Przedmiotem wynalazku jest sposób wyosobnia¬ nia skladników hemoaglutyninowych i neuramini¬ dazowych z wirusa grypy. Wynalazek dotyczy selektywnego oddzielania i wyosabniania uodporniajacych skladników wiru^ sa, powodujacego grype. Na fig. 1 rysunku przedstawiono schematycznie czastke wirusa grypy. Material genetyczny, to jest kwas rybonykleinowy (RNA), razem z nukleopro- teina okreslonej grupy, jest otoczony podwójna blona, skladajaca sie z wewnetrznej warstwy pro¬ teinowej i warstwy zewnetrznej z substancji lipi- dowej, wlasciwej dla gospodarza. Na powierzchni blony, otaczajacej wirusa, znajduja sie dwie gli- koproteiny, a mianowicie hemoaglutynina i neura- minidaza w postaci kolców. Wiadomo, ze dwie glikoproteiny — hemoagluty¬ nina i neuraminidaza stanowia najwazniejsze sklad¬ niki wirusa grypy, podczas gdy wszystkie inne skladniki, w tym równiez inne proteiny wirusowe, kwasy nukleinowe i lipidy, nie maja istotnego znaczenia dla powstawania odpornosci. Jednakze obecnosc tych nieistotnych skladników w szcze¬ pionce przeciw grypie moze wywolywac niepo¬ zadane oddzialywania uboczne, a w kazdym przy¬ padku ograniczaja one ilosc szczepionki, która moze byc podana, zmniejszajac tym samym stopien u- odpornienia. Idealna szczepionka przeciwgrypowa powinna przeto skladac sie z obu zasadniczych substancji uodporniajacych, to jest z hemoaglutyniny i neura¬ minidazy i nie powinna zawierac wcale lub pra¬ wie wcale nieistotnych skladników wirusa. Znane sposoby oddzielania skladników, uodporniajacych przed grypa, polegaly na tym, ze poczatkowo sta¬ rano sie calkowicie rozszczepic lub rozpuscic skladniki wirusa, np. za pomoca anionowych de¬ tergentów, takich jak sól sodowa kwasu dezo- ksycholanowego lub dodecylosiarczan sodowy. W tym procesie uwalniane sa wszystkie lub najistot¬ niejsze skladniki wirusa i przechodza do roztworu razem ze skladnikami nadajacymi odpornosc. Ko¬ nieczne nastepnie calkowite lub czesciowe oczysz¬ czanie zadanych substancji nadajacych odpornosc jest pracochlonne, a wydajnosc procesu jest zwykle mala. Sposób wedlug wynalazku umozliwa wyosob¬ nianie uodporniajacych substancji, to jest hemo- aglutyniny i neuraminidazy, przez selektywne roz¬ puszczanie tych skladników, podczas gdy pozostale czastki wirusa, skladajace sie z nienaruszonych lipidów i blon proteinowych, zawierajace inne, nie¬ istotne skladniki wirusa, pozostaja nierozpuszczo- ne. Rózna wielkosc i ciezar wlasciwy roztworzonej substancji uodporniajacej i pozostalych czastek wirusa umozliwia oddzielanie substancji uodpor¬ niajacych zwyklymi metodami, stosowanymi do rozdzielania, opartymi na róznicy fizycznych wlas¬ ciwosci. Stwierdzono mianowicie, ze to selektywne roztwarzanie hemoaglutyniny i neuraminidazy 93 68993 689 3 4 mozna osiagnac przez traktowanie wirusa grypy kationowym detergentem. Przedmiotem wynalazku jest sposób wyosobnia¬ nia skladników hemoaglutyniny i neuraminidazy z wirusa grypy przez traktowanie tego wirusa w wodnym srodowisku kationowym detergentem o wzorze 1, w którym Rx i R3 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki alkilowe, R2 oznacza rodnik alkilowy lub benzylowy, R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X oznacza anion halogenku, siarczanu lub octanu, albo chlorkiem lub bromkiem benzalkoniowym lub chlorkiem de- kametoniow^mT w celu selektywnego roztworzenia T &WA pljl^cfajkówii nastepnie oddzielenie otrzyma- \ nych roztworzonych skladników od pozostalych czastek wirusa. | -Proces^wedlu'g [wynalazku prowadzi sie korzyst¬ acie, stosujac-Wirusy grypy typów A, Al, A2 lub B albo mieszanine dwóch lub kilku takich wirusów. Dobór okreslonego szczepu zalezy oczywiscie od zadanej odpornosci i wyosabnianych substancji uodporniajacych, ale mozna np. stosowac nastepu¬ jace szczepy: A2 (Aichi) 68, MRC-2 [rekombinanty typów A2 (Anglia) 42/72], MRC-11 [rekombinanty typów A2 (Port Chalmers) 73], A (Pasteur 30 C) „Mutagrip", Instytut Pasteura) i B (Mass) 67. Stosowany zgodnie z wynalazkiem szczep wiru¬ sa grypy korzystnie rozmnaza sie w znany sposób, np. przez przeszczepianie na jedenastodniowe em¬ brionalne jajo kurze i przez inkubacje w ciagu odpowiedniego czasu i w odpowiedniej tempera¬ turze np. w ciagu 2 dni w temperaturze 37°C. Otrzymane ciecze omoczniowe laczy sie i oczyszcza, steza wirus za pomoca ultrawirówki, i ponownie wytwarza zawiesine w fizjologicznym roztworze chlorku sodowego z dodatkiem np. fosforanowego roztworu buforowego, albo przez ultrawirowanie w wirówce ze strefowym przeplywem, przy uzy¬ ciu np. gradientu z cukru trzcinowego w fizjolo¬ gicznym roztworze chlorku sodowego buforowanego fosforanem i nastepnie zmniejszanie zawartosci cukru trzcinowego np. do mniej niz 5%*, korzystnie dializujac za pomoca fizjologicznego roztworu chlorku sodowego, albo przez chromatografowanie na preparacie Sephadex lub przez rozcienczanie. Stezenie wyjsciowego wirusa nie ma decydujacego znaczenia i moze byc nastawiane zaleznie od za¬ danej ilosci (zawartosci) substancji uodporniajacej. Wartosc.pH koncentratu wirusa powinna wyno¬ sic korzystnie 6,5—8,5 i nastawia ja, stosujac e- wentualnie roztwór buforowy, np. fosforanowy, dodawany do koncentratu przed dodaniem katio¬ nowego detergentu. Koncentrat mozna takze dezak- tywowac, np. przez dodanie aldehydu mrówko¬ wego. Nastepnie do koncentratu wirusa dodaje sie kationowy detergent, korzystnie w postaci wodne¬ go roztworu. Ilosc kationowego detergentu, która powinna.byc dodana, zalezy np. od rodzaju stoso¬ wanego detergentu. Ogólnie biorac, kationowy de¬ tergent dodaje sie w takiej ilosci, aby stosunek wagowy detergentu do proteiny w otrzymanej mie¬ szaninie wynosil 1:2 do 1:10, a zwlaszcza 1:3 do 1:5. Po dodaniu detergentu mieszanine nalezy ko¬ rzystnie pozostawic do odstania np. w okresie od minut do* 16 godzin, w temperaturze 4—37°C, przy czym im wyzsza temperatura, tym krótszy jest czas odstawania. Korzystnie utrzymuje sie mieszanine w ciagu 30—60 minut w temperaturze pokojowej lub w ciagu nocy w temperaturze 4°C. Zgodnie z wynalazkiem jako kationowe detegen- ty mozna stosowac zwiazki o ogólnym wzorze la, w którym R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 ato¬ mach wegla, R\ i R'3 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki metylowe, lub etylowe, R'2 ozna- io cza rodnik metylowy lub benzylowy, a X' oznacza anion halogenku. Korzystnymi zwiazkami o wzorze la sa zwiazki o ogólnym wzorze laa, w którym R4 i X' maja wyzej podane znaczenie, albo zwiazki o ogólnym wzorze lab, w którym R4 i X' maja wyzej podane znaczenie. Jako rodniki alkilowe o 8—22 atomach wegla korzystnie wystepuja rodniki o 12—18 atomach wegla, a zwlaszcza rodniki laurylowe, mirystylowe, cetylowe i stearylowe. W podanych wyzej wzorach X i X' oznaczaja korzystnie anion chlorkowy i bromkowy. Korzystnymi zwiazkami o wzorze laa sa zwlasz¬ cza sole mirystylotrójmetyloamoniowe i cetylotrój- metyloamoniowe, a szczególnie chlorki lub bromki, przy czym bromki sa korzystniejsze. Korzystnymi zwiazkami o wzorze lab sa sole stearylodwumety- lobenzyloamoniowe, zwlaszcza chlorki lub bromki, ale przede wszystkim bromki. Jako zwiazki o wzo- rze Ib korzystnie stosuje sie sole cetylopirydynio- we, zwlaszcza chlorki lub bromki, a przede wszy¬ stkim bromki. Mozna tez stosowac inne kationowe detergenty, takie ijak chlorki i bromki benzalkoniowe, np. chlorek benzetoniowy lub chlorek metylobenzeto- niowy, albo tez takie zwiazki, jak chlorek deka- metoniowy. Jako kationowy detergent zgodnie z wynalaz¬ kiem szczególnie korzystnie stosuje sie bromek ce- tylotrójmetyloamoniowy. Po zakonczeniu procesu, prowadzonego sposo¬ bem wedlug wynalazku, skladniki hemoaglutynino- we i neuraminidazowe mozna oddzielac od pozosta¬ lych, nie naruszonych czastek wirusowych znany¬ mi sposobami. Przy oddzielaniu wykorzystuje sie rózna wielkosc i ciezar wlasciwy oddzielanych cza¬ stek, np. stosujac stopniowe odwirowywanie przy uzyciu srodków takich, jak cukier trzcinowy lub glutaminian sodowy, po czym gradienty frakcjo¬ nuje sie przez sedymentacje lub na drodze chro¬ matografii na sitach molekularnych albo przez gra¬ nulowanie w ultrawirówce. Mieszanine substancji uodporniajacych, otrzyma¬ na sposobem wedlug wynalazku, mozna korzystnie stosowac do wytwarzania szczepionek przeciw gry¬ pie. W tym celu opisane wyzej, wyosobnione sklad¬ niki hemoaglutyninowe i neuraminidazowe ponow¬ nie miesza sie w zwyklym rozpuszczalniku, np. w izotonicznym roztworze fizjologicznym, takim jak np. 0,9% roztwór chlorku sodowego, który ewen¬ tualnie zawiera dodatek np. fosforanowego roz¬ tworu buforowego. Zawartosc cukru trzcinowego, pozostajacego w szczepionce po procesie oczyszcza¬ nia wyjsciowego wirusa lub po oddzielaniu roztwo¬ rzonych skladników, nalezy korzystnie zmniejszyc 45 50 55 6093688 a do mniej niz 50/q wagowych w stosunku do szcze¬ pionki, np- za pomoca dializy. Zawartosc pozosta¬ lego detergentu kationowego nalezy równiez sil¬ nie obnizyc, np. do mniej pi? o,qi°/o w stosunku do szczepionki, np. na drodze dializy lub chroma-* tograjii zelazowej, W razie potrzeby do szczepionek mozna stoso¬ wac dodatek srodków konserwujacych \^ deza-r ktywujaqyph? np, aldehydu mrówkowego. Podatki te stosuje »ie, w zwyklych ilosciach, np, 1 czesc wagowa na 10000 czesci wagowych szczepionki. Uodporniajace dzialanie szczepionek mozna ko¬ rzystnie polepszyc przez dodanie znanych substan¬ cji uodporniajacych, takich jak wodorotlenek gU= nowy lub fosforan glinowy. Dodatki te stosuje sie W zwyklych ilosciach, a korzystnie stosuje sie do^ datek 0,2% wodorotlenku glinowego, W szeregu testów przebadano oehrone myszy w ciagu róznych okresów czasu po immuniizacji pod^ jednostkowa szoaepionka grypy i za pomoca ca¬ losci wirusa grypy przy obciazeniu wirulentnym wirusem grypy. Model ten obejmuje wszystkie specyficzne i niespecyficzne, mechanizmy obronne. Qrupom po 30 myszy aplikuje sie po Q,2§ ml anty^ genu na mysz sródotrzewnowo, po uplywie 3, 4 i 8 tygodni czesc tej grupy zakaza sie droga rpz^ pylania i po uplywie 9 dni po infekcji okregla stopien ochrony. Podstawa oceny jest redukcja smiertelnosci w V* i redukcja uszkodzen pluc w typ. Próby te powtarza sie, stosujac rózne iawar- tosci antygenu w szczepionkach. Wyniki prób swiadcza o tym, ze podjednostkowe az.ez.epionki, wytworzone powyzazym sposobem* uodporniaja na zakazenie wirusem w ciagu dluzszego okresu czasu, niz znane szczepionki 35 wirusami calkowitymi, a równoczesnie maja poza tym dzialanie takie sa-. me. Dawka szczepionki do powyzszych celów moze byc rózna, a przewaznie zadowalajace wyniki u- zyskuje sie, stosujac szczepionke w dawkaoh po¬ jedynczych w ilosci ft—43 jednostek miedzynaro= dowych na 1 kg masy oiala zwierzecia. Dla wie¬ kszych ssaków korzystnie stosuje sie pojedyncze dawki, zawierajace 600—3000 miedzynarodowych jednostek. Szczepionke korzystnie stosuje sie pod¬ skórnie lub domiesniowo. Nastepujace przyklady blizej wyjasniaja wynala¬ zek. Przyklad I. Wirus grypy typu antygenowego X-31 rekombinanty szczepu A2 (Aichi/68) rozmna¬ za sie, inkubujac w zarodkowym jaju kurzym w temperaturze 37°C w ciagu 2 dni, po czym jaja chlodzi sie do temperatury 4°C i pozostawia na noc. Otrzymane zakazone ciecze omoczniowe laczy sie i przez odwirowywanie w wirówce ze strefowym przeplywem (Model RK, Elektro-Nucleonios), sto¬ sujac gradient z cukru trzcinowego w roztworze chlorku sodowego z dodatkiem fosforanowej sub¬ stancji buforowej, steza wirus i oczyszcza. Otrzy¬ many koncentrat wirusowy poddaje sie na zimno dializie za pomoca roztworu chlorku sodowego, za¬ wierajacego fosforanowa substancje buforowa, po¬ wodujac zmniejszenie zawartosci cukru trzcinowego do mniej niz 5°/o i otrzymujac koncentrat wirusowy o mianie hemoa^lutyininowym 1 ? V7 i zawartosci protein 0,7 mg/ml. W celu odszczepienia substancji uodporniajacych zawiesine wirusa traktuje sie wodnym roztworem detergentu (iVo roztwór bromku cetylotrójmetyio- amoniowego) w ilosci — objetosci zawiesiny i po uplywie 30—60 minut w temperaturze pokojo¬ wej mieszanine, poddaje sie gradientowemu odwi¬ rowywaniu, stosujac uprzednio przygotowany linio¬ wy gradient z cukru trzcinowego* a nastepnie frak¬ cjonujac gradient za pomoca perystaltycznej pom¬ py. W procesie tym hemoaglutynina i neuramini- daza zostaja calkowicie roztworzone i znajduja sie w górnej czesci gradientu, oddzielajac sie latwo od szybciej osiadajacych pozostalych czastek wiru¬ sa, Przyklad II. Rozmnazanie, stezanie i rozszcze¬ pianie wirusa prowadzi sie w sposób, opisany w przykladzie I, a dalsza przeróbke prowadzi sie przez równowagowe odwirowywanie w przygoto¬ wanym gradientowym roztworze cukru trzcinowe¬ go. Po ustaleniu sie równowagi roztwór gradien¬ towy frakcjonuje §ie i wyprobowuje. Hemoagiu- tynina i neuraminidaza znajduja sie w lzejszej czesci gradientu, dobrze oddzielane od gesciejszych pozostalych czastek wirusa. Przyklad IH. Proces prowadzi sie w SPOS^b, analogiczny dP opisanego w przykladzie I lub II» ale stosujac szczep grypowy MftOS [rekombinacja typu A2 (Anglia) 4?/72] lub MRC41 [rekombinanty typu A2 (Port Chalmers) 73]. Przyklad IV. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I i III, ale mieszanine r-e-r akcyjna poddaje sie obróbce metoda chromatografii na sicie molekularnym. Przyklad V. Wirus grypy typu A (Pasteur) C („Mutagrip" Instytut Pasteura), uprzednio zdezaktywowany aldehydem mrówkowym, traktuje sie 0,§ft/e roztworem wodnym bromku cetylopirydy- niowego. Detergent ten dodaje sie w takiej ilosci, aby jego koncowe stezenie wynioslo 0,02^0,lVe, po czym mieszanine poddaje sie obróbce, opisanej w przykladzie I, II lub IV. Przyklad VI. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I, II, IV lub V, ale stosuje sie szczep grypowy wirusa B (Massa) 67. Przyklad VII. Postepuje sie w sposób, opi¬ sany w przykladach I, III, V lub VI, ale miesza¬ nine po procesie rozszczepiania poddaje obróbce przez granulowanie w ultrawirówce, np. stosujac wirówke Beckmanna L-2-65 B (wirnik 60 Ti, 35 000 obrotów ma minute, czas wirowania 90 minut). Roztworzone substancje uodparniajace sa zawarte w frakcji górnej. Przyklad VIII. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I—VII, ale zamiast roztwo¬ ru bromku cetylotrójmetyloamoniowego stosuje sie 1% roztwór bromku mirystylotrójmetyloamoniowe- go, chlorku benzetoniowego, chlorku metylobenze- toniowego, chlorku dekamentoniowego lub bromku stearylodwumetylobenzyloamoniowego, przy czym uzyskuje sie wyniki, podobne do opisanych w po¬ wyzszych przykladach. %o 2P 40 45 50 55 6093 689 7 8 Przyklad IX. W celu wytworzenia szczepionki przeciw grypie stosuje sie nizej podane skladniki w nastepujacych ilosciach: mieszanina uodporniajaca — 700 jednostek miedzynaro¬ dowych tiomerosal — 1 czesc na 000 czesci fosforanowa substancja buforowa w 0,9% roztworze fizjologicznym chlorku sodowego — do 0,5 ml. Uodporniajaca mieszanine mozna wytwarzac jed¬ nym ze sposobów, opisanych w poprzednich przy¬ kladach, np. w przykladzie III, stosujac szczep gry¬ powy MRC-11 [rekombinanty typu A2 (Port Chal- rners) 73]. PL PL PL PL PL PL PL