JP2812352B2 - 核酸製剤 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規の医薬製品、即ち
脊椎動物生体組織中に直接導入した場合にヒトインフル
エンザウイルスを特異的に認識する免疫反応の生成を誘
発する核酸の製造及び使用に関する。
脊椎動物生体組織中に直接導入した場合にヒトインフル
エンザウイルスを特異的に認識する免疫反応の生成を誘
発する核酸の製造及び使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】インフルエンザはＡ又はＢ型インフルエ
ンザウイルスによる気道の感染により引き起こされる急
性発熱性疾患である。インフルエンザの大発生は殆ど毎
年、周期的流行病又は汎性流行病を伴って全世界で起こ
る。インフルエンザは重篤な全身性症状、入院を要する
重症疾患（例えばウイルス性肺炎）、及び二次細菌性肺
炎のような合併症を引き起こし得る。最近の米国での流
行の年で＞１０，０００（４０，０００まで）以上の死
亡者を出しているが、非流行年の１年当たりの死亡は
５，０００〜１０，０００名であると考えられる。イン
フルエンザ関連の罹患及び死亡を防止するための最良の
方法はワクチン接種である。最新の認可ワクチンは卵中
で増殖させ、次いで不活性化した３種類のウイルス株
（Ａ株２種及びＢ株１種）を含むウイルスから得られ
る。３種類のワクチン：即ち全ウイルス、サブビリオン
及び精製表面抗原が利用できる。全ウイルスワクチンで
は発熱性反応が増大するため、小児に用いられるのは後
者の２種のみである。９歳以下の小児は２段階の免疫化
を要するが、一方成人は１回の注射だけでよい。しかし
ながら、老齢患者ではワクチン接種後の抗体力価が４か
月又はそれ以前に防御レベル未満にまで減少した例があ
ったことにより、“初秋にワクチン接種を受けた患者は
冬又は初春に二次投与すると有効である”ことが示唆さ
れている（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒ ３２：８９
−９０，Ｓｅｐｔ．１７，１９９３参照）。最近のウイ
ルス株で臨床的に流行するものを予測し、新規の有毒株
は来たるべきインフルエンザシーズンに優勢であると予
期されるものに基づき、これらのワクチンを毎年再処方
する。ワクチン再接種は毎年行なうよう推奨されてい
る。
ンザウイルスによる気道の感染により引き起こされる急
性発熱性疾患である。インフルエンザの大発生は殆ど毎
年、周期的流行病又は汎性流行病を伴って全世界で起こ
る。インフルエンザは重篤な全身性症状、入院を要する
重症疾患（例えばウイルス性肺炎）、及び二次細菌性肺
炎のような合併症を引き起こし得る。最近の米国での流
行の年で＞１０，０００（４０，０００まで）以上の死
亡者を出しているが、非流行年の１年当たりの死亡は
５，０００〜１０，０００名であると考えられる。イン
フルエンザ関連の罹患及び死亡を防止するための最良の
方法はワクチン接種である。最新の認可ワクチンは卵中
で増殖させ、次いで不活性化した３種類のウイルス株
（Ａ株２種及びＢ株１種）を含むウイルスから得られ
る。３種類のワクチン：即ち全ウイルス、サブビリオン
及び精製表面抗原が利用できる。全ウイルスワクチンで
は発熱性反応が増大するため、小児に用いられるのは後
者の２種のみである。９歳以下の小児は２段階の免疫化
を要するが、一方成人は１回の注射だけでよい。しかし
ながら、老齢患者ではワクチン接種後の抗体力価が４か
月又はそれ以前に防御レベル未満にまで減少した例があ
ったことにより、“初秋にワクチン接種を受けた患者は
冬又は初春に二次投与すると有効である”ことが示唆さ
れている（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒ ３２：８９
−９０，Ｓｅｐｔ．１７，１９９３参照）。最近のウイ
ルス株で臨床的に流行するものを予測し、新規の有毒株
は来たるべきインフルエンザシーズンに優勢であると予
期されるものに基づき、これらのワクチンを毎年再処方
する。ワクチン再接種は毎年行なうよう推奨されてい
る。
【０００３】Ａ．認可ワクチンの限界： １）特にＡ型インフルエンザでは抗原変異が生じ、以前
のワクチン（又は以前の感染）により生じている抗体で
は中和されないウイルスを生じる。表面糖タンパク質
（ヘマグルチニン［ＨＡ］及びニューラミニダーゼ）を
コードする遺伝子の点突然変異（抗原連続変異）により
及び再類別（抗原不連続変異）により新規の株が生じ、
一方内部タンパク質は連続変異株及び不連続変異株内で
も高度に保存される。免疫化は、細胞媒介免疫を基礎に
した“異種”群間共通免疫ではなく、“同種”株特異性
抗体媒介免疫を引き出すに過ぎない。
のワクチン（又は以前の感染）により生じている抗体で
は中和されないウイルスを生じる。表面糖タンパク質
（ヘマグルチニン［ＨＡ］及びニューラミニダーゼ）を
コードする遺伝子の点突然変異（抗原連続変異）により
及び再類別（抗原不連続変異）により新規の株が生じ、
一方内部タンパク質は連続変異株及び不連続変異株内で
も高度に保存される。免疫化は、細胞媒介免疫を基礎に
した“異種”群間共通免疫ではなく、“同種”株特異性
抗体媒介免疫を引き出すに過ぎない。
【０００４】２）インフルエンザウイルスの優勢流行株
が、ある年からその翌年にかけて有意に不連続変異又は
連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため免疫
化は毎年実施しなければならない。血球凝集阻止（Ｈ
Ｉ）及び中和の抗体は数か月〜数年存続し、その後次第
に低減することが幾人かにより報告されているけれど
も、Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＰｒａｃｔｉｃｅｓは、大きな
連続変異又は不連続変異が認められなかった場合でも年
に１度の免疫化を推奨する理由として、ワクチン接種後
その年内に抗体力価が低減すると言及している（ＨＩ抗
体は赤血球を凝集するインフルエンザウイルスの能力を
阻害する。中和抗体と同じく、それはＨＡ抗原に主とし
て対応する。血球凝集阻止試験は中和検定より容易に且
つ低経費で実施し得るので、異なる株に対して反応する
インフルエンザのある株に対して生じる抗体の能力を評
価する手段としてしばしば用いられる）。上記のよう
に、ある程度危険な状態にある老齢患者は、上記防御抗
体力価の有効期間が短いために１シーズンに２回ワクチ
ン接種すべきであると、上記Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｅｔｔ
ｅｒは示唆している。
が、ある年からその翌年にかけて有意に不連続変異又は
連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため免疫
化は毎年実施しなければならない。血球凝集阻止（Ｈ
Ｉ）及び中和の抗体は数か月〜数年存続し、その後次第
に低減することが幾人かにより報告されているけれど
も、Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎＰｒａｃｔｉｃｅｓは、大きな
連続変異又は不連続変異が認められなかった場合でも年
に１度の免疫化を推奨する理由として、ワクチン接種後
その年内に抗体力価が低減すると言及している（ＨＩ抗
体は赤血球を凝集するインフルエンザウイルスの能力を
阻害する。中和抗体と同じく、それはＨＡ抗原に主とし
て対応する。血球凝集阻止試験は中和検定より容易に且
つ低経費で実施し得るので、異なる株に対して反応する
インフルエンザのある株に対して生じる抗体の能力を評
価する手段としてしばしば用いられる）。上記のよう
に、ある程度危険な状態にある老齢患者は、上記防御抗
体力価の有効期間が短いために１シーズンに２回ワクチ
ン接種すべきであると、上記Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｅｔｔ
ｅｒは示唆している。
【０００５】３）ワクチンの有効性は満足なものではな
い。次シーズンのワクチンの開発は、来たるべき流行株
を予測すること（アジアにおける監視サンプリングによ
る）に依っており、これは不正確で、ワクチン用に用い
る株と実際に野外で流行するものとが余り適合しないと
いうことが起こり得る。さらに１９９２〜１９９３年の
インフルエンザシーズン中に起きたように、新規のＨ３
Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２）がインフルエンザ
シーズンの後期になってから臨床的に明らかになった。
これは、抗原不連続変異のために昔のＨ３Ｎ２株（Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９）により誘発された抗体が、Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と交叉反応性が不十分となったた
めで、１９９３〜１９９４年ワクチンの組成の変更を促
した。しかしながら、現在では認可ワクチンの製造及び
調剤に時間を要するために、既存のワクチンによる防御
が不十分であることが判明し、且つ新規流行中のＨ３Ｎ
２株の被害が増大しているにもかかわらず、１９９２〜
１９９３年シーズン中には新規のワクチン株は導入でき
なかった。
い。次シーズンのワクチンの開発は、来たるべき流行株
を予測すること（アジアにおける監視サンプリングによ
る）に依っており、これは不正確で、ワクチン用に用い
る株と実際に野外で流行するものとが余り適合しないと
いうことが起こり得る。さらに１９９２〜１９９３年の
インフルエンザシーズン中に起きたように、新規のＨ３
Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２）がインフルエンザ
シーズンの後期になってから臨床的に明らかになった。
これは、抗原不連続変異のために昔のＨ３Ｎ２株（Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９）により誘発された抗体が、Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と交叉反応性が不十分となったた
めで、１９９３〜１９９４年ワクチンの組成の変更を促
した。しかしながら、現在では認可ワクチンの製造及び
調剤に時間を要するために、既存のワクチンによる防御
が不十分であることが判明し、且つ新規流行中のＨ３Ｎ
２株の被害が増大しているにもかかわらず、１９９２〜
１９９３年シーズン中には新規のワクチン株は導入でき
なかった。
【０００６】ワクチンと流行株とがよく適合した場合で
も、認可ワクチンは健康な小児及び青年の約７０％、虚
弱老齢者の３０〜４０％の疾患を予防するに過ぎない。
したがって、ワクチン株が流行株に対応する場合にワク
チンの効能を示すためには他の判定基準を用いる。これ
らの判定基準としては、重症疾患及び二次合併症の予防
が挙げられるが、これらは入院防止（自宅生活年配者に
関しては７０％、老人ホーム生活年配者に関しては５０
〜６０％）及び死亡防止（老人ホーム居住者に関しては
８０％）に反映される。老人ホームでの感染の蔓延を低
減するための集団免疫は、免疫化のもう一つの利点であ
ると考えられる。
も、認可ワクチンは健康な小児及び青年の約７０％、虚
弱老齢者の３０〜４０％の疾患を予防するに過ぎない。
したがって、ワクチン株が流行株に対応する場合にワク
チンの効能を示すためには他の判定基準を用いる。これ
らの判定基準としては、重症疾患及び二次合併症の予防
が挙げられるが、これらは入院防止（自宅生活年配者に
関しては７０％、老人ホーム生活年配者に関しては５０
〜６０％）及び死亡防止（老人ホーム居住者に関しては
８０％）に反映される。老人ホームでの感染の蔓延を低
減するための集団免疫は、免疫化のもう一つの利点であ
ると考えられる。
【０００７】Ｂ．理想的な普遍的インフルエンザワクチ
ンの特性（本発明の目的）： １）群共通（異種）防御の生成。 普遍的ワクチンと
は、例えばＨ３Ｎ２サブタイプ内の、そしてできればサ
ブタイプ間でも、例えばＨ１Ｎ１からＨ３Ｎ２までの異
なる株に対して防御し得るものである。これは内部保存
ウイルスタンパク質からの抗原を認識する細胞毒性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）の媒介に依存するものと思われるが、
しかし膜結合タンパク質の保存部分に対して向けられる
中和抗体もある役割を演じると考えられる。
ンの特性（本発明の目的）： １）群共通（異種）防御の生成。 普遍的ワクチンと
は、例えばＨ３Ｎ２サブタイプ内の、そしてできればサ
ブタイプ間でも、例えばＨ１Ｎ１からＨ３Ｎ２までの異
なる株に対して防御し得るものである。これは内部保存
ウイルスタンパク質からの抗原を認識する細胞毒性Ｔリ
ンパ球（ＣＴＬ）の媒介に依存するものと思われるが、
しかし膜結合タンパク質の保存部分に対して向けられる
中和抗体もある役割を演じると考えられる。
【０００８】２）抗体反応の幅の増大。 ＣＴＬは疾病
からの回復にある役割を演じると考えられるため、もっ
ぱらＣＴＬ反応を基礎にしたワクチンは疾病の持続期間
を短縮する（疾病を無症状にさせる点までの場合を含
む）ことが予期されるが、しかし疾病を完全に防止はし
ないと思われる。卵中での継代による現在のインフルエ
ンザワクチンの製造方法は、ＨＡ抗原性を変えたウイル
ス亜集団が選択され得ることが実験的に示されている。
その結果、ワクチンにより引き出された抗体が優勢な流
行株に対して完全には有効でないために、ワクチン効力
が減殺される可能性がある。したがって現在のワクチン
と比較して反応の幅を改良した抗体の産生が望まれる。
１９９２〜９３年のインフルエンザシーズンは、Ａ／Ｂ
ｅｉｊｉｎｇ／８９を用いたワクチンがやはり毒性の大
きい新規のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２株に対して十分に
交叉反応を示さず、防御力の低い抗体を生成するとい
う、現行のワクチンの限界の優れた事例を提供した。両
株はＨ３Ｎ２、即ち同一サブタイプのものでありなが
ら、アミノ酸配列に関しては、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９
２株はＨＡ１領域における点突然変異が僅かに１１（位
置１３３、１３５、１４５、１５６、１５７、１８６、
１９０、１９１、１９３、２２６及び２６２）で、Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株とは異なっていた。現在の製造
方法が交差反応性の欠如に影響を及ぼすか否かは分から
ないが、しかし抗体反応の幅の改良が望ましいことは明
らかである。
からの回復にある役割を演じると考えられるため、もっ
ぱらＣＴＬ反応を基礎にしたワクチンは疾病の持続期間
を短縮する（疾病を無症状にさせる点までの場合を含
む）ことが予期されるが、しかし疾病を完全に防止はし
ないと思われる。卵中での継代による現在のインフルエ
ンザワクチンの製造方法は、ＨＡ抗原性を変えたウイル
ス亜集団が選択され得ることが実験的に示されている。
その結果、ワクチンにより引き出された抗体が優勢な流
行株に対して完全には有効でないために、ワクチン効力
が減殺される可能性がある。したがって現在のワクチン
と比較して反応の幅を改良した抗体の産生が望まれる。
１９９２〜９３年のインフルエンザシーズンは、Ａ／Ｂ
ｅｉｊｉｎｇ／８９を用いたワクチンがやはり毒性の大
きい新規のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２株に対して十分に
交叉反応を示さず、防御力の低い抗体を生成するとい
う、現行のワクチンの限界の優れた事例を提供した。両
株はＨ３Ｎ２、即ち同一サブタイプのものでありなが
ら、アミノ酸配列に関しては、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９
２株はＨＡ１領域における点突然変異が僅かに１１（位
置１３３、１３５、１４５、１５６、１５７、１８６、
１９０、１９１、１９３、２２６及び２６２）で、Ａ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株とは異なっていた。現在の製造
方法が交差反応性の欠如に影響を及ぼすか否かは分から
ないが、しかし抗体反応の幅の改良が望ましいことは明
らかである。
【０００９】３）抗体反応の持続時間の増大。 インフ
ルエンザ感染の罹患率及び死亡率に関して最も危険性の
高い群の１つ（年配者）は、防御抗体力価が年１度の免
疫化では急速に低減して有効でない群でもあるため、改
良ワクチンはより長く存続する抗体の防御力価を生成す
る必要がある。
ルエンザ感染の罹患率及び死亡率に関して最も危険性の
高い群の１つ（年配者）は、防御抗体力価が年１度の免
疫化では急速に低減して有効でない群でもあるため、改
良ワクチンはより長く存続する抗体の防御力価を生成す
る必要がある。
【００１０】Ｃ．ワクチンとしてのポリヌクレオチド ポリヌクレオチド構築物、即ちタンパク質をコードする
ＤＮＡプラスミドの筋肉内接種は、筋肉細胞でタンパク
質をその場で生成させることが示されている。ウイルス
タンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いるこ
とにより、抗体及びＣＴＬ反応をともに生じて、それぞ
れ同種又は交差株防御をその後の誘発の際の同種及び異
種防御に提供する。これらの種類の免疫反応は各々、既
存のワクチン法を上回ると思われる利点を提供する。抗
体を生成するためにＰＮＶを使用すると、抗体反応の持
続時間の増大と、並びにウイルスの臨床的流行株の正確
な配列並びに元のタンパク質（組換え体タンパク質に対
して）の適正な翻訳後修飾及び配座とを有し得る抗原の
供給が生じ得る。この方法によるＣＴＬ反応の発生によ
り、病原となる可能性のある生ベクター又は弱毒ウイル
スを使用せずに、交差株防御の実現が可能となる。
ＤＮＡプラスミドの筋肉内接種は、筋肉細胞でタンパク
質をその場で生成させることが示されている。ウイルス
タンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドを用いるこ
とにより、抗体及びＣＴＬ反応をともに生じて、それぞ
れ同種又は交差株防御をその後の誘発の際の同種及び異
種防御に提供する。これらの種類の免疫反応は各々、既
存のワクチン法を上回ると思われる利点を提供する。抗
体を生成するためにＰＮＶを使用すると、抗体反応の持
続時間の増大と、並びにウイルスの臨床的流行株の正確
な配列並びに元のタンパク質（組換え体タンパク質に対
して）の適正な翻訳後修飾及び配座とを有し得る抗原の
供給が生じ得る。この方法によるＣＴＬ反応の発生によ
り、病原となる可能性のある生ベクター又は弱毒ウイル
スを使用せずに、交差株防御の実現が可能となる。
【００１１】Ｄ．背景のさらなる説明： したがって、インフルエンザのようなウイルス（中和抗
体が生成される対象の）に対するワクチンの開発のため
の主な課題は、単離物間又は株間のウイルスエンベロー
プタンパク質の多様性である。マウス及びヒト双方にお
ける細胞毒性Ｔリンパ球は保存内部ウイルスタンパク質
由来のエピトープを認識でき［Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８２，１７８５（１９８５）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗ
ｎｓｅｎｄら，Ｃｅｌｌ ４４，９５９（１９８６）；
Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，７１９（１９８６）；Ｊ．Ｂａｓｔｉｎら，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５，１５０８（１９８７）；
Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＨ．Ｂｏｄｍｅｒ，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，６０１（１９
８９）］、ウイルスに対する免疫反応に重要であると考
えられる［Ｙ．Ｌ．Ｌｉｎ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａ
ｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，２２５（１９８
１）：Ｉ．Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．４，６８（１９７４）；Ｋ．Ｌ．Ｙａｐ及びＧ．
Ｌ．Ａｄａ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３，２３８（１９７
８）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，ＮｅＷ Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９，１３（１９８３）；Ｐ．Ｍ．
Ｔａｌｏｒ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．５８，４１７（１９８６）］ので、異なるウイルス
株に対する異種防御を提供し得るＣＴＬワクチンの開発
に尽力が注がれた。
体が生成される対象の）に対するワクチンの開発のため
の主な課題は、単離物間又は株間のウイルスエンベロー
プタンパク質の多様性である。マウス及びヒト双方にお
ける細胞毒性Ｔリンパ球は保存内部ウイルスタンパク質
由来のエピトープを認識でき［Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８２，１７８５（１９８５）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗ
ｎｓｅｎｄら，Ｃｅｌｌ ４４，９５９（１９８６）；
Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６７，７１９（１９８６）；Ｊ．Ｂａｓｔｉｎら，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５，１５０８（１９８７）；
Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＨ．Ｂｏｄｍｅｒ，
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，６０１（１９
８９）］、ウイルスに対する免疫反応に重要であると考
えられる［Ｙ．Ｌ．Ｌｉｎ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａ
ｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，２２５（１９８
１）：Ｉ．Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．４，６８（１９７４）；Ｋ．Ｌ．Ｙａｐ及びＧ．
Ｌ．Ａｄａ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３，２３８（１９７
８）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌら，ＮｅＷ Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９，１３（１９８３）；Ｐ．Ｍ．
Ｔａｌｏｒ及びＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．５８，４１７（１９８６）］ので、異なるウイルス
株に対する異種防御を提供し得るＣＴＬワクチンの開発
に尽力が注がれた。
【００１２】ＣＤ８＋ＣＴＬは、それらのＴ細胞受容体
がＭＨＣクラスＩ分子と会合したウイルスペプチドを認
識したとき、ウイルス感染細胞を殺す。［Ｒ．Ｍ．Ｚｉ
ｎｋｅｒｎａｇｅｌ及びＰ．Ｃ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，同誌
１４１，１４２７（１９７５）；Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉ
ｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３，６０５（１９９１）］。こ
れらのペプチドは、ウイルス内のタンパク質の位置又は
機能にかかわらず、内生的合成ウイルスタンパク質由来
のものである。したがって、保存ウイルスタンパク質か
らエピトープを認識することにより、ＣＴＬは交差株防
御を提供し得る。ＣＴＬ認識に関してＭＨＣクラスＩと
会合し得るペプチドは細胞質又は小胞体の中に又はそれ
を通過して存在するタンパク質から生じる［Ｊ．Ｗ．Ｙ
ｅｗｄｅｌｌ及びＪ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４，１０７２（１９８９）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔ
ｏｗｎｓｅｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４０，４４３（１
９８９）；Ｊ．Ｇ．Ｎｕｃｈｔｅｒｎら，同誌３３９，
２２３（１９８９）］。したがって、エンドソーム性処
理経路に入る外生タンパク質は（ＭＨＣクラスＩＩ分子
による抗原の場合と同様に）概して、ＣＤ８＋ＣＴＬ反
応を生じるに際して有効でない。
がＭＨＣクラスＩ分子と会合したウイルスペプチドを認
識したとき、ウイルス感染細胞を殺す。［Ｒ．Ｍ．Ｚｉ
ｎｋｅｒｎａｇｅｌ及びＰ．Ｃ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，同誌
１４１，１４２７（１９７５）；Ｒ．Ｎ．Ｇｅｒｍａｉ
ｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３，６０５（１９９１）］。こ
れらのペプチドは、ウイルス内のタンパク質の位置又は
機能にかかわらず、内生的合成ウイルスタンパク質由来
のものである。したがって、保存ウイルスタンパク質か
らエピトープを認識することにより、ＣＴＬは交差株防
御を提供し得る。ＣＴＬ認識に関してＭＨＣクラスＩと
会合し得るペプチドは細胞質又は小胞体の中に又はそれ
を通過して存在するタンパク質から生じる［Ｊ．Ｗ．Ｙ
ｅｗｄｅｌｌ及びＪ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４４，１０７２（１９８９）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔ
ｏｗｎｓｅｎｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４０，４４３（１
９８９）；Ｊ．Ｇ．Ｎｕｃｈｔｅｒｎら，同誌３３９，
２２３（１９８９）］。したがって、エンドソーム性処
理経路に入る外生タンパク質は（ＭＨＣクラスＩＩ分子
による抗原の場合と同様に）概して、ＣＤ８＋ＣＴＬ反
応を生じるに際して有効でない。
【００１３】ＣＴＬ反応を生じるための研究の殆どが、
細胞内でタンパク質抗原を産生するための複製ベクター
を用いる［Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋら、同誌３１１，５
７８（１９８４）；Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ及びＪ．
Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ，Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，１５３（１９９
０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５
１，４５６（１９９１）；Ａ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ及び
Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３５１，４７９
（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１４９，５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８９，２６７９（１９９２）］か、又は細胞質ゾル
中へのペプチドの導入に集中した［Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏ
ｎｅ及びＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６９，６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４２，５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉら，同誌３４４，８７３（１９９０）；Ｄ．
Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，
３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎら，同誌
１４８，２３５７（１９９２）］。これらのアプローチ
はともに、ワクチンとしての有用性をそこなうような限
界を有する。レトロウイルスベクターは融合タンパク質
として発現され得るポリペプチドの大きさ及び構造が限
られているが、一方複製する組換え体ウイルスの能力は
保持しており［Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
Ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１
（１９９２）］、その後の免疫化のためのワクチンのよ
うなベクターの有効性は、ベクターそれ自体に対する免
疫反応により弱体化され得る［Ｅ．Ｌ．Ｃｏｏｎｅｙ
ら，Ｌａｎｃｅｔ ３３７，５６７（１９９１）］。さ
らに、ウイルスベクター及び修飾病原体は、ヒトでのそ
の使用を妨げ得る固有の危険性を有する［Ｒ．Ｒ．Ｒｅ
ｄｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１
６，６７３（１９８７）；Ｌ．Ｍａｓｃｏｌａら，Ａｒ
ｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，１５６９（１９
８９）］。さらに、示されるペプチドエピトープの選択
は、個々のＭＨＣ抗原の構造に依っており、したがって
ペプチドワクチンは異系交配集団におけるＭＨＣハプロ
タイプの多様性のために限定された有効性を有する。
細胞内でタンパク質抗原を産生するための複製ベクター
を用いる［Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋら、同誌３１１，５
７８（１９８４）；Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ及びＪ．
Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ，Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，１５３（１９９
０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５
１，４５６（１９９１）；Ａ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ及び
Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３５１，４７９
（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１４９，５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）８９，２６７９（１９９２）］か、又は細胞質ゾル
中へのペプチドの導入に集中した［Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏ
ｎｅ及びＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６９，６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３４２，５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉら，同誌３４４，８７３（１９９０）；Ｄ．
Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，
３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎら，同誌
１４８，２３５７（１９９２）］。これらのアプローチ
はともに、ワクチンとしての有用性をそこなうような限
界を有する。レトロウイルスベクターは融合タンパク質
として発現され得るポリペプチドの大きさ及び構造が限
られているが、一方複製する組換え体ウイルスの能力は
保持しており［Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
Ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１
（１９９２）］、その後の免疫化のためのワクチンのよ
うなベクターの有効性は、ベクターそれ自体に対する免
疫反応により弱体化され得る［Ｅ．Ｌ．Ｃｏｏｎｅｙ
ら，Ｌａｎｃｅｔ ３３７，５６７（１９９１）］。さ
らに、ウイルスベクター及び修飾病原体は、ヒトでのそ
の使用を妨げ得る固有の危険性を有する［Ｒ．Ｒ．Ｒｅ
ｄｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１
６，６７３（１９８７）；Ｌ．Ｍａｓｃｏｌａら，Ａｒ
ｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，１５６９（１９
８９）］。さらに、示されるペプチドエピトープの選択
は、個々のＭＨＣ抗原の構造に依っており、したがって
ペプチドワクチンは異系交配集団におけるＭＨＣハプロ
タイプの多様性のために限定された有効性を有する。
【００１４】Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．とＲｅｓｈｅ
ｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ ８３，９５５１−９５５５，（１
９８６）］は、マウスに腹腔内、静脈内又は筋肉内投与
された、ＣａＣｌ２沈降したＤＮＡが発現されることを
示した。マウスにＤＮＡ発現ベクターを筋注（ｉ．
ｍ．）すると、筋肉細胞のＤＮＡ取り込み及びＤＮＡに
よりコードされるタンパク質の発現が生じることが立証
された［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５２，８１５（１９９１）］。プラスミド
はエピソーム的に保持され、複製しないことが示され
た。その後、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋並びにラ
ットの心筋に筋注後に持続性発現が観察された［Ｈ．Ｌ
ｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２，２２１７（１
９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１
９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，２１（１９９２）；
Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１，３６３（１９９２）］。治療薬として核酸を用
いる技術は、ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月
４日）に報告されているが、この場合、裸ポリヌクレオ
チドを用いて脊椎動物にワクチン接種した。
ｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ ８３，９５５１−９５５５，（１
９８６）］は、マウスに腹腔内、静脈内又は筋肉内投与
された、ＣａＣｌ２沈降したＤＮＡが発現されることを
示した。マウスにＤＮＡ発現ベクターを筋注（ｉ．
ｍ．）すると、筋肉細胞のＤＮＡ取り込み及びＤＮＡに
よりコードされるタンパク質の発現が生じることが立証
された［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３５２，８１５（１９９１）］。プラスミド
はエピソーム的に保持され、複製しないことが示され
た。その後、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋並びにラ
ットの心筋に筋注後に持続性発現が観察された［Ｈ．Ｌ
ｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２，２２１７（１
９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１
９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．
２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，２１（１９９２）；
Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ
ｔ．１，３６３（１９９２）］。治療薬として核酸を用
いる技術は、ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月
４日）に報告されているが、この場合、裸ポリヌクレオ
チドを用いて脊椎動物にワクチン接種した。
【００１５】方法の成功のためには免疫化が筋注である
必要はない。即ち、Ｔａｎｇ等［Ｎａｔｕｒｅ，３５
６，１５２−１５４（１９９２）］は、ウシ成長ホルモ
ン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金ミクロ入
射粒子をマウスの皮膚に導入するとマウスにおいて抗−
ＢＧＨ抗体が産生されることを開示した。Ｆｕｒｔｈ等
［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２０５，３６５−３６８（１９９２）］は、生きた動物
の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織をトランスフェクトす
るためにジェットインジェクターを用い得ることを示し
た。核酸を導入するための種々の方法に関し、近年Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２
７５−１２８１（１９８９）］の総説がある。Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎら，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ
Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ １９９２ ｍｅ
ｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅ
ｓｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎ
ｇ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆ ＡＩＤＳ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｐ９２も参照して頂きた
いが、この場合、鳥類インフルエンザＤＮＡの鶏へのｉ
ｍ、ｉｐ及びｉｖ投与は致命的影響に対する防御を提供
したと記載されている。しかしながら、どの鳥類インフ
ルエンザウイルス遺伝子を用いたかの開示はなかった。
さらに、交差株防御の誘発については何も触れずに、Ｈ
７特異性免疫反応のみが記載されている。
必要はない。即ち、Ｔａｎｇ等［Ｎａｔｕｒｅ，３５
６，１５２−１５４（１９９２）］は、ウシ成長ホルモ
ン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金ミクロ入
射粒子をマウスの皮膚に導入するとマウスにおいて抗−
ＢＧＨ抗体が産生されることを開示した。Ｆｕｒｔｈ等
［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
２０５，３６５−３６８（１９９２）］は、生きた動物
の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織をトランスフェクトす
るためにジェットインジェクターを用い得ることを示し
た。核酸を導入するための種々の方法に関し、近年Ｆｒ
ｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２
７５−１２８１（１９８９）］の総説がある。Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎら，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ
Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ １９９２ ｍｅ
ｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅ
ｓｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃｌｕｄｉｎ
ｇ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆ ＡＩＤＳ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｐ９２も参照して頂きた
いが、この場合、鳥類インフルエンザＤＮＡの鶏へのｉ
ｍ、ｉｐ及びｉｖ投与は致命的影響に対する防御を提供
したと記載されている。しかしながら、どの鳥類インフ
ルエンザウイルス遺伝子を用いたかの開示はなかった。
さらに、交差株防御の誘発については何も触れずに、Ｈ
７特異性免疫反応のみが記載されている。
【００１６】したがって、本発明はタンパク質の発現を
誘発するために生組織中に核酸を導入するための任意の
公知の方法を意図する。本発明は、ウイルス特異性ＣＴ
Ｌを生成するための抗原処理経路にウイルスタンパク質
を導入する方法を提供する。したがって、ウイルス性病
原体に対する所望の予防的免疫反応を引き出し得る特異
的治療薬の必要性は、本発明のインフルエンザウイルス
により満たされた。本治療アプローチにおいて特に重要
なことは、抗原遺伝子を得た株と比べ異種であるウイル
ス株の感染をさえ防止し得るＴ細胞免疫反応を誘発する
能力である。したがって、本発明は、ヒトインフルエン
ザウイルス核タンパク質（ＮＰ）、ヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）、ニューラミニダーゼ（ＮＭ）、マトリックス
（Ｍ）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１及びＰ
Ｂ２＝塩基性ポリメラーゼ１及び２；ＰＡ＝酸性ポリメ
ラーゼ）のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築
物、又は特異的ＣＴＬを生成する物質をコードする任意
の他のインフルエンザ遺伝子を提供する。
誘発するために生組織中に核酸を導入するための任意の
公知の方法を意図する。本発明は、ウイルス特異性ＣＴ
Ｌを生成するための抗原処理経路にウイルスタンパク質
を導入する方法を提供する。したがって、ウイルス性病
原体に対する所望の予防的免疫反応を引き出し得る特異
的治療薬の必要性は、本発明のインフルエンザウイルス
により満たされた。本治療アプローチにおいて特に重要
なことは、抗原遺伝子を得た株と比べ異種であるウイル
ス株の感染をさえ防止し得るＴ細胞免疫反応を誘発する
能力である。したがって、本発明は、ヒトインフルエン
ザウイルス核タンパク質（ＮＰ）、ヘマグルチニン（Ｈ
Ａ）、ニューラミニダーゼ（ＮＭ）、マトリックス
（Ｍ）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１及びＰ
Ｂ２＝塩基性ポリメラーゼ１及び２；ＰＡ＝酸性ポリメ
ラーゼ）のウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ構築
物、又は特異的ＣＴＬを生成する物質をコードする任意
の他のインフルエンザ遺伝子を提供する。
【００１７】インフルエンザウイルスは、複数のＲＮＡ
セグメントから成るリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有す
る。各ＲＮＡは少なくとも１つの遺伝子物質をコードす
る。ＮＰ遺伝子物質はＲＮＡと結合して、ウイルスＲＮ
Ａを感染細胞の核中にトランスロケートする。配列は、
５０年の期間を見ても、アミノ酸配列中に僅か約７％の
変化率で保存されている。Ｐ遺伝子物質（ＰＢ１、ＰＢ
２、ＰＡ）は新規のウイルスＲＮＡの合成に関与する。
これらの遺伝子は、ＮＰ遺伝子よりさらに高度に保存さ
れている。ＨＡは主要ウイルスエンベロープ遺伝子物質
である。それはＮＰほど高度には保存されていない。そ
れは細胞受容体を結合し、したがって新規のインフルエ
ンザ感染をもたらす。主要な中和抗体反応はこの遺伝子
物質に対して向けられる。大部分の細胞毒性Ｔリンパ球
反応もこのタンパク質に対して向けられる。ヒトインフ
ルエンザウイルスに対する現行のワクチンは、３種類の
株のインフルエンザウイルス又はそれらのＨＡタンパク
質を有している。しかしながら、株が違うとＨＡのタン
パク質配列が変異するので、ワクチンは絶えず流行して
いる病原株に合わせて作られねばならない。しかしなが
ら、ＨＡは、適正に存在する場合には、ＣＴＬの生成の
ためのいくつかの保存要素を有している。ＮＳ１及びＮ
Ｓ２遺伝子物質は生理機能が十分に判明していないが、
しかし防御ＣＴＬ反応の生成に有意であると思われる。
最後に、ＨＡにおけるよりもわずかに多く保存されたＭ
１及びＭ２遺伝子物質は、主要ＣＴＬ反応を誘発する。
Ｍ１タンパク質は非常に豊富に存在するウイルス遺伝子
物質である。
セグメントから成るリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有す
る。各ＲＮＡは少なくとも１つの遺伝子物質をコードす
る。ＮＰ遺伝子物質はＲＮＡと結合して、ウイルスＲＮ
Ａを感染細胞の核中にトランスロケートする。配列は、
５０年の期間を見ても、アミノ酸配列中に僅か約７％の
変化率で保存されている。Ｐ遺伝子物質（ＰＢ１、ＰＢ
２、ＰＡ）は新規のウイルスＲＮＡの合成に関与する。
これらの遺伝子は、ＮＰ遺伝子よりさらに高度に保存さ
れている。ＨＡは主要ウイルスエンベロープ遺伝子物質
である。それはＮＰほど高度には保存されていない。そ
れは細胞受容体を結合し、したがって新規のインフルエ
ンザ感染をもたらす。主要な中和抗体反応はこの遺伝子
物質に対して向けられる。大部分の細胞毒性Ｔリンパ球
反応もこのタンパク質に対して向けられる。ヒトインフ
ルエンザウイルスに対する現行のワクチンは、３種類の
株のインフルエンザウイルス又はそれらのＨＡタンパク
質を有している。しかしながら、株が違うとＨＡのタン
パク質配列が変異するので、ワクチンは絶えず流行して
いる病原株に合わせて作られねばならない。しかしなが
ら、ＨＡは、適正に存在する場合には、ＣＴＬの生成の
ためのいくつかの保存要素を有している。ＮＳ１及びＮ
Ｓ２遺伝子物質は生理機能が十分に判明していないが、
しかし防御ＣＴＬ反応の生成に有意であると思われる。
最後に、ＨＡにおけるよりもわずかに多く保存されたＭ
１及びＭ２遺伝子物質は、主要ＣＴＬ反応を誘発する。
Ｍ１タンパク質は非常に豊富に存在するウイルス遺伝子
物質である。
【００１８】その後のウイルス感染に対するＤＮＡワク
チン接種の防御効力は、１つ又はそれ以上の上記のウイ
ルスタンパク質をコードする非複製プラスミドＤＮＡを
用いた免疫化により実証される。これは、感染性物質の
関与がなく、ウイルス粒子を集める必要がなく、そして
決定因子選択が可能であるために有益である。さらに、
核タンパク質及びいくつかの他のウイルス遺伝子物質の
配列がインフルエンザの種々の株内に保存されているた
め、クローン化遺伝子が得られた株と同種の又は異種の
インフルエンザウイルスの有毒株によるその後の感染に
対する防御が可能となる。
チン接種の防御効力は、１つ又はそれ以上の上記のウイ
ルスタンパク質をコードする非複製プラスミドＤＮＡを
用いた免疫化により実証される。これは、感染性物質の
関与がなく、ウイルス粒子を集める必要がなく、そして
決定因子選択が可能であるために有益である。さらに、
核タンパク質及びいくつかの他のウイルス遺伝子物質の
配列がインフルエンザの種々の株内に保存されているた
め、クローン化遺伝子が得られた株と同種の又は異種の
インフルエンザウイルスの有毒株によるその後の感染に
対する防御が可能となる。
【００１９】本発明の要約 注射又は他の方法により動物組織中に直接導入する場合
に発現され得る本発明のＤＮＡ構築物は、新規の予防製
剤である。それらは、株特異性である一般の抗体に対比
して、異なる株のウイルスと反応するウイルス抗原に特
異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘発する。この
ようなＣＴＬのｉｎ ｖｉｖｏ生成は通常、ウイルス感
染の場合と同様に、抗原の内生的発現を要する。直接ペ
プチド供給の制約を伴わず又はウイルスベクターを使用
せずに、免疫系に関与するウイルス抗原を生成するため
に、ヒトインフルエンザウイルスタンパク質をコードす
るプラスミドＤＮＡをＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に注
入した。これによりインフルエンザウイルス特異性ＣＴ
Ｌが生成され、ウイルス肺力価の低下、体重損失の阻
止、及び生存率の増大で測定されたように、インフルエ
ンザウイルスの異種株を用いたその後の感染試験の防御
がなされた。ヘマグルチニンに対する抗力価中和抗体及
び核タンパク質に対する抗体がアカゲザルで生成され、
鼻腔ウイルスカ価の低下がフェレットの同種及び異種誘
発試験後に観察された。
に発現され得る本発明のＤＮＡ構築物は、新規の予防製
剤である。それらは、株特異性である一般の抗体に対比
して、異なる株のウイルスと反応するウイルス抗原に特
異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘発する。この
ようなＣＴＬのｉｎ ｖｉｖｏ生成は通常、ウイルス感
染の場合と同様に、抗原の内生的発現を要する。直接ペ
プチド供給の制約を伴わず又はウイルスベクターを使用
せずに、免疫系に関与するウイルス抗原を生成するため
に、ヒトインフルエンザウイルスタンパク質をコードす
るプラスミドＤＮＡをＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭筋に注
入した。これによりインフルエンザウイルス特異性ＣＴ
Ｌが生成され、ウイルス肺力価の低下、体重損失の阻
止、及び生存率の増大で測定されたように、インフルエ
ンザウイルスの異種株を用いたその後の感染試験の防御
がなされた。ヘマグルチニンに対する抗力価中和抗体及
び核タンパク質に対する抗体がアカゲザルで生成され、
鼻腔ウイルスカ価の低下がフェレットの同種及び異種誘
発試験後に観察された。
【００２０】本発明に関連する主要な観察を以下に挙げ
る： １）効力の実証。 ＮＰ遺伝子の供給源株とは異なるイ
ンフルエンザの株を用いて試験したマウスにおける生存
率の増大、ウイルス肺力価の低下、及び体重損失の阻止
で測定されるように、核タンパク質（ＮＰ）ＤＮＡを用
いた免疫化後に異種防御が認められる。この場合、２つ
の株の表面タンパク質はまったく異なっており（Ｈ１Ｎ
１対Ｈ３Ｎ２）、試験株は初期株後３４年目に生じたも
のである。ＮＰ ＤＮＡ及びマトリックス（Ｍ１）ＤＮ
Ａを別々に、一緒に、又はＨＡＤＮＡと組合せてフェレ
ットを免疫化すると、連続変異株（臨床的単離物）を用
いた試験に対する防御（鼻腔ウイルス脱落低減）が示さ
れた。特にＤＮＡカクテル（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９タン
パク質をコードするＮＰ及びＭ１ ＤＮＡ、及びＢｅｉ
ｊｉｎｇ／８９又はＨａｗａｉｉ／９１ ＨＡをコード
するＨＡ ＤＮＡ）による防御は、フェレットにおける
連続変異株（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）に対しては、認可
ワクチン（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９含有）によってもたら
されるものより大きかった。Ｈａｗａｉｉ／９１からの
ＨＡ ＤＮＡを含有するカクテルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９からのＨＡ ＤＮＡを含有するカクテルよりもわず
かに効力が高いと思われた。ＨａＷａｉｉ／９１に関す
るＨＡ ＤＮＡを含むカクテルを用いて観察された防御
は同種ＨＡ ＤＮＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を用いて
観察された防御と同等だったが、一方Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９に関するＨＡ ＤＮＡを有するカクテルは同種防御
とは異なっていたが、しかしそれは依然として認可物質
よりも有意に効力が良好であった。ＨＩ抗体は、マウ
ス、フェレット、アカゲザル及びアフリカミドリザルを
含めたすべての試験種で産生された。
る： １）効力の実証。 ＮＰ遺伝子の供給源株とは異なるイ
ンフルエンザの株を用いて試験したマウスにおける生存
率の増大、ウイルス肺力価の低下、及び体重損失の阻止
で測定されるように、核タンパク質（ＮＰ）ＤＮＡを用
いた免疫化後に異種防御が認められる。この場合、２つ
の株の表面タンパク質はまったく異なっており（Ｈ１Ｎ
１対Ｈ３Ｎ２）、試験株は初期株後３４年目に生じたも
のである。ＮＰ ＤＮＡ及びマトリックス（Ｍ１）ＤＮ
Ａを別々に、一緒に、又はＨＡＤＮＡと組合せてフェレ
ットを免疫化すると、連続変異株（臨床的単離物）を用
いた試験に対する防御（鼻腔ウイルス脱落低減）が示さ
れた。特にＤＮＡカクテル（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９タン
パク質をコードするＮＰ及びＭ１ ＤＮＡ、及びＢｅｉ
ｊｉｎｇ／８９又はＨａｗａｉｉ／９１ ＨＡをコード
するＨＡ ＤＮＡ）による防御は、フェレットにおける
連続変異株（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）に対しては、認可
ワクチン（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９含有）によってもたら
されるものより大きかった。Ｈａｗａｉｉ／９１からの
ＨＡ ＤＮＡを含有するカクテルは、Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９からのＨＡ ＤＮＡを含有するカクテルよりもわず
かに効力が高いと思われた。ＨａＷａｉｉ／９１に関す
るＨＡ ＤＮＡを含むカクテルを用いて観察された防御
は同種ＨＡ ＤＮＡ（Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を用いて
観察された防御と同等だったが、一方Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９に関するＨＡ ＤＮＡを有するカクテルは同種防御
とは異なっていたが、しかしそれは依然として認可物質
よりも有意に効力が良好であった。ＨＩ抗体は、マウ
ス、フェレット、アカゲザル及びアフリカミドリザルを
含めたすべての試験種で産生された。
【００２１】２）持続性。 リポーター遺伝子をコード
するＤＮＡを用いた試験において、ＤＮＡ及びタンパク
質発現の存在は少なくとも１．５年間存続した（マウス
で試験した最長時間；Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２）。したがって、インフル
エンザ遺伝子物質も持続的に発現されるならば、その結
果生じる免疫反応も持続しているはずである。インフル
エンザＤＮＡ注入により生成される抗体及びＣＴＬ（Ｙ
ａｎｋａｕｃｋａｓら，ＤＮＡ ＆ ＣｅｌｌＢｉｏ
ｌ．，１９９３）、並びに同種防御免疫（ＭＲＬデー
タ）は、マウスでは１年に亘って存続することが示され
ている。抗体は、アカゲザルでは今までのところ少なく
とも１年間存続することが示されている。ＣＴＬ反応及
び異質防御の持続時間（生存率増大）は、６か月まで存
続する（これまでの試験最長時間）。異種防御度のわず
かな低減が生じたが、防御は増強可能である。
するＤＮＡを用いた試験において、ＤＮＡ及びタンパク
質発現の存在は少なくとも１．５年間存続した（マウス
で試験した最長時間；Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９２）。したがって、インフル
エンザ遺伝子物質も持続的に発現されるならば、その結
果生じる免疫反応も持続しているはずである。インフル
エンザＤＮＡ注入により生成される抗体及びＣＴＬ（Ｙ
ａｎｋａｕｃｋａｓら，ＤＮＡ ＆ ＣｅｌｌＢｉｏ
ｌ．，１９９３）、並びに同種防御免疫（ＭＲＬデー
タ）は、マウスでは１年に亘って存続することが示され
ている。抗体は、アカゲザルでは今までのところ少なく
とも１年間存続することが示されている。ＣＴＬ反応及
び異質防御の持続時間（生存率増大）は、６か月まで存
続する（これまでの試験最長時間）。異種防御度のわず
かな低減が生じたが、防御は増強可能である。
【００２２】３）用量範囲。 アカゲザルで投与試験を
実施した結果、ＨＡ ＤＮＡ １００μｇを２回投与す
ると、今までのところ１年ＨＩ抗体の良好な力価が存続
することが示された。マウスにおける防御の発生（異種
試験後の生存率増大）は、６μｇ（３回投与）という低
い用量で、そして２００μｇの１回注入で観察された
が、しかし概して注射回数を増大すると（３回まで）防
御程度が改良された。霊長類試験からは、３つのＨＡｓ
並びにＮＰ及びＭ１（後者はＨ３Ｎ２ Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９遺伝子をコードする）をコードするＤＮＡ １０
〜１００μｇを２回注射すると、認可ワクチンにより生
成されるものとほぼ同じＨＩ抗体力価を生じた。試験し
たすべての動物がインフルエンザには未感染であった
が、一方で標的臨床集団（老齢個体）はすべてインフル
エンザを経験しているということを思い起こすことは重
要である（９才以下の小児に認可ワクチンを２回注射し
たことを思い出していただきたい）。
実施した結果、ＨＡ ＤＮＡ １００μｇを２回投与す
ると、今までのところ１年ＨＩ抗体の良好な力価が存続
することが示された。マウスにおける防御の発生（異種
試験後の生存率増大）は、６μｇ（３回投与）という低
い用量で、そして２００μｇの１回注入で観察された
が、しかし概して注射回数を増大すると（３回まで）防
御程度が改良された。霊長類試験からは、３つのＨＡｓ
並びにＮＰ及びＭ１（後者はＨ３Ｎ２ Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９遺伝子をコードする）をコードするＤＮＡ １０
〜１００μｇを２回注射すると、認可ワクチンにより生
成されるものとほぼ同じＨＩ抗体力価を生じた。試験し
たすべての動物がインフルエンザには未感染であった
が、一方で標的臨床集団（老齢個体）はすべてインフル
エンザを経験しているということを思い起こすことは重
要である（９才以下の小児に認可ワクチンを２回注射し
たことを思い出していただきたい）。
【００２３】本発明の詳しい説明 本発明は、哺乳類及びヒトのような脊椎動物を含めた動
物に直接導入する場合に、動物内でのコード化タンパク
質の発現を誘発する核酸製剤を提供する。タンパク質が
病的症状の場合を除いて通常はその動物には生じないも
の、例えばインフルエンザウイルスと会合したタンパク
質、例えばインフルエンザ核タンパク質、ニューラミニ
ダーゼ、ヘマグルチニン、ポリメラーゼ、マトリックス
又は非構造タンパク質である（しかしこれらに限定され
ない）場合、動物の免疫系が活性化されて防御反応を起
こす。これらの外生タンパク質は動物自身の組織により
生成されるため、発現タンパク質は主な組織適合性複合
体ＭＨＣにより処理され、提示される。この認識は、関
連する生物体による実際の感染時に起きるものと類似す
る。結果は、本開示に示すように、有毒感染に対して防
御する免疫反応の誘発である。
物に直接導入する場合に、動物内でのコード化タンパク
質の発現を誘発する核酸製剤を提供する。タンパク質が
病的症状の場合を除いて通常はその動物には生じないも
の、例えばインフルエンザウイルスと会合したタンパク
質、例えばインフルエンザ核タンパク質、ニューラミニ
ダーゼ、ヘマグルチニン、ポリメラーゼ、マトリックス
又は非構造タンパク質である（しかしこれらに限定され
ない）場合、動物の免疫系が活性化されて防御反応を起
こす。これらの外生タンパク質は動物自身の組織により
生成されるため、発現タンパク質は主な組織適合性複合
体ＭＨＣにより処理され、提示される。この認識は、関
連する生物体による実際の感染時に起きるものと類似す
る。結果は、本開示に示すように、有毒感染に対して防
御する免疫反応の誘発である。
【００２４】本発明は、同様の機序（上記の“発明の背
景”参照）により注射、吸入又は押印によって動物組織
中にｉｎ ｖｉｖｏに導入した場合に、ヒトインフルエ
ンザウイルス遺伝子物質の発現が起きる核酸を提供す
る。したがって、例えば本発明のＤＮＡ構築物をマウス
の筋肉中に注射すると、コード化遺伝子物質の発現が誘
発される。フェレット及びアカゲザルでも同様である。
有毒インフルエンザウイルスを用いたその後の試験にお
いては、等しく対照動物を殺す用量を用いても、ポリヌ
クレオチドワクチンを注射した動物は罹患率及び死亡率
が非常に低下する。したがって、本発明は、インフルエ
ンザウイルス感染を防止するためのヒトに有用なワクチ
ンを開示する。
景”参照）により注射、吸入又は押印によって動物組織
中にｉｎ ｖｉｖｏに導入した場合に、ヒトインフルエ
ンザウイルス遺伝子物質の発現が起きる核酸を提供す
る。したがって、例えば本発明のＤＮＡ構築物をマウス
の筋肉中に注射すると、コード化遺伝子物質の発現が誘
発される。フェレット及びアカゲザルでも同様である。
有毒インフルエンザウイルスを用いたその後の試験にお
いては、等しく対照動物を殺す用量を用いても、ポリヌ
クレオチドワクチンを注射した動物は罹患率及び死亡率
が非常に低下する。したがって、本発明は、インフルエ
ンザウイルス感染を防止するためのヒトに有用なワクチ
ンを開示する。
【００２５】インフルエンザウイルスタンパク質をコー
ドするＤＮＡ構築物が動物における防御免疫反応を引き
出すことを、我々は示す。下記でさらに詳しく述べるよ
うに、動物における免疫反応としては、マウスにおける
抗体及びＣＴＬ産生、フェレット及び霊長類における抗
体産生、並びにマウス及びフェレットにおけるインフル
エンザの同種の連続変異及び不連続変異株を用いたウイ
ルス誘発試験に対する防御が挙げられる。ウイルスタン
パク質をコードするＤＮＡを用いた免疫化のおそらくは
最もめざましい結果は、別のサブタイプのウイルスに対
する防御を付与する能力であった。これは、ＣＴＬ誘発
成分のワクチンへの付加は、シーズン半ばに発生したり
又はワクチン株が翌年のために毎年選択された際には予
想できなかった新変種の出現による衝撃を軽減するのに
役立つことを示唆する。ＨＡ、ＮＰ及びＭ１遺伝子をコ
ードするｃＤＮＡベクターによる免疫化が、認可ワクチ
ンの場合よりもフェレットにおけるウイルスの連続変異
株に対してより有効に防御し得た、ということは重要で
ある。これは、ＰＮＶにおける内部遺伝子をコードする
構築物の使用の妥当性を意味する。
ドするＤＮＡ構築物が動物における防御免疫反応を引き
出すことを、我々は示す。下記でさらに詳しく述べるよ
うに、動物における免疫反応としては、マウスにおける
抗体及びＣＴＬ産生、フェレット及び霊長類における抗
体産生、並びにマウス及びフェレットにおけるインフル
エンザの同種の連続変異及び不連続変異株を用いたウイ
ルス誘発試験に対する防御が挙げられる。ウイルスタン
パク質をコードするＤＮＡを用いた免疫化のおそらくは
最もめざましい結果は、別のサブタイプのウイルスに対
する防御を付与する能力であった。これは、ＣＴＬ誘発
成分のワクチンへの付加は、シーズン半ばに発生したり
又はワクチン株が翌年のために毎年選択された際には予
想できなかった新変種の出現による衝撃を軽減するのに
役立つことを示唆する。ＨＡ、ＮＰ及びＭ１遺伝子をコ
ードするｃＤＮＡベクターによる免疫化が、認可ワクチ
ンの場合よりもフェレットにおけるウイルスの連続変異
株に対してより有効に防御し得た、ということは重要で
ある。これは、ＰＮＶにおける内部遺伝子をコードする
構築物の使用の妥当性を意味する。
【００２６】ある態様において、連続変異及び不連続変
異抗原に対する群共通防御を提供するために、本ワクチ
ン生成物質は、例えばＡ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｔｅｘａｓ／
９１）、Ａ／Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）及
びＢ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０）ウイルスに代表された
３つの流行の臨床株からのＨＡをコードする別々のＤＮ
Ａプラスミド、並びにＡ（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９；Ｈ３
Ｎ２）及びＢ株の両方からの内部保存タンパク質ＮＰ及
びＭ１（マトリックス）をコードするＤＮＡ構築物から
成る。ＨＡ ＤＮＡは、ＨＡを生成し、その結果ＨＡに
対する中和抗体を生じることにより機能する。これはタ
イプ特異性であって、あるものは現行認可タンパク質ベ
ースのワクチンに比して連続変異株に対する防御の幅を
増大した。ＮＰ及びＭ１構築物はＣＴＬ生成を促し、こ
れが交差株防御を提供して、ウイルス負荷を低減し、疾
病からの回復を促進する。ＤＮＡ構築物（筋細胞におけ
るエピソーム性非複製非一体化形態での）の予測持続性
は、現行ワクチンに比して防御の持続時間を増大するこ
とが予期される。
異抗原に対する群共通防御を提供するために、本ワクチ
ン生成物質は、例えばＡ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｔｅｘａｓ／
９１）、Ａ／Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）及
びＢ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０）ウイルスに代表された
３つの流行の臨床株からのＨＡをコードする別々のＤＮ
Ａプラスミド、並びにＡ（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９；Ｈ３
Ｎ２）及びＢ株の両方からの内部保存タンパク質ＮＰ及
びＭ１（マトリックス）をコードするＤＮＡ構築物から
成る。ＨＡ ＤＮＡは、ＨＡを生成し、その結果ＨＡに
対する中和抗体を生じることにより機能する。これはタ
イプ特異性であって、あるものは現行認可タンパク質ベ
ースのワクチンに比して連続変異株に対する防御の幅を
増大した。ＮＰ及びＭ１構築物はＣＴＬ生成を促し、こ
れが交差株防御を提供して、ウイルス負荷を低減し、疾
病からの回復を促進する。ＤＮＡ構築物（筋細胞におけ
るエピソーム性非複製非一体化形態での）の予測持続性
は、現行ワクチンに比して防御の持続時間を増大するこ
とが予期される。
【００２７】現行認可ワクチンよりも有益であると考え
られる点を以下に挙げる：ＣＴＬ反応による防御幅の増
大±抗体幅の増大、及び防御継続時間の増大。ＰＮＶア
プローチは、新規のＤＮＡ構築物は臨床的野外単離物か
らもっと直接的に作り得るため、現行認可ワクチンのよ
うにリアソータントを作製し、選択しそして増殖する必
要がない。
られる点を以下に挙げる：ＣＴＬ反応による防御幅の増
大±抗体幅の増大、及び防御継続時間の増大。ＰＮＶア
プローチは、新規のＤＮＡ構築物は臨床的野外単離物か
らもっと直接的に作り得るため、現行認可ワクチンのよ
うにリアソータントを作製し、選択しそして増殖する必
要がない。
【００２８】本発明のある態様では、Ａ／ＰＲ／８／３
４株から得られたヒトインフルエンザウイルス核タンパ
ク質ＮＰ配列を発現ベクター中でクローン化する。ベク
ターはＲＮＡポリメラーゼ転写のためのプロモーター、
及びＮＰコード配列の末尾に転写ターミネーターを含有
する。ある好ましい態様においては、プロモーターは、
強力な転写プロモーターであるラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）である。さ
らに好ましいプロモーターは、イントロンＡ配列を有す
るサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔ
Ａ）である。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長
ホルモンターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧ
Ｈターミネーターの組合せが特に好ましい。さらに、製
剤の調製を容易にするために、抗生物質耐性マーカーも
発現ベクター中に含まれるのが好ましい。アンピシリン
耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は任意の他の製
薬上許容可能な抗生物質耐性マーカーを用い得る。本発
明の好ましい態様において、抗生物質耐性遺伝子はネオ
マイシン耐性のための遺伝子物質をコードする。さら
に、原核生物において発酵による製剤を高効率で達成す
るためには、ベクターが複製原点を含有し、高複写数を
有すると有益である。多数市販されている原核性クロー
ニングベクターは、いずれもこれらの利益を提供する。
本発明の好ましい態様においては、これらの機能性は、
ｐＵＣとして公知の市販ベクターにより提供される。非
必須ＤＮＡ配列は除去するのが望ましい。したがって、
ｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコード配列は、本発明の
ある態様においては除去される。
４株から得られたヒトインフルエンザウイルス核タンパ
ク質ＮＰ配列を発現ベクター中でクローン化する。ベク
ターはＲＮＡポリメラーゼ転写のためのプロモーター、
及びＮＰコード配列の末尾に転写ターミネーターを含有
する。ある好ましい態様においては、プロモーターは、
強力な転写プロモーターであるラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）である。さ
らに好ましいプロモーターは、イントロンＡ配列を有す
るサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔ
Ａ）である。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長
ホルモンターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧ
Ｈターミネーターの組合せが特に好ましい。さらに、製
剤の調製を容易にするために、抗生物質耐性マーカーも
発現ベクター中に含まれるのが好ましい。アンピシリン
耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は任意の他の製
薬上許容可能な抗生物質耐性マーカーを用い得る。本発
明の好ましい態様において、抗生物質耐性遺伝子はネオ
マイシン耐性のための遺伝子物質をコードする。さら
に、原核生物において発酵による製剤を高効率で達成す
るためには、ベクターが複製原点を含有し、高複写数を
有すると有益である。多数市販されている原核性クロー
ニングベクターは、いずれもこれらの利益を提供する。
本発明の好ましい態様においては、これらの機能性は、
ｐＵＣとして公知の市販ベクターにより提供される。非
必須ＤＮＡ配列は除去するのが望ましい。したがって、
ｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコード配列は、本発明の
ある態様においては除去される。
【００２９】ある態様では、発現ベクターｐｎＲＳＶを
用いるが、この場合ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロン
グターミナルリピート（ＬＴＲ）をプロモーターとして
用いる。別の態様では、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ
転写ターミネーターをその中でクローン化したＶ１、即
ち突然変異化ｐＢＲ３２２ベクターを用いる。Ｖ１−Ｎ
Ｐ構築物を用いてマウスを免疫化し、異種感染を防御す
るＣＴＬを誘発した。本発明の特に好ましい態様におい
て、Ｖ１の要素を組合せてＶ１Ｊと命名する発現ベクタ
ーを生成した。Ｖ１Ｊ中で、インフルエンザウイルス遺
伝子、例えばＡ／ＰＲ／８／３４ ＮＰ、ＰＢ１、ＮＳ
１、ＨＡ、ＰＢ２又はＭ１遺伝子をクローン化する。さ
らに別の態様において、アンピシリン耐性遺伝子をＶ１
Ｊから除去し、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換えて、
Ｖ１Ｊ−ｎｅｏ（配列番号１８、図７）を形成し、この
中で、本発明に従って用いるために多数の異なるインフ
ルエンザウイルス遺伝子をクローン化した。さらに別の
態様では、ベクターはＶ１Ｊｎｓであって、これは、そ
れまでになかったＳｆｉＩ制限部位をＶ１Ｊ−ｎｅｏの
２１１４位に一つだけあるＫｐｎＩ部位に組み込んだ以
外は、Ｖ１Ｊと同様である。ヒトゲノムＤＮＡにおける
ＳｆｉＩ部位の頻度は非常に低い（約１部位／１００，
０００塩基）。したがって、抽出ゲノムＤＮＡをＳｆｉ
Ｉ消化するだけで、このベクターにより宿主ＤＮＡとの
発現ベクター一体化を注意深く監視し得る。さらなる改
良において、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターに
おいては、できるだけ非必須ＤＮＡをベクターから“切
り取って”高度に詰まったベクターを生成した。このベ
クターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であって、図３６（配列番
号４５）に示す。このベクターによって、望ましくない
配列がコードされることなく大きな挿入物を使用できる
し、特異的インフルエンザウイルス遺伝子をコードする
構築物が周囲組織に導入される場合の細胞による取り込
みを最適化できる。図３６では、切り取られたＶ１Ｊｎ
ｅｏ（図７）の部分をギャップで、挿入配列は太字で示
すが、Ｖ１Ｊｎｅｏの塩基番号は変えていない。前述の
ベクター修飾及び開発手順は当業者に公知の方法により
達成し得る。記載した特定の生成物質は、慣用的方法に
より得られたが、適用される特定の目的には特に有用で
あった。
用いるが、この場合ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロン
グターミナルリピート（ＬＴＲ）をプロモーターとして
用いる。別の態様では、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ
転写ターミネーターをその中でクローン化したＶ１、即
ち突然変異化ｐＢＲ３２２ベクターを用いる。Ｖ１−Ｎ
Ｐ構築物を用いてマウスを免疫化し、異種感染を防御す
るＣＴＬを誘発した。本発明の特に好ましい態様におい
て、Ｖ１の要素を組合せてＶ１Ｊと命名する発現ベクタ
ーを生成した。Ｖ１Ｊ中で、インフルエンザウイルス遺
伝子、例えばＡ／ＰＲ／８／３４ ＮＰ、ＰＢ１、ＮＳ
１、ＨＡ、ＰＢ２又はＭ１遺伝子をクローン化する。さ
らに別の態様において、アンピシリン耐性遺伝子をＶ１
Ｊから除去し、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換えて、
Ｖ１Ｊ−ｎｅｏ（配列番号１８、図７）を形成し、この
中で、本発明に従って用いるために多数の異なるインフ
ルエンザウイルス遺伝子をクローン化した。さらに別の
態様では、ベクターはＶ１Ｊｎｓであって、これは、そ
れまでになかったＳｆｉＩ制限部位をＶ１Ｊ−ｎｅｏの
２１１４位に一つだけあるＫｐｎＩ部位に組み込んだ以
外は、Ｖ１Ｊと同様である。ヒトゲノムＤＮＡにおける
ＳｆｉＩ部位の頻度は非常に低い（約１部位／１００，
０００塩基）。したがって、抽出ゲノムＤＮＡをＳｆｉ
Ｉ消化するだけで、このベクターにより宿主ＤＮＡとの
発現ベクター一体化を注意深く監視し得る。さらなる改
良において、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターに
おいては、できるだけ非必須ＤＮＡをベクターから“切
り取って”高度に詰まったベクターを生成した。このベ
クターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であって、図３６（配列番
号４５）に示す。このベクターによって、望ましくない
配列がコードされることなく大きな挿入物を使用できる
し、特異的インフルエンザウイルス遺伝子をコードする
構築物が周囲組織に導入される場合の細胞による取り込
みを最適化できる。図３６では、切り取られたＶ１Ｊｎ
ｅｏ（図７）の部分をギャップで、挿入配列は太字で示
すが、Ｖ１Ｊｎｅｏの塩基番号は変えていない。前述の
ベクター修飾及び開発手順は当業者に公知の方法により
達成し得る。記載した特定の生成物質は、慣用的方法に
より得られたが、適用される特定の目的には特に有用で
あった。
【００３０】本発明のある態様はＡ／ＰＲ／８／３４株
からのインフルエンザＮＰ遺伝子を組み入れるのである
が、さらに好ましい態様は最近のインフルエンザウイル
ス単離物からのＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遣伝子、
ＰＢ遺伝子、Ｍ遺伝子又はＮＳ遺伝子を組み入れる。こ
れは、ウイルス遺伝子のＤＮＡコピーを調製し、次いで
個々の遺伝子をサブクローニングすることにより達成さ
れる。多数のインフルエンザウイルス株の多数の遺伝子
に関する配列が、現在、ＧＥＮＢＡＮＫから公式に入手
できる（インフルエンザＡ遺伝子に関しては約５０９の
配列）。したがって、ウイルスの近年のＴｅｘａｓ，Ｂ
ｅｉｊｉｎｇ又はＰａｎａｍａ単離物からクローン化さ
れ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌが抗インフルエンザワクチンに望ましいと推奨し
た株であるこれらの遺伝子が本発明に好ましい（Ｌｅｄ
ｅｒｌｅ，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ，１９９３，ｐ１２３２のＦＬＵ−ＩＭＭＵ
ＮＥＲ インフルエンザウイルスワクチンを参照。Ａ／
Ｔｅｘａｓ／３６／９１，Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎ
ｇ／３５３／８９，Ｈ３Ｎ２；及びＢ／Ｐａｎａｍａ／
４５／９０からのヘマグルチニンタンパク質を含有する
３価の精製インフルエンザ表面抗原ワクチン）。用語を
統一するために、ＤＮＡ構築物を記述するために本明細
書中では以下の慣例に従った：“ベクター名 − イン
フルエンザ株 − 遺伝子”。したがって、Ａ／ＰＲ／
８／３４株のＮＰ遺伝子が発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ中
にクローン化される構築物は、本明細書では“Ｖ１Ｊｎ
ｅｏ−ＰＲ−ＮＰ”と呼ぶ。当然、ウイルス変異の病因
株として、製剤中に組み込まれるのに最適な遺伝子は変
わり得る。しかしながら、下記に実証するように、異種
株に対して防御し得る細胞毒性リンパ球反応が誘発され
るため、全ウイルス又はサブユニットポリペプチドベー
スのワクチンと比較した場合、本発明の新規のワクチン
において株変異性は余り重要でない。さらに、製剤は新
規の遺伝子を容易に挿入できるため、これは分子生物学
の標準的方法で容易になされる調節手段である。
からのインフルエンザＮＰ遺伝子を組み入れるのである
が、さらに好ましい態様は最近のインフルエンザウイル
ス単離物からのＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、ＮＡ遣伝子、
ＰＢ遺伝子、Ｍ遺伝子又はＮＳ遺伝子を組み入れる。こ
れは、ウイルス遺伝子のＤＮＡコピーを調製し、次いで
個々の遺伝子をサブクローニングすることにより達成さ
れる。多数のインフルエンザウイルス株の多数の遺伝子
に関する配列が、現在、ＧＥＮＢＡＮＫから公式に入手
できる（インフルエンザＡ遺伝子に関しては約５０９の
配列）。したがって、ウイルスの近年のＴｅｘａｓ，Ｂ
ｅｉｊｉｎｇ又はＰａｎａｍａ単離物からクローン化さ
れ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌが抗インフルエンザワクチンに望ましいと推奨し
た株であるこれらの遺伝子が本発明に好ましい（Ｌｅｄ
ｅｒｌｅ，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅ，１９９３，ｐ１２３２のＦＬＵ−ＩＭＭＵ
ＮＥＲ インフルエンザウイルスワクチンを参照。Ａ／
Ｔｅｘａｓ／３６／９１，Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｂｅｉｊｉｎ
ｇ／３５３／８９，Ｈ３Ｎ２；及びＢ／Ｐａｎａｍａ／
４５／９０からのヘマグルチニンタンパク質を含有する
３価の精製インフルエンザ表面抗原ワクチン）。用語を
統一するために、ＤＮＡ構築物を記述するために本明細
書中では以下の慣例に従った：“ベクター名 − イン
フルエンザ株 − 遺伝子”。したがって、Ａ／ＰＲ／
８／３４株のＮＰ遺伝子が発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ中
にクローン化される構築物は、本明細書では“Ｖ１Ｊｎ
ｅｏ−ＰＲ−ＮＰ”と呼ぶ。当然、ウイルス変異の病因
株として、製剤中に組み込まれるのに最適な遺伝子は変
わり得る。しかしながら、下記に実証するように、異種
株に対して防御し得る細胞毒性リンパ球反応が誘発され
るため、全ウイルス又はサブユニットポリペプチドベー
スのワクチンと比較した場合、本発明の新規のワクチン
において株変異性は余り重要でない。さらに、製剤は新
規の遺伝子を容易に挿入できるため、これは分子生物学
の標準的方法で容易になされる調節手段である。
【００３１】核タンパク質の配列はインフルエンザの種
々の株に保存されるため、核タンパク質に関する遺伝子
をクローニングした株に対して異種であるインフルエン
ザＡの有毒株によるその後の誘発に対しても、防御が達
成される。インフルエンザＡの多数の株からのＮＰの比
較は、二次構造に有意差を示さず［Ｍ．Ｇａｍｍｅｌｉ
ｎら，Ｖｉｒｏｌ．１７０，７１，１９８９］、アミノ
酸配列の変化も非常に少なかった［Ｏ．Ｔ．Ｇｏｒｍａ
ｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３７０４，１９９１］。
約５０年の間に、ヒト株におけるＮＰは０．６６アミノ
酸変化／年の割合で進化したに過ぎない。さらに、Ａ／
ＨＫ／６８−特異性ＣＴＬがＡ／ＰＲ／８／３４ ＮＰ
の配列に由来する合成ペプチド ＮＰ（１４７−１５
５）で刺激された標的細胞を認識するという我々の結果
は、このＨ−２Ｋｄ−制限ＣＴＬエピトープが３４年間
機能的に無傷のままであったことを示している（図２参
照）。遺伝子がウイルス表面抗原、例えばヘマグルチニ
ン又はニューラミニダーゼをさえコードする場合、相当
の中和体液性（抗体）免疫反応が非常に重要な細胞毒性
リンパ球反応に加えて生じ得るということにも留意すべ
きである。
々の株に保存されるため、核タンパク質に関する遺伝子
をクローニングした株に対して異種であるインフルエン
ザＡの有毒株によるその後の誘発に対しても、防御が達
成される。インフルエンザＡの多数の株からのＮＰの比
較は、二次構造に有意差を示さず［Ｍ．Ｇａｍｍｅｌｉ
ｎら，Ｖｉｒｏｌ．１７０，７１，１９８９］、アミノ
酸配列の変化も非常に少なかった［Ｏ．Ｔ．Ｇｏｒｍａ
ｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３７０４，１９９１］。
約５０年の間に、ヒト株におけるＮＰは０．６６アミノ
酸変化／年の割合で進化したに過ぎない。さらに、Ａ／
ＨＫ／６８−特異性ＣＴＬがＡ／ＰＲ／８／３４ ＮＰ
の配列に由来する合成ペプチド ＮＰ（１４７−１５
５）で刺激された標的細胞を認識するという我々の結果
は、このＨ−２Ｋｄ−制限ＣＴＬエピトープが３４年間
機能的に無傷のままであったことを示している（図２参
照）。遺伝子がウイルス表面抗原、例えばヘマグルチニ
ン又はニューラミニダーゼをさえコードする場合、相当
の中和体液性（抗体）免疫反応が非常に重要な細胞毒性
リンパ球反応に加えて生じ得るということにも留意すべ
きである。
【００３２】インフルエンザＡの保存内部タンパク質を
コードするＤＮＡ発現ベクターを筋注すると、その後の
ウイルス誘発に対し有意の防御免疫が生じる。特に、Ｎ
Ｐ特異性抗体及び一次ＣＴＬが生成された。ＮＰ ＤＮ
Ａ免疫化は、対照と比較した場合、ウイルス肺力価の低
下、体重損失の阻止及び生存率の増大を引き起こした。
防御免疫反応は、ウイルス感染との戦いにおいてＮＰ抗
体単独の作用の欠如によって実証される（実施例４参
照）ように、ＮＰ−特異性抗体により媒介されず、した
がってＮＰ特異性細胞免疫によるものと考えられた。さ
らに、ＮＰに対して向けられる相当量の一次ＣＴＬを生
じた。防御は、ＤＮＡをクローニングした株とは異種の
インフルエンザＡの有毒株に対してであった。さらに、
誘発株がＡ／ＰＲ／８／３４株後３０年以上経ったもの
だが、これは、変異性エンベロープタンパク質は抗原性
不連続変異及び連続変異したにもかかわらず、保存タン
パク質に対して向けられる免疫反応が有効であることを
示す。インフルエンザウイルス遺伝子物質は各々ある程
度の保存を示すため、そしてＣＴＬは細胞内発現及びＭ
ＨＣプロセッシングに対する反応で生成され得るため、
他のインフルエンザウイルス遣伝子はＮＰに関してなさ
れたのと同様の反応を生じることが予測される。免疫原
性エピトープの同定方法は、当業者には十分公知である
［例えば、Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
８：１６５７−１６６７，１９９２；Ｃｈｏｐｐｉｎ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：５７５−５８３，１
９９１；Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓら，Ｖａｃｃｉｎ
ｅ １１：９７４−９７８，１９９３参照］。したがっ
て、発現ベクターにおけるクローン化し配列決定した結
合物によって示される（下記参照）ように、多数のこれ
らの遺伝子が、これらの構築物が利用可能形態の予防薬
であるようクローン化された。
コードするＤＮＡ発現ベクターを筋注すると、その後の
ウイルス誘発に対し有意の防御免疫が生じる。特に、Ｎ
Ｐ特異性抗体及び一次ＣＴＬが生成された。ＮＰ ＤＮ
Ａ免疫化は、対照と比較した場合、ウイルス肺力価の低
下、体重損失の阻止及び生存率の増大を引き起こした。
防御免疫反応は、ウイルス感染との戦いにおいてＮＰ抗
体単独の作用の欠如によって実証される（実施例４参
照）ように、ＮＰ−特異性抗体により媒介されず、した
がってＮＰ特異性細胞免疫によるものと考えられた。さ
らに、ＮＰに対して向けられる相当量の一次ＣＴＬを生
じた。防御は、ＤＮＡをクローニングした株とは異種の
インフルエンザＡの有毒株に対してであった。さらに、
誘発株がＡ／ＰＲ／８／３４株後３０年以上経ったもの
だが、これは、変異性エンベロープタンパク質は抗原性
不連続変異及び連続変異したにもかかわらず、保存タン
パク質に対して向けられる免疫反応が有効であることを
示す。インフルエンザウイルス遺伝子物質は各々ある程
度の保存を示すため、そしてＣＴＬは細胞内発現及びＭ
ＨＣプロセッシングに対する反応で生成され得るため、
他のインフルエンザウイルス遣伝子はＮＰに関してなさ
れたのと同様の反応を生じることが予測される。免疫原
性エピトープの同定方法は、当業者には十分公知である
［例えば、Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４
８：１６５７−１６６７，１９９２；Ｃｈｏｐｐｉｎ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：５７５−５８３，１
９９１；Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓら，Ｖａｃｃｉｎ
ｅ １１：９７４−９７８，１９９３参照］。したがっ
て、発現ベクターにおけるクローン化し配列決定した結
合物によって示される（下記参照）ように、多数のこれ
らの遺伝子が、これらの構築物が利用可能形態の予防薬
であるようクローン化された。
【００３３】したがって、本発明は免疫原としてインフ
ルエンザウイルスタンパク質をコードする発現ベクター
を提供する。本発明は、自己複製剤又はアジュバントを
必要としない交差株防御免疫を誘発する手段を提供す
る。さらに、ＤＮＡを用いた免疫化は、多数の他の利点
を提供する。先ず、ワクチン接種のためのこのアプロー
チは、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応が病理生理学的工程に重要で
あるため、腫瘍並びに感染剤に適用できる［Ｋ．Ｔａｎ
ａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３
５９（１９８８）］。したがって、形質転換工程に決定
的なタンパク質に対する免疫反応を引き出すことは、癌
防御又は免疫療法の有効な手段である。第二に、ウイル
スタンパク質（ＮＰ及びヘマグルチニン）及びヒト成長
ホルモンＤＮＡの注入後の発現タンパク質に対する高力
価抗体の形成［例えば、Ｄ．Ｃ．Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３５６，１５２，１９９２参照］は、これが、別
々に又は保存抗原を標的にした細胞毒性Ｔリンパ球ワク
チンと組合せて、抗体由来のワクチンを製造する平易で
且つ非常に有効な手段であることを示す。
ルエンザウイルスタンパク質をコードする発現ベクター
を提供する。本発明は、自己複製剤又はアジュバントを
必要としない交差株防御免疫を誘発する手段を提供す
る。さらに、ＤＮＡを用いた免疫化は、多数の他の利点
を提供する。先ず、ワクチン接種のためのこのアプロー
チは、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応が病理生理学的工程に重要で
あるため、腫瘍並びに感染剤に適用できる［Ｋ．Ｔａｎ
ａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３
５９（１９８８）］。したがって、形質転換工程に決定
的なタンパク質に対する免疫反応を引き出すことは、癌
防御又は免疫療法の有効な手段である。第二に、ウイル
スタンパク質（ＮＰ及びヘマグルチニン）及びヒト成長
ホルモンＤＮＡの注入後の発現タンパク質に対する高力
価抗体の形成［例えば、Ｄ．Ｃ．Ｔａｎｇら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３５６，１５２，１９９２参照］は、これが、別
々に又は保存抗原を標的にした細胞毒性Ｔリンパ球ワク
チンと組合せて、抗体由来のワクチンを製造する平易で
且つ非常に有効な手段であることを示す。
【００３４】ＤＮＡ構築物の生成及び精製が容易である
ことは、伝統的タンパク質精製によく比べ、組合せワク
チンの生成がしやすいという利点がある。したがって、
例えばＮＰ、ＨＡ、Ｍ１、ＰＢ１、ＮＳ１又は他のイン
フルエンザウイルス遺伝子をコードする多面的構築物を
調製、混合、同時投与し得る。最後に、タンパク質発現
がＤＮＡ注入後に保持されるため［Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．
Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．
ＨａｎＳｏｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２９０，７３
（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌ
ｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３
（１９９２）］、Ｂ−及びＴ細胞記憶の持続性が増強さ
れ［Ｄ．Ｇｒａｙ及びＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，９６９（１９９１）；Ｓ．Ｏｅ
ｈｅｎら，同誌１７６，１２７３（１９９２）］、それ
により永続性体液性及び細胞媒介性免疫が生み出され
る。
ことは、伝統的タンパク質精製によく比べ、組合せワク
チンの生成がしやすいという利点がある。したがって、
例えばＮＰ、ＨＡ、Ｍ１、ＰＢ１、ＮＳ１又は他のイン
フルエンザウイルス遺伝子をコードする多面的構築物を
調製、混合、同時投与し得る。最後に、タンパク質発現
がＤＮＡ注入後に保持されるため［Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．
Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．
ＨａｎＳｏｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２９０，７３
（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌ
ｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３
（１９９２）］、Ｂ−及びＴ細胞記憶の持続性が増強さ
れ［Ｄ．Ｇｒａｙ及びＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，９６９（１９９１）；Ｓ．Ｏｅ
ｈｅｎら，同誌１７６，１２７３（１９９２）］、それ
により永続性体液性及び細胞媒介性免疫が生み出され
る。
【００３５】現行認可インフルエンザワクチンの限界に
より、感染防止及び病状軽減のためのさらに有効な手段
の開発の必要性が強調されている。古いワクチンは防御
の限界を示し、２〜３の選択ウイルス株に対してのみ有
効であって、その効力は短期間で衰える。したがって、
現在のワクチンは、有効性維持のためには毎年接種用に
再処方せねばならない。内部タンパク質に対する改良Ｃ
ＴＬ反応の生成は、現在の認可ワクチンではできない有
意の長期交差反応性免疫を提供するものと思われる。
より、感染防止及び病状軽減のためのさらに有効な手段
の開発の必要性が強調されている。古いワクチンは防御
の限界を示し、２〜３の選択ウイルス株に対してのみ有
効であって、その効力は短期間で衰える。したがって、
現在のワクチンは、有効性維持のためには毎年接種用に
再処方せねばならない。内部タンパク質に対する改良Ｃ
ＴＬ反応の生成は、現在の認可ワクチンではできない有
意の長期交差反応性免疫を提供するものと思われる。
【００３６】インフルエンザ抗原に対して向けられる宿
主免疫反応の検出により、マウス、フェレット及び非ヒ
ト霊長類におけるＰＮＶ構築物からのタンパク質発現
を、我々は実証した。マウスにインフルエンザＮＰをコ
ードするＤＮＡを注射すると、ＤＮＡ構築物に含まれる
ものとは異なるインフルエンザサブタイプ（不連続変異
株）による誘発後に、対照動物と比較して、生存率の増
大、ウイルス肺力価の低下及び体重損失減少をもたらし
た。ＮＰ ＤＮＡを接種したフェレットにおける不連続
変異株での誘発後のウイルス脱落低減も我々は観察し
た。これらの結果は、インフルエンザ株における主要不
連続変異に対する防御がＮＰをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡワクチンにより増強されたことを示す。ＨＡ Ｄ
ＮＡを注射し、その後連続変異ウイルス株で実験動物を
誘発すると、ウイルス脱落のさらなる実質的低減が引き
起こされた。内部タンパク質ＤＮＡを付加すると、ＨＡ
ＤＮＡ単独注入後に観察された高程度の防御が多少増
大した。
主免疫反応の検出により、マウス、フェレット及び非ヒ
ト霊長類におけるＰＮＶ構築物からのタンパク質発現
を、我々は実証した。マウスにインフルエンザＮＰをコ
ードするＤＮＡを注射すると、ＤＮＡ構築物に含まれる
ものとは異なるインフルエンザサブタイプ（不連続変異
株）による誘発後に、対照動物と比較して、生存率の増
大、ウイルス肺力価の低下及び体重損失減少をもたらし
た。ＮＰ ＤＮＡを接種したフェレットにおける不連続
変異株での誘発後のウイルス脱落低減も我々は観察し
た。これらの結果は、インフルエンザ株における主要不
連続変異に対する防御がＮＰをコードする遺伝子を含む
ＤＮＡワクチンにより増強されたことを示す。ＨＡ Ｄ
ＮＡを注射し、その後連続変異ウイルス株で実験動物を
誘発すると、ウイルス脱落のさらなる実質的低減が引き
起こされた。内部タンパク質ＤＮＡを付加すると、ＨＡ
ＤＮＡ単独注入後に観察された高程度の防御が多少増
大した。
【００３７】インフルエンザＤＮＡに対する免疫反応
を、注射後６か月間マウスで追跡調査した結果、抗体、
ＣＴＬ活性及びｉｎ ｖｉｖｏ防御の持続が認められ
た。ＤＮＡを反復注入すると、異なるサブタイプのイン
フルエンザ株による２５週目の誘発後の生存率がさらに
増大し、防御的細胞媒介免疫を高める能力を示した。抗
体持続性も、アフリカミドリザルにおいてＨＡ ＤＮＡ
を２回注射後少なくとも１年間実証され、ＨＡ ＤＮＡ
を１回注射後は少なくとも１か月間存続した。
を、注射後６か月間マウスで追跡調査した結果、抗体、
ＣＴＬ活性及びｉｎ ｖｉｖｏ防御の持続が認められ
た。ＤＮＡを反復注入すると、異なるサブタイプのイン
フルエンザ株による２５週目の誘発後の生存率がさらに
増大し、防御的細胞媒介免疫を高める能力を示した。抗
体持続性も、アフリカミドリザルにおいてＨＡ ＤＮＡ
を２回注射後少なくとも１年間実証され、ＨＡ ＤＮＡ
を１回注射後は少なくとも１か月間存続した。
【００３８】これらの動物実験の結果は、直接ＤＮＡ注
入がインフルエンザ感染及び疾病に対するヒトの防御の
ための方法改良を提供することを示す。留意すべきは、
ＤＮＡ注入による実験的防御が未感染マウス及びフェレ
ットのワクチン接種により達成されたことである。ＤＮ
Ａを接種した成人は、過去にインフルエンザに曝された
ことがある。これらの人々は、ＤＮＡ構築物による免疫
化により、おそらくは持続時間の増大したさらに実質的
な免疫反応を示す。
入がインフルエンザ感染及び疾病に対するヒトの防御の
ための方法改良を提供することを示す。留意すべきは、
ＤＮＡ注入による実験的防御が未感染マウス及びフェレ
ットのワクチン接種により達成されたことである。ＤＮ
Ａを接種した成人は、過去にインフルエンザに曝された
ことがある。これらの人々は、ＤＮＡ構築物による免疫
化により、おそらくは持続時間の増大したさらに実質的
な免疫反応を示す。
【００３９】使用濃度を最適にするために、免疫原性に
関して用量範囲を比較する。小哺乳類実験では、１μｇ
という少量のＮＰＤＮＡが抗体及びＣＴＬ反応を誘発し
た。アカゲザルの免疫化は、１００及び１０００μｇの
用量のＨＡ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／０８／３４）を用いて
２匹中２匹とも抗体反応をもたらしたが、一方、１０μ
ｇ １回注射には２匹のうち１匹が反応した。別々の実
験において、未使用アフリカミドリザルに３種類のウイ
ルスサブタイプからのＨＡをコードする５つの異なるＤ
ＮＡ構築物並びにインフルエンザＡウイルスからのＮＰ
及びＭ１をコードするＤＮＡの混合物を注射した。各群
とも３匹のサルのうち３匹が５つの構築物の各々を１０
μｇ又は１００μｇ含有するワクチンに反応した。これ
らの所見に基づいて、１０、５０、１００及び２００μ
ｇのＤＮＡの投与がヒトでは有効であると予測される。
関して用量範囲を比較する。小哺乳類実験では、１μｇ
という少量のＮＰＤＮＡが抗体及びＣＴＬ反応を誘発し
た。アカゲザルの免疫化は、１００及び１０００μｇの
用量のＨＡ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／０８／３４）を用いて
２匹中２匹とも抗体反応をもたらしたが、一方、１０μ
ｇ １回注射には２匹のうち１匹が反応した。別々の実
験において、未使用アフリカミドリザルに３種類のウイ
ルスサブタイプからのＨＡをコードする５つの異なるＤ
ＮＡ構築物並びにインフルエンザＡウイルスからのＮＰ
及びＭ１をコードするＤＮＡの混合物を注射した。各群
とも３匹のサルのうち３匹が５つの構築物の各々を１０
μｇ又は１００μｇ含有するワクチンに反応した。これ
らの所見に基づいて、１０、５０、１００及び２００μ
ｇのＤＮＡの投与がヒトでは有効であると予測される。
【００４０】認可不活化ワクチンによる感染防止は、Ｈ
Ａに対して向けられる血清及び粘膜抗体レベルと相関す
るが、内部インフルエンザタンパク質に対する抗体反応
とは相関しない。したがって、ＨＡはインフルエンザＤ
ＮＡワクチンの開発に含まれねばならない。しかしなが
ら、ＮＰに対する免疫反応はＨＡに対する抗体反応を増
強し、インフルエンザ内部タンパク質はインフルエンザ
の抗原的に別種の株と交差反応性のＣＴＬ反応を提供す
る。上記のように、注射に内部タンパク質並びにＨＡを
コードするＤＮＡ構築物が含まれる場合の免疫原性及び
防御の改良を動物実験は示している。内部タンパク質を
コードするＤＮＡ構築物を含入すると、ヒトにおけるＤ
ＮＡワクチンの効力が増強されると思われる。投与レベ
ルはこれらの成分の相互作用に依っていると考えられる
ため、標準的手段により当業者はＨＡ、ＮＰ及びＭ１
ＤＮＡ構築物の混合物を製造するためにワクチン中のＤ
ＮＡの量を決定し得る。これらの各成分に対する宿主反
応は、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価、及びＨＡ成分
に対する中和、並びにＭ１及びＮＰエピトープに対する
ＣＴＬ反応を比較して、別々に測定し得る。結果を、Ｈ
Ａのみを発現する構築物を注射後の抗体反応と比較す
る。これらの試験によりＨＡ及び内部タンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有するワクチンに対する反応増強の可
能性を評価できる。
Ａに対して向けられる血清及び粘膜抗体レベルと相関す
るが、内部インフルエンザタンパク質に対する抗体反応
とは相関しない。したがって、ＨＡはインフルエンザＤ
ＮＡワクチンの開発に含まれねばならない。しかしなが
ら、ＮＰに対する免疫反応はＨＡに対する抗体反応を増
強し、インフルエンザ内部タンパク質はインフルエンザ
の抗原的に別種の株と交差反応性のＣＴＬ反応を提供す
る。上記のように、注射に内部タンパク質並びにＨＡを
コードするＤＮＡ構築物が含まれる場合の免疫原性及び
防御の改良を動物実験は示している。内部タンパク質を
コードするＤＮＡ構築物を含入すると、ヒトにおけるＤ
ＮＡワクチンの効力が増強されると思われる。投与レベ
ルはこれらの成分の相互作用に依っていると考えられる
ため、標準的手段により当業者はＨＡ、ＮＰ及びＭ１
ＤＮＡ構築物の混合物を製造するためにワクチン中のＤ
ＮＡの量を決定し得る。これらの各成分に対する宿主反
応は、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価、及びＨＡ成分
に対する中和、並びにＭ１及びＮＰエピトープに対する
ＣＴＬ反応を比較して、別々に測定し得る。結果を、Ｈ
Ａのみを発現する構築物を注射後の抗体反応と比較す
る。これらの試験によりＨＡ及び内部タンパク質をコー
ドするＤＮＡを含有するワクチンに対する反応増強の可
能性を評価できる。
【００４１】ヒトでの有効性を、同一のウイルス株並び
に異なるサブタイプのインフルエンザ株に対するワクチ
ン効力を示すよう、インフルエンザＤＮＡワクチンを接
種し、その後鼻腔内誘発を施された有志で明らかにし
た。ワクチンの組成、用量及び投与計画は前記試験を基
礎にする。臨床的効力は、感染率、疾病状況及び疾病持
続期間で示す。防御と相関する代用マーカーを調べるた
めに、これらの臨床所見を、宿主免疫反応及びウイルス
脱落の実験室評価と比較する。
に異なるサブタイプのインフルエンザ株に対するワクチ
ン効力を示すよう、インフルエンザＤＮＡワクチンを接
種し、その後鼻腔内誘発を施された有志で明らかにし
た。ワクチンの組成、用量及び投与計画は前記試験を基
礎にする。臨床的効力は、感染率、疾病状況及び疾病持
続期間で示す。防御と相関する代用マーカーを調べるた
めに、これらの臨床所見を、宿主免疫反応及びウイルス
脱落の実験室評価と比較する。
【００４２】ＤＮＡ構築物を調製及び精製するための分
子生物学の標準技法により、本発明のＤＮＡ治療薬の調
製が可能である。したがって分子生物学の標準技法は本
発明の生成物質の製造のために十分である一方、本明細
書に開示した特定の構築物は意外にも、標準不活化全ウ
イルス又はサブユニットタンパク質ワクチンによっては
これまで得られなかった交差株防御を生じる、新規の治
療薬を提供する。
子生物学の標準技法により、本発明のＤＮＡ治療薬の調
製が可能である。したがって分子生物学の標準技法は本
発明の生成物質の製造のために十分である一方、本明細
書に開示した特定の構築物は意外にも、標準不活化全ウ
イルス又はサブユニットタンパク質ワクチンによっては
これまで得られなかった交差株防御を生じる、新規の治
療薬を提供する。
【００４３】ワクチン受容者に導入される発現可能なＤ
ＮＡの量は、ＤＮＡ構築物中に用いる転写及び翻訳プロ
モーターの強度に、そして発現化遺伝子物質の免疫原性
に依っている。概して、約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは
約１０μｇ〜３００μｇの免疫的又は予防的有効量を筋
組織に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を通し
ての押印、及び他の投与方法、例えば腹腔内、静脈内、
又は吸入投与を意図してもよい。ブースターワクチン接
種が提供されることも意図し得る。
ＮＡの量は、ＤＮＡ構築物中に用いる転写及び翻訳プロ
モーターの強度に、そして発現化遺伝子物質の免疫原性
に依っている。概して、約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは
約１０μｇ〜３００μｇの免疫的又は予防的有効量を筋
組織に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を通し
ての押印、及び他の投与方法、例えば腹腔内、静脈内、
又は吸入投与を意図してもよい。ブースターワクチン接
種が提供されることも意図し得る。
【００４４】ＤＮＡは裸で、即ちいずれのタンパク質、
アジュバント又は受容者免疫系に影響を及ぼす他の薬剤
とも会合していないこともある。この場合、ＤＮＡが生
理的に許容可能な溶液、限定はしないが例えば滅菌食塩
水又は滅菌緩衝食塩水中に存在することが望ましい。あ
るいは、ＤＮＡは、ＤＮＡ−リポソーム混合物として、
リポソーム、例えばレシチンリポソーム又は当業界で公
知の他のリポソームと会合し得る（例えばＷＯ９３／２
４６４０参照）か、あるいはＤＮＡは免疫反応を増強す
るために当業界で公知のアジュバント、例えばタンパク
質又は他の担体（これらに限定されない）と会合し得
る。ＤＮＡの細胞取り込みを助ける薬剤、例えばカルシ
ウムイオン、ウイルスタンパク質及び他のトランスフェ
クション促進剤（これらに限定されない）を用いるのも
有益である。これらの薬剤は一般に、トランスフェクシ
ョン促進剤及び製薬上許容可能な担体と呼ばれる。本明
細書で用いる場合、遺伝子という用語は、独立のポリペ
プチドをコードする核酸のセグメントを指す。製剤及び
ワクチンという用語は、免疫反応の誘発に有用な組成物
を示すために同じ意味で用いる。構築物及びプラスミド
という用語は、同じ意味で用いる。ベクターという用語
は、本発明の方法に用いるために遺伝子がその中にクロ
ーン化されるＤＮＡを示すために用いる。
アジュバント又は受容者免疫系に影響を及ぼす他の薬剤
とも会合していないこともある。この場合、ＤＮＡが生
理的に許容可能な溶液、限定はしないが例えば滅菌食塩
水又は滅菌緩衝食塩水中に存在することが望ましい。あ
るいは、ＤＮＡは、ＤＮＡ−リポソーム混合物として、
リポソーム、例えばレシチンリポソーム又は当業界で公
知の他のリポソームと会合し得る（例えばＷＯ９３／２
４６４０参照）か、あるいはＤＮＡは免疫反応を増強す
るために当業界で公知のアジュバント、例えばタンパク
質又は他の担体（これらに限定されない）と会合し得
る。ＤＮＡの細胞取り込みを助ける薬剤、例えばカルシ
ウムイオン、ウイルスタンパク質及び他のトランスフェ
クション促進剤（これらに限定されない）を用いるのも
有益である。これらの薬剤は一般に、トランスフェクシ
ョン促進剤及び製薬上許容可能な担体と呼ばれる。本明
細書で用いる場合、遺伝子という用語は、独立のポリペ
プチドをコードする核酸のセグメントを指す。製剤及び
ワクチンという用語は、免疫反応の誘発に有用な組成物
を示すために同じ意味で用いる。構築物及びプラスミド
という用語は、同じ意味で用いる。ベクターという用語
は、本発明の方法に用いるために遺伝子がその中にクロ
ーン化されるＤＮＡを示すために用いる。
【００４５】したがって、本発明のある態様は、ヒトを
含めた哺乳類のような脊椎動物における免疫反応をｉｎ
ｖｉｖｏで誘発するためのインフルエンザウイルス遺
伝子の使用方法であって、以下の： ａ）遺伝子を単離し； ｂ）生組織中に導入される場合に遺伝子の転写開始及び
その後の翻訳を指図する制御配列と操作可能的に遺伝子
が結合するように遺伝子を調節配列と結合させ； ｃ）遺伝子を生組織中に導入し；そして ｄ）任意に付加的インフルエンザ遺伝子で増強する ことを包含する方法である。
含めた哺乳類のような脊椎動物における免疫反応をｉｎ
ｖｉｖｏで誘発するためのインフルエンザウイルス遺
伝子の使用方法であって、以下の： ａ）遺伝子を単離し； ｂ）生組織中に導入される場合に遺伝子の転写開始及び
その後の翻訳を指図する制御配列と操作可能的に遺伝子
が結合するように遺伝子を調節配列と結合させ； ｃ）遺伝子を生組織中に導入し；そして ｄ）任意に付加的インフルエンザ遺伝子で増強する ことを包含する方法である。
【００４６】本発明の好ましい態様は、インフルエンザ
ウイルスの異種株に対する防御方法である。これは、保
存インフルエンザウイルスエピトープをコードする免疫
的有効量の核酸を投与することにより達成される。例え
ば、核タンパク質に関する全インフルエンザ遺伝子はこ
の機能を提供するので、これらの遺伝子内の保存エピト
ープをコードする他のインフルエンザ遺伝子及びその部
分に関するコード配列も同様に交差株防御を提供すると
みられる。
ウイルスの異種株に対する防御方法である。これは、保
存インフルエンザウイルスエピトープをコードする免疫
的有効量の核酸を投与することにより達成される。例え
ば、核タンパク質に関する全インフルエンザ遺伝子はこ
の機能を提供するので、これらの遺伝子内の保存エピト
ープをコードする他のインフルエンザ遺伝子及びその部
分に関するコード配列も同様に交差株防御を提供すると
みられる。
【００４７】本発明の別の態様では、ＤＮＡワクチンは
ヒトインフルエンザウイルス核タンパク質、ヘマグルチ
ニン、マトリックス、非構造、又はポリメラーゼ遺伝子
物質をコードする。この態様の特定の実施例を以下に示
すが、この場合ヒトインフルエンザウイルス遺伝子は、
ヒトインフルエンザウイルス単離物 Ａ／ＰＲ／８／３
４の核タンパク質、塩基性ポリメラーゼ１、非構造タン
パク質１、ヘマグルチニン、マトリックス１、塩基性ポ
リメラーゼ２、ヒトインフルエンザウイルス単離物 Ａ
／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９の核タンパク質、ヒト
インフルエンザウイルス単離物 Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６
／９１のヘマグルチニン遺伝子、又はヒトインフルエン
ザウイルス単離物 Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４６／９０のヘ
マグルチニン遺伝子をコードする。
ヒトインフルエンザウイルス核タンパク質、ヘマグルチ
ニン、マトリックス、非構造、又はポリメラーゼ遺伝子
物質をコードする。この態様の特定の実施例を以下に示
すが、この場合ヒトインフルエンザウイルス遺伝子は、
ヒトインフルエンザウイルス単離物 Ａ／ＰＲ／８／３
４の核タンパク質、塩基性ポリメラーゼ１、非構造タン
パク質１、ヘマグルチニン、マトリックス１、塩基性ポ
リメラーゼ２、ヒトインフルエンザウイルス単離物 Ａ
／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９の核タンパク質、ヒト
インフルエンザウイルス単離物 Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６
／９１のヘマグルチニン遺伝子、又はヒトインフルエン
ザウイルス単離物 Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４６／９０のヘ
マグルチニン遺伝子をコードする。
【００４８】本発明の特定の態様において、ＤＮＡ構築
物はインフルエンザウイルス遺伝子をコードするが、こ
の場合、ＤＮＡ構築物を動物生体組織中に導入すると発
現して、そのコード化インフルエンザ遺伝子発現物質に
対する免疫反応を生じ得る。このようなＤＮＡ構築物の
例を以下に示す： ａ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲ−ＮＰ； ｂ）Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ； ｃ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ（これの５′末端が配列番号１
２である）； ｄ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１（これの５′末端が配列番号
１３である）； ｅ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ（これの５′末端が配列番号１
４である）； ｆ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ（これの５′末端が配列番号１
５である）； ｇ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２（これの５′末端が配列番号
１６である）； ｈ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１（これの５′末端が配列番号１
７である）； ｉ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＢＪ−ＮＰ（これの５′末端が配列
番号２０でありそしてこれの３′末端が配列番号２１で
ある）； ｊ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＮＰ（これの５′末端が配列
番号２４でありそしてこれの３′末端が配列番号２５で
ある）； ｋ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＰＡ−ＨＡ（これの５′末端が配列
番号２６でありそしてこれの３′末端が配列番号２７で
ある）； ｌ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＧＡ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０
３／９３），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末
端が配列番号４６でありそしてこれの３′末端が配列番
号４７である）； ｍ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＴＸ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／
９１），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末端が
配列番号４８でありそしてこれの３′末端が配列番号４
９である）； ｎ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５０でありそしてこれの３′末端が配列番号
５１である）； ｏ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ６．４２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５２でありそしてこれの３′末端が配列
番号５３である）； ｐ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ５．６２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５４でありそしてこれの３′末端が配列
番号５５である）； ｑ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．５４Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５６でありそしてこれの３′末端が配列番号
５７である）； ｒ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ５．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５８でありそしてこれの３′末端が配列番号
５９である）。
物はインフルエンザウイルス遺伝子をコードするが、こ
の場合、ＤＮＡ構築物を動物生体組織中に導入すると発
現して、そのコード化インフルエンザ遺伝子発現物質に
対する免疫反応を生じ得る。このようなＤＮＡ構築物の
例を以下に示す： ａ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲ−ＮＰ； ｂ）Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ； ｃ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ（これの５′末端が配列番号１
２である）； ｄ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１（これの５′末端が配列番号
１３である）； ｅ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ（これの５′末端が配列番号１
４である）； ｆ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ（これの５′末端が配列番号１
５である）； ｇ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２（これの５′末端が配列番号
１６である）； ｈ）Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１（これの５′末端が配列番号１
７である）； ｉ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＢＪ−ＮＰ（これの５′末端が配列
番号２０でありそしてこれの３′末端が配列番号２１で
ある）； ｊ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＮＰ（これの５′末端が配列
番号２４でありそしてこれの３′末端が配列番号２５で
ある）； ｋ）Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＰＡ−ＨＡ（これの５′末端が配列
番号２６でありそしてこれの３′末端が配列番号２７で
ある）； ｌ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＧＡ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０
３／９３），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末
端が配列番号４６でありそしてこれの３′末端が配列番
号４７である）； ｍ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＴＸ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／
９１），構築物サイズ６．５６Ｋｂ（これの５′末端が
配列番号４８でありそしてこれの３′末端が配列番号４
９である）； ｎ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５０でありそしてこれの３′末端が配列番号
５１である）； ｏ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ６．４２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５２でありそしてこれの３′末端が配列
番号５３である）； ｐ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ５．６２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５４でありそしてこれの３′末端が配列
番号５５である）； ｑ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．５４Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５６でありそしてこれの３′末端が配列番号
５７である）； ｒ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ５．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５８でありそしてこれの３′末端が配列番号
５９である）。
【００４９】
【実施例】以下の実施例で本発明をさらに説明するが、
本発明はこれら実施例の個別条件に限定されるものでは
ない。
本発明はこれら実施例の個別条件に限定されるものでは
ない。
【００５０】実施例１ ヒトインフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤ
ＮＡ構築物の調製 ： ｉ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲＮＰ：Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子
をｐＡＰＲ−５０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ
Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対Ｅ
ｃｏＲＩ断片（ｐＲＳＶ−ＢＬのクレノウ充填及びホス
ファターゼ処理ＸｂａＩ部位中にクレノウ充填及びクロ
ーン化した）として単離した。ｐＲＳＶ−ＢＬを、先ず
ｐＢＬ−ＣＡＴ３［Ｂ．Ｌｕｃｋｏｗ及びＧ．Ｓｃｈｕ
ｔｚ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，５４９０（１
９８７）］ベクターをＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化して
ＣＡＴコード配列を除去し、クレノウ充填及び自己結紮
（ｌｉｇａｔｅ）して構築した。ＲＳＶプロモーター断
片をＮｄｅＩ及びＡｓｐ７１８断片としてｐＲｓｈｇｒ
ｎｘ［Ｖ．Ｇｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３０，
６２４（１９８７）］（クレノウ充填して上記で生じた
中間ベクター（ＣＡＴ配列を欠くｐＢＬ−ＣＡＴ）のＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化した）から単離した。
ＮＡ構築物の調製 ： ｉ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲＮＰ：Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子
をｐＡＰＲ−５０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ
Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対Ｅ
ｃｏＲＩ断片（ｐＲＳＶ−ＢＬのクレノウ充填及びホス
ファターゼ処理ＸｂａＩ部位中にクレノウ充填及びクロ
ーン化した）として単離した。ｐＲＳＶ−ＢＬを、先ず
ｐＢＬ−ＣＡＴ３［Ｂ．Ｌｕｃｋｏｗ及びＧ．Ｓｃｈｕ
ｔｚ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，５４９０（１
９８７）］ベクターをＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化して
ＣＡＴコード配列を除去し、クレノウ充填及び自己結紮
（ｌｉｇａｔｅ）して構築した。ＲＳＶプロモーター断
片をＮｄｅＩ及びＡｓｐ７１８断片としてｐＲｓｈｇｒ
ｎｘ［Ｖ．Ｇｉｇｕｅｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ ３３０，
６２４（１９８７）］（クレノウ充填して上記で生じた
中間ベクター（ＣＡＴ配列を欠くｐＢＬ−ＣＡＴ）のＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位中にクローン化した）から単離した。
【００５１】ｉｉ）Ｖ１−ＮＰ：ｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ
−ＤＨＦＲ［Ｙ．Ｗｈａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６１，
１７９６（１９８７）］から発現ベクターＶ１を構築し
た。ベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自己結紮してＡＫ
Ｉ及びＤＨＦＲ遺伝子を除去した。このベクターはＣＭ
Ｖプロモーター中にイントロンＡを含有しないので、そ
れを内部にＳａｃＩ部位を欠くＰＣＲ断片として加えた
［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｃ．１９，３９７９（１９９１）の配列番号による１
８５５に］。ＰＣＲ反応のために用いた鋳型は、ｐＣＭ
ＶｉｎｔＢＬを生成するよう、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハ
ンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ
６ａ１２０［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，同誌を参照］
からのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ断片を、ｐＢＬ３の
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位に結紮して作ったｐＣ
ＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。ＲＳＶ−Ｌｕｘ［Ｊ．
Ｒ．ｄｅ Ｗｅｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
７，７２５，１９８７］からの１８８１塩基対ルシフェ
ラーゼ遺伝子断片（クレノウ充填したＨｉｎｄＩＩＩ−
ＳｍａＩ）を、クレノウ充填しホスファターゼ処理した
ｐＣＭＶｉｎｔＢＬのＳａ１Ｉ部位中にクローン化し
た。
−ＤＨＦＲ［Ｙ．Ｗｈａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．６１，
１７９６（１９８７）］から発現ベクターＶ１を構築し
た。ベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自己結紮してＡＫ
Ｉ及びＤＨＦＲ遺伝子を除去した。このベクターはＣＭ
Ｖプロモーター中にイントロンＡを含有しないので、そ
れを内部にＳａｃＩ部位を欠くＰＣＲ断片として加えた
［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｃ．１９，３９７９（１９９１）の配列番号による１
８５５に］。ＰＣＲ反応のために用いた鋳型は、ｐＣＭ
ＶｉｎｔＢＬを生成するよう、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハ
ンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ
６ａ１２０［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，同誌を参照］
からのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ断片を、ｐＢＬ３の
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位に結紮して作ったｐＣ
ＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。ＲＳＶ−Ｌｕｘ［Ｊ．
Ｒ．ｄｅ Ｗｅｔら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
７，７２５，１９８７］からの１８８１塩基対ルシフェ
ラーゼ遺伝子断片（クレノウ充填したＨｉｎｄＩＩＩ−
ＳｍａＩ）を、クレノウ充填しホスファターゼ処理した
ｐＣＭＶｉｎｔＢＬのＳａ１Ｉ部位中にクローン化し
た。
【００５２】イントロンＡを結びつけるプライマーを以
下に示す： ５′プライマー（配列番号５）： ５′−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧ ＣＴＣＧＴＴＴ
ＡＧ−３′． ３′プライマー（配列番号６）： ５′−ＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴ
ＧＡ ＣＴＧＣＡＧ−３′． ＳａｃＩ部位を除去するのに用いたプライマーを以下に
示す： センスプライマー（配列番号７）： ５′−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴ
ＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３′ 及びアンチセンスプライマー（配列番号８）： ５′−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴ
ＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ−３′ ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、同一酵
素で切断済のベクターに挿入した。インフルエンザＡ
（Ａ／ＰＲ／８／３４）からのＮＰ遺伝子をｐＡＰＲ５
０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ
ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＰｕｂｌｉＳｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎ
ｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対のＥｃｏＲＩ断
片として切り離し、盲端化した。それを盲端化ＢｇｌＩ
Ｉ部位でＶ１に挿入して、Ｖ１−ＮＰを作製した。大腸
菌Ｅ．ｃｏｌｉ中でプラスミドを増殖させて、アルカリ
性溶解法により精製した［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
１９８９）］。ＣｓＣｌバンド化ＤＮＡをエタノール沈
降させ、注射用に０．９％食塩水中に２ｍｇ／ｍｌで再
懸濁した。
下に示す： ５′プライマー（配列番号５）： ５′−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧ ＣＴＣＧＴＴＴ
ＡＧ−３′． ３′プライマー（配列番号６）： ５′−ＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴ
ＧＡ ＣＴＧＣＡＧ−３′． ＳａｃＩ部位を除去するのに用いたプライマーを以下に
示す： センスプライマー（配列番号７）： ５′−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴ
ＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３′ 及びアンチセンスプライマー（配列番号８）： ５′−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴ
ＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ−３′ ＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、同一酵
素で切断済のベクターに挿入した。インフルエンザＡ
（Ａ／ＰＲ／８／３４）からのＮＰ遺伝子をｐＡＰＲ５
０１［Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇら，Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ
ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＰｕｂｌｉＳｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎ
ｃ．，１９８３）］から１５６５塩基対のＥｃｏＲＩ断
片として切り離し、盲端化した。それを盲端化ＢｇｌＩ
Ｉ部位でＶ１に挿入して、Ｖ１−ＮＰを作製した。大腸
菌Ｅ．ｃｏｌｉ中でプラスミドを増殖させて、アルカリ
性溶解法により精製した［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
１９８９）］。ＣｓＣｌバンド化ＤＮＡをエタノール沈
降させ、注射用に０．９％食塩水中に２ｍｇ／ｍｌで再
懸濁した。
【００５３】実施例２ ヒトインフルエンザウイルス細胞毒性Ｔリンパ球に関す
る検定 ： 細胞毒性Ｔリンパ球を、ＤＮＡで免疫化した、又はＡ／
ＨＫ／６８の感染から回復したマウスから生成した。対
照培養は、対照ＤＮＡを注射したマウス並びに非注射マ
ウスから得た。単一細胞懸濁液を調製し、塩化アンモニ
ウムを用いて溶血させて赤血球を除去し、１０％ ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び２ｍＭ １−グルタミンを
補充したＲＰＭＩ １６４０中で脾細胞を培養した。同
数の自系照射刺激体細胞をＨ−２Ｋｄ制限ペプチドエピ
トープ ＮＰ１４７−１５５（Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ
Ａｒｇ Ｔｈｒ ＡｒｇＡｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ
（配列番号９））を用いて１０μＭで６０分間パルスす
るか、又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ
１）で感染させ、１０Ｕ／ｍｌの組換え体ヒトＩＬ−２
（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｕｆｆａｌ
ｏ，ＮＹ）を加えて、培養を５％ＣＯ２及び１００％相
対湿度で３７℃で７日間保持した。選択実験では、ｒｈ
ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びＣｏｎＡ（２μｇ／ｍ
ｌ）を自系刺激体細胞の代わりに加えた。細胞毒性Ｔ細
胞エフェクター活性を、細胞１０６個当たり６０μＣｉ
の５１Ｃｒを用いて３時間標識化し、上記の様にＮＰ１
４７−１５５でパルス化した、又はインフルエンザＡ／
Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）に感染させたＰ８
１５細胞を用いて測定した。対照標的（ペプチド又はウ
イルスを用いずにＰ８１５で標識化）は溶解しなかっ
た。標的を丸底９６ウエルプレート中に１×１０４細胞
／ウエルで平板培養し、３通りで４時間インキュベート
した。上清（３０μｌ）を各ウエルから取り出してＢｅ
ｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（ＬＫＢ−
Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数し
た。６Ｍ ＨＣｌの付加により放出される最大計数及び
ＣＴＬを用いずに放出される自発的計数を各標的標本に
関して調べた。特異的溶解率（％）は以下のように算出
した：［（実験値−自然発生値）／（最大値−自然発生
値）］×１００。
る検定 ： 細胞毒性Ｔリンパ球を、ＤＮＡで免疫化した、又はＡ／
ＨＫ／６８の感染から回復したマウスから生成した。対
照培養は、対照ＤＮＡを注射したマウス並びに非注射マ
ウスから得た。単一細胞懸濁液を調製し、塩化アンモニ
ウムを用いて溶血させて赤血球を除去し、１０％ ウシ
胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１
００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．０１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び２ｍＭ １−グルタミンを
補充したＲＰＭＩ １６４０中で脾細胞を培養した。同
数の自系照射刺激体細胞をＨ−２Ｋｄ制限ペプチドエピ
トープ ＮＰ１４７−１５５（Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ
Ａｒｇ Ｔｈｒ ＡｒｇＡｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ
（配列番号９））を用いて１０μＭで６０分間パルスす
るか、又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ
１）で感染させ、１０Ｕ／ｍｌの組換え体ヒトＩＬ−２
（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｕｆｆａｌ
ｏ，ＮＹ）を加えて、培養を５％ＣＯ２及び１００％相
対湿度で３７℃で７日間保持した。選択実験では、ｒｈ
ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びＣｏｎＡ（２μｇ／ｍ
ｌ）を自系刺激体細胞の代わりに加えた。細胞毒性Ｔ細
胞エフェクター活性を、細胞１０６個当たり６０μＣｉ
の５１Ｃｒを用いて３時間標識化し、上記の様にＮＰ１
４７−１５５でパルス化した、又はインフルエンザＡ／
Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）に感染させたＰ８
１５細胞を用いて測定した。対照標的（ペプチド又はウ
イルスを用いずにＰ８１５で標識化）は溶解しなかっ
た。標的を丸底９６ウエルプレート中に１×１０４細胞
／ウエルで平板培養し、３通りで４時間インキュベート
した。上清（３０μｌ）を各ウエルから取り出してＢｅ
ｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（ＬＫＢ−
Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で計数し
た。６Ｍ ＨＣｌの付加により放出される最大計数及び
ＣＴＬを用いずに放出される自発的計数を各標的標本に
関して調べた。特異的溶解率（％）は以下のように算出
した：［（実験値−自然発生値）／（最大値−自然発生
値）］×１００。
【００５４】実施例３ ＮＰ特異性ＣＴＬ及び抗体のｉｎ ｖｉｖｏ生成 ： ＢＡＬＢ／ｃマウスの両足の四頭筋に、ラウス肉腫ウイ
ルス又はサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動
されるＡ／ＰＲ／８／３４核タンパク質をコードするプ
ラスミドｃＤＮＡを注射した。
ルス又はサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動
されるＡ／ＰＲ／８／３４核タンパク質をコードするプ
ラスミドｃＤＮＡを注射した。
【００５５】使用した発現ベクターを以下に示す： ｉ）ｐｎＲＳＶ−ＰＲＮＰ（実施例１参照）： ｉｉ）Ｖ１−ＮＰ（実施例１参照）。
【００５６】用いた動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ
から入手した雌ＢＡＬＢ／ｃ マウスであった。マウス
は生後４〜５週齢で入手し、最初に５〜６週齢でＤＮＡ
を注射した。別記しない限り、ＤＮＡの注射は両足の四
頭筋に投与し、各足はＤＮＡ １００μｇを含有する滅
菌食塩水 ５０μｌを摂取した。マウスには３週間の間
隔で１、２又は３回の摂取を施した。陰性対照動物には
注射しないか又は挿入ＮＰ遺伝子を欠いた適切なブラン
クベクターを注射した。
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ
から入手した雌ＢＡＬＢ／ｃ マウスであった。マウス
は生後４〜５週齢で入手し、最初に５〜６週齢でＤＮＡ
を注射した。別記しない限り、ＤＮＡの注射は両足の四
頭筋に投与し、各足はＤＮＡ １００μｇを含有する滅
菌食塩水 ５０μｌを摂取した。マウスには３週間の間
隔で１、２又は３回の摂取を施した。陰性対照動物には
注射しないか又は挿入ＮＰ遺伝子を欠いた適切なブラン
クベクターを注射した。
【００５７】選択動物の筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡ
の存在又は非存在をＰＣＲで分析した（図１）。プラス
ミドＤＮＡ（ＮＰ又はルシフェラーゼＤＮＡ）は、試験
した注射筋肉４８例中４４例で検出された。ルシフェラ
ーゼＤＮＡ注射マウスでは、当業界で公知の方法によっ
て筋抽出物中に回収されたルシフェラーゼ活性により、
タンパク質発現を実証した［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５（１９９０）：Ｇ．Ａ
ｓｃａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，８１５（１９９
１）；Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２，
２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，
４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏ
ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，２１（１
９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］。
の存在又は非存在をＰＣＲで分析した（図１）。プラス
ミドＤＮＡ（ＮＰ又はルシフェラーゼＤＮＡ）は、試験
した注射筋肉４８例中４４例で検出された。ルシフェラ
ーゼＤＮＡ注射マウスでは、当業界で公知の方法によっ
て筋抽出物中に回収されたルシフェラーゼ活性により、
タンパク質発現を実証した［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５（１９９０）：Ｇ．Ａ
ｓｃａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３５２，８１５（１９９
１）；Ｈ．Ｌｉｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２，
２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓら，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，
４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎら，ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏ
ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，２１（１
９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］。
【００５８】ＮＰ ＤＮＡの注射後の筋肉中のＮＰ発現
は、ウエスタンブロット分析に関する検出限界を下回っ
た（＜１ｎｇ）が、しかしＮＰ特異性抗体の産生によっ
て示された（図２参照）。ＮＰ特異性ＣＴＬ生成の分析
のために、免疫化後１〜４週目に脾臓を取り出し、脾臓
胞を組換え体ヒトＩＬ−２＋インフルエンザＡ（Ａ／Ｐ
Ｒ／８／３４）に感染させるか又はＨ−２Ｋｄ制限核タ
ンパク質ペプチドエピトープ（ＮＰ残基１４７−１５
５。Ｏ．Ｋ．Ｒｏｔｚｓｃｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ３４
８，２５２（１９９０）参照）でパルス化した自系脾細
胞で再刺激した。ウイルス感染又はエピトープパルス化
同系細胞で再刺激した脾細胞は、核タンパク質エピトー
プパルス化標的細胞を殺すことができる（図３Ａ）。こ
れは、ＮＰＤＮＡの筋注が、特異的ＣＴＬ反応の誘発の
ためにＩ種のＭＨＣと会合した適切なＮＰ由来ペプチド
を生成したことを示す。これらのＣＴＬはウイルスに感
染した標的細胞（図３Ｂ）を、又はＨ−２Ｋｄ制限核タ
ンパク質ペプチドエピトープ及びウイルス感染標的細胞
でパルス化した標的細胞を認識又は溶解できる。このこ
とはそれらの特異性並びに感染細胞中に自然に生じるエ
ピトープを検出するそれらの能力の表われである。
は、ウエスタンブロット分析に関する検出限界を下回っ
た（＜１ｎｇ）が、しかしＮＰ特異性抗体の産生によっ
て示された（図２参照）。ＮＰ特異性ＣＴＬ生成の分析
のために、免疫化後１〜４週目に脾臓を取り出し、脾臓
胞を組換え体ヒトＩＬ−２＋インフルエンザＡ（Ａ／Ｐ
Ｒ／８／３４）に感染させるか又はＨ−２Ｋｄ制限核タ
ンパク質ペプチドエピトープ（ＮＰ残基１４７−１５
５。Ｏ．Ｋ．Ｒｏｔｚｓｃｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ３４
８，２５２（１９９０）参照）でパルス化した自系脾細
胞で再刺激した。ウイルス感染又はエピトープパルス化
同系細胞で再刺激した脾細胞は、核タンパク質エピトー
プパルス化標的細胞を殺すことができる（図３Ａ）。こ
れは、ＮＰＤＮＡの筋注が、特異的ＣＴＬ反応の誘発の
ためにＩ種のＭＨＣと会合した適切なＮＰ由来ペプチド
を生成したことを示す。これらのＣＴＬはウイルスに感
染した標的細胞（図３Ｂ）を、又はＨ−２Ｋｄ制限核タ
ンパク質ペプチドエピトープ及びウイルス感染標的細胞
でパルス化した標的細胞を認識又は溶解できる。このこ
とはそれらの特異性並びに感染細胞中に自然に生じるエ
ピトープを検出するそれらの能力の表われである。
【００５９】ＮＰ ＤＮＡワクチンの免疫原性のさらに
厳密な測定は、一次ＣＴＬ反応の評価であった。ＮＰ
ＤＮＡ注入マウスから採取した脾細胞をＣｏｎ Ａ及び
ＩＬ−２に曝して活性化したが、しかし適切な標的を殺
すそれらの能力を試験する前の抗原発現細胞によるｉｎ
ｖｉｔｒｏ再刺激は実施しなかった。ＮＰ ＤＮＡで
免疫化したマウスからの脾細胞は、抗原特異性再刺激を
行なわずにＣｏｎ Ａ及びＩＬ−２でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で活性化した場合、エピトープパルス化及びウイルス感
染標的細胞をともに溶解した（図３Ｃ及びＤ）。再刺激
化及び活性化脾細胞の両方のこの溶解活性は、Ａ／ＰＲ
／８／３４（Ｈ１Ｎ１）後３４年目に生じた有毒マウス
適合Ｈ３Ｎ２株であるインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で
予め感染させたマウスから得た同様に処理した脾細胞よ
りも優れている。したがって、ＮＰ ＤＮＡの注入は、
核タンパク質エピトープに特異的な、そして天然に処理
された抗原を同定し得る（即ちウイルス感染細胞を殺し
得る）ＣＴＬを生成した。ＮＰ ＣＴＬも、ヒトＨＬＡ
−Ａ２を発現するＣ３Ｈ及びＢ６トランスジェニックマ
ウスで生成された。
厳密な測定は、一次ＣＴＬ反応の評価であった。ＮＰ
ＤＮＡ注入マウスから採取した脾細胞をＣｏｎ Ａ及び
ＩＬ−２に曝して活性化したが、しかし適切な標的を殺
すそれらの能力を試験する前の抗原発現細胞によるｉｎ
ｖｉｔｒｏ再刺激は実施しなかった。ＮＰ ＤＮＡで
免疫化したマウスからの脾細胞は、抗原特異性再刺激を
行なわずにＣｏｎ Ａ及びＩＬ−２でｉｎ ｖｉｔｒｏ
で活性化した場合、エピトープパルス化及びウイルス感
染標的細胞をともに溶解した（図３Ｃ及びＤ）。再刺激
化及び活性化脾細胞の両方のこの溶解活性は、Ａ／ＰＲ
／８／３４（Ｈ１Ｎ１）後３４年目に生じた有毒マウス
適合Ｈ３Ｎ２株であるインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で
予め感染させたマウスから得た同様に処理した脾細胞よ
りも優れている。したがって、ＮＰ ＤＮＡの注入は、
核タンパク質エピトープに特異的な、そして天然に処理
された抗原を同定し得る（即ちウイルス感染細胞を殺し
得る）ＣＴＬを生成した。ＮＰ ＣＴＬも、ヒトＨＬＡ
−Ａ２を発現するＣ３Ｈ及びＢ６トランスジェニックマ
ウスで生成された。
【００６０】ＮＰ ＣＴＬは、１用量１μｇという少な
いＮＰ ＤＮＡ（試験した最低用量）を注射したＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの脾臓でも検出されている（表３−Ｉ
Ｖ）。
いＮＰ ＤＮＡ（試験した最低用量）を注射したＢＡＬ
Ｂ／ｃマウスの脾臓でも検出されている（表３−Ｉ
Ｖ）。
【００６１】表 ３−ＩＶ ＮＰ ＤＮＡ１回注射後のマウスにおけるＣＴＬ反応
【００６２】
【表１】 表３−ＩＶ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週）にＡ／
ＰＲ／３４ ＮＰ ＤＮＡ（Ｖ１ＪＮＰ）又は対照ＤＮ
Ａ（Ｖ１Ｊ）を指定用量で１回注射した。比較のため
に、マウスをインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／３４に
感染させた。ＣＴＬを８週目に得て、ＮＰペプチドパル
ス化同系脾細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激し、５０：１
のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパルス化Ｐ８１
５細胞に対して検定した。データは代表的な個々のマウ
スに関して特異的溶解度（％）で表した。
ＰＲ／３４ ＮＰ ＤＮＡ（Ｖ１ＪＮＰ）又は対照ＤＮ
Ａ（Ｖ１Ｊ）を指定用量で１回注射した。比較のため
に、マウスをインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／３４に
感染させた。ＣＴＬを８週目に得て、ＮＰペプチドパル
ス化同系脾細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激し、５０：１
のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパルス化Ｐ８１
５細胞に対して検定した。データは代表的な個々のマウ
スに関して特異的溶解度（％）で表した。
【００６３】追加実験は、１μｇのＮＰ ＤＮＡを１用
量投与したマウスが少なくとも４．５か月（試験終了
時）ＮＰ ＣＴＬを保持したことを示した。ＤＮＡ注入
後のＣＴＬ反応の大きさは、インフルエンザ感染マウス
に匹敵した。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原再刺
激後のＣＴＬの分析は厳密には定量的でないことに留意
すべきである。したがって、マウスにおけるＮＰ特異的
ＣＴＬのレベルをより定量的に評価するために、限定希
釈検定を我々は目下開発中である。１００μｇのＮＰ
ＤＮＡを３用量注入されたマウスにおいて、ＣＴＬ反応
は免疫化後少なくとも６か月検出された（図１９）。し
たがって、インフルエンザＰＮＶは、保存インフルエン
ザ抗原に向けられる長期的ＣＴＬ反応を生成する可能性
を有する。
量投与したマウスが少なくとも４．５か月（試験終了
時）ＮＰ ＣＴＬを保持したことを示した。ＤＮＡ注入
後のＣＴＬ反応の大きさは、インフルエンザ感染マウス
に匹敵した。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原再刺
激後のＣＴＬの分析は厳密には定量的でないことに留意
すべきである。したがって、マウスにおけるＮＰ特異的
ＣＴＬのレベルをより定量的に評価するために、限定希
釈検定を我々は目下開発中である。１００μｇのＮＰ
ＤＮＡを３用量注入されたマウスにおいて、ＣＴＬ反応
は免疫化後少なくとも６か月検出された（図１９）。し
たがって、インフルエンザＰＮＶは、保存インフルエン
ザ抗原に向けられる長期的ＣＴＬ反応を生成する可能性
を有する。
【００６４】マウスにＮＰ ＤＮＡを注射すると、高力
価抗ＮＰ ＩｇＧ抗体の産生が生じた（図２）。マウス
における高力価ＩｇＧ抗体の生成は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の
助けを要すると考えられる（Ｐ．Ｖｉｅｉｒａ及びＫ．
Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４８
７（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４５，３０７１（１９９０））。これ
はｉｎ ｓｉｔｕでプラスミドから発現されたＮＰがＩ
種及びＩＩ種のＭＨＣの両方を提示するようにプロセッ
シングされたことを示す。
価抗ＮＰ ＩｇＧ抗体の産生が生じた（図２）。マウス
における高力価ＩｇＧ抗体の生成は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の
助けを要すると考えられる（Ｐ．Ｖｉｅｉｒａ及びＫ．
Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，４８
７（１９９０）；Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４５，３０７１（１９９０））。これ
はｉｎ ｓｉｔｕでプラスミドから発現されたＮＰがＩ
種及びＩＩ種のＭＨＣの両方を提示するようにプロセッ
シングされたことを示す。
【００６５】実施例４ 有毒性ヒトインフルエンザウイルスによる誘発における
マウスの防御 ： インフルエンザに対する防御免疫におけるＮＰ抗体の役
割を、２つのアプローチで示す：先ず、ウイルス肺力価
を受動輸送実験で測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生
後１０週齢以上）に、ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを３回
注射したマウスからプールした血清（ＰＢＳ ２．０ｍ
ｌで希釈）０．５ｍｌを腹腔内注射した。対照マウスに
は等容量のプールした正常マウス血清か又はＡ／ＨＫ／
６８による感染から回復したマウスからのプール血清を
これも２．０ｍｌのＰＢＳに希釈して注射した。Ａ／Ｈ
Ｋ／６８免疫血清の用量は、抗ＮＰ抗体のＥＬＩＳＡ力
価がＮＰ ＤＮＡ注射マウスからのプール血清と等しく
なるように調整した。血清注射後２時間目に１０４ＴＣ
ＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いて盲検的に麻酔せずに
マウスに誘発し、３日後、等量の血清をさらに注射し
た。注射後６及び７日目にマウスを屠殺し、ＴＣＩＤ
５０／ｍｌでのウイルス肺力価をＭｏｒａｎ［Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４６，３２１，１９９１］の記載と同様
にして測定した。
マウスの防御 ： インフルエンザに対する防御免疫におけるＮＰ抗体の役
割を、２つのアプローチで示す：先ず、ウイルス肺力価
を受動輸送実験で測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（生
後１０週齢以上）に、ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを３回
注射したマウスからプールした血清（ＰＢＳ ２．０ｍ
ｌで希釈）０．５ｍｌを腹腔内注射した。対照マウスに
は等容量のプールした正常マウス血清か又はＡ／ＨＫ／
６８による感染から回復したマウスからのプール血清を
これも２．０ｍｌのＰＢＳに希釈して注射した。Ａ／Ｈ
Ｋ／６８免疫血清の用量は、抗ＮＰ抗体のＥＬＩＳＡ力
価がＮＰ ＤＮＡ注射マウスからのプール血清と等しく
なるように調整した。血清注射後２時間目に１０４ＴＣ
ＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いて盲検的に麻酔せずに
マウスに誘発し、３日後、等量の血清をさらに注射し
た。注射後６及び７日目にマウスを屠殺し、ＴＣＩＤ
５０／ｍｌでのウイルス肺力価をＭｏｒａｎ［Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１４６，３２１，１９９１］の記載と同様
にして測定した。
【００６６】未使用マウスに、ＮＰ ＤＮＡを注射した
マウスから得た抗ＮＰ抗血清を注入し、次いでＡ／ＨＫ
／６８を用いて誘発した。ウイルス誘発はＡ／ＨＫ／６
８のマウス適合株を用いて実施し、その後マウスでｉｎ
ｖｉｖｏ継代を維持させた（Ｄｒ．Ｉ．Ｍｂａｗｕｉ
ｋｅ私信）。使用したウイルス種子ストックは感染マウ
スからの肺のホモジネートであって、ＭＤＣＫ細胞では
５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を有した。ウ
イルス肺力価測定及び体重損失試験のために、非麻酔マ
ウスの鼻孔に１０４ＴＣＩＤ５０を含有する２０μｌを
鼻腔内点滴注入してウイルス誘発した。この方法はウイ
ルスの肺感染を徐々に引き起こすが、ＢＡＬＢ／ｃマウ
スには致命的でない［Ｙｅｔｔｅｒ，Ｒ．Ａ．ら，Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９，６５４，１９８
０］。生存実験では、ケタミン及びキシラジンによる全
身麻酔下でマウスの鼻孔に１０２．５ＴＣＩＤ５０を含
有する２０μｌを点滴注入してウイルス誘発した。この
用量で麻酔マウスを感染させると急速な肺感染が生じ、
非免疫化マウスの９０〜１００％が死亡した［Ｊ．Ｌ．
Ｓｃｈｕｌｍａｎ及びＥ．Ｄ．Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１８，２５７，１９６３；Ｇ．
Ｈ．Ｓｃｏｔｔ及びＲ．Ｊ．Ｓｙｄｉｓｋｉｓ，Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４，６９６，１９７６；
Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ２９，６５４，１９８０］。ウイルス肺力価は、
Ｍｏｒａｎ等（上掲）の記載と同様に９６ウエルプレー
ト中のＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤから入手）における順次滴定により測定した。
マウスから得た抗ＮＰ抗血清を注入し、次いでＡ／ＨＫ
／６８を用いて誘発した。ウイルス誘発はＡ／ＨＫ／６
８のマウス適合株を用いて実施し、その後マウスでｉｎ
ｖｉｖｏ継代を維持させた（Ｄｒ．Ｉ．Ｍｂａｗｕｉ
ｋｅ私信）。使用したウイルス種子ストックは感染マウ
スからの肺のホモジネートであって、ＭＤＣＫ細胞では
５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの感染力価を有した。ウ
イルス肺力価測定及び体重損失試験のために、非麻酔マ
ウスの鼻孔に１０４ＴＣＩＤ５０を含有する２０μｌを
鼻腔内点滴注入してウイルス誘発した。この方法はウイ
ルスの肺感染を徐々に引き起こすが、ＢＡＬＢ／ｃマウ
スには致命的でない［Ｙｅｔｔｅｒ，Ｒ．Ａ．ら，Ｉｎ
ｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２９，６５４，１９８
０］。生存実験では、ケタミン及びキシラジンによる全
身麻酔下でマウスの鼻孔に１０２．５ＴＣＩＤ５０を含
有する２０μｌを点滴注入してウイルス誘発した。この
用量で麻酔マウスを感染させると急速な肺感染が生じ、
非免疫化マウスの９０〜１００％が死亡した［Ｊ．Ｌ．
Ｓｃｈｕｌｍａｎ及びＥ．Ｄ．Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１８，２５７，１９６３；Ｇ．
Ｈ．Ｓｃｏｔｔ及びＲ．Ｊ．Ｓｙｄｉｓｋｉｓ，Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４，６９６，１９７６；
Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ ２９，６５４，１９８０］。ウイルス肺力価は、
Ｍｏｒａｎ等（上掲）の記載と同様に９６ウエルプレー
ト中のＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
ＭＤから入手）における順次滴定により測定した。
【００６７】抗ＮＰ抗血清（６．３±０．２；平均±Ｓ
ＥＭ；ｎ＝４）を投与したマウスにおいては、正常血清
（６．１±０．３；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）を投与した
対照マウスと比較して、ウイルス肺力価の低下は認めら
れなかった。陽性対照として、Ａ／ＨＫ／６８に感染さ
せたマウスから血清を収集し、４匹の未使用マウスに受
動輸送させた。Ａ／ＨＫ／６８による誘発後、ウイルス
感染はそれらの肺では検出されなかったが、これは全ウ
イルスに対するこの血清が同種ウイルスを用いた誘発を
完全に防御したことを示す。第二に、筋注により未使用
マウスを精製ＮＰ（５μｇ／足。６週間に３回）で免疫
化した。これらのマウスは高力価ＮＰ特異性抗体を生成
したが、しかしＮＰ特異性ＣＴＬは生成できず、致死用
量のウイルスを防御できなかった。したがって、全ウイ
ルスに対する抗体の中和作用と違って、流行中の抗ＮＰ
ＩｇＧはマウスに対して防御免疫を付与しなかった。
ＥＭ；ｎ＝４）を投与したマウスにおいては、正常血清
（６．１±０．３；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）を投与した
対照マウスと比較して、ウイルス肺力価の低下は認めら
れなかった。陽性対照として、Ａ／ＨＫ／６８に感染さ
せたマウスから血清を収集し、４匹の未使用マウスに受
動輸送させた。Ａ／ＨＫ／６８による誘発後、ウイルス
感染はそれらの肺では検出されなかったが、これは全ウ
イルスに対するこの血清が同種ウイルスを用いた誘発を
完全に防御したことを示す。第二に、筋注により未使用
マウスを精製ＮＰ（５μｇ／足。６週間に３回）で免疫
化した。これらのマウスは高力価ＮＰ特異性抗体を生成
したが、しかしＮＰ特異性ＣＴＬは生成できず、致死用
量のウイルスを防御できなかった。したがって、全ウイ
ルスに対する抗体の中和作用と違って、流行中の抗ＮＰ
ＩｇＧはマウスに対して防御免疫を付与しなかった。
【００６８】ＮＰ ＤＮＡ注射のｉｎ ｖｉｖｏ防御効
力を評価して、細胞媒介免疫反応が機能的に有意である
か否かを調べた。免疫反応の有効性の直接測定法の１つ
は、最初にＮＰ ＤＮＡで免疫化したマウスが異種株の
インフルエンザ（Ａ／ＨＫ／６８；Ｈ３Ｎ２）による漸
進的亜致命的肺感染を消散する能力であった。ウイルス
誘発は上記と同様に実施した。ＮＰ ＤＮＡで免疫化し
たマウスは、免疫化されなかった（４．１±０．３；平
均±ＳＥＭ；ｎ＝４）、又はブランクベクターで免疫化
された（４．５±０．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）対照
マウスの場合に比べ、７日目の大きさが３等級低い
（１．０±１．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）誘発後ウイ
ルス肺力価を有した。実際、４匹の免疫化マウスのうち
３匹がその肺に検出不可能なレベルのウイルスを有した
に過ぎなかったが、一方この時点でウイルスが除去され
た対照はなかった。この実験及び別の６つの実験で観察
されたウイルス肺力価の顕著な差異は、免疫反応がウイ
ルスの清掃を促すことを意味する。ブランクベクター対
照に防御作用が欠けていることは、ＤＮＡそれ自体は免
疫反応に関与しないことを示す。さらに、ウイルスの誘
発株Ａ／ＨＫ／６８（有毒性マウス適合Ｈ３Ｎ２株）は
ＮＰ遺伝子をクローン化した株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ
１Ｎ１）とは異種であるため、免疫は明らかに異型であ
った。
力を評価して、細胞媒介免疫反応が機能的に有意である
か否かを調べた。免疫反応の有効性の直接測定法の１つ
は、最初にＮＰ ＤＮＡで免疫化したマウスが異種株の
インフルエンザ（Ａ／ＨＫ／６８；Ｈ３Ｎ２）による漸
進的亜致命的肺感染を消散する能力であった。ウイルス
誘発は上記と同様に実施した。ＮＰ ＤＮＡで免疫化し
たマウスは、免疫化されなかった（４．１±０．３；平
均±ＳＥＭ；ｎ＝４）、又はブランクベクターで免疫化
された（４．５±０．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）対照
マウスの場合に比べ、７日目の大きさが３等級低い
（１．０±１．０；平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）誘発後ウイ
ルス肺力価を有した。実際、４匹の免疫化マウスのうち
３匹がその肺に検出不可能なレベルのウイルスを有した
に過ぎなかったが、一方この時点でウイルスが除去され
た対照はなかった。この実験及び別の６つの実験で観察
されたウイルス肺力価の顕著な差異は、免疫反応がウイ
ルスの清掃を促すことを意味する。ブランクベクター対
照に防御作用が欠けていることは、ＤＮＡそれ自体は免
疫反応に関与しないことを示す。さらに、ウイルスの誘
発株Ａ／ＨＫ／６８（有毒性マウス適合Ｈ３Ｎ２株）は
ＮＰ遺伝子をクローン化した株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ
１Ｎ１）とは異種であるため、免疫は明らかに異型であ
った。
【００６９】ウイルス誘発性罹患の尺度として、ＮＰ
ＤＮＡで免疫化後にインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で亜
致命的に感染させたマウスにおいて体重損失を監視した
（図４）。非注射マウス又はブランクベクターを注射し
たマウスを対照として用いた。ＮＰ ＤＮＡで免疫化し
たマウスは対照マウスに比して体重損失が少なく、イン
フルエンザＡ感染後により迅速に試験前の体重に戻っ
た。
ＤＮＡで免疫化後にインフルエンザＡ／ＨＫ／６８で亜
致命的に感染させたマウスにおいて体重損失を監視した
（図４）。非注射マウス又はブランクベクターを注射し
たマウスを対照として用いた。ＮＰ ＤＮＡで免疫化し
たマウスは対照マウスに比して体重損失が少なく、イン
フルエンザＡ感染後により迅速に試験前の体重に戻っ
た。
【００７０】全身麻酔マウスをインフルエンザＡで鼻腔
内感染させると、肺での急速な広範囲のウイルス複製が
生じ、感染を制御できない場合には６〜８日で死亡した
（Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ ２９，６５４（１９８０））。この方法で誘発
したマウスの生存率は急性肺感染の重症度を制限するそ
れらの能力を反映する。インフルエンザの２つの異なる
株Ａ／ＨＫ／６８（図５参照）及びＡ／ＰＲ／８／３４
を用いた誘発に生き残るマウスの能力を調べた。ＮＰ
ＤＮＡで予め免疫化したマウスは９０％の生存率を示し
たが、これに比してブランクベクター注射対照では０
％、非注射対照動物では２０％であった（図５）。この
ような１４の試験全体で、ＮＰ ＤＮＡで免疫化したマ
ウスは対照よりも少なくとも５０％多い生存率を示し
た。したがって、３４年後に生じた異なる株のウイルス
により引き起こされる回復及び疾病低減を有効に促すＮ
Ｐ ＤＮＡ誘発性免疫反応の能力は、細胞毒性Ｔリンパ
球反応の生成のために保存タンパク質を標的とすべきだ
とする論理的根拠を支持する。
内感染させると、肺での急速な広範囲のウイルス複製が
生じ、感染を制御できない場合には６〜８日で死亡した
（Ｒ．Ａ．Ｙｅｔｔｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ
ｉｔｙ ２９，６５４（１９８０））。この方法で誘発
したマウスの生存率は急性肺感染の重症度を制限するそ
れらの能力を反映する。インフルエンザの２つの異なる
株Ａ／ＨＫ／６８（図５参照）及びＡ／ＰＲ／８／３４
を用いた誘発に生き残るマウスの能力を調べた。ＮＰ
ＤＮＡで予め免疫化したマウスは９０％の生存率を示し
たが、これに比してブランクベクター注射対照では０
％、非注射対照動物では２０％であった（図５）。この
ような１４の試験全体で、ＮＰ ＤＮＡで免疫化したマ
ウスは対照よりも少なくとも５０％多い生存率を示し
た。したがって、３４年後に生じた異なる株のウイルス
により引き起こされる回復及び疾病低減を有効に促すＮ
Ｐ ＤＮＡ誘発性免疫反応の能力は、細胞毒性Ｔリンパ
球反応の生成のために保存タンパク質を標的とすべきだ
とする論理的根拠を支持する。
【００７１】実施例５ インフルエンザウイルス単離物からの遺伝子の単離 ： 古くから多数のインフルエンザウイルス株がＡＴＣＣに
寄託されている（Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ ＆
Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ ＆Ｒｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａｅ第六版の１９９０年カタログにはインフ
ルエンザＡ株２０種及びインフルエンザＢ株１４種が列
挙されている）。
寄託されている（Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ ＆
Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ ＆Ｒｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａｅ第六版の１９９０年カタログにはインフ
ルエンザＡ株２０種及びインフルエンザＢ株１４種が列
挙されている）。
【００７２】Ａ．ウイルス株及び精製： 現在の１９９２年インフルエンザシーズンワクチンを包
含するインフルエンザ株は、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ
Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｌＤｉｓｅ
ａｓｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡのＮａｎｃｙ
Ｊ．Ｃｏｘ博士から入手した。これらの株を以下に挙げ
る：（１）Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９（Ｈ３Ｎ
２）；（２）Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ
１）；（３）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０；及び
（４）Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３。
含するインフルエンザ株は、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ
Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａｌＤｉｓｅ
ａｓｅｓ，Ｃｅｎｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡのＮａｎｃｙ
Ｊ．Ｃｏｘ博士から入手した。これらの株を以下に挙げ
る：（１）Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９（Ｈ３Ｎ
２）；（２）Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ
１）；（３）Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０；及び
（４）Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３。
【００７３】これらのウイルスはすべて、９〜１１日齢
鶏卵胚中で継代により増殖させ（ＭＤＣＫ細胞中で増殖
させたＡ／Ｇｅｏｒｇｉａを除く）（１００〜２００／
ウイルス標本）、Ｍａｓｓｉｃｏｔ等（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １０１，２４２−２４９（１９８０））が記載した
方法の変法により精製した。手短に言えば、ウイルス懸
濁液を８０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｒ
Ｃ５Ｃ遠心分離器。ＧＳ−３ローター）して透明にし、
次いでＢｅｃｋｍａｎ １９型ローターで１８，０００
ｒｐｍで２時間遠心分離してペレットとした。ペレット
化ウイルスをＳＴＥ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁
し、４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離（Ｈｅｒｍｌｅ
Ｚ３６０Ｋ遠心分離器）して、凝集物を除去した。上
清 ２ｍｌを、６０％ショ糖 ２ｍｌとＳＴＥで緩衝し
た上層の３０％ショ糖 ７ｍｌから成る不連続ショ糖勾
配上に層とし、３６，０００ｒｐｍ（ＳＷ−４０ロータ
ー，Ｂｅｃｋｍａｎ）で９０分遠心分離した。バンド化
ウイルスを界面で収集し、ＳＴＥで１０倍に希釈して、
３０，０００ｒｐｍで２時間（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ４
５ローター）ペレット化した。次にペレット化ウイルス
を−７０℃で凍結した。
鶏卵胚中で継代により増殖させ（ＭＤＣＫ細胞中で増殖
させたＡ／Ｇｅｏｒｇｉａを除く）（１００〜２００／
ウイルス標本）、Ｍａｓｓｉｃｏｔ等（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １０１，２４２−２４９（１９８０））が記載した
方法の変法により精製した。手短に言えば、ウイルス懸
濁液を８０００ｒｐｍで遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ Ｒ
Ｃ５Ｃ遠心分離器。ＧＳ−３ローター）して透明にし、
次いでＢｅｃｋｍａｎ １９型ローターで１８，０００
ｒｐｍで２時間遠心分離してペレットとした。ペレット
化ウイルスをＳＴＥ（０．１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁
し、４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離（Ｈｅｒｍｌｅ
Ｚ３６０Ｋ遠心分離器）して、凝集物を除去した。上
清 ２ｍｌを、６０％ショ糖 ２ｍｌとＳＴＥで緩衝し
た上層の３０％ショ糖 ７ｍｌから成る不連続ショ糖勾
配上に層とし、３６，０００ｒｐｍ（ＳＷ−４０ロータ
ー，Ｂｅｃｋｍａｎ）で９０分遠心分離した。バンド化
ウイルスを界面で収集し、ＳＴＥで１０倍に希釈して、
３０，０００ｒｐｍで２時間（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ４
５ローター）ペレット化した。次にペレット化ウイルス
を−７０℃で凍結した。
【００７４】Ｂ．ウイルスＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡ合
成： Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９（１９８７））
の方法を用い、市販キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてグアニジニウムイソチ
オシアネート抽出により凍結ウイルスからウイルスＲＮ
Ａを精製した。メーカーの指示に従い、いくつかの修正
を加えて、市販ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用いてウイルスＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製
した。すべてのＡ株遺伝子に関し、ウイルスＲＮＡの
３′末端に位置する保存配列と相補的である合成オリゴ
デオキシリボヌクレオチド ５′−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣ
ＡＧＧ−３′（配列番号３０）を用いて、ｃＤＮＡの一
次鎖をプライムした。この配列はすべてのＡ型インフル
エンザウイルスＲＮＡに共通であり、したがって任意の
Ａ株インフルエンザウイルス遺伝子をクローニングして
もよい。ｃＤＮＡの一次及び二次鎖の合成後、フェノー
ル／クロロホルムで反応物を抽出し、キットの指令に従
うよりむしろエタノール沈降させた。次にこれらの盲端
化ｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化したＶ１Ｊｎ
ｅｏ又はＶ１Ｊｎｓベクターに直接結紮し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで盲端化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理した。
成： Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９（１９８７））
の方法を用い、市販キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌ
ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてグアニジニウムイソチ
オシアネート抽出により凍結ウイルスからウイルスＲＮ
Ａを精製した。メーカーの指示に従い、いくつかの修正
を加えて、市販ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を用いてウイルスＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製
した。すべてのＡ株遺伝子に関し、ウイルスＲＮＡの
３′末端に位置する保存配列と相補的である合成オリゴ
デオキシリボヌクレオチド ５′−ＡＧＣＡＡＡＡＧＣ
ＡＧＧ−３′（配列番号３０）を用いて、ｃＤＮＡの一
次鎖をプライムした。この配列はすべてのＡ型インフル
エンザウイルスＲＮＡに共通であり、したがって任意の
Ａ株インフルエンザウイルス遺伝子をクローニングして
もよい。ｃＤＮＡの一次及び二次鎖の合成後、フェノー
ル／クロロホルムで反応物を抽出し、キットの指令に従
うよりむしろエタノール沈降させた。次にこれらの盲端
化ｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化したＶ１Ｊｎ
ｅｏ又はＶ１Ｊｎｓベクターに直接結紮し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで盲端化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで処理した。
【００７５】特定の全長ウイルス遺伝子をスクリーニン
グするために、指定ウイルス遺伝子の翻訳開放読み枠の
末尾に３′末端を補足するよう意図された合成オリゴデ
オキシリボヌクレオチドを我々は用いた。アガロース電
気泳動ゲル上での制限マッピング及びサイズ確定により
全長遺伝子を示すと思われる標本を、ウイルス遺伝子と
Ｖ１Ｊｎｅｏとの両接合部のジデオキシヌクレオチドシ
ーケンシングにより実証した。これらのウイルスからク
ローン化した各遺伝子の配列接合部を下記の実施例８に
示す。
グするために、指定ウイルス遺伝子の翻訳開放読み枠の
末尾に３′末端を補足するよう意図された合成オリゴデ
オキシリボヌクレオチドを我々は用いた。アガロース電
気泳動ゲル上での制限マッピング及びサイズ確定により
全長遺伝子を示すと思われる標本を、ウイルス遺伝子と
Ｖ１Ｊｎｅｏとの両接合部のジデオキシヌクレオチドシ
ーケンシングにより実証した。これらのウイルスからク
ローン化した各遺伝子の配列接合部を下記の実施例８に
示す。
【００７６】同様の方法を用いて、ウイルスＲＮＡの各
末端に共通の配列を有さぬＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９
０に関するものを除き、上記のウイルスの各々からｃＤ
ＮＡをクローニングし、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの混合物を用いて一次鎖ｃＤＮＡ合成をプライムし
た。これらのプライマーを以下に示す： （１）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣ−３′（Ｐ
Ｂ１及びＰＢ２、配列番号３１）； （２）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡ−３′
（ＮＳ及びＨＡ、配列番号１９）； （３）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＣＡＣ−３′
（Ｍ、配列番号２２）；及び （４）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡ−３′
（ＮＰ、配列番号２３）。
末端に共通の配列を有さぬＢ／Ｐａｎａｍａ／４５／９
０に関するものを除き、上記のウイルスの各々からｃＤ
ＮＡをクローニングし、オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドの混合物を用いて一次鎖ｃＤＮＡ合成をプライムし
た。これらのプライマーを以下に示す： （１）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣ−３′（Ｐ
Ｂ１及びＰＢ２、配列番号３１）； （２）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＡ−３′
（ＮＳ及びＨＡ、配列番号１９）； （３）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＧＣＡＣ−３′
（Ｍ、配列番号２２）；及び （４）５′−ＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＣＡ−３′
（ＮＰ、配列番号２３）。
【００７７】ＰＣＲでクローン化された遺伝子に関して
は、盲端ｃＤＮＡ溶液をＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ反応に
直接用いた。ＰＣＲによって得た６つのインフルエンザ
遣伝子をクローニングするために用いたプライマーを以
下に挙げる： １．Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３３） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣＴ
ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号３３） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＡＴ
Ｇ ３′ ２．Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３５） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＴＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＴＧ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号３６） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＡＴ
ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＧ ３′ ３．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３７） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ
ＡＴＡ ＡＴＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＴＧ
３′ アンチセンスプライマー（配列番号３８） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＴＡ ＴＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ
３′ ４．Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９からのＭ１遺伝
子 センスプライマー（配列番号３９） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４０） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ
ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＣ
３′ ５．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＮＰ遣伝子 センスプライマー（配列番号４１） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＣ
ＧＧＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４２） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＴＡ
ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＡＴＣ
ＣＴＣ ３′ ６．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＭ１遺伝子 センスプライマー（配列番号４３） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ
ＡＴＴ ＧＣＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４４） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＡＧ
ＧＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＡＧＣ
ＴＧ ３′ 生成するのがｃＤＮＡであれＰＣＲであれ、すべてのイ
ンフルエンザ遺伝子クローンを遺伝子結紮部位を中心に
配列解析し、トランスフェクトＲＤ細胞において遣伝子
を発現することにより立証した。発現はイムノブロット
により検出した。
は、盲端ｃＤＮＡ溶液をＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ反応に
直接用いた。ＰＣＲによって得た６つのインフルエンザ
遣伝子をクローニングするために用いたプライマーを以
下に挙げる： １．Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３３） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＣＴ
ＡＴＣ ＡＴＴ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号３３） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＡＡＴ
ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＡＡＴ
Ｇ ３′ ２．Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３５） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＣＡ
ＡＡＡ ＣＴＡ ＣＴＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＴＴＡ
ＴＧ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号３６） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＡＴ
ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＧ ３′ ３．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＨＡ遺伝子 センスプライマー（配列番号３７） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ
ＡＴＡ ＡＴＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＴＣ ＡＴＧ
３′ アンチセンスプライマー（配列番号３８） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＴＡ ＴＡＧ ＡＣＡ ＧＡＴ
ＧＧＡ ＧＣＡ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＣＴ
３′ ４．Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９からのＭ１遺伝
子 センスプライマー（配列番号３９） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４０） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴＴ
ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＣ
３′ ５．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＮＰ遣伝子 センスプライマー（配列番号４１） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＣ
ＧＧＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４２） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＡＴＡ
ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＡＴＣ
ＣＴＣ ３′ ６．Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０からのＭ１遺伝子 センスプライマー（配列番号４３） ５′ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ
ＴＣＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＣＡ
ＡＴＴ ＧＣＣ ３′ アンチセンスプライマー（配列番号４４） ５′ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＡ ＴＡＧ
ＧＴＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＡＧＣ
ＴＧ ３′ 生成するのがｃＤＮＡであれＰＣＲであれ、すべてのイ
ンフルエンザ遺伝子クローンを遺伝子結紮部位を中心に
配列解析し、トランスフェクトＲＤ細胞において遣伝子
を発現することにより立証した。発現はイムノブロット
により検出した。
【００７８】Ａ／Ｈ３Ｎ２株に関するＮＰ及びＭ１構築
物（ベクター４及び５）をＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３
／８９から作製した。ＮＰ及びＭ１遺伝子には高程度の
保存が期待でき、そしてそれらの有効性のために、これ
らの遺伝子を選択した。
物（ベクター４及び５）をＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３
／８９から作製した。ＮＰ及びＭ１遺伝子には高程度の
保存が期待でき、そしてそれらの有効性のために、これ
らの遺伝子を選択した。
【００７９】前記の研究から、組合せて生成される７つ
の発現ベクターの特に好ましい群を以下に挙げる： １．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３） ６．５６Ｋｂ ２．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１） ６．５６Ｋｂ ３．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ６．６１Ｋｂ ４．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）６．４２Ｋｂ ５．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）５．６２Ｋｂ ６．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ６．５４Ｋｂ ７．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ５．６１Ｋｂ 発現ベクター中のこれらの遺伝子の接合部に関して関連
のある配列を以下に示す。構築物の小部分の配列解析
が、正確に遺伝子がクローン化されたことを実証するの
に十分だった。同様の公知の遺伝子と比較すれば、指定
遺伝子がＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子等である
ことを実証するのは容易である。例えば、Ａ／Ｔｅｘａ
ｓ ＨＡ遺伝子配列はＡ／Ｋｉｅｖ／５９／７９のＨＡ
遺伝子配列と非常に類似しており、その配列は受け入れ
番号Ｍ３８３５３号としてＧＥＮＢＡＮＫで入手可能で
ある。同様に、Ｂ／Ｐａｎａｍａ ＨＡ配列に関して
は、受け入れ番号Ｍ１８３８４号としてＧＥＮＢＡＮＫ
で入手可能なＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２２２／８２ ＨＡ
配列と非常に類似している。同様の方法で、任意のヒト
インフルエンザウイルスからの指定の遣伝子に関するク
ローン化配列の同一性を実証し得る。下記の各々の場
合、全遺伝子が存在することの確認のために、５′配列
と３′配列の両方を検討した。各々の場合、下線ＡＴＧ
はインフルエンザ遺伝子の開始コドンを示し、一方３′
部分の下線配列は停止コドンである： 実施例６ Ｖ１Ｊ発現ベクター（配列番号１０） ： Ｖ１Ｊを作るに際しての我々の目的は、それらを所要の
状況により対処するようにわれわれのベクター Ｖ１か
らプロモーター及び転写終止要素を除去し、より密なベ
クターを作製し、そしてプラスミド精製収率を改良する
ことであった。
の発現ベクターの特に好ましい群を以下に挙げる： １．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３） ６．５６Ｋｂ ２．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１） ６．５６Ｋｂ ３．Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ６．６１Ｋｂ ４．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）６．４２Ｋｂ ５．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９）５．６２Ｋｂ ６．Ｖ１Ｊｎｓ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ６．５４Ｋｂ ７．Ｖ１Ｊｎｓ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０） ５．６１Ｋｂ 発現ベクター中のこれらの遺伝子の接合部に関して関連
のある配列を以下に示す。構築物の小部分の配列解析
が、正確に遺伝子がクローン化されたことを実証するの
に十分だった。同様の公知の遺伝子と比較すれば、指定
遺伝子がＮＰ遺伝子、ＨＡ遺伝子、Ｍ１遺伝子等である
ことを実証するのは容易である。例えば、Ａ／Ｔｅｘａ
ｓ ＨＡ遺伝子配列はＡ／Ｋｉｅｖ／５９／７９のＨＡ
遺伝子配列と非常に類似しており、その配列は受け入れ
番号Ｍ３８３５３号としてＧＥＮＢＡＮＫで入手可能で
ある。同様に、Ｂ／Ｐａｎａｍａ ＨＡ配列に関して
は、受け入れ番号Ｍ１８３８４号としてＧＥＮＢＡＮＫ
で入手可能なＢ／Ｅｎｇｌａｎｄ／２２２／８２ ＨＡ
配列と非常に類似している。同様の方法で、任意のヒト
インフルエンザウイルスからの指定の遣伝子に関するク
ローン化配列の同一性を実証し得る。下記の各々の場
合、全遺伝子が存在することの確認のために、５′配列
と３′配列の両方を検討した。各々の場合、下線ＡＴＧ
はインフルエンザ遺伝子の開始コドンを示し、一方３′
部分の下線配列は停止コドンである： 実施例６ Ｖ１Ｊ発現ベクター（配列番号１０） ： Ｖ１Ｊを作るに際しての我々の目的は、それらを所要の
状況により対処するようにわれわれのベクター Ｖ１か
らプロモーター及び転写終止要素を除去し、より密なベ
クターを作製し、そしてプラスミド精製収率を改良する
ことであった。
【００８０】Ｖ１Ｊは、ベクターＶ１（実施例１参照）
及び市販プラスミドであるｐＵＣ１８から得た。Ｖ１を
ＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ＤＮＡの
２つの断片を生成した。ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及
び異種遺伝子の発現を制御するウシ成長ホルモン（ＢＧ
Ｈ）転写終止要素を含有するこれらの断片の小さい方
（配列番号１１）を、アガロース電気泳動ゲルから精製
した。次に、別の“盲端”ＤＮＡ断片にそれを結紮しや
すくするために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用い
てこのＤＮＡ断片の末端を“盲端”にした。
及び市販プラスミドであるｐＵＣ１８から得た。Ｖ１を
ＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化して、ＤＮＡの
２つの断片を生成した。ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及
び異種遺伝子の発現を制御するウシ成長ホルモン（ＢＧ
Ｈ）転写終止要素を含有するこれらの断片の小さい方
（配列番号１１）を、アガロース電気泳動ゲルから精製
した。次に、別の“盲端”ＤＮＡ断片にそれを結紮しや
すくするために、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用い
てこのＤＮＡ断片の末端を“盲端”にした。
【００８１】発現ベクターの“骨格”には、ｐＵＣ１８
を選択した。それは高収率のプラスミドを生成として知
られ、配列及び機能が十分特徴づけられており、サイズ
は最小である。われわれはＨａｅＩＩ制限酵素を用いた
部分消化により、このベクターから全ｌａｃオペロンを
除去したが、これはわれわれの目的には不必要であっ
て、プラスミド収率及び異種遺伝子発現に不利益であ
る。残りのプラスミドを、上記と同様にアガロース電気
泳動ゲルから精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで盲端
化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、
上記のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素と結紮した。ｐＵＣ
骨格内のプロモーター要素の２つの考え得る配向のいず
れかを持つプラスミドを得た。これらのプラスミドの１
つは大腸菌中でさらに高収率のＤＮＡを生じ、これをＶ
１Ｊ（配列番号１０）と名づけた。このベクターの構造
を接合領域の配列解析により確認し、次いでＶ１と比較
した場合に、それに匹敵する又はより高い異種遺伝子発
現率をしめすことを実証した。
を選択した。それは高収率のプラスミドを生成として知
られ、配列及び機能が十分特徴づけられており、サイズ
は最小である。われわれはＨａｅＩＩ制限酵素を用いた
部分消化により、このベクターから全ｌａｃオペロンを
除去したが、これはわれわれの目的には不必要であっ
て、プラスミド収率及び異種遺伝子発現に不利益であ
る。残りのプラスミドを、上記と同様にアガロース電気
泳動ゲルから精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで盲端
化して、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理し、
上記のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素と結紮した。ｐＵＣ
骨格内のプロモーター要素の２つの考え得る配向のいず
れかを持つプラスミドを得た。これらのプラスミドの１
つは大腸菌中でさらに高収率のＤＮＡを生じ、これをＶ
１Ｊ（配列番号１０）と名づけた。このベクターの構造
を接合領域の配列解析により確認し、次いでＶ１と比較
した場合に、それに匹敵する又はより高い異種遺伝子発
現率をしめすことを実証した。
【００８２】実施例７ 発現ベクターＶ１Ｊにおけるインフルエンザウイルス遺
伝子構築物 ： インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４株からの
遺伝子の多くは、実施例４に記載されているように、Ｖ
１ベクターと同様か又はそれより高いレベルでの発現を
生じるベクターＶ１Ｊ中にクローン化した。ＰＲ８遺伝
子配列は公知であって、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースか
ら入手できる。下記のクローン化遺伝子の各々に関し
て、クローン化される断片のサイズをサイジングゲルに
より点検し、部分配列が比較対象となるＧＥＮＢＡＮＫ
受け入れ番号を提示した。ウイルス株から、例えばＡＴ
ＣＣから入手したウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４はＡＴ
ＣＣＶＲ−９５である）からこれらの遺伝子を得る方法
に関しては、実施例５を参照して頂きたい。
伝子構築物 ： インフルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／８／３４株からの
遺伝子の多くは、実施例４に記載されているように、Ｖ
１ベクターと同様か又はそれより高いレベルでの発現を
生じるベクターＶ１Ｊ中にクローン化した。ＰＲ８遺伝
子配列は公知であって、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースか
ら入手できる。下記のクローン化遺伝子の各々に関し
て、クローン化される断片のサイズをサイジングゲルに
より点検し、部分配列が比較対象となるＧＥＮＢＡＮＫ
受け入れ番号を提示した。ウイルス株から、例えばＡＴ
ＣＣから入手したウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４はＡＴ
ＣＣＶＲ−９５である）からこれらの遺伝子を得る方法
に関しては、実施例５を参照して頂きたい。
【００８３】Ａ．ＰＲ８遺伝子のＶ１Ｊ中でのサブクロ
ーニング： １．ＮＰ遺伝子 ｐＡＰＲ５０１からＮＰ遺伝子をサブクローニングした
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ５０１を切断
することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩ
Ｉで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．６キロ塩
基の長さであった。
ーニング： １．ＮＰ遺伝子 ｐＡＰＲ５０１からＮＰ遺伝子をサブクローニングした
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ５０１を切断
することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩ
Ｉで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．６キロ塩
基の長さであった。
【００８４】２．ＮＳ ｐＡＰＲ８０１からＮＳ遺伝子をサブクローニングした
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｔ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ８０１を切断
することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩ
Ｉで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼで盲端化した。クローン化断片は０．９キロ塩
基の長さ（ＮＳ１及びＮＳ２を含む完全ＮＳコード領
域）であった。
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｔ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＥｃｏＲＩでｐＡＰＲ８０１を切断
することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩ
Ｉで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリ
メラーゼで盲端化した。クローン化断片は０．９キロ塩
基の長さ（ＮＳ１及びＮＳ２を含む完全ＮＳコード領
域）であった。
【００８５】３．ＨＡ ｐＪＺ１０２からＨＡ遺伝子をサブクローニングした
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＨｉｎｄＩＩＩでＰＪＺ１０２を切
断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌ
ＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．７５キ
ロ塩基の長さであった。
（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅ
ｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａ
ｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），
Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅ
ｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．
１２９−１３８）。ＨｉｎｄＩＩＩでＰＪＺ１０２を切
断することにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌ
ＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポ
リメラーゼで盲端化した。クローン化断片は１．７５キ
ロ塩基の長さであった。
【００８６】４．ＰＢ１ ｐＧｅｍ１−ＰＢ１からＰＢ１遺伝子をサブクローニン
グした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配
列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕ
ｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅ
ｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉ
ｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８を参
照）。ＨｉｎｄＩＩＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ１を切断する
ことにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで
切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼで盲端化した。クローン化断片は２．３キロ塩基の
長さであった。
グした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配
列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕ
ｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅ
ｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉ
ｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８を参
照）。ＨｉｎｄＩＩＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ１を切断する
ことにより切り出し、断片ゲルを精製し、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで盲端化した。盲端化断片をＢｇｌＩＩで
切断したＶ１Ｊ中に挿入し、再びＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼで盲端化した。クローン化断片は２．３キロ塩基の
長さであった。
【００８７】５．ＰＢ２ ｐＧｅｍ１−ＰＢ２からＰＢ２遺伝子をサブクローニン
グした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配
列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕ
ｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅ
ｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉ
ｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。
それを、ＢａｍＨＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ２を切断するこ
とにより切り出し、断片ゲルを精製した。付着端化断片
をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入した。クローン
化断片は２．３キロ塩基の長さであった。
グした（ベクターとの遺伝子の５′及び３′接合部を配
列解析してそれらの同一性を実証した。Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕ
ｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅ
ｓ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉ
ｎｓ ｏｆ Ｐａｎｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。
それを、ＢａｍＨＩでｐＧｅｍ１−ＰＢ２を切断するこ
とにより切り出し、断片ゲルを精製した。付着端化断片
をＢｇｌＩＩで切断したＶ１Ｊ中に挿入した。クローン
化断片は２．３キロ塩基の長さであった。
【００８８】６．Ｍ１ プラスミドｐ８９０１ ＭＩＴＥからＰＣＲによりＭ１
遺伝子を生成した。このプラスミド中のＭ配列は、“セ
ンス”プライマーに関してはオリゴマー５′−ＧＧＴ
ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＴＴ Ｃ
ＴＡ ＡＣＣＧＡＧ ＧＴＣ−３′（配列番号３）を、
“アンチセンス”プライマーに関してはオリゴマー
５′−ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ
Ｔ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＣ
−３′（配列番号４）を用いて、ｐＡＰＲ７０１からＰ
ＣＲにより生成した（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓ
ｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅ
ｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆＰａｎ
ｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，
Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＰＣＲ断片をゲル
精製し、ＢｇｌＩＩで切断して、ＢｇｌＩＩで切断した
Ｖ１Ｊ中に結紮した。クローン化断片は０．７キロ塩基
の長さであった。コード化Ｍ１のアミノ末端は上記のよ
うに“ＡＴＧ”として“センス”プライマー中にコード
され、一方Ｍ１翻訳停止コドンは、センス方向では停止
コドン“ＴＧＡ”である “ＴＣＡ”コドンの復帰によ
りコードされる。
遺伝子を生成した。このプラスミド中のＭ配列は、“セ
ンス”プライマーに関してはオリゴマー５′−ＧＧＴ
ＡＣＡ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＴＴ Ｃ
ＴＡ ＡＣＣＧＡＧ ＧＴＣ−３′（配列番号３）を、
“アンチセンス”プライマーに関してはオリゴマー
５′−ＣＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ
Ｔ ＧＡＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＣ
−３′（配列番号４）を用いて、ｐＡＰＲ７０１からＰ
ＣＲにより生成した（Ｊ．Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｕ．Ｄｅｓ
ｓｅｌｂｅｒｂｅｒ，Ｐ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｐ．Ｐａｌｅ
ｓｅ，Ａ．Ｓｈａｔｚｍａｎ及びＭ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇ（１９８３），Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆＰａｎ
ｄｅｍｉｃ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，
Ｗ．Ｇ．Ｌａｖｅｒ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ）ｐｐ．１２９−１３８）。ＰＣＲ断片をゲル
精製し、ＢｇｌＩＩで切断して、ＢｇｌＩＩで切断した
Ｖ１Ｊ中に結紮した。クローン化断片は０．７キロ塩基
の長さであった。コード化Ｍ１のアミノ末端は上記のよ
うに“ＡＴＧ”として“センス”プライマー中にコード
され、一方Ｍ１翻訳停止コドンは、センス方向では停止
コドン“ＴＧＡ”である “ＴＣＡ”コドンの復帰によ
りコードされる。
【００８９】Ｂ．インフルエンザ遺伝子−Ｖ１Ｊ発現構
築物： 各々の場合に、クローン化遺伝子中での５′プロモータ
ー領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）からの接合配列を示す。これ
らの配列は、コード配列の配列を生成するプライマー： ＣＭＶｉｎｔＡプライマー ５′−ＣＴＡ ＡＣＡ Ｇ
ＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣＴＴＴ ＣＣＡ ＴＧ−３′（配
列番号２８） をシーケンシングして作成した。接合が起きる位置を
“／”で区分したが、これは配列がここで切れているこ
とを示すものではない。これらの構築物の調製方法を下
記のすべての配列の後に要約した。提示した各配列は指
定のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且
つ発現可能なＤＮＡ構築物を表す。
築物： 各々の場合に、クローン化遺伝子中での５′プロモータ
ー領域（ＣＭＶｉｎｔＡ）からの接合配列を示す。これ
らの配列は、コード配列の配列を生成するプライマー： ＣＭＶｉｎｔＡプライマー ５′−ＣＴＡ ＡＣＡ Ｇ
ＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣＴＴＴ ＣＣＡ ＴＧ−３′（配
列番号２８） をシーケンシングして作成した。接合が起きる位置を
“／”で区分したが、これは配列がここで切れているこ
とを示すものではない。これらの構築物の調製方法を下
記のすべての配列の後に要約した。提示した各配列は指
定のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且
つ発現可能なＤＮＡ構築物を表す。
【００９０】各構築物を一時的に培養中のヒト横紋筋肉
腫細胞系であるＲＤ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１３６）中で
トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時
間目に細胞を採集し、溶解させて、ウエスタンブロット
を実施した（マウスで試験し、ウエスタンブロット実施
前に抗ＨＡ特異性抗体を生じ、したがって発現がｉｎ
ｖｉｖｏで観察されたのでウエスタンブロットを実施す
る必要がないＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ構築物を除く）。ＰＢ
１、ＰＢ２及びＮＳタンパク質に特異的な抗体は、β−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現される精製
タンパク質を用いてポリクローナル抗血清を生成したケ
ンブリッジ大学のＳｔｅｐｈｅｎ Ｉｎｇｌｉｓの提供
によるものであった。全Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスを
用いてウサギを免疫化して、抗ＮＰポリクローナル抗血
清を生成した。抗Ｍ１抗体は、ヤギ抗インフルエンザＡ
抗血清として、カタログ番号Ｂ６５２４５ＧでＢｉｏｄ
ｅｓｉｇｎから市販されている。各々の場合、予測サイ
ズのタンパク質が観察されたが、これはコード化インフ
ルエンザタンパク質のｉｎ Ｖｉｔｒｏ発現を示すもの
である。
腫細胞系であるＲＤ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１３６）中で
トランスフェクトした。トランスフェクション後４８時
間目に細胞を採集し、溶解させて、ウエスタンブロット
を実施した（マウスで試験し、ウエスタンブロット実施
前に抗ＨＡ特異性抗体を生じ、したがって発現がｉｎ
ｖｉｖｏで観察されたのでウエスタンブロットを実施す
る必要がないＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ構築物を除く）。ＰＢ
１、ＰＢ２及びＮＳタンパク質に特異的な抗体は、β−
ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現される精製
タンパク質を用いてポリクローナル抗血清を生成したケ
ンブリッジ大学のＳｔｅｐｈｅｎ Ｉｎｇｌｉｓの提供
によるものであった。全Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスを
用いてウサギを免疫化して、抗ＮＰポリクローナル抗血
清を生成した。抗Ｍ１抗体は、ヤギ抗インフルエンザＡ
抗血清として、カタログ番号Ｂ６５２４５ＧでＢｉｏｄ
ｅｓｉｇｎから市販されている。各々の場合、予測サイ
ズのタンパク質が観察されたが、これはコード化インフ
ルエンザタンパク質のｉｎ Ｖｉｔｒｏ発現を示すもの
である。
【００９１】これらの構築物に対する呼称は慣用的に以
下のように示す：“ベクター名−インフルエンザ株−遺
伝子”。すべての場合に、クローン化及びシーケンス化
Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子配列に関してＧＥＮＢＡＮＫ
の公知配列との異同を点検した。これらの構築物の各々
の生理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証
した： ＣＭＶｉｎｔＡ及びＡ／ＰＲ／８／３４からのインフル
エンザ遺伝子の５′接合部付近の配列： 断片接合方法： １．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＰ） ２．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＰＢ１） ３．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＳ１） ４．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＨＡ） ５．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベク
ター）−付着端化ＢａｍＨＩ（ＰＢ２） ６．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−付着端化ＢｇｌＩＩ（Ｍ１） Ｍ１は、鋳型としてのｐ８９０−Ｍ１ＴＥ及び両端にＢ
ｇｌＩＩ部位を付加し、Ｍ１（ＴＧＡ）に関してＡＴＧ
の３塩基前で開始して終止コドン後の右で終結するプラ
イマーを用いて、ＰＣＲにより得た。
下のように示す：“ベクター名−インフルエンザ株−遺
伝子”。すべての場合に、クローン化及びシーケンス化
Ａ／ＰＲ／８／３４遺伝子配列に関してＧＥＮＢＡＮＫ
の公知配列との異同を点検した。これらの構築物の各々
の生理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証
した： ＣＭＶｉｎｔＡ及びＡ／ＰＲ／８／３４からのインフル
エンザ遺伝子の５′接合部付近の配列： 断片接合方法： １．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＰ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＰ） ２．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ１：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＰＢ１） ３．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＮＳ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＥｃｏＲＩ（ＮＳ１） ４．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ：盲端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−盲端化ＨｉｎｄＩＩＩ（ＨＡ） ５．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＰＢ２：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベク
ター）−付着端化ＢａｍＨＩ（ＰＢ２） ６．Ｖ１Ｊ−ＰＲ−Ｍ１：付着端化ＢｇｌＩＩ（ベクタ
ー）−付着端化ＢｇｌＩＩ（Ｍ１） Ｍ１は、鋳型としてのｐ８９０−Ｍ１ＴＥ及び両端にＢ
ｇｌＩＩ部位を付加し、Ｍ１（ＴＧＡ）に関してＡＴＧ
の３塩基前で開始して終止コドン後の右で終結するプラ
イマーを用いて、ＰＣＲにより得た。
【００９２】実施例８ Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター（配列番号１８） ： 大規模発酵槽中ではアンピシリンを用い得ないため、Ｖ
１Ｊを採取した細菌の抗生物質選択のためにあるａｍｐ
ｒ遺伝子を除去する必要があった。ＳｓｐＩ及びＥａｍ
Ｉ１０５１制限酵素で消化することにより、Ｖ１Ｊのｐ
ＵＣ骨格からａｍｐｒ遺伝子を除去した。残りのプラス
ミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化して、次いで仔ウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３
から得られ、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含有される市販
のｋａｎｒ遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素を用いて切り出
し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで盲端化した。この断片をＶ１Ｊ骨格と
結紮し、いずれかの方向でｋａｎｒ遺伝子を有するプラ
スミドを得て、これをＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名し
た。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接
合領域のＤＮＡ配列解析により確認し、Ｖ１と同様の量
のプラスミドを生成することを示した。異種遺伝子物質
の発現も、これらのＶ１ＪｎｅｏベクターはＶ１Ｊに匹
敵した。我々は取りあえずＶ１Ｊｎｅｏ＃３という呼称
を選択したが、以後Ｖ１Ｊｎｅｏ（配列番号１８）と呼
ぶ。これは発現構築物としてのＶ１Ｊ中にａｍｐｒ遺伝
子と同じ方向にｋａｎｒ遺伝子を含有する。
１Ｊを採取した細菌の抗生物質選択のためにあるａｍｐ
ｒ遺伝子を除去する必要があった。ＳｓｐＩ及びＥａｍ
Ｉ１０５１制限酵素で消化することにより、Ｖ１Ｊのｐ
ＵＣ骨格からａｍｐｒ遺伝子を除去した。残りのプラス
ミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡポリメラーゼで盲端化して、次いで仔ウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３
から得られ、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含有される市販
のｋａｎｒ遺伝子をＰｓｔＩ制限酵素を用いて切り出
し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼで盲端化した。この断片をＶ１Ｊ骨格と
結紮し、いずれかの方向でｋａｎｒ遺伝子を有するプラ
スミドを得て、これをＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名し
た。これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、接
合領域のＤＮＡ配列解析により確認し、Ｖ１と同様の量
のプラスミドを生成することを示した。異種遺伝子物質
の発現も、これらのＶ１ＪｎｅｏベクターはＶ１Ｊに匹
敵した。我々は取りあえずＶ１Ｊｎｅｏ＃３という呼称
を選択したが、以後Ｖ１Ｊｎｅｏ（配列番号１８）と呼
ぶ。これは発現構築物としてのＶ１Ｊ中にａｍｐｒ遺伝
子と同じ方向にｋａｎｒ遺伝子を含有する。
【００９３】Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９、Ａ／
Ｔｅｘａｓ／３６／９１及びＢ／Ｐａｎａｍａ／４６／
９０株の各々からの遺伝子をｃＤＮＡとして、ベクター
Ｖ１Ｊｎｅｏ中でクローン化した。各々の場合、コード
配列の配列を規制する５′プロモーター領域（ＣＭＶｉ
ｎｔＡ）からクローン化遺伝子への接合配列を、プライ
マー： ＣＭＶｉｎｔＡ プライマー ５′−ＣＴＡ ＡＣＡ
ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣＴＴＴ ＣＣＡ ＴＧ−３′
（配列番号２８） を用いて配列解析した。これはターミネーター／コード
配列へ続いており、その接合も示されている。この配列
は、非コード化鎖の配列を規制するプライマー：ＢＧＨ
プライマー ５′−ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＣＴ
ＴＣＣ ＡＧＧ−３′（配列番号２９）を用いて生成し
た。すべての場合に、これらの又は他のインフルエンザ
単離物からのクローン化し配列解析した遺伝子に関して
は、ＧＥＮＢＡＮＫからの公知の配列と照合した。接合
が起きる位置を“／”で区分したが、ここで配列が切れ
ているわけではない。Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＨＡ接合の
場合、シーケンシングゲルが圧縮され、初期配列を読み
取るのは難しかった。したがって、この接合部の最初の
８塩基を“Ｎ”とした。これらのヌクレオチドは後に確
認し、同定ヌクレオチドが表示されている。各配列に含
まれる最初の“ＡＴＧ”はそれぞれのクローン化遺伝子
に関する翻訳開始コドンである。表示した各配列は指定
のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且つ
発現可能なＤＮＡ構築物を表す。これらの構築物に対す
る呼称は慣用的に以下のように示す：“ベクター名−イ
ンフルエンザ株−遺伝子”。これらの構築物の各々の生
理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証し
た。
Ｔｅｘａｓ／３６／９１及びＢ／Ｐａｎａｍａ／４６／
９０株の各々からの遺伝子をｃＤＮＡとして、ベクター
Ｖ１Ｊｎｅｏ中でクローン化した。各々の場合、コード
配列の配列を規制する５′プロモーター領域（ＣＭＶｉ
ｎｔＡ）からクローン化遺伝子への接合配列を、プライ
マー： ＣＭＶｉｎｔＡ プライマー ５′−ＣＴＡ ＡＣＡ
ＧＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣＴＴＴ ＣＣＡ ＴＧ−３′
（配列番号２８） を用いて配列解析した。これはターミネーター／コード
配列へ続いており、その接合も示されている。この配列
は、非コード化鎖の配列を規制するプライマー：ＢＧＨ
プライマー ５′−ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＣＴ
ＴＣＣ ＡＧＧ−３′（配列番号２９）を用いて生成し
た。すべての場合に、これらの又は他のインフルエンザ
単離物からのクローン化し配列解析した遺伝子に関して
は、ＧＥＮＢＡＮＫからの公知の配列と照合した。接合
が起きる位置を“／”で区分したが、ここで配列が切れ
ているわけではない。Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＴＸ−ＨＡ接合の
場合、シーケンシングゲルが圧縮され、初期配列を読み
取るのは難しかった。したがって、この接合部の最初の
８塩基を“Ｎ”とした。これらのヌクレオチドは後に確
認し、同定ヌクレオチドが表示されている。各配列に含
まれる最初の“ＡＴＧ”はそれぞれのクローン化遺伝子
に関する翻訳開始コドンである。表示した各配列は指定
のインフルエンザ遺伝子に関する完全な、利用可能且つ
発現可能なＤＮＡ構築物を表す。これらの構築物に対す
る呼称は慣用的に以下のように示す：“ベクター名−イ
ンフルエンザ株−遺伝子”。これらの構築物の各々の生
理活性を、上記の実施例２、３及び４と同様に実証し
た。
【００９４】異なるインフルエンザ株及びタンパク質を
用いての、ＣＭＶｉｎｔＡ及びインフルエンザ遺伝子の
５′接合部、並びにインフルエンザ遣伝子及びＢＧＨタ
ーミネーター発現構築物との３′接合部配列： 実施例９ インフルエンザ遺伝子の皮内注射 ： 遺伝子の皮内導入のための手法は筋注の場合と同様で、
Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ ２００μｇを３週間おきに３回注射
した。３回目の注射後５５日目にｉｎ ｖｉｔｒｏ検定
のために脾臓を採取し、ノナペプチド核タンパク質エピ
トープ１４７−１５５（配列番号９）で再刺激した。標
的細胞（Ｐ８１５細胞、マウス肥満細胞腫、ＢＡＬＢ／
ｃマウス Ｈ−２ｄと同系のもの）を異種ウイルスＡ／
Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３に感染させて、５：１〜４０：
１の範囲のエフェクター：標的比でエフェクターとして
脾細胞を用いて特異的溶解を施した。陰性対照には、イ
ンフルエンザウイルスに感染していない標的細胞の溶解
を測定した。陽性対照には、Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ １３０
μｇを３回注射し、Ａ／ＨＫ／６８による生インフルエ
ンザウイルス感染を生き抜いたマウスから得た脾細胞に
よるインフルエンザウイルス感染標的細胞の溶解を測定
した。
用いての、ＣＭＶｉｎｔＡ及びインフルエンザ遺伝子の
５′接合部、並びにインフルエンザ遣伝子及びＢＧＨタ
ーミネーター発現構築物との３′接合部配列： 実施例９ インフルエンザ遺伝子の皮内注射 ： 遺伝子の皮内導入のための手法は筋注の場合と同様で、
Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ ２００μｇを３週間おきに３回注射
した。３回目の注射後５５日目にｉｎ ｖｉｔｒｏ検定
のために脾臓を採取し、ノナペプチド核タンパク質エピ
トープ１４７−１５５（配列番号９）で再刺激した。標
的細胞（Ｐ８１５細胞、マウス肥満細胞腫、ＢＡＬＢ／
ｃマウス Ｈ−２ｄと同系のもの）を異種ウイルスＡ／
Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３に感染させて、５：１〜４０：
１の範囲のエフェクター：標的比でエフェクターとして
脾細胞を用いて特異的溶解を施した。陰性対照には、イ
ンフルエンザウイルスに感染していない標的細胞の溶解
を測定した。陽性対照には、Ｖ１−ＰＲ−ＮＰ １３０
μｇを３回注射し、Ａ／ＨＫ／６８による生インフルエ
ンザウイルス感染を生き抜いたマウスから得た脾細胞に
よるインフルエンザウイルス感染標的細胞の溶解を測定
した。
【００９５】結果：全エフェクター：標的比での皮内注
射マウスからの脾細胞を用いて特異的溶解を達成した。
非注射マウス又は挿入ＰＲ−ＮＰ遺伝子を含有しないベ
クターＶ１を注射したマウスから得た脾細胞をエフェク
ター細胞として用いた場合は、特異的溶解は認められな
かった。さらに、皮内供給を用いて達成した特異的溶解
は、全エフェクター：標的比で筋注により得た結果に匹
敵した。インフルエンザウイルス肺力価も皮内注射又は
筋注マウスで測定した。各群５匹のマウスを用い、３×
２００μｇの用量で３週間おきに投与し、そして最終投
与後３週目に誘発した結果を以下に示す：
射マウスからの脾細胞を用いて特異的溶解を達成した。
非注射マウス又は挿入ＰＲ−ＮＰ遺伝子を含有しないベ
クターＶ１を注射したマウスから得た脾細胞をエフェク
ター細胞として用いた場合は、特異的溶解は認められな
かった。さらに、皮内供給を用いて達成した特異的溶解
は、全エフェクター：標的比で筋注により得た結果に匹
敵した。インフルエンザウイルス肺力価も皮内注射又は
筋注マウスで測定した。各群５匹のマウスを用い、３×
２００μｇの用量で３週間おきに投与し、そして最終投
与後３週目に誘発した結果を以下に示す：
【００９６】最後に、マウスの生存率（％）を２８日ま
で試験した。２８日目に、Ｖ１−ＮＰ−ＰＲを投与した
マウスのうち、筋注受容者の８９％、皮内受容者の５０
％が生存した。Ｖ１ベクターのものはまったく生存せ
ず、非処理マウスは３０％だけが生存した。この実験
は、Ａ／ＰＲ／８／３４株からの核タンパク質をコード
するＤＮＡが、それとは異種株のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ
／７３からの核タンパク質を認識するＣＴＬ及び異種株
Ａ／ＨＫ／６８に対する防御免疫反応を誘発し得たこと
を実証する。
で試験した。２８日目に、Ｖ１−ＮＰ−ＰＲを投与した
マウスのうち、筋注受容者の８９％、皮内受容者の５０
％が生存した。Ｖ１ベクターのものはまったく生存せ
ず、非処理マウスは３０％だけが生存した。この実験
は、Ａ／ＰＲ／８／３４株からの核タンパク質をコード
するＤＮＡが、それとは異種株のＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ
／７３からの核タンパク質を認識するＣＴＬ及び異種株
Ａ／ＨＫ／６８に対する防御免疫反応を誘発し得たこと
を実証する。
【００９７】実施例１０ 霊長類におけるポリヌクレオチドワクチン接種 １．アカゲザルにおけるＮＰに対する抗体：アカゲザル
（００６ ＮＰ、００９ＮＰ又は対照１０１；０２１）
に１ｍｇ／部位のＲＳＶ−ＮＰを１日目に３部位に筋注
した。各々１ｍｇのＲＳＶ−ＬＵＸ及びＣＭＶ−ｉｎｔ
ＬＵＸ（リポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ発現に
関する構築物）を同時に別々の部位に注射した。１５日
目に動物に、以前と同量のＤＮＡと、並びに１ｍｇのｐ
Ｄ５−ＣＡＴ（リポーター遺伝子クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ発現に関する構築物）を各
々の部位に再注射した。リポーター遺伝子を含有する筋
肉部位を生検し、リポーター遺伝子活性に関して検定し
た。最初の注射後３、５、９、１１、１３及び１５週目
に血清を採集した。抗ＮＰ抗体に関する陽性標本は１１
週目に初めて採集され、さらに陽性標本を１３及び１５
週目にも採集した。抗ＮＰ抗体は、ＥＬＩＳＡにより定
量した。結果を図９に示す。
（００６ ＮＰ、００９ＮＰ又は対照１０１；０２１）
に１ｍｇ／部位のＲＳＶ−ＮＰを１日目に３部位に筋注
した。各々１ｍｇのＲＳＶ−ＬＵＸ及びＣＭＶ−ｉｎｔ
ＬＵＸ（リポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ発現に
関する構築物）を同時に別々の部位に注射した。１５日
目に動物に、以前と同量のＤＮＡと、並びに１ｍｇのｐ
Ｄ５−ＣＡＴ（リポーター遺伝子クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ発現に関する構築物）を各
々の部位に再注射した。リポーター遺伝子を含有する筋
肉部位を生検し、リポーター遺伝子活性に関して検定し
た。最初の注射後３、５、９、１１、１３及び１５週目
に血清を採集した。抗ＮＰ抗体に関する陽性標本は１１
週目に初めて採集され、さらに陽性標本を１３及び１５
週目にも採集した。抗ＮＰ抗体は、ＥＬＩＳＡにより定
量した。結果を図９に示す。
【００９８】２．アカゲザルにおけるヘマグルチニン抑
制（ＨＩ）抗体：１日目にサルにＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡを
筋注した。２匹の動物の各四頭筋に各々１ｍｇ、１００
μｇ又は１０μｇのＤＮＡを投与した。注射は各々０．
５ｍｌの容量で投与した。１日目の注射の前に動物を採
血した。１５日目に全動物にＤＮＡを再注射して、その
後２〜４週間おいて血液を採集した。Ａ／ＰＲ／８／３
４に対するヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価は、Ｖ１Ｊ
−ＰＲ−ＨＡ ＤＮＡの最初の注射後５、９及び１２週
目に陽性となった。結果を表１０−Ｉに示す。
制（ＨＩ）抗体：１日目にサルにＶ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡを
筋注した。２匹の動物の各四頭筋に各々１ｍｇ、１００
μｇ又は１０μｇのＤＮＡを投与した。注射は各々０．
５ｍｌの容量で投与した。１日目の注射の前に動物を採
血した。１５日目に全動物にＤＮＡを再注射して、その
後２〜４週間おいて血液を採集した。Ａ／ＰＲ／８／３
４に対するヘマグルチニン抑制（ＨＩ）力価は、Ｖ１Ｊ
−ＰＲ−ＨＡ ＤＮＡの最初の注射後５、９及び１２週
目に陽性となった。結果を表１０−Ｉに示す。
【００９９】表 １０−Ｉ Ｖ１Ｊ−ＰＲ−ＨＡ ＤＮＡ投与アカゲザルのＨＩ抗体
力価
力価
【０１００】
【表２】 実施例１１ フェレットにおけるポリヌクレオチドワクチン試験 １．ＨＡ（株特異性中和抗体を誘発し得る表面タンパク
質）又は内部タンパク質ＮＰ、ＮＳ１、ＰＢ１、Ｍ（株
非依存性である細胞媒介免疫反応を誘発すると考えられ
る）をコードする遺伝子で免疫化することにより、イン
フルエンザＡ感染から動物が防御されるか否かを調べる
ために、フェレットにおけるポリヌクレオチドワクチン
接種の試験を開始した。下記のように、われわれのＶ１
Ｊ−ベクター中の種々のインフルエンザ遺伝子をコード
するＤＮＡを動物に注射した：表 １１−Ｉ
質）又は内部タンパク質ＮＰ、ＮＳ１、ＰＢ１、Ｍ（株
非依存性である細胞媒介免疫反応を誘発すると考えられ
る）をコードする遺伝子で免疫化することにより、イン
フルエンザＡ感染から動物が防御されるか否かを調べる
ために、フェレットにおけるポリヌクレオチドワクチン
接種の試験を開始した。下記のように、われわれのＶ１
Ｊ−ベクター中の種々のインフルエンザ遺伝子をコード
するＤＮＡを動物に注射した：表 １１−Ｉ
【０１０１】
【表３】 ２．免疫化後２２日目及び４３日目に、免疫化動物から
血清を採集し、中和（ヘマグルチニン抑制−ＨＩ）抗体
及び核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体に関して、ＥＬ
ＩＳＡにより検定した。ＤＮＡを投与した動物は、対応
する遺伝子に対する抗体を発現していた。これらを添付
の図１０、１１及び１６に示す。
血清を採集し、中和（ヘマグルチニン抑制−ＨＩ）抗体
及び核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体に関して、ＥＬ
ＩＳＡにより検定した。ＤＮＡを投与した動物は、対応
する遺伝子に対する抗体を発現していた。これらを添付
の図１０、１１及び１６に示す。
【０１０２】３．１２８日目に、選択免疫化動物に１２
００ＴＣＩＤ５０のインフルエンザＡ／ＨＫ／６８によ
る誘発を施した。この株は、免疫化するために用いるコ
ード配列の供給源であるＡ／ＰＲ／８／３４株に対して
異種であって、したがって防御は細胞媒介株非依存性免
疫機序を基礎にした免疫を示す。添付の図１２に示すよ
うに、対照と比較した場合のウイルス脱落の統計的に有
意の低減は内部タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化
した動物に認められ、このことはフェレットにおけるポ
リヌクレオチド免疫化が免疫反応を引き出し得、このよ
うな反応は防御的であることを実証する。
００ＴＣＩＤ５０のインフルエンザＡ／ＨＫ／６８によ
る誘発を施した。この株は、免疫化するために用いるコ
ード配列の供給源であるＡ／ＰＲ／８／３４株に対して
異種であって、したがって防御は細胞媒介株非依存性免
疫機序を基礎にした免疫を示す。添付の図１２に示すよ
うに、対照と比較した場合のウイルス脱落の統計的に有
意の低減は内部タンパク質をコードするＤＮＡで免疫化
した動物に認められ、このことはフェレットにおけるポ
リヌクレオチド免疫化が免疫反応を引き出し得、このよ
うな反応は防御的であることを実証する。
【０１０３】４．Ａ／ＰＲ／８／３４を用いた同種誘発
を同様に実施し、ポリヌクレオチドワクチン接種により
誘発される中和抗体の防御効力を同様に実証する。
を同様に実施し、ポリヌクレオチドワクチン接種により
誘発される中和抗体の防御効力を同様に実証する。
【０１０４】実施例１２ Ｖ１Ｊｎｓの取得 組込み研究を可能にするために、Ｓｆｉｌ部位をＶ１Ｊ
ｎｅｏに付加した。市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）をベクタ
ーのＢＧＨ配列内のＫｐｎｌ部位に付加した。Ｖ１Ｊｎ
ｅｏをＫｐｎＩで線状にし、ゲル精製して、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼにより盲端化し、盲端ＳｆｉＩリンカー
に結紮した。制限マッピングによりクローン性単離物を
選択し、リンカー部分の配列解析で確認した。新規のベ
クターをＶ１Ｊｎｓと呼ぶ（図１７）。Ｖ１Ｊｎｓ（Ｓ
ｆｉＩを有する）における異種遺伝子の発現は、Ｖ１Ｊ
ｎｅｏ（ＫｐｎＩを有する）における同一遣伝子の発現
に匹敵した。
ｎｅｏに付加した。市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）をベクタ
ーのＢＧＨ配列内のＫｐｎｌ部位に付加した。Ｖ１Ｊｎ
ｅｏをＫｐｎＩで線状にし、ゲル精製して、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼにより盲端化し、盲端ＳｆｉＩリンカー
に結紮した。制限マッピングによりクローン性単離物を
選択し、リンカー部分の配列解析で確認した。新規のベ
クターをＶ１Ｊｎｓと呼ぶ（図１７）。Ｖ１Ｊｎｓ（Ｓ
ｆｉＩを有する）における異種遺伝子の発現は、Ｖ１Ｊ
ｎｅｏ（ＫｐｎＩを有する）における同一遣伝子の発現
に匹敵した。
【０１０５】実施例１３ 免疫原性 １．体液性免疫反応 インフルエンザＨＡ、ＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡ
の注入は、マウス、フェレット又は非ヒト霊長類（アフ
リカミドリザル及びアカゲザルを含む）において、体液
性免疫反応を引き起こした。今日までのところ、インフ
ルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ｂ／Ｐａｎａｍａ
／９０、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／
９１、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３株からクローン化したＨＡ遺伝子を含有するＰＮ
Ｖは、抗体を生成することが示された。
の注入は、マウス、フェレット又は非ヒト霊長類（アフ
リカミドリザル及びアカゲザルを含む）において、体液
性免疫反応を引き起こした。今日までのところ、インフ
ルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ｂ／Ｐａｎａｍａ
／９０、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ／Ｔｅｘａｓ／
９１、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３株からクローン化したＨＡ遺伝子を含有するＰＮ
Ｖは、抗体を生成することが示された。
【０１０６】ａ）マウス：ＮＰ及びＭ１に対する抗体
を、ＤＮＡ注射後のマウスからの血清中でＥＬＩＳＡに
より検出した。抗体力価の相当な値（１０４〜１０６）
が、１μｇという少ないＮＰ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３
４）を１回投与（試験最小用量）でも生じ、注射後２週
間という早さ（試験最短時間）で生じ、注射後少なくと
も６か月間は低減しなかった。これらのＮＰ抗体は中和
を示さず、防御に関与しなかった。しかしながら、それ
らはＤＮＡ注射後のｉｎ ｖｉｖｏでのＮＰタンパク質
発現をもたらす。これに対比して、ＨＡに対する抗体
は、インフルエンザウイルスの同種株に対する防御免疫
を提供する。Ａ／ＰＲ／３４株からクローン化したＨＡ
ＤＮＡを注入すると、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）検
定によりｉｎＶｉｔｒｏで測定されたところによると、
中和抗体の産生が起こる。ＨＩ力価≧１２８０は、１０
０μｇのＨＡ ＤＮＡを３回投与したマウスの多数で測
定され、検出可能な力価は０．１μｇの２回投与といっ
た少量投与動物でも何匹かに観察された。ＨＩ力価とＤ
ＮＡ用量との間、並びにＨＩ力価と注入回数との間に用
量−反応関係が認められた（表１３−Ｉ）： 表 １３−Ｉ マウスにおける体液性免疫反応の発生
を、ＤＮＡ注射後のマウスからの血清中でＥＬＩＳＡに
より検出した。抗体力価の相当な値（１０４〜１０６）
が、１μｇという少ないＮＰ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３
４）を１回投与（試験最小用量）でも生じ、注射後２週
間という早さ（試験最短時間）で生じ、注射後少なくと
も６か月間は低減しなかった。これらのＮＰ抗体は中和
を示さず、防御に関与しなかった。しかしながら、それ
らはＤＮＡ注射後のｉｎ ｖｉｖｏでのＮＰタンパク質
発現をもたらす。これに対比して、ＨＡに対する抗体
は、インフルエンザウイルスの同種株に対する防御免疫
を提供する。Ａ／ＰＲ／３４株からクローン化したＨＡ
ＤＮＡを注入すると、ヘマグルチニン抑制（ＨＩ）検
定によりｉｎＶｉｔｒｏで測定されたところによると、
中和抗体の産生が起こる。ＨＩ力価≧１２８０は、１０
０μｇのＨＡ ＤＮＡを３回投与したマウスの多数で測
定され、検出可能な力価は０．１μｇの２回投与といっ
た少量投与動物でも何匹かに観察された。ＨＩ力価とＤ
ＮＡ用量との間、並びにＨＩ力価と注入回数との間に用
量−反応関係が認められた（表１３−Ｉ）： 表 １３−Ｉ マウスにおける体液性免疫反応の発生
【０１０７】
【表４】 表１３−Ｉ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）にＡ
／ＰＲ／３４ ＨＡＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おき
に指定用量で１、２又は３回注射した。陰性対照には、
遺伝子挿入物を含有しないベクター（Ｖ１Ｊ）から成る
対照ＤＮＡを注射したマウス、及び未使用非注射マウス
が含まれた。投与後７週目に血清標本を採集し、ヘマグ
ルチニン抑制（ＨＩ）抗体の存在に関して分析した。デ
ータはゲノム平均ＨＩ力価（ｎ＝１０）で表す。
／ＰＲ／３４ ＨＡＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おき
に指定用量で１、２又は３回注射した。陰性対照には、
遺伝子挿入物を含有しないベクター（Ｖ１Ｊ）から成る
対照ＤＮＡを注射したマウス、及び未使用非注射マウス
が含まれた。投与後７週目に血清標本を採集し、ヘマグ
ルチニン抑制（ＨＩ）抗体の存在に関して分析した。デ
ータはゲノム平均ＨＩ力価（ｎ＝１０）で表す。
【０１０８】ａＨＩ力価に対して陽性の試験マウスが一
部あった。
部あった。
【０１０９】ｂ全マウス。
【０１１０】試験したすべてのマウスにおいて、ＨＩ抗
体の存在は同種誘発モデルにおける防御と相関した。Ｈ
Ａ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を注射したマウスにおけ
るＨＩ抗体反応は、少なくとも６か月間は事実上変わら
ぬままであった。ＨＡ抗体は、ＥＬＩＳＡで測定される
ように、インフルエンザウイルスのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／
９１株からのＨＡ ＤＮＡを用いてマウスにおいて生成
された。
体の存在は同種誘発モデルにおける防御と相関した。Ｈ
Ａ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を注射したマウスにおけ
るＨＩ抗体反応は、少なくとも６か月間は事実上変わら
ぬままであった。ＨＡ抗体は、ＥＬＩＳＡで測定される
ように、インフルエンザウイルスのＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／
９１株からのＨＡ ＤＮＡを用いてマウスにおいて生成
された。
【０１１１】ＤＮＡ注入後の老齢マウスにおける低リポ
ーター遺伝子発現を示した文献の報告に基づいて、ＨＡ
に対する体液性免疫反応に及ぼす年齢の影響を調べた。
老齢処女雌マウスが入手できないために、約１０か月齢
の引退した繁殖用動物を用いた。引退繁殖用動物及び４
〜６週齢処女マウスを、ＨＡに対する抗体を生成するそ
の能力に関して比較した。老齢マウスは、若年マウスよ
り低い力価にもかかわらず、１μｇ（試験最低用量）と
いう低用量でのＨＡ ＤＮＡ注射後にもＨＡ抗体を生成
した（表１３−ＩＩ）。
ーター遺伝子発現を示した文献の報告に基づいて、ＨＡ
に対する体液性免疫反応に及ぼす年齢の影響を調べた。
老齢処女雌マウスが入手できないために、約１０か月齢
の引退した繁殖用動物を用いた。引退繁殖用動物及び４
〜６週齢処女マウスを、ＨＡに対する抗体を生成するそ
の能力に関して比較した。老齢マウスは、若年マウスよ
り低い力価にもかかわらず、１μｇ（試験最低用量）と
いう低用量でのＨＡ ＤＮＡ注射後にもＨＡ抗体を生成
した（表１３−ＩＩ）。
【０１１２】表 １３−ＩＩ 体液性免疫反応に及ぼす年齢の影響
【０１１３】
【表５】 表１３−ＩＩ：雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢処女
及び１０か月齢引退繁殖用動物）にＡ／ＰＲ／３４ Ｈ
Ａ ＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おきに指定用量で３
回注射した。陰性対照には、対照ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ）を注
射したマウス、及び未使用非注射マウスが含まれた。比
較のために、他のマウスに亜致死量のインフルエンザＡ
／ＰＲ／３４を注入した。投与後９週目に血清標本を採
集し、ＨＩ力価に関して分析した。データはゲノム平均
ＨＩ力価（ｎ＝１５）で表す。
及び１０か月齢引退繁殖用動物）にＡ／ＰＲ／３４ Ｈ
Ａ ＤＮＡ（Ｖ１ＪＨＡ）を３週間おきに指定用量で３
回注射した。陰性対照には、対照ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ）を注
射したマウス、及び未使用非注射マウスが含まれた。比
較のために、他のマウスに亜致死量のインフルエンザＡ
／ＰＲ／３４を注入した。投与後９週目に血清標本を採
集し、ＨＩ力価に関して分析した。データはゲノム平均
ＨＩ力価（ｎ＝１５）で表す。
【０１１４】ａＨＩ力価に対して全試験マウスが陰性だ
った。
った。
【０１１５】しかしながら、これはＰＮＶそれ自体の結
果ではなく、むしろ生Ａ／ＰＲ／３４ウイルスに感染後
に老齢マウスは概して若年マウスよりも低いＨＩ反応を
示すという、体液性免疫反応を生成する老齢マウスの能
力の低下の結果であった。実際、ＨＩ抗体はＤＮＡ接種
老齢マウスにおいてはインフルエンザ感染老齢マウスよ
りＨＩ抗体の抑制度は低いと思われた。さらに、本試験
に用いた引退繁殖用動物は、同一年齢の典型的処女より
約５０％重かったが、このことはマウスにおけるカロリ
ー制限餌を用いた他の研究者の研究に基づけば、これら
の動物の免疫反応に不利益な作用を及ぼし得た。このそ
して他の理由により、これらのマウスの免疫反応は代表
的なものとはいえない。にもかかわらず、年齢（少なく
とも１０か月まで）によっては、１μｇという低用量に
おいてさえ、体液性免疫反応を誘発するポリヌクレオチ
ドワクチン接種の能力が有意に低減したとは思えない。
果ではなく、むしろ生Ａ／ＰＲ／３４ウイルスに感染後
に老齢マウスは概して若年マウスよりも低いＨＩ反応を
示すという、体液性免疫反応を生成する老齢マウスの能
力の低下の結果であった。実際、ＨＩ抗体はＤＮＡ接種
老齢マウスにおいてはインフルエンザ感染老齢マウスよ
りＨＩ抗体の抑制度は低いと思われた。さらに、本試験
に用いた引退繁殖用動物は、同一年齢の典型的処女より
約５０％重かったが、このことはマウスにおけるカロリ
ー制限餌を用いた他の研究者の研究に基づけば、これら
の動物の免疫反応に不利益な作用を及ぼし得た。このそ
して他の理由により、これらのマウスの免疫反応は代表
的なものとはいえない。にもかかわらず、年齢（少なく
とも１０か月まで）によっては、１μｇという低用量に
おいてさえ、体液性免疫反応を誘発するポリヌクレオチ
ドワクチン接種の能力が有意に低減したとは思えない。
【０１１６】ｂ）フェレット：体液性免疫反応は、イン
フルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／８９、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒ
ｇｉａ／９３株からのＨＡ ＤＮＡを注射したフェレッ
トにおいて生じた。Ａ／ＰＲ／３４に対するＨＩ抗体及
び他の株からのＨＡに対するＥＬＩＳＡ抗体を適切なＰ
ＮＶにより引き出した。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ
／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３
ＨＡ ＤＮＡを注射したフェレットからの血清は、これ
らの動物がウイルス誘発から防御されたため、ＨＩ抗体
及び中和抗体を有することが判明している。
フルエンザウイルスのＡ／ＰＲ／３４、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／８９、Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒ
ｇｉａ／９３株からのＨＡ ＤＮＡを注射したフェレッ
トにおいて生じた。Ａ／ＰＲ／３４に対するＨＩ抗体及
び他の株からのＨＡに対するＥＬＩＳＡ抗体を適切なＰ
ＮＶにより引き出した。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９、Ａ
／Ｈａｗａｉｉ／９１及びＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３
ＨＡ ＤＮＡを注射したフェレットからの血清は、これ
らの動物がウイルス誘発から防御されたため、ＨＩ抗体
及び中和抗体を有することが判明している。
【０１１７】ｃ）非ヒト霊長類：（上記実施例１０も参
照）。１０、１００及び１０００μｇ／足の用量でＨＡ
ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を２回用いてアカゲザルを
免疫化した。３２０に及ぶＨＩ力価が、１００又は１０
００μｇ用量を投与した動物において測定されたが、２
匹の１０μｇ投与サルのうちの１匹はＨＩ力価が８０で
あった。今までのところ、１３か月まで血清を検定し
た。ＨＩ力価は６〜１３か月では検出できるほどは低減
しなかった（表１３−ＩＩＩ）： 表 １３−ＩＩＩ アカゲザルにおけるＨＩ抗体の生成
照）。１０、１００及び１０００μｇ／足の用量でＨＡ
ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）を２回用いてアカゲザルを
免疫化した。３２０に及ぶＨＩ力価が、１００又は１０
００μｇ用量を投与した動物において測定されたが、２
匹の１０μｇ投与サルのうちの１匹はＨＩ力価が８０で
あった。今までのところ、１３か月まで血清を検定し
た。ＨＩ力価は６〜１３か月では検出できるほどは低減
しなかった（表１３−ＩＩＩ）： 表 １３−ＩＩＩ アカゲザルにおけるＨＩ抗体の生成
【０１１８】
【表６】
【０１１９】表１３−ＩＩＩ：体重４．３〜８．８ｋｇ
の大きさのアカゲザル（雌雄）にＡ／ＰＲ／３４ ＨＡ
ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ ＨＡ）を指定用量で０及び２週目に
注入した。血清標本は投与後の指定時間に採取し、ＨＩ
力価に関して分析した。データは個々の動物に関するＨ
Ｉ力価を表す。
の大きさのアカゲザル（雌雄）にＡ／ＰＲ／３４ ＨＡ
ＤＮＡ（Ｖ１Ｊ ＨＡ）を指定用量で０及び２週目に
注入した。血清標本は投与後の指定時間に採取し、ＨＩ
力価に関して分析した。データは個々の動物に関するＨ
Ｉ力価を表す。
【０１２０】ＨＡ ＤＮＡ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８
９）１００μｇを含有する組合せＰＮＶを注射したアフ
リカミドリザルにおいて、１回投与後４〜６週目の血清
の評価は２９というＧＭＴを示した（８／９感応）。こ
れは、同時点での認可サブビリオンワクチン（ＧＭＴ＝
１６，５／６感応）及び認可全ビリオンワクチン（ＧＭ
Ｔ＝３６，６／６感応）に対する反応よりも優れている
（図１８）。二次免疫化すると顕著な効力増強の起こる
ことが、１０μｇ用量のＨＡ ＤＮＡ投与動物で観察さ
れた（１回投与後のＧＭＴ＝１．９，２回投与後＝１９
９）。認可全ビリオンワクチンでは同様の効力増強を示
したが、一方サブビリオンワクチンの二次投与では生成
したＨＩ力価は一過性に過ぎなかった。今までのとこ
ろ、同様レベルのＨＩ抗体は、最良認可ワクチン（全ビ
リオン）と比較して、１０μｇ及び１００μｇ用量のＨ
Ａ ＤＮＡで免疫化した動物において１８週までに測定
されている。これらの結果は、ＰＮＶが、全ビリオンワ
クチンと少なくとも同様にそしてサブビリオンワクチン
を上回って、中和抗体生成に際して有効であることを示
す。精製サブユニットワクチンは、マウスにおいて検出
可能な免疫原性を示さなかった。したがって、非ヒト霊
長類ではそれらを試験しなかった。本試験では、候補ワ
クチンに似せて、ＰＮＶは、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８
９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／９１
からのＨＡ、並びにＡ／ＰＲ／３４からのＮＰ及びＭ１
をコードするＤＮＡの５価のカクテルを含有した。ワク
チンの他の成分に対する体液性免疫反応の発生に関して
これらの動物をさらにわれわれは調べ、Ｂ／Ｐａｎａｍ
ａ／９０ ＨＡ及びＡ／ＰＲ／３４ ＮＰに対する抗体
を検出した。別々の実験において、Ａ／Ｔｅｘａｓ／９
１に対するＨＩ及び中和抗体はともにＰＣＲクローン化
ＨＡ ＤＮＡの２回投与により誘発した。
９）１００μｇを含有する組合せＰＮＶを注射したアフ
リカミドリザルにおいて、１回投与後４〜６週目の血清
の評価は２９というＧＭＴを示した（８／９感応）。こ
れは、同時点での認可サブビリオンワクチン（ＧＭＴ＝
１６，５／６感応）及び認可全ビリオンワクチン（ＧＭ
Ｔ＝３６，６／６感応）に対する反応よりも優れている
（図１８）。二次免疫化すると顕著な効力増強の起こる
ことが、１０μｇ用量のＨＡ ＤＮＡ投与動物で観察さ
れた（１回投与後のＧＭＴ＝１．９，２回投与後＝１９
９）。認可全ビリオンワクチンでは同様の効力増強を示
したが、一方サブビリオンワクチンの二次投与では生成
したＨＩ力価は一過性に過ぎなかった。今までのとこ
ろ、同様レベルのＨＩ抗体は、最良認可ワクチン（全ビ
リオン）と比較して、１０μｇ及び１００μｇ用量のＨ
Ａ ＤＮＡで免疫化した動物において１８週までに測定
されている。これらの結果は、ＰＮＶが、全ビリオンワ
クチンと少なくとも同様にそしてサブビリオンワクチン
を上回って、中和抗体生成に際して有効であることを示
す。精製サブユニットワクチンは、マウスにおいて検出
可能な免疫原性を示さなかった。したがって、非ヒト霊
長類ではそれらを試験しなかった。本試験では、候補ワ
クチンに似せて、ＰＮＶは、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８
９、Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０及びＡ／Ｔｅｘａｓ／９１
からのＨＡ、並びにＡ／ＰＲ／３４からのＮＰ及びＭ１
をコードするＤＮＡの５価のカクテルを含有した。ワク
チンの他の成分に対する体液性免疫反応の発生に関して
これらの動物をさらにわれわれは調べ、Ｂ／Ｐａｎａｍ
ａ／９０ ＨＡ及びＡ／ＰＲ／３４ ＮＰに対する抗体
を検出した。別々の実験において、Ａ／Ｔｅｘａｓ／９
１に対するＨＩ及び中和抗体はともにＰＣＲクローン化
ＨＡ ＤＮＡの２回投与により誘発した。
【０１２１】２．細胞媒介免疫反応 上記実施例３参照。
【０１２２】３．免疫反応の生成 ａ）体液性免疫：ＤＮＡ注入後に体液性及び細胞媒介免
疫反応の発生が起こる現象は、まだ解明されていない。
中和抗体（例えばインフルエンザウイルスＨＡに対す
る）を生成するためには、細胞は形質膜上で抗原を発現
するか又はそれを細胞外環境に分泌しなければならな
い。さらに、トランスフェクト化細胞は、ビリオンの場
合のそれと同様の二次、三次及び四次構造を有するＨＡ
を発現する必要がある。ロゼット検定においては、ＨＡ
の細胞表面発現は、ＨＡ ＤＮＡで一時的にトランスフ
ェクト化したＲＤ細胞（横紋筋肉腫；筋原細胞起源）で
実証された。赤血球はＨＡトランスフェクト化細胞の表
面に凝集し、疑似トランスフェクト化細胞には凝集しな
かったが、これはＨＡが表面上で発現されただけでな
く、シアル酸含有タンパク質と結合するための適正な形
状を有していたことを示す。
疫反応の発生が起こる現象は、まだ解明されていない。
中和抗体（例えばインフルエンザウイルスＨＡに対す
る）を生成するためには、細胞は形質膜上で抗原を発現
するか又はそれを細胞外環境に分泌しなければならな
い。さらに、トランスフェクト化細胞は、ビリオンの場
合のそれと同様の二次、三次及び四次構造を有するＨＡ
を発現する必要がある。ロゼット検定においては、ＨＡ
の細胞表面発現は、ＨＡ ＤＮＡで一時的にトランスフ
ェクト化したＲＤ細胞（横紋筋肉腫；筋原細胞起源）で
実証された。赤血球はＨＡトランスフェクト化細胞の表
面に凝集し、疑似トランスフェクト化細胞には凝集しな
かったが、これはＨＡが表面上で発現されただけでな
く、シアル酸含有タンパク質と結合するための適正な形
状を有していたことを示す。
【０１２３】ｂ）細胞媒介免疫：細胞媒介免疫反応（例
えば、インフルエンザウイルスＮＰに対する）の発生に
は、Ｉ種ＭＨＣと会合してそこから得られるペプチドの
予防的プロセッシング及び提示を要する。ＤＮＡ注入後
に免疫反応を発生させる抗原提示細胞の性質はまだ分か
っていない。筋細胞は低レベルのＩ種ＭＨＣしか発現せ
ず、その表面に同時刺激分子を発現するとは考えられな
い。したがって、筋細胞は一般に、抗原提示細胞ではな
いと考えられる。しかしながら、数種類の証拠は、筋細
胞がＤＮＡ筋注後の免疫反応の発生に関与していること
を示唆する。先ず、ｉｎ ｓｉｔｕでのタンパク質発現
を引き起こす裸プラスミドＤＮＡを内在化し得る組織の
限定調査は、プラスミドを直接組織中に注入すると多数
の細胞型がリポーター遺伝子を発現し得るが、しかし実
質的には筋細胞より効力が低いことを示した。筋注後の
非筋細胞によるＤＮＡの取り込みの完全分析はまだ報告
されていないが、しかし取り込みはさらに低効率である
と思われる。第二に、ＤＮＡ筋注後のリポーター遺伝子
の発現は、多数の異なる種の骨格筋及び心筋で示され
た。第三に、ＣＴＬ反応は他の経路（静注及び皮内注
射）によってもＤＮＡ注入後に発生し得るが、しかしマ
ウスにおける最良の免疫反応はＤＮＡ筋注後に引き出さ
れた。第四に、筋原細胞及び筋細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ
でＣＴＬに認識され、溶解され、この溶解はＩ種ＭＨＣ
発現を向上させるγ−インターフェロンで前処理するこ
とにより増強し得る。最後に、安定トランスフェクト化
ＮＰ発現筋原細胞を未使用同系マウスに移植すると、防
御的細胞媒介免疫反応がｉｎ ｖｉｖｏで引き起こされ
る（図２０）。したがって、筋細胞による抗原の発現
は、ＤＮＡ注入後に観察される防御的免疫反応を誘発す
るのに十分である。さらに、非筋細胞によるＤＮＡの取
り込み及び発現は、防御免疫の生成を引き起こすのに必
要でないかも知れない。ワクチンとしてのポリヌクレオ
チドの見地から、ＤＮＡ取り込みを筋細胞に限定するの
は有益である可能性がある。第一に、筋細胞は最終的に
弁別され、分裂しない。これはプラスミドＤＮＡが染色
体ＤＮＡと一体化する可能性を低減し、抗原の永続的発
現を保持するのに重要であって、これにより長期免疫反
応が生じ得る。第二に、筋細胞は、筋原細胞の融合によ
り再生し得る大型多核細胞である。これはＤＮＡ注入が
なぜ、ＣＴＬによる細胞溶解的分解の証拠がなくてもお
そらくは長期間存続し得るタンパク質発現を引き起こす
のかを説明するのに役立つものと思われる。
えば、インフルエンザウイルスＮＰに対する）の発生に
は、Ｉ種ＭＨＣと会合してそこから得られるペプチドの
予防的プロセッシング及び提示を要する。ＤＮＡ注入後
に免疫反応を発生させる抗原提示細胞の性質はまだ分か
っていない。筋細胞は低レベルのＩ種ＭＨＣしか発現せ
ず、その表面に同時刺激分子を発現するとは考えられな
い。したがって、筋細胞は一般に、抗原提示細胞ではな
いと考えられる。しかしながら、数種類の証拠は、筋細
胞がＤＮＡ筋注後の免疫反応の発生に関与していること
を示唆する。先ず、ｉｎ ｓｉｔｕでのタンパク質発現
を引き起こす裸プラスミドＤＮＡを内在化し得る組織の
限定調査は、プラスミドを直接組織中に注入すると多数
の細胞型がリポーター遺伝子を発現し得るが、しかし実
質的には筋細胞より効力が低いことを示した。筋注後の
非筋細胞によるＤＮＡの取り込みの完全分析はまだ報告
されていないが、しかし取り込みはさらに低効率である
と思われる。第二に、ＤＮＡ筋注後のリポーター遺伝子
の発現は、多数の異なる種の骨格筋及び心筋で示され
た。第三に、ＣＴＬ反応は他の経路（静注及び皮内注
射）によってもＤＮＡ注入後に発生し得るが、しかしマ
ウスにおける最良の免疫反応はＤＮＡ筋注後に引き出さ
れた。第四に、筋原細胞及び筋細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ
でＣＴＬに認識され、溶解され、この溶解はＩ種ＭＨＣ
発現を向上させるγ−インターフェロンで前処理するこ
とにより増強し得る。最後に、安定トランスフェクト化
ＮＰ発現筋原細胞を未使用同系マウスに移植すると、防
御的細胞媒介免疫反応がｉｎ ｖｉｖｏで引き起こされ
る（図２０）。したがって、筋細胞による抗原の発現
は、ＤＮＡ注入後に観察される防御的免疫反応を誘発す
るのに十分である。さらに、非筋細胞によるＤＮＡの取
り込み及び発現は、防御免疫の生成を引き起こすのに必
要でないかも知れない。ワクチンとしてのポリヌクレオ
チドの見地から、ＤＮＡ取り込みを筋細胞に限定するの
は有益である可能性がある。第一に、筋細胞は最終的に
弁別され、分裂しない。これはプラスミドＤＮＡが染色
体ＤＮＡと一体化する可能性を低減し、抗原の永続的発
現を保持するのに重要であって、これにより長期免疫反
応が生じ得る。第二に、筋細胞は、筋原細胞の融合によ
り再生し得る大型多核細胞である。これはＤＮＡ注入が
なぜ、ＣＴＬによる細胞溶解的分解の証拠がなくてもお
そらくは長期間存続し得るタンパク質発現を引き起こす
のかを説明するのに役立つものと思われる。
【０１２４】実施例１４ 防御試験 ヒトインフルエンザ感染のため、広く用いられる二つの
動物モデル（マウス及びフェレット）を用いて、インフ
ルエンザ株を種々の組合せで、インフルエンザウイルス
抗原をコードするＤＮＡを用いて免疫化すると、死亡及
び疾病が防御され、ウイルス負荷が低減した。
動物モデル（マウス及びフェレット）を用いて、インフ
ルエンザ株を種々の組合せで、インフルエンザウイルス
抗原をコードするＤＮＡを用いて免疫化すると、死亡及
び疾病が防御され、ウイルス負荷が低減した。
【０１２５】１．異種（異型，群共通）防御は、認可死
菌ワクチンによっては有効に達成されないものである
が、動物モデルにおけるＤＮＡワクチン接種により提供
された。この防御は、ＮＰ又はＭ１をコードするＤＮＡ
を実験室動物に注入した場合に示された。これらのＤＮ
Ａを用いたワクチン接種により誘発される交差反応細胞
媒介免疫（ＣＭＩ）反応は、防御反応を提供した。
菌ワクチンによっては有効に達成されないものである
が、動物モデルにおけるＤＮＡワクチン接種により提供
された。この防御は、ＮＰ又はＭ１をコードするＤＮＡ
を実験室動物に注入した場合に示された。これらのＤＮ
Ａを用いたワクチン接種により誘発される交差反応細胞
媒介免疫（ＣＭＩ）反応は、防御反応を提供した。
【０１２６】ａ．マウス：Ａ／ＰＲ／３４からのＮＰを
コードするＤＮＡを筋注したＢＡＬＢ／ｃ及びＣ３Ｈマ
ウスは、ＬＤ９０のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ
３Ｎ２）（Ｈ３であり、Ｈ１であるＡ／ＰＲ／３４とは
異型株）を用いた全気道感染による誘発の場合に、死亡
及び疾病を防御した（体重減少で評価）。図２１は、３
週間おきにＮＰ ＤＮＡ（２００μｇ／投与）で３回免
疫化し、最終免疫化後３週目に誘発したＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの生存率を示す。図２２は、免疫化マウスにおける
誘発後の体重損失の阻止を示すが、これに比して対照マ
ウスは重度の体重損失を示した。図２３は、対照非コー
ドＤＮＡを投与したマウスと比較した場合の、ＮＰ Ｄ
ＮＡにより免疫化したマウスの上気道誘発後７日目の肺
におけるウイルス負荷の減少を示す。ＮＰ ＤＮＡで免
疫化したマウスは、対照マウスと比較して、死亡を完全
に防御し、体重損失を低減し、肺のウイルス負荷の低下
を示した。死亡及び体重損失を防御するのに要するＮＰ
ＤＮＡの量は、ＤＮＡを３回投与する場合は、≦６．
２５μｇ／注射であることが判明した（図２４）。ＮＰ
ＤＮＡを用いた免疫化により生じる防御は、免疫化マ
ウスにおいては少なくとも３か月間は事実上変わらずに
存続することが判明した。防御は６か月後まで続いた
が、最終免疫化後３〜６か月間にわずかに低下した。し
かしながら、ＮＰ ＤＮＡを２５週目の誘発の３週間前
である２２週目に１回注射する再接種をすると、完全防
御を回復した（図２５）。したがって、ＮＰ ＤＮＡに
よるマウスの免疫化は長期存続性で、増強可能な異種防
御を生じた。これらの動物を再接種した場合に既往反応
を生じる能力は、免疫学的記憶がＮＰ ＤＮＡ免疫化に
より生成されたことを示唆する。
コードするＤＮＡを筋注したＢＡＬＢ／ｃ及びＣ３Ｈマ
ウスは、ＬＤ９０のＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ
３Ｎ２）（Ｈ３であり、Ｈ１であるＡ／ＰＲ／３４とは
異型株）を用いた全気道感染による誘発の場合に、死亡
及び疾病を防御した（体重減少で評価）。図２１は、３
週間おきにＮＰ ＤＮＡ（２００μｇ／投与）で３回免
疫化し、最終免疫化後３週目に誘発したＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの生存率を示す。図２２は、免疫化マウスにおける
誘発後の体重損失の阻止を示すが、これに比して対照マ
ウスは重度の体重損失を示した。図２３は、対照非コー
ドＤＮＡを投与したマウスと比較した場合の、ＮＰ Ｄ
ＮＡにより免疫化したマウスの上気道誘発後７日目の肺
におけるウイルス負荷の減少を示す。ＮＰ ＤＮＡで免
疫化したマウスは、対照マウスと比較して、死亡を完全
に防御し、体重損失を低減し、肺のウイルス負荷の低下
を示した。死亡及び体重損失を防御するのに要するＮＰ
ＤＮＡの量は、ＤＮＡを３回投与する場合は、≦６．
２５μｇ／注射であることが判明した（図２４）。ＮＰ
ＤＮＡを用いた免疫化により生じる防御は、免疫化マ
ウスにおいては少なくとも３か月間は事実上変わらずに
存続することが判明した。防御は６か月後まで続いた
が、最終免疫化後３〜６か月間にわずかに低下した。し
かしながら、ＮＰ ＤＮＡを２５週目の誘発の３週間前
である２２週目に１回注射する再接種をすると、完全防
御を回復した（図２５）。したがって、ＮＰ ＤＮＡに
よるマウスの免疫化は長期存続性で、増強可能な異種防
御を生じた。これらの動物を再接種した場合に既往反応
を生じる能力は、免疫学的記憶がＮＰ ＤＮＡ免疫化に
より生成されたことを示唆する。
【０１２７】ｂ．フェレット：フェレットは、インフル
エンザウイルスの広範囲のヒト単離物で感染しやすいた
め、ヒトインフルエンザ感染のためのモデルとして一般
に用いられる。フェレットにおけるウイルス複製は主に
鼻孔及び気管で、そして非常に少程度には肺で生じる
が、これに対比してマウスでは肺におけるウイルス負荷
が大きい。フェレットにおける感染は、鼻腔洗浄液中に
ウイルスを滴入することにより最も容易にできる。ヒト
から得られた最近の株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｈ
３Ｎ２）からのＮＰ ＤＮＡ又はＭ１ ＤＮＡを単一で
又は組合せて用いて免疫化したフェレットは、野外単離
物Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３（Ｈ３Ｎ２）で誘発した場
合１〜６日目にウイルス脱落の有意の低減を示した（図
２６）。この野外単離物は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９
認可ワクチンがＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３によって引き
起こされる疾病に対するヒトの防御を殆ど又はまったく
提供しない程度に、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９型株から
の抗原連続変異を示した。Ａ／ＰＲ／３４の内部タンパ
ク質をコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、同
型株Ａ／ＰＲ／３４で感染後５及び６日目に鼻腔ウイル
ス脱落の有意の低減を示した（図２７）。ウイルス脱落
の低減は初期及び後期時点の両方でＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３誘発後に観察されたが、一方脱落の後期低減はＡ
／ＰＲ／３４誘発後に観察された。これは２株間のフェ
レットに対する毒性の差に依るものと思われる。
エンザウイルスの広範囲のヒト単離物で感染しやすいた
め、ヒトインフルエンザ感染のためのモデルとして一般
に用いられる。フェレットにおけるウイルス複製は主に
鼻孔及び気管で、そして非常に少程度には肺で生じる
が、これに対比してマウスでは肺におけるウイルス負荷
が大きい。フェレットにおける感染は、鼻腔洗浄液中に
ウイルスを滴入することにより最も容易にできる。ヒト
から得られた最近の株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｈ
３Ｎ２）からのＮＰ ＤＮＡ又はＭ１ ＤＮＡを単一で
又は組合せて用いて免疫化したフェレットは、野外単離
物Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３（Ｈ３Ｎ２）で誘発した場
合１〜６日目にウイルス脱落の有意の低減を示した（図
２６）。この野外単離物は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９
認可ワクチンがＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３によって引き
起こされる疾病に対するヒトの防御を殆ど又はまったく
提供しない程度に、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９型株から
の抗原連続変異を示した。Ａ／ＰＲ／３４の内部タンパ
ク質をコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、同
型株Ａ／ＰＲ／３４で感染後５及び６日目に鼻腔ウイル
ス脱落の有意の低減を示した（図２７）。ウイルス脱落
の低減は初期及び後期時点の両方でＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３誘発後に観察されたが、一方脱落の後期低減はＡ
／ＰＲ／３４誘発後に観察された。これは２株間のフェ
レットに対する毒性の差に依るものと思われる。
【０１２８】２．同種（同型，型特異性）防御は、ＨＡ
ＤＮＡで免疫化したマウス及びフェレットの両方で容
易に実証された。
ＤＮＡで免疫化したマウス及びフェレットの両方で容
易に実証された。
【０１２９】ａ．マウス：ＨＡ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３
４）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＬＤ９０のＡ
／ＰＲ／３４による誘発から完全に防御された。免疫化
マウスでは誘発後に死亡（図２８）も体重の５％以上の
損失（図２９）も認められなかったが、一方対照の９０
〜１００％が死亡しそして重度の体重損失を示した。防
御を達成するのに要するＨＡ ＤＮＡの用量は、１μｇ
のＨＡ ＤＮＡを３回注射すれば、完全防御を達成する
のに十分であることを示した（図３０）。
４）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＬＤ９０のＡ
／ＰＲ／３４による誘発から完全に防御された。免疫化
マウスでは誘発後に死亡（図２８）も体重の５％以上の
損失（図２９）も認められなかったが、一方対照の９０
〜１００％が死亡しそして重度の体重損失を示した。防
御を達成するのに要するＨＡ ＤＮＡの用量は、１μｇ
のＨＡ ＤＮＡを３回注射すれば、完全防御を達成する
のに十分であることを示した（図３０）。
【０１３０】ｂ．フェレット：Ａ／ＰＲ／３４からのＨ
ＡをコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、対照
ＤＮＡを投与したフェレットより有意に低いウイルス脱
落を同種誘発後１〜６日目に示した（図３１）。同様
に、Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ ＤＮＡで免疫化し
たフェレットは、同種感染後１日目及び３〜７日目にウ
イルス脱落の低減を示した（図３２）。ＨＩ抗体は免疫
化フェレットのすべてからの血清中の適切な株に対して
存在した（上記参照）。したがって、ＨＡ ＤＮＡによ
る免疫化は同種防御を生じる。
ＡをコードするＤＮＡで免疫化したフェレットは、対照
ＤＮＡを投与したフェレットより有意に低いウイルス脱
落を同種誘発後１〜６日目に示した（図３１）。同様
に、Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ ＤＮＡで免疫化し
たフェレットは、同種感染後１日目及び３〜７日目にウ
イルス脱落の低減を示した（図３２）。ＨＩ抗体は免疫
化フェレットのすべてからの血清中の適切な株に対して
存在した（上記参照）。したがって、ＨＡ ＤＮＡによ
る免疫化は同種防御を生じる。
【０１３１】３．ワクチン組合せ：ＮＰ及びＭ１ ＤＮ
Ａと組合せて、一層普遍的な防御を提供するＨＡ ＤＮ
Ａの能力をフェレットで調べた。
Ａと組合せて、一層普遍的な防御を提供するＨＡ ＤＮ
Ａの能力をフェレットで調べた。
【０１３２】ａ．抗原性連続変異変種に対する防御の
幅：Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９及びＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／９２株間に生じた抗原性連続変異は、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／８９株を含有する認可ワクチンで免疫化した多数
のヒトがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２変種により引き起こ
される疾病に対して防御されないほどに、広範囲のもの
であった。北米では、蔓延した疾病が、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／９２様の野外単離物、例えばＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３により引き起こされた。この北米野外単離物は抗
原的にはその型株、即ちＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と同
様であるが、しかし単離の地理的位置、及びそれらが卵
ではなく哺乳類細胞培養中で継代されたという継代歴が
異なる。しかしながら、ＨＡのアミノ酸配列に関して
は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２様の株はＨＡ１領域の１
１の点突然変異（１３３、１３５、１４５、１５６、１
５７、１８６、１９０、１９１、１９３、２２６及び２
６２位置）だけがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の株と異
なる。したがって、ＨＡ ＤＮＡに誘発される同型免疫
反応と、ＮＰ及びＭ１ ＤＮＡにより誘発される交差反
応性ＣＭＩ反応とを組合せれば、この抗原性連続変異変
種に対し、より大きな防御を提供するのではないかを検
討することにした。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有
する認可ワクチンによる、あるいはＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の野外単離物
（Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１）からのＨＡＤＮＡによるフ
ェレットの免疫化は、フェレットにＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３による誘発を施した場合、ウイルス脱落の低減を
生じた（図３３）。ＮＰ、Ｍ１及びＨＡ ＤＮＡを含有
する組合せＰＮＶで免疫化したフェレットは、認可物質
で、又はＨＡ ＤＮＡ単独で免疫化したフェレットより
有意に低いウイルス脱落を示した（図３４）。Ａ／Ｂｅ
ｉｊｉｎｇ／８９ ＮＰ及びＭ１ＤＮＡと組合せたＡ／
Ｈａｗａｉｉ／９１ＨＡ ＤＮＡの場合、生じた防御は
同種Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ ＤＮＡにより提供
される最大防御とはさして異ならなかった（図３５）。
したがって、ＨＡ、ＮＰ及びＭ１ ＤＮＡを組合せる
と、認可ワクチンに比して抗原性連続変異変種に対する
防御の改良が生じた。
幅：Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９及びＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／９２株間に生じた抗原性連続変異は、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／８９株を含有する認可ワクチンで免疫化した多数
のヒトがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２変種により引き起こ
される疾病に対して防御されないほどに、広範囲のもの
であった。北米では、蔓延した疾病が、Ａ／Ｂｅｉｊｉ
ｎｇ／９２様の野外単離物、例えばＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３により引き起こされた。この北米野外単離物は抗
原的にはその型株、即ちＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２と同
様であるが、しかし単離の地理的位置、及びそれらが卵
ではなく哺乳類細胞培養中で継代されたという継代歴が
異なる。しかしながら、ＨＡのアミノ酸配列に関して
は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２様の株はＨＡ１領域の１
１の点突然変異（１３３、１３５、１４５、１５６、１
５７、１８６、１９０、１９１、１９３、２２６及び２
６２位置）だけがＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の株と異
なる。したがって、ＨＡ ＤＮＡに誘発される同型免疫
反応と、ＮＰ及びＭ１ ＤＮＡにより誘発される交差反
応性ＣＭＩ反応とを組合せれば、この抗原性連続変異変
種に対し、より大きな防御を提供するのではないかを検
討することにした。Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有
する認可ワクチンによる、あるいはＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ
／８９又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９様の野外単離物
（Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１）からのＨＡＤＮＡによるフ
ェレットの免疫化は、フェレットにＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３による誘発を施した場合、ウイルス脱落の低減を
生じた（図３３）。ＮＰ、Ｍ１及びＨＡ ＤＮＡを含有
する組合せＰＮＶで免疫化したフェレットは、認可物質
で、又はＨＡ ＤＮＡ単独で免疫化したフェレットより
有意に低いウイルス脱落を示した（図３４）。Ａ／Ｂｅ
ｉｊｉｎｇ／８９ ＮＰ及びＭ１ＤＮＡと組合せたＡ／
Ｈａｗａｉｉ／９１ＨＡ ＤＮＡの場合、生じた防御は
同種Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３ＨＡ ＤＮＡにより提供
される最大防御とはさして異ならなかった（図３５）。
したがって、ＨＡ、ＮＰ及びＭ１ ＤＮＡを組合せる
と、認可ワクチンに比して抗原性連続変異変種に対する
防御の改良が生じた。
【０１３３】ｂ．ワクチン抗原の継代歴の影響：組織培
養のＭＤＣＫ細胞中で継代させた米国野外単離物（Ａ／
Ｈａｗａｉｉ／９１）から得られたＨＡ ＤＮＡ配列か
ら成るワクチンで免疫化したフェレットは、抗原的連続
変異株Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３で誘発した場合、卵継
代Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有する認可死菌ウイ
ルスワクチンを投与したフェレットに比べ、低い（２次
元分散分析によりｐ＝０．０２１）ウイルス脱落を示し
た（図３３）。これに対比して、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９からのＨＡ ＤＮＡを投与したフェレットは、同一
ウイルスを含有する認可ワクチンを投与したフェレット
とは、有意に異なる（ｐ＝０．０５８）Ａ／Ｇｅｏｒｇ
ｉａ／９３誘発後ウイルス脱落を示した。卵及び哺乳類
細胞増殖株はＨＡのＨＡ１領域の２つの点突然変異（１
８６及び１９３位置）で異なるが、これはともにＨＩ及
び中和抗体の結合に重要であると考えられる領域のＨＡ
モノマーの先端に近い抗原部位Ｂに位置する。いくつか
のヒトインフルエンザ単離物がニワトリＲＢＣと結合す
る能力は、最初は非常に低いがしかし卵中での連続継代
により増大することがある。このことはＨＡの受容体結
合領域が鳥細胞における増殖による実質的選択を受け得
ることを示唆する。実験室動物におけるＨＡベースのイ
ンフルエンザワクチンの効力に及ぼす小配列変異の作用
は、このようなワクチンを調製する場合に野生型ウイル
スの配列にできるだけ近いものにすることの重要性を強
調する。
養のＭＤＣＫ細胞中で継代させた米国野外単離物（Ａ／
Ｈａｗａｉｉ／９１）から得られたＨＡ ＤＮＡ配列か
ら成るワクチンで免疫化したフェレットは、抗原的連続
変異株Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３で誘発した場合、卵継
代Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９株を含有する認可死菌ウイ
ルスワクチンを投与したフェレットに比べ、低い（２次
元分散分析によりｐ＝０．０２１）ウイルス脱落を示し
た（図３３）。これに対比して、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／
８９からのＨＡ ＤＮＡを投与したフェレットは、同一
ウイルスを含有する認可ワクチンを投与したフェレット
とは、有意に異なる（ｐ＝０．０５８）Ａ／Ｇｅｏｒｇ
ｉａ／９３誘発後ウイルス脱落を示した。卵及び哺乳類
細胞増殖株はＨＡのＨＡ１領域の２つの点突然変異（１
８６及び１９３位置）で異なるが、これはともにＨＩ及
び中和抗体の結合に重要であると考えられる領域のＨＡ
モノマーの先端に近い抗原部位Ｂに位置する。いくつか
のヒトインフルエンザ単離物がニワトリＲＢＣと結合す
る能力は、最初は非常に低いがしかし卵中での連続継代
により増大することがある。このことはＨＡの受容体結
合領域が鳥細胞における増殖による実質的選択を受け得
ることを示唆する。実験室動物におけるＨＡベースのイ
ンフルエンザワクチンの効力に及ぼす小配列変異の作用
は、このようなワクチンを調製する場合に野生型ウイル
スの配列にできるだけ近いものにすることの重要性を強
調する。
【０１３４】ｃ．非ヒト霊長類：非ヒト霊長類は、感染
の臨床反応が乏しいために、インフルエンザ誘発モデル
としては一般に用いない。しかしながら、認可死菌ウイ
ルスワクチンとの比較に際して、非ヒト霊長類における
ＰＮＶワクチン組合せの免疫原性をわれわれは調べた。
ＨＡ及び内部タンパク質遺伝子を含有する組合せＰＮＶ
によりもたらされる抗体力価は、ＨＩ抗体力価及び反応
の持続時間に関しては認可物質と少なくとも等しかった
（上記参照）。ＰＮＶで免疫化したアフリカミドリザル
は抗原連続変異性変種に関するＨＡ ＰＮＶに反応した
が、これはＰＮＶに対する型特異性反応が過去に免疫化
された被験体に生じ得ることを示す。ＰＮＶで免疫化さ
れたサルはさらに慣用の死菌ウイルスワクチンを用いた
その後の免疫化にも反応した。
の臨床反応が乏しいために、インフルエンザ誘発モデル
としては一般に用いない。しかしながら、認可死菌ウイ
ルスワクチンとの比較に際して、非ヒト霊長類における
ＰＮＶワクチン組合せの免疫原性をわれわれは調べた。
ＨＡ及び内部タンパク質遺伝子を含有する組合せＰＮＶ
によりもたらされる抗体力価は、ＨＩ抗体力価及び反応
の持続時間に関しては認可物質と少なくとも等しかった
（上記参照）。ＰＮＶで免疫化したアフリカミドリザル
は抗原連続変異性変種に関するＨＡ ＰＮＶに反応した
が、これはＰＮＶに対する型特異性反応が過去に免疫化
された被験体に生じ得ることを示す。ＰＮＶで免疫化さ
れたサルはさらに慣用の死菌ウイルスワクチンを用いた
その後の免疫化にも反応した。
【０１３５】４．結論：インフルエンザに対するポリヌ
クレオチドワクチンは、インフルエンザ感染の実験室動
物モデルに有効である。同種防御はＨＡをコードするＤ
ＮＡベクターを用いて、最も有利には現行認可インフル
エンザワクチンに用いるＨＡタンパク質により誘発され
るのと同様の免疫学的機序により達成し得る。異種防御
は、インフルエンザの保存内部タンパク質をコードする
ＤＮＡを含入することにより、抗原的不連続変異及び連
続変異株の両方に対して達成し得る。１回免疫化にこれ
らのアプローチを組合せると、フェレットモデルにおい
ては現行認可ワクチンと比較して、抗原性連続変異変種
に対する防御の改良が生じた。
クレオチドワクチンは、インフルエンザ感染の実験室動
物モデルに有効である。同種防御はＨＡをコードするＤ
ＮＡベクターを用いて、最も有利には現行認可インフル
エンザワクチンに用いるＨＡタンパク質により誘発され
るのと同様の免疫学的機序により達成し得る。異種防御
は、インフルエンザの保存内部タンパク質をコードする
ＤＮＡを含入することにより、抗原的不連続変異及び連
続変異株の両方に対して達成し得る。１回免疫化にこれ
らのアプローチを組合せると、フェレットモデルにおい
ては現行認可ワクチンと比較して、抗原性連続変異変種
に対する防御の改良が生じた。
【０１３６】実施例１５ ベクターＶ１Ｒ調製 基礎ワクチンベクターを絶えず最適化しようと、我々は
Ｖ１Ｒと呼ばれるＶ１Ｊｎｓの誘導体を調製した。この
ベクター構築の目的は、Ｖ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓがもたら
す全体的最適化遺伝子発現特性及び高プラスミド収率を
依然として保持したまま、最小サイズの、即ち不必要な
ＤＮＡ配列を含有しないワクチンベクターを生成するこ
とであった。文献から並びに経験により、（１）大腸菌
の複製原点をなすｐＵＣ骨格内の領域を、プラスミド収
率を犠牲にせずに細菌から切り取り得る；（２）カナマ
イシン開放読み枠後のｋａｎｒ遺伝子の３′領域を、そ
の代わりに細菌ターミネーターを挿入して切り取り得
る；そして（３）ＢＧＨの３′側の〜３００塩基対の半
分を、その調節機能に影響を及ぼさずに切り取り得る
（ＢＧＨエレメント内に現存するＫｐｎｌ制限部位の
後）ということを我々は確かめた。
Ｖ１Ｒと呼ばれるＶ１Ｊｎｓの誘導体を調製した。この
ベクター構築の目的は、Ｖ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓがもたら
す全体的最適化遺伝子発現特性及び高プラスミド収率を
依然として保持したまま、最小サイズの、即ち不必要な
ＤＮＡ配列を含有しないワクチンベクターを生成するこ
とであった。文献から並びに経験により、（１）大腸菌
の複製原点をなすｐＵＣ骨格内の領域を、プラスミド収
率を犠牲にせずに細菌から切り取り得る；（２）カナマ
イシン開放読み枠後のｋａｎｒ遺伝子の３′領域を、そ
の代わりに細菌ターミネーターを挿入して切り取り得
る；そして（３）ＢＧＨの３′側の〜３００塩基対の半
分を、その調節機能に影響を及ぼさずに切り取り得る
（ＢＧＨエレメント内に現存するＫｐｎｌ制限部位の
後）ということを我々は確かめた。
【０１３７】それぞれＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／Ｂ
ＧＨターミネーター、複製原点及びカナマイシン耐性遺
伝子のＤＮＡの３つのセグメントをＶ１ＪｎｓからＰＣ
Ｒを用いて合成し、Ｖ１Ｒを構築した。ＰＣＲオリゴマ
ーを用いて、各々のセグメントに特有の制限酵素を各セ
グメント末端に付加した：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨに関
してはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎｒ遺伝子に関して
はＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ；そしてｏｒｉｒに関して
はＢｃｌＩ及びＳａｌＩ。各々のＰＣＲ−由来ＤＮＡセ
グメントを方向性をもって結紮させ、各部位をその後除
去できるよう、これらの酵素部位を選択した：ＥｃｏＲ
Ｖ及びＳｓｐＩは結紮に適合性の盲端ＤＮＡを残し、一
方ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩの場
合と同様に相補的オーバーハングを残す。ＰＣＲにより
これらのセグメントを得た後、各セグメントを上記の適
切な制限酵素で消化し、次いで３つのＤＮＡセグメント
をすべて含有する、単一の反応混合物に結紮した。ｏｒ
ｉｒ５′末端は、カナマイシン耐性遺伝子に関する終結
情報を提供し得るようにこの領域内に一般に見出される
Ｔ２ ｒｈｏ非依存性ターミネーター配列を包含するよ
う意図した。制限酵素消化（＞８酵素）により、並びに
結紮接合部のＤＮＡ配列解析により、結紮物質を確認し
た。Ｖ１Ｒ内でのウイルス遺伝子を用いたＤＮＡプラス
ミド収率及び異種発現は、Ｖ１Ｊｎｓと同様であると思
われる。ベクターサイズの正味低減は、１３４６ｂｐ
（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６Ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２Ｋｂ）
であった（図３６（配列番号４５）参照）。
ＧＨターミネーター、複製原点及びカナマイシン耐性遺
伝子のＤＮＡの３つのセグメントをＶ１ＪｎｓからＰＣ
Ｒを用いて合成し、Ｖ１Ｒを構築した。ＰＣＲオリゴマ
ーを用いて、各々のセグメントに特有の制限酵素を各セ
グメント末端に付加した：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨに関
してはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎｒ遺伝子に関して
はＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ；そしてｏｒｉｒに関して
はＢｃｌＩ及びＳａｌＩ。各々のＰＣＲ−由来ＤＮＡセ
グメントを方向性をもって結紮させ、各部位をその後除
去できるよう、これらの酵素部位を選択した：ＥｃｏＲ
Ｖ及びＳｓｐＩは結紮に適合性の盲端ＤＮＡを残し、一
方ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩの場
合と同様に相補的オーバーハングを残す。ＰＣＲにより
これらのセグメントを得た後、各セグメントを上記の適
切な制限酵素で消化し、次いで３つのＤＮＡセグメント
をすべて含有する、単一の反応混合物に結紮した。ｏｒ
ｉｒ５′末端は、カナマイシン耐性遺伝子に関する終結
情報を提供し得るようにこの領域内に一般に見出される
Ｔ２ ｒｈｏ非依存性ターミネーター配列を包含するよ
う意図した。制限酵素消化（＞８酵素）により、並びに
結紮接合部のＤＮＡ配列解析により、結紮物質を確認し
た。Ｖ１Ｒ内でのウイルス遺伝子を用いたＤＮＡプラス
ミド収率及び異種発現は、Ｖ１Ｊｎｓと同様であると思
われる。ベクターサイズの正味低減は、１３４６ｂｐ
（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６Ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２Ｋｂ）
であった（図３６（配列番号４５）参照）。
【０１３８】Ｖ１Ｒを合成するために用いたＰＣＲオリ
ゴマー配列を以下に示す（制限酵素部位には下線を施
し、配列の後ろのかぎ括弧内にその名称を示した）：
ゴマー配列を以下に示す（制限酵素部位には下線を施
し、配列の後ろのかぎ括弧内にその名称を示した）：
【０１３９】
【配列表】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】
【０１５７】
【０１５８】
【０１５９】
【０１６０】
【０１６１】
【０１６２】
【０１６３】
【０１６４】
【０１６５】
【０１６６】
【０１６７】
【０１６８】
【０１６９】
【０１７０】
【０１７１】
【０１７２】
【０１７３】
【０１７４】
【０１７５】
【０１７６】
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【０１８０】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【図１】ＰＣＲによる筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの
検出を示す電気泳動の写真である。ＲＳＶ−ＮＰ ＤＮ
Ａ又はブランクベクター（１００μｇ／足）をＢＡＬＢ
／ｃマウスの両四頭筋に３週間間隔で３回注射し、その
後マウスをインフルエンザに感染させた。最終注射後４
週間目に筋肉を摘出し、直ちに液体窒素中で凍結させ
た。次にそれらをＭＩＫＲＯＤＩＳＭＥＭＢＲＡＴＯＲ
ＴＭ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入
れた溶解緩衝液（２５ｍＭ トリス−Ｈ３ＰＯ４，ｐＨ
８、２ｍＭ トランス−１：２−ジアミノシクロヘキサ
ン四酢酸（ＣＤＴＡ）、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％ グリ
セロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で粉砕
し、高分子ＤＮＡをフェノール／クロロホルム及びエタ
ノール沈降により抽出した。４０サイクルＰＣＲ反応
（ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｇ
ＥＮＥＡＭＰＴＭキットでの操作支持どおりとした）を
実施して筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの存在を検出し
た。ＣＭＶプロモーターからの挿入ＮＰ遺伝子の５′部
分の殆どに及ぶ７７２塩基対のＰＣＲ生成物質（矢印を
参照）を、プロモーター領域でプライムした１８塩基長
センスオリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＡ
ＡＧＣＴＧＧ，配列番号１）及び挿入ＮＰ配列の５′部
分の２３塩基長オリゴヌクレオチドアンチセンスプライ
マー（ＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＡＴＴＣ，
配列番号２）から生成した。この７７２ｂｐ物質は、選
択ＮＰ ＤＮＡ注入筋肉標本において臭化物染色アガロ
ースゲル上で観察されるが、ブランクベクター対照（６
００Ｌ）では認められない。上記の各レーンの名称は、
マウス同定番号及び右又は左足を示す。
検出を示す電気泳動の写真である。ＲＳＶ−ＮＰ ＤＮ
Ａ又はブランクベクター（１００μｇ／足）をＢＡＬＢ
／ｃマウスの両四頭筋に３週間間隔で３回注射し、その
後マウスをインフルエンザに感染させた。最終注射後４
週間目に筋肉を摘出し、直ちに液体窒素中で凍結させ
た。次にそれらをＭＩＫＲＯＤＩＳＭＥＭＢＲＡＴＯＲ
ＴＭ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入
れた溶解緩衝液（２５ｍＭ トリス−Ｈ３ＰＯ４，ｐＨ
８、２ｍＭ トランス−１：２−ジアミノシクロヘキサ
ン四酢酸（ＣＤＴＡ）、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％ グリ
セロール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で粉砕
し、高分子ＤＮＡをフェノール／クロロホルム及びエタ
ノール沈降により抽出した。４０サイクルＰＣＲ反応
（ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｇ
ＥＮＥＡＭＰＴＭキットでの操作支持どおりとした）を
実施して筋肉中のＮＰプラスミドＤＮＡの存在を検出し
た。ＣＭＶプロモーターからの挿入ＮＰ遺伝子の５′部
分の殆どに及ぶ７７２塩基対のＰＣＲ生成物質（矢印を
参照）を、プロモーター領域でプライムした１８塩基長
センスオリゴヌクレオチド（ＧＴＧＴＧＣＡＣＣＴＣＡ
ＡＧＣＴＧＧ，配列番号１）及び挿入ＮＰ配列の５′部
分の２３塩基長オリゴヌクレオチドアンチセンスプライ
マー（ＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＡＴＴＣ，
配列番号２）から生成した。この７７２ｂｐ物質は、選
択ＮＰ ＤＮＡ注入筋肉標本において臭化物染色アガロ
ースゲル上で観察されるが、ブランクベクター対照（６
００Ｌ）では認められない。上記の各レーンの名称は、
マウス同定番号及び右又は左足を示す。
【図２】ＮＰ ＤＮＡ注射マウスにおけるＮＰ抗体の産
生。マウスの各足にＶ１−ＮＰＤＮＡ １００μｇを
０、３及び６週間目に注射し、０、２、５及び８週目に
血液を採取した。血清中の抗ＮＰ ＩｇＧの存在を、バ
キュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトしてお
いた昆虫細胞から精製したＮＰを用いて、ＥＬＩＳＡ
（Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４５，３０７１（１９９０））により検定した。結果
は、最初のＮＰ ＤＮＡ注射後の時間に対する平均ｌｏ
ｇ１０ＥＬＩＳＡ力価±ＳＥＭ（ｎ＝１０）としてプロ
ットした。ブランクベクターで免疫化したマウスは検出
可能なＮＰ抗体を生じなかった。
生。マウスの各足にＶ１−ＮＰＤＮＡ １００μｇを
０、３及び６週間目に注射し、０、２、５及び８週目に
血液を採取した。血清中の抗ＮＰ ＩｇＧの存在を、バ
キュロウイルス発現ベクターでトランスフェクトしてお
いた昆虫細胞から精製したＮＰを用いて、ＥＬＩＳＡ
（Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４５，３０７１（１９９０））により検定した。結果
は、最初のＮＰ ＤＮＡ注射後の時間に対する平均ｌｏ
ｇ１０ＥＬＩＳＡ力価±ＳＥＭ（ｎ＝１０）としてプロ
ットした。ブランクベクターで免疫化したマウスは検出
可能なＮＰ抗体を生じなかった。
【図３】ＤＮＡで免疫化したマウスから得られたＣＴＬ
に関して４時間５１Ｃｒ放出検定で測定した特異的溶解
（％）。マウスを４００μｇのＶ１−ＮＰ ＤＮＡ（黒
丸）又はブランクベクター（黒四角）で免疫化して、３
〜４週間後に屠殺した。陰性対照ＣＴＬは、未使用マウ
ス（白三角）、そして陽性対照は４週間前にＡ／ＨＫ／
６８で感染させておいたマウス（黒三角）から得た。グ
ラフは代表的な個々のマウスからのデータを示す。少な
くとも８匹の個体を各組の条件に関して調べた。Ａ図：
ＮＰ１４７−１５５パルス化自系脾細胞で再刺激し、Ｎ
Ｐ１４７−１５５パルス化Ｐ８１５細胞に対して検定し
た脾細胞。Ｂ図：ＮＰ１４７＝１５５パルス化自系脾細
胞で再刺激し、ＣＴＬ付加前に６時間インフルエンザＡ
／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）で感染させたＰ
８１５標的に対して検定した脾細胞。Ｃ図：付加的抗原
を用いずにＣｏｎ Ａ及びＩＬ−２で再刺激し、ＮＰ１
４７−１５５でパルス化したＰ８１５細胞に対して検定
した脾細胞。Ｄ図：マウスに１回の注射につき２００μ
ｇのＶ１−ＮＰ ＤＮＡ又はブランクベクターを３週間
置きに３回注射した。最終免疫化後４週目に脾臓を取り
出して、脾細胞をＩＬ−２及びＣｏｎ Ａと７日間培養
し、ＣＴＬをＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３で感染させた
Ｐ８１５標的細胞に対して検定した。
に関して４時間５１Ｃｒ放出検定で測定した特異的溶解
（％）。マウスを４００μｇのＶ１−ＮＰ ＤＮＡ（黒
丸）又はブランクベクター（黒四角）で免疫化して、３
〜４週間後に屠殺した。陰性対照ＣＴＬは、未使用マウ
ス（白三角）、そして陽性対照は４週間前にＡ／ＨＫ／
６８で感染させておいたマウス（黒三角）から得た。グ
ラフは代表的な個々のマウスからのデータを示す。少な
くとも８匹の個体を各組の条件に関して調べた。Ａ図：
ＮＰ１４７−１５５パルス化自系脾細胞で再刺激し、Ｎ
Ｐ１４７−１５５パルス化Ｐ８１５細胞に対して検定し
た脾細胞。Ｂ図：ＮＰ１４７＝１５５パルス化自系脾細
胞で再刺激し、ＣＴＬ付加前に６時間インフルエンザＡ
／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３（Ｈ３Ｎ２）で感染させたＰ
８１５標的に対して検定した脾細胞。Ｃ図：付加的抗原
を用いずにＣｏｎ Ａ及びＩＬ−２で再刺激し、ＮＰ１
４７−１５５でパルス化したＰ８１５細胞に対して検定
した脾細胞。Ｄ図：マウスに１回の注射につき２００μ
ｇのＶ１−ＮＰ ＤＮＡ又はブランクベクターを３週間
置きに３回注射した。最終免疫化後４週目に脾臓を取り
出して、脾細胞をＩＬ−２及びＣｏｎ Ａと７日間培養
し、ＣＴＬをＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３で感染させた
Ｐ８１５標的細胞に対して検定した。
【図４】１０４ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いた
非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスにおける体
重損失（グラム）及び回復。Ｖ１−ＮＰ ＤＮＡ又はブ
ランクベクターを用いて３週間置きに３回マウスを免疫
化するか、あるいは注射せずに、最終免疫化後３週目に
誘発した。誘発時点でそして４日目から毎日、ＮＰ Ｄ
ＮＡ注射マウス（黒丸）、ブランクベクター対照（白三
角）及び非注射対照（白丸）に関し、各群マウス１０匹
の重量を調べた。ここに、平均体重±ＳＥＭを示す。Ｎ
Ｐ ＤＮＡ注射マウスは、ｔ−検定によると、８〜１３
日目にブランクベクター注射（ｐ≦０．００５）及び非
注射マウス（ｐ≦０．０１）より有意に低い体重損失を
示した。２つの対照間に有意差は認められなかった（ｔ
−検定ではｐ＝０．８）。
非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスにおける体
重損失（グラム）及び回復。Ｖ１−ＮＰ ＤＮＡ又はブ
ランクベクターを用いて３週間置きに３回マウスを免疫
化するか、あるいは注射せずに、最終免疫化後３週目に
誘発した。誘発時点でそして４日目から毎日、ＮＰ Ｄ
ＮＡ注射マウス（黒丸）、ブランクベクター対照（白三
角）及び非注射対照（白丸）に関し、各群マウス１０匹
の重量を調べた。ここに、平均体重±ＳＥＭを示す。Ｎ
Ｐ ＤＮＡ注射マウスは、ｔ−検定によると、８〜１３
日目にブランクベクター注射（ｐ≦０．００５）及び非
注射マウス（ｐ≦０．０１）より有意に低い体重損失を
示した。２つの対照間に有意差は認められなかった（ｔ
−検定ではｐ＝０．８）。
【図５】１０２．５ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用
いた非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスの生存
率。Ｖ１−ＮＰ ＤＮＡ（黒丸）又はブランクベクター
（白丸）で３週間置きに３回免疫化したマウス、及び非
注射対照（白三角）を最終免疫化後３週間目に誘発し
た。生存率（％）は、９匹又は１０匹のマウス群に関し
て示す。ＮＰ ＤＮＡ注射マウスの生存率は、対照より
有意に大きかった（χ２乗分析でｐ＝０．０００４）
が、一方ブランクベクター注射マウスと非注射マウスと
の間に有意差は認められなかった（χ２乗分析でｐ＝
０．１７）。
いた非麻酔下鼻腔内誘発後のＤＮＡ免疫化マウスの生存
率。Ｖ１−ＮＰ ＤＮＡ（黒丸）又はブランクベクター
（白丸）で３週間置きに３回免疫化したマウス、及び非
注射対照（白三角）を最終免疫化後３週間目に誘発し
た。生存率（％）は、９匹又は１０匹のマウス群に関し
て示す。ＮＰ ＤＮＡ注射マウスの生存率は、対照より
有意に大きかった（χ２乗分析でｐ＝０．０００４）
が、一方ブランクベクター注射マウスと非注射マウスと
の間に有意差は認められなかった（χ２乗分析でｐ＝
０．１７）。
【図６】発現ベクターＶ１Ｊ，配列番号１０の配列。
【図７】発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ，配列番号１８の配
列。
列。
【図８】ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨプロモーター−ターミ
ネーター配列，配列番号１１の配列。
ネーター配列，配列番号１１の配列。
【図９】サル抗−ＮＰ抗体。
【図１０】フェレット赤血球凝集抑制。点線は最小防御
抗体力価を示し、貫通横線付き丸で平均値を示す。
抗体力価を示し、貫通横線付き丸で平均値を示す。
【図１１】ＤＮＡ免疫化後のフェレットにおけるＩｇＧ
抗ＮＰ抗体。
抗ＮＰ抗体。
【図１２】ＤＮＡ免疫化をした場合としない場合のフェ
レットにおけるインフルエンザウイルス脱落。
レットにおけるインフルエンザウイルス脱落。
【図１３】ｐＲＳＶ−ＰＲ−ＮＰ及びＶ１−ＮＰベクタ
ーの図解。ＮＰは挿入されたコーディング領域を示す。
ーの図解。ＮＰは挿入されたコーディング領域を示す。
【図１４】インフルエンザタンパク質及び株の図解。
【図１５】細胞内での注入ＤＮＡプロセッシングの図
式。
式。
【図１６】ＨＡ及び内部タンパク質遺伝子による免疫化
によって誘発されるインフルエンザＡ／ＲＰ／８／３４
に対するフェレットの耐性。
によって誘発されるインフルエンザＡ／ＲＰ／８／３４
に対するフェレットの耐性。
【図１７】Ｖ１Ｊｎｓベクターの図解。
【図１８】アフリカミドリザルにＨＡ ＤＮＡ（Ａ／Ｂ
ｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０，Ａ／Ｔ
ｅｘａｓ／９１）、ＮＰ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）及
びＭ１ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）から成るＤＮＡのカ
クテルを注射した。各成分は、１０μｇ（黒四角）又は
１００μｇ（黒丸）を６週間の間隔をおいて（矢印参
照）２回投与した。比較のために、他の動物に完全ヒト
用量（４５μｇタンパク質当量；１５μｇ／ＨＡ）で、
認可サブビリオン（白四角）及び全ビリオン（白丸）ワ
クチンを別の動物に注射した。血清標本を２週間毎に１
８週間収集し、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９ ＨＡに対す
るＨＩ力価に関して分析した。データは幾何平均ＨＩ力
価±ＳＥＭ（この場合ｎ＝３）として表す。
ｅｉｊｉｎｇ／８９，Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０，Ａ／Ｔ
ｅｘａｓ／９１）、ＮＰ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）及
びＭ１ ＤＮＡ（Ａ／ＰＲ／３４）から成るＤＮＡのカ
クテルを注射した。各成分は、１０μｇ（黒四角）又は
１００μｇ（黒丸）を６週間の間隔をおいて（矢印参
照）２回投与した。比較のために、他の動物に完全ヒト
用量（４５μｇタンパク質当量；１５μｇ／ＨＡ）で、
認可サブビリオン（白四角）及び全ビリオン（白丸）ワ
クチンを別の動物に注射した。血清標本を２週間毎に１
８週間収集し、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９ ＨＡに対す
るＨＩ力価に関して分析した。データは幾何平均ＨＩ力
価±ＳＥＭ（この場合ｎ＝３）として表す。
【図１９】雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６週齢）にＡ／
ＰＲ／３４ ＮＰ ＤＮＡ（２００μｇ）を３週間おき
に３回注射した。陰性対照としては、対照ＤＮＡ（２０
０μｇ）、組換え体ＮＰタンパク質（１０μｇ）を注射
したマウス、及び未使用非注射マウス（模擬）が含まれ
た。比較のために、インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／
６８（インフルエンザ）に感染させたマウスも試験し
た。ＣＴＬは投与後６か月のものから得られ、ウイルス
感染同系脾細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激し
て、１０：１のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパ
ルス化Ｐ８１５細胞に対して試験した。データは％特異
的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示す。
ＰＲ／３４ ＮＰ ＤＮＡ（２００μｇ）を３週間おき
に３回注射した。陰性対照としては、対照ＤＮＡ（２０
０μｇ）、組換え体ＮＰタンパク質（１０μｇ）を注射
したマウス、及び未使用非注射マウス（模擬）が含まれ
た。比較のために、インフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／
６８（インフルエンザ）に感染させたマウスも試験し
た。ＣＴＬは投与後６か月のものから得られ、ウイルス
感染同系脾細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激し
て、１０：１のエフェクター：標的比でＮＰペプチドパ
ルス化Ｐ８１５細胞に対して試験した。データは％特異
的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示す。
【図２０】Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスに正常Ｃ２Ｃ１２筋原
細胞（１×１０７細胞）、組換え体ＮＰタンパク質（２
μｇ）又はＮＰトランスフェクト化筋原細胞（１×１０
７細胞）を注射した。この量のＮＰタンパク質（２μ
ｇ）は抗体反応を生じるのに十分であり、移植ＮＰトラ
ンスフェクト化筋原細胞中に存在するＮＰの量の約１０
０倍と等価であった。ＣＴＬは処置後６週目のこれらの
マウスから調製し、インフルエンザウイルス感染同系脾
細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。陽性対照とし
て、ＣＴＬをインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／６８に
感染させておいたマウスから調製した。未処置（黒）、
インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３−
感染（斜線）及びＮＰトランスフェクト筋原細胞（点
描）を２５：１のエフェクター：標的比で標的細胞とし
て用いた。データは％特異的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示
す。
細胞（１×１０７細胞）、組換え体ＮＰタンパク質（２
μｇ）又はＮＰトランスフェクト化筋原細胞（１×１０
７細胞）を注射した。この量のＮＰタンパク質（２μ
ｇ）は抗体反応を生じるのに十分であり、移植ＮＰトラ
ンスフェクト化筋原細胞中に存在するＮＰの量の約１０
０倍と等価であった。ＣＴＬは処置後６週目のこれらの
マウスから調製し、インフルエンザウイルス感染同系脾
細胞でｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激した。陽性対照とし
て、ＣＴＬをインフルエンザウイルスＡ／ＨＫ／６８に
感染させておいたマウスから調製した。未処置（黒）、
インフルエンザウイルスＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３−
感染（斜線）及びＮＰトランスフェクト筋原細胞（点
描）を２５：１のエフェクター：標的比で標的細胞とし
て用いた。データは％特異的溶解±ｓｄ（ｎ＝３）で示
す。
【図２１】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おき
に３回ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを筋注して免疫化し
た。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投
与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した
（全気道誘発）。生存マウス（１０匹／群）の比率を誘
発後の時間に対してプロットした。
に３回ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを筋注して免疫化し
た。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投
与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した
（全気道誘発）。生存マウス（１０匹／群）の比率を誘
発後の時間に対してプロットした。
【図２２】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おき
に３回ＮＰ ＤＮＡ １００μｇを筋注して免疫化し
た。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投
与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した
（全気道誘発）。マウスを毎日計量し、各生存マウスに
関して初期体重との比率を算出した。初期体重との平均
パーセントを±ＳＥＭ対誘発後の時間でプロットした。
に３回ＮＰ ＤＮＡ １００μｇを筋注して免疫化し
た。麻酔下での３００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８投
与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発した
（全気道誘発）。マウスを毎日計量し、各生存マウスに
関して初期体重との比率を算出した。初期体重との平均
パーセントを±ＳＥＭ対誘発後の時間でプロットした。
【図２３】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おき
に３回ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを筋注して免疫化し
た。非麻酔下での２０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６
８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発し
た（上部気道誘発）。誘発後７日目にマウスを安楽死さ
せて、肺を摘出し、ホモジェナイズして、ＭＤＣＫ細胞
に関する順次測定によりウイルス力価を測定した。
に３回ＮＰ ＤＮＡ ２００μｇを筋注して免疫化し
た。非麻酔下での２０００ＴＣＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６
８投与により３回目の免疫化後３週目にマウスに誘発し
た（上部気道誘発）。誘発後７日目にマウスを安楽死さ
せて、肺を摘出し、ホモジェナイズして、ＭＤＣＫ細胞
に関する順次測定によりウイルス力価を測定した。
【図２４】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おき
に３回ＮＰ ＤＮＡ ６．２５、２５、１００又は２０
μ″ｇを筋注して免疫化した。麻酔下での３００ＴＣＩ
Ｄ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３
週目にマウスに誘発した（全気道誘発）。生存マウス
（１０匹／群）の比率を誘発後の時間に対してプロット
した。
に３回ＮＰ ＤＮＡ ６．２５、２５、１００又は２０
μ″ｇを筋注して免疫化した。麻酔下での３００ＴＣＩ
Ｄ５０のＡ／ＨＫ／６８投与により３回目の免疫化後３
週目にマウスに誘発した（全気道誘発）。生存マウス
（１０匹／群）の比率を誘発後の時間に対してプロット
した。
【図２５】４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、３週間おき
に３回、２００μｇのＮＰ ＤＮＡ、対照ＤＮＡ又は模
擬物質を筋注して免疫化した。次に麻酔下で３００ＴＣ
ＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いてＤＮＡの３回注射後
６、１２及び２５週目にマウスに誘発した。選択マウス
では２２週目にＮＰ ＤＮＡ ２００μｇで再免疫化
し、次いで２５週目に誘発した（“追加免疫”）。平均
体重は、各群に関する初期全体重の百分率として示す。
図示した対照体重は６、１２及び２５週誘発からの全対
照群、対照ＤＮＡを摂取した又は模擬物質を注射した６
群の合計の体重の平均である。各群は最初は各々１０匹
の動物を含有した。死亡したマウスは次の重量分析から
除外した。
に３回、２００μｇのＮＰ ＤＮＡ、対照ＤＮＡ又は模
擬物質を筋注して免疫化した。次に麻酔下で３００ＴＣ
ＩＤ５０のＡ／ＨＫ／６８を用いてＤＮＡの３回注射後
６、１２及び２５週目にマウスに誘発した。選択マウス
では２２週目にＮＰ ＤＮＡ ２００μｇで再免疫化
し、次いで２５週目に誘発した（“追加免疫”）。平均
体重は、各群に関する初期全体重の百分率として示す。
図示した対照体重は６、１２及び２５週誘発からの全対
照群、対照ＤＮＡを摂取した又は模擬物質を注射した６
群の合計の体重の平均である。各群は最初は各々１０匹
の動物を含有した。死亡したマウスは次の重量分析から
除外した。
【図２６】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰをコードするＤＮＡ
１ｍｇ、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＭ１をコード
するＤＮＡ １ｍｇ、又は両ＤＮＡを併合したもの １
ｍｇを用いて、０及び４２日目に免疫化した。対照フェ
レットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／
株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイ
ルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０
及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を
用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時の
ウイルス脱落は上記と同様に測定した。３〜５日目のウ
イルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェ
レットの脱落と比較した。ＮＰ ＤＮＡ、Ｍ１ ＤＮＡ
又はＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は
対照フェレットの脱落よりも有意に低かった（それぞれ
ｐ＜０．０００１、０．００１６及び＜０．０００
１）。ＮＰ（データは示されていない）、Ｍ１又はＮＰ
＋Ｍ１投与フェレットの脱落は、認可ワクチン投与フェ
レットの場合の脱落と有意に異ならなかった（それぞれ
ｐ＝０．１０４、０．５３３及び０．１４５）。１ｍｇ
の免疫化用量は、任意に選択した。用量範囲試験は非ヒ
ト霊長類で実施した。
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰをコードするＤＮＡ
１ｍｇ、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＭ１をコード
するＤＮＡ １ｍｇ、又は両ＤＮＡを併合したもの １
ｍｇを用いて、０及び４２日目に免疫化した。対照フェ
レットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／
株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイ
ルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０
及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を
用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時の
ウイルス脱落は上記と同様に測定した。３〜５日目のウ
イルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェ
レットの脱落と比較した。ＮＰ ＤＮＡ、Ｍ１ ＤＮＡ
又はＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は
対照フェレットの脱落よりも有意に低かった（それぞれ
ｐ＜０．０００１、０．００１６及び＜０．０００
１）。ＮＰ（データは示されていない）、Ｍ１又はＮＰ
＋Ｍ１投与フェレットの脱落は、認可ワクチン投与フェ
レットの場合の脱落と有意に異ならなかった（それぞれ
ｐ＝０．１０４、０．５３３及び０．１４５）。１ｍｇ
の免疫化用量は、任意に選択した。用量範囲試験は非ヒ
ト霊長類で実施した。
【図２７】雄２２〜２５週齢フェレット８匹の各群を対
照ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３
４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及
び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。
免疫化動物はＮＰ ＤＮＡ １ｍｇ又はＮＰ、ＮＳ１、
ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１ ＤＮＡを併合したもの ２ｍ
ｇ（各構成分 ４００μｇ）を摂取した。対照は食塩水
０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ １ｍｇを摂取した。
解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群を併
合し（対照）、ＮＰ ＤＮＡを単独で又は他の内部タン
パク質遺伝子と組合せて摂取した群（内部）と比較し
た。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄液の５０μｌ当
たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性力価を示す。未
希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸出物の１：１０
希釈物であると仮定して、陽性未希釈標本は１ ｌｏｇ
の値を割り当てた。１ ｌｏｇより大きい力価は３回の
反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ内挿法に基づ
いて割り当てて、５ｇ％感染性終点を得た。未希釈を試
験した場合に陰性であった標本には、０ ｌｏｇの値を
割り当てた。グラフに示したｐの値を、２平均に関する
Ｔ−検定により指定日に免疫化フェレット対対照に関し
てコンピューター処理する。全曲線に関するｐの値を２
次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＮＰ対
対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．００
１となった。
照ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３
４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及
び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。
免疫化動物はＮＰ ＤＮＡ １ｍｇ又はＮＰ、ＮＳ１、
ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１ ＤＮＡを併合したもの ２ｍ
ｇ（各構成分 ４００μｇ）を摂取した。対照は食塩水
０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ １ｍｇを摂取した。
解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群を併
合し（対照）、ＮＰ ＤＮＡを単独で又は他の内部タン
パク質遺伝子と組合せて摂取した群（内部）と比較し
た。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄液の５０μｌ当
たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性力価を示す。未
希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸出物の１：１０
希釈物であると仮定して、陽性未希釈標本は１ ｌｏｇ
の値を割り当てた。１ ｌｏｇより大きい力価は３回の
反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ内挿法に基づ
いて割り当てて、５ｇ％感染性終点を得た。未希釈を試
験した場合に陰性であった標本には、０ ｌｏｇの値を
割り当てた。グラフに示したｐの値を、２平均に関する
Ｔ−検定により指定日に免疫化フェレット対対照に関し
てコンピューター処理する。全曲線に関するｐの値を２
次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＮＰ対
対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．００
１となった。
【図２８】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウ
イルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、２００μ
ｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又は
対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回節注した。
最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ５０の
Ａ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での鼻腔下
での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘発
後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９又
は１０匹／群）。
イルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、２００μ
ｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又は
対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回節注した。
最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ５０の
Ａ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での鼻腔下
での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘発
後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９又
は１０匹／群）。
【図２９】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウ
イルスで誘発したマウスの体重損失。マウスに、２００
μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又
は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回節注し
た。最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での
鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、各群に関
して平均を出した各固体の初期体重の％対時間としてプ
ロットした（死亡動物は平均から除外した）。
イルスで誘発したマウスの体重損失。マウスに、２００
μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードするＤＮＡ又
は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３回節注し
た。最終免疫化後３週目にマウスに１０００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔下での
鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、各群に関
して平均を出した各固体の初期体重の％対時間としてプ
ロットした（死亡動物は平均から除外した）。
【図３０】ＤＮＡで免疫化し、次いでインフルエンザウ
イルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、１、１０
又は１００μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードす
るＤＮＡ又は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３
回節注した。最終免疫化後３週目にマウスに１０００Ｔ
ＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔
下での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘
発後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９
又は１０匹／群）。
イルスで誘発したマウスの生存率。マウスに、１、１０
又は１００μｇのＡ／ＰＲ／３４からのＨＡをコードす
るＤＮＡ又は対照（非コード）ＤＮＡを３週間置きに３
回節注した。最終免疫化後３週目にマウスに１０００Ｔ
ＣＩＤ５０のＡ／ＰＲ／３４を用いた全気道誘発（麻酔
下での鼻腔内点滴注入による）を施した。データは、誘
発後の生存率（％）対時間としてプロットした（ｎ＝９
又は１０匹／群）。
【図３１】雄２２〜２５週齢フェレット８匹の各群を対
象ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３
４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及
び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。
免疫化動物はＨＡ ＤＮＡ １ｍｇ又はＨＡ、ＮＰ、Ｎ
Ｓ１、ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１ ＤＮＡを併合したもの
２ｍｇ（各構成分 ３３０μｇ）を摂取した。対照は食
塩水 ０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ １ｍｇを摂取し
た。解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群
を併合し（対照）、ＨＡ ＤＮＡを単独で又は他の内部
タンパク質遺伝子と組合せて摂取した群（ＨＡ，ＨＡ＋
内部）と比較した。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄
液の５０μｌ当たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性
力価を示す。末希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸
出物の１：１０希釈物であると仮定して、陽性末希釈標
本に１ ｌｏｇの値を割り当てた。１ ｌｏｇより大き
い力価は３回の反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃ
ｈ内挿法に基づいて割り当てて、５０ｇ％感染性終点を
得た。未希釈を試験した場合に陰性であった標本には、
０ ｌｏｇの値を割り当てた。全曲線に関するｐの値を
２次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＨＡ
対対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．０
００１となった。
象ＤＮＡ、食塩水又はインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３
４タンパク質をコードするＤＮＡを筋注して０、２１及
び１２１日目に免疫化し、１４８日目に２００ＴＣＩＤ
５０のＡ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与して誘発した。
免疫化動物はＨＡ ＤＮＡ １ｍｇ又はＨＡ、ＮＰ、Ｎ
Ｓ１、ＰＢ１、ＰＢ２及びＭ１ ＤＮＡを併合したもの
２ｍｇ（各構成分 ３３０μｇ）を摂取した。対照は食
塩水 ０．５ｍｌ／足又は対照ＤＮＡ １ｍｇを摂取し
た。解析の都合上、食塩水及び対照ＤＮＡを摂取した群
を併合し（対照）、ＨＡ ＤＮＡを単独で又は他の内部
タンパク質遺伝子と組合せて摂取した群（ＨＡ，ＨＡ＋
内部）と比較した。グラフは、３ｍｌの容量の鼻腔洗浄
液の５０μｌ当たりのＴＣＩＤ５０での鼻腔洗浄感染性
力価を示す。末希釈洗浄液（試験最低希釈）は原鼻腔浸
出物の１：１０希釈物であると仮定して、陽性末希釈標
本に１ ｌｏｇの値を割り当てた。１ ｌｏｇより大き
い力価は３回の反復実験の中からＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃ
ｈ内挿法に基づいて割り当てて、５０ｇ％感染性終点を
得た。未希釈を試験した場合に陰性であった標本には、
０ ｌｏｇの値を割り当てた。全曲線に関するｐの値を
２次元分散分析によりコンピューター処理すると、ＨＡ
対対照は＜０．０００１、併合ＤＮＡ対対照は＜０．０
００１となった。
【図３２】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／
Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ １
ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フ
ェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／
株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイ
ルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０
及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を
用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時の
ウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウ
イルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェ
レットの脱落と比較した。ＨＡ ＤＮＡ投与フェレット
における脱落は対照フェレットの脱落よりも有意に低か
った（ｐ＜０．０００１）。
Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ １
ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対照フ
ェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／
株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイ
ルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０
及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を
用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時の
ウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウ
イルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェ
レットの脱落と比較した。ＨＡ ＤＮＡ投与フェレット
における脱落は対照フェレットの脱落よりも有意に低か
った（ｐ＜０．０００１）。
【図３３】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／
Ｈａｗａｉｉ／９１又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９（デ
ータは示されていない）からのＨＡをコードするＤＮＡ
１ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対
照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μ
ｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全
ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）
を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９
３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄
時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目
のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与
フェレットの脱落と比較し、著しく低い（ｐ＜０．００
０１）ことを認めた。Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１ ＨＡ
ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は認可物質投与フェ
レットの脱落よりも有意に低かった（Ａ／Ｈａｗａｉｉ
／９１ ＨＡ ＤＮＡに関してはｐ＝０．０２１；１〜
６日目についての２次元分散分析）。一方、Ａ／Ｂｅｉ
ｊｉｎｇ／８９ ＨＡＤＮＡ投与フェレットの場合の脱
落（データは示されていない）は認可物質投与フェレッ
トにおける脱落と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０５
８；１〜６日目についての２次元分散分析）。
Ｈａｗａｉｉ／９１又はＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９（デ
ータは示されていない）からのＨＡをコードするＤＮＡ
１ｍｇを筋注して、０及び４２日目に免疫化した。対
照フェレットは非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μ
ｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全
ウイルスインフルエンザワクチン（９２〜９３処方物）
を０及び４２日目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９
３を用いて５６日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄
時のウイルス脱落は上記と同様に測定した。１〜６日目
のウイルス脱落を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与
フェレットの脱落と比較し、著しく低い（ｐ＜０．００
０１）ことを認めた。Ａ／Ｈａｗａｉｉ／９１ ＨＡ
ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落は認可物質投与フェ
レットの脱落よりも有意に低かった（Ａ／Ｈａｗａｉｉ
／９１ ＨＡ ＤＮＡに関してはｐ＝０．０２１；１〜
６日目についての２次元分散分析）。一方、Ａ／Ｂｅｉ
ｊｉｎｇ／８９ ＨＡＤＮＡ投与フェレットの場合の脱
落（データは示されていない）は認可物質投与フェレッ
トにおける脱落と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０５
８；１〜６日目についての２次元分散分析）。
【図３４】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／
Ｈａｗａｉｉ／９１（図１３参照）からのＨＡをコード
するＤＮＡ １ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／
９１からのＨＡ並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からの
ＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡ各々３３０μｇを筋注
して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは
非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフ
ルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日
目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６
日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱
落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落
を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱
落と比較した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレッ
トにおける脱落は認可ワクチン（ｐ＜０．０００１）又
はＨＡ ＤＮＡ単独（ｐ＝０．００５３）投与フェレッ
トの脱落よりも有意に低かった。
Ｈａｗａｉｉ／９１（図１３参照）からのＨＡをコード
するＤＮＡ １ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／
９１からのＨＡ並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からの
ＮＰ及びＭ１をコードするＤＮＡ各々３３０μｇを筋注
して、０及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは
非コードＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／
Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフ
ルエンザワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日
目に摂取した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６
日目にフェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱
落は上記と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落
を２次元分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱
落と比較した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレッ
トにおける脱落は認可ワクチン（ｐ＜０．０００１）又
はＨＡ ＤＮＡ単独（ｐ＝０．００５３）投与フェレッ
トの脱落よりも有意に低かった。
【図３５】成熟（２２〜２８週齢）雄フェレットをＡ／
Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ １
ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１からのＨ
Ａ、並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰ及びＭ
１をコードするＤＮＡ 各々３３０μｇを筋注して、０
及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コード
ＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊ
ｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザ
ワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取
した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフ
ェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記
と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元
分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較
した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレットにおけ
る脱落は同種ＨＡ ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落
と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０６４）。
Ｇｅｏｇｉａ／９３からのＨＡをコードするＤＮＡ １
ｍｇを用いて、又はＡ／Ｈａｗａｉｉ／９１からのＨ
Ａ、並びにＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９からのＮＰ及びＭ
１をコードするＤＮＡ 各々３３０μｇを筋注して、０
及び４２日目に免疫化した。対照フェレットは非コード
ＤＮＡ又は全ヒト用量（１５μｇ／株）のＡ／Ｂｅｉｊ
ｉｎｇ／８９を含有する認可全ウイルスインフルエンザ
ワクチン（９２〜９３処方物）を０及び４２日目に摂取
した。Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３を用いて５６日目にフ
ェレットに誘発した。鼻腔洗浄時のウイルス脱落は上記
と同様に測定した。１〜６日目のウイルス脱落を２次元
分散分析により対照ＤＮＡ投与フェレットの脱落と比較
した。ＨＡ＋ＮＰ＋Ｍ１ ＤＮＡ投与フェレットにおけ
る脱落は同種ＨＡ ＤＮＡ投与フェレットにおける脱落
と有意に異ならなかった（ｐ＝０．０６４）。
【図３６】発現ベクターＶ１Ｒ，配列番号４５の配列。
フロントページの続き (72)発明者 ジヨン・ジエイ・ドンリー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19083、ヘイバータウン、ビアウツド・ ロード・1505 (72)発明者 バラバニ・ジエイ・ドウワルキ アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 94501、アラメダ、ブロードウエイ・ 1175、アパートメント・エヌ (72)発明者 マーガレツト・エイ・リウ アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 19190、ローズモント、クツシユマン・ ロード・４ (72)発明者 ドンナ・エル・モンゴメリー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 18914、カルフオント、ヒツコリー・レ ーン・９ (72)発明者 スザンヌ・イー・パーカー アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92130、サン・デイエゴ、カーメル・ラ ンデイング・3646 (72)発明者 ジヨン・ダブリユ・シバー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 18901、ドイルスタウン、ビユーラ・ロ ード・125 (72)発明者 ジエフリー・ビー・ウルマー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・ 18914、カルフオント、ドリー・サーク ル・128 (56)参考文献 特開 昭63−304988（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−51992（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−507203（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−503464（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501973（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／3173（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｕｒｒａｌ ｏｆ Ｇｅｕｅｒａ ｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．73 （1992）ｐ．359−367 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/44 A61K 39/145 A61K 31/70 A61K 48/00 C07H 21/04 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 インフルエンザウイルスによる疾病から
動物を防御するために投与されるポリヌクレオチドワク
チンであって、核タンパク質、ポリメラーゼ、マトリッ
クス又は非構造ヒトインフルエンザウイルス遺伝子生成
物質から選択されるインフルエンザウイルスタンパク質
をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合した調
節配列を少なくとも１つ有するＤＮＡブラスミドを含む
ポリヌクレオチドワクチン。 - 【請求項２】 上記ＤＮＡがＶ１Ｊｎｓ ＤＮＡプラス
ミドベクターと調節配列の少くとも１つに操作可能に結
合した上記インフルエンザウイルスタンパク質をコード
する上記ヌクレオチド配列とを含む請求項１に記載のポ
リヌクレオチドワクチン。 - 【請求項３】 １つ又はそれ以上の下記の： ａ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ６．４２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５２でありそしてこれの３′末端が配列
番号５３である）； ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ５．６２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５４でありそしてこれの３′末端が配列
番号５５である）； ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．５４Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５６でありそしてこれの３′末端が配列番号
５７である）；及び ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ５．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５８でありそしてこれの３′末端が配列番号
５９である）から選択されるＤＮＡ構築物を含有する請
求項１または２に記載のポリヌクレオチドワクチン。 - 【請求項４】 非ヒト動物における、予防的有効量の請
求項１ないし３のいずれかに記載のＤＮＡによる免疫化
を包含するインフルエンザウイルスによる感染に対する
防御方法。 - 【請求項５】 生体組織へのＤＮＡの直接投与を包含す
る請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 ＤＮＡが担体を用いずに生理的に許容可
能な溶液中の裸ＤＮＡとしてあるいはＤＮＡとリポソー
ムの混合物としてあるいはアジュバントとの又はトラン
スフェクション促進剤との混合物として投与される請求
項５記載の方法。 - 【請求項７】 下記のＤＮＡ； ａ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−ＮＰ（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ６．４２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５２でありそしてこれの３′末端が配列
番号５３である）； ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＢＪ−Ｍ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３
５３／８９），構築物サイズ５．６２Ｋｂ（これの５′
末端が配列番号５４でありそしてこれの３′末端が配列
番号５５である）； ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−ＮＰ（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ６．５４Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５６でありそしてこれの３′末端が配列番号
５７である）；及び ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ−ＰＡ−Ｍ１（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５
／９０），構築物サイズ５．６１Ｋｂ（これの５′末端
が配列番号５８でありそしてこれの３′末端が配列番号
５９である）。
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| US089985 | 1993-07-08 | ||
| US032383 | 1993-07-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| EP1017283B1 (en) * | 1997-02-14 | 2004-12-15 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
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| AU2005248361B2 (en) | 2004-05-18 | 2010-03-11 | Vical Incorporated | Influenza virus vaccine composition and methods of use |
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| WO2008150998A1 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detecting influenza a and influenza b virus |
| US8354230B2 (en) * | 2007-12-21 | 2013-01-15 | Quest Diagnostics Investments Inc. | Multiplex detection assay for influenza and RSV viruses |
| CN102170902B (zh) | 2008-08-01 | 2015-07-15 | 伽玛疫苗有限公司 | 流感疫苗 |
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| SG168423A1 (en) * | 2009-07-13 | 2011-02-28 | Agency Science Tech & Res | Influenza detection method and kit therefor |
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| Bhattacharya et al. | Sub-unit Peptide and Genetic Vaccination with Measles Virus | |
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