスのP0継代は、WHO承認のベロ細胞で増殖した。Vero細胞は、5%FBSを補充したDMEM中で単層として維持され、コンフルエンスが70〜80%に達したとき、救済されたrMuVJL2FLウイルスのP0継代により、全体積が5.0mLのOPTIMEM中で5.0〜1.0mLの救済されたウイルスを用いて感染された。細胞を37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。インキュベーション後、接種材料をDMEM+5%FBSで置換した。感染した細胞は2日後に分裂し、5−dpi後に90〜100%の合胞体形成が観察された。回収した無細胞画分(CF)の1×104pfu/mLと回収された細胞関連画分(CA)の1×106pfu/mLの間に力価を達するように、無細胞(CF)および細胞関連(CA)画分を回収し、ラボスケールのウイルスストックを得た。
実施例4:救済された流行性耳下腺炎JL2ウイルスのマスター細胞バンクの調製および単一ウイルス回収物の生産
P0継代から救出された流行性耳下腺炎ウイルスは、十分なマスターシードを得るために、Vero細胞の継代2(P2)までさらに継代された。
P0継代から救出された流行性耳下腺炎ウイルスは、十分なマスターシードを得るために、Vero細胞の継代2(P2)までさらに継代された。
Vero細胞における各継代後に得られた力価を以下に示す:
P0継代:1×103pfu/mL(CF、無細胞画分)〜1×104pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
P1継代:1×104pfu/mL(CF、無細胞画分)〜5×104pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
P2継代:1×104pfu/mL(CF、無細胞画分)〜1×106pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
P0継代:1×103pfu/mL(CF、無細胞画分)〜1×104pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
P1継代:1×104pfu/mL(CF、無細胞画分)〜5×104pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
P2継代:1×104pfu/mL(CF、無細胞画分)〜1×106pfu/mL(CA、細胞関連画分)の間の力価。
このようなマスターシードは、−150℃〜−196℃の間の温度で貯蔵される。このマスターシードは、ヒト用の市販のワクチンを調製するためのワーキングシードを生産するために使用される。マスターシードから得られたワーキングシードは、Vero細胞における単一のウイルス回収物の生産に使用される。マスターシードから得られたワーキングシードは、MRC5細胞における単一のウイルス回収物の生産に使用することができる。MRC5細胞における単一のウイルス回収物の産生はまた本明細書において以下に例示する。
MRC5細胞における単一のウイルス回収物の生産
細胞の増殖
培地を除去し、細胞をMEM EBS培地で洗浄し、1ml/T75cm2および10ml/RB 850cm2でTrypLE溶液を添加(トリプシン置換)し、35±2℃でインキュベートした。新鮮な培地での分離後に細胞を再懸濁し、新しい培養フラスコおよびローラーボトルに播種した。完全にコンフルエントなT75フラスコを、バッチサイズに応じて、次の継代でそれぞれT75、T75およびRB850ローラーボトルの1:4〜1:16の比で分割した。細胞を1週間に1回、および十分なコンフルエンスを達成した後に分割した。その後、ウイルス接種に細胞を用いた。
細胞の増殖
培地を除去し、細胞をMEM EBS培地で洗浄し、1ml/T75cm2および10ml/RB 850cm2でTrypLE溶液を添加(トリプシン置換)し、35±2℃でインキュベートした。新鮮な培地での分離後に細胞を再懸濁し、新しい培養フラスコおよびローラーボトルに播種した。完全にコンフルエントなT75フラスコを、バッチサイズに応じて、次の継代でそれぞれT75、T75およびRB850ローラーボトルの1:4〜1:16の比で分割した。細胞を1週間に1回、および十分なコンフルエンスを達成した後に分割した。その後、ウイルス接種に細胞を用いた。
単一のウイルス回収物生産
単一のウイルス回収−流行性耳下腺炎は、MRC−5細胞にワーキングウイルス種子を感染させ、ウイルス吸着のために33±2℃で60〜120分間インキュベートすることにより産生させた。吸着後、各感染ローラーボトルに250〜300mLのCreek最小培地(CMM)を補充し、33±2℃、0.5rpmでローラー装置中で40〜70時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、すべてのローラーボトルを単層の透明性および分離について観察した。単層をプレーンMEM培地で洗浄し、100〜200mLのプレーンMEM培地で補充した。ボトルをローラー装置中で33±2℃、0.5rpmで5〜13日間再びインキュベートした。インキュベーションの終わりに、全てのローラーボトルを細胞病理学的効果の明瞭さと存在について観察し、単一の容器内の全てのローラーボトルから回収した。ヒト血清アルブミンを、回収したウイルス採取のための安定化剤として使用した。その後、単一の回収物として個々の予め滅菌されたPETGボトルに分配した。こうして得られたバルクを浄化し、流行性耳下腺炎ワクチンを製造するのに必要な濃度に希釈した。感染のないMRC5細胞(対照)およびrMuVJL2FLに感染したMRC5細胞をそれぞれ図4に(a)および(b)として示す。
単一のウイルス回収−流行性耳下腺炎は、MRC−5細胞にワーキングウイルス種子を感染させ、ウイルス吸着のために33±2℃で60〜120分間インキュベートすることにより産生させた。吸着後、各感染ローラーボトルに250〜300mLのCreek最小培地(CMM)を補充し、33±2℃、0.5rpmでローラー装置中で40〜70時間インキュベートした。インキュベーションの完了後、すべてのローラーボトルを単層の透明性および分離について観察した。単層をプレーンMEM培地で洗浄し、100〜200mLのプレーンMEM培地で補充した。ボトルをローラー装置中で33±2℃、0.5rpmで5〜13日間再びインキュベートした。インキュベーションの終わりに、全てのローラーボトルを細胞病理学的効果の明瞭さと存在について観察し、単一の容器内の全てのローラーボトルから回収した。ヒト血清アルブミンを、回収したウイルス採取のための安定化剤として使用した。その後、単一の回収物として個々の予め滅菌されたPETGボトルに分配した。こうして得られたバルクを浄化し、流行性耳下腺炎ワクチンを製造するのに必要な濃度に希釈した。感染のないMRC5細胞(対照)およびrMuVJL2FLに感染したMRC5細胞をそれぞれ図4に(a)および(b)として示す。
流行性耳下腺炎ワクチン(JL)製造物を効力について試験し、細胞培養法により試験した104.12/ml〜104.57/mlのCCID50(培養細胞の50%に感染する細胞培養感染用量)の範囲にあることが判明した。
実施例5:プラークアッセイおよびインサイチュ免疫蛍光法による流行性耳下腺炎JL2株の同定および定量
プラークアッセイによるウイルス滴定
ウイルス調製物の連続10倍希釈をOPTIMEMを用いて最終容量0.5mlになるまで実施した。各希釈物を35mmのVero細胞培養物に添加した。ウイルス吸着の1時間後、接種物を除去し、感染細胞に5%FCSおよび1%低融点アガロース(LMPアガロース)を含む2.0mlのDMEMを重層した。37℃および5%CO2での5日間のインキュベーション後、培養物を1mlの10%TCAで1時間固定し、次いでUV架橋を30分間行った。アガロースオーバーレイを除去した後、細胞単層を4%エタノールに溶解したクリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、プラークを倒立顕微鏡下で計数した。顕微鏡画像は図5に与えられる。
プラークアッセイによるウイルス滴定
ウイルス調製物の連続10倍希釈をOPTIMEMを用いて最終容量0.5mlになるまで実施した。各希釈物を35mmのVero細胞培養物に添加した。ウイルス吸着の1時間後、接種物を除去し、感染細胞に5%FCSおよび1%低融点アガロース(LMPアガロース)を含む2.0mlのDMEMを重層した。37℃および5%CO2での5日間のインキュベーション後、培養物を1mlの10%TCAで1時間固定し、次いでUV架橋を30分間行った。アガロースオーバーレイを除去した後、細胞単層を4%エタノールに溶解したクリスタルバイオレットで染色し、水で洗浄し、プラークを倒立顕微鏡下で計数した。顕微鏡画像は図5に与えられる。
インサイチュ免疫蛍光
マスターシードの様々な10倍希釈物を、2%FBS(ウシ胎仔血清)を含有するMEM(最小必須培地)培地中のマスターシードウイルスから調製した。続いて、Vero細胞懸濁液を0.15〜0.20百万/mLの濃度範囲で調製した。この細胞懸濁液を96ウェルプレートにウイルス希釈上に注ぎ、5%CO2で37℃に保った。プレートを同じ条件下で10日間インキュベートした。10日後、プレートからの細胞上清を捨て、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。プレート中の細胞をアセトンメタノール固定緩衝液で固定した。FITC(フルオレセインイソチオシアネート)とコンジュゲートした抗流行性耳下腺炎IgG抗体を1:50の希釈倍率で添加した。ウイルス力価は、Spearman Karber式を用いて蛍光顕微鏡下で染色細胞を計数することによって決定した。
マスターシードの様々な10倍希釈物を、2%FBS(ウシ胎仔血清)を含有するMEM(最小必須培地)培地中のマスターシードウイルスから調製した。続いて、Vero細胞懸濁液を0.15〜0.20百万/mLの濃度範囲で調製した。この細胞懸濁液を96ウェルプレートにウイルス希釈上に注ぎ、5%CO2で37℃に保った。プレートを同じ条件下で10日間インキュベートした。10日後、プレートからの細胞上清を捨て、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した。プレート中の細胞をアセトンメタノール固定緩衝液で固定した。FITC(フルオレセインイソチオシアネート)とコンジュゲートした抗流行性耳下腺炎IgG抗体を1:50の希釈倍率で添加した。ウイルス力価は、Spearman Karber式を用いて蛍光顕微鏡下で染色細胞を計数することによって決定した。
Spearman Karber式:
x0=(全てのウェルが陽性である最低希釈のlog10)、d=希釈ステップのlog10、この場合は1、ni=複製数、この場合は6、ri=陽性ウェルの数。
実施例6:免疫原性組成物の形成
流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収の必要量を計算し、1000CCID50の標的力価を得た。同様に原材料(安定剤)の必要量を計算して、最終製品の組成に従って所望のバッチサイズのワクチンを製剤化した。計算量あたりの安定剤176(ゼラチンソルビトールと他のアミノ酸の組合せ混合物)およびM199(希釈剤)を滅菌容器に移し、流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収のその計算された量まで添加され、混合された。
流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収の必要量を計算し、1000CCID50の標的力価を得た。同様に原材料(安定剤)の必要量を計算して、最終製品の組成に従って所望のバッチサイズのワクチンを製剤化した。計算量あたりの安定剤176(ゼラチンソルビトールと他のアミノ酸の組合せ混合物)およびM199(希釈剤)を滅菌容器に移し、流行性耳下腺炎ワクチンの単回回収のその計算された量まで添加され、混合された。
最終製剤は以下に記載の通りである。
最終製剤を0.5ml/バイアルに充填し、バイアルを半分にし、標準サイクルで凍結乾燥させた。ここで、急速凍結は−60℃、一次乾燥は−40℃で、二次乾燥は37℃で行った。1分未満で再構成され、水分試験は1.6%〜2%に下がるラウンドインタクトなケーキが見出された。
製造された流行性耳下腺炎ワクチン(JL)ワクチンは、効力について試験され、細胞培養法により試験した103/用量〜103.57/mlのCCID50の範囲にあることが判明した。
本発明の免疫原性組成物は、標準的な免疫アッセイ法により救済された流行性耳下腺炎ウイルスの免疫原性の測定について試験される。このような免疫アッセイ法の例は、ELISA(酵素結合免疫吸着検査法)および流行性耳下腺炎ウイルス中和抗体の測定に使用される他の標準的方法である。このようなアッセイは、非霊長類または霊長類における救済されたウイルスの免疫原性を決定するために使用され得る。このような研究は、上記ワクチンの最適用量および投与計画を決定するために有用であり得る。救済された流行性耳下腺炎ウイルスを有する本発明の免疫原性組成物は、さらなるワクチン調製に適していることが見出される。本発明による救助された流行性耳下腺炎ウイルスを製造するためのプロセスは、任意の他のウイルス性または非ウイルス性病原体由来の任意の要素の使用を伴わない。このようにして、救済された流行性耳下腺炎ウイルスは安定で均質であり、したがって、流行性耳下腺炎以外の病原性粒子を欠いている。よって、本発明による救済された流行性耳下腺炎ウイルスは、ワクチン開発に適した候補である。
Claims (14)
- 配列番号8を有するポリヌクレオチド配列を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株の単離された全長ゲノムであって、ここで、JL2株が、HEK293T細胞、Vero細胞及びMRC−5細胞から選択される宿主細胞において増殖する、前記単離された全長ゲノム。
- 宿主細胞が、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含み、ここで、ベクターが、pUC19、pBluescript、pBluescript II、pBluescript II SK(+)、pCA又はpSC6から選択される、請求項1に記載の単離された全長ゲノム。
- 請求項1に記載の流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株の全長ゲノムを含む流行性耳下腺炎ウイルスワクチン。
- 適切な医薬としての賦形剤とともに、請求項1に記載の流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株の全長ゲノムを含有する免疫原性組成物。
- 医薬としての賦形剤が、緩衝剤、安定化剤、等張剤、界面活性剤、アジュバント、凍結保護剤又はそれらの組み合わせから選択される、請求項4に記載の免疫原性組成物。
- (a)緩衝液が、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液、及びそれらの混合物から選択され;
(b)安定化剤が、アミノ酸、糖、ポリオール、又はそれらの組み合わせから選択され;
(c)等張剤が、糖、塩、又はそれらの組み合わせから選択され;
(d)界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tween)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、又はそれらの組み合わせから選択され;
(e)アジュバントが、アルミニウム、モノホスホリル脂質類似体、サイトカイン誘導物質、スクアレン系アジュバント、親油性アジュバント、又はそれらの組合せから選択され;そして
(f)凍結防止剤が糖である、請求項5に記載の免疫原性組成物。 - アミノ酸、糖、ポリオール、若しくはそれらの組み合わせから選択される安定化剤、緩衝剤、または塩を含む、請求項6に記載の免疫原性組成物。
- 緩衝液が、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、アルギニン緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トロメタミン緩衝液、及びそれらの混合物から選択され;
アミノ酸が、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、システイン/シスチン、及びそれらの適切な組み合わせから選択され;
糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ソルボース、リボース、デオキシリボース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、及びそれらの適切な混合物から選択され、好ましくはトレハロース又はラフィノースから選択され;
ポリオールが、マンニトール、ソルビトール、デキストラン、グリセロール、アラビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの適切な組み合わせから選択され;そして
塩が、NaCl又はKClから選択される、請求項7に記載の免疫原性組成物。 - 以下の要素:
a.請求項1に記載のポリヌクレオチド配列を含む転写ベクター;
b.NPタンパク質、Pタンパク質、Lタンパク質、及びそれらの組み合わせから選択されるトランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクター;
c.請求項1に記載のポリヌクレオチド配列の適切な転写のためのRNAポリメラーゼ
を含むレスキュー組成物。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え流行性耳下腺炎ウイルスを生成する方法であって、
a.流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株のゲノム配列断片を化学合成するステップ:
b.得られた各遺伝子断片およびそれらの組み合わせを、それを増幅するための中間ベクターにクローニングするステップ;
c.ステップbから得られた各遺伝子断片を単一の転写ベクターに連結することによりpMuVJL2ベクターを得るために、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒化JL2株の全長DNAゲノムのクローンを構築するステップ;
d.pMuVJL2と、トランス作用性タンパク質をコードする単離された遺伝子を含む発現ベクターとを宿主細胞に同時トランスフェクトするステップであって、ここで、トランス作用性タンパク質が、NPタンパク質、Pタンパク質、及びLタンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスのマイナス鎖をレスキューするためのRNAポリメラーゼから選択される上記ステップ;
e.場合により、レスキューされた流行性耳下腺炎ウイルスをその拡大のために宿主細胞中で継代するステップ
を含む上記方法。 - NPタンパク質、Pタンパク質、及びLタンパク質をコードする遺伝子が、それぞれ配列番号9、配列番号10、及び配列番号11に示される、請求項9に記載のレスキュー組成物。
- NPタンパク質、Pタンパク質、及びLタンパク質のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号12、配列番号13、及び配列番号14に示される、請求項9に記載のレスキュー組成物。
- RNAポリメラーゼをコードするベクターが、配列番号15のポリヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生する方法。
- 転写ベクター又は中間ベクターが、pUC19、pBluescript、pBluescript II、pBluescript II SK(+)、pCA、又はpSC6から選択され;
宿主細胞が、HEK293T細胞、Vero細胞、及びMRC−5細胞から選択される、請求項10に記載の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを生成する方法。
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