PL93689B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyosobnia¬ nia skladników hemoaglutyninowych i neuramini¬ dazowych z wirusa grypy.

Wynalazek dotyczy selektywnego oddzielania i wyosabniania uodporniajacych skladników wiru^ sa, powodujacego grype.

Na fig. 1 rysunku przedstawiono schematycznie czastke wirusa grypy. Material genetyczny, to jest kwas rybonykleinowy (RNA), razem z nukleopro- teina okreslonej grupy, jest otoczony podwójna blona, skladajaca sie z wewnetrznej warstwy pro¬ teinowej i warstwy zewnetrznej z substancji lipi- dowej, wlasciwej dla gospodarza. Na powierzchni blony, otaczajacej wirusa, znajduja sie dwie gli- koproteiny, a mianowicie hemoaglutynina i neura- minidaza w postaci kolców.

Wiadomo, ze dwie glikoproteiny — hemoagluty¬ nina i neuraminidaza stanowia najwazniejsze sklad¬ niki wirusa grypy, podczas gdy wszystkie inne skladniki, w tym równiez inne proteiny wirusowe, kwasy nukleinowe i lipidy, nie maja istotnego znaczenia dla powstawania odpornosci. Jednakze obecnosc tych nieistotnych skladników w szcze¬ pionce przeciw grypie moze wywolywac niepo¬ zadane oddzialywania uboczne, a w kazdym przy¬ padku ograniczaja one ilosc szczepionki, która moze byc podana, zmniejszajac tym samym stopien u- odpornienia.

Idealna szczepionka przeciwgrypowa powinna przeto skladac sie z obu zasadniczych substancji uodporniajacych, to jest z hemoaglutyniny i neura¬ minidazy i nie powinna zawierac wcale lub pra¬ wie wcale nieistotnych skladników wirusa. Znane sposoby oddzielania skladników, uodporniajacych przed grypa, polegaly na tym, ze poczatkowo sta¬ rano sie calkowicie rozszczepic lub rozpuscic skladniki wirusa, np. za pomoca anionowych de¬ tergentów, takich jak sól sodowa kwasu dezo- ksycholanowego lub dodecylosiarczan sodowy. W tym procesie uwalniane sa wszystkie lub najistot¬ niejsze skladniki wirusa i przechodza do roztworu razem ze skladnikami nadajacymi odpornosc. Ko¬ nieczne nastepnie calkowite lub czesciowe oczysz¬ czanie zadanych substancji nadajacych odpornosc jest pracochlonne, a wydajnosc procesu jest zwykle mala.

Sposób wedlug wynalazku umozliwa wyosob¬ nianie uodporniajacych substancji, to jest hemo- aglutyniny i neuraminidazy, przez selektywne roz¬ puszczanie tych skladników, podczas gdy pozostale czastki wirusa, skladajace sie z nienaruszonych lipidów i blon proteinowych, zawierajace inne, nie¬ istotne skladniki wirusa, pozostaja nierozpuszczo- ne. Rózna wielkosc i ciezar wlasciwy roztworzonej substancji uodporniajacej i pozostalych czastek wirusa umozliwia oddzielanie substancji uodpor¬ niajacych zwyklymi metodami, stosowanymi do rozdzielania, opartymi na róznicy fizycznych wlas¬ ciwosci. Stwierdzono mianowicie, ze to selektywne roztwarzanie hemoaglutyniny i neuraminidazy 93 68993 689 3 4 mozna osiagnac przez traktowanie wirusa grypy kationowym detergentem.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyosobnia¬ nia skladników hemoaglutyniny i neuraminidazy z wirusa grypy przez traktowanie tego wirusa w wodnym srodowisku kationowym detergentem o wzorze 1, w którym Rx i R3 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki alkilowe, R2 oznacza rodnik alkilowy lub benzylowy, R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X oznacza anion halogenku, siarczanu lub octanu, albo chlorkiem lub bromkiem benzalkoniowym lub chlorkiem de- kametoniow^mT w celu selektywnego roztworzenia T &WA pljl^cfajkówii nastepnie oddzielenie otrzyma- \ nych roztworzonych skladników od pozostalych czastek wirusa. | -Proces^wedlu'g [wynalazku prowadzi sie korzyst¬ acie, stosujac-Wirusy grypy typów A, Al, A2 lub B albo mieszanine dwóch lub kilku takich wirusów.

Dobór okreslonego szczepu zalezy oczywiscie od zadanej odpornosci i wyosabnianych substancji uodporniajacych, ale mozna np. stosowac nastepu¬ jace szczepy: A2 (Aichi) 68, MRC-2 [rekombinanty typów A2 (Anglia) 42/72], MRC-11 [rekombinanty typów A2 (Port Chalmers) 73], A (Pasteur 30 C) „Mutagrip", Instytut Pasteura) i B (Mass) 67.

Stosowany zgodnie z wynalazkiem szczep wiru¬ sa grypy korzystnie rozmnaza sie w znany sposób, np. przez przeszczepianie na jedenastodniowe em¬ brionalne jajo kurze i przez inkubacje w ciagu odpowiedniego czasu i w odpowiedniej tempera¬ turze np. w ciagu 2 dni w temperaturze 37°C.

Otrzymane ciecze omoczniowe laczy sie i oczyszcza, steza wirus za pomoca ultrawirówki, i ponownie wytwarza zawiesine w fizjologicznym roztworze chlorku sodowego z dodatkiem np. fosforanowego roztworu buforowego, albo przez ultrawirowanie w wirówce ze strefowym przeplywem, przy uzy¬ ciu np. gradientu z cukru trzcinowego w fizjolo¬ gicznym roztworze chlorku sodowego buforowanego fosforanem i nastepnie zmniejszanie zawartosci cukru trzcinowego np. do mniej niz 5%*, korzystnie dializujac za pomoca fizjologicznego roztworu chlorku sodowego, albo przez chromatografowanie na preparacie Sephadex lub przez rozcienczanie.

Stezenie wyjsciowego wirusa nie ma decydujacego znaczenia i moze byc nastawiane zaleznie od za¬ danej ilosci (zawartosci) substancji uodporniajacej.

Wartosc.pH koncentratu wirusa powinna wyno¬ sic korzystnie 6,5—8,5 i nastawia ja, stosujac e- wentualnie roztwór buforowy, np. fosforanowy, dodawany do koncentratu przed dodaniem katio¬ nowego detergentu. Koncentrat mozna takze dezak- tywowac, np. przez dodanie aldehydu mrówko¬ wego. Nastepnie do koncentratu wirusa dodaje sie kationowy detergent, korzystnie w postaci wodne¬ go roztworu. Ilosc kationowego detergentu, która powinna.byc dodana, zalezy np. od rodzaju stoso¬ wanego detergentu. Ogólnie biorac, kationowy de¬ tergent dodaje sie w takiej ilosci, aby stosunek wagowy detergentu do proteiny w otrzymanej mie¬ szaninie wynosil 1:2 do 1:10, a zwlaszcza 1:3 do 1:5. Po dodaniu detergentu mieszanine nalezy ko¬ rzystnie pozostawic do odstania np. w okresie od minut do* 16 godzin, w temperaturze 4—37°C, przy czym im wyzsza temperatura, tym krótszy jest czas odstawania. Korzystnie utrzymuje sie mieszanine w ciagu 30—60 minut w temperaturze pokojowej lub w ciagu nocy w temperaturze 4°C.

Zgodnie z wynalazkiem jako kationowe detegen- ty mozna stosowac zwiazki o ogólnym wzorze la, w którym R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 ato¬ mach wegla, R\ i R'3 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki metylowe, lub etylowe, R'2 ozna- io cza rodnik metylowy lub benzylowy, a X' oznacza anion halogenku.

Korzystnymi zwiazkami o wzorze la sa zwiazki o ogólnym wzorze laa, w którym R4 i X' maja wyzej podane znaczenie, albo zwiazki o ogólnym wzorze lab, w którym R4 i X' maja wyzej podane znaczenie.

Jako rodniki alkilowe o 8—22 atomach wegla korzystnie wystepuja rodniki o 12—18 atomach wegla, a zwlaszcza rodniki laurylowe, mirystylowe, cetylowe i stearylowe.

W podanych wyzej wzorach X i X' oznaczaja korzystnie anion chlorkowy i bromkowy.

Korzystnymi zwiazkami o wzorze laa sa zwlasz¬ cza sole mirystylotrójmetyloamoniowe i cetylotrój- metyloamoniowe, a szczególnie chlorki lub bromki, przy czym bromki sa korzystniejsze. Korzystnymi zwiazkami o wzorze lab sa sole stearylodwumety- lobenzyloamoniowe, zwlaszcza chlorki lub bromki, ale przede wszystkim bromki. Jako zwiazki o wzo- rze Ib korzystnie stosuje sie sole cetylopirydynio- we, zwlaszcza chlorki lub bromki, a przede wszy¬ stkim bromki.

Mozna tez stosowac inne kationowe detergenty, takie ijak chlorki i bromki benzalkoniowe, np. chlorek benzetoniowy lub chlorek metylobenzeto- niowy, albo tez takie zwiazki, jak chlorek deka- metoniowy.

Jako kationowy detergent zgodnie z wynalaz¬ kiem szczególnie korzystnie stosuje sie bromek ce- tylotrójmetyloamoniowy.

Po zakonczeniu procesu, prowadzonego sposo¬ bem wedlug wynalazku, skladniki hemoaglutynino- we i neuraminidazowe mozna oddzielac od pozosta¬ lych, nie naruszonych czastek wirusowych znany¬ mi sposobami. Przy oddzielaniu wykorzystuje sie rózna wielkosc i ciezar wlasciwy oddzielanych cza¬ stek, np. stosujac stopniowe odwirowywanie przy uzyciu srodków takich, jak cukier trzcinowy lub glutaminian sodowy, po czym gradienty frakcjo¬ nuje sie przez sedymentacje lub na drodze chro¬ matografii na sitach molekularnych albo przez gra¬ nulowanie w ultrawirówce.

Mieszanine substancji uodporniajacych, otrzyma¬ na sposobem wedlug wynalazku, mozna korzystnie stosowac do wytwarzania szczepionek przeciw gry¬ pie. W tym celu opisane wyzej, wyosobnione sklad¬ niki hemoaglutyninowe i neuraminidazowe ponow¬ nie miesza sie w zwyklym rozpuszczalniku, np. w izotonicznym roztworze fizjologicznym, takim jak np. 0,9% roztwór chlorku sodowego, który ewen¬ tualnie zawiera dodatek np. fosforanowego roz¬ tworu buforowego. Zawartosc cukru trzcinowego, pozostajacego w szczepionce po procesie oczyszcza¬ nia wyjsciowego wirusa lub po oddzielaniu roztwo¬ rzonych skladników, nalezy korzystnie zmniejszyc 45 50 55 6093688 a do mniej niz 50/q wagowych w stosunku do szcze¬ pionki, np- za pomoca dializy. Zawartosc pozosta¬ lego detergentu kationowego nalezy równiez sil¬ nie obnizyc, np. do mniej pi? o,qi°/o w stosunku do szczepionki, np. na drodze dializy lub chroma-* tograjii zelazowej, W razie potrzeby do szczepionek mozna stoso¬ wac dodatek srodków konserwujacych \^ deza-r ktywujaqyph? np, aldehydu mrówkowego. Podatki te stosuje »ie, w zwyklych ilosciach, np, 1 czesc wagowa na 10000 czesci wagowych szczepionki.

Uodporniajace dzialanie szczepionek mozna ko¬ rzystnie polepszyc przez dodanie znanych substan¬ cji uodporniajacych, takich jak wodorotlenek gU= nowy lub fosforan glinowy. Dodatki te stosuje sie W zwyklych ilosciach, a korzystnie stosuje sie do^ datek 0,2% wodorotlenku glinowego, W szeregu testów przebadano oehrone myszy w ciagu róznych okresów czasu po immuniizacji pod^ jednostkowa szoaepionka grypy i za pomoca ca¬ losci wirusa grypy przy obciazeniu wirulentnym wirusem grypy. Model ten obejmuje wszystkie specyficzne i niespecyficzne, mechanizmy obronne.

Qrupom po 30 myszy aplikuje sie po Q,2§ ml anty^ genu na mysz sródotrzewnowo, po uplywie 3, 4 i 8 tygodni czesc tej grupy zakaza sie droga rpz^ pylania i po uplywie 9 dni po infekcji okregla stopien ochrony. Podstawa oceny jest redukcja smiertelnosci w V* i redukcja uszkodzen pluc w typ. Próby te powtarza sie, stosujac rózne iawar- tosci antygenu w szczepionkach. Wyniki prób swiadcza o tym, ze podjednostkowe az.ez.epionki, wytworzone powyzazym sposobem* uodporniaja na zakazenie wirusem w ciagu dluzszego okresu czasu, niz znane szczepionki 35 wirusami calkowitymi, a równoczesnie maja poza tym dzialanie takie sa-. me.

Dawka szczepionki do powyzszych celów moze byc rózna, a przewaznie zadowalajace wyniki u- zyskuje sie, stosujac szczepionke w dawkaoh po¬ jedynczych w ilosci ft—43 jednostek miedzynaro= dowych na 1 kg masy oiala zwierzecia. Dla wie¬ kszych ssaków korzystnie stosuje sie pojedyncze dawki, zawierajace 600—3000 miedzynarodowych jednostek. Szczepionke korzystnie stosuje sie pod¬ skórnie lub domiesniowo.

Nastepujace przyklady blizej wyjasniaja wynala¬ zek.

Przyklad I. Wirus grypy typu antygenowego X-31 rekombinanty szczepu A2 (Aichi/68) rozmna¬ za sie, inkubujac w zarodkowym jaju kurzym w temperaturze 37°C w ciagu 2 dni, po czym jaja chlodzi sie do temperatury 4°C i pozostawia na noc. Otrzymane zakazone ciecze omoczniowe laczy sie i przez odwirowywanie w wirówce ze strefowym przeplywem (Model RK, Elektro-Nucleonios), sto¬ sujac gradient z cukru trzcinowego w roztworze chlorku sodowego z dodatkiem fosforanowej sub¬ stancji buforowej, steza wirus i oczyszcza. Otrzy¬ many koncentrat wirusowy poddaje sie na zimno dializie za pomoca roztworu chlorku sodowego, za¬ wierajacego fosforanowa substancje buforowa, po¬ wodujac zmniejszenie zawartosci cukru trzcinowego do mniej niz 5°/o i otrzymujac koncentrat wirusowy o mianie hemoa^lutyininowym 1 ? V7 i zawartosci protein 0,7 mg/ml.

W celu odszczepienia substancji uodporniajacych zawiesine wirusa traktuje sie wodnym roztworem detergentu (iVo roztwór bromku cetylotrójmetyio- amoniowego) w ilosci — objetosci zawiesiny i po uplywie 30—60 minut w temperaturze pokojo¬ wej mieszanine, poddaje sie gradientowemu odwi¬ rowywaniu, stosujac uprzednio przygotowany linio¬ wy gradient z cukru trzcinowego* a nastepnie frak¬ cjonujac gradient za pomoca perystaltycznej pom¬ py. W procesie tym hemoaglutynina i neuramini- daza zostaja calkowicie roztworzone i znajduja sie w górnej czesci gradientu, oddzielajac sie latwo od szybciej osiadajacych pozostalych czastek wiru¬ sa, Przyklad II. Rozmnazanie, stezanie i rozszcze¬ pianie wirusa prowadzi sie w sposób, opisany w przykladzie I, a dalsza przeróbke prowadzi sie przez równowagowe odwirowywanie w przygoto¬ wanym gradientowym roztworze cukru trzcinowe¬ go. Po ustaleniu sie równowagi roztwór gradien¬ towy frakcjonuje §ie i wyprobowuje. Hemoagiu- tynina i neuraminidaza znajduja sie w lzejszej czesci gradientu, dobrze oddzielane od gesciejszych pozostalych czastek wirusa.

Przyklad IH. Proces prowadzi sie w SPOS^b, analogiczny dP opisanego w przykladzie I lub II» ale stosujac szczep grypowy MftOS [rekombinacja typu A2 (Anglia) 4?/72] lub MRC41 [rekombinanty typu A2 (Port Chalmers) 73].

Przyklad IV. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I i III, ale mieszanine r-e-r akcyjna poddaje sie obróbce metoda chromatografii na sicie molekularnym.

Przyklad V. Wirus grypy typu A (Pasteur) C („Mutagrip" Instytut Pasteura), uprzednio zdezaktywowany aldehydem mrówkowym, traktuje sie 0,§ft/e roztworem wodnym bromku cetylopirydy- niowego. Detergent ten dodaje sie w takiej ilosci, aby jego koncowe stezenie wynioslo 0,02^0,lVe, po czym mieszanine poddaje sie obróbce, opisanej w przykladzie I, II lub IV.

Przyklad VI. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I, II, IV lub V, ale stosuje sie szczep grypowy wirusa B (Massa) 67.

Przyklad VII. Postepuje sie w sposób, opi¬ sany w przykladach I, III, V lub VI, ale miesza¬ nine po procesie rozszczepiania poddaje obróbce przez granulowanie w ultrawirówce, np. stosujac wirówke Beckmanna L-2-65 B (wirnik 60 Ti, 35 000 obrotów ma minute, czas wirowania 90 minut).

Roztworzone substancje uodparniajace sa zawarte w frakcji górnej.

Przyklad VIII. Proces prowadzi sie w sposób, opisany w przykladach I—VII, ale zamiast roztwo¬ ru bromku cetylotrójmetyloamoniowego stosuje sie 1% roztwór bromku mirystylotrójmetyloamoniowe- go, chlorku benzetoniowego, chlorku metylobenze- toniowego, chlorku dekamentoniowego lub bromku stearylodwumetylobenzyloamoniowego, przy czym uzyskuje sie wyniki, podobne do opisanych w po¬ wyzszych przykladach. %o 2P 40 45 50 55 6093 689 7 8 Przyklad IX. W celu wytworzenia szczepionki przeciw grypie stosuje sie nizej podane skladniki w nastepujacych ilosciach: mieszanina uodporniajaca — 700 jednostek miedzynaro¬ dowych tiomerosal — 1 czesc na 000 czesci fosforanowa substancja buforowa w 0,9% roztworze fizjologicznym chlorku sodowego — do 0,5 ml.

Uodporniajaca mieszanine mozna wytwarzac jed¬ nym ze sposobów, opisanych w poprzednich przy¬ kladach, np. w przykladzie III, stosujac szczep gry¬ powy MRC-11 [rekombinanty typu A2 (Port Chal- rners) 73].

Claims (10)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wyosabniania skladników hemoaglu- tyninowych i neuraminidazowych z wirusa grypy, znamienny tym, ze wirusa grypy traktuje sie katio¬ nowym detergentem o wzorze ogólnym 1, w któ¬ rym Ri i R, sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki alkilowe, R2 oznacza rodnik alkilowy, a R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X oznacza anion halogenku, siarczanu lub octa¬ nu, po czym otrzymane roztworzone skladniki od¬ dziela sie od pozostalych czastek wirusa.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wirus grypy stosuje sie wirus grypy typu A, Ai, A2 lub B, albo mieszanine dwóch lub wiekszej liczby tych wirusów.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wirus grypy stosuje sie szczep A2 (Aichi) 68, MRC-2 [rekombinanty typu A2 (Anglia) 42/72], MRC-11 [rekombinanty typu A2 (Port Chalmers) 73], A (Pasteur) 30 C (Mutagrip) lub B (Mass) 67.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie kationowy detergent o ogólnym wzorze la, w którym R< oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, R'i i R'« sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki metylowe lub etylowe, R'2 ozna¬ cza rodnik metylowy, a X' oznacza anion halogen- 5 ku.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie kationowy detergent o ogólnym wzorze laa, w którym R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X' oznacza anion halogenku.

6. Sposób wyosabniania skladników hemoagluty- ninowych i neuraminidazowych z wirusa grypy, znamienny tym, ze wirusa grypy traktuje sie w wodnym roztworze kationowym detergentem o wzo¬ rze ogólnym 1, w którym Ri i R3 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki alkilowe, R2 ozna¬ cza rodnik benzylowy, R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X oznacza anion halo¬ genku, siarczanu lub octanu, albo chlorkiem lub bromkiem benzalkoniowym lub chlorkiem deka- metoniowym, po czym otrzymane roztworzone skladniki oddziela sie od pozostalych czastek wi¬ rusa.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze jako wirus grypy stosuje sie wirus grypy typu A, Ai, A2 lub B, albo mieszanine dwóch lub wiekszej liczby wirusów.

8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze jako wirus grypy stosuje sie szczep A2 (Aichi) 68, MRC-2 [rekombinanty typu A2 (Anglia) 42/72], MRC-11 [rekombinanty typu A2 (Port Chalmers) 73], A (Pasteur) 30 C (Mutagrip) lub B (Mass) 67.

9. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie kationowy detergent o ogólnym wzorze la, w którym R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, R'i i R's sa jednakowe lub rózne i oznaczaja rodniki metylowe lub etylowe, R'2 ozna¬ cza rodnik benzylowy, a X' oznacza anion halo¬ genku.

10. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze stosuje sie kationowy detergent o ogólnym wzorze lab, w którym R4 oznacza rodnik alkilowy o 8—22 atomach wegla, a X' oznacza anion halogenku. 15 20 25 30 3593 689 FIG. 1. , A Nukleoproteina Lipid / Neuraminidaza RiN© /R3 e /\ x R2 HA WZÓR 1 RN©/R3 l0 <"\ * R2 R^ WZÓR 1a CH^©/CH3 ,0 Hemoaglutynina w X Polimeraza RNA Proteina blony CH3 R^ WZÓR 1aa CH^© /CH3 X x' C6H5CH2 R^ WZ(3R lab