SI9420014A - Nucleic acid pharmaceuticals. - Google Patents

Description

Merck & Co., Inc.

126 Ea$t Lincoln Avenue Rahway, NJ 07065 ZDA

ZDRAVILNI PRIPRAVEK Z NUKLEINSKO KISLINO

Izumitelji:

John J. Donnelly, J. Varavani, Margaret J. Liu, Donna L. Montgomery, Suezanne E. Parker, John Shiver, Jeffrey Ulmer

ZDRAVILNI PRIPRAVEK Z NUKLEINSKO KISLINO

LITERATURA, KI SE NANAŠA NA PATENTNO PRIJAVO

Predloženi izum je delno nadaljevanje izuma USSN 08/089.985, ki je bil vložen 8. julija 1993 in še ni bil odobren, le-ta pa je nadaljevanje izuma USSN 08/032.383, ki je bil vložen 18. marca 1993, ter še tudi ni bil odobren.

TEORETIČNE OSNOVE IZUMA

i. Področje izuma

Predloženi izuma se nanaša na izdelavo in uporabo novejšega farmacevtskega proizvoda: nukleinsko kislino, ki po aplikaciji neposredno v živo tkivo vretenčarjev sproži imunski odziv proti humanemu virusu influence (gripe).

ii. Teoretične osnove izuma

Gripa je akutno vročinsko obolenje, posledica okužbe dihalnih poti z virusom gripe A ali B. Vsako leto širom po svetu zasledimo zbruhe gripe periodično, kot epidemije ali pandemije. Gripa lahko povzroči značilne sistemske znake, resna obolenja (kot je virusna pljučnica) ki zahtevajo bolnišnično zdravljenje in zaplete, kot je sekundarna bakterijska pljučnica. Domnevajo, da je bilo pri nedavnih epidemijah v Združenih državah Amerike > 10.000 (do 40.000) smrtnih primerov letno in v neepidemičnih letih 5.000 do 10.000 smrtnih primerov. Najboljša strategija za preprečevanje bolezni in umrljivosti zaradi gripe, je cepljenje. Obstoječa registrirana cepiva vsebujejo tri različne seve inaktiviranega virusa (dva seva A in sev B), ki jih razmnožujejo v jajcih. Na voljo ima tri različne vrste cepiv: cepivo z živim virusom, oslabljenim virusom in prečiščenim površinskim antigenom. Zadnja dva uporabljamo pri cepljenju otrok, zaradi povečanega vročinskega odziva ob uporabi cepiva z živim virusom. Pri otrocih, mlajših od 9 let, sta potrebni dve cepljenji medtem, ko pri odraslih imunizacijo dosežemo že po enkratnem cepljenju. Vendar predlagajo [glej Medical Letter 32: 89-90, 17. september 1993], da je za paciente, ki so bili cepljeni zgodaj spomladi koristno, da se ponovno cepijo pozimi ali zgodaj spomladi, saj so pri nekaterih starejših pacientih opazili, da se količina protiteles po cepljenju v štirih mesecih ali še prej, zniža pod raven, ki več ne zagotavlja zaščite. Cepiva so na novo pripravljena vsako leto, glede na predvidevanja, kateri virusni sev bo povzročitelj in oceno o tem, kateri sev bo prevladoval v prihajajoči sezoni. Priporočljivo je vsakoletno cepljenje.

A. Omejitve registriranih cepiv so:

1) Spreminjanje antigena, posebaj pri sevih A, je vzrok, da protitelesa, ki so bila proizvedena pri predhodnem cepljenju (ali obolenju), virusa ne nevtralizirajo. V novih sevih pride do točkovne mutacije (naključna zamenjava nukleotida v specifični nukleotidni sekvenci gena - antigenic drift) in prerazporeditve nukleotidov (antigenic shift) pri genih, ki nosijo zapis za površinske glikoproteine (hemaglutinin - HA in neuraminidazo) medtem, ko ostajajo notranji proteini pri sevih z naključno zamenjanimi in prerazporejenimi genskimi nukleotidi nespremenjeni. Z imunizacijo dosežemo homologno imunost, kjer pride do tvorbe specifičnih protiteles proti določenemu sevu, ne pa tudi heterologne splošne imunosti proti skupini, ki temelji na celično posredovanem odzivu.

2) Čeprav pri prevladujočih krožečih sevih virusa gripe iz leta v leto ne pride do značilnejših mutacij, je vsakoletna imunizacijo kljub temu potrebna, zaradi znižanja količine protiteles. Čeprav nekateri poročajo, da hemaglutinin inhibirajoča (HI) in nevtralizacijska protitelesa, kljub postopnemu zniževanju vztrajajo od nekaj mesece do nekaj let pa Nadzorni odbor na imunizacijskih mestih meni, da je padec količine protiteles v letu po cepljenju vzrok za vsakoletno imunizacijo, čeprav pri sevih niso opazili večjih naključnih prerazporeditev in zamenjav genskih nukleotidov. (HI protitelesa inhibirajo sposobnost virusa gripe, da zleplja rdeče krvničke. Enako kot nevtralizacijska protitelesa, primarno reagirajo s HA antigenom. Izvedba hemaglutininskega inhibicijskega testa je enostavnejša in cenejša od izvedbe nevtralizacijskega testa in je zato test izbire pri dokazovanju sposobnosti protiteles, ki so se tvorila proti enemu sevu virusa gripe, da reagirajo na različne seve). Kot je že omenjeno, v Medica! Letter predlagajo, da naj bi bili zaradi večjega tveganja starostniki cepljeni dvakrat v eni sezoni, saj je življenska doba zaščitnih protiteles kratka.

3) Učinkovitost cepiva je slabša. Razvoj cepiva za naslednjo sezono temelji na predvidevanjih o prihajajočih krožečih sevih (preko rutinskega vzorčenja v Aziji), ki pa je netočno in je zato ujemanje med sevi uporabljenimi za cepivo in tistimi, ki povzročajo okužbo, slabo. To se je zgodilo v sezoni gripe 1992 - 1993, saj je v drugi polovici sezone postal klinično pomemben nov sev H3N2 (A/Beijing/92). To je narekovalo spremembo sestave cepiva za naslednjo sezono 1993 - 1994, saj je bila navzkrižna reaktivnost A/Beijing/92, zaradi točkovne mutacije antigena (antigenic shift), s protitelesi, ki so se tvorila pri okužbah z zgodnejšimi sevi H3N2 (A/Beijing/89), slaba. Zaradi časa, ki je potreben za izdelavo in oblikovanje sedanjega registriranega cepiva, novega cepiva ni bilo možno uporabiti v sezoni 1992 - 1993, kljub dokazano slabi zaščiti, ki jo je le-ta nudil proti novim, bolj virulentnim krožečim sevom H3N2.

Celo ko se cepivo in krožeči sevi zelo dobro ujamejo, registrirano cepivo prepreči obolenje le pri približno 70% zdravih otrok in mladostnikov ter 30 - 40% slabotnejših starostnikov. Zato so za ugotavljanje učinkovitosti cepiva in ujemanja s krožečimi sevi uporabljeni tudi drugi kriteriji. Ti kriteriji so: preventiva pred resnejšimi obolenji in sekundarnimi zapleti in zato bolnišnično zdravljenje ni potrebno (pri 70% starostnikov, ki živijo doma v primerjavi s 50 - 60% starostnikov, ki živijo v domovih za ostarele) ter preprečevanje umrljivosti (pri 80% starostnikov v domovih za ostarele). Skupinska imunost, ki pripomore k zmanjšanem širjenju infekcije v domovih za ostarele, je druga prednost imunizacije.

B. Značilnosti idealnega splošnega cepiva proti gripi (predmet izuma)

1) Omogoča široko splošno zaščito. Splošno cepivo naj bi bilo sposobno zaščiti pred različnimi sevi, npr. v okviru podvrste H3N2, in če je mogoče tudi navzkrižno zaščito med različnimi podvrstami, to je H1N1 do H3N2. Slednja naj bi bila posredovana s pomočjo citotoksičnh T limfocitov (CTL), ki prepoznajo antigene notranjih, ohranjenih virusnih proteinov, čeprav naj bi imela pomembno vlogo nevtralizacijska protitelesa, ki reagirajo z ohranjenimi deli proteinov vezanih na membrano.

2) Povečana širina protitelesnega odziva. Menijo, da so CTL pomembni pri okrevanju, zato je pričakovati, da naj bi cepivo, ki izzove izključno CTL odziv, skrajšalo trajanje bolezni (do točke ko menimo, da ni več opaziti klinično pomembnih bolezenskih znakov), vendar bolezni ne bi popolnoma preprečilo. Eksperimentalno je dokazano, da obstoječa metoda za pripravo sedanjega cepiva proti gripi, inokulacija virusa v jajce, omogoče izbiro virusne podpopulacije, ki ima spremenjeno antigenost. Rezultat tega je lahko zmanjšana učinkovitost cepiva, ker protitelesa, ki nastajajo po cepljenju, niso popolnoma učinkovita proti prevladujočemu krožečemu sevu. Mi pa želimo izzvati tvorbo protiteles, z večjo širino kot sedanje cepivo. Gripa v sezoni 1992 -93 bila izvrstna prilika za študij omejitev sedanjega cepiva z A/Beijing/89, in izzove tvorbo slabo navzkrižno reaktivnih protiteles, (ki nudijo slabo zaščito) proti novemu, veliko bolj virulentnemu sevu A/Beijing/92. Oba seva sta enake podvrste H3N2. Če to opišemo s sekvenco (zaporedjem) aminokislin se sevi, podobni A/Beijing/92, razlikujejo od sevov, podobnih A/Beijing/89,. v 11 točkovnih mutacijah (položaji 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193,226 in 262) na področju HA1. Ni pa znano ali obstoječi proizvodni proces vpliva na slabšo navzkrižno rektivnost, vendar je jasno, da je zaželena večja širina protiteles.

3) Podaljšano trajanje protitelesnega odziva. Zaradi zelo rizične skupine, kar se tiče obolevanja in umrljivosti po okužbi z virusom gripe (starostniki) ter je to istočasno skupina, pri kateri se zaščitna količina protiteles zelo hitro znižuje, je za učinkovito imunizacijo nujno potrebno izboljšano cepivo, ki bi zagotovilo tvorbo zaščitnega titra protiteles, z daljšo življensko dobo.

C. Polinukleotidi kot cepivo

Intramuskularna aplikacija polinukleotidnih konstruktov, to je DNK plazmidov s kodnim zapisom za proteine, je v mišični celici sprožila in situ tvorbo proteinov. Uporaba cDNK plazmidov, s kodnim zapisom za virusne proteine, je vzpodbudila tako protitelesni kot CTL odziv in torej zagotovila tako homologno kot heterologno zaščito proti kasnejšim okužbam s homologno zaščito ali zaščito pred različnimi sevi. Vsaka vrsta imunskega odziva predstavlja morebitno prednost pred uveljavljeno strategijo cepljenja. Z uporabo PNV, ki sproži tvorbo protiteles lahko podaljšamo trajanje protitelesnega odziva, kot tudi obstoj antigena, ki ima oboje, natančno sekvenco klinično krožečega seva virusa, kot tudi ustrezno post-translacijsko modifikacijo in konformacijo naravnega proteina (v primerjavi z rekombinantnim proteinom). CTL odziv, ki ga sprožimo s tem cepivom, omogoča navzkrižno zaščito proti različnim sevom, brez uporabe živega, potencialno nevarnega patogenega vektorja ali oslabljenega virusa.

D. Nadaljni opis teoretičnih osnov izuma

Glavni izziv v razvoju cepiv proti virusom gripe, proti katerim se tvorijo nevtralizacijska protitelesa, je različnost proteinov virusne ovojnice pri različnih izolantih ali sevih. Ker so citotoksični T limfociti pri miših in pri ljudeh sposobni prepoznati epitope, pridobljene iz ohranjenih notranjih virusnih proteinov [J. W. Yewdell et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 1785 (1985); A.R.M. Townsend, et al., Celi 44, 959 (1986); A.J. McMichael et al., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin et al., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend in H. Bodmer, Annu. Rev. Immunot. 7, 601 (1989)] menijo, da so pomembni pri imunskem odzivu proti virusom [Y.-L. Lin in B.A. Askonas, J. Exp. Med. 154, 225 (1981); I. Gardner et al., Eur.

J. Immunol. 4 68 (1974); K.L. Yap in G.L. Ada, Nature 273,238 (1978); A.J. McMichael et al., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P.M. Taylor in B.A. Askonas, Immunol. 58, 417 (1986)] so napore usmerili v razvoj CTL cepiv, ki imajo sposobnost zagotoviti heterologno zaščito proti različnim virusnim sevom.

CD8+CTL ubijajo z virusom okužene celice, ko receptorji T celic prepoznajo virusne peptide, povezane z molekulami MHC razred I [R.M. Zinkernagel in P.C. Doherty, ibid. 141, 1427 (1975); R.N. Germain, Nature 353, 605 (1991)]. Ti proteini so nastali iz endogeno sintetiziranih virusnih proteinov, ne glede na lokacijo ali funkcijo proteina v virusu. Torej s tem, da prepoznajo epitop ohranjenih virusnih proteinov lahko CTL zagotavljajo navzkrižno zaščito pred različnimi virusnimi sevi. Peptidi, ki so sposobni povezovanja z molekulami MHC razred I in jih CTL prepozna, izvirajo iz proteinov, ki so prisotni ali prehajajo skozi citoplazmo ali endoplazmatski retikulum [J.W. Yewdell in J.R. Bennink, Science 244, 1072 (1989); A.R.M. Tovvnsend et al., Nature 340, 443 (1989); J.G. Nuchtern et al., ibid. 339, 223 (1989)]. Torej v splošnem eksogeni proteini, ki vstopajo v endosomalno pot nastajanja (kot je to v primeru antigenov, ki jih predstavljajo molekule MHC razred II), niso učinkoviti pri nastajanju CD8+CTL odziva.

CTL odziv smo skušali sprožiti z uporabo replikativnih vektorjev, kjer se tvori proteinski antigen v celici [J.R. Bennink et al., ibid. 311, 578 (1984); J.R. Bennink in J.W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C.K. Stover et al., Nature 351, 456 (1991); A. Aldovini in R.A. Young, Nature 351, 479 (1991); R. Schafer et al., J. Immunol. 149, 53 (1992); C.S. Hahn et al., Proč. Natl. acad. Sci. (USA) 89, 2679 (1992)] ali z uvedbo proteinov v citosol [F.R.Carbone in M.J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres, Nature 342, 561 (1989); H. Takahashi et al., ibid. 344, 837 (1990); D.S. Collins et al., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M.J. Newman et al., ibid. 148, 2357 (1992)]. Oba pristopa imata omejitve, ki lahko zmanjšajo koristnost cepiva. Uporaba retrovirusnih vektorjev je omejena z velikostjo in zgradbo polipeptidov, ki se lahko združijo medtem, ko ohranijo sposobnost rekombinantnega proteina, da se podvajajo [A.D. Miller, Curr. Top. Microb. Immunol. 158, 1 (1992)] in učinkovitost vektorja kot cepiva, za kasnejše imunizacije, saj lahko pride do imunskega odziva proti vektorjem samim [E.L. Cooney et. al., Lancet 337, 567 (1991)]. Tudi uporaba virusnih vektorjev in modificiranih patogenov na ljudeh ni brez nevarnosti [R.R. Redfield et al., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola et al., Arch. Intern. Med. 149, 1569 (1989)]. Izbor peptidnih epitopov je odvisen od zgradbe posameznih MHC antigenov saj imajo peptidna cepiva, zaradi različnosti hapiotipov MHC v naslednih populacijah, lahko omejeno učinkovitost.

Benvenisty, N. in Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555 (1986)] sta pokazala, da lahko pride do ekspresije DNK, oborjena s CaCI₂, ki so jo nato aplicirali miši intraperitonealno, intravensko ali imtramuskularno. Opazili smo, da po intramuskularni (i.m.) injekciji DNK ekspresijskega vektorja pri miši pride do prevzema DNK v mišične celice in ekspresije odgovarjajočega proteina [J.A. Wolff et. al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Pokazalo se je, da se plazmidi, vgrajeni episomalno, ne podvajajo. Po i.m. injekciji, v skeletno mišico miši, rib in primatov ter mišjo srčno mišico, so opazili stalno ekspresijo [H. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et al., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol.

Genet. 1, 363 (1992)]. O uporabi nukleinskih kislin so poročali v W090/11092 (4. oktober 1990), kjer so uporabili čiste polinukleotide za cepljenje vretenčarjev.

Za uspešnost cepljenja ni nujno, da je imunizacija intramuskularna. Tang in sodelavci [Nature 356, 152-154 (1992)] so ugotovili, da vnos zlatih mikroprojektilov obloženih z DNK s kodnim zapisom za goveji rastni hormon (BGH) v kožo miši sproži nastajanje anti-BGH protiteles. Furth in sodelavci [Analytical Biochemistry 205, 365-368 (1992)] so opisali uporabo jet injektorjev pri transfekciji (prenosu) kože, mišic, maščobe in tkiva dojk živih živalih. Friedman je skupaj s sodelavci [Science 244, 1275-1281 (1989) ] pred nedavnim objavil pregledni članek o različnih načinih vnosa nukleinskih kislin. Glej tudi Robinson et al., Abstract of Papers predstavljenih leta 1992 na srečanju Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, 92 str., kjer so trdili da i.m., i.p., in i.v. aplikacija DNK virusa ptičje gripe v kokoši zagotovi dovolj veliko zaščito, da le-te niso poginile. Niso pa omenili, kateri virus ptičje gripe so uporabili. Poročali so le o specifičnem imunskem odzivu H7, brez omembe nastanka navzkrižne zaščite pred različnim sevi.

Zato v izumu poročamo o vseh znanih metodah za vnos nukleinskih kislin v živo tkivo z namenom, da pride do ekspresije proteinov. Izum opisuje metodo za vnos virusnih proteinov v proces nastajanja antigena, ki sproži virusno specifične CTL. Pokazala se je potreba po specifični terapevtski učinkovini, ki je sposobna sprožiti želeni profilaktični imunski odziv proti virusnim patogenom, natančneje proti virusu gripe. Posebaj pomembno pri tej vrsti terapevtskega pristopa je sposobnost sprožiti Tcelični imunski odziv, ki lahko prepreči infekcijo celo pred heterolognimi virusnimi sevi, iz katerih so pridobili gene za antigen. Torej je v izumu opisan DNK konstrukt, s kodnim zapisom za virusne proteine humanega virusa gripe: nukleoprotein (NP), hemaglutinin (HA), neuraminidaza (NM), matriks (M), nestrukturne proteine (NS). polimeraza (PB1 in PB2 to je bazični polimerazi 1 in 2; PA = kisla polimeraza) ali katerikoli drugi gen virusa gripe, ki ima kodni zapis za produkt, ki sproži nastanek specifičnih CTL.

Virus gripe ima ribonukleinski (RNK) genom sestavljen iz več RNK segmentov. Vsaka RNK ima kodni zapis z najmanj eno gensko spojino. NP gen se veže na RNK in prenese virusno RNK v jedro okužene celice.

Sekvenca se ohrani, v 50-ih letih so opazili le 7% spreminjanje v sekvenci aminokislin. Genski produkti P (PB1, PB2, PA) so odgovorni za sintezo novih virusnih RNK. Ti geni se še veliko bolj ohranjajo od NP genov. HA je najpomembnejši genski produkt virusne ovojnice. Se veliko hitreje spreminja od NP. Veže se na celični receptor in pomaga v začetni fazi nove okužbe z virusom gripe. Odziv nevtralizacijskih protiteles je usmerjen pretežno proti temu genskemu produktu. Ta protein sproži tudi močan odziv citotoksičnih T limfocitov. Obstoječa cepiva proti humanemu virusu gripe vsebujejo tri seve virusa gripe ali njihove HA proteine. Zaradi spremenljivosti proteinske sekvence HA pri različnih sevih, moramo cepivo nenehno prilagajati sevom, ki dejansko povzročajo okužbo. Če so pravilno vneseni, imajo HA ohranjene elemente za tvorbo CTL. Biološka funkcija genskih produktov NS1 in NS2 ni še popolnoma poznana, vendar naj bi imela pomembno vlogo pri tvorbi zaščitnega CTL odziva. Nazadnje, genska produkta M1 in M2, ki sta pri HA nekoliko bolje ohranjena, sprožita glavni CTL odziv. Protein M1 je virusni genski produkt, ki nastaja v veliki količini.

Zaščitno učinkovitost cepljenja z DNK proti kasnejši virusni okužbi ponazorimo s cepljenjem z DNK plazmidom, ki se ne podvaja in nosi kodni zapis za enega ali več zgoraj omenjenih virusnih proteinov. Prednost tega je, da pri tem ne uporabimo infekcijske učinkovine, sestava virusnih delcev zato ni potrebna, potrebna je le določena selekcija. Sekvenca nukleoproteinov in več drugih genskih produktov je ohranjena med različnimi sevi virusa gripe, omogočena je zaščita tudi pri naslednjih okužbah z virulentnim sevom, ki je homologen ali heterologen, če ga primerjamo s sevom, iz katerega je bil klonirani gen izoliran.

POVZETEK IZUMA

DNK konstrukt, s sposobnostjo ekspresije po neposrednem vnosu v živalsko tkivo, preko injekcije ali kako drugače, je nov profilaktični zdravilni pripravek. Le-ta sproži nastajanje citotoksičnih T limfocitov (CTL), ki specifično reagirajo z virusnimi antigeni, ki se nato odzivajo na različne virusne seve, v nasprotju s protitelesi, ki se v splošnem odzivajo le na določen sev. Za tvorba takšnih CTL in vivo je potrebna endogena ekspresija antigena, enako kot v primeru virusne infekcije. Da je nastal virusni antigen, ki je šel v imunski sistem, brez omejevanja neposrednega vnosa peptida ali uporabe virusnih vektorjev, smo DNK plazmid s kodnim zapisom za proteine humanega virusa gripe, injiciran v stegensko mišico BALB/c miši, kar je sprožilo tvorbo za virus gripe specifičnih CTL in zaščito pred kasnejšimi okužbami s heterolognim sevom virusa gripe, kar smo dokazali s pljučnim virusnim titrom, inhibicijo izgube telesne teže in povečanim številom preživelih osebkov. Tvorila se je velika količina nevtralizacijskih protiteles proti hemaglutininu in protiteles proti nukleoproteinu pri Rhesus opicah, znižan nosni virusni titer smo opazili tudi pri homologni in heterologni okužbi belih dihurjev.

Ključna opažanja, ki se nanašajo na naš izum so:

1) Demonstracija učinkovitosti. Po imunizaciji z DNK nukleoproteina (NP) je sledila heterologna zaščita, ki smo jo dokazali s povečanim številom preživelih osebkov in inhibicijo izgube telesne teže pri miših, ki so bile okužene s sevom virusa, ki se je razlikoval od seva, iz katerega smo pridobili NP gen. V tem primeru so bili površinski proteini dveh sevov zelo različni (H1N1 v primerjavi z H3N2), sev s katerim je bila miš okužena je zrasel 34 let po začetnem sevu. Imunizacija belih dihurjev z DNK NP in DNK matriksa (M1), ločeno, skupaj ali skupaj z DNK HA zagotavlja zaščito (znižana količina virusa v nosu) pred okužbo z mutiranimi (drifted) sevi (klinično izoliranimi). Zaščita z DNK kokteilom (NP in M1 DNK s kodnim zapisom za proteine Beijing/89 in HA DNK s kodnim zapisom za HA Beijing/89 ali Hawaii/91) je bila pri belih dihurjih učinkovitejša proti naključno mutiranim sevom (Georgia/93) od zaščite z registriranim cepivom (ki vsebuje Beijing/89). Kokteil, ki vsebuje HA DNK iz Hawaii/91 se je izkazal kot nekoliko učinkovitejši od kokteila s HA DNK iz Beijing/89. Zaščita, ki smo jo opazili po aplikaciji kokteila s HA DNK iz Hawaii/91 je enaka kot v primeru zaščite s homologno HA DNK (Georgia/93), medtem ko se je koktail s HA DNK iz Beijing/89 razlikoval od homologne zaščite, čeprav je bila veliko boljša od zaščite po cepljenju z registriranim cepivom. HI protitelesa so se tvorila pri vseh testiranih vrstah vključno z mišmi, belimi dihurji, Rhesus opisami in afriškimi zelenimi opicami.

2) Vztrajnost. Pri študijah, kjer smo uporabili DNK s kodnim zapisom za reporterski gen je prisotnost DNK in ekspresija proteinov trajala 1.5 leta (najdaljši čas testiranja pri miših; Wolff et al., Human. Mol. Genet, 1992). Torej, v primeru, da so genski produkti virusa gripe vztrajno prisotni je prisoten tudi imunski odziv. Protitelesa in CTL (Yankauckas et al., DNA & Celi Biol., 1993) ter homologna zaščitna imunost (podatki MRL), ki jo je vzpodbudila injicirana DNK so bili prisotni pri miših več kot leto dni. Protitelesa pri Rhesus opicah so bila navzoča do sedaj najmanj leto dni. CTL odziv in heterologna zaščita (povečano število preživelih) sta trajala 6 mesecev (do sedaj najdaljši čas testiranja). Opazili smo rahel padec v stopnji heterologne zaščite, ki pa jo lahko sekundarno vzpodbudimo.

-i3) Velikost odmerkov. Študije o doziranju so bile izvedene na Rhesus opicah in so pokazale, da 100 μg HA DNK aplicirana dvakrat sproži tvorbo velike količine HI protiteles, ki so bili prisotni eno leto do sedaj. Nastanek odpornosti (povečano število preživelih po heterolognem stiku) pri miših smo opazili pri odmerkih tako nizkih kot 6 μg (apliciran trikrat) in pri posameznem injiciranju 200 μρ, vendar v splošnem večje število injekcij (do 3) izboljša stopnjo zaščite. Študije, izdelane na primatih, so pokazale, da dve injekciji z 10 ali 100 μg DNK s kodnim zapisom za tri HA, NP in M1 (črke označujejo gen H3N2 Beijing/89) sprožita tvorbo enake količine HI protiteles kot registrirano cepivo. Pomembno je spomniti, da študijske živali niso bile okužene z gripo, medtem ko je bila celotna ciljna klinična populacija (starejši posamezniki) že okužena z njo. (Ne smemo pozabiti da vse otroke, mlajše od devet let, dvakrat cepijo z registriranim cepivom.)

KRATEK OPIS SLIK

Slika 1. Določevanje NP plazmida DNK z PCR v mišici. Miši so aplicirali trikrat, v tri tedenskih intervalih, RSV-NP DNK ali placebo vektor (100 μ g/nogo) v obe stegenski mišici BALB/c miši, temu je sledila okužba z gripo. Mišice so odstranili štiri tedne po zadnjem cepljenju in takoj zamrznili v tekočem dušiku. Nato so jih uprašili v Ozirajočem pufru (25 mM Tris-H₃PO₄, pH=8, 2mM trans-1:2-diaminocikloheksan-tetra-ocetna kislina (CDTA), 2mM DTT, 10% glicerol, 1% Triton Χ-100) v MIKRODISMEMBRATOR ™-ju (B. Braun Instruments), visokomolekularno DNK smo ekstrahirali z zmesjo fenol/kloroform in oborili z etanolom. S 40 cikelno PCR reakcijo (PCR je bil narejen po navodilih priloženih Perkin Elmer Cetus GENEAMP™) smo zasledovali prisotnost NP plazmida DNK v mišici. PCR produkt s 772 baznimi pari (glej puščico), ki se razteza od CMV promoterja do konca 5’ vrinjenega gena, se je tvoril iz 18 baz dolgega modelnega oligonukleotida, ki ima začetek na mestu promoterja (GTGTGCACCTCAAGCTGG, SEQ. ID:1) in 23 baz dolgo oligonukleotidno priležno modelno začetno sekvenco na položaju 5’ dela vrinjene NP sekvence (CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC, SEQ. ID:2). Pri izbranih vzorcih mišic, v katere je bil injiciran NP DNK je na agaroznem gelu, obarvanim z etidijevim bromidom, opazen produkt s 772 baznimi pari, tega pri injiciranem placebo vektorju (60GL) nišmo opazili, oznake zgoraj vsake vrste pomenijo identifikacijsko številko miši in oznako za desno ali levo nogo.

Slika 2. Nastajanje NP protiteles v miši, kateri smo injicirali NP DNK. Miši smo injicirali 100 μ9 V1-NP DNK v vsako nogo 0., 3. in 6. teden ter odvzemali krvne vzorce v 0., 2., 5. in 8. tednu. Prisotnost anti-NP IgG v serumu smo določevali z encimsko imunskim testom (ELISA) (J.J. Donnelly et al., J. Immunol. 145, 3071 (1990)) s pomočjo NP izoliranega iz celic insektov, v katerega je bil vnesen ekspresijski vektor baculovirusa. Rezultat je podan kot desetiški logaritem povprečne vrednosti ELISA titra ± SEM (n=10) v odvisnosti od časa po prven injiciranju NP DNK. Pri miših imuniziranih s placebo vektorjem NP protiteles nismo zasledili.

Slika 3. Odstotek specifične liže, določene v štiriurnem testu s sproščanjem ⁵¹ Cr za CTL dobljene iz miši, ki so bile imunizirane z DNK. Miši smo imunizirali s 400 μg V1-NP DNK (polni krogi) ali placebo vektorjem (polni kvadrati) in jih 3 do 4 tedne kasneje usmrtili. Negativno kontrolo za CTL so predstavljale neokužene miši (prazni trikotniki) in pozitivno kontrolo miši, ki so preživele okužbo z A/HK/68 štiri tedne pred tem (polni trikotniki). V diagramu so prikazani podatki za posamezne miši. V vsaki skupini je bilo najmanj osem miši. Slika 3A: Celice vranice restimulirane z NP147-155 vzpodbujenimi avtolognimi celcami vranice in testirani na NP147-155 vzpodbujene P815 celice. Slika 3B: Celice vranice restimulirane z NP147-155 vzpodbujenimi avtolognimi celcami vranice in testirani na NP147-155 ciljne celice, okužene z virusom gripe A/Victoria/73 (H3N2) 6 ur pred dodatkom CTL. Slika 3C: Celice vranice restimulirane z

Con A in IL-2 brez dodatnega antigena in testirani na celice P815 vzpodbujene z NP147-155. Slika 3D: Mišim so aplicirali 200 μρ injekcijo V1NP DNK ali placebo vektorja 3-krat v tri tedenskih intervalih. Štiri tedne po zadnji imunizaciji so zbrali vranice, celice vranice so gojili skupaj z IL-2 in Con A 7 dni in zatem določali CTL s ciljnimi celicami P815 okuženimi z A/Victoria/73.

Slika 4. Izguba telesne teže (v gramih) in njen porast pri miših, imuniziranih z DNK po intranazalni okužbi z 10⁴ TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68^ opravljeni brez anestezije. Miši smo imunizirali trikrat v tri tedenskih intervalih z V1-NP DNK ali placebo vektorjem ali niso bile imunizirane in so bile okužene z virusom tri tedne po zadnji imunizaciji. Telesno težo skupine, v kateri je bilo deset miši, smo določili v času okužbe z virusom in dnevno od 4. dneva dalje pri miših, ki smo jim vbrizgali NP DNK (polni krogi), placebo vektor (prazni trikotniki) in necepljeni kontrolni skupini miši (prazni krogi). Na diagramu so prikazane povprečne telesne teže + SEM. Pri statistični obdelavi podatkov s t-testom smo prišli do zaključka, da je izguba telesne teže pri miših, ki so jim vbrizgali NP DNK od 8. do 13. dne opazno manjša, kot pri miših, katerim’so vbrizgali placebo vektor (p < 0.005) ali pri necepljeni kontrolni skupini (p < 0.01). Med obema kontrolnima skupinama nismo opazili signifikantnie razlike (p = 0.8 določeno s ttestom).

Slika 5. Število preživeli miši po imunizaciji z DNK, intranazalno okuženih z 10²·⁵ TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68, opravljeni z anestezije. Miši smo imunizirali trikrat v tri tedenskih intervalih z V1-NP DNK (polni krogi) ali placebo vektorjem (prazni krogi) ali niso bile imunizirane (prazni trikotniki) in so bile okužene z virusom tri tedne po zadnji imunizaciji. Odstotek preživelih miši je prikazan za skupine 9 ali 10 miši. Pri statistični obdelavi podatkov s testom Hikvadrat smo prišli do zaključka, da je število preživelih miših, ki so jim vbrizgali N P DNK opazno večje od števila preživelih v kontrolnih skupinah (p < 0.0004) medtem, ko med obema kontrolnima skupinama nismo opazili signifikantne razlike (p = 0.8 določeno testom Hi-kvadrat).

Slika 6. Sekvenca za ekspresijski vektor V1J, SEQ.ID:1Q:.

Slika 7. Sekvenca za ekspresijski vektor VUneo, SEQ.ID:18:.

Slika 8. Sekvenca za CMVintA-BGH promotor, SEQ.ID:11:.

Slika 9. Opičja anti-NP protitelesa.

Slika 10. Inhibicija hemaglutinacije pri belem dihurju, prekinjene črte nakazujejo minimalno količino zaščitnih protiteles, povprečna vrednost predstavljajo krogi, skozi katere poteka črta.

Slika 11. IgG anti-NP protitelesa po imunizaciji belih dihurjev z DNK.

Slika 12. Količina virusa pri belih dihurjih po in brez imunizacije z DNK.

Slika 13. Shematski prikaz vektorjev pRSV-PR-NP in V1-NP. X označuje vloženi kodni del.

Slika 14. Shematski prikaz proteinov virusa gripe in različnih virusnih sevov.

Slika 15. Shematski prikaz dogajanja v celici po injiciranju DNK.

Slika 16. Odpornost belih dihurjev proti virusu gripe A/RP/8/34 po imunizaciji s HA in geni za notranje proteine.

Slika 17. Shematski prikaz vektorja VUns.

Slika 18. Afriškim zelenim opicam so vbrizgali DNK kokteil s sledečo sestavo; HA DNK (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texas/91), NP DNK (A/PR/34) in M1 DNK (A/PR/34). 10 gg (polni kvadrati) ali 100 gg (polni krogi) vsake od komponent so aplicirali dvakrat v 6. tedenskem intervalu (glej puščice). Za primerjavo, drugim živalim so vbrizgali celotni humani odmerek registriranega cepiva s subvirionom (prazni kvadrati) in živim virusom (prazni kvadrati) (45 gg proteinskega ekvivalenta; 15 gg na HA).

Serumske vzorce so zbirali vsakih štirinajst dni 18 tednov in določevali titer HI proti A/Beijing/89 HA. Podatki so predstavljeni kot geometrična sredina HI titra ± SEM pri n=3.

Slika 19. Samicam BALB/c miši (starosti 4 -6- tednov) so vbrizgali A/PR/34 NP DNK (200 gg) trikrat v tritedenskih intervalih. Negativno kontrolno skupino predstavljajo miši, ki so jim vbrizgali kontrolno DNK (200 gg), rekombinantni NP protein (10 gg) in zdrave miši, katerim niso aplicirali ničesar. Za primerjavo so bile testirane tudi miši, okužene z virusom gripe A/HK/68. CTL so opazili šest mesecev po prvi injekciji, ti so bjli ponovno stimulirani in vitro z virusno okuženimi singeničnimi celicami vranice in testirani na z NP peptidom vzpodbujene celice P815 v razmerju efektor:cilj 10:1. Podatki so predstavljeni kot odstotek specifične liže ± sd pri n=3.

Slika 20. Mišim C3H/HeN so vbrizgali normalne C₂C₁₂ mioblaste (1x10⁷ celic), rekombinantni N P protein (2 gg) ali z N P okužene mioblaste (1x10⁷ celic). Ta količina NP proteina (2 gg) je bila dovolj velika, da je sprožila protitelesni odziv in je bila enakovredna približno 100-kratni količini NP, prisotnega v presajenih, z NP okuženih mioblastih. Šest tednov po obravnavanju so odvzeli CTL teh miši in jih ponovno stimulirali in vitro z virusom gripe okuženimi singeničnimi celicami vranice. Pozitivno kontrolno skupino so predstavljali CTL odvzeti iz miši, ki so bile okužene z virusom gripe A/HK/68. Neobravnavane (polni stolpci), z virusom gripe A/Victoria/73 okužene (črtkani stolpci) in z NP-okužene mioblaste (punktirani stolpci) smo uporabili kot ciljne celice pri razmerju efektor:trača 25:1. Podatki so prikazani kot odstotek specifične liže ± sd, pri n=3.

Slika 21. Štiri tedne stare BALB/c mišje samice so bile imunizirane intramuskularno z 200 gg NP DNK trikrat v tritedenskih intervalih. Mišim so tri tedne po tretji imunizaciji pod anestezijo aplicirali 300 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68 (v stiku je bil celoten respiratorni trakt). Prikazan je delež preživelih miši (10 miši v skupini) v odvisnosti od časa po okužbi.

Slika 22. Štiri tedne stare BALB/c mišje samice so bile imunizirane intramuskularno s 100 gg NP DNK trikrat v tritedenskih intervalih. Mišim so tri tedne po tretji imunizaciji pod anestezijo aplicirali 300 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68 (v stiku je bil celoten respiratorni trakt). Mišim so vsak dan določevali telesno težo in izračunali razmerje z začetno težo za vsako preživelo miš. Prikazan je srednji odstotek začetne teže + SEM v odvisnosti od časa po okužbi.

Slika 23. Štiri tedne stare BALB/c mišje samice so bile imunizirane intramuskularno z 200 μg NP DNK trikrat v tritedenskih intervalih. Mišim so tri tedne po tretji imunizaciji brez anestezije aplicirali 2000 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) ₄A/HK/68 (v stiku je bil zgornji del respiratornega trakta). Miši so bile 7 dni po okužbi usmrčene, odstranjena pljuča so bila homogenizirana, virusni titer je bil določen s serijo titracij na MDCK celicah.

Slika 24. Štiri tedne stare BALB/c mišje samice so bile imunizirane intramuskularno s 6.25, 25, 100 ali 200 μg NP DNK trikrat v tritedenskih intervalih. Mišim so tri tedne po tretji imunizaciji pod anestezijo aplicirali 300 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68 (v stiku je bil celoten respiratorni trakt). Prikazan je odstotek začetne teže miši (10 miši v skupini) v odvisnosti od odmerka NP DNK.

Slika 25. Štiri tedne stare BALB/c mišje samice so bile imunizirane intramuskularno z 200 μρ A/PR/34 NP DNK, kontrolno DNK ali placebo injekcijo. Miši so nato po tretji injekciji DNK pod anestezijo aplicirali 300 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68, 6., 12. in 25. teden. Izbrane miši so nato ponovno imunizirali z 200 μρ N P DNK 22. teden ter 25. teden ponovno aplicirali virus (reboost = sekundarna vzpodbuda). Povprečne telesne teže so podane kot odstotek začetne skupne telesne teže za vsako skupino. Prikazana kontrolna telesna teža je povprečje telesnih tež vseh osebkov v kontrolni skupini v 6., 12., in 25. tednu po okužbi, skupna telesna teža šestih skupin, ki so prejele kontrolno DNK ali placebo injekcijo. Vsako skupino je na začetku sestavljalo 10 miši; poginule miši so izključili iz nadaljne analize.

Slika 26. Odrasli (22-28 tednov stari) beli dihurji so bili 0. in 42. dan imunizirani intramuskularno z 1 mg DNK s kodnim zapisom za NP iz

A/Beijing/89, 1 mg DNK s kodnim zapisom za M1 iz A/Beijing/89 ali zmesjo, ki jo je sestavljalo po 1 mg vsake DNK. Kontrolna skupina belih dihurjev je 0. in 42. dan prejela nekodirano DNK ali celoten humani odmerek (15 μg/sev) registriranega cepiva z živim virusom (formulacija 9293), ki je vsebovala A/Beijing/89. Bele dihurje so 56. dan okužili z A/Georgia/93. Virusni titer nosnega izpirka je bil določen, kot je opisano zgoraj. Virusni titer od 3. do 5. dne smo s pomočjo statističnega testa dvonivojne analize variance, primerjali s titrom pri belih dihurjev, ki so jim aplicirali kontrolno DNK. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli NP DNK, M1 DNK ali kombinacijo obeh DNK je bil signifikantno nižji (p* < 0.0001, 0.0016 in < 0.0001) od titra pri kontrolni skupini belih dihurjev. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli NP (podatki niso prikazani), M1 ali kombinacijo NP+M1 ni bil signifikantno različen od titra belih dihurjev, ki so dobili registrirano cepivo (p = 0.104, 0.533 in 0.145). Imunizacijski odmerek 1 mg je bil izbran naključno; študije za določevanje velikosti odmerkov so bile izvedene na nečloveških primatih.

Slika 27. Skupina osmih samcev belih dihurjev, starih od 22-25 tednov, je bila 0., 21. in 121. dan imunizirana intramuskularno s kontrolno DNK, fiziološko raztopino ali DNK s’ kodnim zapisom za proteine virusa gripe A/PR/34, nato so jim 148. dan aplicirali intranazalno 200 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/68. Imunizirane živali so prejele 1 mg NP DNK ali 2 mg zmesi NP, NS1, PB1, PB2 in M1 DNK (po 400 μg vsakega konstrukta). Kontrolna skupina je prejela 0,5 ml/nogo fiziološke raztopine aii 1 mg kontrolne DNK. Za namene analize, sta bili skupini, ki sta prejeli fiziološko raztopino in kontrolno DNK združeni (kontrolna skupina), kot sta bili združeni skupini živali, ki sta prejeli NP DNK samo ali v kombinaciji z drugimi geni internih proteinov (interna skupina). Diagram prikazuje infektivni titer v nosnem izpirku v TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) na 50 μΙ v 3 ml nosnega izpirka. Neredčeni nosni izpirek (testirana je bila najmanjša redčitev) naj bi pomenilo redčitev 1:10 osnovnega nosnega izločka in pozitivnem neredčenem vzorcu so pripisali vrednost 1 log. Titri nad 1 log so bili določeni s pomočjo Reed-Muenchove interpolacije med tremi ponovitvami, da je bila v končni točki dosežena 50% infektivnost. Negativnim vzorcem so pripisali vrednost 0. Vrednosti p prikazane na grafu, so bile izračunane za imunizirane bele dihurje v primerjavi s kontrolo, na označeni dan, s pomočjo t-testa za dve povprečni vrednosti. Vrednosti p za celotno krivuljo so bile izračunane s pomočjo dvonivojne analize variance in so bile < 0.0001 za NP proti kontroli in < 0.001 za združene DNK proti kontroli.

Slika 28. Število preživelih miši, ki so bile po imunizaciji z DNK okužene z virusom gripe. Miši so bile imunizirane intramuskularno z 200 μg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/PR/34 ali kontrolno DNK (brez kodnega zapisa) trikrat v tritedenskih intervalih. Anesteziranim mišim so tri tedne po tretji imunizaciji aplicirali 1000 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/34 tako, da je bil okužen celoten respiratorni trakt. Prikazan je odstotek preživelih miši v odvisnosti od časa po okužbi (n= 9 ali 10 miši v skupini).

Slika 29. Izguba telesne teže pri miših, ki so bile po imunizaciji z DNK okužene z virusom gripe. Miši so bile imunizirane intramuskularno z 200 μο DNK s kodnim zapisom za HA iz A/PR/34 ali kontrolno DNK (brez kodnega zapisa), trikrat v tritedenskih intervalih. Anesteziranim mišim so tri tedne po tretji imunizaciji aplicirali z intranazalno instilacijo 1000 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/34, tako da je bil okužen celoten respiratorni trakt. Prikazan je odstotek začetne teže za vsako posamezno žival, povprečje za vsako skupino v odvisnosti od časa po infekciji (Poginule živali so izključene iz povprečja).

Slika 30. Število preživelih miši, ki so bile po imunizaciji z DNK okužene z virusom gripe. Miši so bile imunizirane intramuskularno z 1, 10 ali 100 μg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/PR/34 ali kontrolno DNK (brez kodnega zapisa) trikrat v tritedenskih intervalih. Anesteziranim mišim so tri tedne po tretji imunizaciji aplicirali z intranazalno instilacijo 1000 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/34 tako, da je bil okužen celoten respiratorni trakt. Prikazan je odstotek preživelih miši v odvisnosti od časa po stiku (n= 9 ali 10 miši v skupini).

Slika 31. Skupina osmih samcev belih dihurjev, starih od 22-25 tednov, je bila 0., 21. in 121. dan imunizirana intramuskularno s kontrolno DNK, fiziološko raztopino ali DNK s kodnim zapisom za proteine virusa gripe A/PR/34, nato so jim 148. dan intranazalno aplicirali 200 TKD₅₀ (točna količina virusa, ki povzroči citopatogeni učinek na 50% celic) A/HK/34. Imunizirane živali so prejele 1 mg HA DNK ali 2 mg zmesi HA, NP, NS1, PB1, PB2 in M1 DNK (po 330 pg vsakega konstrukta). Kontrolna skupina je prejela 0,5 ml/nogo fiziološke raztopine ali 1 mg kontrolne DNK. Za namene analize, sta bili skupini, ki sta prejeli fiziološko raztopino in kontrolno DNK združeni (kontrolna skupina), kot sta bili združeni skupini, ki sta prejeli HA DNK samo ali v kombinaciji z drugimi geni internih proteinov (HA, HA+interna skupina). Diagram prikazuje infektivni titer-v nosnem izpirku v TKD₅₀ na 50 μΙ v 3 ml nosnega izpirka. Neredčeni nosni izpirek (testirana je bila najmanjša redčitev) naj bi pomenilo redčitev 1:10 osnovnega nosnega izločka in pozitivnem neredčenem vzorcu so pripisali vrednost 1 log. Titri nad 1 log so bili določeni s pomočjo Reed-Muenchove interpolacije med tremi ponovitvami, da je bila v končni točki dosežena 50% infektivnost. Negativnim vzorcem so pripisali vrednost 0 log. Vrednosti p za celotno krivuljo so bile izračunane s pomočjo dvonivojne analize variance in so bile < 0.0001 za HA proti kontroli in < 0.0001 za združene DNK proti kontroli.

Slika 32. Odrasli (22-28 tednov stari) beli dihurji so bili 0. in 42. dan imunizirani intramuskularno z 1 mg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/Georgia/93. Kontrolna skupina belih dihurjev je 0. in 42. dan prejela nekodirano DNK ali celoten humani odmerek (15 μg/sev) registriranega cepiva z živim virusom (formulacija 92-93), ki je vsebovala A/Beijing/89. Bele dihurje so 56. dan prišli v stik z A/Georgia/93. Virusni titer nosnega izpirka je bil določen, kot je opisano zgoraj. Virusni titer od 1 do 6 dne smo primerjali s titrom belih dihurjev, ki so jim aplicirali kontrolno DNK s pomočjo dvonivojne analize variance. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA DNK, je bil signifikantno nižji (p < 0.0001) od titra pri kontrolni skupini.

Slika 33. Odrasli (22-28 tednov stari) beli dihurji so bili 0. in 42. dan imunizirani intramuskularno z 1 mg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/Hawaii/91 ali A/Beijing/89 (podatki niso prikazani). Kontrolna skupina belih dihurjev je 0. in 42. dan prejela nekodirano DNK ali celoten humani odmerek (15 pg/sev) registriranega cepiva z živim virusom (formulacija 9293), ki je vsebovala A/Beijing/89. Bele dihurje so 56. dan okužili z A/Georgia/93. Virusni titer nosnega izpirka je bil določen, kot je opisano zgoraj. Virusni titer od 1 do 6 dne smo primerjali s titrom belih dihurjev, ki so jim aplicirali kontrolno DNK s pomočjo dvonivojne analize variance. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA DNK A/Hawaii/91, je bil signifikantno nižji (p < 0.0001) od titra pri kontrolni skupini belih dihurjev. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA DNK A/Hawaii/91, je bil signifikantno manjši od titra pri belih dihurjih, ki so dobili registrirano cepivo (p = 0.021 za HA DNK A/Hawaii/91, ANOVA za 1 do 6 dan); titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA DNK A/Beijing/89 (podatki niso prikazani) ni bil signifikantno različen od titra pri belih dihurjih, ki so prejeli registrirano cepivo (p=0.058; dvonivojna ANOVA za 1. do 6. dan).

Slika 34. Odrasli (22-28 tednov stari) beli dihurji so bili 0. in 42. dan imunizirani intramuskularno z 1 mg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/Hawaii/91 (glej sliko 13) ali z 330 pg vsake DNK s kodnim zapisom za HA A/Hawaii/91 in NP ter M1 iz A/Beijing/89. Kontrolna skupina belih dihurjev je 0. in 42. dan prejela nekodirano DNK ali celoten humani odmerek (15 pg/sev) registriranega cepiva z živim virusom (formulacija 9293), ki je vsebovala A/Beijing/89. Bele dihurje so 56. dan okužili z A/Georgia/93. Virusni titer nosnega izpirka je bil določen, kot je opisano zgoraj. Virusni titer od 1 do 6 dne smo primerjali s titrom belih dihurjev, ki so jim aplicirali kontrolno DNK s pomočjo dvonivojne analize variance. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA+NP+M1 DNK je bil signifikantno nižji od titra pri belih dihurjih, ki so prejeli registrirano cepivo (p < 0.0001) ali HA DNK samo (p=0.0053).

Slika 35. Odrasli (22-28 tednov stari) beli dihurji so bili 0. in 42. dan imunizirani intramuskularno z 1 mg DNK s kodnim zapisom za HA iz A/Georgia/93 (glej sliko 13) ali z 330 pg vsake DNK s kodnim zapisom za HA A/Hawaii/91 in NP ter M1 iz A/Beijing/89. Kontrolna skupina belih dihurjev je 0. in 42. dan prejela nekodirano DNK ali celoten humani odmerek (15 pg/sev) registriranega cepiva z živim virusom (formulacija 9293), ki je vsebovala A/Beijing/89. Bele dihurje so 56. dan okužili z A/Georgia/93. Virusni titer nosnega izpirka je bil določen, kot je opisano zgoraj. Virusni titer od 1 do 6 dne smo primerjali s titrom belih dihurjev, ki so jim aplicirali kontrolno DNK s pomočjo dvonivojne analize variance. Titer pri belih dihurjih, ki so prejeli HA+NP+M1 DNK je bil signifikantno različen od titra virusov pri belih dihurjih, ki so prejeli homologno HA DNK (p = 0.064).

Slika 36. Sekvenca V1R.

NATANČNEJŠI OPIS IZUMA

Predloženi izum opisuje zdravilni pripravek z nukleinsko kislino, ki po neposredni aplikaciji v žival, vključno z vretenčarji kot so sesalci in ljudje, sproži ekspresijo ustreznih proteinov. Pri tem so to proteini, ki se v zdravi živali ne pojavljajo, razen v patoloških pogojih, kot so proteini povezani z virusom gripe, na primer, vendar brez omejevanja, nukleoprotein, neuraminidaza, hemaglutinin, polimeraza, matriks in nestrukturni proteini virusa gripe, živalski organizem je aktiviran zato se sproži zaščitni odziv. Ker se ti eksogeni proteini sintetizirajo v živalskem tkivu, se ekspresijski proteini tvorijo in predstavljajo glavni histokompatibilni kompleks MHC. Prepoznavanje je enako, kot pri infekciji s sorodnimi organizmi. Rezultat, kot je prikazan v tem odkritju, je vzpodbuda imunskega sistema, ki ščiti pred virusno infekcijo.

Predloženi izum opisuje nukleinske kisline, ki po vnosu v živalsko tkivo in vivo s pomočjo injekcije, inhalacije ali na podoben način (glej TEORETIČNE OSNOVE IZUMA zgoraj) sprožijo ekspresijo produktov gena humanega virusa gripe. Na primer, injekcija DNK konstrukta, ki je predmet tega izuma, v mišico miši sproži ekspresijo ustreznih genskih produktov. Podobno se zgodi tudi pri belih dihurjih in Rhesus opicah. Pri naslednjih okužbah z virulentnim virusom gripe je, v odmerkih, ki navadno žival usmrtijo, obolevanje in umrljivost živali, ki so jim vbrizgali polinukleotidno cepivo, zelo zmanjšano. Torej je v izumu predstavljeno cepivo, za preprečevanje infekcije z virusom gripe, ki je uporabno pri ljudeh.

Pokazali smo, da so DNK konstrukti s kodnim zapisom za virusne proteine gripe sprožijo pri živalih imunski odziv. Kot bo spodaj podrobneje opisano, imunski odziv pri živalih obsega tvorbo protiteles in CTL pri miših, tvorbo protiteles pri belih dihurjih in primatih in odpornost pred virusno okužbo pri miših in belih dihurjih s homolognimi mutiranimi (shifted in drifted) sevi virusa gripe. Verjetno je najbolj presentljiv rezutat imunizacije z DNK, s kodnim zapisom za virusne proteine, sposobnost zaščite pred oddaljenimi podvrstami virusov. To nakazuje, da naj bi dodatek komponent, ki sprožijo nastajanje CTL, cepivu služil za ublažitev vpliva novih variantov, ki se pojavijo v sredini sezone ali so nepredvideni, ko izbirajo seve za pripravo cepiva, ki bo v uporabi v naslednjem letu. Pomembno je, da imunizacija z cDNK, s kodnim zapisom za gene HA, NP in M1, pri belih dihurjih učinkovitejša proti mutiranim virusnim sevom od registriranega cepiva. To opravičuje uporabo konstruktov s kodnim zapisom za interne gene v PNV.

V okviru tega izuma, cepivo sestavljajp posamezni DNK plazmidi, na primer HA iz treh prevladujočih kliničnih sevov, ki jih predstavljajo virusi A/H1N1 (A/Texas/89), A/H3N2 (A/Georgia/93) in B (B/Panama/90), kot tudi DNK konstrukti, s kodnim zapisom za notranje ohranjene proteine NP in M1 (matriks) iz obeh A (Beijing/89; H3N2) in B sevov, z namenom zagotoviti splošno zaščito proti skupini z mutiranimi (drifted in shifted) antigeni. DNK HA bo vzpodbudila nastajanje HA in seveda posledično protiteles proti HA. Ti bodo tipsko specifični z nekoliko večjo širino zaščite proti naključno spremenjenim sevom, v primerjavi s sedanjim registriranim cepivom, ki ga sestavljajo proteini. NP in M1 konstrukti bodo sprožili nastajanje CTL, ki bodo zagotovili navzkrižno zaščito proti različnim, nekoliko manj virulentnim sevom in hitrejše ozdravljenje. Pričakovana vztrajnost DNK konstruktov (v episomalni, brez podvajanja, neintegrirani obliki v mišični celici) naj bi zagotovili podaljšano trajanje zaščite v primerjavi z obstoječim cepivom.

Pričakovane prednosti pred sedanjim, registriranim zdravilom so: večja širina zaščite zaradi CTL odziva ± povečana širina protiteles, in dolgotrajnejša zaščita. S PNV pristopom se izognemo izdelavi, selekciji in propagaciji ustreznih sevov, kot to delomo pri sedanjem, registriranem cepivu, saj nov DNK konstrukt pripravimo neposredno iz klinično izoliranega seva.

V okviru izuma, zaporedje nukleoproteina (NP) humanega virusa gripe, dobljenega iz seva A/PR/8/34, kloniramo v ekspresijski vektor. Vektor vsebuje promotor za transkripcijo z RNK polimerazo in transkripcijski terminator na koncu kodne sekvence za NP. Zaželeno je, da je promotor dolga terminalna ponovitev (LTR) Rous sarkoma virusa (RSV), ki je močan transkripcijski promoter. Še bolj zaželen promoter je citomegalovirusni promoter s sekvenco intro A (CMV-int A). Zaželen transkripcijski terminator je terminator govejega rastnega hormona. Posebaj zaželena je kombinacija terminatorjev CMV int A - BGH. Kot pomoč pri pripravi zdravilnega pripravka je zaželen označevalec za rezistenco na antibiotike, ki naj bo vključen v ekspresijski vektor. Uporabimo lahko gen za rezistenco na ampilcilin, neomicin ali katerikoli farmacevtsko sprejemljiv označevalec za rezistenco na antibiotike. V želenem okviru tega izuma je, da gen za rezistenco na antibiotike nosi kodni zapis za genske produkte razistentne na neomicin. Nadalje, pri veliki proizvodnji zdravilnega pripravka s fermentacijo v prokationtskih organizmih je prednost, da vektor obsega začetek za replikacijo in je sposoben kopiranja v velikem številu. To sposobnost imajo številni komercialno dosegljivi prokariontski vektorji. V zaželenem okviru tega izuma, to zmožnost zagotavljajo komercialno dosegljivi vektorji poznani pod imenom pUC. Zaželeno je, da se odstranijo neesencialne DNK sekvence. V okviru izuma je torej pri pUC potrebno odstraniti kodne sekvence lacZ in lacl.

V okviru izuma, je bil uporabljen ekspresijski vektor pnRSV, kjer je kot promoter uporabljena dolga terminalna ponovitev (LTR) Rous sarkoma virusa (RSV). V drugem primeru je uporabljen vektor V1, mutiranec pBR322, v katerega je kloniran CMV promoter in BGH transkripcijski terminator. S konstruktom V1-NP smo imunizirali miši in vzpodbudili CTL, ki ščitijo pred heterologno okužbo. Posebaj zaželeno v okviru izuma je združitev elementov V1 tako, da je nastal ekspresijski vektor z oznako V1J. V V1J je kloniran gen virusa gripe, kot je gen A/PR/8/34 NP, PB1, NS1, HA, PB2 ali M1. Še druga možnost opisana v izumu je, zamenjava v V1J gena za rezistenco na ampicilin z genom za rezistenco na neomicin, da nastane V1J-neo (SEQ.ID:18:, slika 7) v katerega je klonirano poljubno število različnih genov virusa gripe namenjenih uporabi v skladu s tem izumom. Druga možnost v okviru izuma je, da vektor V1Jns, ki je identičen z V1, s to razliko, da je enkratno restrikcijsko mesto Sfi1 pri V1J-neo spremenjeno v enojno mesto Kpn1, na mestu 2114. Obseg mest Sfi1 v humanem DNK genomu je zelo majhen (približno eno mesto na 100.000 baz). Torej ta vektor omogoča previdno nadzorovanje integracije ekspresijskega vektorja v DNK gostitelja preprosto z digestijo Sfi1 ekstrahiranega DNK genoma. Z nadaljnjim čiščenjem dobimo vektor V1R. Temu vektorju je bilo odstranjenih toliko neesencialnih DNK, kot je mogoče, da smo dobili zelo zgoščen vektor. Ta vektor je derivat VUns in je prikazan na sliki 36 (SEQ.ID.45:). Pri tem vektorju je mogoče uporabiti daljše vključke z manjšo možnostjo, da so zakodirane neželene sekvence in optimiziran je prevzem v celico, ko konstrukt s kodnim zapisom za specifične gene virusa gripe, uvedemo v okolišno tkivo. Na sliki 36 so izbrisani deli VUneo (slika 7) ponazorjeni s praznino, vključena sekvenca je napisana s povdarjenim tiskom, številčenje VUneo pa je ostalo nespremenjeno. Nadaljne modifikacije vektorja in razvoj postopka je izveden z metodami, ki so strokovnjakom dobro poznane. Opisani določeni produkti, dobljeni s konvencionalnimi metodami, so za določene namene, za katere so prilagojeni, še posebaj uporabni.

Medtem, ko je v enem delu izuma opisano vgrajevanje gena NP virusa gripe seva A/PR/8/34, je še bolj zaželeno vgrajevanje gena NP, gena HA, gena NA, gena PB, gena M ali gena NS iz virusa gripe, izoliranega pred nedavnim. To izvršimo s pripravo DNK kopij virusnih genov in nato posamezne gene subkloniramo. Sekvence genov številnih sevov virusa gripe so javno dostopni na GENEBANK (približno 509 sekvenc za gene virusa gripe A). Katerikoli gen od teh, kloniran iz nedavnih Texas, Beijing ali Panama izolantov virusa, ki predstavljajo seve, ki jih Center za nadzor bolezni priporoča za cepiva proti gripi in so predmet tega izuma (glej FLUIMMUNE® cepivo proti gripi, proizvajalca Lederle, Physicians Desk Reference, 1993, stran 1232, trivalentno cepivo očiščenega površinskega antigena virusa gripe sestavlja protein hemaglutinin iz A/Texas/36/91, H1N1; A/Beijing/353/89, H3N2 in B/Panama/45/90). Da bi ohranili enako poimenovanje je sprejet naslednji dogovor za opis DNK konstruktov: ime vektorja-sev-gen. Torej se konstrukt, pri katerem je gen NP A/PR/8/34 kloniran v ekspresijski vektor VUneo, imenuje V1Jneo-PR-NP. Če se spremeni etiologija virusa se spremeni tudi gen, ki je optimalen za vgraditev v zdravilni pripravek. Kot je prikazano spodaj, je zaradi citotoksičnega limfocitnega odziva, ki je sposoben zagotoviti zaščito pred heterolognimi sevi, pri novem cepivu, ki je predmet izuma, variabilnost med sevi manj kritična v primerjavi s cepivi, z živim virusom ali polipeptidi. Ker zdravilni pripravek lažje spreminjamo in vanj vgrajujemo nove gene s pomočjo tehnik, dobro poznanih v molekularni biologiji.

Ker se sekvenca nukleoproteina med različnimi sevi virusa gripe ohranja, je bila odpornost, ki smo jo dosegli proti kasnejšim okužbam z virulentnim sevi virusa gripe A heterologna, glede na sev iz katerega je bil gen za nukleoprotein pridobljen.

Pri primerjavi N P različnih sevov virusa gripe A, nismo opazili signifikantnih razlik v sekundarni zgradbi [M. Gammelin et al., Virol. 170, 71 (1989)] in zelo malo sprememb v sekvenci aminokislin [O.T. Gorman et al.,

J. Virol. 65, 3704 (1991)]. V obdobju približno 50-ih let se je pri humanih sevih spremenilo le 0.66 aminokisline letno. Še več, naši rezultati kažejo, da A/HK/68 specifični CTL spoznajo ciljne celice vzpodbujene s- sintetičnim peptidom NP(147-155), ki je bil dobljen iz sekvence A/PR8/34 NP, kar kaže na funkcionalno enak H-2K^d omejen CTL epitop že več kot 34 let (glej sliko 2). Moramo še omentit, da tam kjer imamo gen, z zapisom za virusni površinski antigen, kot je hemaglutinin ali celo neuraminidaza, pride do poleg zelo pomembnega citotoksičnega limfatičnega odziva še do signifikantnega nevtralizacijskeha humoralnega (protitelesnega) imunskega odziva.

I.m. injekcija DNK ekspresijskega vektorja, s kodnim zapisom za ohranjene notranje proteine virusa gripe A, je povzročila nastajanje signifikantne zaščitne imunosti proti kasnejšim virusnim okužbam. Natančneje, prišlo je do tvorbe za NP specifičnih protiteles in primarnih CTL. Po imunizaciji z NP DNK je bilo opazno znižanje virusnega titra v pljučih, inhibicije izgube telesne teže in večjega števila preživelih osebkov, v primerjavi s kontrolno skupino. Zaščitni imunski odziv ni bil posredovan z NP specifičnimi protitelesi, kot je bilo prikazano, zaradi pomankljivega učinka samih NP protiteles (glej Primer 4) v borbi z virusno infekcijo, ampak je bil posledica NP-specifične celične imunosti. Še več, določili smo visok nivo primarnih CTL proti NP. Odpornost proti virulentnim sevom virusa gripe A je bila heterologna, glede na sev, iz katerega smo izolirali DNK. Sev s katerim smo živali okužili, je zrastel več kot tri desetletja za sevom A/PR/8/34, kar kaže, da imunski odziv usmerjen proti ohranjenim proteinom učinkovit, kljub antigenskim mutacijam različnih proteinov ovojnice. Kljub temu, da genski produkti virusa gripe kažejo na določeno stopnjo ohranjanja in ker naj bi CTL nastajali kot odgovor na intracelularno ekspresijo in zorenje MHC, lahko napovemo, da bodo drugi geni virusa gripe izzvali odgovor, ki je enak temu, ki ga dosežemo z N P. Metode za identifikacijo imunogenih epitopov so v stroki dobro poznane [za primer glej Shirai et al., J. Immunol. 148, 1657-1667 (1992); Choppin et al., J. Immunol. 147, 575-583 (1991); Calin-Laurens et al., Vaccine 11, 974-978 (1993)]. Številni od teh genov so bili klonirani, kot je prikazano s kloniranimi in sekvenčnimi stiki v ekspresijskem vektorju (glej spodaj) tako, da so ti konstrukti profilaktične učinkovine v razpoložljivi obliki.

V predloženem izumu so predstavljeni imunogeni ekspresijski vektorji s kodnim zapisom za proteine virusa gripe. V tem izumu je predstavljeno sredstvo, ki sproži nastanek navzkrižne imunosti pred različnimi sevi brez potrebe po učinkovini, ki se podvaja ali adjuvansa. Imunizacija z DNK ponuja tudi številne druge prednosti. Prvič, tak pristop k cepljenju lahko uporabimo tako pri tumorjih kot tudi infektivnih spojinah, saj je CD8+CTL odziv pomemben pri obeh patofizioloških procesih [K. Tanaka et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Prvič, sprožitev imunskega odziva proti proteinu, ki je ključen za proces transformacije, predstavlja učinkovito sredstvo za zaščito pred rakom ali imunoterapijo. Drugič, tvorba visokega titra protiteles proti ekspresijskim proteinom po vbrizganju proteina (NP in hemaglutinin) in DNK humanega rastnega hormona [glej primer D.-C. Tang et al., Nature 356, 152 (1992)] kaže, da je to enostavno in učinkovito sredstvo za pripravo cepiva s ‘protitelesi ali ločeno ali skupaj s cepivom s citotoksičnimi T limfociti, ki učinkujejo proti ohranjenim antigenom.

Enostavna priprava in čiščenje DNK konstruktov v primerjavi s tradicionalnim čiščenjem proteinov, olajša pripravo kombiniranih cepiv. Pripravimo, zmešamo in skupaj apliciramo lahko številne konstrukte, ki na primer označujejo NP, HA, M1, PB1, NS1 ali katerikoli drugi gen virusa gripe. Nezadnje, ker se po aplikaciji DNK začne ekspresija proteinov [H. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1990); E. Hansen et al., FEBS Lett. 290, 73 (1991);

S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)] lahko podaljšamo prisotnost B- in T-celičnega spomina [D. Gray in P. Matzinger, J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S. Oehen et al., ibid. 176, 1273 (1992)] in tako vzpodbudimo dolgotrajno humoralno in celično posredovano imunost.

Zaradi sedanjih omejitev registriranih cepiv proti gripi se je pokazala potreba po razvoju učinkovitejšega sredstva za preprečevanje okužbe in izboljšanje bolezni. Starejša cepiva imajo omejeno učinkovitost, so učinkovita le proti nekaterim izbranim sevom virusov, njihova učinkovitost v kratkem času poide. Torej morajo sedanja cepiva, če hočemo da so učinkovita, vsako leto ponovno formulirati. Nastajanje učinkovitejšega CTL odziva proti notranjim proteinom bi zagotovilo očitno dologotrajnejšo navzkrižno-reaktivno imunost, kar z registriranimi cepivi ne moremo doseči.

Dosegli smo ekspresijo proteinov po PNV konstruktih pri miših, belih dihurjih in nečloveških primatih, z dokazovanjem imunskega odziva, usmerjenega proti antigenom virusa gripe, pri gostitelju. Vbrizganje DNK s kodnim zapisom za NP virusa gripe, se je pri miših odražala v povečanem številu preživelih osebkov, znižanem virusnem titru v pljučih in manjši izgubi telesne teže v primerjavi z živalmi v kontrolni skupini po okužbi s podvrsto virusa gripe (mutirani sevi), ki so bili drugačni od tistih, ki so vsebovali DNK konstrukt. Opazili smo tudi znižan virusni titer po okužbi z mutiranimi (shifted) sevi pri belih dihurjih, ki smo jim vbrizgali NP DNK. Taki rezultati kažejo, da pri zaščiti proti večjim mutacijam virusnih sevom pomagajo DNK cepiva, ki imajo tudi gene s kodnim zapisom za NP. Ko je injiciranju HA DNK sledila okužba poskusnih živali z mutiranimi (drifted) virusnimi sevi je bilo znižanje virusnega titra še veliko večja. Dodatek internega proteina DNK rahlo zviša visoko stopnjo zaščite, ki smo jo opazili po injiciranju same HA DNK.

Imunski odziv na DNK virusa gripe smo pri miših spremljali 6. mesecev po injiciranju tako, da smo spremljali prisotnost protiteles, aktivnost CTL in in vivo zaščito. Ponovljena aplikacija DNK je še povečala število preživelih, ki so bili okuženi 25. teden s sevi virusa gripe različnih podvrst in tako pokazali, da je možno celično posredovano imunost sekundarno vzpodbuditi. Pri afriških zelenih opicah smo po dveh injekcijah HA DNK prisotnost protiteles dokazali najmanj eno leto, prisotnost protiteles po eni injekciji, pa je bila najmanj devet mesecev.

Rezultati teh živalskih poskusov kažejo, da neposredna DNK injekcija zagotavlja izboljšan način zaščite ljudi pred infekcijo in obolevanjem za gripo. Mimogrede, eksperimentalno zaščito z DNK injekcijo smo dosegli s cepljenjem nikoli okuženih miši in belih dihurjev. Odrasli ljudje, ki smo jih cepili z DNK so pred tem gripo že preboleli. Te osebe bodo pokazale po imunizaciji z DNK konstrukti še bolj izražen, po možnosti dolgotrajnejši, imunski odziv.

Velikost odmerka smo primerjali po imunogenosti, z namenom določiti optimalno koncentracijo za uporabo. Pri poskusih na malih sesalcih je že tako majhna količina, kot je 1 μρ NP DNK sprožila nastajanje protiteles in CTL odziva. Pri imunizaciji Rhesus opic smo opazili protitelesni odziv pri obeh živalih pri odmerku 100 in 1000 μρ HA DNK (A/PR/08/34), medtem, ko se je ena žival odzvala že na eno samo injekcijo z odmerkom 10 μρ. V ločenih poskusih smo zdravim afriškim zelenim opicam aplicirali zmes petih različnih DNK konstruktov s kodnim zapisom za HA iz treh različnih podvrst virusa, kot tudi DNK s kodnim zapisom za NP in M1 iz virusa gripe A. Vse tri opice v vsaki skupini so se odzvale na cepivo, ki so imele po 10 μρ ali 100 μρ vsakega konstrukta. Na osnovi teh ugotovitev

lahko predvidevamo, da bodo	odmerki	10, 50, 100	in	200 μρ	DNK
učinkoviti tudi pri ljudeh.
Preprečevanje okužbe z	registriranimi, inaktiviranimi	cepivi	je v
soodnosu z nivojem protiteles	proti HA	v serumu in	sluznici, ni	pa v

soodnosu s protitelesnim odzivom na interne proteine virusa gripe. Torej je potrebno, da je HA vključena v razvoj cepiva z DNK virusa gripe. Kakorkoli, imunski odziv na NP vzpodbudi protitelesno odzov proti HA, interni proteini virusa gripe pa sprožijo CTL odziv, navzkrižno reaktiven proti antigensko različnim sevom virusa gripe. Kot je že zapisano zgoraj, so poskusi na živalih pokazali izboljšano imunogenost in zaščito, ko je injekcija z DNK konstrukti, s kodnim zapisom za interne proteine kot tudi HA. Vključitev DNK konstruktov s kodnim zapisom za interne proteine bi izboljšala učinkovitost DNK cepiva pri ljudeh. Ker je količina odmerkov odvisna od interakcij teh sestavin je strokovnjaku potreben rutinski test, da določi količino DNK v cepivu, da pripravi zmes HA, NP in M1 DNK konstruktov. Lahko določamo odziv gostitelja na vsako sestavino posebaj in ga primerjamo s titrom inhibicije hemaglutinina (HI) in nevtralizacije proti komponenti HA in CTL odziv proti M1 in NP epitopom. Rezultate primerjamo s protitelesnim odzivom po cepljenju s konstrukti, ki sprožijo le ekspresijo HA. Te študije dovoljujejo oceno potencialnega odziva na cepivo, ki vsebuje DNK, s kodnim zapisom za HA, kot tudi interne proteine.

Učinkovitost na ljudeh smo preverili na prostovoljcih, ki so prejeli cepivo z DNK virusa gripe in jih nato intranazalno okužili, da bi s tem dokazali učinkovitost cepiva proti podobnim virusnim sevom, kot tudi različnim podvrstam sevov virusa gripe. Sestava, doziranje in način aplikacije za cepivo temelji na izsledkih študij, ki so v teku. Klinično učinkovitost je dokazana s stopnjo okužbe, težo bolezni in njenim trajanjem. Klinične ugotovitve smo primerjali z laboratorijsko oceno imunskega odziva gostitelja in količine virusa, z namenom določitve nadomestnih označevalcev ki so v soodnosu z zaščito.

Standardne tehnike v molekularni biologiji za pripravo in čiščenje DNK konstruktov omogočajo pripravo DNK kot zdravila, ki je predmet tega izuma. Medtem, ko so standardne tehnike poznane v molekularnih biologiji, zadostne za pripravo produkta, ki je opisan v izumu, so le-te nezadostne za pripravo specifičnih, tukaj odkritih, konstruktov, ki predstavljajo novo terapevtsko učinkovino in ki presenetljivo omogočijo zaščito pred različnimi sevi, kar s standardnimi cepivi z inaktiviranim celotnim virusom ali podenotami proteinom ni mogoče doseči.

Količina DNK, ki je sposobna pri prejemniku cepiva sprožiti ekspresijo, je odvisna od transkripcijskih in translacijskih promoterjev, ki so vključeni v DNK konstrukt in tudi od imunogenosti nastalih genskih ^! produktov. Na splošno velja, da je imunološko in profilaktično učinkovit že i odmerek približno od 1 μg do 1 mg, najbolje pa od 10 μg do 300 mg, ki ga apliciramo neposredno v mišično tkivo. Podkožne (subkutane), intradermalne injekcije in vnos skozi kožo, sprejemljivi pa so tudi drugi načini aplikacije na primer intraperitonealno, intravenozno ali kot inhalacija. Priporočljiva je tudi drugo cepljenje, sekundarna vzpodbuda.

DNK je lahko prosta, to je nepovezana s proteinom, adjuvansom ali drugim pomožnim sredstvom, ki vpliva na imunski sistem prejemnika. V tem primeru je zaželeno, da je DNK v obliki fiziološko sprejemljive raztopine, kot je, kar seveda ni nujno, sterilne fiziološke ali puferirane fiziološke raztopine. Alternativo predstavlja DNK vgrajena v liposome, kot so liposomi iz lecitina ali drugačni poznani liposomi, kot zmes DNK-liposomi (glej primer WO9324640) ali DNK, ki je povezna z adjuvansom, za katerega je poznano, da izzove imunski odziv, kot so proteini ali drugi nosilci. Vgradijo se lahko tudi učinkovine, ki pomagajo pri celičnem prevzemu DNK, kot so, vendar ni nujno, kalcijevi ioni, virusni proteini in druge spojine sposobne prenosa. Za te spojine je navadno znano, da so sposobne transfekcije in so farmacevtsko sprejemljivi nosilci. Izraz gen, ki se tukaj uporablja, pomeni del nukleinske kisline, s kodnim zapisom za določen polipeptid. Izraza zdravilni pripravek in cepivo sta zamenljiva in se uporabljata za opis sestave, ki je sposobna spodbuditi imunski odziv. Zamenljiva sta tudi izraza konstrukt in plazmid. Izraz vektor pomeni DNK, v katero so klonirani geni za uporabo skladno z izumom.

V izumu je opisana metoda za uporabo genov virusa gripe za spodbuditev imunskega odziva in vivo pri vretenčarjih natančneje sesalcih vključno z ljudmi in obsega:

a) izolacijo gena

b) vključitev gena v regulatorno sekvenco tako, da je gen operativno povezan s kontrolno sekvenco, ki pri vnosu v živo tkivo usmerja začetek transkripcije in sledečo translacijo gena

c) vnos gena v živo tkivo in

d) sekundarno vzpodbudo z dodatnim genom virusa gripe.

Predmet izuma je metoda za zaščito proti heterogenim sevom virusa gripe. To je povezano z vnosom imunološko učinkovite količine nukleinske kisline, s kodnim zapisom za ohranjene epitope virusa gripe. Na primer, celoten gen virusa gripe za nukleoprotein omogoča to funkcijo, zato pričakujemo, da sekvenca s kodnim zapisom za druge gene virusa gripe in njihovi deli s kodnim zapisom ohranjenih epitopov v teh genih tudi zagotavljajo navzkrižno zaščito proti različnim sevom.

Drugi predmet tega izuma je DNK cepivo s kodnim zapisom za sledeče genske produkte virusa gripe: nukleoprotein, hemaglutinin, matriks, nenstrukturne proteine ali polimeraza. Posebni primeri v tem okviru so opisani spodaj, kjer gen humanega virusa gripe, izolant A/PR/8/34, s kodnim zapisom za nukleoprotein, bazično polimerazo 1, nestrukturni protein 1, hemaglutinin, matriks 1, bazično polimerazo 2, nukleoprotein izolanta A/Beijing/353/89 humanega virusa gripe, gen za hemaglutin izolanta humanega virusa gripe A/Texas/36/91 ali gen za hemaglutin izolanta humanega virusa gripe B/Panama/46/90.

Posebni del tega izuma opisuje DNK konstrukt s kodnim zapisom za gen virusa gripe, kjer je DNK konstrukt sposoben ekspresije po vnosu v živo tkivo in vivo in sprožiti imunski odziv proti nastalim produktom zapisanega gena virusa gripe. Nadalje, v kombinacijah se nahajajo taki konstrukti s poiinukleotidi s kodnimi zapisi za druge antigene, ki niso povezani z viruson gripe vendar so v skladu s tem izumom. Primeri najboljših genov virusa gripe s kodnim zapisom za DNK konstrukt obsegajo:

a) pnRSV-PR-NP

b) V1-PR-NP

c) V1J-PR-NP, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:12:,

d) V1J-PR-PB1, konec 5’ predstavlja $EQ.ID:13:,

e) V1J-PR-NS, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:14:,

f) V1J-PR-HA, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:15:,

g) V1J-PR-PB2, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:16:,

h) V1J-PR-M1, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:17:,

i) V1Jneo-BJ-NP, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:20: in konec 3’ SEQ.ID:21:,

j) V1Jneo-TX-NP, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:24: in konec 3ζ SEQ.ID:25: in

k) V1 Jneo-PA-HA, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:26: in konec 3’ SEQ.ID:27:,

l) V1Jns-GA-HA (A/Georgia/03/93), velikost konstrukta 6.56 Kb, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:46: in konec 3’ SEQ.ID: 47:,

m) V1Jns-TX-HA (A/Teyas/36/91), velikost konstrukta 6.56 Kb, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:48: in konec 3’ SEQ.ID:49:,

n) V1Jns-PA-HA (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.61 KB, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:50: in konec 3’ SEQ.ID:51:,

o) V1Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/39), velikost konstrukta 6.42 KB, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:52: in konec 3’ SEQ.ID:53:,

p) VUns-BJ-M1 (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 5.62 KB, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:54: in konec 3’ SEQ.ID:55:,

q) V1Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.54 KB, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:56: in konec 3’ SEQ.ID:57:,

r) V1Jns-PA-M1 (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 5.61 KB, konec 5’ predstavlja SEQ.ID:58: in konec 3’ SEQ.lD:59:,

Sledeči primeri so podani za nadaljno razlago izuma, brez omejevanja izuma na nekatere posebnosti primerov.

Primer 1

PRIPRAVA DNK KONSTRUKTOV S KODNIM ZAPISOM ZA PROTEINE

HUMANEGA VIRUSA GRIPE:

i) pnRSV-PRNP Gen A/PR/8/34 NP je bil izoliran iz pAPR-501 [J.F. Young et al., v The Origin of Pandemlc Influenza Viruses, W.G. Laver, urednik (Elsvier Science Publishing Co„ Inc., 1983)] kot EcoRI fragment s 1565 baznimi pari, Klenow filled-in in kloniran v KIenow filled-in s fosfatazo tretirano mesto pRSV-BL. pRSV-BI je bil pripravljen z digestijo pBL-CAT3 [B. Luckow in G. Schutz, Nuc. Acids Res. 15, 5490 (1987)] vektorja z Xho I in Nco I, kateremu je bila odstranjena kodna sekvenca CAT in KIenow filled-in in samopovezana. Fragment RSV promoterja je bil izoliran kot Nde I in fragment Asp718 iz pRshgrnx [V. Giguere et al., Nature 330, 624 (1987)], Klenow filled-in in kloniran na mesto Hindlll vmesnega vektorja, ki je nastal zgoraj (pBL-CAT brez CAT sekvence).

ii) V1-NP ekspresijski vekotr V1 je bil pripravljen iz pCMVlE-AKl-DHFR [ Y. Whang et al., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Gena AKI in DHFR sta bila odstranjena s cepitvijo vektorja z EcoR I in povezana. Ta vektor ne vsebuje intron A v CMV promoterju, ki je bil dodan kot PCR fragment, ki je izbrisal notranje mesto Sac I [pri 1855 kot je številčeno pri B.S. Chapman et al., Nuc. Acids. Res. 19, 3979 (1991)]. Model, uporabljen za PCR reakcijo, je bil pCMVintA-Lux, ki je bil pripravljen z združevanjem Fragmentov Hind lil in Nhe I iz pCMV6a120 [glej B.S. Chapman et al., ibid.], ki vključuje hCMV-IE1 pospeševalec/promoter in intron A v Hind lit in Xba I mesti pBL3, da je nastal pCMVIntBL. Fragment gena luciferaze s 1881 baznimi pari (Hind Ill-Sma I Klenow filled-in) iz RSV-Lux [J.R. de Wet et al., Mol. Celi. Biol. 7, 725 (1987)] je bil kloniran na mesto Sal I pCMVIntBI, ki je bil tretiran z Klenovv filled-in in fosfatazo.

RNK iniciatorji (kratka veriga RNK = primer), ki so bili vključeni v intron A so:

5’ RNK iniciator, SEQ.ID:5: 5’-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3’

3’ RNK iniciator, SEQ.ID:6: 5’-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA

CTGCAG-3’.

RNK iniciatorji, ki smo jih uporabili za odstranitev mesta Sac I so: vzorčni RNK iniciator, SEQ.ID:7:

5’-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3’ in komplementarna veriga RNK iniciatorja, SEQ.ID:8:

5’-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3’.

PCR fragment smo odstranili s Sac I in Bgl II in vključili v vektor, ki smo ga cepili z istim encimom. NP genu virusa gripe A (A/PR/8/34) smo odcepili pAPR501 [J.F. Young et al., v The Origin of Pandemic Influenza Viruses, W.G. Laver, urednik (Elsvier Science Publishing Co„ Inc., 1983)] kot fragment EcoR I s 1565 baznimi pari. Ta je bil vključen v V1 na topem mestu Bgl II, da je nastal V1-NP. Plazmidi so bili propragirani v E. coli in čiščeni po metodi alkalne liže [J. Sambrook. E.F. Fritsch in

T.Maniatis, v Molecular Cloning, a Laboratory Manual, druga izdaja, (Cold Spring Laboratory Press, 1989)]. S CsCI združeno DNK smo oborili z etanolom in ponovno suspendirali v 0.9% raztopini NaCl pri 2 mg/ml za injekcijo.

Primer 2

DOLOČEVANJE CITOTOKSIČNIH T-LIMFOCITOV PROTI HUMANEMU

VIRUSU GRIPE

Tvorba citotoksičnih T-limfocitov pri miših je posledica imunizacije z DNK ali prebolene okužbe z virusom A/HK/68. Kontrolne kulture smo pridobili iz miši, ki smo jim vbrizgali kontrolno DNK ali miši, ki jim nismi vbrizgali ničesar. Pripravili smo suspenzije ene celice, rdeče krvne celice smo odstranili z lizo z amonijevim kloridom, vranične celice smo gojili v gojišču RPMI 1640 obogatenim z 10% govejim serumom zarodkov (FBS), 100 U/ml penicilina, 100 Mg/ml streptomicina, 0.01 M HEPES (pH=7.5) in 2 mM Lglutamina. Dodanih je bilo enako število analognih, neobsevanih stimulatorskih celic, vzpodbujenih za 60 minut z H-2K^d-omejenim epitopom NP147-155 (Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val, SEQ.ID:9:) pri 10 μΜ ali inficiranimi z virusom gripe A/PR/34 (H1N1) in 10 U/ml rekombinantnih humanih IL-2 (Cellular Products, Buffalo, NY), kulture smo inkubirali 7 dni pri 37°C s 5% CO₂ in 100% relativni vlagi. Pri določenih poskusih smo namesto analognih stimulatorskih celic dodali rhlL-2 (20 U/ml) in Con A (2 gg/ml). Aktivnost citotoksičnih T-celic smo določili s celicami P815 označenimi za 3 ure s 60 μθί ⁵¹Cr na 10⁶ celic in vzpodbujenimi kot zgoraj z NP147-155 ali okuženimi z virusom gripe A/Victoria/73 /H3N2). Kontrolne tarče (označene celice P815 brez peptida ali virusa) niso bile lizirane. Tarče smo nanesli na ploščice s 96. vdolbinami z okroglim dnom, 10⁴ celic/vdolbino, in jih inkubirali 4 ure v treh paralelah. Iz vsake vdolbine smo odstranili supernatant (30 μΙ) in v Betaplate iskrečem se števcu (LKBWallac, Turku, Finska) prešteli. Maksimalno število, sproščeno po dodatku 6M HCI in spontano število, sproščeno brez CTL smo določili za vsak ciljni preparat. Izračunali smo odstotek specifične liže kot [(eksperimentalno spontano)/(maksimalno - spontano)] X 100.

Primer 3

NASTANEK ZA NP SPECIFIČNIH CTL IN PROTITELES IN VIVO

Mišim BABL/c smo v stegensko mišico obeh nog vbrizgali plazmid cDNK s kodnim zapisom za nukleoprotein iz A/PR/8/34 z Rous sarkoma virusom ali citomegalovirusnim promoterjem.

Uporabili smo sledeče ekspresijske vektorje:

i) pnRSV-PRNP. glej Primer 1 ii) V1-NP. glej Primer 1

Uporabljene živali, mišje samice BABL/c, smo dobili iz Charles River Laboratories, Raleigh, NC. Miši so bili stare 4-5 tednov in smo jim pri starosti 5-6 tednov prvič vbrizgali DNK. Če ni drugače navedeno, smo DNK vbrizgali v stegenske mišice obeh nog, v vsako nogo smo aplicirali 50 μΙ sterilne fiziološke raztopine, ki je vseboval 100 μg DNK. Miši so odmerek prejele 1-krat, 2-krat ali 3-krat v tritedenskih intervalih. Negativno kontrolno skupino so predstavljale živali, ki niso prejele ničesar ali pa so jim aplicirali ustrezno skupino placebo vektorja brez N P gena.

Prisotnost ali odsotnost NP plazmida DNK v mišicah izbranih živali smo analizirali s PCR (slika 1). Plazmid DNK (NP ali DNK luciferaze) smo zasledili v 44-ih od 48-ih testiranih mišicah. Pri miših, ki smo jim aplicirali DNK luciferaze, smo po obnovljeni aktivnosti luciferaze v mišičnem ekstraktu zasledili proteinsko ekspresijo, s pomočjo znanstveno poznanih metod [J.A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991); H. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proč. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et al., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)].

Ekspresija NP po injiciranju NP DNK je bila nižja od meje detekcije z VVestern analizo madeža (< 1 ng), vendar smo jo dokazali s pomočjo nastalih specifičnih protiteles proti NP (glej sliko 2). Za analizo nastalih, za NP-specifičnih CTL, smo 1.-4. teden po imunizaciji odstranili vranico in celice vranice ponovno stimulirali z rekombinantnim humanim IL-2 plus autolognimi celicami vranice, ki so bile ali okužene z virusom gripe A (A/PR/8/34) ali vzpodbujene z H-2K^d-omejenim nukleoproteinskim beljakovinskim epitopom [NP zaostanek 147-155, glej O.K. Rotzscke et al., Nature 348, 252 (1990)]. Ponovno stimulirane celice vranice z virusom okuženimi ali epitopno-vzpodbujenimi singeničnimi celicami so bile sposobne ubiti nukleoproteinske ciljne celice z vzpodbujenim epitopom (slika 3A). To kaže, da so po i.m. injekciji NP DNK nastali odgovarjajoči peptidi povezani z MHC razred I, ki so sprožili specifičen CTL odziv. Nastali CTL so bili sposobni prepoznati in lizirati z virusom okužene ciljne celice (slika 3B) ali ciljne celice vzpodbujene z H-2K^d-omejenim nukleoproteinskim epitopom in z virusom okuženimi celicami. To dokazuje njihovo specifičnost kot tudi njihovo sposobnost, da zaznajo naravno nastali epitop v okuženih celicah.

Veliko težje je bilo oceniti imunogenost cepiva z NP DNK preko primarnega CTL odziva. Celice vranice, odvzete mišim, ki so jim vbrizgali NP DNK, so bile aktivirane tako, da smo jih izpostavili Con A in II-2, nismo pa jih ponovno stimulirali in vitro z antigen ekspresijskimi celicami preden smo preiskusili njihovo sposobnost ubijanja ustrezne ciljne celice. Splenociti miši, imuniziranih z NP DNK, ko so bili akitivirani z Con A in IL2 in vitro brez antigen specifične stimulacije, so lizirali oboje, s stimuliranim epitopom in z virusom okužene ciljne celice (slika 3C in D). Litično aktivnost ponovno stimuliranih in aktiviranih vraničnih celic lahko primerjamo s podobno tretiranimi splenociti, ki smo jih pridobili iz miši, ki smo jih predhodno okužili z virusom gripe A/HK/68, virulenten mišje spremenjen H3N2 sev, ki je zrastel 34 let kasneje kot A/PR/8/34 (H1N1).

Injekcija NP DNK je sprožila nastajanje CTL, ki so specifični za nukleoproteinski epitop in so bili sposobni spoznati naravni antigen (to je, lahko ubijajo virusno okužene celice). NP CTL, ki so sprožili ekspresijo humanega HLA-A2, so nastajali tudi v transgenskih miših C3H in B6.

NP CTL smo zaznali tudi v vranici BALB/c miši, ki smo jim vbrizgali samo en odmerek 1 gg NP DNK (najnižji preiskušeni odmerek) (Preglednica 3-IV):

Preglednica 3-IV: CTL odziv pri miših po eni injekciji NP DNK

vneseni material	odmerek (gg)	% specifične liže	sd
NP DNK	400	52,5	10,7
	400	80,4	10,3
NP DNK	200	75,6	5,4
	200	44,6	4,4
NP DNK	100	76,7	2,9
	100	35,6	8,9
NP DNK	50	62,9	0,6
	50	76,7	7,4
NP DNK	10	83,2	10,1
	10	37,7	2,5
NP DNK	1	44,2	0,3
	1	13,0	2,0
kontrolna DNK	100	4,9	1,0
virus gripe	-	79,3	8,3

Preglednica 3-IV: Samice BALB/c miši (4-6 tednov starosti) smo vbrizgali en odmerek A/PR/34 NP DNK (V1JNP) ali kontrolno DNK (V1J) v količinah, ki so navedene v preglednici. Za primerjavo smo miši okužili z virusom gripe A/PR/34. CTL so se pojavili po osmih tednih in so bili ponovno stimulirani in vitro z NP peptidom vzpodbujenimi singeničnimi vraničnimi celicami in nato preiskušene na NP peptid vzpodbujene P815 celice pri razmerju efektor:cilj 50:1. Rezultati so prikazani kot odstotek specifične liže za reprezentativne posameze miši.

Sledeči poskusi so pokazali, da so pri miših, ki so prejele en odmerek 1 μρ NP DNK, NP, CTL ostali prisotni najmanj 4.5 meseca (zadnje testiranje). Jakost CTL odziva po DNK injekcij je bila primerljiva z jakostjo odziva pri miših, okuženih z virusom gripe. Vsekakor je treba omeniti, da analiza CTL po ponovni in vitro stimulaciji z antigenom ni strogo kvantitivna. Zato smo pred nedavnim razvili omejujoč razredčevalni test, s katerim količino NP-specifičnih CTL določimo bolj kvantitativno. Pri miših, ki so prejele tri odmerke po 100 μρ NP DNK smo CTL odziv zasledili še najmanj šest mesecev po imunizaciji (slika 19). Torej ima influenčni PNV sposobnost tvorbe dolgoživega CTL odziva neposredno proti ohranjenim virusnim antigenom.

Aplikacija NP DNK mišim je sprožila nastajanje visokega titra anti-NP IgG protiteles (slika 2). Domnevali so, da so za nastajanje visokega titra IgG protiteles pri miših potrebne CD4+ T celice pomagalke [P. Vieira in K. Rajewsky, Int. Immunol. 2, 487 (1990); J.J. Donnelly et al., J. Immunol. 145, 3071 (1990)]. To dokazuje, da plazmid sproži ekspresijo NP in situ pri obeh MHC razred I in II.

Primer 4

ZAŠČITA MIŠI PO OKUŽBI Z VIRULENTNIM HUMANIM VIRUSOM

GRIPE:

Vloga NP protiteles pri zaščitni imunosti proti gripi je pokazana z dvema pristopoma: Prvič, količino virusa v pljučih smo določili v poskusu s pasivnim prenosom. Samicam BALB/c miši (> 10 tednov stare) smo intraperitonealno vbrizgali 0.5 ml združenih serumov (razredčenih z 2.0 ml PBS) miši, ki smo jim trikrat vbrizgali po 200 μρ NP DNK. Kontrolni skupini miši smo vbrizgali enak volumen združenih serumov zdravih miši ali združenih serumov miši, ki so prebolele okužbo z A/HK/68, redčen z 2.0 ml PBS. Odmerek A/HK/68 imunskega seruma smo uravnali tako, da je bil ELISA titer anti-NP protiteles enak količini v združenih serumih miši, okuženih z NP DNK. Neanestezirane miši so izpostavili okužbi s placebom z 10⁴ TKD₅₀ A/HK/68, dve uri po vbrizganju seruma, tri dni kasneje so prejele naslednjo injekcijo z enako količino seruma. Miši smo usmrtili 6 in dan po okužbi in določali virusni titer v pljučih ter določevali TKD₅₀ na ml, kot je opisano v Moran. [J. Immunol. 146, 321 (1991)].

Zdravim mišim smo aplicirali infuzijo z anti-NP protiserumom, ki smo ga pripravili iz miši, ki so bile okužene z NP DNK in nato okužene z A/HK/68. Mišim so aplicirali mišim-prilagojen virusnim sevom A/HK/68 in nato to vzdrževali z in vivo prehodom v miš (dr. I. Mbawuike, personal communication). Kužnino smo odvzeli tako, da smo pljuča okuženih miši homogenizirali in določili 5 χ 10⁸ TKD50 na celicah MDCK. Iz določitve virusnega pljučnega titra in študija izgube telesne teže, smo slepo okužbo z virusom izvedli z intranazalno instilacijo 20 μΐ z 10 ⁴ TKD50 v nosnici neanesteziranih miši, kar vodi v progresivno okužbo pljuč z virusom, ki pa za BALB/c miši ni smrtna [R.A. Yetter et al., Infect. Immunity 29, 645, (1980)]. Pri določevanju števila preživelih osebkov, smo miši okužili z intranazalno instilacijo 20 μΙ z 10²·⁵ TKD₅₀ v nosnici popolnoma s ketaminom in ksilazinom anesteziranih živali; okužba anesteziranih živali s tolikšnim odmerkom je povzročila takojšno smrt pri 90-100% neimuniziranih miši [J.L. Schulman in E.D. Kilbourne, J. Exp. MedAtS, 257 (1963); G.H. Scott in R.J. Sydiskis, Infect. Immunity 14, 696, (1976); R.A. Yetter et al., Infect. Immunity 29, 654 (1980)]. Virusni pljučni titer smo določili s pomočjo serijske titracije na MDCK celicah (ki smo jih dobili iz ATCC, Rockville, MD) na ploščicah s 96-imi vdolbinami, kot je opisano v članku Moran et al., [Ibld.].

Pri miših, ki so prejele anti-NP protiserum nismo opazili znižanja virusnega pljučnega titra (6.3 ± 0.2; povprečje ± SEM; n=4), če smo ga primerjali s kontrolno skupino miši, ki je prejela normalen serum (6.1 ± 0.3; povprečje ± SEM; n=4). Za pozitivno kontrolo smo zbrali serum štirih miši, ki so bile okužene z A/HK/68 in zatem pasivno imunizirane. Po okužbi z A/HK/68 v pljučih nismo opazili virusne infekcije, kar kaže na to, da je bil serum učinkovita zaščita pri okužbi s homolognim virusom. Drugič, zdrave miši smo imunizirali z i.m. injekcijo s prečiščenim NP (5 μ g/nogo, trikrat v obdobju šestih tednov). Pri teh miših se je tvoril višji titer NP-specifičnih protiteles, ki pa ni sprožil nastanka NP-specifičnih CTL in ni ščitil pred smrtnimi odmerki virusa. V nasprotju z nevtralizacijskim učinkom protiteles na celoten virus, krožeči anti-NP IgG mišim niso omogočali zaščitne imunosti.

In vivo zaščitno učinkovitost NP DNK injekcij smo ocenili tako ,da smo določili ali je bil celično posredovan imunski odziv signifikanten. Neposredno merjenje učinkovitosti imunskega odziva je bila sposobnost z NP DNK prvič imuniziranih miši, da preživijo progresivno, nesmrtno pljučno okužbo s heterolognim sevom virusa gripe (A/HK/68; H3N2). Virusno okužbo smo izvedli kot je opisano zgoraj. Virusni pljučni titer pri miših imuniziranih z NP DNK je bil 7. dan po okužbi tri dekade nižji (1.0 + 1.0; povprečje ± SEM; n=4) kot pri kontrolni skupini miši, ki niso bile imunizirane (4.1 ± 0.3; povprečje ± SEM; n=4) ali so bile imunizirane s placebo vektorjem (4.5 ± 0.0; povprečje ± SEM; n=4). Dejstvo je, da je bila količina virusa pri treh od štirih miši v pljučih nedoločljiva medtem, ko so bili pri obeh kontrolnih skupinah v tem času virusi še prisotni. Očitna razlika, ki smo jo opazili v pljučnem virusnem titru v tem in šestih drugih poskusih je dokaz, da je imunski odziv pospešil odstranjevanje (klirens) virusa. Pomankanje zaščitnega učinka placebo vektorja potrjuje, da DNK sama ne sproži imunskega odziva. Še več, zaradi okužbe z virusnim sevom A/HK/68 (virulenten, mišim prilagojen sev H3N2), ki je bil heterologen glede na sev A/PR/8/34 (H1N1) iz katerega smo NP gen klonirali, je bila imunost popolnoma heterotipična.

Kot merilo za umrljivost, ki jo je povzročil virus, smo spremljali izgubo telesne teže miši, ki so bile okužene s subletalnim odmerkom virusa gripe A/HK/68 po predhodni imunizaciji z NP DNK (slika 4). Kontrolno skupino so predstavljale necepljene miši ali miši, ki so prejele placebo vektor. Pri miših, imuniziranih z NP DNK, smo po okužbi z virusom gripe A, opazili manjšo izgubo telesne teže in hitrejši porast na težo pred okužbo, v primerjavi s kontrolno skupino.

Intranazalna infekcija popolnoma anesteziranih živali z virusom gripe A je, v primeru, ko infekcija ni bila kontrolirana, povzročila hitro virusno replikacijo v pljučih, ki ji je 6-8 dan sledila smrt [R.A. Yetter et al., Infect. Immunity 29, 654 (1980)]. Preživetje miši, ki so bile okužene po tej metodi, odseva njihovo sposobnost omejevanja teže akutne pljučne infekcije. Preučevali smo sposobnost miši, da preživijo okužbo z dvema različnima sevoma gripe A/HK/68 (glej sliko 5) in A/PR/8/34. Miši, predhodno imunizirane z NP DNK, so preživele v 90% v primerjevi z 0% preživelih miši, imuniziranih s placebo vektorjem in 20% preživelih pri neimuniziranih živalih (slika 5). Pri 14. tovrstnih študijah smo pri miših, imuniziranih z NP

DNK, opazili najmanj 50% večje število preživelih v primerjavi s kontrolno skupino. Torej sposobnost NP DNK vzpodbujenega imunskega odziva, da okužbi sledi hitrejše okrevanje in zmanjšanje bolezni, ki jo povzroči spremenjen sev virusa, vzgojen 34 let kasneje, kaže na smiselnost ciljanja na ohranjene proteine za tvorbo citotoksičnega T-limfocitnega odziva.

Primer 5

IZOLACIJA GENA IZ IZOLIRANEGA VIRUSA GRIPE

Številni starejši sevi virusa gripe so naloženi na ATCC (The 1990 Catalogue of Animal Viruses & Antisera, Chlamydiae & Rickettsiae, 6. izdaja, naštetih je 20 sevov virusa gripe A in 14. sevov virusa gripe B).

A. Virusni sevi in čiščenje

Seve virusa gripe, ki je v cepivu za sezono gripe 1992, smo prejeli od dr. Nancy J. Cox iz Enote za virusne in rikecijske bolezni Centra za nadzor nad boleznimi iz Atlante, GA. Ti sevi so; (1) A/Beijing/353/89 (H3N3; (2) A/Texas/36/91 (H1N1); (3) B/Panama/45/90 in (4) A/Georgia/03/93.

Vse te viruse so razmnožili z inokulacijo v 9 do 11 dni stara oplojena kokošja jajca (razen A/Georgia, ki je zrasel na MDCK celicah), (100-200 na virusni preprat) in očiščeni z modificirano metodo opisano v Massicot et al., [Virology 101, 242-249 (1980)]. Na kratko, virusne suspenzije smo zbistrili s pomočjo centrifugiranja pri 8000 obratov na minuto (centrifuga Sorvall RC5C, rotor GS-3) in nato peletizirane s centrifugiranjem pri 18.000 obratih na minuto 2 uri v rotorju tipa Beckman. Peletizirane viruse smo ponovno suspendirali v STE (0.1 M NaCI, 20 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) in centrifugirali pri 4.000 obratih na minuto 10 minut (centrifuga Hermle Z360 K), da smo odstranili agregate. 2 ml supernatanta smo nanesli na diskontinuiran sukrozni gradient, sestavljen iz 2 ml 60% sukroze prekrite z 7 ml 30% sukroze puferirane s STE in centrifugi rane pri 36.000 obratih na minuto (rotor SW-40, Beckman) 90 minut. Združene viruse smo zbrali na mejni površini, jih desetkrat redčili s STE in peletizirali pri 30.000 obratih na minuto 2 uri (Beckman, rotor Ti45). Peletizirane viruse smo zamrznili na -70°C.

B. Ekstrakcija virusne RNK in sinteza cDNK

Virusno RNK smo očistili iz zmrznjenih virusov z gvanadijevim izotiocianatom z uporabo komercialno dosegljive opreme (Stratagene, La Jolla, CA) z metodo po Chomczynkemu in Sacchiju [Anai. Biochem. 162, 156-159 (1987)]. Dvovijačno cDNK smo pripravili iz virusne RNK, z uporabo komercialno dosegljive opreme za sintezo cDNK (Pharmacia) po večkrat modificiranih navodilih proizvajalca. Prvo verigo cDNK smo pripravili s pomočjo sintetičnega oligodeoksiribonukleotida, 5’-AGCAAAAGCAGG-3’, SEQ.ID:30:, ki je komplementaren ohranjeni sekvenci, locirani na koncu 3’ virusne RNK za vse gene sevov A. Ta sekvenca je skupna za vse vrste RNK virusa gripe A in zato zagotavlja metodo za kloniranje kateregakoli gena virusa gripe A. Po sintezi prve in druge verige cDNK smo jih raje ekstrahirali z zmesjo fenol/kloroform in oborili z etanolom, kot delali po navodilih proizvajalca. cDNK s surovim koncem smo vključili neposredno v V1neo ali V1ns vektor, ki je bil nato izpostavljen Bglll restrikcijskem encimu, surovo zaključen z T4 DNK polimerazo in obdelan z govejo intestinalno alkalno fosfatazo.

Da smo pregledali ali je virusni gen celoten smo uporabili oligodeoksiribonukleotid, ki je bil sintetiziran tako, da je bil komplementaren 3’ koncu po končanem translacijskem odprtju določenega virusnega gena. Vzorci, ki so kazali, da vsebujejo celoten gen z ustreznim zaporedjem in velikostjo na agaroznem elektroforeznem gelu, smo preverjili še na sekvence dideoksinukleotidov na obeh stikih virusnega gena z V1neo. Sekvenca na obeh stikih za vsak kloniran gen iz tega virusa je podan spodaj v Primeru 8.

Podobno strategijo smo uporabili za kloniranje cDNK iz vsakega, zgoraj navedenega virusa, razen za B/Panama/45/90, ki nima skupne sekvence na vsakem koncu virusne RNK, uporabili smo zmes oligodeoksiribonukleotidov za pripravo sinteze prve verige cDNK. Ti iniciatorji so bili :

(1) 5’-AGCAGAAGCGGAGC-3’, SEQ.ID:31: za PB1 in PB2;

(2) 5’-AGCAGAAGCAGAGCA-3’, SEQ.ID:19: za NS in HA;

(3) 5’-AGCAGAAGCACGCAC-3’, SEQ.ID:22: za M in;

(4) 5’-AGCAGAAGCACAGCA-3’, SEQ.ID:23: za NP.

Geni, ki so bili klonirani s pomočjo PCR, smo v PCR reakcijah, uporabili neposredno raztopino cDNk s surovim koncem, kot DNK model. Iniciatorji, ki smo jih uporabili za šest genov virusa gripe pridobljenih s PCR so sledeči;

1. HA gen iz A/Georgia/03/93 vzorčni iniciator: SEQ.ID:33:

5’-GGT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC-3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.ID:34:

5’ CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G 3’

2. HA gen iz AITexas/36l9/ vzorčni iniciator: SEQ.ID:35:

5’-GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TG 3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.ID:36:

5’ CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG 3’

3. HA gen iz BIPanama/45190 vzorčni iniciator: SEQ.ID:37:

5’-GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG 3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.ID:38:

5’ CCA CAT TTA TAG ACA GAT GGA GCA AGA AAC ATT GTC 3’

4. M1 gen iz A/Beiiing/353/89 vzorčni iniciator: SEQ.ID:39:

5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC 3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.ID:40:

5’ CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC 3’

5. NP gen iz B(Panama/45/90 vzorčni iniciator: SEQ.ID:41:

5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGC 3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.ID:42:

5’ CCA CAT GGA TCC TTA ATA ATC GAG GTC ATC ATA ATC CTC 3’

6. M1 gen iz B/Panama/45/90 vzorčni iniciator: SEQ.ID:43:

5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC 3’ komplementarni vzorčni iniciator: SEQ.lD:44:

5’ CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA TTT CTT CAC AAG AGC TG 3’

Preverili smo sekvence na vseh veznih mestih vseh kloniranih genov virusa gripe, ki so nastale s pomočjo cDNK ali PCR, in jih nato ekspresirali v transfektiranih RD celicah. Ekspresijo smo spremljali z imunodifuzijo.

Konstrukta NP in M1 za seva A/H3N2 (vektroja 4 in5) sta bila pripravljena iz genov A/Beijing/353/89. Ti geni so bili izbrani, ker smo pričakovali visoko stopnjo ohranjenosti obeh, NP in M1, genov in zaradi njihove dostopnosti.

Za nadalnje delo smo izbrali sedem ekspresijskih vektorjev, ki smo jih združili v cepivo, ki je vsebovalo:

1. V1Jns-HA (A/Georgia/03/93) 6.56 Kb

2. V1Jns-HA (A/Texas/36/91) 6.56 Kb

3. V1Jns-HA (B/Panama/45/90) 6.61 Kb

4. V1Jns-NP (A/Beijing/353/89) 6.42 Kb

5. V1Jns-M1 (A/Beijing/353/89) 5.62 Kb

6. V1Jns-NP (B/Panama/45/90) 6.54 Kb

7. V1Jns-M1 (B/Panama/45/90) 5.61 Kb

Ustrezne sekvence za povezave teh genov v ekspresijskih vektorjih so navedene spodaj. Le pri majhnem številu konstruktov je bilo potrebno preveriti sekvence, da smo klonirali pravilen gene. Če jih primerjamo s podobnimi poznanimi geni lahko potrdimo, da je določen gen NP gen, HA gen, M1 gen itd. Na primer, sekvenca pri genu A/Texas HA je zelo podobna sekvenci gena HA A/Kiev/59/79, sekvenci, ki je na razpolago v GENEBANK pod številko M38353. Podobno je sekvenca za HA B/Panama zelo podobna sekvenci HA B/England/222/82, ki jo najdemo v GENEBANK pod številko M18384. Potrdimo lahko istovetnost katerekoli klonirane sekvence za določen gen humanega virusa gripe. Pri vsakem, spodaj nevedenem primeru, smo obe sekvenci na koncu 5’ in 3’ preverili, da smo se prepričali, da je prisoten celoten gen. V vsakem primeru povdarjeno tiskane ATG kažejo na začetni kodon gena virusa gripe, medtem ko povdarjene sekvenca na koncu 3’ predstavlja končni kodon:

1. V1Jns-HA (A/Georgia/03/93) 6.56 Kb sekvenca 5' ($EQ.ID:46:)

...TCA CCG TCC KA GAT C/GG TAC AAC CAT GAA GAC TAT CAT TGC TTT GAG CTA CAT TTT ATG TCT GGT TTT CGC....

sekvenca 3' (SEQ.ID:47:)

...TCA TGC TTT TTG CK TGT GK GK TTG CTG GGG TTC ATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTG TGC...

2. V1Jns-HA (A/Texas/36/91) 6.56 Kb sekvenca 5' (SEQ.ID:48:)

...KA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG KA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA....

sekvenca 3’ (SEQ.ID:49:}

...CTG GTG CTT KG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CK...

3. V1Jns-HA (A/Panama/45/90) 6.61 Kb sekvenca 5’ (SEQ.ID:50:)

...CCT TAG ATC/ GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA AK GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG....

sekvenca 3' (SEQ.ID:51:)

...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATC TGT CTA TAA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT....

4. V1Jns-NP (A/Beijing/353/89) 6.42 Kb sekvenca 5' (SEQ.ID:52:)

...GTC CK AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG AAT GCA ACT...

sekvenca 3’ (SEQ.ID:53:)

...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...

5. V1Jns-M1 (A/Beijing/353/89) 5.62 Kb sekvenca 5’ (SEQ.ID:54:)

...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...

sekvenca 3’ iSEO.ID:55:l

GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT GAT CTT CTT GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGA ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCT ATG TGG/ GAT CTG CTG TGC CTT....

6. V1Jns-NP (B/Panama/45/90) 6.54 Kb sekvenca 5’ (SEQ.ID:56:)

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT...

sekvenca 3' (SEQ.ID:57:)

...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TIT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...

7. V1Jns-M1 (B/Panama/45/90) 5.61 Kb sekvenca 5’ (SEO.ID:58:)

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG ITT GGA GAC ACA ATT GCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGC AAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA....

sekvenca 3' (SEQJD:59:)

... AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAA GGA ΑΤΓ GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGC TCT ATG GGA AAT TCA GCT CK GTG AAG AAA TAC CTA TAA G/GA TCT GCT GTG...

Primer 6

EKSPRESIJSKl VEKTOR V1J, SEQJD:10:

Naš namen pri pripravi V1J je bil, odstraniti promotor in transkripcijske končne elemente iz našega vektorja V1 z namenom, da jih namestimo v bolj določeno zvezo, da bi ustvarili bolj zgoščen vektor in da bi izboljšali izkoristek pri čiščenju plazmida.

V1J je derivat vektorja V1 (glej Primer 1) in komercialno dosegljivega plazmida pUC18. V1 smo, s pomočjo restrikcijskih encimov Sspl in EcoRI, cepili v dva fragmenta DNK. Manjši fragment, ki je obsegal transkripcijska terminatorska elementa CMVintA in goveji rastni hormon (BGH), ki kontrolirata ekspresijo heterolognih genov (SEQ.ID:11:) smo očistili s agaroznim elektroforetskim gelom. Konci DNK fragmentov so bili cepljeni s pomočjo encima T4 DNK polimeraze, da smo pospešili vezavo na drug fragment DNK s topim koncem.

pUC18 smo izbrali zato, da smo zagotovili ogrodjeekspresijskega vektorja. Znano je, da z njegovo pomočjo izdelamo plazmide z visokim izkoristkom, ki imajo poznane sekvence in funkcijo, in je zelo majhen.

Temu vektorju smo odstranili celoten /ac operon, ki za naše namene nepotreben in bi lahko zmanjšal količino plazmida in ekspresijo heterolognega gena z delno cepitvijo z restrikcijskim encimom Haell. Preostali del plazmida smo čistili z agaroznim elektroforetskim gelom, združili z T4 DNK polimerazo, obdelovali z govejo intestinalno alkalno fosfatazo in povezali v zgoraj opisani CMVintA/BGH element. Dobljeni plazmid je izkazoval obe možni usmerjenosti promotorskih elememtov v pUC ogrodju. Eden od teh plazmidov je omogočal nastajanje večje količine DNK v E. coli in smo ga poimenovali V1J (SEQ.ID:1Q.j. Zgradbo vektorja smo preverili z analizo sekvence vezavnih področij in in kasneje pokazali, da smo dobili primerljivo ali višjo ekspresijo heterolognih genov v primerjavi z V1.

Primer 7

KONSTRUKTI GENA VIRUSA GRIPE V EKSPRESIJSKEM VEKTORJU

VU

Veliko genov seva A/PR/8/34 virusa gripe je bilo kloniranih v ekspresijski vektor V1J, ki, kot je opisano v Primeru 4, dvigne ekspresijo na tako visok nivo kot vektor V1. Sekvenca gena PR8 je poznana in na voljo v bazi podatkov GENBANK. Za vsak klonirani, spodaj opisani gen, smo velikost kloniranega fragmenta preverili s sejočim gelom in zagotovili tudi pristopno številko za GENBANK, s katerimi smo preverili delne sekvence. Metoda, s katero smo gene pridobili iz virusnih sevov, na primer virusi naloženi na ATCC (A/PR/8/34 je ATCC VR-95; na ATCC so naloženi tudi številni drugi sevi) je opisana v Primeru 5.

A Subkloniranie genov PR8 v V1J:

1. NP gen

NP gen smo subklonirali iz pAPR502 [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129-138]. Fragment pAPR501 smo odcepili s EcoRI in nato čistili s pomočjo gela ter obdelali s T4 DNK polimerazo. Fragment s surovim koncem smo vključili v V1J, cepili z Bgl II in ponovno obdelali s T4 DNK polimerazo. Klonirani fragment je bil dolg 1.6 kilobaz.

2. NS

NS gen smo subklonirali iz pAPR801 [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129-138]. Fragment pAPR801 smo odcepili s EcoRI in nato čistili s pomočjo gela ter obdelali s T4 DNK polimerazo. Fragment s surovim koncem smo vključili v V1J, cepili z Bgl II in ponovno obdelali s T4 DNK polimerazo. Klonirani fragment je bil dolg 0.9 kilobaz (celotno NS kodno področje vključuje NS1 in NS2).

3. HA

HA gen smo subklonirali iz pJZ102 [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129138]. Fragment pJZ102 smo odcepili s Hind III in nato čistili s pomočjo gela ter obdelali s T4 DNK polimerazo. Fragment s surovim koncem smo vključili v V1J, cepili z Bgl II in ponovno obdelali s T4 DNK polimerazo. Klonirani fragment je bil dolg 1.75 kilobaz.

4. PB1

PB1 gen smo subklonirali iz pAPR502 (konec 5’ in 3’ stik gena z vektorjem smo preverili sekvenco, da smo se prepričali o njihovi istovetnosti) [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129-138]. Fragment pGemPB1 smo odcepili s Hind lil in nato čistili s pomočjo gela ter obdelali s T4 DNK polimerazo. Fragment s surovim koncem smo vključili v V1J, cepili z Bgl II in ponovno obdelali s T4 DNK polimerazo. Klonirani fragment je bil dolg 2.3 kilobaz.

5. PB2

PB2 gen smo subklonirali iz pGem1-PB2 (konec 5’ in 3’ stik genov z vektorjem smo preverili sekvenco, da smo se prepričali o njihovi istovetnosti) [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129-138]. Fragment pGemPB2 smo odcepili s BamH I in nato čistili s pomočjo gela. Lepljivi konec fragmetna smo vključili v V1J in cepili z Bgl II. Klonirani fragment je bil dolg 2.3 kilobaz.

6. IVI1

Gen M1 smo pridobili s PCR iz plazmida p8901 MITE. Sekvenca M v tem plazmidu je bila narejena s PCR iz pAPR701 [J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman in M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ur. W.G. Laver, Elsevier, Amsterdam, str. 129-138] pri tem pa je bil uporabljem oligomer 5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC-3’, SEQ.ID:3:, kot kalupni iniciator in oligomer 5’-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC-3’, SEQ.ID:4: kot komplementarni kalupni iniciator. PCR fragment smo gelsko čistili, cepili z Bgl II in povezali v V1J, ki smo ga cepili z Bgl II. Klonirani fragment je bil dolg 0.7 kilobaze. Amino konec M1 je zapisan v kalupnem iniciatorju zgoraj, kot ATG kodon, medtem ko je zaključni kodon M1 obrnjen 'TCA kodon, ki je v smeri kalupnega iniciatorja zaključni kodon 'TGA.

B. Gen virusa gripe - V1J ekspresijski konstrukti

V vsakem primeru je prikazana stična sekvenca iz 5’ promoterskega dela (CMVintA). Sekvence smo pripravili tako, da smo spreminjali iniciator: CMVintA iniciator 5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3’, SEQ.ID:28:, ki je tvorilec sekvence s kodnim zapisom. Položaj, na katerem se nahaja stik je označen z zakom ki ne predstavlja diskonuinuitete v sekvenci. Metoda za pripravo teh konstruktov je opisana nazadnje. Vsaka opisana sekvenca predstavlja popoln, dosegljiv, ekspresiblien DNK konstrukt za oblikovane gene virusa gripe.

Vsak konstrukt smo vnesli v RD celice (ATCC CCL136), humana rabdomiosarkomska celična linija v kulturi. 48 ur po vnosu smo celice poželi, lizirali in kromatografirali (razen konstrukt V1J-PR-HA, ki smo ga pred kromatografiranjem testirali na miših in dodali specifična anti-HA protitelesa, torej je kromatografija nepotrebna saj smo ekspresijo opazili in vivo). Specifična protitelesa proti proteinom PB1, PB2 in NS smo dobili od Stephena Inglisa iz Univerze v Cambridgu, ki je uporabil očiščene proteine ekspresirane kot proteine, združene z β-galaktozidazo v poliklonalnem antiserumu. Anti-NP poliklonalni protiserum smo pripravili z imunizacijo zajcev s celim virusom A/PR/8/34. Anti-M1 protitelesa so komercialno dosegljive pri Biodesign, kot kozji protiserum prot gripi A, s kataloško številko B65245G. V vsakem primeru smo opazili proteine s pričakovano velikostjo, kar potrjuje in vitro ekspresijo zakodiranega proteina virusa gripe.

Po dogovoru je poimenovanje teh konstruktov sledeče: ime vektorjasev virusa gripe-gen. V vsakem primeru smo sekvenco preverili s pomočjo poznanih sekvenc iz GENBANK za klonirane in zaporedne gene A/PR/8/34. Biološko učinkovitost vsakega konstrukta je opisana v Primerih 2, 3 in 4:

Sekvenca stika 5’ CMVintA in gena virusa gripe A/PR/8/34:

1. V1J-PR-NP, SEQ.ID:12:, v GENBANK pod številko M38279

5’ GTC ACC GTC CK AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG TAG CMVintA NP...

ATA ATC ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG

2. V1J-PR-PB1, SEQJD:13:, v GENBANK pod številko J02151

5’ ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC CAT

CMVintA PB1...

KG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTT AAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTT CCC TTA TAC

3. V1J PR NS. SEQ.ID:14:, v GENBANK pod številko J02150

5’ GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG TGA

CMVintA NS....

CAA

AAA

CAT

AAT

GGA

TCC

AAA

CAC

TGT

GTC

AAG

CK

TCA

GGT

AGA

KG

CK

TCT

KG

GCA

TGT

CCG

CAA

ACG

AGT

TGC

AGA

CCA

AGA

ACT

AGG

TGA

T....

4. V1J-PR-HA, SEQ.ID:15:, v GENBANK pod številko J02143

5’ TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG AGC AAA AGC

CMVintA HA....

AGG GGA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA ACC TAC TGG TCC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG ACA CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA ACA ATT CAA CC....

5. V1J-PR-PB2. SEQ.ID:16:. v GENBANK pod številko J02153

5’ ITT TCT GCA GCT ACC GTC CTT AGA TC/C CGA ATT CCA GCA CMVintA PB2

AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAA TAA AAG AAC TAA GAA ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCA CCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG TGG ACC ATA TGG CCA TAA TCA AGA AGT....

6. V1J-PR-M1. SEQ.ID:17:. v GENBANK pod številko J02145

5’ GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG

CMVintA M1

GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAA GAG KG ACG GAA GA...

Kako so bili fragmenti povezani:

1. V1J-PR-NP: surov Bglll (vektor) s surovim EcoRI (NP)

2. V1J-PR-PB1: surov Bglll (vektor) s surovim hinDIII (PB1)

3. V1J-PR-NS: surov Bglll (vektor) s surovim EcoRI (NS1)

4. V1J-PR-HA: surov Bglll (vektor) s surovim HinDIII (HA)

5. V1J-PR-PB2: lepljiv Bglll (vektor) z lepljivim BamHI (PB2)

6. V1J-PR-M1: lepljiv Bglll (vektor) z lepljivim Bglll (M1)

M1 smo dobili z PCR z uporabo p8901-MITE kot kalup in iniciatorji, ki dodajo mesto Bglll na obeh koncih in se začnejo tri baze pred ATG ter končajo po zaključnem kodonu za M1 (TGA).

Primer 8

VUneo EKSPRESIJSKI VEKTOR. SEQ. ID:18:

Potrebno je bilo odstraniti gen amp^r nujen za izbor antibiotika pri bakteriji z zasidranim V1J, saj ni nujno, da v velikih fermentatorjih uporabljamo ampicilin. Gen amp^r smo iz ogrodja pUc V1J odstranili s cepitvijo s pomočjo restrikcijskih encimov Sspl in Eam1105l. Preostali plazmid smo čistili z elektroforezo na agaroznem gelu, obdelali s T4 DNK polimerazo in nato tretirali z govejo intestinalno alkalno fosfatazo. Komercialno dosegljiv kan^r gen, ki smo ga pridobili iz transposoma 903 in je bil del plazmida pUC4K, smo odstranili s pomočjo restrikcijskega encima Pstl, čistili z elektroforezno na agaroznem gelu in obdelali s T4 DNK polimerazo. Ta fragment smo vezali z ogrodjem V1J in plazmidom z kna^r genom v obeh smereh in imata zato oznaki VUneo številka 1 in 3. Vsak plazmid smo preverili z analizo s encimsko cepitvijo, preverjanje sekvence DNK na stičnih mestih, kar je pokazalo, da se tvori enaka količina plazmida in V1J. Ekspresija heterolognih genskih produktov V1J je bila primerljiva z VUneo vektorjem. Naključno smo izbrali VUneo #3 glede na VUneo (SEQ.ID;18:), ki ima kan^r gen enako usmerjen kot gen amp^r v V1J kot ekspresijski konstrukt.

Geni iz vsakega od sevov A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91 in

B/Panama/46/90 smo klonirali v vektor VUneo kot cDNK. V vsakem primeru smo stičnim sekvencam iz 5’ promoterskega področja (CMVintA) v klonirani gen, določali zaporedje z uporabo iniciatorja: CMVintA iniciator 5’- CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG - 3’, SEQ.ID:28:, ki pomaga pri tvorbi sekvence za kodno sekvenco. Ta je soseden stik sekvenci terminator/kodna sekvenca, ki je tudi prikazan. Sekvenca je nastajala po iniciatorju: BGH iniciator 5’ - GGA GTG GCA CCT TCC AGG -3’, SEQ.ID:29:, ki je pomagal pri sekvenci za nekodirano verigo. V vsakem primeru smo sekvence primerjali z znanimi sekvencami iz GENBANK za klonirane in zaporedne gene iz teh ali drugih izolantov virusa gripe. Položaj stične točke je označen z ki ne predstavlja diskontinuitete sekvence. V primeru stika VUneo-TX-HA se je sekvenčni gel stisnil in smo začetno sekvenco težko razbrali. Zato je prvih osem baz na stiku prikazanih kot N. Te nukleotide smo potrdili in identificirali. Prvi ATG, ki je v vsaki sekvenci, je translacijski začetni kodon za klonirani gen. Vsaka sekvenca predstavlja popolno, dosegljiv, ekspresibilen DNK konstrukt za oblikovani gen virusa gripe. Po dogovoru je poimenovanje teh konstruktov sledeče: ime vektorjasev virusa gripe-gen. Biološko učinkovitost vsakega konstrukta je opisana v Primerih 2, 3 in 4:

Sekvenca stika 5’ CMVintA in gena virusa gripe in stika 3’ gena gripe in BGH terminatorja ekspresijskega konstrukta pri uporabi različnih stvov virusa gripe in proteinov:

i. A/BEIJING/353/89

A V1Jneo-BJ-NP:

Promotor, SEQ.ID:20:

5’ TCA CCG TCC πΑ GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC ACT CAC

CMVintA NP...

TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT

Terminator, SEO.ID: 21:

5’ GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT/ ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...

BGH NP...

1L_AZTEXAS/36/91

A. V1Jneo-TX-HA

Promotor. SEQ.ID:24:

5’ CCT TAG ATC/ GGA AAT AAA AAC AAC CAA AAT GAA AGC AAA ACT CMVintA HA

ACT AGT CC...

Terminator, SEQ.ID:25:

5’ GCA GAT C/CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC... BGH HA...

TCA GAT...

IH. B/PANAMA/46/90

A VUrteo-PA-HA

Promotor, SEQ.ID:26: (Prvih 1080 baz te sekvence je mogoče videti na GENBANK pod številko M65171; spodaj opisana sekvenca je istovetna s poznano sekvenco; 3’ sekvenca, (SEQ.ID:27: spodaj) prej ni bila poznana).

5’ ACC GTC CTT AGA TC/C AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT ATC CAC

CMVintA HA...

AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC...

Terminator, SEQ.ID:27:

5’ GGC ACA GCA GAT C/TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT AAT GGT

BGH HA...

AAC..

Primer 9

INTRADERMALNA APLIKACIJA GENOV VIRUSA GRIPE

Protokol za intradermalno aplikacijo je bil enak, kot pri intradermalnem vnosu; tri 200 μg injekcije V1-PR-NP smo aplicirali v tritedenskih intervalih. 55. dan po tretji injekciji smo vranico odvzeli za in vitro preiskušanje, jo ponovno stimulirali z nonapeptidnim nukleoproteinskim epitopom 147-155, SEQ.ID:9:. Ciljne celice (P815 celice, mišjega mastocitoma, singenične z BALB/c mišjim H-2^d) smo okužili s heterolognim virusom A/Victoria/73 in jih specifično lizirali z vraničnimi celicami kot efektorjem pri razmerju efektorzcilj med 5:1 in 40:1. Negativno kontrolo je predstavljala liza ciljnih celic, ki niso bile okužene z virusom gripe. Pozitivna kontrola je bila liza z virusom gripe okuženih ciljnih celic po dodatku vraničnih celic, ki smo jih odvzeli miši, ki smo jim trakrat vbrizgali 130 μg V1-Pr-NP in so preživele okužbo z živim sevom A/HK/68 virusa gripe.

Rezultat: Po intradermalni aplikaciji vraničnih celic smo pri miših opazili specifična lizo pri vseh razmerjih efektor:cilj. Medtem, ki pri uporabi vraničnih celic kot efektorskih celic, neokuženih miši ali miši, ki smo jim aplicirali vektor V1 brez PR-NP gena, do specifične liže ni prišlo. Specifična liza, po intradermalni aplikaciji, je bila primerljiva v vseh razmerjih efektor:cilj z rezultati dobljenimi po intramuskularni aplikaciji. Merili smo tudi titer virusa v pljučih po intradermalni ali intramuskularni aplikaciji. Rezultat pri skupinah s petimi mišmi, ki so trikrat prejele 200 μg injekcijo v tritedenskih intervalih in bile tri tedne po zadnjem injiciranju okužene, so sledeči:

Cepivo	Način aplikacije Pljučni titer pri miših* 5. dan 7.dan
V1-PR-NP	intradermalno	5.2 ± 0.2	4.1 ± 1.0**
V1	intrdermalno	5.9 ± 1.0	6.6 ± 0.3
V1-PR-NP	intramuskularno	4.6 ± 0.4	4.5 ± 1.1**
nič	—	6.2 ± 0.3	5.9 ± 0.3

* povprečni log totra ± SEM ** ena miš ni imela nobenega virusa

Nazadnje, odstotek preživelih miši smo spremljali osemindvajset dni. 28. dan je bilo živih še 89% miši, ki so prejele V1-PR-NP i.m. in 50% miši, ki so cepivo prelele i.d. Preživala ni nobena miš, ki je prejela V1 vektor in samo 30% miši, ki niso prejele ničesar. S tem poskusom smo dokazali, da je DNK s kodnim zapisom za nukleoprotein iz seva A/PR/8/34, sposobna sprožiti tvorbo CTL, ki prepozna nukleoprotein iz heterolognega seva A/Victoria/73 in zaščitni imunski odziv proti heterolognem sevu A/HK/68.

Primer 10

CEPLJENJE PRIMATOV Z POLINUKLEOTIDOM

1. Protitelesa proti NP pri Rhesus opicah: Rhesus opicam (006 NP, 009 NP ali kontrola 101; 021) smo 1. dan na treh mestih i.m. vbrizgali 1 mg/mesto RSV-NP. Istočasno smo na tri različna mesta aplicirali tudi injekcije s po 1 mg konstruktov RSV-LUX in CMV-int-LUX za poročevalski gen je sprožil ekspresijo luciferaze. Živali smo 15. dan ponovno v vsako mesto aplicirali enako količino DNK kot prej in tudi 1 mg pD5-CAT, konstrukta za reporterski gen za ekspresijo kloramfenikol acetil transferaze. Mišično mesto, ki je vsebovalo reporterske gene, smo izpostavili biopsiji in testirali na aktivnost reporterskega gena. Serum smo zbirali 3., 5., 9., 11., 13. in 15. teden po prvem vnosu. Prvi pozitivni vzorec, v katerem smo našli anti-NP protitelesa, je bil 11. teden, pozitivne vzorce smo nabrali tudi 13. in 15. teden. Anti-NP protitelesa smo določevali z ELISA testom. Rezultati so prikazani na sliki 9.

2. Hemaglutininska inhibirajoča (HI) protitelesa pri Rhesus opicah: 1. dan smo opicam i.m. injicirali V1J-PR-HA. Dve živali sta prejeli 1 mg, 100 μg ali 10 μg DNK v vsako stegensko mišico. Volumen vsake aplicirane injekcije je bil 0.5 ml. Živali so prvi dan pred injiciranjem krvavele. Vse živali smo ponovno cepili z DNK 15. dan in nato zbirali krvne vzorce v 2-4 tedenskih intervalih. Titri inhibicije hemaglutinacije (HI) proti A/PR/8/34 so bili pozitivni 5., 9. in 12. teden po prvi injekciji DNK V1J-PR-HA. Rezultati so podani v preglednici 10-1:

Preglednica 10-1

Titer HI protiteles pri Rhesus opicah, ki so prejele DNK V1J-PR-HA

Rhesus #	Odmerek	Titer HI protiteles v tednu # pre 3. teden 5. teden 9. teden 12. teden
88-010	1 mg	<10	<10	320	320	320
88-0200		<10	<10	<10	40	40
88-021	100 μg	<10	<10	<10	40	20
90-026		<10	<10	20	20	40
88-084	10 μg	<10	20	40	20	10
90-028		<10	<10	20	<10	<10

Primer 11

ŠTUDIJE S POLINUKLEOTIDNIM CEPIVOM NA BELIH DIHURJIH

1. Študija cepljenje s polinukleotidnim cepivom na belih dihurjih je bila izvedena z namenom, da bi določili ali lahko živali, ki jo imuniziramo z geni s kodnim zapisom za HA (površinski proteini sposobni izzvati tvorbo za določen sev specifičnih nevtralizacijskih protiteles) ali notranje proteine NP, NS1, PB1, M (domnevajo, da vzpodbudijo celično posredovan imunski odziv, ki je neodvisen od seva) dosežemo odpornost proti okužbi z virusom gripe A. Živalim smo vbrizgali DNK s kodnim zapisom za različne gene virusa gripe v našem vektorju V1J kot je prikazano:

Preglednica 11-1

Skupina	Konstrukt	Odmerek	Število neimunizi ranih živali	Okužba s H1N1	Okužba s H3N2
1	V1J-HA	1000 mg	16	8	8
2	V1J-NP	1000 mg	16	8	8
3	V1J-NP +NS1 +PB1+PB2+M	2000 mg skupaj	16	8	8
4	V1J-HA+NP +NS1+PB1 + PB2+M	2000 mg skupaj	16	8	8
5	V1J-	1000 mg	16	8	8
6	nič	nič	10	5	5
Skupaj živali			90	45	45

2. 22. in 43, dan po imunizaciji smo imuniziranim živalim odvzeli serum in z ELISA testom določali nevtralizacijska (inhibicija hemaglutinina - HI) protitelesa in protitelesa proti nukleoproteinu (NP). Živali, ki so prejele DNK, so sintetizirala protitelesa proti odgovarjajočim genom. To je prikazano na slikah 10, 11 in 16.

3. 128. dan smo izbrane imunizirane živali okužili s 1200 TKD₅₀ virusa gripe A/HK/68. Ta sev je heterologen sevu A/PR/8/34, ki je osnovni vir kodne sekvence, uporabljene za imunizacijo in torej zaščita kaže imunost, ki temelji na celično posredovanem, od seva neoidvisnem imunskem mehanizmu. Iz priložene slike 12 je razvidno, da je prišlo do statistično signifikantnega znižanja virusnega titra pri živalih imuniziranih z DNK, s kodnim zapisom za interne proteine, v primerjavi s kontrolno skupino, kar je potrditev, da imunizacija belih dihurjev s polinukleotidom sproži zaščitni imunski odziv.

4. Podobno smo preiskusili tudi okužbo s A/PR/8/34, pri kateri se je pokazala podobna zaščitna učinkovitost nevtralizacijskih protiteles, ki so se tvorili po cepljenju s polinukleotidnim cepivom.

Primer 12 PRIPRAVA V1Jns

Za sledeče integracijske študije smo k V1Jns dodali mesto Sfi I. Na mestu Κρη I, znotraj sekvence BGH, smo vektorju dodali komercialno dosegljiv povezovalec s 13. baznimi pari Sfi I (New England BioLabs). V1J smo s Κρη I linearizirali, očistili s pomočjo gela, obdelali s T4 DNK polimerazo in vezali na povezovalec Sfi I s surovim koncem. Izoliran klon smo izbrali s pomočjo restrikcijskega mapinga in preverili z določanjem sekvence povezovalca. Tako je bil oblikovan nov vektor V1Jns (slika 17). Ekspresija heterolognih genov v V1Jns (z Sfi I) je bil primerljiva z ekspresijo enakih genov v VUneo (z Κρη I).

Primer 13 IMUNOGENOST

1. HUMORALNI IMUNSKI ODZIV

Injekcija DNK s kodnim zapisom za HA, NP in M1 je pri miših, belih dihurjih ali nehumanih primatih (vključno z afriškimi zelenimi in

Rhesus opicami) sprožila humoralni imunski odziv. Izkazalo se je, da PNV, ki vsebujejo HA gene, klonirane iz sevov virusa gripe A/PR/34, B/Panama/90, A/Beijing/89, A/Texas/91, A/Hawaii/91 in A/Georgia/93 vzpodbudijo nastajanje protiteles.

a). Miši: Prititelesa proti NP in M1 smo določevali z ELISA testom v serumu miši po vbrizganju DNK. Že pri pri enkratni aplikaciji tako nizkega odmerka kot je 1 gg NP DNK (A/PR/34) (najnižji preizkušeni odmerek) se je že po dveh tednih (najzgodnejši čas testiranja) tvorila velika količina protiteles (10⁴-10⁶), katerih količina se ni znižala najmanj 6. mesecev. NP protitelesa niso nevtralizacijska in ne prispevajo k zaščiti. Vsekakor pa potrjujejo in vivo ekspresijo NP gena po aplikaciji DNK. Nasprotno pa HA protitelesa nudijo zaščitno imunost proti homolognemu sevu virusa gripe. Injekcija HA DNK, klonirane iz seva A/PR/34, je sprožila tvorbo nevtralizacijskih protiteles, ki smo jih določevali in vitro s testom inhibicije hemaglutinacije (HI). Količina HI pri miših po treh 100 gg odmerkih HA DNK je bila > 1280, določljivo količino HI smo zasledili tudi pri nekaterih živalih, ki so prejele le dva 0.1 gg odmerka. Razmerje med odmerkom in odzivom med titrom HI in odmerkom DNK, kot tudi titrom HI in številom aplikacij, je razvidno iz Preglednice 13-1:

Preglednica 13-1: Humoralni imunski odziv pri miših

doza (gg)	GMT HI
št.	odmerkov
1	2	3
HA DNK (100)	75	106	260
HA DNK (10)	37	69	86
HA DNK (1)	<10a	13	24
HA DNK (0.1)	<10b	<10a	<10a
kontrolna DNK (100)	<10b	<10b	<10b
neinjicirane		<10b

Preglednica 13-1: Samicam BALB/c miši (4-6 tednov starosti) smo vbrizgali HA DNK iz seva A/PR/34 (V1JHA) v navedenih odmerkih enkrat, dvakrat ali trikrat v tritedenskih intervalih. Negativno kontrolno skupino so predstavljale miši, ki smo jim vbrizgali kontrolno DNK z vektorjem brez vgrajenega gena (V1J) in zdrave necepljene miši. Vzorce seruma smo odvzeli sedmi teden po prvem odmerku in jim določevali prisotnost protiteles inhibicije hemaglutinacije (HI). Podatki so podani kot geometrična sredina titra HI pri n=10.

^apri nekaterih miših smo določili pozitivni titer HI bvse miši

Pri vsaki testirani miši je bila prisotnost HI protiteles v korelaciji z zaščito pri homolognem okužbenem modelu. HI protiteiesni odziv je pri miših, ki smo jim vbrizgali HA DNK (A/PR/34), ostal nespremenjen najmanj šest mesecev. HA protitelesa, ki smo jih določevali z ELISA testom, so se tvorila tudi pri miših, ki smo jim vbrizgali HA DNK iz sevov virusa gripe A/Beijing/89, B/Panama/90 in A/Texas/91.

Literaturni podatki navajajo nižjo gensko ekspresijo pri starejših miših, ki so jim vbrizgali DNK, zato smo preizkusili tudi vpliv starosti na humoralni imunski odziv na HA. Zaradi pomankanja starejših nedolžnih mišjih samic smo uporabili 10 mesecev stare miši, ki niso več primerne za nadaljevanje vrste. Primerjali smo sposobnost nastajanja HA protiteles pri ostarelih in 4-6 tednov starih miših, ki še niso imele mladičkov. Starejše miši so bile po vbrizganju 1 μg HA DNK (najnižji preiskušeni odmerek) sposobne tvoriti HA protitelesa, vendar je bil njihov titer nižji, kot pri mladih miših (Preglednica 13-11):

Preglednica 13-11: Vpliv starosti na humoralni imunski odziv

inokulum	doza (pg)	GMT	GMT
(4.-6. tednov)	(10. mesecev)
HA DNK	100	1034	110
HA DNK	10	338	68
HA DNK	1	80	20
kontrolna DNK	100	< 5a	< 5a
neinjicirane	-	< 5a	< 5a
_	-	538	36

Preglednica 13-11: Mišjim BALB/c samicam (device stare 4-6 tednov in ostarele miši stare 10. mesecev) smo inficirali A/PR/34 HA DNK (V1JHA) v navedenih odmerkih, trikrat v tritedenskih intervalih. Negativno kontrolno skupino so predstavljale miši, ki smo jim injicirali kontrolno DNK (V1 J) in zdrave miši, ki jim nismo injicirali ničesar. Za primerjavo smo druge miši okužili s subletalnimi odmerki virusa gripe A/PR/34. Vzorce seruma smo odvzeli 9. teden po prvem odmerku in določevali titer HI. Podatki so podani kot geometrična sredina HI titra pri n=15.

^apri vseh miših smo določili negativni titer HI

To ni bil rezultat samega PNV, ampak prej zmanjšane sposobnost starejših miši, da sprožijo humoralni imunski odziv na splošno, saj smo pri starejših miših opazili nižji HI odziv, kot pri mladih miših, po aplikaciji živega virusa A/PR/34. Dejstvo je, da je bila količina HI protiteles, pri z DNK cepljenih ostarelih miših nekoliko višja, kot pri ostarelih miših okuženih z virusom. Ostarele miši, ki smo jih uporabili pri teh študijah so bile približno 50% težje, kot enako stare tipične nedolžne miši, ki so jih uporabili v drugih študijah, ki so temeljile na dietah z omejevanjem vnosa kalorij pri miših, ki bi lahko imele na imunski odziv teh živali določen učinek. Zaradi teh in drugih razlogov lahko imunski odziv pri teh miših ni reprezativen. Kljub temu, pa izgleda, da starost (do najmanj 10. mesecev) signifikantno ne zniža sposobnosti polinukletidnega cepiva, da izzove humoralni imunski odziv tudi pri tako nizkih odmerkih kot je 1 μρ.

b. Beli dihurji: Humoralni imunski odzivsmo opazili pri belih dihurjih, ki smo jim vbrizgali HA DNK iz sevov virusa gripe A/PR/34, A/Beijing/89, A/Hawaii/91 in A/Georgia/93. HI protitelesa proti A/PR/34 in ELISA protitelesa proti HA drugih sevov smo določili z odgovarjajočo PNV. V serumu belih dihurjev, ki smo jim aplicirali HA DNK iz sevov A/Beijing/89, A/Hawaii/91 in A/Georgia/93 smo našli HI in nevtralizacijska protitelesa, saj so bile te živali odporne na virusno okužbo.

c. Nehumani primati: (glej tudi Primer 10 zgoraj). Rhesus opice smo dvakrat imunizirali z odmerki 10, 100 in 1000 μ9/ηο9θ HA DNK (A/PR/34). Pri živalih, ki so prejele 100 ali 1000 gg odmerke smo določili titer HI do

320 in pri eni od dveh opic, ki smo jim vbrizgali odmerek 10 μg, pa titer HI 80. Do sedaj smo serume zbirali 13. mesecev; titer HI se ni znižal od 3. do 16. mesecev (Preglednica 13-111):

Preglednica 13-111: Tvorba HI protiteles pri Rhesus opicah

doza (gg)	prej	1. mesec	2. mesec	5.5 mesec	13. mesec
2000	<10	640	320	160	80
2000	<10	40	40	20	20
200	<10	80	40	40	80
200	<10	80	80	40	20
20	<10	40	20	20	20
20	<10	<10	<10	<10	<10

Preglednica 13-111: 0. in 2. teden smo Rhesus opicam, (samcem in samicam) velikosti 4.3 do 8.8 kg, injicirali navedene odmerke A/PR/34 HA DNK (V1JHA). V navedenih časih po prvem odmerku smo odvzeli serumske vzorce in določevali HI titer. Podatki so navedeni kot HI titer za posamezno žival.

Pri afriških zelenih opicah, ki smo jim injicirali kombinacijo PNV, ki je vsebovala 100 μρ HA DNK (A/Beijing/89), smo v serumskih vzorcih, odvzetih po 4-6 tednih, določili GMT 29 (8/9 odzivajočih). To je primerljivo z obema registriranima subvirionskima cepivoma (GMT je 16, 5/6 reagirajočih), in registriranim cepivom s celotnim virusom (GMT = 36, 6/6 reagirajočih), v enakih časovnih interavlih (slika 18). Označeni učinek sekundarne vzpodbude po drugi imunizaciji smo opazili pri živalih, ki so prejele odmerek 10 μρ HA DNK (GMT =1.9 po prvem odmerku in 199 po dveh odmerkih). Pri registriranem cepivu s celim virusom smo opazili podoben učinek, vendar so bili HI titri, nastali po drugem odmerku cepiva z oslabljenim virusom, le prehodni. Podobno količino HI protiteles smo izmerili v 18. tednu pri živalih imuniziranih z 10 μρ in 100 μρ odmerkom HA DNK, v primerjavi z najboljšim registriranim cepivom (celoten virus). Ti rezultati so dokaz, da je PNV pri tvorbi nevtralizacisjkih protiteles najmanj tako učinkovit, kot cepivo z živim virusom in učinkovitejši od cepiva z oslabljenim virusom. Pri očiščenem cepivu s podenotami nismo zaznali imunogenosti pri miših; na kratko niso bile testirane na nehumanih primatih. V tej študiji je PNV sestavljal 5 valentni kokteil z DNK s kodnim zapisom za HA iz A/Beijing/89, B/Panama/90 in A/Texas/91 ter NP in M1 iz A/PR/34, z namenom, da bi ga primerjali z potencialnim cepivom. Na teh živalih smo preiskusili nastajanje humoralnega imunskega odziva proti ostalim komponentam cepiva in zasledili protitelesa proti HA iz B/Panama/90 in N P iz A/PR/34. V ločenem poskusu, kjer smo injicirali dva odmerka PCR klonirano HA DNK, so nastajala HI in nevtralizacijska protitelesa proti HA seva A/Texas/91.

2. CELIČNO POSREDOVAN IMUNSKI ODZIV

Glej Primer 3 zgoraj.

3. NASTAJANJE IMUNSKEGA ODZIVA

a. Humoralna imunost: Dogodki, ki sprožijo nastajanje humoralnega in celično posredovanega imunskega odziva po injiciranju DNK še niso bili pojasnjeni. Da spodbudimo nevtralizacijska protitelesa (npr. proti HA virusa gripe) morajo celice imeti na plazemski membrani + antigen ali ga izločiti v ekstracelularni milje. Transficirane celice morajo imeti HA s sekundarno, terciarno in kvarterno zgradbo, podobno kot pri virusu. V rosetting testu smo določili ekspresijo HA na površini RD celic (rabdomiosarkoma; po izvoru mioblast), ki so bile prehodno transficirane z HA DNK. Rdeče krvničke so se prilepile na površino HA transficirane celice in ne tudi pri lažno transficiranih celicah, kar kaže, da HA ni samo izražen na površini, ampak je obdržal tudi ustrezno konformacijo za vezavo na proteine s sialinsko kislino.

b. Celično posredovana imunost: Nastajanje celično posredovanega imunskega odziva (to je proti NP virusa gripe) zahteva proteolitično zorenje in prisotnost peptidov povezanih z MHC razred I. Narava celice z antigenom, ki sproži nastanek imunskega odziva po injiciranju DNK še ni znana. Mišične celice sintetizirajo majhno količino MHC razred I in jim ne pripisujejo sinteze kostimulatornih molekul na njihovi površini. Mišične celice torej naj ne bi bile nosilke antigena. Več dokazov namiguje, da so mišične celice vključene pri nastajanju imunskega odziva po i.m. injekciji DNK. Hiter pregled tkiv, ki so sposobne internalizacije proste plazmidne DNK, ki sproži ekspresijo proteinov in situ kaže, da veliko celičnih vrst lahko sintetizira poročevalske gene, ko plazmid injiciramo neposredno v tkivo, vendar veliko manj kot mišične celice. Popolna analiza prevzema DNK v nemišične celice po i.m. injekciji še ni bila narejena, vendar naj bi ta prevzem še veliko manj učinkovit. Drugič, ekspresijo poročevalskih genov po i.m. injekciji DNK smo opazili v skeletnih in srčnih mišičnih celicah pri številnih različnih vrstah. Tretjič, čeprav CTL odziv nastaja po injiciranju DNK po drugih poteh (i.v. in i.d.) smo najbolj zaščitni imunski odziv pri miših opazili prav po

i.m. aplikaciji DNK. Četrtič, CTL lahko in vitro prepoznajo mioblaste in miocite, lizo pa lahko pospešimo s predhodnim dodajanjem γ-interferona, ki uravnava ekspresijo MHC razred I. Nazadnje, transplantacija transfektiranih mioblastov, ki sprožijo ekspresijo NP v zdravih, singeničnih miših ima za rezultat nastajanje zaščitnega celično posredovanega imunskega odziva in vivo (slika 20). Torej je ekspresija antigenov, ki ji botrujejo mišične celice zadostna, da se sproži zaščitni imunski odziv po DNK aplikaciji. Nadalje, prevzem in ekspresija DNK v nemišičnih celicah ni pogoj za nastajanje zaščitne imunosti. S stališča polinukleotidov kot cepiva je potencialna prednost, omejen prevzem DNK v mišične celice. Prvič, miociti se diferencirajo in ne delijo. To je lahko pomembno, saj je tako možnost vgrajevanja plazmidne DNK v kromosomsko DNK manjša in vzdrževanja nenehne antigenske ekspresije, ki vodi do dolgoživega imunskega odziva. Drugič, miociti so velike, večjederne celice, ki se obnavljajo z zlivanjem mioblastov. To lahko pomaga pojasniti, zakaj injiciranje DNK vodi do proteinske ekspresije, ki potencialno lahko traja daljši čas, brez dokaza o celični liži, ki ga povzročijo CTL.

Primer 14:

ZAŠČITNE ŠTUDIJE

Imunizacija z DNK s kodnim zapisom za antigene virusa gripa zagotavlja zaščito pred umrljivostjo in boleznijo, zmanjša virulentnost pri številnih kombinacijah sevov virusa gripe, pri uporabi dveh široko uporabljenih živalskih modelov za okužbo s humanim virusom gripe (miši in beli dihurji).

1. Heteroloana (heterotipična, splošna) zaščita po imunizaciji z registriranim mrtvim cepivom ni bila zadostna, zagotovili po jo je imunizacija z DNK cepivom na živalskih modelih. Zaščito smo demonstrirali, ko smo injicirali DNK s kodnim zapisom za NP ali M1, v laboratorijske živali. Navzkrižno reaktivno celično posredovan imunski odziv (CMI), ki smo ga izzvali s temi DNK, zagotavlja zaščitni odziv.

a) Miši: BALB/c in C3H mišim smo i.m. injicirali DNK s kodnim zapisom za NP iz A/PR/34 in jim tako zaščitenim pred obolenjem in umrljivostjo (ocenjeno z znižanjem telesne teže) okužili celoten respiratorni trakt z LD₉₀ sevom A/Hong Kong/68 (H3N2), heterotipičnim sevom (H3 proti H1 za A/PR/34). Na sliki 21 je prikazano število preživelih BALB/c miši, trikrat imuniziranih z NP DNK (200 gg/odmerek) v tritedenskih intervalih in okuženih tri tedne po zadnji imunizaciji. Na sliki 22 je prikazana inhibicija izgube telesne teže po okužbi pri imuniziranih miših v primerjavi z večjo izgubo telesne teže pri miših v kontrolni skupini. Iz slike 23 je razvidno znižanje v virusni obremenitvi v pljučih 7 dni po okužbi zgornjhega dela respiratornega trakta pri miših, imuniziranih z N P DNK, v primerjavi z mišmi, ki so prejele nekodirano DNK. Miši, imunizirane z NP DNK so bile popolnoma zaščitene pred umrljivostjo, izguba telesne teže je bila manjša in manjša je bila količina virusov v pljučih, v primerjavi z mišmi v kontrolni skupini. Ugotovili smo, da je potrebna količina N P DNK, ki prepreči smrt in izgubo telesne teže < 6.25 μρ na injekcijo potem, ko smo aplicirali tri injekcije (slika 24). Ugotovili smo, da zaščita (odpornost), ki jo zagotavlja imunizacija z NP DNK, pri imuniziranih miših ostaja nespremenjena najmanj 3 mesece. Nivo odpornosti je ohranjena do 6. mesecev, rahlo pada med 3. in 6. mesecem po zadnji imunizaciji. Vendar smo s ponovnim cepljenjem z injekcijo NP DNK v 22. tednu, tri tedne pred okužbo v 25. tednu, zagotovili celovito odpornost (slika 25). Torej imunizacija miši z NP DNK omogoča dolgotrajno, sekundarno vzpodbujeno heterologno odpornost. Sposobnost vzpodbuditi spominski odziv po ponovnem cepljenju pri teh živalih nakazuje, da smo imunološki spomin inducirali z NP DNK imunizacijo.

b) Beli dihurji: beli dihurji so splošno uporabljajo kot model za okužbo s humanim virusom gripe, ker so sprejemljivi za okužbo s široko skupino humanih izolantov virusa gripe. Razmnoževanje virusa v belih dihurjih pretežno poteka v nosnicah in sapniku, in v veliko manjšem obsegu v pljučih, v nasprotju z mišmi, kjer poteka razmnoževanje virusov pretežno v pljučih. Do okužbe belih dihurjev pride po titraciji virusa v nosnem izpirku. Beli dihurji, imunizirani z NP DNK ali M1 DNK, posamezno ali v kombinaciji, iz nedavno izoliranih humanih sevov (A/Beijing/89, H3N2), kažejo signifikantno znižano količino virusov 1-6 dan po okužbi z izolanti A/Georgia/93 (H3N2) (slika 26). Ti izolanti imajo spremenjen antigen glede na A/Beijing/89 vrste seva tako, da z registrirani cepivom z A/Beijing/89 zagotovimo malo ali celo nično odpornost proti infekciji, ki jo povzroči A/Georgia/93. Beli dihurji, imunizirani z DNK s kodnim zapisom za interne proteine A/PR/34, izkazujejo signifikantno nižjo količino virusa v nosu 5. in 6. dan po okužbi s homotipičnim sevom A/PR/34 (slika 27). Znižanje količine virusa smo opazili po okužbi z A/Georgia/93 pri zgornjih in kasnejših časih odvzema vzorcev, medtem ko smo poznejše znižanje količine virusa opazili po okužbi z A/PR/34; to naj bi bila posledica različne viruieninosti dveh sevov za bele dihurje.

2. Homologno (homotipično, vrstno specifično) odpornost smo dokazali pri miših in belih dihurjih po imunizaciji z HA DNK.

a) Miši: BALB/c miši imunizirane z HA DNK (A/PR/34) smo v celoti zaščitili proti okužbi z LD₉₀ A/PR/34. Pri imuniziranih miših po okužbi nismo opazili umrljivosti (slika 28) niti več kot 5% izgubo telesne teže (slika 29), medtem ko je bila v kontrolni skupini umrljivost 90-100% in izguba telesne teže veliko večja. Pokazalo se je da tri 1 μρ injekcije HA DNK zagotavljajo celovito zaščito (slika 30).

b) Beli dihurji: Pri belih dihurjih imuniziranih z DNK s kodnim zapisom za HA iz A/PR/34 je bila količina virusa 1-6. dan po homologni okužbi veliko nižja kot pri belih dihurjih, ki smo jim aplicirali kontrolno DNK (slika 31). Podobno, smo pri belih dihurjih, ki so bili imunizirani z HA DNK iz A/Georgia/93, opazili znižano količino virusa 1. in 3-7. dan po homologni okužbi (slika 32). Pri vseh imuniziranih belih dihurjih so bila prisotna protitelesa proti ustreznim sevom (vide supra). Torej imunizacija z HA DNK omogoča homologno odpornost.

3. Kombinacija cepiv: Sposobnost HA DNK, da omogoči večjo širino odpornosti v kombinaciji z NP in M1 DNK, smo preiskusili na belih dihurjih.

a) Širina odpornosti proti sevom s spremenjenim antigenom: Sprememba antigena, do katere je prišlo med sevoma A/Bejing/89 in A/Beijing/92, je dovolj velika, da veliko ljudi, ki so bili imunizirani z registriranim cepivom, ki je vsebovalo sev A/Beijing/89, ni bilo zaščitenih proti obolenju, ki ga je povzročil variant A/Beijing/92. V severni Ameriki je epidemijo gripe povzročil izolant podoben A/Beijing/89, na primer A/Georgia/93. V severni Ameriki so izolanti antigensko podobni sevu vrste A/Beijing/92, razlikujejo le se v mestu izolacije in njihovi zgodovini razmnoževanja v tem, da so se razmnoževala na sesalskih celičnih kulturah pogosteje kot v jajcih. V smislu sekvence aminokislin v HA se A/Beijing/92 podobni sevi razlikujejo od A/Beijing/89 podobnih sevov v 11 točkovnih mutacijah (položaji 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193, 226 in 262) na področju HA1. Torej smo želeli določiti ali homotipični imunski odziv, ki ga vzpodbudi HA DNK in navzkrižno-reaktivni CMI odziv, ki ga vzpodbudita NP in M1 DNK omogočata večjo stopnjo zaščitenosti proti variantam s spremenjenim antigenom. Imunizacija belih dihurjev z registriranim cepivom, ki vsebuje sev A/Beijing/89 ali z HA DNK iz A/Beijing/89 ali njemu podobnih izolantov (A/Hawaii/91) znižajo količino virusa, po okužbi belih dihurjev z A/Georgia/93 (slika 33). Pri belih dihurjih, ki smo jih imunizirali z zmesjo PNV, ki je vsebovala NP, M1 in HA DNK, smo opazili signifikantno nižjo količno virusov, kot pri belih dihurjih imuniziranih z registriranim cepivom ali s samo HA DNK (slika 34). V primeru HA DNK iz A/Hawaii/91 združeno z NP in M1 DNK iz A/Beijing/89 nastala zaščita ni bila signifikantno različna od maksimalne zaščite, ki jo je zagotavljala homologna HA DNK iz A/Georgia/93 (slika 35). Torej združitev DNK HA, NP in M1 izboljša zaščito proti variantam s spremenjenim antigenom v primerjavi z registriranim cepivom.

b) Vpliv zgodovine razmnoževanja na antigen cepiva: Pri belih dihurjih imuniziranih s cepivom, ki vsebuje HA DNK sekvenco, ki smo jo dobili iz izolantov Združenih držav, ki so jih razmnoževali s pomočjo MDKC celic v tkivnih kulturah (A/Hawaii/91) smo, po okužbi s sevom A/Georgia/93 s spremenjenim antigenom, opazili manjšo količino virusa (p=0.021 z dvonivojno ANOVO) kot pri belih dihurjih, ki so prejeli registrirano cepivo z mrtvim virusom, kjer so sev A/Beijing/89 razmnoževali na jajcih (slika 33). V nasprotju s tem, pa pri belih dihurjih, ki smo jim aplicirali HA DNK iz A/Beijing/89, po okužbi z A/Georgia/93 nismo opazili signifikantno spremenjene količine virusa (p=0.058) v primerjavi z belimi dihurji, ki so prejeli registrirano cepivo enakim virusom. Na jajcih in sesalskih celicah rastoči sevi se razlikujejo v dveh točkovnih mutacijah na HA1 področju HA (položaja 186 in 193), oba pa sta locirana na antigenskem mestu B, bliže koncu HA monomera na mestu, ki naj bi bil pomemben za vezavo HI in nevtralizacijskih protiteles. Sposobnost nekaterih humanih izolantov virusa gripe, da se vežejo na kokošje RBC je v začetku zelo nizko, vendar se poveče pri zaporednem razmnoževanju v jajcih, kar nakazuje, da je receptorsko vezavno mesto HA izpostavljeno selekciji z razmnoževanjem v ptičjih celicah. Učinek malih sprememb v sekvenci na učinkovitost na HA temelječih cepivih proti gripi na laboratorijskih živalih, še poveča potencialno pomembnost ohranitve sekvence divjih vrst virusa pri pripravi teh cepiv.

c) Nehumani primeti: Nehumane primate običajno ne uporabljamo kot model za okužbo z virusom gripe, zaradi njihovega majhnega odziva na okužbo. Vendar smo preučevali imunogenost PNV kombiniranega cepiva pri nehumanih primatih v primerjavi z registriranim cepivom z mrtvim virusom. Količino protiteles, ki je nastala kot odgovor na kombinirano PNV cepivo, ki je vsebovalo HA in gene za interne proteine je bila najmanj enaka količini, ki nastane pri registriranem produktu, kar se tiče titra HI protiteles in trajanja odziva (vide supra). Afriške zelene opice, ki smo jih imunizirali z PNV, so se odzvale na HA PNV s spremenjenim antigenom, kar kaže, da lahko pride pri predhodno imuniziranih živalih do vrstno specifičnega odziva na PNV. Opice, ki so bile imunizirane z PNV so se odzvale tudi na kasnejše imunizacije s konvencionalnim cepivom z mrtvim virusom.

4. Zaključek: Polinukleotidna cepiva proti gripi so učinkovita na laboratorijskih živalskih modelih okuženih z gripo. Homologno zaščito lahko dosežemo z uporabo DNK vektorja s kodnim zapisom za HA, najverjetneje z imunološkim mehanizmom, ki je analogen kot pri uporabi sedanjega registriranega cepiva proti gripi, ki vsebuje HA protein. Heterologno zaščito lahko dosežemo z antigensko spremenjenimi sevi (shifted in drifted) s pomočjo DNK s kodnim zapisom za ohranjene interne proteine virusa gripe. S kombinacijo vseh pristopov pri enkratni imunizaciji dosežemo izboljšano zaščito proti antigensko spremenjenim sevom v primerjvai s sedaj uporabljenimi registriranimi cepivi na belih dihurjih.

Primer 15

PRIPRAVA VEKTORJA V1R

Da bi še izboljšali naš osnovni vektor v cepivu smo pripravili derivat VUneo, ki se imenuje V1R. Namen priprave tega vektorja ja bilo zmanjšati velikost vektorja v cepivu, to je odstraniti nepotrebne DNK sekvence, ki so še prisotne pri drugače optimizirani heterologni genski ekspresiji in visokem izkoristku plazmida, ki ga VU in VUns nudita. S pomočjo literature kot tudi poskusov smo določili, da (1) področje znotraj pUC ogrodja, ki vključuje E. coli začetek za replikacijo lahko odstranimo brez, da bi vplivali na izkoristek plazmida iz bakterije; (2) konec 3’ in odprti okvir za gen kan^r lahko odstranimo, če smo na njuno meso vložili bakterijski iniciator; in (3) lahko odstranimo približno 300 baznih parov iz 3’ polovice BGH terminatorja brez, da bi to vplivalo na njegovo regulatorno funkcijo (če sledimo originalnem Kpnl restrikcijskem encimskem mestu znotraj BGH terminatorja).

V1R smo konstruirali z uporabo PCR tako, da smo sintetizirali tri segmente DNK iz VUns, ki predstavljajo promoter CMVintA/ terminator BGH, začetek replikacije in del z zapisom za rezistenco proti kanamicinu. Vsakemu koncu segmenta smo dodali značilen restrikcijski encim za vsak segment tako, da smo uporabili PCR oligomer: Ssli in Xhol za CMVintA/BGH: EcoRV in BamHI za kan^r gen in Bell in Sall za ori^r. Ta encimska mesta smo izbrali zato, ker omogočajo neposredno vezavo vsakega DNK segmenta, ki smo ga dobili s pomočjo PCR z nadaljno izgubo vsakega mesta; EcoRV in Sspl sta zapustila DNK s topim koncem, ki sta združljivi za vezanje z BamHI in Bell zapustita topa koneca DNK, kompatibilna s presežkom kot sta tudi Sall in Xhol. Ko smo te segmente pripravili s PCR, smo vsak segment cepili z odgovarjajočim restrikcijskim encimom, kot je opisano zgoraj in nato povezali v enkratni reakcijski zmesi, v kateri so bili vsi trije DNK segmetni. 5’ konec orir smo oblikovali tako, da smo vključili T2 neodvisno končno sekvenco, ki jo normalno najdemo na tem mestu, tako da smo zagotovili končno informacijo za gen z rezistenco na kanamicin. Vezan produkt smo potrdili s cepitvijo z restrikcijskim encimom (> 8 encimov), kot tudi z določevanjem DNK sekvence na vezavnem mestu. Nastali DNK plazmid in heterologna ekspresija, ki je posledica uporabe virusnih genov znotraj V1R, naj bi bil podoben VUns. Velikost vektorja se je zmanjšala za 1346 baznih parov (VUns = 4.86 kb; V1R = 3.52 kb), glej sliko 36, SEQ.ID:45:.

PCR oligomerne sekvence, ki smo jih uporabili pri sintezi V1R (mesta restrikcijskega encima so podčrtane in določene v oklepajih sledeče sekvence);

(1) 5’- GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3’ [Sspl], SEQ.ID:60:, (2) 5’-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3’ [ XhoL], SEQ.ID:61:, (za segment CMVintA/BGH) (3) 5’-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC 3’ [EcoRV], SEQ.ID:62:, (4) 5-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC - 3’ [BamHI], SEQ.ID:63:, (segment za gen rezistence proti kanamicinu) (5) 5’- GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG - 3’ [Bell], SEQ.ID:64:, (6) 5’ - CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG - 3’ [Sall], SEQ.ID: 32:, (začetek E. coli za replikacijo)

SEZNAM SEKVENC (1) Splošne informacije (i) Vlagatelji: Donnelly, John J.

Dwarki, Varavani J.

Liu, Margaret A. Montgomery, Donna L. Parker, Suezanne E. Shiver, John W.

(ii) Naslov izuma: Zdravilni pripravek z nukleinsko kislino

(iii)	Število sekvenc: 64
(iv)	Naslov: (A)	naslovnik:	Merck & Co., Inc.
	(B)	ulica:	P.O. Box 2000
	(C)	mesto:	Rahway
	(D)	zvezna država:	New Jersey
	(E)	država:	Združene države Amerike
	(F)	ZIP:	07065

(v) Elektronski mediji:

(A) medij: disketa (B) strojna oprema: z IBM združljivi osebni računalniki (C) operacijski sistem: PC-DOS/MS-DOS (D) programska oprema: Patentln Release #1.0, verzija #1.25 (vi) Sedanji podatki o vlogah;

(A) številka vloge (B) datum vloge (C) razporeditev (vii) Podatki o predhodnih vlogah:

(A) številka vloge: US 08/032,383 (B) datum vloge: 18. marec 1993 (vii) Podatki o predhodnih vlogah:

(A) številka vloge: US 08/089.985 (B) datum vloge: 8. julij 1993 (viii) Podatki o zakonitem zastopniku:

(A) ime: Bencen, Gerard H (B) številka registracije: 35,746 (C) številka reference: 18972Υ (ix) Podatki o telekomunikacijah:

	(A) telefon: (B) telefaks:	(908) 549-3901 (908) 549-4720
(2)	Podatki o SEO.ID. No:1:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	18. baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:1:
GTGTGCACCT CAAGCTGG

(2) Podatki o SEO.ID. No:2:

(i)	Lastnosti sekvence:
(A) (B) (C) (D)	dolžina: vrsta: vijačnica: topologija:	23. baznih parov nukleinska kislina enojna linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis	sekvence:	SEO.ID. No:2:

CCCTTTGAGA ATGTTGCACA TTC (2) Podatki o SEO.ID. No:3:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	33. baznih	parov
(B)	vrsta:	nukleinska	kislina
(C)	vijačnica:	enojna
(D)	topologija:	linearna

(ii) Tip molekule: cDNK (lil) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:3:

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) Podatki o SEO.ID. No:4:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	36 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(0	vijačnica:	enojna
(D)	topologija:	linearna

(ii) Tip molekule: cDNK (iii) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ja (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:4:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC (2) Podatki o $EQ.ID. No:5:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	23. baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	enojna
(D)	topologija:	linearna
T’tp	molekule:	cDNK
Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:5:

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG (2) Podatki o SEO.ID. No:6:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	30. baznih	parov
(B)	vrsta:	nukleinska	kislina
(C)	vijačnica:	enojna
(D)	topologija:	linearna

(ii) Tip molekule: cDNK (ni) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ja (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:6:

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG 30 (2) Podatki o SEO.ID, No:7:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	39. baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	enojna
(D)	topologija:	linearna

(ii) Tip molekule: cDNK

(Hi) (iv)	Hipotetična: ne Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence: SEO.ID. No:7:
GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GCTCGCAC	39
(2)	Podatki o SEO.ID. No:8:

(i) Lastnosti sekvence:

(H)	(A) dolžina: (B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija: Tip molekule:	39. baznih parov nukleinska kislina enojna linearna cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ja
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:8:

GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC

(2)	Podatki o SEO.ID. No:9:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	9 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	peptid
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
M	Tip fragmetna:	notranji
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:9:

Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val

	1 5
(2)	Podatki o SEO.ID. No:10:
(i)	Lastnosti sekvence: (A) dolžina: 4432 baznih parov (B) vrsta: nukleinska kislina (C) vijačnica: dvojna (D) topologija: oboje
(H)	Tip molekule: cDNK
(Hi)	Hipotetična: ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence: SEO.ID. No: 10:

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGT 60

AGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGGTG 120

TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180

ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG 240

CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG 300

TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC 360

GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACfTA CGGTAAATGG 420

CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC 480

CATAGTAACG CCAATAGGGA CKTCCAnG ACGTCAATGG GTGGAGTATTTACGGTAAAC 540

TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA 600

TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC 660

TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA 720

CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA 780

CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840

CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 900

AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960

TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GAACGCGGAT 1020

TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC 1080

TTCCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCGTCATGTT 1140

ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC 1200

CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260

TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC 1320

AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACCCCT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380

CCGCAGTTTT TATTAAACT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG 1440

ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560

CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC 1620

TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1630

GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC 1740

CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGA 1800

GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT 1860

CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC 1920

CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980

ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG 2040

GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG2100

GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160

AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220

CAC TCA TAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280

TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340

GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400

TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460

CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520

TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580

AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 2640

CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700

CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760

GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 2820

AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 2880

GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 2940

CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGATA 3000

GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 3060

TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 3120

TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGIIIIIIIG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 3180

CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 3240

TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 3300

TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 3360

TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 3420

CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 3480

CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 3540

TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 3600

GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 3660

AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT 3720

ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 3780

TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA

GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA

AGATGCTTTT CTGTGACTTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG

CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT

TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG

CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT

ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA

ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC

ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA

CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT

ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TC (2) Podatki o SEO.ID. No:11:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	2196 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	dvojna
(D)	topologija:	oboje
Tip	molekule:	cDNK
Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:11:

ATTGGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CCATATCAT ATATGTACAT TTATATTGGC

TCATGTCCAA CATTACCGCC ATGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA

ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA

AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT

GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG

TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC

GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT

CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4432

120

180

240

300

360

420

480

CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC 540

ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT 600

AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA 660

AGCAGAGCTG GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTGTTTTGAC 720

GTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG 780

CGGATTCCCC GTGCCAAGAG TGACGTAAGT ACCGCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC 840

TTGGCTTCTT ATGCATGCTA TACTGTTTTT GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC 900

ATGTTATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA TTATTGACCA 960

CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTGCCACAAC 1020

TCTCTTTATT GGCTATATGC GAATACACTG TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT 1080

TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC 1140

AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATGTC GGGTACGTGT 1200

TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GAAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT 1260

GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC TAACAGTGGA GGCCAGACTT 1320

AGGCACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT CTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT 1380

GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG 1440

GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA 1500

ACTCCCGTTG CGGTGCTGK AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT 1560

GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA GACTGTTCCT TTCCATGGGT 1620

CTTTTCTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTGC CTGGCCTTCT AGTTGCGACC CATCTGTTGT 1680

TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA 1740

ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG 1800

GGTGGGGCAG CACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC1860

GGTGGGCTCT ATGGGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC GGTTCCTCCT GGGCCAGAAA 1920

GAAGCAGGCA CATCCCCTTC TCTGTGACAC ACCCTGTCCA CGCCCCTGGT TCTTAGTTCC 1980

AGCCCCACTC ATAGGACACT CATAGCTCAG GAGGGCTCCG CCTTCAATCC CACCCGCTAA 2040

AGTACTTGGA GCGGTCTCTC CCTCCCTCAT CAGCCCACCA AACCAAACCT AGCCTCCAAG 2100

AGTGGGAAGA AATTAAAGCA AGATAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA 2160

ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC 2196 (2) Podatki o SEQ.ID. No:12:

(i) Lastnosti sekvence;

(H)	(A) dolžina: (B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija: Tip molekule:	71 baznih parov nukleinska kislina enojna linearna cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SECUD. No:12:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA TAATCACTCA CTGAGTGACA 60

TCAAAATCAT G 71 (2) Podatki o SEQ.ID. No:13:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	117 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:13:

ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT TGAATGGATG TCAATCCGAC 60

CTTACTTTTC TTAAAAGTGC CAGCACAAAA TGCTATAAGC ACAACTTTCC CTTATAC 117 (2) Podatki o SECUD. No: 14:

(i)	Lastnosti sekvence:
	(A)	dolžina:	136 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No: 14:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC AAAAACATAA TGGATCCAAA 60

CACTGTGTCA AGCTTTCAGG TAGATTGCTT TCTTTGGCAT GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA 120

CCAAGAACTA GGTGAT 136 (2) Podatki o SEQID, No:15:

(I) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	152 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	dvojna
(D)	topologija:	oboje

(ii) Tip molekule: cDNK (7/7) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No: 15:

TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG AGCAAAAGCA GGGGAAAATA AAAACAACCA 60

AAATGAAGGC AAACCTACTG GTCCTGTTAA GTGCACTTGC AGCTGCAGAT GCAGACAGAA 120

TATGTATAGG CTACCATGCG AACAATTCAA CC 152 (2) Podatki o SEO.ID. No: 16:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	162 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne

(Iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No: 16:

TTTTCTGCAG TCACCGTCCT TAGATCCCGA ATTCCAGCAA AAGCAGGTCA ATTATATTCA 60

ATATGGAAAG AATAAAAGAA CTAAGAAATC TAATGTCGCA GTCTGCCACC CCGGAGATAC 120

TCACAAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT

162 (2) Podatki o SEOJD. No:17:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	122 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:17:

GTCACCGTCC TTAGATCTAC CATGAGTCTT CTAACCGAGG TCGAAACGTA CGTACTCTCT 60

ATCATCCCGT CAGGCCCCCT CAAAGCCGAG ATCGCACAGA GACTTGAAGA GTTGACGGAA 120

GA 122 (2) Podatki o SEO.ID. No:18:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	4864 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:18:

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60

CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCGGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120

TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180

ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG 240

CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG 300

TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC 360

GGGGTCAT7A GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG 420

CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC 480

CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC 540

TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA 600

TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC 660

TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TAK ACC ATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA 720

CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA 780

CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840

CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 900

AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960

TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GAACGCGGAT 1020

TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC 1080

TTCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT 1140

ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTAIT GACCATTATT GACCACTCCC 1200

CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260

TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC 1320

AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380

CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG 1440

ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560

CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC 1620

TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1680

GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAAGCTCC 1740

CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800

GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCITTCCA TGGGTCTTTT 1860

CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC 1920

CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980

ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG 2040

GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG2100

GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160

AGGCACATCC CCITCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTGTTA GTTCCAGCCC 2220

CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280

TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340

GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400

TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA ZCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460

CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520

TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580

AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 2640

CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700

CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760

GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 2820

AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 2280

GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 2940

CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 3000

GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 3060

TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 3120

TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGIHIITTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG 3180

CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 3240

TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 3300

TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 3360

TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 3420

CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCGGGGG GGGGGGGCGC TGAGGTCTGC CTCGTGAAGA 3480

AGGTGTTGCT GACTCATACC AGGCCTGAAT CGCCCCATCA TCCAGCCAGA AAGTGAGGGA 3540

GCCACGGTTG ATGAGAGCTT TGTTGTAGGT GGACCAGTTG GTGATTTTGA ACTTTTGCTT 3600

TGCCACGGAA CGGTCTGCGT TGTCGGGAAG ATGCGTGATC TGATCCTTCA ACTCAGCAAA 3660

AGTTCGATTT ATTCAACAAA GCCGCCGTCC CGTCAAGTCA GCGTAATGCT CTGCCAGTGT 3720

TACAACCAAT TAACCAATTC TGATTAGAAA AACTCATCGA GCATCAAATG AAACTGCAAT

TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA

GAAAACTCAC CGAGGCAGTT CCATAGGATG GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG

ACTCGTCCAA CATCAATACA ACCTATTAAT TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT

GAGAAATCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC GGTGAGAATG GCAAAAGCTT ATGCATTTCT

TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCATTA CGCTCGTCAT CAAAATCACT CGCATCAACC

AAACCGTTAT TCAITCGTGA TTGCGCCTGA GCGAGACGAA ATACGCGATC GCTGTTAAAA

GGACAATTAC AAACAGGAAT CGAATGCAAC CGGCGCAGGA ACACTGCCAG CGCATCAACA

ATATTTTCAC CTGAATCAGG ATATTCTTCT AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC

GCAGTGGTGA GTAACCATGC ATCATCAGGA GTACGGATAA AATGCTTGAT GGTCGGAAGA

GGCATAAATT CCGTCAGCCA GTTTAGTCTG ACCATCTCAT CTGTAACATC ATTGGCAACG

CTACCTTTGC CATGTTTCAG AAACAACTCT GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG

ATTGTCGCAC CTGATTGCCC GACATTATCG CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA

TCCATGTTGG AATTTAATCG CGGCCTCGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA

ACACCCCTTG TATTACTGTT TATGTAAGCA GACAGTTTTA TTGTTCATGA TGATATATTT

TTATCTTGTG CAATGTAACA TCAGAGATTT TGAGACACAA CGTGGCTTTC CCCCCCCCCC

CATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT

TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC

TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT

CGTC (2) Podatki o SEQ.ID. No:19:

(i) Lastnosti sekvence:

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4800

4860

4864

	(A) dolžina:	15 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne

(ix) Opis sekvence: AGCAGAAGCA GAGCA	SEO.ID. No:19:
(2)	Podatki o SEO.ID. No:20:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	119 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	dvojna
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:20:

TCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT GAGTGACATC AAAATCATGG 60

CGTCCCAAGG CACCAAACGG TCTTATGAAC AGATGGAAAC TGATGGGGAA CGCCAGATT 119 (2) Podatki o SEO.ID, No:21:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	67 baznih	parov
(B)	vrsta:	nukleinska	kislina
(C)	vijačnica:	dvojna
(D)	topologija:	oboje

(ii) Tip molekule: cDNK (iii) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ja (ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:21:

GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATATTTT TTCCITAATT 60

GTCGTAC 67 (21 Podatki o SEO.ID. No:22:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina: 15 baznih parov (B) vrsta: nukleinska kislina (C) vijačnica: enojna

	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:22:
AGCAGAAGCA CGCAC
(2)	Podatki o SEO.ID. No:23:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	15 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:23:

AGCAGAAGCA CAGCA (2) Podatki o SEO.ID. No:24:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	33 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	dvojna
(D)	topologija:	oboje
(H) Tip	molekule:	cDNK
(iii) Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:24:

CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA (2) Podatki o SEO.iD, No:25:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina: 36 baznih parov

	(B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija:	nukleinska kislina dvojna oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ja
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:25:
GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT

(2) Podatki o SEO.ID. No:2G:

(i)	Lastnosti sekvence:
	(A)	doižina:	102 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:26:

ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT TCTAATATCC ACAAAATGAA GGCAATAATT 60

GTACTACTCA TGGTAGTAAC ATCCAACGCA GATCGAATCT GC 102 (2) Podatki o SEO.ID. No:27:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	42 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	dvojna
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ja
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:27:

GGCACAGCAG ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC (2) Podatki o SEO.ID. No:28:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	23 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:28:
CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG
(2)	Podatki o SEO.ID. No:29:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	18 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ja
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:29:
GGAGTGGCAC CTTCCAGG
(2)	Podatki o SEO.ID. No:3Q:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	12 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	enojna
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:30:

AGCAAAAGCA GG (2) Podatki o SEO.ID. No:31:

(i) Lastnosti sekvence:

(H)	(A) dolžina: (B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija: Tip molekule:	14 baznih parov nukleinska kislina enojna linearna cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:31:

AGCAGAAGCG GAGC

(2)	Podatki o SEO.ID. No:32:
(i)	Lastnosti sekvence: (A) dolžina: 35 baznih parov (B) vrsta: nukleinska kislina (C) vijačnica: oboje (D) topologija: linearna
(H)	Tip molekule: cDNK
(Hi)	Hipotetična: ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence: SEO.ID. No:32:

CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTi GCTGG (2) Podatki o SEO.ID. No:33:

(i)	Lastnosti sekvence: (A) dolžina: 33 baznih parov (B) vrsta: nukleinska kislina (C) vijačnica: oboje (D) topologija: linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:33:

GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC (2) Podatki o SECUD. No:34:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	37 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SECUD. No:34:
CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG
(2)	Podatki o SECUD. No:35:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	38 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SECUD. No:35:
GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG
(2)	Podatki o SECUD. No:36:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	32 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	linearna
(Π)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SECUD. No:36:

CCACATTCAG ATGCATATTC TACACTGCAA AG (2) Podatki o SEO.ID. No:37:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina: (B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija: (ii) Tip molekule:	36 baznih parov nukleinska kislina oboje linearna cDNK ne veriga: ne
(Hi) (iv)	Hipotetična: Komplementarna
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:37:
GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG

(2) Podatki o SEO.ID. No:38:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	36 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:38:
CCACATTTAT AGACAGATGG AGCAAGAAAC ATTGTC
(2)	Podatki o SEO.ID. No:39:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	33 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	linearna
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:39:

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) Podatki o SEO.ID. No:4Q:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	36 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	oboje
(D)	topologija:	linearna

(ii) Tip molekule: cDNK (iii) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:40:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC 36 (2)_Pridatki p $EQ.ID. Nq:41:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	39 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(0	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	linearna
fn\ r/	Tip	molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:41:

GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC 39 (2) Podatki o SEO.ID. No:42:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	39 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(0)	vijačnica:	oboje
(D)	topologija:	linearna
(H) Tip	molekule:	cDNK
(iii) Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:42:

CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC (2) Podatki o SEO.ID. No:43:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina: (B) vrsta: (C) vijačnica: (D) topologija: (ii) Tip molekule:	42 baznih parov nukleinska kislina oboje linearna cDNK ne veriga: ne
(Hi) (iv)	Hipotetična: Komplementarna
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:43:
GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG

(2) Podatki o SEO.ID. No:44:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	38 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	linearna
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:44:

CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCTTCAC AAGAGCTG (21 Podatki o SEO.ID. No:45:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	3553 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:45:

GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT

GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA 120

TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG 180

GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGGCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGACG 240 'IATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA 300

CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT 360

GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC 420

TTTCCTACTT GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT 480

TGGCAGTATA TCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAC 540

CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG CACCAAAATC AACGGGACTT TCCAAAATGT 600

CGTAACAACT CCGCCCCAH GACGCAAATG GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT 660

ATAAGCAGAG CTCGTTTAGT GAACCGTCAG ATCGCCTGGA GACGCCATCC ACGCTGTTTT 720

GACCTCCATA GAAGACACCG GGACCGATCC AGCCTCCGCG GCCGGGAACG GTGCATTGGA 780

ACGCGGATTC CCCGTGCCAA GAGTGACGTA AGTACCGCCT ATAGAGTCTA TAGGCCCACC 840

CCCTTGGCTT CTTATGCATG CTATACTGTT TTTGGCTTGG GGTCTATACA CCCCCGCTTC 900

CTCATGTTAT AGGTGATGGT ATAGCTTAGC CTATAGGTGT GGGTTATTGA CCATTATTGA 960

CCACTCCCCT ATTGGTGACG ATACTTTCCA TTACTAATCC ATAACATGGC TCTTTGCCAC 1020

AACTCTCTTT ATTGGCTATA TGCCAATACA CTGTCCTTCA GAGACTGACA CGGACTCTGT 1080

ATTTTTACAG GATGGGGTCT CATTTATTAT TTACAAATTC ACATATACAA CACCACCGTC 1140

CCCAGTGCCC GCAGTTTTTA TTAAACATGC TAACGTGGGA TCTCCACGCG AATCTCGGGT 1200

ACGTGTTCCG GACATGGGCT CTTCTCCGGT AGCGGCGGAG CTTCTACATC CGAGCCCTGC 1260

TCCCATGCCT CCAGCGACTC ATGGTCGCTC GGCAGCTCCT TGCTCCTAAC AGTGGAGGCC 1320

AGACTTAGGC ACAGCACGAT GCCCACCACC ACCAGTGTGC CGCACAAGGC CGTGGCGGTA 1380

GGGTATGTGT CTGAAAATGA GCTCGGGGAG CGGGCTTGCA CCGCTGACGC ATTTGGAAGA 1440

CTTAAGGCAG CGGCAGAAGA AGATGCAGGC AGCTGAGTTG TTGTGTTCTG ATAAGAGTCA 1500

GAGGTAACTC CCGTTGCGGT GCTGTTAACG GTGGAGGGCA GTGTAGTCTG AGCAGTACTC 1560

GTTGCTGCGG CGCGCGCCAC CAGACATAAT AGCTGACAGA CTAACAGACT GTTCCTTTCC 1620

ATGGGTCTTT TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCTGCTGTG CCTTCTAGTT GCCAGCCATC 1680

TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA GGTGCCACTC CCACTGTCCT 1740

TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA ITGTCTGAGT AGGTGTCATT CTATTCTGGG 1800

GGGTGGGGTG GGGCAGCACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA GGCATGCTGG 1860

GGATGCGGTG GGCTCTATGG GTACGGCCGC AGCGGCCGTA CCCAGGTGCT GAAGAATTGA 1920

CCCGGTrCCT CGACCCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC 1980

CCTGACGAGC ACTACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC GACAGGACTA 2040

TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTG 2100

CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT TTCTCAATGC 2160

TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC 2220

GGACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCAAC 2280

CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGGCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG 2340

AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGC 2400

TGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT 2460

GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG 2520

CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGTGA 2580

TCCCGTAATG CTCTGCCAGT GTTACAACCA ATTAACCAAT TCTGATTAGA AAAACTCATC 2640

GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA 2700

AAGCCGTTTC TGTAATGAAG GAGAAAACTC ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC 2760

CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC 2820

GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA 2880

TGGCAAAAGC TTATGCATTT CTTTCCAGAC TTGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC 2940

ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT ATTCATTGGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG 3000

AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG 3060

GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTTC ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG 3120

GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT 3180

AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC 3240

ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTACCTTT GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC 3300

GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTGTCGC ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA 3360

TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT' GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT 3420

TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT 3480

TATTGTTCAT GATGATATAT TITTATCTTG TGCAATGTAA CATCAGAGAT TTTGAGACAC 3540

AACGTGGCTT TCC 3553 (2) Podatki o SEO.ID. No:46:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	72 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:46:

TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT GCTTTGAGCT ACATTTTATG

TCTGGTTTTC GC (2) Podatki o SEO.ID. No:47:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	111 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:47:

TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC 60

AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAAGA TCTATGTGGG ATCTGCTGTG C

111 <2) Podatki ο SECUD. Νο:48:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžna:	63 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:48:

TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTA GTCCTGTTAT GTGCATTTAC AGCTACATAT

GCA (2) Podatki o SECUD. No:49:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	102 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	dvojna
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

(iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SECUD. No:49:

CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG

CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT CTGCTGTGCC π

102 (2) Podatki o SECUD. No:50:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžna:	108 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:50:

CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGTAGT AACATCCAAC 60

GCAGATCGAA TCTGCACTGG GATAACATCT TCAAACTCAC CTCATGTG 108 (2) Podatki o SEO.ID. No:51:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	102 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:51:

TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTTT ATTGTTTATA TGGTCTCCAG AGACAATGTT

TCTTGCTCCA TCTGTCTATA AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT

102 (2) Podatki o SEO.ID. No:52:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	84 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:52:

GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT CTTATGAACA GATGGAAACT 60

GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT 84 (2) Podatki o SEQ.ID. No:53:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina: 3108 baznih parov

(B) vrsta:	nukleinska kislina
(H)	(C) vijačnica: (D) topologija: Tip molekule:	oboje oboje cDNK
(N)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEQ.ID. No:53:

GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA GTAATGAAGG ATCTTATTTC

TTCGGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT (2) Podatki o SEQJD. No:54:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	132 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:54:

CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG AAACGTATGT TCTCTCTATC

GTTCCATCAG GCCCCCTCAA AGCCGAAATC GCGCAGAGAC TTGAAGATGT CTTTGCTGGG

AAAAACACAG AT

108

120

132 (2) Podatki o SEO.ID. No:55:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	129 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne

100 (ίχ) Opis sekvence: SEO.ID. No:55:

GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGATGATC TTCTTGAAAA TTTGCAGACC 60

TATCAGAAAC GAATGGGGGT GCAGATGCAA CGGTTCAAGT GAAGATCTAT GTGGGATCTG 120

CTGTGCCTT 129 (2) Podatki o SEO.ID. No:56:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	81 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:56:

CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA ACACTGGGAC AAUGACAAA 60

ACACCGGAAG AAATAACITC T 81 (2) Podatki o SEO.ID. No:57:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	96 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:57:

GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT TTGGGAGGGA CACAGCAGAG 60

GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG

101 (2} Podatki o SEO.ID. No:58:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	96 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:58:

CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT ACCTGCTTTC ATTGACAGAA 60

GATGGAGAAG GCAAAGCAGA ACTAGCAGAA AAATTA 96 (2) Podatki o SEQ.ID. No:59:

(i) Lastnosti sekvence:

(A) dolžina:	123 baznih parov
(B) vrsta:	nukleinska kislina
(C) vijačnica:	oboje
(D) topologija:	oboje
(ii) Tip molekule:	cDNK
(iii) Hipotetična:	ne
(iv) Komplementarna	veriga: ne
(ix) Opis sekvence:	SEO.ID. No:59:
AGATCTCTTG GGGCAAGTCA	AGAGAATGGG GAAGGAATTG CAAAGGATGT GATGGAAGTG
CTAAAGCAGA GCTCTATGGG GTG	AAATTCAGCT CTTGTGAAGA AATACCTATA AGGATCTGCT

(2)	Podatki o SEO.ID. No:60:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A)	dolžina:	33 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
(H)	Tip	molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne

102 (iv) Komplementarna veriga: ne

(i*)	Opis sekvence:	SEQ.ID. No:60:
GGTACAAATA TTGGCTATTG	GCCATTGCAT ACG
(2)	Podatki o SEO.ID. No:61:
(i)	Lastnosti sekvence:
	(A) dolžina:	36 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:61:
CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC

(2) Podatki o SEO.ID. No:62:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A) dolžina:	38 baznih parov
	(B) vrsta:	nukleinska kislina
	(C) vijačnica:	oboje
	(D) topologija:	oboje
(H)	Tip molekule:	cDNK
(Hi)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna	veriga: ne
(ix)	Opis sekvence:	SEO.ID. No:62:

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC (2) Podatki o SEO.ID. No:63:

(i) Lastnosti sekvence:

(A)	dolžina:	37 baznih parov
(B)	vrsta:	nukleinska kislina
(C)	vijačnica:	oboje
(D)	topologija:	oboje

103 (ii) Tip molekule: cDNK (iii) Hipotetična: ne (iv) Komplementarna veriga: ne (ix) Opis sekvence: SEO.ID. No:63:

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC (2) Podatki o SEO.ID. No:&4:

(i) Lastnosti sekvence:

	(A)	dolžina:	39 baznih parov
	(B)	vrsta:	nukleinska kislina
	(C)	vijačnica:	oboje
	(D)	topologija:	oboje
	Tip	molekule:	cDNK
(iii)	Hipotetična:	ne
(iv)	Komplementarna veriga: ne

(lx) Opis sekvence: SEO.ID. No:64:

Claims (25)

1. DNK konstrukt, ki vsebuje nukleinsko kislino s kodnim zapisom za gen virusa gripe, označen s tem, da je sposoben inducirati ekspresijo antigenskega produkta gena virusa gripe, ki sproži za virus gripe specifični imunski odziv, po aplikaciji omenjenega DNK konstrukta v živalsko tkivo in vivo in po prevzemu tega DNK konstrukta v celice, ki eksprimirajo kodno zapisani gen virusa gripe.

2. DNK konstrukt, po zahtevku 1, označen s tem, da gen virusa gripe nosi kodni zapis za nukleoprotein, hemaglutinin, polimerazo, matriks ali nestrukturne genske produkte humanega virusa gripe.

3. Polinukleotidno cepivo, ki vsebuje DNK konstrukt, ki po aplikaciji v živalska tkiva in vivo vzpodbudi nevtralizacijska protitelesa proti humanemu virusu gripe, specifične citotoksične limfocite proti virusu gripe ali zaščitne imunske odzive, označeno s tem, da je ta žival vretenčar in da polinukleotidno cepivo nosi zapis za gen virusa gripe čigar ekspresija poteka po vnosu v omenjena živalska tkiva in vivo.

4. Polinukleotidno cepivo, po zahtevku 3, označeno s tem, da vsebuje DNK konstrukt izbran med enim ali več naslednjimi:

a) pnRVS-PR-NP,

b) V1-PR-NP,

c) ) V1J-PR-NP, čigar 5’ konec je SEQ.ID:12:,

d) V1J-PR-PB1, čigar 5’ konec je SEGUD:13:,

e) V1J-PR-NS, čigar 5’ konec je SEQ.ID:14:,

f) V1J-PR-HA, čigar 5’ konec je SECUD: 15:,

g) V1J-PR-PB2, čigar 5’ konec je SECUD: 16:,

h) V1J-PR-M1, čigar 5’ konec je SEQ.ID:17:,

i) V1 Jneo-BJ-NP, SEQ.ID:21:, čigar 5’ konec ίθ SEQ.ID:20: in 3’ konec je j) V1 Jneo-TX-NP, SEQ.iD:25: in čigar 5’ konec je SEQ.ID:24: in 3’ konec je k) V1Jneo-PA-HA, SEQ.ID:27:, čigar 5’ konec je SEQ.ID:26: in 3’ konec je

105

l) V1Jns-GA-HA (A/Georgia/03/93), velikost konstrukta 6.56 Kb, konec 5’ je SEQ.ID:46: in 3’ konec je SEQ.lD: 47:,

m) V1 Jns-ΤΧ ΗΑ (A/Texas/36/91), velikost konstrukta 6.56 Kb, konec 5’ je SEQ.ID:48: in 3’ konec je SEQ.ID:49:,

n) VUns-PA-HA (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.61 KB, konec 5’ je SEQ.ID:50: in 3’ konec je SEQ.ID:51:,

o) V1Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 6.42 KB, konec 5’ je SEQ.ID:52: in 3’ konec je SEQ.ID:53:,

p) V1Jns-BJ-M1 (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 5.62 KB, konec 5’ je SEQ.ID:54: in 3’ konec je’ SEQ.ID:55:,

q) VUns-PA-NP (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.54 KB, konec 5’ je SEQ.ID:56: in 3’ konec je SEQ.ID:57:,

r) V1Jns-PA-M1 (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 5.61 KB, konec 5’ je SEQ.ID:58: in 3’ konec je SEQ.ID:59:.

5. Ekspresijski vektor, označen s tem, da je V1J, SEO.ID: 10:.

6. Ekspresijski vektor, označen s tem, da je VUneo, SEO.ID: 18:.

7. DNK po zahtevku 1, označena s tem, da je za uporabo v profilaktično učinkovitih količinah pri imunizaciji za zaščito pred okužbo s humanim virusom gripe.

8. DNK po zahtevku 3, označena s tem, da je za uporabo v profilaktično učinkovitih količinah pri imunizaciji za zaščito pred okužbo s humanim virusom gripe.

9. DNK po zahtevku 4, označena s tem, da je za uporabo v profilaktično učinkovitih količinah pri imunizaciji za zaščito pred okužbo s humanim virusom gripe.

10. DNK po zahtevku 1, za uporabo v profilaktično učinkovitih količinah pri imunizaciji za zaščito pred okužbo s humanim virusom gripe, označena s tem, da je namenjena neposredni aplikaciji v tkivo in situ.

106

11. DNK po zahtevku 1, za uporabo v profilaktično učinkovitih količinah pri imunizaciji za zaščito pred okužbo s humanim virusom gripe, ki jo apliciramo neposredno v tkivo in situ, označena s tem, da je aplicirana ali kot gola DNK v fiziološko sprejemljivi raztopini brez nosilca ali kot zmes DNK in liposoma ali kot zmes z adjuvansom ali sredstvom ki pospešuje transfekcijo.

12. Gen virusa gripe

a) izoliran in vezan na regulatorno sekvenco tako, da je gen operativno vezan na kontrolno sekvenco, ki po vnosu v živo tkivo usmerja začetek transkripcije in sledečo translacijo gena in

b) vnesen v živo tkivo, označen s tem, da je za uporabo, pri indukciji imunskega odziva in vivo.

13. Gen virusa gripe po zahtevku 12, označen s tem, da je za uporabo pri sekundarno vzpodbujenem imunskem odzivu po večkratnem vnosu.

14. Gen virusa gripe po zahtevku 12, označen s tem, nosi kodni zapis za nukleoprotein, hemaglutinin, matriksni, nestruktumi ali polimerazni genski produkt humanega virusa gripe.

15. Gen virusa gripe, po zahtevku 14, označen s tem, da je gen humanega virusa gripe, ki nosi zapis za nukleoprotein, bazično polimerazol, nestruktumi proteini, hemaglutinin, matriksl, bazično polimerazo2, enega ali več naslednjih izoliranih humanih virusov gripe: A/PR/8/34, A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91, A/Georgia/03/91 in B/Panama/45/90.

16. Nukleinska kislina, za uporabo pri vzpodbudi imunskega odziva proti okužbi ali obolenju, ki ga povzročijo sevi virusa gripe, označena s tem, da nosi kodni zapis za ohranjeni epitop virusa gripe, ki je specifičen za prvi sev virusa gripe tako, da sproženi imunski odziv ščiti ne le pred okužbo ali boleznijo, ki jo povzroči prvi sev virusa gripe, ampak tudi pred okužbo ali obolenjem, ki ga povzročijo sevi, ki so drugačni od omenjenega prvega seva.

107

17. Nukleinska kislina, po kateremkoli zahtevku od 7 do 16, označena s tem, da je za uporabo pri zdravljenju človeškega organizma.

18. DNK, označena s tem, da je:

a) pnRVS-PR-NP,

b) V1-PR-NP,

c) ) V1J-PR-NP, čigar 5’ konec je SEO.ID: 12:,

d) V1J-PR-PB1, čigar 5’ konec je SEQ.!D:13:,

e) V1J-PR-NS, čigar 5’ konec je SEQ.ID:14:,

f) V1J-PR-HA, čigar 5’ konec je SEO.ID: 15:,

g) V1J-PR-PB2, čigar 5’ konec je SEO.ID: 16:,

h) V1J-PR-M1, čigar 5’ konec je SEQ.ID:17:,

i) V1Jneo-BJ-NP, čigar 5’ konec je SEQ.ID:20: in konec 3’ je SEQ.ID:21:, j) V1Jneo-TX-NP, cigar 5’ konec je SEQ.iD:24: in konec 3’ je SEQ.ID:25: in k) V1 Jneo-PA-HA, čigar 5’ konec je SEQ.ID:26: in konec 3’ je

SEQ.ID:27:,

i) ViJris-GA-HA (A/Georgia/03/93), velikost konstrukta 6.56 Kb, 5’ konec je SEQ.ID:46: in 3’ konec je SEO.ID: 47:,

m) V1Jns-TX-HA (A/Texas/36/91), velikost konstrukta 6.56 Kb, 5’ konec je SEQ.ID:48: in 3’ konec je SEQ.ID:49:,

n) V1Jns-PA-HA (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.61 KB, 5’ konec je SEQ.ID:50: in 3’ konec je SEQ.ID:51:,

o) V1Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 6.42 KB, 5’ konec je SEQ.ID:52: in 3’ konec je SEQ.ID:53:,

p) V1Jns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 5.62 KB, 5’ konec je SEQ.ID:54: in 3’ konec je SEQ.ID:55:,

q) V1Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.54 KB, 5’ konec je SEQ.ID:56: in 3’ konec je SEQ.ID:57:,

r) V1Jns-PA-M1 (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 5.61 KB, 5 konec’ je SEQ.ID:58: in 3’ konec je SEQ.ID:59:.

19. Sestavek konstruktov nukleinske kisline, označen s tem, da nosi zapis za gene virusa gripe obeh A in B tipa humanih virusov gripe.

108

20. Sestavek, po zahtevku 19, označen s tem, da vsebuje konstrukte nukleinske kisline s kodnim zapisom za hemaglutininski gen najmanj treh sevov virusa gripe, nukleoproteinski gen najmanj dveh sevov virusa gripe in gen proteina matriksa najmanj dveh sevov virusa gripe.

21. Sestavek, po zahtevku 19, označen s tem, da omenjene gene virusa gripe dobimo iz virusov gripe H1N1, H2N2, H3N3 in B sevov virusa gripe.

22. Sestavek, po zahtevku 19, označen s tem, da vsebuje:

a) V1Jns-GA-HA (A/Georgia/03/93), velikost konstrukta 6.56 Kb, 5’ konec je SEQ.ID:46: in 3’ konec SEO.ID: 47:,

b) VUns-ΤΧΉΑ (A/Texas/36/91), velikost konstrukta 6.56 Kb, 5’ konec je SEQ.ID:46: in 3’ konec je SEQ.ID:49:,

c) VUns-PA-HA (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.61 KB, 5’ konec je SEQ.ID:50: in 3’ konec je SEQ.ID:51:,

d) V1Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 6.42 KB, 5’ konec je SEQ.ID:52: in 3’ konec je SEQ.ID:53:,

e) VUns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), velikost konstrukta 5.62 KB, 5’ konec je SEQ.ID:54: 3’ konec je SEQ.ID:55:,

f) VUns-PA-NP (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 6.54 KB, 5’ konec je SEQ.ID:56: in 3’ konec je SEQ.ID:57:,

g) V1Jns-PA-M1 (B/Panama/45/90), velikost konstrukta 5.61 KB, 5’ konec je SEQ.ID:58: in 3’ konec je SEQ.iD:59:.

23. Ekspresijski vektor, označen s tem, da je VUns.

24. Ekspresijski vektor označen s tem, da je V1JR, SEQ.ID:45:.

25. Uporaba izoliranega gena humanega virusa gripe, operativno povezanega z eno ali več kontrolnih sekvenc za vgradnjo v cepivo, za uporabo pri imunizaciji proti okužbi s humanim virusom gripe.