RO117710B1 - Construct adn si compozitie imunogena cu acesta - Google Patents
Construct adn si compozitie imunogena cu acesta Download PDFInfo
- Publication number
- RO117710B1 RO117710B1 RO95-01622A RO9501622A RO117710B1 RO 117710 B1 RO117710 B1 RO 117710B1 RO 9501622 A RO9501622 A RO 9501622A RO 117710 B1 RO117710 B1 RO 117710B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- dna
- mice
- influenza
- sequence
- gene
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 53
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 47
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 190
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 105
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 88
- 241000845082 Panama Species 0.000 claims description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 3
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 claims description 2
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 34
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 186
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 78
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 75
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 72
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 72
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 69
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 69
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 64
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 64
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 61
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 55
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 49
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 48
- 230000004044 response Effects 0.000 description 46
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 41
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 29
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 28
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 238000009954 braiding Methods 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 23
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 21
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 14
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 13
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 102100037516 Protein polybromo-1 Human genes 0.000 description 12
- 101710085035 RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 12
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 12
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 11
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 11
- 101710102873 Polymerase basic protein 2 Proteins 0.000 description 11
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 11
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 11
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 11
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 8
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 7
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 6
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 6
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 6
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 6
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 6
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 6
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 6
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 5
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 5
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 101150109178 M1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 238000011735 C3H mouse Methods 0.000 description 2
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 229940033326 influenza DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150002210 34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150005896 59 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150067230 79 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001504544 Cercopithecus mona Species 0.000 description 1
- 241001185363 Chlamydiae Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane-1,2-diaminetetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1CCCCC1N(CC(O)=O)CC(O)=O FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 101710195101 Flagellar filament outer layer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 240000004670 Glycyrrhiza echinata Species 0.000 description 1
- 235000001453 Glycyrrhiza echinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000006200 Glycyrrhiza glabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000017382 Glycyrrhiza lepidota Nutrition 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N Leu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XBBKIIGCUMBKCO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 101150046652 M2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150095629 NS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103639 PB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150030427 PB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001303601 Rosacea Species 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229940038444 antibody-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- -1 basic polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N bromoethane Chemical compound CCBr RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000021158 dinner Nutrition 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 229940010454 licorice Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000020442 loss of weight Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000005541 medical transmission Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000002794 monomerizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150074154 pe gene Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000172 trivalent influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Inventia se refera la un construct ADN, capabil sa induca un raspuns imun fata de virusul Influenza si la o compozitie imunogena, ce contine acest construct ADN, in vederea prevenirii infectarii cu virusul Influenza.
Description
Invenția se referă la un construct ADN capabil să inducă un răspuns imun față de virusul influenza utilizat ca vaccin împotriva acestui virus și la o compoziție imunogenă pe baza acesteia.
Gripa este o boală acută febrilă provocată prin infectarea tractului respirator cu virusul influenza A sau B. Izbucnirile gripei se întâlnesc pretutindeni în lume, aproape în fiecare an în perioadele epidemice sau pandemice. Gripa poate produce simptome sistemice semnificative, boală severă (precum, pneumonia virală), care necesită spitalizare sau pneumonia bacteriană secundară. Recentele epidemii din SUA au fost considerate a avea ca urmare, peste 10000 (până la 40000) cecese pe an și 5000 -10000 în anii lipsiți de epidemii. Cea mai bună strategie pentru prevedea morbidității și mortalității asociate cu cripa este vaccinarea. Vaccinurile curente autorizate sunt derivate de la un virus crescut în ouă și apoi inactivat și includ trei tulpini virale (2 Tulpini A și o tulpină B). Sunt accesibile 3 tulpini de vaccin: virus integral, subviron și antigen de suprafață purificat. Numai ultimele două sunt folosite la copii din cauza răspunsurilo' febrile crescute cu vaccinuri virus integral. Copii sub vârsta de 9 ani necesită 2 imunizări, r timp ce adulții necesită o singură injectare. Totuși, s-a sugerat (vezi, Medical Letter 32: 59=90, sept. 17, 1993) că pacienții vaccinați în toamnă devreme pot să beneficieze de o a ac_a doză de iarnă sau primăvară devreme cazat pe observațiile că la unii pacienți în vârstă rjurile de anticorp după vaccinare pot să scadă spre niveluri mai puțin protectoare în par_ luni sau chiar mai repede. Aceste vaccinuri se reformulează în fiecare an anticipâ.ncj-se ce tulpini virale revente vor circula clinic și evaluându-se care tulpină nouă virulercă este de așteptat să fie predominantă în sezonul de gripare care urmează.
Revaccinarea este recomandată anua'
A. Limitele vaccinurilor autoriza.e sunt:
1. Variația antigenică, în specia, la tulpinile A ale virusului influenza, are ca urmare virusuri care nu sunt neutralizate prin anticorpii generați printr-un vaccin anterior (sau infecție anterioară). Noi tulpini apar prin mutați punctuale (derivare antigenică) și prin rearanjarea (derivare antigenică) genelor care codifică glicoproteinele de suprafață (hemoglutmma (HA) și neuraminidaza), în timp ce proteinele interne sunt mai strict conservate printre tulpinile derivate și deviate.Imunizarea provoacă imunitate “homoloagă” cu specificitate de tulpină mediată de anticorp și cu imunitate '’beteroloagă” comună grupului, imunitate bazată pe mediere celulară.
2. Chiar dacă tulpinile virusului influenza din circulație nu sunt derivate sau deviate de la un an la următorul, imunizarea trebuie să fie făcută în fiecare an datorită scăderi litrului de anticorp. Deși, anticorpii care inhibă hemaglutinarea (HI) și cei neutralizanți sunt raportați de către unii ca persistenți, timp de câteva luni ale anului cu o scădere graduală în continuare, Comitetul de Avizare al Procedurilor de Imunizare citează scăderea titlurilor de anticorp în anul care urmează imunizării ca motiv pentru imunizare anuală, chiar, când nu a existat o derivare sau deviere importantă. (Anticorpii HI inhibă capacitatea virusului influenza de a aglutina eritrocitele. Ca și anticorpii de neutralizare, ei sunt orientați inițial, împotriva antigenului HA. Testele de inhibare sunt mai ușoare și mai puțin costisitoare de realizat, decât cele de neutralizare și astfel, sunt folosite adesea drept mijloace pentru testarea capacității anticorpilor produși de una dintre tulpinile influenza de a reacționa la o tulpină diferită. Așa cum s-a menționat mai sus, Medical Letter sugerează că anumiți indivizi mai în vârstă, cu risc crescut, ar putea fi vaccinați de două ori într-un sezon datorită vieții scurte a titrurilor de anticorp de protecție.
3. Eficacitatea vaccinului este suboptimală. Dezvoltarea vaccinului sezonului următor pe baza presupunerilor asupra tulpinilor care urmează să intre în circulație (pe baza probelor de veghe din ASIA) este inexactă și poate avea ca urmare o potrivire redusă între tulpinile
RO 117710 Β1 folosite pentru vaccin și cele care circulă în prezent. Mai mult decât atât așa cum s-a 50 întâmplat în timpul sezonului de gripă 1992 - 1993, o tulpină nouă H3N2 (A/Beijing/92) a devenit aparent clinic în timpul fazei mai târzii a sezonului de gripă. Aceasta a ânctiat o schimbare în compoziția vaccinului 1993-1994, datorită inter-reactivității scăzute cu anticorpul
A/Beijing/92, indus prin tulpina H3N2 mai timpurie (A/Beijing/89) datorită devierii antigenice.
Cu toate acestea, datorită timpului lung necesar pentru a produce și formula vaccinul auto- 55 rizat curent, noua tulpină de vaccin nu s-a putut introduce în sezonul 1992 -1993 în ciuda evidenței privind protecția scăzută de la vaccinul existent și a virulenței crescute a noii tulpini H3N2 aflată în circulație.
Chiar când, între vaccin și tulpinile în circulație există o potrivire, vaccinul autorizat previne boala în numai circa 70% din copiii sănătoși și adulții tineri și în 30...40 % dintre 60 adulții debili mai în vârstă. Astfel, pentru a indica eficacitatea vaccinului se folosesc alte criterii când tulpinile de vaccin corespund tulpinilor în circulație. Aceste criterii includ prevenirea bolii severe și a complicațiilor secundare, care se reflectă prin prevenirea spitalizării (70 % pentru bătrânii care locuiesc acasă față de 50...60 % pentru bătrânii care locuiesc în case de îngrijire) și prevenirea decesului (80% pentru rezidenții caselor de îngrijire). Un alt 65 avantaj al imunizării se consideră imunitatea puternică pentru reducerea răspândirii infecției într-o casă de îngrijire.
B. Caracteristicile unui vaccin influențează universal ideal t
1. Asigurarea protecției comune de grup (heteroloagă).
Un vaccin universal va fi capabil să protejeze contra tulpinilor diferite, dintr-un subtip 70 H3N2, de exemplu, și posibil chiar subtipuri încrucișate, de exemplu, de la H1N1 la H3N2. De asemenea, aceasta va fi mediată prin limfocite T citotoxice (CTL) care recunosc antigeni din proteinele virale interne conservate, deși anticorpii orientați împotriva porțiunilor legate la membrană ar putea, de asemenea, să joace un rol.
2. Domeniul crescut al răspunsului anticorp. 75
Deoarece CTL sunt considerate a juca un rol în recuperarea din boală, un vaccin bazat numai pe un răspuns CTL este de așteptat să scurteze durata bolii (potențial până la punctul transmiterii bolii subclinice). dar el nu va putea preveni complet boala. Metoda producerii vaccinului influenza prin pasare în ouă s-a dovedit experimental ca find capabilă să selecteze subpopulațiile virale care au antigenitate HA modificată. Ca un rezultat, eficaci- 80 tatea vaccinului poate fi diminuată datorită anticorpului provocat de vaccin, acesta neputând fi complet eficient față de tulpinile predominante în circulație. în acest fel, primul ar putea genera anticorpi, care au un domeniu al răspunsului îmbunătățit în comparație cu vaccinul curent, prin aceea că, vaccinul a fost folosit A/Beijing/89 a generat anticorpi care au fost mai puțin inter-reactivi (și puțin proiectivi) față de noua tulpină A/Beijing/92, care de asemenea, 85 a fost mai virulentă. Ambele tulpini sunt H3N2, adică aparțin aceluiași subtip. în termenii secvenței aminoacide, totuși, tulpinile asemenea A/Beijing/92 diferă de tulpinile asemenea A/Beijing/89 prin numai 11 mutații punctuale (pozițiile 133, 135, 145, 156, 157.186, 190, 191, 193, 226 și 262) din regiunea HA1. Nu se cunoaște dacă, procedeul obișnuit de fabricare a influențat lipsa de interactivitate, dar este clar că o îmbunătățire in ceea ce 90 privește lărgirea domeniului de răspuns anticorp este de dorit.
3. Creșterea duratei răspunsurilor anticorp.
Din cauză că unul dintre grupurile foarte expuse morbidității și mortalității (bătrâni) datorate infecției cu virus influenza, grup la care de asemenea, titrurile de anticorp de protecție pot să scadă atât de rapid la imunizarea actuală printr-un vaccin îmbunătățit, s-ar 95 putea genera titruri de anticorpi proiectivi care să persiste mai mult.
RO 117710 Β1
C. Polinucleotide ca vaccin
Inocularea intramusculară a constructelor polinucleotidice, adică plasmidele
ADN care codifică proteine, s-a dovedit a avea ca rezultat generarea in situ. in celulele musculare, a proteinei.
Prin folosirea plasmidelor cADN care codifică proteine virale, s-au generat, atât răspunsuri anticorp cât și CTL, furnizând protecție omoloagă, cât și heteroloagă, față de provocarea ulterioară, fie cu tulpini omoloage, cât și respectiv, tulpini încrucișate. Fiecare din aceste tipuri de răspunsuri imune oferă un avantaj potențial față de strategiile de vaccinare existente. Folosirea PNV-urilor pentru generarea anticorpilor poate avea ca rezultat o durată mărită a răspunsurilor anticorp,precum și asigurarea unui antigen care poate avea, atât secvență exactă a tulpinii virale aflată clinic în circulație, precum și modificările posttranslaționale corespunzătoare și conformația proteinei native (față de o proteină recombinată). Generarea răspunsurilor CTL prin aceste mijloace oferă beneficiile protecției de tulpină încrucișată fără folosirea unui vector viu potențial patogen sau a unui virus atenuat.
Astfel, o provocare principală centru dezvoltarea vaccinurilor împotriva virusurilor precum influenza, împotriva căruia sum generați anticorpi de neutralizare, este diversitatea proteinelor învelișului viral printre diferr.e izolate sau tulpini. Deoarece, limfocitele T citotoxice sunt capabile să recunoscă epitopi ce~vați de la proteinele virale interconservare. atât la oameni, cât și la șoareci (J.W.Yewdell ș colab., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 82, 1785 (1985);
A.R.M. Townsed și colab., Cell44, 955 1986); A.J.Mc.Michael și colab., J.Gen.Virol.67, 719 (1986); J.Bastin și colaboratori., J.Exp.Med.1Q5, 1508 (1987); A.R.M. Townsend și H.Bodmer, Ann.Rev.lmmunol.7, 601 (1S89) și sunt considerate a fi importante în răspunsul imun împotriva virusurilor (Y.-L. Lin și EAAskonas, J.Exp.Med.154, 225 (1981); I.Gardner și colab., Eur. J.lmmunol. 4,68 (1974); K.L.Yap și G.L.Ada, Natura 273, 238 (1978); A.J.McMichael și colab., New Engl. J.Med.3Q9, 13 (1983); P.M. Taylor și BA Askona, Immunol 58, 417 (1986), eforturile au fost orientate spre dezvoltarea vaccinurilor CTL capabile să asigure protecție heteroloagă față de diferite tulpini virale.
CTL CD8+ omoară celule infectate viral când receptorii celulei T recunosc peptide virale asociate cu molecule MHC clasa I (R.M.Zinkernagel și P.C.Doherty, ibidem, 141,1427 (1975); R.N. Germain Nature 353, 605 (1991). Aceste peptide sunt derivate de la proteine virale sintetizate endogen, indiferent de focalizarea sau funcția proteinei în virus. Astfel, prin recunoașterea epitopilor din regiunile vvale, limfocitele T citotoxice (CTL) pot asigura protecție de tulpină încrucișată. Peptide capabile de asociere (CTL) pot asigura protecție de tulpină încrucișată. Peptide capabile de asociere cu MHC clasa I recunosc pentru CTL originea din proteinele care sunt prezente sau trec prin citoplasmă sau reticulul enooplasmic (J.W.Yewdell și R.J. Bennink, Science 244,1072 (1989); A.R.M-Townsend și colab.. Nature 340, 443 (1989); J.G.Nuchtern și colab.. ibid. 339, 223 (1989).
Ca urmare, în general, proteinele endogene care intră pe ciclul prelucrării endozomale (ca în cazul antigenilor prezentați de molecule MHC clasa II), nu sunt eficiente pentru generarea răspunsurilor CTL CD8+.
Cele mai multe eforturi de a genera răspunsuri CTL au folosit, fie replicarea vectorilor pentru a produce proteina antigen în celulă (J.R.Bennink și colab.., ibid. 311, 578 (1984); J.R.Bennink și J.W.Yewdell, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 163, 153 (1990), C.K.Stover și colab., Nature 351,456 (1991); AAIdovini și R.A. Young, Nature 351,479 (1991); RSchafer și colab., J.lmmunol. 149,53 (1992); C.S.Hahn și colab., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 89,2679 (1992), sau ele au fost concentrate pe introducerea peptidelor în citosol (F.R.Carbone și M.J.Bevan, J.Exp.Med, 169, 603 (1989); K.Deres și colab., Nature 342, 561 (1989), H.Takahashi și colab., ibid.344, 873 (1990), D.S.Collins și colab., J.lmmunol, 148, 3336 (1992); M.J. Newman și colab.., ibid.148,2357 (1992). Ambele abordări au limite care pot
RO 117710 Β1 reduce utilitatea lor ca vaccinuri. Vectorii retrovirali au restricții privind mărimea și structura polipeptidelor care pot fi exprimate ca fuziune proteinică, cu menținerea în același timp a capacității de replicare a virusului recombinat (A.D.MilIer, Curr.Top.Microbiol.lmmunolA58,
I (1992) și eficacitatea vectorilor, precum vaccinia, pentru imunizări ulterioare, poate fi compromisă prin răspunsuri imune față de vector însuși/E.L.Cooney și colab., lancet 337, 567 150 (1991). De asemenea, vectorii virali și patogeni modificați prezintă riscuri inerente care pot limita utilizarea la oameni (R.R.Redfield și colab., New Engl. J.Med.316, 673 (1987); L.Mascola și colab., Arch lntern.Med.149, 1569 (1989). Mai mult decât atât selectarea epitopilor peptidici prezentați este dependentă de structura antigenelor MHC ai unui individ și ca urmare, vaccinurile peptidice pot avea eficacitate limitată datorită diversității haplo- 155 tipurilor MHC la populații din afara speciei.
Benvenisty. N., și Reshef, L. (PNAS 83, 9551 - 9555 (1986) au arătat că poate fi exprimat ADN precipitat CaCI2 introdus în șoareci intraperitoneal, intravenos sau intramuscular. Injectarea intramusculare (i.m) la șoareci a vectorilor de expresie ADN s-a demonstrat că are ca rezultat absorbția ADN-ului de către celulele musculare și expresia 160 proteinei codificate de către ADN (JAWolff și colab., Science 247, 1465 (1990): G.Ascadi și colab., Nature 352, 815 (1991). Fiasmidele s-au dovedit a fi menținute și nu au replicat. Ulterior, s-a observat expresie persisrentă după injectare i.m. în mușchii scheletici ai șobolanilor, peștilor și primatelor și în mușchiul cardiac al șobolanilor (H.Lin și colab.. Circulation 82, 2217 (1990), R.N. Kitsis și colab. Proc.Natl.Acad.Scil USA) 88, 4138 (1991): E.Hansen 165 și colab., FEBS Lett. 290, 73 (1991). S.Jiao și colab., Hum.Gene Therapy3. 21 (1992); J.A.Wolff și colab., Human Mol.Genet. 1,363 (1992). Tehnica folosirii acizilor nucleici ca agenți terapeutici s-a raportat în WO 90/11092 (4 octombrie 1990), în care s-au folosit polinucleotide dezvelite pentru vaccinarea vertebratelor.
Pentru succesul metodei nu este necesar ca imunizarea să fie intramusculară. 170 Astfel, Tang și colab.,(Natura, 356,152-154 (1992) au arătat că introducerea microproiectilelor de aur învelite cu ADN care codifică hormonul de creștere bovin (BGH) în pielea șoarecilor are ca rezultat producerea în șoareci a anticorpilor anti-BGH.Furth și colab., (Analitical Biochemestry, 205, 365-368, (1992) a arătat că ar putea fi folosit un jet injector pentru transfectarea pielii, mușchiului, grăsimii și țesutului mamar al mamiferelor vii.Recent au fost 175 recenzate de către Friedman, T., (Science, 244,1275 -1281 (1989) diferite metode de introducere a acizilor nucleici. Vezi, de asemenea, Robinson și colab., Abstracts of papers Presented at the 1992 meeting of AIDS, Cold Spring Harbor, p.92, unde administrarea im, ip și iv a ADN-ului de influenza la păsări, s-a susținut a asigura protecție față de provocarea letală. Cu toate acestea, nu a existat rad o descrierea a genelor virusului influenza aviar care 180 s-a folosit. în plus, s-au susținut numai răspunsurile imune specifice H7, fără vreo mențiune de inducere a protecției de tulpină încrucișată.
Astfel, în WO 93/19183 este descris un produs pentru imunizare la vertebrate, care cuprinde o unitate de transcripție a ADN care cuprinde ADN ce codifică un agent terapeutic legat operativ de o regiune a promotorului. 185
Prezenta invenție înlătură dezavantajele menționate mai sus prin aceea ca. constructul ADN constă dintr-un vector de expresie selectat din grupul constând din pnRSV, VI, VIJ, VIJR, VIJns și VIJneo și VIJneo și un terminator de transcripție legat operativ la o secvență nucleotidică care codifică o proteină a virusului influenta.
Totodată, compoziția imunogenă cuprinde constructul ADN împreună cu o soluție 190 acceptabilă farmaceutic, cu lipozomi sau cu un adjuvant acceptabil, și opțional, cu agenți care facilitează transfecția.
Invenția de față prezintă următoarele avantaje: mărirea domeniului de protecție datorită răspunsurilor CTL + mărirea domeniului anticorpului și creșterea duratei de protecție.
R0117710 Β1
Abordarea PNV evită nevoia de a face selecția și propagă resortanți.așa cum se face pentru vaccinul uzual autorizat, deoarece se poate produce mai direct constructul ADN nou, dintr-un domeniu izolat clinic.
Invenția asigură vectori de expresie care codifică o proteină virală influenza ca un agent imunogen.
Invenția oferă un mijloc pentru «ducerea imunității protectoare de tulpină încrucișată fără să fie nevoie de agenți auto-replicativi sau adjuvanți. Suplimentar, imunizarea cu ADN oferă numeroase alte avantaje. în primul rând, această abordare pentru vaccinare va fi aplicabilă pentru tumori, la fel de bine ca și pentru agenți infecțioși, deoarece răspunsul CTL CD8* este important pentru ambele procese patofiziologice. (K.Tanaka și colab., Annu.Rev.lmmunol. 6,359 1988).
Deci, provocarea unui răspuns imun împotriva unei proteine cruciale pentru procesul de transformare poate fi un mijloc eficient pentru protejarea față de cancer sau pentru imunoterapie. în al doilea rând, generarea unui titru de anticorpi față de proteine exprimate după injectarea proteinei virale (NP și hemaglutinină) și ADN-ul hormonului uman de creștere (vezi, de exemplu, D-C.Tang ș; colab., Nature 256,152,1992), arată că acesta este un mijloc facil și extrem de eficient pentru producerea vaccinurilor bazate pe anticorpi, fie separat, fie în combinație cu vaccinul limfocit-T citotoxic îndreptat spre antigeni conservați.
Această facilitare a producerii și purificării constructelor ADN apare a fi favorabilă față de purificarea de proteină, ușurând generarea combinației de vaccinuri. Astfel, constructele multiple, care codifică, de exemplu, NP. HA, Ml, PBI, NSI sau oricare alte gene afe virusului gripei se pot prepara, amesteca și administra împreună. în sfârșit, deoarece expresia proteinei se menține după injectare ADN (HJLin.și colab., Circulation 82, 2217 (1990): R.N.Kitsis și colab.., Proc.Natl.Acad.Sci (USA) 88.4138, (1992); E.Hansen și colab.., FEBSLett. 290, 73 (1991), S.JiAo și colab.., Hum. Gene. Therapy3, 21, (1992); J.A. Wolff și colab... Human Mol. Genet. 1,363 (1992), persistența memoriei celulei B și T poate fi sporită (D.Gray și P.Matzinger, J.Exp.Med. 174,969 (1991): S.Oehen și colab., ibid. 176 (1992), prin aceasta producând imunitate umorală de lungă durată și imunitate mediată celular.
Așa cum rezultă de mai sus, prezenta invenție privește oricare dintre metodele cunoscute pentru introducerea acizilor nucleici în țesut viu pentru introducerea expresiei proteinelor. Invenția asigură o metodă pentru introducerea proteinelor virale în ciclul de prelucrare antigenică pentru generarea de CTL specifice virusului. Astfel, necesitatea de agenți terapeutici specifici capabili să provoace răspunsuri imune profilactice dorite față de patogenii virali, s-a realizat în această invenție pentru virusul influenza. De importanță deosebită, în această abordare terapeutică este capacitatea de inducere a răspunsurilor imune Tcelulare care pot preveni infecțiile, chiar de la tulpini virale care sunt heteroloaoe față de tulpina de la care s-a obținut gena antioen. Prin urmare, această invenție asigură constructul ADN care codifică proteine virale ale virusului influenza uman, nucleoproteine (NP), hemoglutinine (HA), neuraminidaze (NM), matrice (M), nestructurale (NS), polimeraza (PB1 și PB2-polimeraze bazice 1 și 2; PA=pofimerază acidă) sau oricare alte gene influenza care codifică produse care generează CTL specifice.
Virusul influenza are un genom de acid ribonucleic (ARN) care constă din numeroase segmente ARN. Fiecare segment ARN codifică cel puțin un produs genetic. Produsul genei NP se leagă la ARN și translocă ARN-ul viral în nucleul celulei infectate. Secvența este conservată cu numai 7% divergență în secvența aminoacidă care a apărut după o perioadă de 50 de ani. Produsele genei P (PB1, PB2. PA) sunt responsabile pentru sinteza de ARN-uri virale noi. Aceste gene sunt chiar mai strict conservate decât genele NP. HA este produsul genetic principal al anvelopei virale. El este conservat mai puțin strict decât NP. El leagă un receptor celular și prin urmare, este instrumentul de inițiere a noilor infecții influenza.
RO 117710 Β1
Răspunsul anticorpului de neutralizare este în principal orientat către acest produs genetic. Un răspuns substanțial limfocit T dtotoxic este îndreptat, de asemenea, împotriva acestei proteine. Vaccinurile uzuale împotriva virusului influenza uman încorporează trei tulpini ale virusului influenza sau proteinele lor HA. Cu toate acestea, datorită variabilității din secvența proteică a HA din diferite tulpini, vaccinul trebuie să fie constant adaptat la tulpinile care cauzează un efect patologic. Totuși. HA dacă este prezentat complet trebuie să aibă unele elemente conservate pentru generarea de CTL. Produsele genei NS1 și NS2 au funcțiunile biologice caracterizate incomplet, car pot fi semnificative în producerea răspunsurilor CTL protective. în sfârșit, produsele genei M1 și M2 care sunt ușor mai puțin conservate decât în HA, induc un răspuns CTL important. Proteina M1 este un produs genetic viral foarte abundent.
Eficacitatea protectoare a vaccinării ADN față de provocarea virală ulterioară este demonstrată prin imunizare cu plasmid ADN nereplicativ care codifică una sau mai multe din proteinele virale menționate mai sus. Acesta este avantajos, deoarece nu este implicat nici un agent infecțios, nu este necesară asamblarea particulelor virale și este permisă selecția predeterminată. Mai mult decât atât din cauza secvenței nucleoproteice și a faptului că alte produse genetice virale sunt conservate printre diverse tulpini de influenza, este posibilă protecția față de provocarea ulterioară printr-o tulpină de influenza virulentă care este omoloagă sau heteroloagă la tulpina de la care s-a obținut gena donată.
Constructul ADN capabil să fie exprimat la introducerea directă pe calea injectării sau altele de același fel, în țesuturile animale sunt terapeutice profilactice noi. Ele introduc limfocite T citotoxice (CTL) specifice pentru antigeni virali care răspund la diferite tulpini ale virusului, spre deosebire de anticorpii care sunt în general, specifici de tulpină. Generarea in vivo de astfel de CTL necesită de obicei expresia endogenă a antigenului, la fel ca în cazul infecției virale. Generarea unui antigen pentru prezentare la sistemul imunitar, fără limitări ale peptidei eliberate direct sau utilizarea vectorilor virali s-a realizat prin injectarea plasmidului ADN care codifică proteinele virusului influenza uman în mușchiul cvadriceps al șoarecilor BALB/c, acesta având ca urmare generarea de CTL virale specifice și protecție față de provocarea ulterioară cu o tulpină heteroloagă de influenza așa cum s-a măsurat prin descreșterea titrurilor virale pulmonare, inhibarea pierderii în greutate și creșterea supraviețuirii. S-a observat titrul ridicat de anticorp de neutralizare pentru hemaglutirină și anticorp pentru nucleoproteine generate în maimuțe Rhesus și descreșterea titrurilor nazale după provocare homoloagă și heteroloagă la fereți (nevăstuică).
Observații cheie în legătură cu invenția includ:
1. Demonstrarea eficacității.
Protecția heteroloagă s-a observat după imunizare cu ADN nucleoproteină (NP) așa cum s-a măsurat prin creșterea supraviețuirii, descreșterea titrurilor virale pulmonare și inhibarea pierderii în greutate la șoareci, provocați cu o tulpină de influenza diferită de sursa tulpinii pentru gena NP. în acest caz. proteinele de suprafață ale celor două tulpini au fost net diferite (H1N1 față de H3N2) și tulpina prin care s-a făcut provocarea a apărut la 34 ani după tulpina inițială. Imunizarea ferelilor cu ADN NP și ADN matrice (m1), fie separat, împreună sau în conjuncție cu ADN HA a asigurat protecție (descreșterea virusului cu rezidență nazală) împotriva provocării cu o tulpină derivată (un izolat clinic). De remarcat că, protecția prin amestecul ADN (ADN NP și M1) care codifică proteinele Beijing/89 și ADN HA care codifică, fie HA Beijing/89 sau HA Hawaii/91) a fost mai mare decât cea conferită prin vaccinul autorizat (care conține Beijing/89). Amestecul conținând ADN HA de la Hawaii/91 a apărut a fi puțin mai eficace, decât amestecul care conține ADN HA de la Beijing/89. Protecția constatată cu amestecul incluzând ADN HA omolog (Georgia/93), în timp ce amestecul cu ADN HA pentru Beijing/89 a fost diferită de protecția omoloagă, deși ea a fost încă semnificativ mai bună decât a produsului autorizat. în toate speciile testate incluzând șoareci, fereți, maimuțe Rhesus și maimuțe africane verzi s-au generat anticorpi HI.
245
250
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 117710 Β1
2. Persistentă.
f în studii care folosesc un ADN codificator al unei gene declarate, prezența ADN-ului și a proteinei de expresie a persistat cel puțin 1,5 ani (cel mai lung timp testat la șoareci: Wolff și colab. Al., Humon Mol.Genet. 1992). Astfel, dacă produsele genetice influenza sunt, de asemenea, exprimate per sistem, răspunsul imun rezultat va persista de asemenea. Anticorpii și CTL /Yankauckas și colab.., DNA & Cel! Biol., 1993), generate prin injectarea ADN influenza s-au dovedit a persista la șoareci timp de peste 1 an. Anticorpii s-au dovedit a persista în maimuțe Rhesus la fel de mult, timp de cel puțin 1 an. Durata răspunsurilor CTL și protecția heteroloagă (creșterea supraviețuirii) persistă până la 6 luni (cel mai lung timp testat, atât de departe). S-a întâlnit un ușor declin în gradul protecției heteroloage, dar protecția este puternic stabilă.
3. Domeniul de dozare.
Studiile de dozare s-au realizat la maimuțe Rhesus arătând că 100 pg ADN date de două ori au avut ca rezultat titruri bune ale anticorpului HI care au persistat până la un an sau mai mult. Generarea protecției (aeșterea supraviețuirii după provocare heteroloagă) la șoareci s-a observat cu doze scăzute la nivelul de 6 pg (dat de 3 ori) și cu o injectare unică de 200 pg, dar, în general, o creștere a numărului injectărilor (până la 3) îmbunătățește gradul de protecție. Studiile la primate au arătat că 2 injectări de 10 sau 100 pg ADN care codifică 3 hemoglutinine, NP și Ml (ultima codificând gena H3N2 Beijing/89) au avut ca urmare titruri de anticorp Ml, similare celor generate prin vaccinul autorizat. Este important de reamintit că toate animalele studiate nu au experiență față de gripă, în timp ce toată populația clinică vizată (indivizi mai în vârstă) are toată experiența față de gripă. (Reamintim că, copiii sub 9 ani au primit 2 injectări de vaccin autorizat).
Invenția asigură acizi terapeutici acizi care, atunci când sunt introduse direct într-un animal, inclusiv vertebrate, precum mamifere sau oameni, induc în animal expresia proteinelor codificate. Când proteina este una care nu se întâlnește de obicei în animal, exceptând condiții patologice, cum ar fi, proteinele asociate cu virusul influenza, de exemplu, însă fără să limiteze la nucleoproteina influenza, neuraminidază, hemaglutinină, polimerază, matrice sau proteine nestructurale, sistemul imunitar al animalului se activează pentru a produce un răspuns de protecție. Din cauză că aceste proteine exogene sunt produse de către țesuturi proprii animalelor, proteinele exprimate sunt prelucrate și prezentate prin complexJ principal de histocompatibilitate, MHC. Această recunoaștere este analoagă celei care are loc pe infecția prezentă cu organismul înrudit. Rezultatul, așa cum s-a arătat în această descriere, este inducerea răspunsurilor imune care protejează față de infecția virulentă.
Această invenție asigură acizi nucleici, care atunci când se introduc în țesuturi animale in vivo, prin injectare, inhalare sau imprimare printr-un mecanism analog, are loc expresia produsului genei virusului gripal. Astfel, de exemplu, injectarea constructului ADN al acestei invenții, în mușchiul șoarecilor, induce expresia produselor codificate de genă, în același mod, la fereți și maimuțe. La provocarea ulterioară cu virus gripal virulent folosind doze care omoară constant animalele de control, animalele injectate cu vaccinul po&iucleotidic prezintă morbiditate și mortalitate mult reduse. Astfel, această invenție descrie un vaccin util la oameni, pentru prevenirea cu virus gripal.
S-a arătat că, constructul ADN care codifică proteine virale influenza provoacă răspunsuri imune la animale. Așa cum se va descrie mai amănunțit în continuare, răspunsurile imune la animale au inclus anticorpul și generarea CTL la șoareci, generarea de anticorpi la fereți și primate și protecția față de provocarea virală la șoareci și fereți cu tulpini omoloage de influenza, derivate sau deviate. Poate că cele mai bune rezultate ale imunizării cu ADN care codifică proteine virale au fost conferirea protecției față de subtipuri virale distincte. Aceasta sugerează că, adăugarea unui component care provoacă CTL, la un
RO 117710 Β1 vaccin, ar putea servi pentru reducerea impactului variantelor noi care apar în mijlocul sezonului sau nu sunt anticipate când tulpinile de vaccin sunt alese în fiecare an pentru anul care urmează. De remarcat că, imunizarea cu vectori cADN care codifică o genă HA, NP și Ml, este posibil să protejeze mai eficient față de tulpina derivată a virusului, la fereti, decât vaccinurile autorizate. Aceasta dă o justificare pentru folosirea constructului care codifică gene interne în PNV.
într-unul din modurile preferate de realizare, produsul de vaccinat va consta din plasmide ADN separate care codifică, de exemplu, HA de la 3 tulpini clinice prevalente care reprezintă virusurile A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) și B (B/Panama/90), precum și constructe ADN care codifică proteinele interne conservate NP și Ml (matrice), atât la tulpini A (Beijing/89; H3N2). cât și B, în vederea asigurării protecției comune de grup față de antigeni derivați sau deviat ADN-urile HA vor funcționa prin generarea HA și anticorpii care rezultă vor neutraliza față de HA. Aceasta va fi specifică de tip, cu o oarecare creștere a domeniului de protecție față de o tulpină derivată, comparativ cu vaccinul curent autorizat bazat pe proteină. Constrjctele NP și Ml vor avea ca urmare generarea de CTL, care va asigura protecția de tulpină încrucișată cu încărcare virală potențial mai scăzută și accelerarea recuperării după îmbolnăvire. Persistența așteptată a constructului ADN (într-o formă epizonală nereplicativă, neintegrată în celulele musculare) este de presupus să asigure o durată de protecție crescută comparativ cu vaccinul uzual.
într-unul dintre modurile de realizare preferate ale invenției, secvența nudeoproteinei (NP) a virusului influenza uman, obținută de la tulpina A/PR/8/34 se donează într-un vector de expresie. Vectorul conține un promotor pentru transcripția la capătul secvenței care codifică NP. într-un mod preferat de realizare, promotorul este lungimea terminală repetată (LTR) de la virusul sarcoma Rous (RSV) care este un promotor de transcripție puternic. Un promotor preferat este promotorul dtomegalovirusului cu secvența intronului A (CMV-IntA). Un terminator de transcripție preferat este terminatorul hormonului bovin de creștere. în mod special, este preferată combinația CMVintA-terminator BGH. Suplimentar, pentru asistarea preparării medicamentului, în vectorul de expresie este inclus, de asemenea, de preferință, un marker de referință la antibiotic. Se pot folosi genele de rezistență la ampicilina, genele de rezistență la neomicină sau oricare alt marker de rezistență la antibiotic acceptabil farmaceutic. în plus, pentru a sprijini producerea la nivel ridicat a medicamentului prin fermentație în organisme procariote și pentru a fi un număr ridicat de copii, este avantajos ca vectorii să conțină o origine a replicării. Oricare dintre numeroșii vectori procariotici de donare accesibili comercial asigură aceste avantaje. într-un mod de realizare preferat al acestei invenții, aceste funcționalități sunt asigurate prin vectorii accesibili comercial, cunoscuți ca pUC. Este de dorit să se îndepărteze secvențele ADN neesențiale. Astfel, secvențele care codifică pUC, lacZ și Iaci se îndepărtează în unul din modurile preferate de realizare a invenției.
într-unul din modurile preferate de realizare se folosește ca vector de expresie pnRSV, în care ca promotor este folosită lungimea terminală repetată (LTR) a virusului sarcoma Rous (RSV). într-un alt mod preferat de realizare se folosește VI de transcripție BGH. Constructul VI-NP s-a folosit pentru a imuniza șoareci și a induce CTL care protejează față de provocare heteroloagă. într-un mod de realizare preferat în mod deosebit al acestei invenții, elementele lui VI s-au combinat pentru a produce un vector de expresie numit VIJ. în VIJ se donează o genă a virusului gripal, precum gena A/PR/8/34, NP, PBI, NSI, HA, PB2 sau Ml. într-un alt mod preferat de realizare, gena de rezistență la ampicilina se îndepărtează din VIJ și se înlocuiește cu o genă de rezistență la neomicină, pentru generarea VIJneo (SECV.ID.NR.18, fig.7), în care s-a donat oricare dintre numeroasele gene diferite ale virusului influenza, în vederea utilizării în conformitate cu această invenție. Conform cu un alt mod preferat de realizare s-a obținut prin inginerie genetică vectorul VIJns, care este
345
350
355
360
365
370
375
380
385
390
RO 117710 Β1 același cu VIJ, cu excepția unui sit de restricție Sfii unic, în unicul sit Kpnl la poziția 2114 a lui VIJ-neo. Incidența siturilor Sfii în ADN-ul genomic uman este foarte scăzută (aproximativ 395 un sit pe 100000 baze). în acest fel acest vector permite urmărirea atentă a integrării vectorului de expresie în ADN-ul gazdă, simplu prin digestia Sfii a ADN-ului genomic extras. O perfecționare ulterioară este vectorul V1R. în acest vector, cât mai mult posibil dh ADN-ul neesențial a fost “lichidat” pentru a produce un vector cât mai compact. Acest vector este un derivat al lui VIJns și este prezentat în fig.36 (SECV.ID:45). Acest vector permite să se 400 folosească inserte mai mari,care sunt codificate de mai puține secvențe nedorite și optimizează absorbția de către celule când constructul care codifică genele se introduce în țesut înconjurător. în fig.36, porțiunile deletate ale lui VIJ-neo (fig.7) sunt prezentate ca o pauză și secvența insertată este în text îngroșat, dar numărătoarea lui VIJ-neo este neschimbată. Modificarea vectorului și procedurile de dezvoltare pot fi realizate prin metode cunoscute 405 specialistului în domeniu. Cu toate acestea, produsele particulare descrise, deși obținute prin mijloace convenționale sunt utile în mod deosebit pentru scopul anume pentru care ele au fost adaptate.
în timp ce unul din modurile de realizare preferate ale acestei invenții încorporează gena influenza NP de la tulpinile A/PR/S/M, modul de realizare preferat încorporează o genă 410 NP, o genă MA, o genă NA, o genă PE o genă M sau o genă NS de la izolate mai recente de la virusul influenza. Aceasta se rea’zează prin prepararea copiilor ADN ale gendor virale și apoi subclonarea individuală a genecc Secvențe pentru numeroase gene a multor tulpini ale virusului influenza sunt accesibile publicului pe GENBANK (circa 509 de astfel de secvențe pentru genele virusului influenza A). Astfel, oricare dintre aceste gene, donate din izo415 late virale recente Texax, Beijing sau Panama, tulpini care sunt recomandate de Centrul pentru Controlul Bolilor ca fiind de dorit în vaccinuri antiinfluenza, sunt preferate în această invenție (vezi FLU-IMMUNE vaccin virus influenza al lui Lederle, Physiciens Desk Reference, 1993, p 1232, un vaccin trivalent purificat din antigen de suprafață influenza care conține o proteină hemoglutinină de la A/TexaxGo/91, H1N1; A/Beijing/353/89, H3N2; și B/Panama 420 (45/90). Pentru menținerea terminologiei constante, în descoperirea constructului ADN s-a convenit următoarea notare: “vector-numele tulpinii-gena”. Astfel, un construct în care este donată gena NP a tulpinii A/PR/8/34 în vedori de expresie VIJ-neo a primit numelez’VUneoPR-NP”. Natural, că așa cum tulpina etiologică a virusului se schimbă, se poate schimba și gena precisă care este optimă pentru încorporare în medicament. Totuși, așa cum se 425 demonstrează în continuare, dat fiind faptul că se induc răspunsuri limfocitare citotoxice care sunt capabile să protejeze față de tulpini heteroloage, variabilitatea de tulpină este mai puțin critică în noile vaccinuri ale acestei invenții, comparativ cu vaccinurile bazate pe virus integral sau subunitate polipeptidică. în plus, datorită faptului că medicamentul este ușor de manipulat pentru inserarea unei gene noi, aceasta este o corecție ce se face ușor prin 430 tehnicile standard ale biologiei moleculare.
Deoarece, secvența nucleoproteinei este conservată printre diverse tulpini influenza, s-a obținut protecție față de provocarea ulterioară printr-ο tulpină de la care s-a donat gena pentru nucleoproteină. Comparațiile NP de la numeroase tulpini ale virusului gripei A nu au demonstrat diferențe semnificative în strudura secundară (M.Gammelin și colab... Vira/. 170, 435 71,1989) și foarte puține schimbări în secvența aminoacizi (O.T.Gormanși colab.., J.V7ro/.65,
3704, 1991). într-o perioadă de aproximativ 50 de ani, NP în tulpinile umane s-a transformat la o rată de 0,66 schimbări pe an. Mai mult decât atât, rezultatele conform invenției, care au demonstrat că CTL spedfice A/HK/68 recunosc celule țintă pulsate cu peptide NP sintetică (147-155) derivată de la secvența NP a A/PR/8/34 arată că acest epitop CTL restricționat 440 N-2Kd a rămas intact funcțional timp de peste 34 ani de la apariție (vezi fig.2). Ar fi de remarcat de asemenea, că acolo unde gena codifică un antigen viral de suprafață cum ar fi, hemaglutinina sau chiar neuraminidaza, se generează în plus la răspunsul limfodtar foarte important, un răspuns imun unoral (anticorp) de neutralizare.
RO 117710 Β1
Injectarea im a unui vector de expresie ADN care codifică o proteină internă conservată a gripei A a avut ca urmare generarea unei imunități de protecție semnificativă față de provocarea virală ulterioară. S-au produs în special, anticorpi NP specifici ș CTL primare. Imunizarea ADN NP a avut ca rezultate, comparativ cu controalele, descreșterea titrurilor virale pulmonare, inhibarea pierdere în greutate și creșterea supraviețuirii. Răspunsul imun de protecție nu a fost mediat prin anticorpi specifici NP, așa cum s-a demonstrat prin absența efectului, doar al anticorpilor NP (vezi, exemplul 4) în combaterea ure infecții virale și astfel a fost datorat imunității celulare NP-specifice. în plus, s-au generat nr/eluri semnificative de CTL primare orientate contra NP. Protecția a fost față de o tulpină virulentă de influenza A care a fost heteroloagă la tulpina de la care s-a donat ADN-ul Suplimentar, tulpina de provocare a apărut la mai mult de 3 decade sub tulpina A/PR/34 indicând că răspunsurile imune orientate împotriva proteinelor conservate pot fi eficiente îr duda devierii și derivării antigenice a proteinelor variabile ale învelișului viral. Datorită faptulu că produsele genei virusului gripei prezintă același grad de conservare și datorită faptului că gena virusului gripei prezintă același grad de ccrservare și datorită faptului că CTL pot f. generate ca răspuns la expresia intracelulară ș prelucrarea MHC, este previzibil, ca alte cene ale virusului gripal vor provoca răspunsur analoage celui obținut pentru NP. Metode pentru identificarea epitopilor imunogeni sun: cinecunoscute în domeniu (vezi de exerrdu, Shirai și colab.., JImmunolAAS: 1657-1667. '992; Choppin și colab.., J.lmmunol 147:575-583, 1991; Calin-laurens și colab.., Vaccine 11:974-978, 1993). Astfel, numeroase dintre aceste gene s-au donat așa cum s-a demonstra: prin joncțiunile donate din vectorul de expresie (vezi mai jos), astfel, încât aceste constructe constituie agenți profilactici într-o formă accesibilă.
Limitările curente ale vaccinurilor gripale autorizate accentuează nevcxa dezvoltării de mijloace mai eficiente pentru prevenirea infecției și ameliorarea bolii. Vaccinurile mai vechi asigură protecție limitată, suni eficiente doar față de câteva tulpini selecție ale virusului și scad în eficacitate după o perioadă scurtă. Astfel, vaccinurile uzuale în scopul de a fi eficiente trebuie să fie formulate pentru inoculare anuală. Generarea unui răspuns CTL îmbunătățit față de proteinele interne va asigura de asemenea, imunitate reactivă încrudșată semnificativă, de lungă durată, care acum nu este produsă prin vaccinul autorizat Conform invenției, s-a demonstrat expresia proteinei de la constructul PNV în șoareci, fereți și primate non-umane, prin detedarea răspunsului imun al gazdei, orientat împotriva antigenilor gripali. Injectarea șoarecilor cu ADN care codifică NP de influenza a avut ca urmare creșterea supraviețuirii, descreșterea titrurilor virale pulmonare și mai puțină pierdere îngreuiate în comparație cu animale de control după provocare cu subtipuri influenza (tulpini deviate), diferite de cele incluse în construdeJe ADN NP. S-a observat, de asemenea, descreșterea rezidenței virale după provocare cu tulpini deviate la fereții inoculați cu ADN NP. Aceste rezultate arată că protecția față de tulpini influenza în principal, este ajustată printr-un vaccin ADN ce include genele care codifică NP. Injectarea cu ADN HA urmată de provocarea experimentală a animalelor cu tulpini virale derivate a avut ca urmare chiar o mai substanțială descreștere în rezidența virală. Adăugarea ADN-ului proteinei interne mărește ușor gradul ridicat al protecției observată după injectarea doar a ADN-ului HA.
Răspunsul imun la ADN influenza a urmat la șoareci aproape 6 luni de la injectare, cu persistența anticorpilor, activitate CTL și protecție in vivo. Repetarea injectării de ADN a mărit supraviețuirea după provocare la 25 săptămâni cu tulpină influenza de subtip diferit și a indicat o capacitate de a produce imunitate de protecție mediată celular. Persistența anticorpului s-a cercetat timp de cel putin 1 an după 2 injectări de ADN HA, cu persistența cel puțin pentru 9 luni după o singură irțectare de ADN HA la maimuțe africane verzi.
Rezultatele de la aceste animale de experiență au arătat că injectarea directă de
ADN asigură o metodă îmbunătățită pentru protecția oamenilor împotriva infecției și bolii
445
450
455
460
465
470
475
480
485
490
RO 117710 Β1 gripale. De remarcat, că protecția experimentală prin injectare de ADN s-a obținut la șoareci și fereți prin vaccinarea animalelor care nu au avut de a face cu virusul gripal. Adutții umani vaccinați cu ADN au avut contacte anterioare cu virusul influenza. Aceste persoane vor demonstra un răspuns imun chiar sensibil mai mare, posibil creșterea duratei, după imunizare cu constructul ADN.
în vederea optimizării construitului pentru utilizare, se face o comparate a domeniului de dozare pentru imunogenicitate în experimentele cu mamifere mici, au indus anticorpi și răspunsuri CTL cantități de orz nul a 1 pg ADN NP. Imunizarea maimuțelor Rhesus a demonstrat răspuns anticorp la 2 c n 2 animale cu doze de 100 și 1000 pg ADN HA (A/PR/34), în timp ce unul din 2 anî~ale au răspuns la o singură injectare de 10 pg. în experimentele separate, s-au injectai imuțe africane verzi cu un amestec de 5 constructe ADN diferite, care codifică HA de la 3 sjbtipuri, precum și ADN care codifică NP și Ml de la virusul influenza A. Trei din 3 maimuțe cin fiecare grup au răspuns la vaccinuri care au inclus 10 pg sau 100 pg din fiecare 50, 100 ș 200 pg ADN sunt eficiente la om.
Prevenirea infecției prin vacin_- inactivate, autorizate se corelează cu nivelurile de anticorp seric și de la nivelul mucoase srientat împotriva HA, dar nu se corelează răspunsuri anticorp pentru proteinele influenza interne. Astfel, HA trebuie să fie inclus în dezvoltarea vaccinului ADN influenza. Cu toate acesiea, răspunsul imun la NP sporește răspunsul anticorpului la HA și proteinele interne inf._enza asigură un răspuns CTL inter-reactiv cu tulpini antigenic diferite de influenza. Așa s-a remarcat mai sus, experimentarea la animale a arătat, de asemenea, îmbunătățirea imunogenității și protecției când injectările includ constructe ADN care codifică proteine interne, precum HA. Includerea constructului ADN care codifică proteine interne ar putea de asemenea, să mărească eficacitatea vaccinului ADN la oameni. Deoarece, nivelurile oe dozare sunt dependente, de asemenea, de interacțiunile acestor componente, testarea ce rutină va permite unui specialist în domeniu să determine cantitatea ADN-ului din vaccin pentru a face un amestec de constructe ADN HA, NP și Ml. Răspunsul gazdei la fiecare cin aceste componente poate fi măsurat separat cu comparații ale tipurilor de inhibare a hemaglutininei și de neutralizare față de componentele HA și răspunsurile CTL față de epitopă Ml și NP. Rezultatele se compară cu răspunsurile anticorp după injectarea constructelor care exprimă doar HA. Aceste studii permit evaluarea potențialului crescut de răspuns la un vaccin conținând ADN care codifică HA precum și proteinele interne.
Eficacitatea la oameni s-a demonstrat la voluntari care au primit vaccin ADN influenza, urmat de o provocare intranazală în vederea demonstrării eficacității vaccinului împotriva tulpinii virale similare, precum tulpinile influenza de subtip diferit. Compoziția, dozarea și regimurile de administrare se bazează pe studiile anterioare. Eficacitatea clinică este arătată prin rate de infectare, scorurile de îmbolnăvire și durata îmbolnăvirii. Aceste încercări clinice sunt comparate cu evaluarea în laborator a răspunsului imun al gazdei și rezidența virală, în vederea determinării markerilor înlocuitori care se corelează cu protecția.
Tehnicile standard ale biologiei moleculare pentru prepararea și purificarea constructelor ADN permit prepararea ADN-urilor terapeutici ale acestei invenții. în timp ce tehnicile standard ale biologiei moleculare sunt prin urmare suficiente pentru producerea invenției, constructe specifice dezvăluite aici asigură noi căi terapeutice care în mod surprinzător produc protecție încrucișată de tulpină, un rezultat care nu s-a obținut până acum cu vaccinuri virale integrale standard inactivate sau vaccinuri de subunități proteice.
Cantitatea ADN-ului exprimabil, care trebuie introdusă la un primitor de vaccin va depinde de forța transcripțipnală și promotorii translaționali folosiți în constructul ADN și de imunogenitatea produsului exprimat de genă. în general, se administrează direct în țesutul muscular o doză imunologică și eficientă profilactic de circa 1 pg până la 1 ml, și de
RO 117710 Β1 preferință, 10 pg până la 300 pg. De asemenea, se au în vedere injectarea subcutanată, introducerea intradermică, impresia prin piele și alte moduri de administrare, precum intraperitoneală, intravenoasă sau eliberarea prin inhalare. De asemenea, se are în vedere să fie asigurate vaccinurile de rapel.
ADN-ul poate fi lipsit de înveliș, ceea ce înseamnă că nu este asociat cu nici o altă proteină, adjuvant sau alt agent care acționează asupra receptorilor sistemului imunitar. în acest caz, este de dorit, dar fără să fie limitat la,o soluție alcalină sterilă sau o soluție alcalină sterilă tamponată. Alternativ, ADN-ul se poate asocia cu lipozomi, precum lipczomi de lecitină sau alți lipozomi cunoscuți în domeniu, ca un amestec ADN-lipozomi (vez de exemplu, WO 9324640) sau ADN-ul poate fi asociat cu un adjuvant cunoscut în domeniu pentru producerea de răspunsuri imune, cum ar fi, o proteină sau un alt purtător.
Agenți pentru sprijinirea absorbției celulare a ADN-ului precum, dar fără să fie limitat la, ioni de calciu, proteine virale și citi agenți care facilitează transfecția se pot folosi de asemenea, în mod avantajos. Acești agenți sunt cunoscuți în general, ca agenți pentru facilitarea transfecției și ca purtători acceptabili farmaceutic. Așa cum s-a folosit a ci, termenul genă se referă la un segment de aod nucleic care codifică o polipeptidă anume. Termenul de medicament și vaccin sunt folcsiți interschimbabil pentru indicarea compozițiilor utile pentru inducerea răspunsurilor imune. Termenii, construct și plasmid sunt -'dosiți interschimbabil. Termenul vector se fo-osește pentru a indica un ADN, în care genele pot fi donate pentru utilizare conform metodei acestei invenții.
Pentru conformitate cu invenția, una din realizările preferate ale aceste; invenții este o metodă pentru utilizarea genelor virusului gripei pentru inducerea răspunsurilor imune in vivo, într-un vertebrat, precum un mamifer, inclusiv un om, care cuprinde:
a- izolarea genei; b - legarea genei la secvențe reglatoare, astfel, încât gena este legată funcțional la secvențe de control, care atunci când sunt introduse într-un țesut viu, inițiază transcripția directă și translația ulterioară a genei; c - introducerea genei într-un țesut viu, și; d - la alegere, provocare cu genă infiuenza suplimentar.
Unul din modurile preferate de realizare a acestei invenții este o metodă pentru protejare față de tulpinile heteroloage ale virusului infiuenza. Aceasta se obține prin administrarea unei cantități eficiente dintr-un acid nucleic care codifică în epitop viral infiuenza conservat. De exemplu, întreaga gamă pentru nucleoproteine infiuenza asigură această funcție și este privită ca secvențele care codifică alte gene infiuenza și porțiuni ate acestora care codifică epitopi conservați în aceste gene asigurând în acest mod protecfie încrucișată de tulpină.
într-o altă realizare a acestei invenții, vaccinul ADN codifică nucleoproteina virusului gripal uman, hemaglutinină, matrice, nestructurală sau produsul genei polimeraza. Exemple specifice ale acestei realizări sunt date în continuare, unde gena virusului gripei umane codifică nucleoproteina, polimeraza bazică 1, proteina nestructurală 1, hemoglutirana, matricea 1, polimeraza bazică 2 a virusului infiuenza uman izolat A/PR/8/34, nucleoproteina virusului infiuenza uman izolat A/Beijino/353/89, gena hemaglutininei virusului infiuenza uman izolat A/Texax/36/91 sau gena hemoglutininei virusului infiuenza uman izolat B/Panama/46/90.
în realizările specifice ale acestei invenții, constructul ADN codifică o genă de virus gripal, în care constructul ADN este capabilă să fie exprimată la introducere în țesuturi animale in vivo și să genereze un răspuns imun împotriva produsului exprimat al genei codificate de infiuenza. Mai mult, combinațiile cuprinzând astfel de constructe cu pofinucleotide care codifică alți antigeni, neîntruditi virusului gripal, sunt în mod clar avuți în vedere prin invenția de fată.
» »
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 117710 Β1
Exemple ale genei influenza preferate care codifică constructul ADN indud:
a) pRSV-PR-NP,
b) V1-PR-NP,
c) VIJ-PR-NP, al cărei capăt 5 este SECV.ID Nr:12,
d) VIJ-PR-PBI, al cărei capăt 5’ este SECV.ID Nr: 13,
e) VIJ-PR-NS, al cărei capăt 5- este SECV.ID Nr: 14,
f) VIJ-PR-HA, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:15,
g) VIJ-PR-PB2, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:16,
h) VIJ-PR-MI, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:17,
i) VIJneo-BJ-NP, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr.20 și al cărei capăt 3 este secv.lD:21,
j) VIJneo-TX-PN, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr.24 și al cărei capăt 3 este SECV.ID Nr:25,
k) VIJneo-PA-HA, al cărei capăt 5' este SECV ID. Nr: 26 și al cărei capăt 3' este SECV.ID Nr.27,
l) VIJns-GA-HAiA/Georgia/OS'SS), constructul de mărime 6,56 kb, al care capăt 5' este SECV.ID Nr:46 și al căre capăt 3' este SECV.ID Nr:47,
m) VIJns-TX-MA(A/Texax/36/£t), construct de mărime 6,56 kb, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:48 și al cărei capăt 3 este SECV.ID Nr.49,
n) VIJns-PA-HA(S/panama/45,$'O), construct de mărime 6,61 kb, al căre: capăt 5' este SECV. ID Nr:50 și al cărei capăt 3' este SECV.IS Nr:51,
o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), construct de mărime 6,42 kb, al căre: capăt 5' este SECV.ID Nr:52 și al cărei capăt 3' este SECV.ID Nr:53,
p) VIJns-BJ-MI(A/Beijing/353/89), construct de mărime 5,62 kb, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:54 și al cărei capăt 3' este SECV.ID Nr:55,
q) VIJns-PA-NP (S/Panama/45’90), construct de mărime 6,54 kb, al căre: capăt 5' este SECV.ID Nr:56 și al cărei capăt 3' este SECV.ID Nr:57,
r) VIJns-PA-MI(B/Panama/45/90), construct de mărime 5,61 kb, al cărei capăt 5' este SECV.ID Nr:58 și al cărei capăt 3 este SECV.ID Nr:59.
în continuare, se dau următoarele exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1-36, care reprezintă:
- fig.1, Detecția în mușchi a plasmoidului ADN NP. Șoareci BALB/c s-au injectat de 3 ori, la intervale de 3 săptămâni cu ADN RSV-NP sau vector blanc (100 pg/picior) în ambii mușchi cvadriceps, apoi a urmat infecție prin influenza. Mușchii s-au îndepărtat la 4 săptămâni după injectarea finală și s-au înghețat imediat în acest lichid. Apoi, ei au fost pulverizați imediat în tampon de liză (25 mM TRIS-H3PO4, pH =8,2 M trans-1:2-acid diaminociclohexan-tetraacetic(CDTA). 2 mM DTT, 10% glicerol, 1% Triton-X-100). într-un MIKRODISMEMBRATOR™ (B.Braun Instrumente) și s-a extras ADN-ul cu greutate moleculară mare prin precipitare cu fenol/cloroform și etanol. S-a realizat o reacție PCR de 40 cicluri /PCR s-a realizat urmând instrucțiunile trusei perkin Elser Cetus GENEAMP™) pentru detectarea prezenței plasmidului ADN NP în mușchi. S-a generat un produs PCR de 772 baze perechi (vezi capătul săgeții), care se întinde, de la promotorul GMV prin majoritatea porțiunii 5' a genei NP insertate de la oligonucleotidă sens de 18 baze lungime care s-a inițiat în regiunea promotorului (GTGTGCACCTCAAGCTGG, secv. ID:1) și o oligonucleotidă antisens de 23 baze lungime inițială în porțiunea 5' a secvenței NP insertate (CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC, secv,ID:2).
Produsul 772 bp se-observă pe un gel de agaroză colorat bromură de etidiu în probele de mușchi alese injectate ADN NP, dar nu se observă pe control injectat cu vectorul blanc (600 L). Marcarea de mai sus a fiecărei linii indică numărul șoarecelui și piciorul drept sau stâng.
RO 117710 Β1
- fig.2, Producerea anticorpilor NP în șoareci injectați cu ADN NP. S-au injectat șoarecii cu 100 pg ADN VI-NP în fiecare picior la 0,3 și 6 săptămâni și s-a prelevat sânge în săptămânile 0,2 5 și 8. Prezența IgG anti-NP în ser s-a cercetat printr-un test ELISA (J.J.Donnely și colab.., J.lmmunol, 145, 3071, 1980), cu NP purificat din celule de insecte transfectate cu un vector de expresie baculovirus. Rezultatele s-au marcat cc medie log. 10 ELISA* SEM(n=10) față de timpul de la prima injectare de ADN NP. Șoarecii imunizați cu vectorul blanc nu au generat anticorpi NP detectabili.
- fig.3, Procentul lizei specifice determinat în a 4-a oră a țesutului de eliberare 51Cr, pentru CTL obținute de la șoareci imunozați cu ADN. Șoarecii s-au imunizat cu 400 pg VI-NP ADN (cercuri umplute) sau vector blanc (pătrate umplute) și s-au sacrificat 34 săptămâni mai târziu. Controlul CTL negativ s-a obținut de la un șoarece recuperat de la injectare 4 săptămâni mai devreme cu A/HK/68 (triunghiuri umplute). Graficele prezintă date de la șoareci reprezentativi individual. S-au studiat cel puțin 8 indivizi pentru fiecare set de condiții. Tabloul A: Celule splenice restimulate cu celule splenice autoloage pulsate NP 147-155 și cercetate față de ținte P815 pulsate NP 147-155. Tabloul B: Celule splenice restimulate cu celule splenice autoloage pulsate NP 147-155 și cercetate față de ținte p815 infectate cu influenza A Victoria/73 (H3N2), tirr.; de 6 h înaintea adăugării de CTL. Tabloul C: Celule splenice restimulate cu ConA și IR-2 fără antigen suplimentar și cercetare fcțâ de celule P815 pulsate cu NP 147-155. Table.! D: S-au injectat șoareci cu 200 pg/injectare ADN VINP sau vector blanc de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. S-au prelevat splinele la 4 săptămâni după ultima imunizare, s-au cultivat celule splenice cu IL-2 și ConA, timp de 7 zile și s-au cercetat CTL față de celule ținta P815 infectate cu A/Victoriea/73.
- fig.4, Pierderea de masă (în a) și recuperarea la șoareci imunizați ADN după provocare intranazală fără anestezie cu 10* TCID50 de A/HK/68. Șoarecii s-au imunizat de 3 ori la intervale de 3 săptămâni cu ADN VI-NP sau vector blanc, sau nu s-au infectat și s-au provocat la 3 săptămâni după ultima rnunizare. S-au determinat greutățile pentru grupul de 10 șoareci la momentul provocării și zilnic din ziua a 4-a pentru șoareci infectați ADN-NP (cercuri umplute), controale cu vector blanc (triunghiuri neumplute). S-a prezentat media greutăților ^em. Șoarecii injectați ADN NP au prezentat pierderi de greutate sensibil mai mici din ziua 8 spre ziua 13, față de șoarecii imunizați cu vector blanc (p mai mic sau egal cu 0,005) și șoareci neinjectați (p mai mic sau egal cu 0,001) așa cum s-au analizat prin țesut t. Nu s-au remarcat diferențe semnificative între două controale (p00,9 prin țesut t).
- fig.5, Supraviețuirea șoarecilor imunizați ADN după provocare intranazală (sub anestezie) cu 102·5 TCID50 de A/HK/68. Șoareci imunizați de 3 ori la intervale de 3 săptămâni (cercuri umplute) și controale neinjectate (triunghiuri neumplute) și s-au provocat la 3 săptămâni după imunizare finală. Procentul de supraviețuire s-a arătat pentru grupuri de 9 sau 10 șoareci. Supraviețuirea șoarecilor injectați a fost semnificativ mai mare decât controale (p=0,004 prin analiză Chrisquare), în timp ce nu s-a observat nici o diferență semnificativă între șoarecii injectați cu vector blanc sau șoareci neinjectați (p=0,17 prin analiză Chisquare).
- fig.6, Secvența vectorului de expresie VIJ, Secv.lD Nr: 10.
- fig.7, Secvența vectorului de expresie VIJ neo, Secv.lD Nr:18.
-fig.8, Secvența promotor - terminator CMVintA-BGH, Secv.lD Nr:11.
- fig.9, Anticorp de maimuță anti-NP.
- fig. 10, Inhibarea hemoglutinării la feret, cu linia punctată indicându-se titrul minim de anticorp de protecție și cu un cerc ce are o linie prin el, fiind notată valoarea medie.
- fig.11, Anticorp IgG anti-NP la fereți după imunizare cu ADN.
- fig.12, Virus influenza rezident la feret cu și fără imunizare ADN.
- fig. 13, Diagrama vectorilor pRSV-PR-NP și VI-NP. X marchează regiunea de codificare inserată.
640
645
650
655
660
665
670
675
680
685
RO 117710 Β1
- fig. 14, Tulpini și proteine de influenza. schematic.
- fig. 15, Prelucrarea ADN-ului injectat în interiorul unei celule schematic
- fig. 16, Rezistența fereților la influenza A/PR/8/34 indusă prin imunizare cu genele HA și proteină internă.
- fig. 17, Vectorul VIJns, schematic
- fig. 18, S-au injectat maimuțe africane verzi cu un amestec de ADN-uri care constă din ADN HA (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texax/91), ADN NP (A/PR/34) și ADN Ml (A/PR/34). Fiecare component a fost administrat de două ori, fie 10 pg (pătrate umplute), fie 100 pg (cercuri umplute) cu un interval, de 6 săptămâni (vezi săgețile). Pentru comparație s-au injectat alte animale cu vaccinuri autorizate, subvironice (pătrate neumplutei și virioni integrali (cercuri umplute) la doză umană integrală (45 pg echivalent proteină. 15 pg/HA). S-au colectat probe de ser la fiecare 2 săptămâni, timp de 18 zile și s-au analizat prin titru Ml față de HA A/Beijing/89. Datele sunt reprezentate ca medie geometrică a titrulu! MI*SEM, unde n=3.
- fig. 19, S-au injectat șoareci BALB/c, femele (4-6 săptămâni) cu ADN NP A/PR/34 (200 pg) de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. Controalele negative au inclus șoarec cu ADN control (200 pg), proteină NP recombinată (10 pg) și șoareci neinițiați neinjectați (s mulare). Pentru comparație s-au testat, de asemenea, șoareci infectați cu virusul influenza A/HK/68 (gripă). S-au obținut in vitro CTL 6 luni post doză cu celule splenice singenice irrectate cu virus, față de celulele P815 pulsate peptidă NP la un raport efector: țintă de 10:1. Datele reprezintă lista specifică %+ sd, unde n=3.
- fig.20, S-au injectat șoareci C3H/HeN cu mioblaste normale C2C12 (1 x 10’ celule). Această cantitate de proteină NP (2 pg) a fost suficientă pentru generarea răspunsurilor anticorp și a fost echivalentă cu aproximativ de 100 de ori cantitatea NP prezentă în mioblastele transfectate NP transplantate. S-au preparat CTL de la acești șoareci 6 săptămâni după tratament și s-au restimulat in vitro cu celule splenice singenice infectate cu virus influenza. Drept control pozitiv s-au preparat CTL de la șoareci care au fost infectați cu virus influenza A/MK/68. Celulele țintă folosite au fost mioblaste netratate (bare umplute), infectate viral influenza A/Victoria/23 (bare cu dungi) și mioblaste transfectate NP (bare punctate) la un raport efector:țintă de 25: 1. Datele sunt prezentate ca liză specifică % ±, unde n=3.
- fig.21, Șoareci BALB/c femele, în vârstă de 4 săptămâni, s-au imunizat intramuscular cu 200 pg ADN NP de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. Șoarecii s-au provocat la 3 săptămâni după a treia imunizare cu 300 TCID50 de A/HK/68, administrat sub anestezie (provocare a tractului respirator în totalitate). Proporția șoarecilor supraviețuitori (10/grup) este marcată față de timpul după provocare.
- fig.22, Șoareci BALB/c, femele în vârstă de 4 săptămâni, s-au imunizat intramuscular cu 100 pg ADN NP de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. Șoarecii s-au provocat 3 săptămâni după a treia imunizare cu 300 TCID^ de A/HK/68, administrat sub anestezie (provocare a tractului respirator în totalitate). S-au cântărit zilnic șoarecii și s-a calculat proporția greutății inițiale pentru fiecare șoarece care supraviețuiește. S-a marcat media procentuală a greutăților inițiale + SEM, față de timpul după provocare.
- fig.23, S-au imunizat șoareci BALB/c femele, în vârstă de 4 săptămâni, intramuscular, cu 200 pg ADN NP de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. Șoarecii s-au provocat 3 săptămâni după a treia imunizare cu 200 TCID^ de A/HK/68, administrat fără anestezie (provocare a tractului respirator superior). S-au supus eutanasiei șoarecii la 7 zile după provocare, s-au recuperat și omogenizat plămânii și s-au determinat titrurile virale prin titrare serială pe celule MDCK.
- fig.24, S-au imunizat șoareci BALB/c femele, în vârstă de 4 săptămâni, intramuscular, cu 6, 25, 100 sau 200 pg ADN NP de 3 ori la intervale de 3 săptămâni.
RO 117710 Β1
Șoarecii s-au provocat 3 săptămâni după a treia imunizare cu 300 TCID^ de A/HK/68, administrat sub anestezie (provocarea tractului respirator în totalitate). Proporția șoarecilor care supraviețuiesc (10 șoareci/grup) este marcată față de timp, după provocare. 740
- fig.25, S-au imunizat șoareci BALB/c femele, în vârstă de 4 săptămâni, intramuscular, la intervale de 3 săptămâni cu 200 pg ADN NPA/PR/34, ADN control sau simulare. Șoarecii s-au provocat apoi cu TCID^ A/HK/68, sub anestezie la 6, 12 și 25 săptămâni după a treia injectare a ADN-ului. Șoarecii selectați s-au reimunizat cu 200 pg ADN NP la săptămâna 22 și apoi s-au provocat la săptămâna 25. S-a prezentat media greutăților ca 745 procent al greutății totale inițiale pentru fiecare grup. Greutatea de control prezentată este media tuturor grupurilor de control de la provocările din săptămânile 6, 12 și 25, un total a grupuri care au primit ADN de control sau la care s-a simulat injectarea. Grupurile inițiale au conținut fiecare 10 animale; șoarecii care au murit s-au exclus de la analiză ulterioară a grutății. 750
- fig.26, S-au imunizat i.m. fereți adulți masculi (în vârstă de 22-26 săptămâni) cu 1 mg ADN care codifică NP de la A/beijing/89,1 mg ADN care codifică Ml de la A/Beijing/89 sau 1 mg ADN combinat, pe zilele 0 și 42. Fereții de control au primit ADN care nu codifică sau o doză umană integrală (15 pgÂulpină) din vaccin integral autorizat pentru virusul gripal, (formularea 92-93) care conține ABeijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții s-au provocat cu 755 A/Georgia/93 pe ziua 56. S-a determinat rezidența virală din spălături nazale, așa cum s-a descris mai sus. S-a comparat rezidența virală pe zilele 3-5 cu rezidența de la fereții care au primit ADN de control printr-o analiză pe două căi a variației. Rezidența virală la fereții care au primit ADN Ml sau ADN NP+Ml a fost semnificativ mai scăzută (p mai mic de 0,0001, 0,0016 și, respectiv, mai mic de 0,001), decât rezidența la fereți de control. Rezidența la 760 fereții care au primit NP (nu s-au prezentat date), NI sau NP+Ml nu a diferit semnificativ de rezidența de la fereții care au primit vaccinul autorizat (p, 0,104, 0,533 și respectiv, 0,145). Doza de imunizare de 1 mg s-a ales arbitrar, studii privind domeniul de dozare s-au realizat la primate non-umane.
- fig.27, S-au imunizat intramuscular grupuri de 8 fereți masculi în vârstă de 22-25 765 săptămâni cu ADN control, soluție salină sau ADN care codifică proteinele de la influenza A/PR/34 pe zilele 0, 21 și 121 și s-au provocat intranazal cu 200 TCID50 A/PR/8/34 pe ziua
148. Animalele imunizate au primit 1 mg ADN NP sau 2 mg ADN combinat NP, NS1, PB1, PB2 și M1 (400 pg din fiecare construct). Controalele au primit 0,5 ml soluție salină/picior sau 1 mg ADN control, pentru scopurile analizei, grupările care au primit soluție salină ADN 770 control s-au combinat (control) ca și grupările care au primit ADN NP singur sau în combinație cu alte gene ale proteinelor interne (intern). Graficul arată titrurile de infectiozitate ale spălăturii nazale exprimate în TCID^JSO pl dintr-un volum de 3 ml fluid de spălare nazală. Fluidul de spălare nediluat (cea mai scăzută siluție testată) s-a considerat a fi o diluție 1:10 din exudatul nazal inițial și s-a acordat unei probe pozitive nediluate o valoare de 1 log. 775 Titrurile peste 1 log s-au desemnat pe baza interpolării Reed-Muech prin 3 replicate la obținerea unui punct final de infectiozitate de 50%. Probele care au fost negative când s-au testat nediluate au primit o valoare de 0 log. Valorile pentru p prezentate pe grafic s-au prelucrat pe computer pentru fereții imunizați față de controale pe zilele indicate printr-un test -T pentru două medii. Valorile pentru p pentru curbele întregi s-au prelucrat pe computer 780 printr-o analiză pe două căi a variației și au fost mai mici de 0,0001 pentru NP, față de control și mai mici de 0,001 pentru ADN-urile combinate, față de control.
- fig.28, Supraviețuirea șoarecilor imunizați cu ADN și apoi, provocati cu virus influenza. Șoarecii s-au injectat im cu 200 pg ADN care codifică HA de la A/PR/34 sau ADN control (care nu codifică), de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. După 3 săptămâni de la imu- 785 nizarea finală șoarecii s-au provocat pe întregul tract respirator (prin instilație intemazală sub anestezie) cu 100 TCIDS0 de A/PR/34. Datele sunt marcate ca supraviețuire % față de timp după provocare (n=9 sau 10 șoareci per grup).
RO 117710 Β1
- fig.29, Pierderea în greutate la șoarecii imunizați cu ADN și apoi provocați cu virus gripal. S-au injectat i.m. șoarecii cu 200 pg ADN care codifică HA de la A/PR/34 sau ADN control (care nu codifică), de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. După 3 săptămâni de la imunizarea finală șoarecii s-au provocat pe întregul tract respirator (prin instilație intemazală sub anestezie) cu 1000 TCIDM de A/PR/34. Datele s-au marcat ca % din greutatea inițială pentru fiecare animal individual, media față de timp pentru fiecare grup (animalele moarte s-au exclus din medie).
- fig.30, Supraviețuirea șoarecăor imunizați cu ADN și apoi provocați cu virus gripal. Șoarecii s-au injectat im cu 1,10 sau 100 pg ADN care codifică HA de la A/PR/34 sau ADN control (care nu codifică)de 3 ori la intervale de 3 săptămâni. După 3 săptămâni de la imunizarea finală șoarecii s-au provocat pe întregul tract respirator (prin instilație intemazală sub anestezie) cu 1000 TCIDS0 de A/PR/34. Datele sunt marcate ca supraviețuire % față de timp după provocare (n=9 sau 10 șoareci per grup).
- fig.31, S-a imunizat intramuscular grupuri de 8 fereți masculi în vârstă oe 22...25 săptămâni cu ADN control, soluție salină sau ADN care codifică proteina influenza A/PR/34 pe zilele 0, 21 și 121 și s-au provocat intranazal cu 200 TCID50 A/PR/34 pe ziua 148. Animalele imunizate au primit 1 mg ADN HA sau 2 mg ADN combinat HA, NP, NS1, PB1, PB2 și M1 (330 pg din fiecare construct). Controalele au primit 0,5 ml soluție sa'inâ/picior sau 1 mg ADN control. Pentru scopurile analizei, grupările care au primit soluție salină și ADN control s-au combinat (Control) ca și grupările care au primit ADN HA singur sau în combinație cu alte gene ale proteinelor interne (ΗΑ,ΗΑ+lntern). Graficul arată titrurile de infecțiozitate ale spălăturii nazale exprimate în TCID so/5O pl dintr-un volum de 3 ml fluid de spălare nazală. Fluidul de spălare nedSuat (cea mai scăzută diluție testată) s-a considerat a fi o diluție 1:10 din exudatul nazal inițial și s-a acordat unei probe pozitive nediluate o valoare de 1 log. Titrurile peste 1 log s-au desemnat pe baza interpolării Reed-Muench prin 3 replicate la obținerea unui punct final de infecțiozitate de 50%. Probele care au fost negative când s-au testat nediluate au primit o valoare de 0 log. Valorile lui p pentru curbele întregi s-au prelucrat pe computer printr-o analiză pe două căi a variației și au fost mai mici de 0,0001 pentru HA față de control și mai mici de 0,0001 pentru ADN-urile combinate față de control.
- fig.32, S-au imunizat i.m. fereți adulți masculi (în vârstă de 22-26 săptămâni) cu 1 mg ADN care codifică HA de la A/Georgia/93 pe zilele 0 și 42. Fereții de control au primit ADN care nu codifică sau o doză umană integrală (15 pg/tulpină) din vaccin integral autorizat pentru virusul gripal. (Formularea 92-93) care conține A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții s-au provocat cu A/Georgia/93 pe ziua 56. S-a comparat rezidența virală din spălaturi nazale, așa cum s-a descris mai sus. S-a comparat rezidența virală pe zilele 1-6 cu rezidența de la fereții care au primit ADN de control printr-o analiză pe două căi a variației. Rezidența virală la fereții care au primit ADN HA a fost semnificativ mai scăzută (p mai mic de 0,0001) decât rezidența la fereții de control.
- fig.33, S-au imunizat i.m. fereți adulți masculului (în vârstă de 22-26 săptămâni) cu 1 mg/ADN care codifică HA de la A/Hawaii/89 (nu s-au prezentat datele) pe zilele 0 și 42. Fereții de control au primit ADN care nu codifică sau o doză umană integrală (15 pg/tulpină) din vaccin integral autorizat pentru virusul gripal, (formularea 92-93) care conține A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții s-au provocat cu A/Georgia/93 pe ziua 56. S-a determinat rezidența virală din spălaturi nazale, așa cum s-a descris mai sus. S-a comparat rezidența-virală pe zilele 1-6 cu rezidența de ia fereții care au primit ADN de control printr-o analiză pe două căi a variației. Rezidența virală la fereții care au primit ADN HA A/Hawaii/91 a fost semnificativ mai scăzută (p mai mic de 0,0001) decât rezidența la fereții de control. Rezidența la fereții care au primit ADN HA A/Hawaii/91 a fost semnificativ mai mică decât
RO 117710 Β1 rezidența la animalele care au primit produsul autorizat (p=0,021 pentru ADN HA A/Hawaii/91; ANOVA pe două căi pentru zilele 1-6); rezidența la fereții care au primit ADN HA A/Beijing/89 (datele nu s-au prezentat) nu a fost semnificativ diferită de rezidența de la animalele care au primit produsul autorizat (p=0,058; ANOVA în 2 moduri pentru zilele 1-6).
- fig.34, S-au imunizat i.m. fereți adulți masculului (în vârstă de 22-26 săptămâni) cu 1 mg ADN care codifică HA de la A/Hawaii/91 (vezi fig. 13), sau cu 330 pg din fiecare ADN care codifică HA de la A/Hawaii(91 și NP și Ml de la A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții de control au primit ADN care nu codifică sau o doză umană integrală (15 pg/tulpinâ) din vaccin integral autorizat pentru virusul gripal. (Formularea 92-93) care conține A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții s-au provocat cu A/Georgia/92 pe ziua 56. S-a determinat rezidența virală pe zilele 1-6 cu rezidența de la fereții care au primit ADN de control printr-o analiză pe două căi a variației. Rezidența virală la fereții care au primit ADN HA+NP+MI a fost semnificativ mai scăzută, decât rezidența la fereții care au primit vaccinul autorizat (p mai mic de 0,0001) sau numai ADN HA (p=0,0053),
- fig.35, S-au imunizat i.m. fereți adulți masculi (în vârstă de 22-26 săptămâni) cu 1 mg ADN care codifică HA de la A'Georgia/93 sau cu 330 pg din fiecare ADN care codifică HA de la A/Hawaii/91 și NP și Ml de la A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții oe control au primit ADN care nu codifică sau o c:ză umană integrală (15 pg/tulpină) din vaccin integral autorizat pentru virusul gripal, (formularea 92-93) care conține A/Beijing/89 pe zilele 0 și 42. Fereții s-au provocat cu A/Georgia/93 pe ziua 56. S-a determinat rezidența virală din spălături nazale așa cum s-a descris mai sus. S-a comparat rezidența virală pe zilele 1-6 cu rezidența de la fereții care au primit ADN de control printr-o analiză în două moduri a variației. Rezidența virală la fereții care au primit ADN HA+NP+MI nu a fost diferită semnificativ de rezidența virală de la animalele care au primit ADN HA homolog (p=0,064).
- fig.36., Secvența pentru VIR.
Exemplul 1. Prepararea constructelor ADN care codifică proteinele virusului influenza uman
1) pnRSV-PRNP Gena A/PR/8(34/NP s-a izolat de la pAPR-501 (J.F.Y și colab.., Young în The origin of Pandemic Influenza Viruses, W.G.Lawer, Ed.(Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1983) ca un fragment EcoRI de 1565 baze-perechi, completat Klenow și donat în situl Xbal completat Klenow și tratat cu fosfatază al lui pRSV-BL. PRSV-BL s-a construit diferind, mai întâi vectorul pBL-CAT3 (B.Luckow și G.Schutz, Nuc.Acids Res.15,5490 (1987), Xho I și Nco I pentru îndepărtarea secvenței care codifică secvența CAT, s-a completat Klenow și s-a autoligat. Fragmentul promotor RSV s-a izolat ca Nde I și Asp 718 de la pRshgrnx (V.Giguere și colab.., Nature 330, 624 (1987), completat Klenow și donat în situl Hindlll al vectorului intermediar generat mai sus (pBL-CAT la care lipsește secvența CAT).
2) VI-NP. Vectorul de expresie VI s-a construit de la pCMVIE-AKI-DHFR (Y.Whang și colab.., J.Virol.61, 1796 (1987). Genele AKI și DMFR s-au îndepărtat prin secționarea vectorului cu EcoR I și autoligare. Acest vector nu conține intronul A în promotorii CMV, așa că el s-a adăugat ca un fragment PCR care a avut deletat situl intern SAC I (la 1885 după cum s-a numerotat în B.S. Chapman și colab.., Nuc.Acids.Rec. 19,397 (1991). Matrița folosită pentru reacțiile PCR a fost pCMVintA-Lux., făcut prin ligarea grafmentului Hind III și Nhe I de la pCMV6a120 (vezi B.S.Chapman și colab.., ibid.), care include intensificatorul /promotorul hCMV-IEI și intronul A în siturile Hind III și Xba I ale lui pBL3 pentru a genera pCMVIntBL. Fragmentul genei luciferazei de la 1881 baze-perechi (Hind lll-Sma I completat Klenow) de la RSV-Lux (J.R. de Wet și colab.., Mol.Cell Biol.7;725,1987) s-a donat fosfatază.
840
845
850
855
860
865
870
875
880
885
RO 117710 Β1
Primerii care înconjoară intronul A sunt
Primerul 5',Secv.lD Nr:5: 5-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3' Primerul 3',Secv.lD Nr:6: 5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3' Primerii folosiți pentru îndepărtarea șișului Sac I sunt: primerul sens, Secv.lD Nr:7: 5'-GTATGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3' și primerul antisens Secv.lD Nr:8: 5'-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3' Fragmentul PCR s-a tăiat cu Sac I și Bgl II și s-a inserat în vectorul care fusese tăiat cu aceleași enzime. Gena NP de la irnuenza A (A/PR/8/34) s-a decupat din pAPR501 (J.F.Youngși colab.., în The origin ofPandemic Influenza Viruses, W.C.Lawer, EcTEIsevier Science Publishing Co., Inc.1983), ca un fragment EcoR I și s-a teșit. El s-a insera: în VI-NP la situl teșit Bgl II pentru a face VI-NP. Plasmidele s-au propagat în E. coli și s-au purificat prin metoda lizei alcaline (J.Sambroo*. S.F.Britsch și T.Maniatis, în Molecular Cloning A Laboratory Manual, ediția a doua (Cod Spring Harbor Laboratory Press, 1989 . ADN-ul stratificat CsCI s-a precipitat cu etano’ ș· s-a resuspendat în soluție salină 0,9 % la 2 mg/ml pentru injectare.
Exemplul 2. Analiza limfocitely T citotoxice pentru virus influenza uman
Limfocitele T citotoxice s-au generat de la șoareci care s-au imunizat cu ADN sau care s-au recuperat de la infecție cu AHK/68. Culturi de control s-au derivat de la șoareci care au fost injectați cu ADN control și oe la șoareci neinjectați. S-au preparat suspensii de celule izolate, s-au îndepărtat eritrocitee prin liză cu clorură de amoniu și celulele izolate, sau îndepărtat eritrocitele prin liză cu cxxură de amoniu și celulele splenice s-au cultivat în RPMI 1640 suplimentar cu 10% ser fetal de bovine (FBS), 100 pg/ml penicilină. 100 u/ml streptomîcină, 0,01 M HEPES (pH= 7,5) și 2 ML-glutamidă. S-a adăugat un număr egal de celule autoloage iradiate stimulator, pulsate 60 min cu epitop peptidic restricționat H-2Kd NP147-155 (Thr Tyr Gin Arg Thr Arc Ala Leu Val, Secv.lD:9) la 10 pM sau infectate cu influenza A/PR/8/34 (MINI) și 10 p/ml IL-2 uman recombinat (Cellular products, Bufete, NY) și culturile s-au menținut 7 zile, la 37£C cu 5 % CO2 și umiditate relativă 100%. în experimente selectate, în locul celulelor autoloage stimulatoare s-a adăugat rhlL-2 (20 u/ml)șî ConA (2pg/ml). Activitatea efectoare a celulei T citotoxice s-a determinat cu celule P8115 marcate, timp, de 3 h, cu 60 pCi ^CR/ICf celule, și pulsate ca mai sus cu NP147-155 sau infectate cu influenza A/Victoria/73 (H3N2). Țintele control s-au etalat la 1 x 104/celde/godeu în plăci 96 godeuri și s-au incubat în tripiicate cu efectori, timp, de 4 h. Supematantuf (30 pl) s-a îndepărtat din fiecare godeu și s-a cuantificat într-un numărător de scintilație Setaplate (LKB-Wallac, Turku, FinlADN). S-au determinat pentru fiecare preparat țintă numerele maxime, eliberate prin adăugare de HCI.
M și numerele spontane eliberate fără CTL. S-a calculat procentul lizei specifice ca:(experimental-spontan)/(maxim-spontan)) x 100.
Exemplul 3. Producerea in vivo de CTL și anticorpi NP specifici.
Producerea in vivo de CTL și anticorpi NP specifici.
S-au injectat șoareci BALB/c în cvadriceps la ambele picioare cu plasmoîd cADN care codifică nucleoproteine A/PR/8/34 condusă, fie printr-un promotor de virus sarcoma Rous, fie citomegalovirus.
Vectorii expresie folosiți au fost
1) pnRSV-PRNP, vezi exemplul 1
2) VI-NP, vezi exemplul 1
RO 117710 Β1
Animalele folosite au fost șoareci femele BALB/c, obținuți de la Charles River Laboratorie, Raleigh. NC. S-au obținut șoareci în vârstă de 4-5 săptămâni și s-au injectat inițial cu ADN la vârsta de 5-6 săptămâni. în afară de cazul când s-a notat altfel, s-au administrat injecții de ADN în mușchii cvadricepși ai ambelor picioare, fiecare picior primind 50 I de soluție salină sterilă care conține 100 g ADN. Șoarecii au primit 1,2 sau 3 seturi de inoculări la intervale de 3 săptămâni. Animalele control negativ nu s-a injectat sau s-au injectat cu vectorii blanc corespunzător căruia îi lipsește gena NP.
Prezența sau absența plasmidului ADN NP în mușchiul animalelor selectate s-a analizat prin PCR (Gig. 1). Plasmidul ADD (fie ADN NP, fie ADN luciferază) s-a detectat în 44 din cei 48 de mușchi injectați testați. La șoarecii injectați cu ADN luciferază recuperată în extracte de mușchi, conform metodelor cunoscute în domeniu (J.A.Wofff și colab.., Science 247, 1465 (1990), G.Ascadi și colab.., Nature 352, 815 (1991), H.Lin și colab.., Circulation 82, 2217 (1990); R.N.Kitsis.și colab., proc.Natl Acad.Sci (USA), 88.4138(1991), E.Hansen și colab.., FEBS Letf.290.73, (1991); S.Jiso și colab.., Hum.Gene Therapy3, 21 (1992), J.A.Wolff și colab.., Human Mol.Genet 1, 363 (1992).
Expresia NP în mușchi, după injectare de ADN NP a fost sub limita detectării pentru analiza Western blot (sub 1 ng), dar s-a indicat prin producerea anticorpilor NP specifici (vezi fig.2).
Pentru analiza generării CTL specifice NP, s-au recuperat splinele la 1-4 săptămâni după imunizare și celulele splenice s-au restimulat cu IL-2 umană recombinată plus celule splenice autoloage care au fost, fie infectate cu influenza A(A/PR/8/34), fie au fost pulsate cu peptidă epitop a nucleoproteinei restricționată H-2Kd (reziduurile NP 147-155, vezi O.K.Rotzsche și colab.., Nature 348,252 (1990).
Celule splenice restimulate cu infectat viral sau cu celule singenice pulsate epitop au fost capabile să omoare celule țintă pulsate epitop nucleoproteină (fig.3A). Aceasta arată că injectarea i.m. de ADN NP a generat peptidă derivată NP corespunzătoare în asociație cu MHC clasa I pentru introducerea de răspunsuri CTL specifice. Aceste CTL au fost capabile de recunoașterea și lizarea celulelor țintă infectate viral (fig.3B), sau celule țintă pulsate cu peptidă epitop nucleoproteină restricționată H-2Kd și celule țintă infectate viral. Aceasta demonstează specificitatea lor, precum și abilitatea lor de a detecta epitopul generat în mod natural în celulele infectate.
O măsură mai stringentă a imunogenității vaccinului ADN NP a fost evaluarea răspunsului CTL primar. Celule splenice prelevate de la șoareci injectați ADN NPs-au activat prin expunere la Con A și IL-2, dar nefiind anterior restimulate în vitro cu celule care exprimă antigenitatea testării capacității lor de a omorî ținte corespunzătoare. Splenocitele de la șoareci imunizați cu ADN NP, când s-au activat în vitro cu Con A și IL, fără restimulare antigen specifică, au lizat, atât celule țintă pulsate epitop, cât și infectate viral (fig.3C și D). Această activitate litică a celulelor splenice restimulate, cât și activate apare favorabilă comparativ cu cea a splenocitelor tratate similar, derivate de la șoareci care au fost anterior infectați cu influenza A/HK/68 o tulpină virulentă H3N2 adaptată la șoareci, tulpină ce a apărut la 34 ani după A/PR/8/34(H1NI).
Astfel, infectarea ADN NP a generat CTL care au fost specifice pentru epitopul nucleoproteinei și care au fost capabile să identifice antigenul prelucrat natural (adică, au putut să omoare celule infectate viral).
De asemenea, s-au generat CTL NP în șoareci C3H și șoareci transgenici B6 care exprimă HLA-A2.
S-au detectat CTL în spline de șoareci BALB/c injectați cu o doză de 1 pg ADN NP (cea mai scăzută doză testată) (Tabelul 1).
935
940
945
950
955
960
965
970
975
980
RO 117710 Β1
Tabelul 1
Răspunsuri CTL la șoareci după o singură injecție ADN NP
| Inocul | Doză | Liză specifică | SC |
| ADN NP | 400 | 52,5 | 10.7 |
| 400 | 8,4 | 10.3 | |
| ADN NP | 200 | 75,6 | 5/ |
| 200 | 44,6 | 4/ | |
| ADN NP | 100 | 76,7 | 2.9 |
| 100 | 35,6 | 8.9 | |
| ADN NP | 50 | 62,9 | o.e |
| 50 | 76,7 | 74 | |
| ADN NP | 10 | 83,2 | 10.' |
| 10 | 37,7 | 2.5 | |
| ADN NP | 1 | 44,2 | 0.3 |
| 1 | 13 | 2 | |
| ADN control | 100 | 4,9 | 1 |
| Gripă | - | 79,3 | 8.3 |
Tabelul 1: Șoareci femele BALE/c (4-6 săptămâni) s-au injectat cu o doză unică de ADN NP A/PR/34 (VIJNP) sau ADN control (VIJ) la dozele indicate. Pentru comparație, șoarecii s-au infectat cu virus gripal A/PR/34. S-a obținut CTL după 8 săptămâni, s-au restimulat în vitro cu celule splenice singenîce pulsate peptidă NP și s-au analizat față oe celule P815 pulsate peptidă NP la un raport etector/țintă de 50:1. Datele sunt prezentate ca liză specifică % individual, pentru șoareci reprezentativi.
Experimentele următoare au arătat că șoarecii care au primit o doză de 1 pg au menținut CTL NP pentru cel puțin 4,5 luni (cd mai târziu punct de timp testat). Mărimea răspunsurilor CTL după injectarea cu ADN a fost comparabilă celor de la șoareci infectați înnuenza. Totuși, ar fi de ramarcat că analiza CTL după restimularea antigenică in vitro nu este strict cantitativă. Prin urmare,invenția a dezvoltat de obicei, analize de diluție limitată pentru a analiza mai precis nivelurile cantitative afe CTL NP specifice la șoareci. La șoarecii care s-au injectat cu 3 doze de 100 pg ADN NP, răspunsurile CTL s-au detectat la cel puțin 6 iuni după imunizare, (fig. 1). Deci, un PRV influenza are potențiatul de a genera răspunsuri CTL de lungă durată orientate spre antigeni gripali conservați.
Injectarea șoarecilor cu ADN NP a avut ca urmare producerea unui titru înalt de anticorpi IgG anti-NP (fig.2). Generarea titrului înalt de anticorpi IgG la șoareci este considerată ca necesitând celule Hei perr T CD4 (P.Vieira ADN K.Kajewsky, lnt.lmmunol.2, 487. (1990); J.J.Donnely și colab.., J.lmmunol, 145. 3071 (1990). Aceasta arată că NP exprimată de plasmid in situ s-a prelucrat pentru prezentare prin ambele clase I și II.
Exemplul 4. Protecția șoarecilor la provocare cu virus gripal uman virulent
Rolul anticorpilor la provocare cu virus gripal uman virulent.
Rolul anticorpilor NP în imunitatea de protecție față de gripă este dovedit prin două abordări: inițial, s-au determinat titrurile virale pulmonare într-un experiment de transfer pasiv. Șoareci femele BALB/c în vârstă de cel puțin 10 săptămâni s-au injectat intraperitoneat cu 0,5 ml de colectat seric (diluat în 2,0 ml PBS) de la șoareci care fuseseră injectați de 3 ori pe zi cu 200 pg de ADN NP. Șoarecii de control s-au injectat cu un volum egal de colectat seric normal, de șoarece sau cu colectat seric de la șoareci care s-au recuperat după infecție cu A/HK/68, de asemenea, în 2,0 ml PBS.
RO 117710 Β1
Doza de ser imun A/HK/68 s-au ajustat, astfel, încât titrul ELISA al anticorpului antiNP a fost egal celui din colectatul seric de la șoareci injectați ADN NP. Șoarecii s-au provocat neanesteziați în manieră oarbă cu 104 TCID50 de A/HK/68, 2 h după injectarea de ser și au primit o injecție suplimentară dintr-un volum egal de ser, 3 zile mai târziu. S-au sacrificat șoarecii la 6 la 7 zile după injectare și s-au determinat titrurile virale pulmonare în TCID^/ml așa cum s-a descris de către Moran (J.lmmunol. 146, 321, 1991).
Șoareci fără contact gripal anterior s-au infuzat cu antiser anti-NP, obținut de la șoareci care s-au injectat cu ADN NP și apoi s-au provocat cu A/HK/68. Provocările virale s-au realizat cu o tulpină A/HK/68 și s-au menținut în continuare, prin păstrare in vivo la șoareci (Dr.l.Mbawuike, comunicare personală). Stocul de însămânțare virala folosit a fost omogenat de plămâni de la șoareci infectați și a avut un titru de infectivitate 5 x 1O8.TCID5O/ml pe celule de MDCK.
Pentru studiile de determinare a titrului viral pulmonar și de pierdere în greutate s-au realizat provocări în manieră oarbă prin instilația a 20 pl care conțin 104 TCID30 pe nările șoarecilor neanesteziați, care conduc la infecția progresivă a plămânilor cu virus, dar infecția nu este letală la șoareci BALB/c (Yetter.R.A.și colab., Infect.lmmunity 29, 654, 1980). în experimente de supraviețuire șoareci s-au provocat prin instilarea a 20 μΙ care conțin 102·5 TCID5o pe nări sau anestezie totală cj ketamină și xilazină, infectarea șoarecilor anesteziați cu această doză provoacă o infecte pulmonară rapidă, care este letală pentru 90-100 % din șoarecii neimunizați (J.L. Schulrr.ai ADN E.D:Kilbourne, J.Exp.Med.118,257.1963; G.H. Scott ADN R.I.Sydiskis, Infect. Immunity 14, 698, 1976; R.A. Yetter și colab.., Infect.lmmunity 29, 654, 1980). Titrurile virale pulmonare s-au determinat printitrare serială pe celule MDCK (obținute de la ATCC. Rockville, MD), în plăci cu 96 godeuri, așa cum s-a descris de Moran și colab.., (Ibid).
Nu s-a observat nici o reducere în titrurile virale pulmonare la șoareci care au primit antiser anti-NP (6,3±0,2; medie ± SEM; n=4). Ca un control pozitiv, s-a colectat ser de la șoareci care au fost infectați cu A/HK/68 și s-a transferat pasiv la 4 șoareci fără experiența gripală. După o provocare cu A/HK/68 nu s-a detectat infecție virală în plămâni lor, indicând că acest ser împotriva virusului integra! a fost complet protector pentru provocare cu virusul omolog. în al doilea rând, șoarecii fără experiență gripală s-au imunizat cu NP purificat (5 pg/picior, de 3 ori într-o perioadă de 6 săptămâni) prin injectare i.m. Acești șoareci au generat titruri ridicate de anticorpi specifici NP, dar au eșuat în ceea ce privește producerea de CTL NP - specifice și nu au fost protejați de o doză letală de virus. Prin urmare, spre deosebire de efectul de neutralizare al anticorpilor pentru virus integral, IgG anti-NP din circulație nu conferă imunitate de protecție pentru șoareci.
S-a evaluat eficacitatea de protecție in vivo a injectărilor ADN NP pentru a determina dacă un răspuns imun mediat celulara fost funcțional în mod semnificativ. O măsură directă a eficacității răspunsului imun a fost capacitatea șoarecilor imunizați la început cu ADN NP de a rezolva o infecție pulmonară subletală progresivă cu o tulpină influenza homoloagă (A/HK/68,Ή3Ν2). Provocările virale s-au condus așa cum s-a descris mai sus. Șoarecii imunizați cu ADN NP au avut titruri virate pulmonare, după provocare, cu 3 ordine de mărime mai scăzute în ziua 7 (1,0 ±1,0; medie +SEM; n=4) decât cele ale șoarecilor de control care nu au fost imunizați ori care s-au imunizat cu vector blanc (4,5 ± 0,0; medie +SEM; n=4). De fapt, 3 din 4 șoareci imunizați au avut niveluri de virus în plămân nedetectabite. în timp ce 9 dintre controale au fost limitați de virus la acest moment. Diferențele substantiale în titrurile virale pulmonare observate în acest experiment și alte 6 demonstrează că răspunsul imun a accelerat îndepărtarea virusului. Lipsa efectului protector al vectorului blanc de control confirmă că nu ADN-ul a fost responsabil pentru răspunsul imun. Mai mult decât atât, deoarece tulpina virală de provocare, A/HK/68 (o tulpină virulentă H3N2 adaptată la șoarece) a fost heteroloagă față de tulpjna A/PR/8/34 (HINI) de la care s-a donat gena NP, imunitatea a fost în mod clar heterotipică.
1030
1035
1040
1045
1050
1055
1060
1065
1070
1075
1080
RO 117710 Β1
Ca o măsură a inducerii morbidității de către virus, s-a urmărit pierderea masei la șoareci care s-au injectat subletal cu influenza A/HK/68 după imunizare cu ADN NP (fig.4).
Drept controale s-au folosit șoareci nei^ectați sau injectați cu vector blanc. Șoarecii imunizați cu ADN NP prezintă pierdere de greutate mai mică și o mai rapidă revenire la greutățile lor dinaintea provocării după infecția gripală A comparativ cu șoarecii de controL
Infecția intranazală a șoareakx cu gripă A anesteziați total produce diminuarea rapidă a replicării virale în plămâni și moartea în 6-8 zile dacă infecția nu se controlează (R.A.Yetter și colab., Infect.ImmunityZS. 654 (1980). Supraviețuirea șoarecilor provocați prin această metodă reflectă capacitatea lor de a limita severitatea unei infecții pulmonare acute. S-a studiat capacitatea șoarecilor de 2 supraviețui provocării cu 2 tulpini gripale diferite., A/HK/68 (vezi fig.5) și A/PR/8/234. Șoarecii imunizați anterior cu ADN NP au prezentat o rată de supraviețuire de 90% comparativ cu 0% în cei injectați cu vector blanc și 20% in animalele de control neinjectate (fig.5). Dintr-un total de 14 astfel de cazuri studiate, șoarecii imunizați cu ADN NP au prezentat o rată de supraviețuire cu cel puțin 50 % mai mare decât controalele. Astfel, capacitatea răspunsului imun indus de ADN NP au prezentat o rată de supraviețuire cu cel puțin 50 % mai mare decât controalele. Astfel, capacitatea răspunsului imun indus ADN NP de a accelera eficient recuperarea și descreșterea bolii produse printrun virus dintr-o tulpină diferită care a acărut 34 ani mai târziu sprijină rațiunea alegerii unei proteine conservate pentru generarea răspunsului T limfocitar citotoxic.
Exemplul 5. Izolarea genelor de la izolate virale influenza
Multe dintre tulpinile influenza vechi sunt depozitate la ATCC (The 1990 Catalog ue of Animal Viruses & Antisera, Chlamydiae & Rickettsiae, 6lh Edition) enumera 20 tulpini influenza A și 14 tulpini influenza B).
A. Tulpini virale și purificare;
Tulpinile gripale cuprinse în vaccăiul curent din sezonul de gripă 1992 s-a obținut de la Dr.Nancy J.Cox de la Division of Viral ADN Rickeettsial Dieseses, Centers of Disease Control, Atlanta, GA. Aceste tulpini sunt: (1) A/Beijing/353/89 (H3N2); (2) A/Texax/36/91 (H1N1); (3) B/Panama/45/90; și 849 A/Georgia/03/93.
Toate aceste virusuri s-au crescut prin trecere în două embrioane de 9 -11 zile (excepție A/Georgia care s-a crescut în celule MDCK), (100 - 200 pe preparat viral) și s-au purificat printr-o modificare a metodei descrisă de Massicot și colab.., (Virology, 101, 242249 (1980). Pe scurt, suspensiile virale s-au clarificat prin centrifugare la 8000 rot/min (Centrifugă Sorvall RC5C, rotor 65-3 și apoi s-au paletat prin centrifugare la 16000 rot/min, timp de 2 h într-un rotor Beckman, Tip 19. Virusul paletat s-a resuspendat în STE (0,1 M NaCI, 20 mM Tris, pH =7,4, 1 mM EDTA) și s-a centrifugat la 4000 rot/min, timp de 10 min (centrifugă Herle Z 360 K) pentru îndepărtarea agregatelor. S-au depus 2 ml supematant pe un gradient discontinuu de sucroză obținută din 2 ml sucroză 60% acoperită cu 7 ml sucroză 30% tamponată cu ETE și s-a centrifugat la 36000 rot/min (Beckman, rotor SN-40) 90 min. Virusul grupat s-a colectat la interfață, s-a diluat de 10 ori cu STE și s-a paletat la 30000 rot/min, 2 h (rotor Bechman T>45). Virusul paletat la 30000 rot/min, 2 h (rotor Beckman Ti45). Virusul paletat s-a încheiat apoi, la -70°C.
B. Extracția ARN-ului viral și sinteza cADN
ADN-ul viral s-a purificat din virus înghețat prin extracție guanidină izotiocianat folosind un Kit accesibil comercial (Stratagens, La Jolla, CA) folosind metoda lui Chomaczynski și Sacchi (Anal.Biochim. 162,156-159. S-a preparat cADN dublu catonar de la ADN viral folosind un kit de sinteză cADN accesibil comercial (Pharmacia) după instrucțiunile fabricantului cu câteva modificări. Prima bandă cADN s-a inițiat folosind o oligodeoxiribonudeotidă 5AGCAAAAGCAGG-3', Secv.lD.Nr:30, care este complementară la o secvență conservată localizată la capătul terminal 3' al ADN-ului viral pentru toate genele tulpinii A Această
RO 117710 Β1 secvență este comună tuturor tipurilor de ADN-uri virale influenza A și prin urmare asigură o metodă pentru clonarea oricărei gene a virusului gripal tulpina A. După sinteza primei și celei de a doua benzi a cADN-ului reacțiile s-au extras cu fenol/cloroform și s-au precipitat cu etanol fără să se mai continue urmând instrucțiunile trusei. Aceste cADN-uri teșite la capete au fost apoi legate direct în vectorul VIJneo sau VI Jns care apoi, s-au digerat cu enzime de restricție BgLII, s-au teșit la capete cu ADN polimerază T4 și s-au tratat cu fosfatază alcalină intestinală de vițe'.
Pentru căutarea genelor virele particulare de lungime integrală s-au folosit oligodioxiribonucleotide sintetice care s-au denumit prin complementul capătul termina! 3' al capătului translațional al cadrului deschis de citire al unei gene de lungime întreagă prin cartografiere de restricție și determinarea mărimii pe electroforeze în geluri de agaroză, s-au verificat prin secvențarea dideoxinuclectidică a ambelor joncțiuni ale genei virale de VIJneo. Secvența joncțiunilor pentru fiecare genă donată de la aceste virusuri este daîă mai jos în exemplul 8.
Strategii similare s-au folos', pentru clonarea cADN-urilor de la fiecare dintre virusurile numite mai sus cu excepția d B/Panama/45/90 care nu are secvențe comune la fiecare capăt al ARN-ului viral, în aces: caz folosindu-se un amestec de oligodecxibonucleotide pentru inițierea sintezei primei senzi cADN.Acești primeri au fost:
(1) 5'-AGCAGAAGCGGAGC-3', Secv.lD Nr:31:pentru PB1 și PB2;
(2) 5’-AGCAGAAGCAGAGCA-3', Secv.lD Nr:19:pentru NS și HA;
(3) 5'-AGCAGAAGCACGCAC-3’, Secv.lD Nr:22: pentru M; și (4) 5'-AGCAGAAGCACAGCA-3', Secv.lD Nr:23:pentru NP.
Pentru genele care s-au donat prin PCR s-a folosit direct soluție de cADN teșit la capete, în reacții PCR ca matriță ADN. Primerii folosiți pentru clonarea celor 6 gene influenza obținute prin PCR sunt precum urmează:
1. Gena HA de la A/GeorgiaO3/93 primer sens: Secv.lD Nr:33
5'GGT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC 3' primer anti-sens:Secv,ID Nr34:
5' CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G 3'
2. Gena HA de la A/Texas/36/91 primer sens: Secv.lD Nr:35:
5'GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA GTC CTG TTA TG 3' primer anti-sens:Secv,ID Nr.36:
5' CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CAA AG 3'
3. Gena HA de la B/Panamaf45/90 primer sens:Secv,ID Nr:37:
5'GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA GTA CTA CTC ATG 3' primer anti-sens:Secv,ID Nr38:
5'CCA CAT TTA TAG ACA GAT GGA GCA AGA AAC ATT GTC 3'
4. Gena Ml de la A/Beijing/353/89 primer sens:Secv.lD Nr:39:
5'GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC 3' primer anti-sens:Sec,IS:40:
5’ CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC 3'
5. Gena NP de la B/Panama/45/90 primer sens: Secv.lD Nr:41:
5'GGT ACA TCC ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGC 3' primer anti-sens:Sec.lD:42:
1130
1135
1140
1145
1150
1155
1160
1165
1170
1175
RO 117710 Β1
5' CCA CAT GGA TCC TTA ATA ATC GAG GTC ATC ATA ATC CTC T
6. Gena Ml de la B/Panama/45/90 primer sens: Secv ID Nr:43:
5'GGT ACA GGA TCC ACC ATG RCG CTG TTT GGA ACA ATT GCC 3 primer anti-sens:Secv.lD Nr:44:
5' CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA TTT CTT CAC AAG AGC TG 3'
Toate clonele genei infiuenza, caca s-au generat cADN sau PCR, s-au verificat prin secvențare prin siturile de ligare în genă și expresia genei în celule RD transfectate. Expresia s-a detectat prin imunobloot.
Constructele NP și M1 pentru tulpina A/H3N2 (vectorii 4 și 5) s-au făcut de la genele A/Beijing/353/89. S-au ales aceste gene datorită gradului așteptat ridicat de conservare al genelor NP și Ml și datorită accesibilității lor.
Pornind de la cele anterioare s-au combinat, pentru formarea unui vaccin, un grup de 7 vectori de expresie preferați, grup care include:
1. VIJns-HA (A/Georgia/03/93) 6,56 Kt
2. VIJns-HA (A/Texas/35/91) 6,56 Kb
3. VIJns-HA (B/Panama/45/90), 6,61 Kb
4. VIJns-NP (A/Beijing/353/89) 6,42 Kc
5. VIJns-MI (a/Beijing/353/89 5,62 Kb
6. VIJns-NP (B/Panama/45/90) 6,54 Kc
7. VIJns-MI (B/Panama(45/90) 5,61 Kt
Secvențele relevante pentru joncțiunile acestor gene în vectori de expresie sunt date mai jos. Pentru confirmarea corectitudinii genelor donate a fost nevoie să se secvențeze doar porțiuni mici ale constructelor. Prin comparație cu gene similare cunoscute, este ușor să se confirme că gena dată este o genă NP, o genă HA, o genă Ml, etc. De exemplu, secvența genei HA A/Texas este foarte asemănătoare cu secvența genei HA A/Kîev/59/79, secvență care este accesibilă în GENBANK sub numărul de acces M38353. în mod asemănător, pentru secvența genei HA B/panama, care este foarte asemănătoare secvenței HA B/EnglADN/222/82, care de asemenea, este accesibilă în GENBANK sub numărui de acces MI8384. în același mod, poate fi confirmată identitatea oricărei secvențe donate pentru o genă dată de la oricare virus gripal uman. în fiecare din cazurile de mai jos, s-a confirmat, atât o secvență 5’, cât și o secvență 3' pentru asigurarea că a fost prezentă întreaga genă, în fiecare caz codonul ATG subliniat arată codonul de start pentru gena infiuenza. în timp ce secvența subliniată din porțiunea 3' este codonul stop.
1. VIJns-HA (A/Georgia/03/93) 6,56 Kb Secvența 5': (Secv.lD Nr:46.)
...TCA CCG TCC TTA GAT C/GG TAC AAC CATGAA GAC TAT CAT TGC TTT GAG CTA CAT TTT ATG TCT GGT TTT CGC...
Secvența 3' (Secv.lD Nr:47:)
...TCA TGC TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GGG TTC ATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTG TGC...
2. V1Jns-HA (A/Texas/36/91) 6,56 Kb:
Secvența 5': (Secv.lD Nr:48:)
...TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TGT GCATTT ACA GCT ACA TAT GCA...
Secvența 3': (Secv.lD Nr:49:)
...CTG GTC CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG/GAT CTG CTG TGC CTT...
RO 117710 Β1
3. VIJns-HA (B/Panama/45/90) 6,61 Kb:
Secvența 5’: (Secv.lD Nr:50:)
...CCT TAG ATC /GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG...
Secvența 3': (Secv.lD Nr;51:)
...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATCTGT CTA TAA ATG TGG/GAT CTG CTG TGC CTT...
1230
1235
4. VIJns-HA (A/Beijing/353/89) 6,42 Kb;
Secvența 5': /Secv.lD Nr:52:)
...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG AAT GCA ACT...
Secvența 3': (Secv.lD Nr:53:)
.. .GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AA.T GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...
5. V1 Jns-M1 (A/Beijing/353/89) 5,62 Kb
Secvența 5'; (Secv.lD Nr: 54;)
...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG GAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...
Secvența 3'; (Secv.lD Nr:55:)
...GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT GAT CTT CTT GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGA ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCT ATG TGG/GAT CTG CTG TGC CTT...
6. VIJns-NP(B/Panama/45/90) 6,54 Kb
Secvența 5': (Secv.lD Nr:56:)
...CTT AGATC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT...
SECVENȚA 3' /Secv.lD Nr:37:)
...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...
7. V1Jns-M1 (B/Panama/45/90) 5,61 Kb
Secvența 5': (Secv.lD Nr:58;)
...CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGC AAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA.. Secvența 3': (Secv.lD Nr:59:)
...AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAA GGA ATT GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGC TCT ATG GGA AAT TCA GCT CTT GTG AAG AAA TAC CTA TAA G/GA TCT GCT GTG...
1240
1245
1250
1255
1260
1265
1270
Exemplul 6. Vectorul de expresie VIJ, secvența ID Nr:10
Pentru crearea lui VIJ s-a urmărit îndepărtarea elementelor de inițiere și terminarea a transcripției din vectorul VI, în vederea înlocuirii lor cu un context mai definit, crearea unui vector mai compact și îmbunătățirea randamentelor de purificare a plasmidului. Vectorul VIJ
1275
RO 117710 Β1 este derivat de la vectorii VI (vezi exemplul 1) și pUC18, un plasmid accesibil comercial. Vectorul VI s-a digerat cu Sspl și EccRl care produs 2 fragmente ADN. Cel mai mic dintre aceste fragmente, care conține promotorul CMVintA și elementele de terminare a transcripției pentru hormonul bovin de creștere (BGH) care controlează expresia genelor heteroloage (Secv.lD Nr.H) s-a purificat, de la c electroforeză în gel de agaroză. Capetele acestui fragment de ADN au fost apoi “retezate” folosind enzima ADN polimerază T4, în vederea facilității ligării lui la alt fragment ADN ‘capăt-retezat”.
S-a ales pUCI8 pentru a asic_'a “miezul” expresiei vectorului. El este cunoscut a produce randamente înalte de plasmic este bine caracterizat prin secvență și funcșe și este de mărime minimă. Conform invenție s-a îndepărtat în întregime operonul lac din acest vector, care nu este necesar pentru scocurile urmărite și poate dăuna randamente^ plasmidului și expresiei genei heteroloage :rin digestie parțială cu enzima de restricre Haell. Plasmidul care a rămas s-a purificat de a o electroforeză în gel de agaroză, s-a teșit la capete cu ADN polimerază T4, s-a tratat cu fosfatază alcalină intestinală de vițel și s-a ligat la elementul CMVintA/BGH descris ma sus. S-au obținut plasmide care prezintă cele două orientări posibile ale elementelor promotoare din cuprinsul lui pUC. Unul din aceste dasmide a dat randamente mult mai mari ale ADN-ului în E.coli și s-a desemnat VIJ (Secv.lD Nr:10). Structura acestui vector s-a verificat ren analiza secvenței regiunilor de joncțiL-e și s-a demonstrat ulterior că, dă expresia aerelor heteroloage comparabilă sau mai ric cată față de VI.
Exemplul 7. Constructul gene . 'rusului influenza în vectorul de expresie VIJ
Numeroase gene ale tulpinii vrele influenza A/PR/8/34 s-au donat în vectorul de expresie VIJ, care, așa cum s-a remarcat în exemplul 4, produce expresie la niveluri tot așa de ridicate sau mai ridicate decât vectorul VI. Secvențele genei PR8 sunt cunoscute și accesibile în baza de date GENBANK 3entru fiecare din genele donate mai jos. s-a înregistrat mărimea fragmentului donat pre măsurare pe gel și este dat numărul de acces GENBANK față de care s-au compara: secvențele parțiale. Pentru o metodă de obținere a acestor gene de la tulpini virale, de exrenplu, de la virusul obținut de la ATCC (APR/8/34// este ATCC VR-95; sunt depozitate la ATCC numeroase alte tulpini), vezi exemplul 4.
A. Subclonarea genelor PR8 în VIJ
1. Gena NP
Gena NP s-a subclonat de la pAPR501 (J.F.Young, U.Desselberber, P.Graves, P.Palese, A.Shatzman ADN M.Rosenberg (1983) în The Origine of PADNemic Influenza Viruses, ed.W.G.Laver (Elsevier, Erriste-dam), pp.129-138. Ea s-a excizat prin secționarea pAPR5ol cu EcoRI, fragmentul s-a purificat pe gel și s-a teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul donat are o lungime de 1.6 kilobaze și s-a inserat în VIJ tăiat cu Bol II și, de asemenea, teșit cu ADN polimerază TA
2. NS
Gena NS s-a subclonat de la pAPR801 (J.F.Young, U.Desselberber, P.Graves, P.Palese, A.Shatzman și M.Rosenbercer (1983), în The Origins of pandemic Influenza Viruses, ed.W.G.Iaver, (Elsevier, Amsterdam, pp.129-138).
Ea s-a excizat prin secționarea pAPR8d cu EcoRI, fragmentul s-a purificat pe gel și s-a teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul donat are o lungime de 0,9 Kb (regiunea codificată completă incluzând NS1 și NS2).
3. HA
Gena HA s-a subclonat de la pJZ102 (J.F.Young, U.Desselberber, P.Graves, P.Palese, A.Shatzman și M.Rosenbercer (1983), în The Origins of pandemic Influenza Viruses, ed.W.G.Laver, (Elsevier, Amsterdam), pp.129-138.
RO 117710 Β1
Ea s-a excizat prin secționarea pJZ102 cu Hind III, fragmentul s-a purificat pe gel și s-a teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul teșit s-a inserat în VIJ tăiat cu Bel II și, de asemenea, teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul donat are o lungimea de 1.75 kb.
4. PB1
Gena PB1 s-a subclonat de la pGemi-PB1 (Joncțiunile 5' și 3' ale genelor vectorulului s-au secvențat pentru verificarea identității lor. Vezi J.F.Young, U.Desselberber, P.Graves, P.Palese, A.Shatzman și M.Rosenberger (1983), în The Origins of pandemic Influenza Viruses, ed.W.G.Laver, (Elsevier, Amsterdam), pp.129-138.
Ea s-a excizat prin tăierea pGem-PB1 cu Hind III, fragmentul s-a purifica:în gel și s-a teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul s-a inserat în VIJ tăiat cu Bgl II și, ce asemenea, s-a teșit cu ADN polimerază T4. Fragmentul donat a fost în lungime de 2,3 kc.
5. PB2
Gena PB2 s-a subclonat de la pGem1-PB2(Joncțiunile 5' și 3' ale gene or vectorului s-au secvențat pentru verificarea identității lor. Vezi J.F.Young, U.Desselberbe'. P.Graves, P.Palese, A.Shatzman și M.Rosenberger (1983), în The origins of pandenTc Influenza Viruses, ed.W.G.Laver, (Elsevier, Amsterdam), pp.129-138. Ea s-a decupa: prin tăierea pGem-PB2 cu BamH I și fragmente’ s-a purificat în gel. Fragmentul cu capetele adezive s-a introdus în VIJ tăiat cu Bglll. Fragmentul donat a fost de 2,3 kb.
6. Ml
Gena Ml s-a generat prin PCR de la plasmidul p8901 MITE. Secvența M din acest plasmid s-a generat prin PCR de la pAPR701 (J.F.Young, U.Desselberber, P.Grves, P.Palese, A.Shatzman și M.Rosenberger (1983), în The Origins of pandemîc Influenza Viruses, ed.W.G. Laver, (Elsevier, Amsterdam), pp.129-138), folosind oligomerul 5-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC-3', Secv.lD Nr:3 pentru primerul “sens” și oligomerul 5'-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG TTG CAT CTG CAC -3', Secv.lD Nr:4, pentru primerul “anti-sens. Fragmentul PCR s-a purificat în ge’. s-a tăiat cu Bgl II și s-a ligat în VIJ tăiat cu BGIII. Fragmentul donat a fost de 0,7 kb lungime. Capătul amino terminal al lui Ml este codificat în primerul “sens” prezentat mai sus ca codon “ATG”, în timp ce codonul stop al translației Ml este codificat prin codonul invers “TCA’, care în direcția sens este codonul stop “TGA*.
B. Constructe de expresie a genei VIJ-influenza în fiecare caz este prezentată joncțiunea secvențelor de la regiunea promotoare 5' (CMVintA) în gena donată. Secvențele s-au generat prin secvențarea primerului: primer CMVintA 5*-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3', Secv.lD Nr:28, care generează succesiunea secvenței care codifică. Poziția la care se întâlnește joncțiunea este delimitată prin “/”, care nu reprezintă vreo discontinuitate în secvență. Metoda pentru prepararea acestor constructe este prezentată sumar după toate secvențele de mai jos. Fiecare secvență dată reprezintă un construd ADN exprimabilă, completă și accesibilă pentru gena influenza desemnată.
Fiecare construd a fost transfectată temporar în celule RD (ATCC CCL36), o linie celulară cultivată de rabdomiosarcom uman. La 40 h după transfecție s-au recoltat celule și s-au rulat western bloot-uri (exceptând constructul VIJ-PR-HA care s-a testat la șoareci și a dat un anticorp specific anti-HA înaintea analizei Western blot, evitând astfel necesitatea unui Western blot pentru ca expresia să fie observată in vivo. Anticorpul specific pentru proteinele PB1, PB2 și NS a fost asigurat prin Stephen Inglis de la Universitatea Cambridge, care a folosit proteine purificate exprimate ca proteine fuzionate β-galactozidază pentru generarea de antiseruri. Antiser polidonat anti-NP s-a generat prin imunizarea iepurilor cu virus integral A/PR/8/34. Anticorpul anti-MI este accesibil comercial de la Biodesign ca un antiser de captă anti-gripă, număr de catalog B65245G. în fiecare caz s-a observat o proteină de mărime anticipată, care confirmă expresia in vitro a proteinei influenza codificate.
1330
1335
1340
1345
1350
1355
1360
1365
1370
1375
RO 117710 Β1
Nomenclatura acestor constructe a urmat convenția “numele vectorului-gsnă-tulpină de gripă. în fiecare caz, secvența a fost înregistrată față de secvențe cur-cscute din
GENBANK pentru secvența genei A/PR/8/34 donată și secvențată. Eficacitatea biologică a fiecăreia dintre aceste constructe este demonstrată ca în exemplele 2,3 și 4 oe mai sus.
1380 Joncțiunile 5' ale secvenței încrucișate a CMVINTA și genele gripei de la A.PR/8/34:
1. VIJ-PR-NP, Secv.lD Nr:12; GENBANK număr de acces M38278
5' GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG CMVintA NP.....
TAG ATA ATC ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG
1385 2. 1.VIJ-PR-PB1, Secv.lD Nr:13; GENEANK număr de acces J02151
5' ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC CMVintA PB1...
CAT TTG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTT AAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTT CCC TTA TAC
1390 3. VIJ-PR-NS, Secv.lD Nr:14; GENAEANK număr de acces JO2150
5' GTC ACC GTC CTT AGA TC/A AT~ CCA GCA AAA GCA GGG CMVintA NS......
TGA CAA AAA CAT AAT GGA TCC A-A CAC TGT GTC AAG CTT TCA GGT.- GA TTG CTT TCT TTG GCA TGT CCG CAA ACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG ~GA T...
1395 4. VIJ-PR-HA, Secv.lD Nr:15; GENAEANK număr de acces J02143
5' TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA. TC/A GCT TGG AGC AAA
CMVintA HA...
AGC AGG GGA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA ACC TAC TGG ~CC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG ACA CAA TAT GTA GCT ACC ATG CGA 1400 ACA ATT CAA CC....
5. VIJ-PR-PB2, Secv.lD Nr: 16; GENAEANK număr de acces J02153
5' TTT TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/C CGA ATT CCA
CMVintA PB2...
GCA AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAA TAA AAG AAC TAA GAA 1405 ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCA CCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG TGG ACC ATA TGG CCA TAA TCA AGA AGT...
6. Vij-PR-M1, Secv.lD Nr:17; GENABANK număr de acces J02145
5' GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ACC ATG AGT CTT CTA ACC
CMVintA M1
1410 GAG GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAA GAG TTG ACG GAA GA...
Cum s-au legat fragmentele:
1. VIJ-PR-NP: (Vector) Bglll teșit la EcoRI teșit (NP)
1415 2. VIJ-PR-PB1:(Vector) Bglll teșit la HinDIII teșit (PB1)
3. VIJ-PR-NS: (Vector) Bglll teșit la EcoRI teșit (NS1)
4. VIJ-PR-HA: (Vector) Bglll telit la HinDIII teșit (HA)
5. VIJ-PR-PB2: (Vector) Bglll adeziv la BamHI adeziv (PB2)
6. VIJ-PR-M1: (Vector) Bglll adeziv la Bglll adeziv (M1)
1420 M1 s-a obținut prin PCR, folosind ca matriță p8901-MITE și primeri care adaugă un sit Bglll la ambele capete 3 baze înainte de codonul de start ATG și exact după codonul de terminare pentru M1 (TGA).
RO 117710 Β1
Exemplul 8. Vectorul de expresie VIJnei, Secv.lD Nr:18
A fost necesar să se îndepărteze gena ampr folosită pentru selecția cfe antibiotice a bacteriilor care adăpostesc VIJ deoarece ampicilina nu se poate folosi în fermentatoare de mare capacitate.
Gena ampr din miezul pUC al lui VIJ s-a îndepărtat prin digestie cu enzimele de restricție Sspl și Eaml 1051. Plasmidul care a rămas s-a purificat prin electroforeză în gel de agaroză, s-a teșit la capete cu ADN polimerază T4 și apoi s-a tratat cu fosfează alcalină intestinală de vițel. Gena karf accesibilă comercial, derivată de la transpozond 903 și conținută în plasmidul pUC4K, s-a exczat folosind enzimă de restricție Pstl, s-a purificat prin electroforeză în gel de agaroză și s-= tratat cu ADN polimerază T4. Acest fragment s-a ligat cu miezul VIJ și s-au derivat plssmidele cu gena karf cu oricare orientare care s-au desemnat ca VIJneo numerele 1 $ 3. Fiecare dintre aceste plasmide s-a confirmat prin analiză cu enzime de restricție, secvențare ADN a regiunilor de joncțiune și s-a demonstrat că produc cantități similare de plasmid VIJ. Expresia produselor genei heteroioage pentru acest vector VIJneo a fost, de asemenea, comparabilă celei a vectorilor VIJ. S-a ales arbitrar VIJneo nr.1, 3, denumit în continuare VIJneo (Secv.lD Nr:18), care conține gena karfîn aceeași orientare ca gena amprdir, VIJ, precum constructul de expresie.
Genele de la fiecare dintreoinile A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91 ș B/Panama/ 46/90 s-au donat în vectorul VIJneo ca cADN-uri. în fiecare caz, secvențele joncțiunii de la regiunea promotoare 5' (CMVintA) or gena donată s-a secvențiat folosind primerukCMVintA 5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3', Secv.lD Nr:28, care generează succesiunea secvenței codificată. Aceasta este învecinată cu secvența de codificare/terminator, a cărei joncțiune este, de asemenea, prezentată.
Această secvență s-a genera? folosind primerul BGH 5'-GGA GTG GCACCT TCC AGG-3', Secv.lD Nr:29, care generează secvența benzii care nu codifică. în fiecare caz, secvența s-a verificat față de secvențele cunoscute din GENBANK pentru donarea și secvențarea genelor din acestea sau alte izolate influenza. Poziția la care se întâlnește joncțiunea este demarcată printr-un T. care nu reprezintă nici o discontinuitate în secvență, în cazul joncțiunii VI Jneo-TX-HA, geW de secvențare a fost comprimat și a fost dificil să se citească secvența inițială. Prin urmare, primele 8 baze la acea joncțiune s-au prezentat ca “N”. S-au confirmat aceste nucleotide și s-au dat nucleotidele identificate. Primul “ATG considerat în fiecare secvență este codonul de inițiere a translației pentru respectiva genă donată. Fiecare secvență dată reprezintă un construct ADN exprimabilă completă, accesibilă pentru gena influenza desemnată. Nomenclatura urmează convenția: “Numele vedorului gena-tulpina gripală”. Eficacitatea biologică a fiecăreia dintre aceste constructe este demonstrată în același mod ca în exemplele 2, 3 și 4 de mai sus.
SECVENȚA JONCȚIUNILOR 5’ ALE CMVintA ÎNCRUCIȘATĂ cu GENELE GRIPEI Șl ÎNCRUCIȘAREA JONCȚIUNILOR 5' ALE CMVintA cu GENELE GRIPEI Șl CONSTRUCTELE DE EXPRESIE A TERMINATORULUI BGH, FOLOSIND DIFERITE TULPINI Șl PROTEINE INFLUENZA
I. A/Beijing/353/89
A. VIJneo-BJ-NP:
PROMOTOR, Secv.lD Nr:20
5’ TCA CCG TCC TTA GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC
CMVintA NP...
ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT
GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT TERMINATOR, Secv.lD Nr:21
1425
1430
1435
1440
1445
1450
1455
1460
1465
1470
RO 117710 Β1
5' GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC
ACA GCA GAT / ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...
BGH NP...
II. A/TEXAS/36/91
A. VIJneo-TX-HA
PROMOTOR, Secv.lD Nr:24:
5-CCT TAG ATC/GGA AAT AAA AAC CAA AAT GAA CMVintA HA...
AGC AAA ACT ACT AGT CC... TERMINATOR, Secv.lD Nr.25 5' GCA GAT C/CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC TCA GAT...
BGH HA...
III. B/PANAMA/46/90
A. VIJneo-PA-HA
B. PROMOTOR, Secv.lD Nr.26 (Primele 1080 baze ale acestei secvențe sunt accesibile pe GENBANK cu numerele de acces M65171; secvența obținută mai jos este identică cu secvența cunoscută; Secvența 3' (Secv.lD Nr:27 de mai jos) nu a fost raportată anterior) 5' ACC GTC CTT AGA TC/C AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT
CMVintA HA...
ATC CAC AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC...
TERMINATOR, Secv.lD Nr:27 5' GGC ACA GCA GAT C/TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT AAT GGT AAC...
BGH HA...
Exemplul 9. Producerea de VIJns
S-a adăugat un sit Sfii la VIJneo pentru a facilita studiile integrării. S-a adăugat un linkerSfil de 13 baze perechi, accesibil comercial (New EnglADN BioLabs) la situl Knpl din secvența BGH a vectorului. S-a linearizat VIJneo cu Kpnl, s-a purificat în gel, s-a tratat cu ADN polimerază T4 și s-a ligat la linkerd teșit Sfii. S-au ales izolate donate prin cartografie restrictivă și s-au verificat prin secvențarea linkerului. Noul vector s-a desemnat VIJna (fig. 17). Expresia genelor heterotoaoe cu VIJns (cu Sfii) a fost comparabilă expresiei acelorași gene în VIJneo (cu Kpnl).
Exemplul 10. Prepararea vectorului VIR în efortul de a continua optimizarea vectorului de bază pentru vaccinare, s-a preparat un derivat al lui VIJns care s-a denumit VIR. Scopul pentru constructul acestui vector a fost de a obține un vector vaccin de mărime minimă, cu alte cuvinte, fără secvențele ADN care nu sunt necesare, care păstrează încă în întregime caracteristicile optimizate ale expresiei genei heteroloage și randamentele ridicate de plasmid pe care le permit VIJ și VIJns. S-a determinat din literatură, precum și experimental că (1) regiunile din miezul pUC care cuprind originea replicării pentru E.coli ar putea fi îndepărtate fără afectarea randamentului plasmidului din bacterie; (2) regiunea 3' a genei karf care urmează cadrului deschis de citire pentru kenamicină poate fi îndepărtat dacă în locul lui s-a insertat un terminator bacterian (3) aproximativ 300 bp de la jumătatea 3' a terminatorului BGH au putut fi îndepărtate fără să afecteze funcția sa reglatoare (după situl enzimei de restricție kpnl original în elementul BGH).
VIR s-a construit folosind PCR pentru sintetizarea a 3 fragmente ADN din VIJns reprezentând CMVintA promotor/BGH terminator, originea replicării și respectiv, elementele de rezistență la kenamicină. S-a adăugat pentru fiecare segment enzime de restricție unice la fiecare capăt de segment folosind ofigomerii PCR’.SspI și Xhol pentru CMVintA/BGH;
RO 117710 Β1
EcoRV și BamHI pentru gena karf: și Beli și Sall pentru orf. Aceste situri enzimatice s-au ales deoarece ele permit legarea drecțională a fiecăruia dintre segmentele ADN derivate
PCR cu pierderea ulterioară a fiecărui sit.
EcoRV și Sspl părăsesc ADN-urile teșite care sunt compatibile pentru igare, în timp ce BamHI și BCII părăsesc prelungirie complementare așa cum fac Sall și Xhol. De restricție corespunzătoare indicată mai sus și apoi s-au ligat împreună într-un singur amestec de reacție care conține toate cele 3 segmente ADN. Capătul 5' al lui orf a fost desemnat pentru includerea secvenței terminator independente T2 rho care este găsită de obicei în această regiune, astfel, încât ea a putut furniza informația de terminare pentru gena de rezistență la kanamicină. Produsul ligat s-a confirmat prin digestie enzimatică de restricție (mai mult de 8 enzime), precum și prin secvențarea joncțiunilor ligării. Randamentele de plasmid ADN și expresia heteroloagă prin folosirea genelor virale din VIR apare similară lui VIJns. Reducerea netă atinsă în mărimea vectorului a fost 1346 bp (VIJns= 4,86 kb; VIR=3.52 kb)., vezi fig.36, Secv.lD Nr:45. Secvențele oligomere folosite pentru sinteza VIR (siturite enzimei de restricție sunt subliniate și sunt identificate în parantezele care urmează secvenței):
(1) 5-GGT ACA AATATT GG CTATTG GCC ATT GCA TAC G-3’(sSPi), Secv.lD Nr:60, (2) 5-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAATTC TTC AGC ACC-3' (Xhol) Secv..id:61 (pentru segmentul CMVintABGH) (3) 5-GGT ACAGATATC GGA AAGCCACGTTGT GTCTCA AAATC-3' (EaxV), Secv.lD Nr:62;
(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC GTT ACA ACC-3'(BamHI). Secv.JD Nr:63; (pentru segmentul genei rezistente la kanamicină) (5) 5-GGT ACATGATCACGT AGAAAA GATCAA ACTTTCTTG-3'(Bcll), Secv.lD Nr.64, (6) 5-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC-3'(Sall), Secv.lD Nr:32 (pentru originea replicării E.coli).
Testul 1. Injecții intradermice ale genelor influenza
Modul pentru introducerea intradermică a genelor a fost același ca pentru introducerea intramusaculară, trei injecții a 200 pg fiecare, 3 săptămâni separate, de VI-PR-NP. S-au prelevat splinele pentru analiza in vitro. la 55 zile după cea de-a 3-a injecție și s-au restimulat cu nonapeptide epitopul nucleoproteinei 147-155, Secv. ID Nr:9. Celulele țintă (celule P815, de mastocitom de șoarece, singenice cu H-2d de șoarece BALB/c) s-au infectat cu virusul heterolog A/Victoria/73 și s-au lizat specific folosind celule splenice ca efectorla rapoarte efector: țintă 5:1 și 40:1. Controalele negative s-au realizat prin măsurarea lizei celulelor țintă care nu s-au infectat cu un virus gripal. Controalele pozitive s-au realizat măsurând liza celulelor infectate cu virus gripal prin celule splenice obținute de la un șoarece care s-a infectat de 3 ori cu 130 pg VI-PR-NP și care a supraviețuit unei infecții cu virus influenza viu aparținând tulpinii A/HK/68.
Rezultate: Liza specifică s-a atins folosind celule splenice de la șoareci ir^ectați intradermic la toate rapoartele efector: țintă.
Nu s-a observat nici o liză specifică atunci când s-au folosit ca efector celule splenice obținute de la șoareci neinjectați sau șoareci injectați cu vectorul VI lipsit de gena inserată
PR-NP. în plus, liza specifică obținută folosind eliberarea intradermică a fost comparabilă la toate rapoartele efector: țintă cu rezultatele obținute folosind eliberarea intramusculară.
S-au măsurat, de asemenea, titrurile virale pulmonare la șoarecii injectați intradermic sau intramuscular. Folosind 5 șoareci/grup, 3 doze de 200 pg în 3 săptămâni după ultima doză, rezultatele au fost după cum urmează:
1525
1530
1535
1540
1545
1550
1555
1560
1565
RO 117710 Β1
Tabelul 2
| Vaccin | Mod de eliberare | Titrul pulmonar la șoarea* | |
| Ziua 5 | Ziua 7 | ||
| VI-PR-NP | Intradermic | 5,2+0,2 | 4,1+1” |
| VI | Intradermîc | 5,9+1 | 6,6+0,3 |
| VI-PR-NP | Intramuscular | 4,6+0,4 | 4,5+1,1” |
| Nici unul | 6,2+0,3 | 5,9+0,3 |
* Titru medie log *SEM
Un șoarece nu a avut nici un virus în final, s-a testat procentul de supraviețuire la șoareci în ziua 28. în ziua 28 au supraviețuit 89 % dintre șoarecii care au primit VI-NP-PR dintre receptorii i.m. și 50 % dintre receptorii id. Nu a supraviețuit nici unul dintre șoarecii tratați cu vectorul VI și doa' 30 % din șoarecii netratați. Acest experiment demonstrează că ADN-ul care codifică nucteoproteine de la tulpina A/PR/34 a fost capabil să inducă CTL care recunosc nucleoproteine de la tulpina A/PR 34 a fost capabil să inducă CTL care recunosc nucleoproteine de la tulpina heteroloagă A/Victoria/73 și un răspuns de protecție imună față de tulpina heieroloagă A/HK/68.
Testul 2. Vaccinarea polinucleotidică a primatelor
1. Anticorpul pentru NP la maimuțe Rhesus
S-au injectat im maimuțe Rhesus (006 NP, 009 NP sau control 101;021) local cu 1 pg de RSV-NP în 3 locuri pe ziua 1. S-au făcut la aceleași momente, în locuri separate, injecții de 1 mg fiecare RSV-LUX și CMV-int-LUX, constructe pentru gena de referință a expresiei luciferazei de licurici. Animatele s-au reinjectat pe ziua 15 cu același cantități de ADN ca înainte și, de asemenea, cu 1 mg de pD5-CAT, un construct pentru gena de referință pentru expresia cloranfenicol a cetii transferază, fiecare într-un loc. S-a făcut biopsia siturilor musculare care conțin genele de referință și s-au analizat pentru activitatea genei de referință. S-a colectat ser după 3,5.9,13 și 15 săptămâni după prima injectare. Prima probă pozitivă pentru anticorp anti-NP s-a colectat la săptămâna 11 și s-au colectat de asemenea, probe pozitive în săptămânile 13 și 15. Anticorpul anti-NP s-a determinat prin ELISA. Rezultatele sunt prezentate în fig.9.
2. Anticorpul de inhibare a hemoglutinării (HI) la maimuțe Rhesus
S-au injectat i.m. maimuțe cu VU-PR-HA pe ziua 1. Câte 2 animale, au primit fiecare 1 mg sau 100 pg ADN în fiecare mușchi cvadriceps. Fiecare injecție s-a administrat într-un volum de 0,5 ml. S-a luat sânge de la animale înaintea injectării din ziua 1. Toate animalele s-au reinjectat cu ADN pe ziua 15 și apoi s-a colectat sânge la intervale de 2-4 săptămâni. Titruri de inhibare a hemoglutinării (HI) față de A/PR/8/34 au fost pozitive la săptămânile 5, 9 și 12, după prima injectare a ADN-ului VIJ-PR-HA. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3 de mai jos:
RO 117710 Β1
Tabelul 3
Titrul de anticorp HI la maimuțe Rhesus care au primit AND V1J-PR-HA
| Rhesus nr. | Doza | Titrul anticorp HI la săptămâna nr. | ||||
| Pre | Săpt.3 | Săpt.5 | Săpt.9 | Săpt.12 | ||
| 88-010 | 1 mg | 10 | 10 | 320 | 320 | 320 |
| 88-0200 | 1 mg | 10 | 10 | 10 | 40 | 40 |
| 88-021 | 100 g | 10 | 10 | 10 | 40 | 20 |
| 90-026 | 100 g | 10 | 10 | 20 | 20 | 40 |
| 88-084 | 10g | 10 | 20 | 40 | 20 | 10 |
| 90-028 | 10 g | 10 | 10 | 20 | 10 | 10 |
1610
1615
Testul 3. Studii de vaccin polinucleotidic la fereți
1. S-a inițiat un studiu al vaccinării polinucleotidice la fereți cu scopul determinării dacă animalele ar putea fi protejate ce infecția gripală A prin imunizare cu gene care codifică fie HA (o proteină de suprafață capabilă să inducă anticorpul de neutralizare specific de tulpină), fie proteina internă NP, NS1. PB1, M (considerate a induce un răspuns imun mediat celular ce ar putea fi independent de tulpină). Animalele s-au injectat cu ADN care codifică diferite gene influenza în vectorul VIJ. așa cum se prezintă în tabelul 4, de mai jos:
1620
1625
Tabelul 4
| Grup | Construct | Doză | Nr. animale | Provoc. HINI | Provoc H3N2 |
| 1 | VIJ-HA | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 2 | VIJ-NP | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 3 | VIJ-NP+ NS1+PB1+PB2+M | total 2000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 4 | VIJ- HA+NP+NS1+PB1+PB2+M | total 2000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 5 | VIJ | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 6 | Nici una | Nici una | 10 | 5 | 5 |
| Total animale | - | - | 90 | 45 | 45 |
1630
1635
2. în zilele 22 și 43 postimunizare, s-a colectat ser de la animale imunizate și s-a analizat pentru anticorpi de neutralizare (Ml-care inhibă homoglutinarea) și pentru anticorpi de neutralizare (Ml-care inhibă homoglutinarea) și pentru anticorpi pentru nucfeoproteină (NP) prin ELISA. Animalele care au fost injectate cu ADN au exprimat anticorpi pentru genele corespunzătoare. Aceasta se reflectă în fig. 10, 11 și 16 anexate.
3. în ziua 128, animalele imunizate selectate s-au provocat cu 1200 TCIDgo de influenza A/HK/68. Această tulpină este heteroloagă tulpinii A/PR/8/34 care a fost sursa secvențelor de codificare folosite pentru imunizare și prin urmare, protecția indică imunitate bazată pe mediere celulară, mecanisme de imunitate independente de tulpină. Așa cum s-a
1640
RO 117710 Β1 arătat în fig. 12 anexată, s-a observat o reducere statistică semnificativă în rezidența virală la animalele imunizate cu ADN care codifică proteine interne comparat la controale, confirmând că imunizarea polinucleotidică la fereți este capabilă să producă răspuns imun și că asemenea răspunsuri sunt protectoare.
4. Este testată similar o provocare omoloagă care folosește A/PR/8/34 și este demonstrată în mod similar eficacitatea de protecție a anticorpului de neutralizare indus prin vaccinare polinucleotidică.
Testul 4.
1. Răspunsuri imune umorale
Injectarea ADN-ului care codifică HA, NP și Ml gripal a avut ca rezultat răspunsuri imune umorale la șoareci, fereți și primate non-umane (incluzând maimuțe africane vezi și maimuțe Rhesus). Până acum s-a dovedit a genera anticorpi PNV-uri care conțin gene HA donate de la tulpinile A/PR/34, B/Panama/90, A/Beijing/89, A/Texas/91, A/Hawaii/91 și A/Georgia/93 ale virusului gripal.
A) Șoarece
S-au detectat prin ELISAÎn ser ce la șoareci după injectarea ADN-ului, anficorpi (104106) s-au generat cu 1 pg de ADN NP (A/PR34) administrat o dată (cea mai mică doză testată), provocați de circa 2 săptămâni după injectare (cel mai devreme momem. de timp testat) și nu au scăzut timp, de cel puțn 5 luni după injectare. Acești anticorpi N~ nu sunt neutralizați și nu participă la protecție. Tc*.uși, ei demonstrează expresia proteinei NP in vivo, după injectarea ADN-ului. Spre deosetxre de aceștia, anticorpii pentru HA asigură imunitate protectoare față de tulpina omoloagă a virusului gripal. Injectarea ADN-ului HA donat de la tulpina A/PR/34 are ca urmare producere a anticorpilor de neutralizare, așa cum s-a măsurat in vitro, printr-o analiză de inhibare a hemoglutinării (HI). S-au măsurat titruri HI mai mari sau egale cu 1280 la numeroși șoareci la care s-au dat 3 doze de 100 pg ADN HA și s-au observat titruri detectabile la acele animale care au primit 2 doze mici, de 0,1 pg. A existat o legătură doză-răspuns între titru HI și doza ADN, precum și între titru Ml și numărul infecțiilor. (Tabelul 5).
Tabelul 5
| Doza (pg) | GMT HI Numărul dozelor | ||
| 1 | 2 | 3 | |
| ADN HA(100) | 75 | 106 | 260 |
| ADN HA(10) | 37 | 69 | 86 |
| ADN HA(1) | 10a | 13 | 24 |
| ADN HA(0,1) | 10b | 10a | 10* |
| ADN HA(100) | 10b | 10b | 10c |
| neinjectat | - | 10b | - |
Tabelul 5: S-au injectat șoareci BALB/c femele (4-6 săptămâni) cu A/PR/34 ADN HA (VIJHA) la dozele indicate, o dată, de două ori sau de trei ori la intervale de 3 săptămâni. Controalele negative au inclus șoareci injectați cu ADN control constând din vectorul lipsit de genă inserată (VIJ) și șoareci neinjectați fără contact anterior cu gripa. S-au colectat probe de ser la. 7 săptămâni după doza 1 și s-au analizat pentru prezența anticorpilor de inhibare a hemaglutinării (HI). Datele sunt reprezentate ca medie geometrică a titrului HI, unde: n=10 a acei șoareci testați pozitiv pentru titruri HI 6 toți șoarecii
RO 117710 Β1 în fiecare șoarece testat, prezența anticorpilor HI s-a corelat cu protecția într-un model de provocare homoloagă. Răspunsurile anticorp HI la șoarecii injectati cu ADN HA, după cum s-au măsurat prin ELISA s-au generat, de asemenea, la șoareci folosind ADN HA de la tulpini A/Beijing/89, B/Panama/90 și A/Texas/91 ale virusului gripal.
Bazat pe o lucrare din literatură care a demonstrat expresia mai scăzută a genei de referință după injectarea ADN-ului la șoareci mai în vârstă, s-a testat efectul vârstei asupra răspunsurilor imune umorale pentru HA. Datorită lipsei șoarecilor femele îmbătrânite virgine, s-au folosit hibrizi izolați de aproximativ 10 luni, s-au comparat hibrizii izolați și șoareci virgini de 4-6 săptămâni asupra capacității lor de a genera anticorpi HA după injectare de ADN HA la doze la fel de mici ca 1 pg (cea ma; scăzută doză testată), titrul ușor mai scăzut la șoarecii mai tineri. (Tabelul 6).
Tabelul 6
1695
1700
1705
Efectul vârstei asupra răspunsurilor imune umorale
| Inocul | Doză | GMT (4-6 săpt) | GMT (10 luni) |
| ADN HA | 100 | 1034 | 110 |
| ADN HA | 10 | 338 | 68 |
| ADN HA | 1 | 80 | 20 |
| ADN control | 100 | 5a | 5a |
| neinjectați | - | 5a | 5a |
| gripă | - | 538 | 36 |
1710
Tabelul 6: Șoareci BALB/c femele (virgine în vârstă de 4-6 săptămâni și hibrizi izolați de 10 luni) s-au injectat cu A/PR/34 ADN HA (VIJHA), la dozele indicate, de 3 ori. la intervale de 3 săptămâni. Controalele negative au inclus șoareci injectați cu ADN control (VIJ) și șoareci fără contact anterior cu gripă, neînjectați. Pentru comparație, s-au infectat alți șoareci cu o doză subletală de influenza A/PR/34. S-au colectat probe de ser la 9 săptămâni după prima doză și s-au analizat pentru titru HI. Datele sunt prezentate ca medie geometrică a titrului HI, unde:
n=15, a toți șoarecii testați negativ pentru titru HI
Totuși acesta nu a fost un rezultat al însă și PNV, ci mai degrabă o capacitate diminuată la șoarecii mai bătrâni de a genera răspunsuri imune umorale, în general deoarece șoarecii mai bătrâni prezintă, de asemenea, răspunsuri HI mai scăzute decât șoarecii mai tineri după infectarea cu virusul viu A/PR/34. De fapt, anticorpii HI au apărut a fi mai puțin dispersați la șoarecii în vârstă vaccinați ADN, decât șoarecii în vârstă infectați influenza. Mai mult decât atât, hibrizii izolați folosiți în aceste studii au fost cu aproximativ 50% mai productivi decât virginii tipici de aceeași vârstă, care, bazat pe studiile altora, care folosind la șoareci diete restricționate caloric, ar fi putut avea un efect dăunător asupra răspunsurilor imune ale acestor animale. Din acest motiv, precum și din din alte motive, răspunsurile imune ale acestor șoareci nu pot fi reprezentative. Totuși, vârsta (cel puțin până la 10 luni) nu apare a reduce semnificativ capacitatea vaccinării polinucleotidice de a induce răspunsuri imune umorale, chiar la doze de ordinul a 1 pg.
1715
1720
1725
1730
1735
RO 117710 Β1
B) Fereți
Răspunsurile imune umorale s-au generat la animale injectate cu ADN HA de la tulpinile virale influenza A/PR/34, A/Beijing/89, A/Hawaii/91 și A/Georgia/93. S-au produs prin PNV corespunzătoare anticorpi HI împotriva A/PR/34 și anticorpi ELISA împotriva HAurilor de la alte tulpini. S-au găsit seruri de la fereți injectați cu ADN-uri HA A/Beijing/89, A/Hawaii/91 și A/Georgia/93 având anticorpi HI și anticorpi de neutralizare, deoarece aceste animale au fost protejate de provocarea virală.
C) Primate non-umane (De asemenea, vezi testul 2)
S-au imunizat de două ori maimuțe Rhesus cu ADN HA (A/PR/34) la doze ce 10,100 și 1000 pg și una din 2 maimuțe cu dcze de 10 pg au avut un HI de 80. Mai depene serurile s-au analizat până la 13 luni; titrurile HI nu au scăzut apreciabil de la luna 6-13 (Tabelul 7)
Tabelul 7
Generarea anticorpilor Ml în maimuțe Rhesus
| Doză (pg) | Pre | 1 lu-.ă | 2 luni | 5,5 luni | '.3 luni |
| 2000 | 10 | 320 | 160 | 80 | |
| 2000 | 10 | 40 | 20 | 20 | |
| 200 | 10 | s: | 40 | 40 | 80 |
| 200 | 10 | 80 | 80 | 40 | 20 |
| 20 | 10 | 40 | 20 | 20 | 20 |
| 20 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
Tabelul 7: Maimuțele Rhesus (etăl masculi, cât și femele) în domeniul de mărime de
4,3 până la 8,8 kg, s-au injectat cu ADN HA A/PR/34 (V1JHA) la dozele indicate, te săptămânile 0 și 2. S-au colectat probe de ser la momentele indicate după prima doză și s-au analizat pentru titru HI. Datele reprezintă titruri HI pentru animale individuale.
La maimuțele africane verzi injectate cu o combinație PNV conținând 100 pg ADN HA (A/Beijing/89), evaluarea serurilor te 4-6 săptămâni post prima doză, a arătat un GMT de 29 (răspuns 8/9). Aceasta se prezintă favorabil comparativ cu răspunsurile la vaccinurile autorizate, subvirionic (GMT de 16, răspuns 5/6) și virionic integral (GMT=36, răspuns 6/6) la același moment de timp (fig. 18). S-a observat un moment de revenire marcat te cea de a doua imunizare la animalele care au primit o doză de 10 pg ADN HA (GMT=1,9. după o doză și 199 după două doze). Vaccinul autorizat de virion integral a demonstrat un efect de revenire similar, în timp ce titrurile HI produse prin a 2-a doză de vaccin subvirionic au fost numai trecătoare. Până în prezent, s-au măsurat niveluri similare ale anticorpilor HI la 18 săptămâni la animale imunizate, atât cu doze de 10 pg, cât și cu 100 pg ADN HA, comparate cu cele mai bune vaccinuri autorizate (virion integral). Aceste rezultate demonstrează că PNV a fost eficient, cel puțin pentru generarea anticorpilor de neutralizare la fel ca vaccinul virion integral și superior vaccinului subvirionic; cu toate acestea, ele nu au fost testate la primatele non-umane. în acest studiu PNV a conținut un amestec pentavalent de ADN-uri care codifică HA de la A/Beijing/89, B/Panama/980 și A/Texas/91 și NP și M1 de la A/PR/34, în vederea desemnării unui candidat de vaccinare. De asemenea,s-au testat aceste animale pentru generarea răspunsurilor imune umorale față de alte componente ale vaccinului și s-au detectat anticorpi pentru HA B/Panama/90 și NP A/PR/34. într-un experiment separat s-au indus anticorpi de neutralizare și anticorpi HI față de A/Texas/91, HA prin injectare a 2 doze de ADN HA donat PCR.
RO 117710 Β1
2. Răspunsuri imune mediate celular
Vezi exemplul 3 de mai sus
3. Generarea răspunsurilor imune
A) Imunitate umorală
Evenimentele care duc la producerea răspunsurilor umorale și mediate celular, după injectarea de ADN nu au fost încă elucidate. Pentru producerea anticorpilor de neutralizare (de exemplu, împotriva HA viral imiuenza), este probabil că celulele trebuie să exprime antigenul pe membrana plasmatică sau să îl secrete în mediul extracelular. în plus, celulele transfectate ar putea exprima HA cu structură secundară, terțiară și cuatemară celei din virion. într-o analiză de rozetare, s-a demonstrat expresia la suprafața celulei a HA în celule RD (rabdomioblastică) transfectate temporar cu ADN HA. Eritrocitele au aglomerat la suprafața celulelor transfectate HA, dar ru și la celulele transfectate simulat, indicând că HA nu s-a exprimat pe suprafață doar, c de asemenea, și-a păstrat conformația caracteristică pentru legare la proteine care conțin acid sialic.
B) Imunitate mediată celula
Generarea răspunsurilor imune mediate celular (de exemplu, împcrva NP viral influenza) necesită prelucrarea proclitică și prezentarea peptidelor derivate c n aceasta în asociere cu MHC clasa I. Natura arrecenului prezentat celulei ce duce la genererea răspunsurilor imune după injectarea ADN-- ui încă nu este cunoscută. Celule musc^ are exprimă niveluri scăzute de MHC clasa I și n» sunt considerate a exprima costimulato' molecule pe suprafețele lor. Prin urmare, celulele musculare, în general, nu sunt considerare a fi celule de prezentare de antigen. Totuși, unele trăsături ale evidenței sugerează că celulele musculare sunt implicate în generarea de răspunsuri imune după injectare im de ADN. în primul rând, s-a demonstrat o limită de supraviețuire a țesuturilor capabile de intemalizare a plasmidului ADN dezvelit care duce la expresia proteinei in situ, numeroase tipuri de celule putând exprima gene de referință când se injectează plasmidul în țesut, dar substanțial mai puțin eficient decât celulele musculare. O analiză completă a absorbției ADN-ului de către celule non-musculare după injectare i.m. nu a fost însă raportată, dar este probabil că absorbția ar putea fi chiar mai puțin eficientă. în al doilea rând, expresia genelor de referință după injectare i.m. de ADN s-a demonstrat în celule musculare scheletice și cardiatice în numeroase specii diferite. în al treilea rând, deși se pot genera răspunsuri CTL după injectarea ADN-ului pe alte căi (iv și id), cele mai bune răspunsuri imune de protecție s-au produs în șoareci după injectarea i.m. a ADN-ului. în al patrulea rând, mioblastele și micocitele pot fi recunoscute și lizate in vftro prin CTL și această liză poate fi sporită prin pretratare cu interferon care reglează expresia MHC clasa I. în sfârșit, transplantarea de mioblaste care exprimă NP transfectate stabil, la șoareci singenici fără experiență gripală are ca rezultat generarea in vivo de răspunsuri imune protectoare mediate celular (fig.20). Prin urmare, expresia antigenilor de către celule musculare este suficientă pentru inducerea răspunsurilor imune de protecție observată după injectarea ADN. Mai mult decât atât, absorbția și expresia ADN-ului de către celule non-musculare, nu este necesar să fie luată în considerare pentru generarea imunității de protecție. Din punctul de vedere al nucleotidelor ca vaccinuri, ar putea fi potențial avantajos să se limiteze absorbția ADN la celule musculare. în primul rând, micocitete sunt diferențiate final și nu se divid. Aceasta poate fi importantă pentru micșorarea posibilității de integrare a plasmidului ADN în ADN cromozomal și menținerea unei expresii persistente a antigenului, care a putut duce la răspunsuri imune de lungă durată. în al doilea rând, miocitele sunt celule mari, multinucleate, ce pot fi regenerate prin fuziunea mioblastelor.
Aceasta poate ajuta să se explice de ce injectarea ADN-ului duce la expresia proteinei care poate persista potențial perioada lungi de timp fără evidențierea distrugerii citolitice prin CTL.
1785
1790
1795
1800
1805
1810
1815
1820
1825
1830
RO 117710 Β1
1835
1840
1845
1850
1855
1860
1865
1870
1875
Testul 5
Studii de protecție
Imunizarea cu ADN care coc'fică antigene virale influenza asigură protecția de moarte și boală și reduce încărcările virale la o diversitate de combinații ale tulpinilor influenza, folosind 2 modele animale acceptate pe larg pentru infecția gripală umană (șoareci și fereți)
1. Protecția heteroioagă (heteretipică, comună de grup) nu este asigurare eficient prin vaccinul autorizat de virus omorât dar a fost asigurată prin vaccinare ADN în modele animale. Această protecție s-a demonsrat când ADN-ul care codifică NP sau M1 s-a injectat în animale de laborator. Răspunsul imir interactiv mediat celular (CMI) s-a indus prin aceste ADN-uri care au asigurat un răspuns ce protecție.
a) Șoareci
S-au injectat i.m. șoareci BALE c și C3H cu ADN care codifică NP de la A'PR/34 și s-au protejat de moarte și boală (testare prin reducere în greutatea corporală) când s-au provocat prin infecție pe întregul tract 'aspirator cu o LD90 a A/Hong Kong/78 H3N2), o tulpină heterotipică (H3 față de H1 perere A/PR/34). Fig. 21 prezintă supraviețuirea șoarecilor BALB/c imunizați de 3 ori cu ADN NP(200 pg/doză) la intervale de 3 ssrremâni și provocați la 3 săptămâni după ultima ir.nizare. Fig. 22 arată inhibarea pierderii oe greutate după provocare la șoareci imunizați cc~carată cu pierderea severă de greutate ccservată la șoarecii de control. Fig. 23 prezintă 'educerea încărcării virale pulmonare la 7 zle după provocarea tractului respirator a șoarec cr imunizați cu ADN NP comparat cu șoarecii care au primit ADN control care nu codifică șoarecii imunizați cu ADN NP au fost corolet protejați de moarte, au prezentat o pierdere redusă în greutate și au arătat o încărcare virală în plămâni mai scăzută cu șoarecii de control. S-a dovedit că o cantitate mai mică sau egală cu 6,25 pg per injecție de ADN NP este necesară pentru protejarea șoarecilor de moarte și pierdere în greutate când s-au dat 3 injecgl de ADN (fig.24). Protecția produsă prin imunizare cu ADN NP s-a dovedit a persista în esență neschimbată la șoarecii imunizați timp de cel târziu 3 luni. Nivelul de protecție a persistat până la 6 luni, dar a scăzut ușor, între lunile 3 și 6 după ultima imunizare. Cu toate acestea, revaccinarea cu o injecție unică de ADN NP la 22 săptămâni a refăcut în întregime protecția (fig.25). Astfel, imunizarea șoarecilor cu ADN NP a produs o protecție de luncă durată, heteroioagă și care se poate reinstaura. Capacitatea de a genera un răspuns anamnezic pe revaccinarea acestor animale sugerează că prin imunizare ADN NP a fost indusă memorie imunologică.
b) Fereți
Fereții sunt un model folosit de obicei pentru infecție influenza umană deoarece ei sunt susceptibili la infecție cu o varietate de izolate umane ale virusului gripal. Replicarea virală la fereți se întâlnește predominant în nări și trahee și nu se extinde aproape de loc în plămâni, spre deosebire de șoareci la care încărcarea virală în plămâni este mare. Infecția la fereți este urmată cel mai rapid de titrarea virusului în fluidul de spălătură nazală. Fereții imunizați cu ADN NP sau ADN M1, singure sau în combinație, dintr-o tulpină obținută recent de la oameni (A/Beijing/89, H3N2) prezintă o rezidență virală redusă semnificativ pe zilele 1-6, pe provocare virală cu un izolat prezent în circulație, A/Georgia/93 (H3N2) (fig.26). Acest izolat prezent în circulație prezintă o derivație antigenică de la tipul de tulpină A/Beijing/89, astfel, încât vaccinul autorizat A/Beijing/89 a oferit o protecție scăzută pentru oameni împotriva bolii produse de către A/Georgia/93.
Fereții imunizați cu ADN care codifică proteine interne ale A/PR/34 prezintă rezidență virală nazală semnificativ redusă pe zilele 8 și 6 după infecție cu tulpina homotipică A/PR/34 (fig.27). Reducerea rezidenței virale s-a observat după provocare A/Georgia/93. atât la momente timpurii, cât și târzii, în timp ce după provocare A/PR/34 s-a observat doar târziu o reducere în rezidență virală; aceasta poate fi datorată unei diferențe de virulență între cele 2 tulpini pentru fereți.
1880
RO 117710 Β1
2. Omoloagă (homotipică. specifică de tip). Protecția homoloagâ s-a observat imediat, atât la șoareci, cât și la fereți imunizați cu ADN.
a) Șoareci
Șoareci BALB/c imunizați cu ADN HA (A/PR/34) au fost complet protejati față de provocare cu LD90 de A/PR/34. După provocare, șoarecii imunizați experimental nu au prezentat nici moarte (fig.28), nici pie'dere în greutate corporală mai mare de 5% (fig.29), în timp ce șoarecii experimentali de ccntrol 90...100 % au murit și au prezentat pierdere severă în greutate. Titrarea dozei de ADN HA necesară pentru a atinge protecție s dovedit că 3 injecții de 1 pg ADN HA au fost sindente pentru atingerea protecției totale (fig.30).
b) Fereți
Fereții care au fost imuniza: cu ADN codificați pentru HA de la A/PR/34 au avut pe zilele 1-6 rezidență virală semnificativ mai mică după infecție provocată hcmolog, decât fereții care au primit ADN control (fie.31). în mod asemănător, fereții care au fost imunizați cu ADN HA/Georgia/93 au avut rezistență virală redusă pe ziua 1 și 3 - 7 după infecție homoloagă (fig.32). Anticorpii HA e_ fost prezenți în serul de la toți fereții imunizați împotriva tulpinilor corespunzătoare (vezi ma sus). Astfel, imunizarea cu ADN HA produce protecție homoloagă.
3. Combinații de vaccinuri: Caoacitatea ADN-ului HA de a furniza un demeniu superior de protecție atunci când s-a cc~binat cu ADN-uri NP și M1 s-a examina: in fereți.
a) Lărgirea protecției împotrja variantelor derivate antigenic
Derivarea antigenică care s-a întâlnit între tulpinile A/Beijing/89 și A/Bei]ing/92 a fost suficient de mare, astfel, încât numeroși oameni imunizați cu vaccinul autorizat conținând tulpina A/Beijing/89 nu au fost protejați împotriva bolii produse de variantul A/Beijing/92. în America de Nord, răspândirea deosebită a bolii a fost produsă de către A/Beijino/92 asemănător izolatelor din circulație, de exemplu, A/Georgia/93. Izolatele în circulație nord-americane sunt similare antigenic tipului de tulpină A/Beijing/92, dar diferă în ceea ce privește locul geografic al izolării și istoricul trecerii lor, în modul în care au trecut ele în culturi de celule mamifere mai degrabă decât în ouă. în termenii secvenței de aminoacizi a HA, totuși tulpinile asemenea A/Beijing/92 au diferit de tulpinile asemenea A/Beijing/89 prin numai 11 puncte de mutație (pozițiile 133, 135. 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193, 226 și 262) din regiunea HI. Prin urmare, conform invenției, s-a luat în considerare să se determine dacă combinația răspunsurilor imune homotipice induse prin ADN NP și M1 ar putea asigura un grad mai mare de protecție împotriva acestui variant derivat antigenic. Imunizarea fereților cu vaccinul autorizat care conține tulpina A/Beijing/89, sau cu ADN HA de la A/Beijing/89, sau un izolat în circulație asemenea lui Beijing/89 (A/Hawaii/91) a dat o reducere din rezidența virală când animalele s-au provocat cu A/Georgia/93 (Fig.33). Animalele care s-au imunizat cu o combinație PNV conținând ADN-uri NP, M1 și HA au avut o rezidență virală semnificativ mai scăzută decât fereții imunizați cu produsul autorizat sau numai cu ADN HA (fig.34). în cazul ADN HA A/Hawaii/91 combinat cu ADN-uri NP și M1 A/Beijing/89, protecția rezultată nu a fost semnificativ diferită de protecția maximă furnizată prin ADN HA homolog A/Georgia/93 (fig.35). Astfel, combinarea ADN-urilor HA, NP și M1 a dat o protecție îmbunătățită împotriva unui derivat antigenic variant comparativ cu vaccinul autorizat.
b) Efectul istoricului pasajului antigenului vaccinului
Fereții care au fost imunizați cu un vaccin constând din secvența ADN HA derivată de la un izolat în circulație din SUA care a fost trecut în culturi tisulare de celule MDCK (A/Hawaii/91) au prezentat experimental rezidență virală mai mică (p=0,21 prin ANOVA pe 2 căi) decât fereții care au primit vaccinul autorizat de virus omorât care conține tulpjna A/Beijing/89, trecută în ouă, când s-au provocat cu tulpina derivată antigenic A/Georgia/93 (fig.33). Spre deosebire de aceștia, fereții care au primit ADN HA de la A/Beijing/89 nu au
1885
1890
1895
1900
1905
1910
1915
1920
1925
1930
RO 117710 Β1 exprimat diferență semnificativă de rezidență virală (p=0,058) după provocare A/Georgia/93 de la fereți care au primit vaccinul autorizat conținând virusul identic. Tulpinile crescute în ouă și celulele de mamifere diferă prin 2 puncte de mutație în regiunea HA1 a HA (pozițiile 186 și 193), ambele fiind localizate în situl antigenic B, în vecinătatea apexului monomerului HA și anticorpilor de neutralizare. în unele circumstanțe, capacitatea unor izolate gripale umane de a se lega la RBC de pui este inițial scăzută, dar este crescută prin pasaje succesive în ouă sugerând că receptorul regiunii de legare a HA poate suferi selecție substanțială prin creșterea în celule aviare. Efectul micilor variații de secvență asupra eficacității vaccinurilor gripale bazate pe HA la animale de laborator subliniază importanța potențială a rămânerii cât mai aproape posibil de secvența virusului de tip sălbatic pentru prepararea de asemenea, virusuri.
c) Primatele non-umane
Primatele non-umane nu sunt folosite de obicei, ca modelele de provocare gripală datorită absenței la ele a unui răspuns clinic la infecție. Cu toate acestea, s-a investigat imunogenitatea combinațiilor de vaccin PNV în primate non-umane comparativ cu vaccinurile autorizate de virus omorât. Titrurile de anticorp produse prin combinație PNV care conține HA și genele proteinelor interne au fos*. cel puțin echivalente produsului autorizat în termenii titrului de anticorp HI și duratei răspunsului la un PNV HA pentru un variant derivat antigenic, arătând că răspunsuri specifice de tip la PNV au putut fi generate la subiecte imunizate anterior. Maimuțele care au fost imunizate cu PNV au răspuns,de asemenea, la tnunizare ulterioară cu vaccin convențional conținând virus omorât.
4. Concluzie: Vaccinurile polinudeotidice împotriva gripei sunt eficace în modele de animale de laborator ale infecției gripate. Protecția homoloagă poate fi atinsă folosind vectori ADN care codifică HA, cel mai probabil printr-un mecanism imunologic analog celui indus prin proteine HA folosite curent în vaanul gripal autorizat.
Protecția heteroloagă poate fi atinsă împotriva tulpinilor, atât deviate, cât și derivate antigenic, de asemenea, prin includerea ADN -ului care codifică proteinele interne conservate ale influenzei. Combinația acestor abordări într-o imunizare unică dă protecție wnbunătățită împotriva variantelor deviate antioenic în comparație cu vaccinul autorizat obișnuit, așa cum s-a văzut în modelul folosind feretul.
(1) INFORMAȚIE GENERALĂ:
(i) SOLICITANT: Dennely, John J
Dwarki. Varavani J Liu, Margaret A Montgomery, Donne L Parker. Suezanne E Shiver. Dohn W (ii) TITLUL INVENȚIEI: CONSTRUCT ADN Șl COMPOZIȚIE
IMUNOGENĂ CU ACESTA (iii) NUMĂRUL SECVENȚELOR: 64 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚĂ:
(A) ADRESANT: Merck & Co., Inc.
(B) STRADA: P.O.Box 2000 (C) ORAȘ: Rahway (D) STAT: New Jersey (E) ȚARA: SUA (F) ZIP: 07065 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER:
(A) TIPUL MEDIULUI: Floppy disk
RO 117710 Β1 (B) COMPUTER: IBM PC compatibil (C) SISTEMUL DE OPERARE: PC-DOS/MS -DOS (D) SOFT: PATENTIN RELEASE NR.1.0, Versiune nr.1.25 (iv) DATE CURENTE ALE CERERII:
(A) CERERE NUMĂRUL: 95 - 01622 (B) DATA DEPUNERII: 14.03.1999 (C) CLASIFICARE: C12 N 15/44 (vii) DATE PRIVIND CERERI ANTERIOARE:
(A) CERERE NUMĂRUL: US 08/032 383 (B) DATA DEPUNERII: 18.03.1993 (vii) DATE PRIVIND CERERI ANTERIOARE:
(A) CERERE NUMĂRUL: US 08/089 985 (B) DATA DEPUNERII: 08.07.1993 (viii) MANDATAR:
(A) NUME: Eencen, Gerard M (B) Numărul ce înregistrare: 35746 (C) NUMĂRU. DE REFERINȚĂ AL DOSARULUI: 18972Y (xi) TELECOMUN'CAȚII:
(A) TELEFON (908)594 - 3901 (B) TELEFAX: (908) 594 - 4720 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR.L:
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI;
(A) LUNGIME. 18bp (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: unică (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
Lista secvențelor (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:1 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 18 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: unică (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței:Secv,ID Nr.1
GTGTGCACCT CAAGTCTCC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:2 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 23 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire; simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu
1985
1990
1995
2000
2005
2010
2015
2020
2025
RO 117710 Β1 (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR.2
CCCTTTGAGA ATGTTGCACA TTC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:3 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 33 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: Nu (IV) Antisens: nu (XI)Descrierea secvenței: Secv.lD Nr3
GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:4 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 36 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:4
CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:5 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 23 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea Secvenței: SECV.ID NR:5
CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:6 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 30 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: Da (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:6 GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:7 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 39 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire:simplă 2085 (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotecă: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR.7 2090
GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA NR:8 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 39 bp 2095 (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu 2100 (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nc8
CTGCGACCC AATCTCCAgc CTCATTTTCA GACACATAC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:9 2105 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 9 aminoacizi (B) Tip: aminoacidă (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară 2110 (II) Tipul moleculei: peptidă (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (V) Tip de fragment: intern (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.92115
Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:10 (I) Caracteristicile secvenței:2120 (A) Lungime: 4432 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN 2125 (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr10
RO 117710 Β1
2130
2135
2140
2145
2150
2155
2160
2165
2170
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60 CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGG4GCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120 7TGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG 240 CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG 300 TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC 360 GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG 420 CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC 480 CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC 540 TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTA~CA TATGCCAACT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA 600 TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC 660 TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA 720 CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA 780 CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840 CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGCT-G GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 900 AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCC7G GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960 TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GAACGCGGAT 1020 TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC 1080 TTCTTATGCA TGGTATACTG TTTTTGGC7T GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT 1140 ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC 1200 CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260 TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTATTTTTAC 1320 AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACMAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380 CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCOGG 1440 ACATGGGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGLGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500 CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560 CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GGTATGTGTC 1620 TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1680 GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTCT TGTGTTCTGA TAAGACTCAG AGCTAACTAA 1740 CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TCTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800 GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT 1860 CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGTTTGCC 1920 CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980 ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGCTGG 2040 GCCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 2100 GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCtGGGCC AGAAAGAAGC 2160 AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220 CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280 TTGGAGCGST CTCTCCCTCC CTCATCAGOC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340 GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400
2175
RO 117710 Β1
TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460 CGCTCGGTCG TTGGGCTGCG GCGAGCGGTATCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520 TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580 AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGOCC CCCTGACGAG 2640 CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTACACGCTGT 2820 AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTOGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC 2880 GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 2940 CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 3000 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 3060 TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 3120 TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGITTIIIIG TTTGCAAGCA G CAGATTACG 3180 CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 3240 TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCAOC 3300 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 3360 TCOTGTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 3420 CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA 3480 CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATâCCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA 3540 TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 3600 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT 3660 AGT7TGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGCT 3720 ATGGCTCCAT TCAGCTCCGG TTCCCMCGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG 3780 TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA CTTGGCOGCA 3840 GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 3900 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG 3960 CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT 4020 TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAAQjTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG 4080 CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT 4140 ACTTTCACCA GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 4200 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCrrCC III ri'CAATA TTATTGAAGC 4260 ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA 4320 CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCOCGA AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT 4380 ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TC 4432
INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:11 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 2196 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.11
2180
2185
2190
2195
2200
2205
2210
2215
2220
2225
RO 117710 Β1
ATTGGCTATT GGCCAITGCA TACGTTGTAT CCATATCATA ATATGTACAT TTATATTGGC 60 TCATGTCCAA CATTACCGCC ATGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA 120 ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA 180 AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACCTAT 240 GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG 300 TAAACÎGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC 360 GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT 420 CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG 480 CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGOGGTTT GACTCACGGG GA7TTCCAAG TCTCCACCCC 540 ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT 600 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGCTGGGA GGTCTATATA 660 AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTGTTTTGAC 720 CTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG 780 CGGATTCCCC GTGCCAAGAG TGACGTMGT ACCGCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC 840 TTGGCTTCTT ATGCATGCTA TACTGTTTTT GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC 900 ATGTTATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA TTATTGACCA 960 CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTGCCACAAC 1020 TCTCTTTATT GGCTATATGC CAATACACTG TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT 1080 TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC 1140 AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACGTGT 1200 TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GGAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT 1260 GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC TAACAGTGGA GGCCAGACTT 1320 AGGCACAGCA OGATGCCCAC CACCACCAGT GTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT 1380 GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG 1440 GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTCA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA 1500 ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT 1560 GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA GACTGTTCCT TTCCATGGGT 1620 CITT'ICTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTGC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTCT 1680 TTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTGTCCTTTCCTA 1740 ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG 1800 GGTGGGGCAG CACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC 1860 GGTGGGCTCT ATGGGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC GGTTCCTCCT GGGCCAGAAA 1920 GAAGCAGGCA CATCCCCTTC TCTGTGACAC ACCCTGTCCA CGCCCCTGGT TCTTAGTTCC 1980 AGCCCCACTC ATAGGACACT CATAGCTCAG GAGGGCTCCG CCTTCAATCC CACCCGCTAA 2040 AGTACTTGGA GCGGTCTCTC CCTCCCTCAT CAGCCCACCA AACCAAACCT AGCCTCCAAG 2100 AGTGGGAAGA AATTAAAGCA AGATAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA 2160 ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC 2196
RO 117710 Β1
Informație pentru secvența ID nr.12 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 71 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:12
GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA TAATCACTCA
CTGAGTGACA 60
TCAAAATCAT G (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:13 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 117 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:13
ACCGTCCTTA GATCAGCTT GCAAAAGCAG GCAAACCATT TGAATGGATG TCAATCCGAC 60
CTTACTTTTC TTAAAAGTGC CAGCAAAA TGCTATAAGC ACAACTTTCC CTTATAC 117 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:14 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 136 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:14
GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC AAAAACATAA TGGATCCAAA 60CACTGTCA AGCTTTCAGG TAGATTGCTT TCTTTGGCAT GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA 120
CCAAGAACTA GGTCAT 136
2275
2280
2285
2290
2295
2300
2305
2310
2315
R0117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚAID NR:15 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 152 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR.15
TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG AAAACAACCA
AAATGAAGGC AAACCTACTG GTCCTGTTAA GCAGACACAA
TATGTATAGG CTACCTGCG AACAATTCAA CC
AGCAAAAGCA
GTGCACTTGC
GGGGAAAATA
AGCTGCAGAT
120
152
| (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:16 | |||
| (I) Caracteristicile secvenței: (A) Lungime: 162 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: dublă (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:16 | |||
| TTTTCTGCAG TCACCGTCCT ATTATATTCA | TAGATCCCGA | ATTCCAGCAA | AAGCAGGTCA 60 |
| ATATGGAAAG AATAAAAGAA CCGAGATAC | CTAAGAAATC | TAATGTCGCA | GTCTGCCACC 120 |
TCACAAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT
162 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚAID NR:17 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 122 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.17
GTCACCGTCC TTAGATCTAC CATGAGTCTT CTAACCGAGG CGTACTCTCT
ATCATCCCGT CAGGCCCCCT CAAAGCCGAG ATCGCACAGA
GTTGACGGAA 120
TCCAAACGTA
GACTTGAAGA
GA
122
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:18 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 4864 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei:cADN (III) Ipotetică: nu (IV) antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.18:
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60
CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120
TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180
ACCATATGCC GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAC AAAATACCGC ATCAGATTGG 240
CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG 300
TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC 360
GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT ACATAACTTA CGGTAAATGG 420
CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC 480
CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACCTCAATGG GTGGAGTATT TACGCTAAAC 540
TGCCCACTTG GCACTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACCTCAA 600
TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC 660
TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTCATGCGGT TTTGGCAGTA 720
CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA 780
CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840
CTCCGCCCCA TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 900
AGCTCGTTTA GTGAACCCTC AGATCSZCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960
2365
2370
2375
2380
2385
2390
2395
TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCOS CGGCCGGGAA CGGTGCATTG CAACGCGGAT 1020 TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACOGC CTATAGACTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC 1080 TTCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT 1140 ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCOC 1200 CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260 TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT GTA'I I ITTAC 1320 AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAMT TCACATATAC AACAOCACCG TCCCCAGTGC 1380 CCGCAGTTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG 1440 ACATGGGCTCTTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500 CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCOT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560 CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTCTGCC GCACAAGGCC GTGGCGGTAG GCTATGTGTC 1620 TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC 1680 GGCACAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TCTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC 1740 CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800 GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT 1860 CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCTGCTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTGT7TGCC 1920 CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGMG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980 ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTCG 2040 GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 2100 GCTCTATGGG TACCCAGGTG CTGAAGMTT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160 AGGCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220 CACTCATAGG ACACTCATAG CTCAGGAGGG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTMAGTAC 2280 TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATCAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340 GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGCTATTAAG TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 2400 TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460 CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520 TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580 AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TI I ITCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG 2640 CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 2700 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC 2760 GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT 2820 AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTOTGCA CGAACCCCCC 2880 GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA 2940 CACGACTTAT CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 3000 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA 3060 TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA 3120 TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTGCAAGCA GCAGATTACG 3180
2440
CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG 3240
RO 117710 Β1
TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 3300 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAASTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT 3360 TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT 3420 CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCOGGGGG GGGGGGGCGC TGAGGTCTGC CTCGTGAAGA 3480 AGGTGTTGCT GACTCATACC AGGCCTGAAT CGAAAACTCA TCCAGCCAGA AAGTGAGGGA 3540 GCCACGGTTG ATGAGAGCTT TGTTGTAGGT GGACCAGTTG GTGATTTTGA ACI1TIGCI I 3600 TGCCACGGAA CGGTCTGCGT TCTCGGGAAG ATGCGTGATC TGATCCTTCA ACTCAGCAAA 3660 AGTTCGATTT ATTCAACAAA GCCGCCGTCC CGTCAAGTCA GCGTAATGCT CTGCCAGTGT 3720 TACAACCAAT TAACCAATTC TGATTAGGAA AACTCATCGA GCATCAAATG AAACTGCAAT 3780 TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA 3840 GAAAACTCAC CGAGGCAGTT CCATAGGATG GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG 3900 ACTCGTCCAA CATCAATACA ACCTATTAAT TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT 3960 GAGAAATCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC GGTGAGAATG GCAAAAGCTT ATGCATTTCT 4020 TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCATTA CGCTCGTCAT CAAAATCACT CGCATCAACC 4080 AAACCGTTAT TCATTCGTGA TTGCGCCTGA GCGAGACGAA ATACGCGATC GCTGTTAAAA 4140 GGACAATTAC AAACAGGAAT CGAATGCAAC CGGCGCAGGA ACACTGCCAG CGCATCAACA 4200 ATATTTTCAC CTGAATCAGG ATATTCTTCT AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC 4260 GCAGTGGTGA GTAACCATGC ATCATCAGGA GTACGGATAA AATGCTTGAT GGTCGGAAGA 4320 GGCATAAATT CCGTCAGCCA GTTTAGTCTG ACCATCTCAT CTGTAACATC ATTGGCAACG 4380 CTACCTTTGC CATGTTTCAG AAACAACTCT GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG 4440 ATTGTCGCAC CTGATTGCCC GACATTATCG CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA 4500 TCCATGTTGG AATTTAATCG CGGCCTCGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA 4560 ACACCCCTTG TATTACTGTT TATGTAAGCA GACAGTTTTA TTGTTCATGA TGATATATTT 4620 TTATCTTGTG CAATGTAACA TCAGAGATTT TGAGACACAA CGTGGCTTTC CCCCOOOOCC 4680 CATTATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT 4740 TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC 4800 TAAGAAACCA TTATTATCAT GACATTAACC TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT 4860 CGTC 4864
Informație pentru secvența ID nr:19 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 15 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei:cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr19
AGCAGAAGCA GAGCA 15
2445
2450
2455
2460
2465
2470
2475
2480
2485
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:20 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 119 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:20
TCACCGTCCT TAGATCAAGC A.GGGTTAATA ATCACTCACT AAAATCATGG
CGTCCCAAGG CACCAAACGG TCTTATGAAC AGATGGAAAC CGCCAGATT (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:21 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 67 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR121
GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG
TTCCTTAATT
GTCGTAC
Informație pentru secvența ID nr:22 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 15 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nn22
AGCAGAACCA CGCAC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:23 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 15 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu
GAGTGACATC
TGATGGGGAA
119
CAGATATTTT
RO 117710 Β1 (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv ID Nr.23
AGCAGAAGCA CAGCA 15 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:24 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 33 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD N':24
CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA 33 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:25 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 36 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împpletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nn25
GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT 36 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:26 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 102 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.26:
ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT TCTAATATCC ACAAAATGAA GGCAATAATT 60
GTACTACTCA TGGTAGTAAC ATCCAACGCA GATCGAATCT GC 102 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:27 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 42 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire:dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN
2540
2545
2550
2555
2560
2565
2570
2575
2580
RO 117710 Β1
| 2585 | (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.27 GGCACAGCAC ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC | 42 |
| 2590 | (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:28 (1) Caracteristicile secvenței: (A) Lungime:23 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă | |
| 2595 | (D)Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr28 | |
| 2600 | CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG (2) Informație pentru secvența ID nr: 29 (1) Caracteristicile secvenței: (A) Lungime: 18 bp | 23 |
| 2605 | (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu | |
| 2610 | (IV) Antisens: da (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.29 | |
| GGAGTGGCAC CTTCCAGG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:30 | 18 | |
| 2615 | (I) Caracteristicile secvenței: (A) Lungime: 12 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară | |
| 2620 | (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nn30: | |
| 2625 | AGCAAAAGCA GG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR.31 (I) Caracteristicile secvenței: (A) Lungime: 14 bp (B) Tip: acid nucleic | 12 |
| 2630 | (C) împletire: simplă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu |
RO 117710 Β1 (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.31
AGCAGAAGCG GAGC 14 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:32 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 35 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.32
CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGCCCGCGTT GCTGG 35 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:33 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 33 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:33
GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC 33 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:34 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 37 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:34
CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG 37 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:35 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 37 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: Secv.lD Nr.35
GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG 38
2635
2640
2645
2650
2655
2660
2665
2670
2675
2680
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR: 36 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 32 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID Nx.36
CCACATTCAG ATGCATATTC TACAOTGCAA AG 32 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:37 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 36 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR.37
GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG 36 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:38 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 36 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NFL38
CCACATTTAT AGACAGATTT AGCAAGAAAC ATTGTC 36 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:39 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 33 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:39
GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC
RO 117710 Β1 (2) Informație pentru secvența ID nr40:
(1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 36 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:40
CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC 36 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:41 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 39 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:41
GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC 39 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:42 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 39 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:42
CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC 39 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:43 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 42 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: liniară (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:43
GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG CC
2735
2740
2745
2750
2755
2760
2765
2770
2775
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:44 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 38 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:44
CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCTTCAC AAGAGCTG 38 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:45 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 3553 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:45
GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT 60
GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA 120
TCAATTACGG GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG 180
GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAG GACCCCCGCC CATTGACGTC AATAATGA0G 240
TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC GTCAATGGGT GGAGTATTTA 300
CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA GTGTATCATA TGCCAAGTAC GCCCCCTATT 360
GACGTCAATG ACGGTAAATG GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTATGGGAC 420
TTTCCTACTT GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT 480
TGGCAGTACA TCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC AAGTCTCCAG 540
CCCATTGACGTCAATGGGAGΊΤ IGI ΓΙ IGGCACCAAAATC AACGGGACTT TCCAAAATGT 600
CGTAACAACT CCGCCCCATT GACGCAAATG GGCGGTAGGC GTGTACGGTG GGAGGTCTAT 660
ATAAGCAGAG CTCGTTTAGT GAACCGTCAG ATCGCCTGGA GACGCCATCC ACGCTGTTTT 720
GACCTCCATA GAAGACACCG GGACCGATCC AGCCTCCGCG GCCGGGAACG GTGCATTGGA 780
ACGCGGATTC CCCGTGCCAA GAGTGACGTA AGTACCGCCT ATAGAGTCTA TAGGCCCACC 840
CCCTTGGCTT CTTATGCATG CTATACTGFT TTTGGCTTGG GGTCTATACA CCCCCGCTTC 900
CTCATGTTAT AGGTGATGGT ATAGCTTAGC CTATAGGTGT GGGTTATTGA CCATTATTGA 960
CCACTCCCCT ATTGGTGACG ATACTTTCCA TTACTAATCC ATAACATGGC TCTTTGCCAC 1020
RO 117710 Β1
AACTCTCTTT ATTGGCTATA TGCCAATACA CTGTCCTTCA GAGACTGACA CGGACTCTGT 1080 ATTTTTACAG GATGGGGTCT CATTTATTAT TTACAAATTC ACATATACAA CACCACCGTC 1140 CCCAGTGCCC GCAGTTTTTA TTAAACATGC TAACGTGGGA TCTCCACGCG AATCTCGGGT 1200 ACGTGTTCCG GACATGGGCT CTTCTCCGGT AGCGGCGGAG CTTCTACATC CGAGCCCTGC 1260 TCCCATGCCT CCAGCGACTC ATGGTCGCTC GGCAGCTCCT TGCTCCTAAC AGTGGAGGCC 1320 AGACTTAGGC ACAGCACGAT GCCCACCACC ACCAGTGTGC CGCACAAGGC CGTGGCGGTA 1380 GGGTATGTGT CTGAAAATGA GCTCGGGGAG CGGGCTTGCA CCGCTGACGC ATTTGGAAGA 1440 CTTAAGGCAG CGGCAGAAGA AGATGCAGGC AGCTGAGTTG TTGTGTTCTG ATAAGAGTCA 1500 GAGGTAACTC CCGTTGCGGT GCTGTTAACG GTGGAGGGCA GTGTAGTCTG AGCAGTACTC 1560 GTTGCTGCCG CGCGCGCCAC CAGACA7AAT AGCTGACAGA CTAACAGACT GTTCCTTTCC 1620 ATGGGTCTTT TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCTCGTGTG CCTTCTAGTT GCCAGCCATC 1680 TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA GGTGCCACTC CCACTGTCCT 1740 TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGT AGGTGTCATT CTATTCTGGG 1800 GGGTGGGGTG GGGCAGCACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA GGCATGCTGG 1860 GGATGCGGTG GGCTCTATGG GTACGGCCGC AGCGGCCGTA CCCAGGTGCT GAAGAATTGA 1920 CCCGGTTCCT CGACCCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC 1980 CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT GGCGAAACCC GACAGGACTA 2040 TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC GCTCTCCTGT TCCGACCCTG 2100 CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCrC CCTTCGGGAA GCGTGGCGCT TTCTCAATGC 2160 TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTUTAG GTCGTTCGCT CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC 2220 GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA ACTATCGTCT TGAGTCCMG 2280 CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG GTAACAGGAT TAGCAGAGCG 2340 AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC CTAACTACGG CTACACTAGC 2400 TGAAGGACAG TATTTGGTAT CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG AAAAAGAGTT 2460 GGTAGCTCTT GATCCGGCAA ACAAACCACC GCTGGTAGCG GTGGITtΓΤI TGTTTGCAAG 2520 CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGTGA 2580 TCCCGTAATG CTCTGCCAGT GTTACAACCA ATTAACCAAT TCTGATTAGA AAAACTCATC 2640 GAGCATCAAA TGAAACTGCA ATTTATTCAT ATCAGGATTA TCAATACCAT ATTTTTGAAA 2700 AAGCCGTTCC TGTAATGAAG GAGAAAACTC ACCGAGGCAG TTCCATAGGA TGGCAAGATC 2760 CTGGTATCGG TCTGCGATTC CGACTCGTCC AACATCAATA CAACCTATTA ATTTCCCCTC 2820 GTCAAAAATA AGGTTATCAA GTGAGAAATC ACCATGAGTG ACGACTGAAT CCGGTGAGAA 2880 TGGCAAAAGC TTATGCATTT CT7TCCAGAC 7TGTTCAACA GGCCAGCCAT TACGCTCGTC 2940 ATCAAAATCA CTCGCATCAA CCAAACCGTT ATTCATTCGT GATTGCGCCT GAGCGAGACG 3000 AAATACGCGA TCGCTGTTAA AAGGACAATT ACAAACAGGA ATCGAATGCA ACCGGCGCAG 3060 GAACACTGCC AGCGCATCAA CAATATTTCC ACCTGAATCA GGATATTCTT CTAATACCTG 3120 GAATGCTGTT TTCCCGGGGA TCGCAGTGGT GAGTAACCAT GCATCATCAG GAGTACGGAT 3180 AAAATGCTTG ATGGTCGGAA GAGGCATAAA TTCCGTCAGC CAGTTTAGTC TGACCATCTC 3240 ATCTGTAACA TCATTGGCAA CGCTAOCTTT GCCATGTTTC AGAAACAACT CTGGCGCATC 3300 GGGCTTCCCA TACAATCGAT AGATTCTCGC ACCTGATTGC CCGACATTAT CGCGAGCCCA 3360 TTTATACCCA TATAAATCAG CATCCATGTT GGAATTTAAT CGCGGCCTCG AGCAAGACGT 3420 TTCCCGTTGA ATATGGCTCA TAACACCCCT TGTATTACTG TTTATGTAAG CAGACAGTTT 3480 TATTGTTCAT GATGATATAT TTTTATCTTG TGCAATGTAA CATCAGAGAT TTTGAGACAC 3540 AACGTGGCTT TCC 3553
2825
2830
2835
2840
2845
2850
2855
2860
2865
2870
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:46 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 72 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:46
TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT GCTTTGAGCT ACATTTTATG 60
TCTGGTTTTC GC 72 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:47 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 111 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:47
TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC 60
AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAAGA TCTATGTGGG ATCTGCTGTG C 111 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:48 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 63bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:48
TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTA GTCCTGTTAT GTGCATTTAC AGCTACATAT 60
GCA 63 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:49 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 63 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire:dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN
RO 117710 Β1 (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:49
CTGGGCTTT TGGTGTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG 60
CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT GTGCTGTGCC TT 102 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:50 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 108 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:50
CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC TC-.TGGTAGT AACATCCAAC 60
GCAGATCGAA TCTGCACTGG GATAACATC TCAAACTCAC CTCATGTG 108 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:51 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 102 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:51
TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTTT ATTGTTTATA TGGTCTCCAG AGACAATGTT 60
TCTTGCTCCA TCTGTCTATA AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT 102 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:52 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 84 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleuclei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:52
GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT CTTATGAACA
GATGGAAACT 60
GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT 84
2925
2930
2935
2940
2945
2950
2955
2960
2965
R0117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:53 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 108 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:53
GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCCCCT TTTGACATGA GTAATGAAGG ATCTTATTTC 60
TTCGGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT 108 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:54 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 132 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:54
CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG TCTCTCTATC
GTTCCATCAG GCCCCCCTCAA AGCCGAAATC GCGCAGAGAC
CTTTGCTGGG
AAAAACACAG AT
AAACGTATGT
TTGAAGATCT
120
132 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:55 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 129 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:55
GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGATGATC TTTGCAGACC
TATCAGAAAC GAATGGGGGT GCAGATGCAA CGGTTCAAGT
TTCTTGAAAA
GAAGATCTAT
GTGGGATCTG 120
CTGTGCCTT 129
RO 117710 Β1
3015 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:56 (I) Caracteristicile secvenței;
(A) Lungime: 81 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:56 CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT AATGACAAA
ACACCGGAAG AAATAACTTC T
GACGGTATCA
ACACTGGGAC
3020
3025 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:57 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 96 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie:ambele (II) Tipul moleculei: cADn (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:57
GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC
AATTTCTTCT
TTGGGAGGGA
3030
3035
CACAGCAGAG
3040
GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:58 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 96 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:58
CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT
3045
3050
ACCTGCTTTC
ATTGACAGAA
GATGGAGAAG GCAAAGCAGA ACTAGCAGAA AAATTA
3055 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:59 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 123 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele
3060
RO 117710 Β1 (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:59
AGATCTCTTG GGGCAAGTCA AGAGAATGGG GAAGGAATTG GATGGAAGTGG
CTAAAGCAGA GCTCTATGGG AAATTCAGCT CTTGTGAAGA AGGATCTGCT
GTG (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:60 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 33 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:60
GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:61 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 38 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:61
CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:62 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 38 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR.62
GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC
CAAAGGATGT
AATACCTATA
120
123
RO 117710 Β1 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:63 (1) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 37 bp (B) Tip: acid nucleic (C) împletire: dublă (D) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu (XI) Descrierea secvenței: SECV.ID NR:63
CCACATGGAT CCGTAAGCT CTGCCAGTGT TACAACC 37 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECVENȚA ID NR:64 (I) Caracteristicile secvenței:
(A) Lungime: 39 bp (B) Tip: acid nucleic (C) Topologie: ambele (II) Tipul moleculei: cADN (III) Ipotetică: nu (IV) Antisens: nu
Claims (5)
- Revendicări1. Construct ADN capabil să inducă un răspuns imun față de virusul influenza, caracterizat prin aceea că este constituită dintr-un vector de expresie selectat din grupul constând din pnESV, V1, V1J, V1JR. V1 Jns și V1 Jneo și un terminator de transcripție legat operativ la o secvență nucleotidică care codifică o proteină a virusului influenza.
- 2. Construct ADN, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că vectorul de expresie este ales din grupul constând:pnRSV-PR-NP, V1-PR-NP, V1Jns-NJ-NP, cu dimensiunea de 6,42 Kb, al cărui capăt terminal 5' esteGTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT CTTATGAACA GATGGAAACT GATGGGGAAC GCCAGATGC AACT (Secv.lD Nr.52), iar capătul terminal 3' esteGAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCTTTTGACATGA GTAATGAAGG ATCTTATTTC TTCGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGCAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT (SECV.ID NR.53),V1Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), cu dimensiunea de 6,54 Kb, al cărui capăt terminal 5' este CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA ACACTGGGAC AATTGACAAA ACACCGGAAG AAATAACTTC T (SECV.ID NR.56) iar capătul terminal 3' esteGTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT TTGGGAGGGA CACAGCAGAG GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG (SECV.ID NR 57), V1 Jneo-BJ-NP al cărui capăt terminal 5' esteTCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT GAGTGACATC AAAATCATGG CGTCCCAAGG CACCAAACCG TCTTATGAAC AGATGGAAAC TGATGGGGAA CGCCAGATT (SECV.ID NR 20),3110311531203125313031353140314531503155RO 117710 Β1 iar capătul terminal 3' esteGAGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATATTTTTTCCTTAATT GTCGACV1Jneo-TX-NP al cărui capăt terminal 5' este CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA iar capătul terminal 3' esteGCAGATCCTT ATATTTCTTGA AATTCTGGTC TCAGAT (SECV.ID NR 25)
- 3. Construct ADN, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se folosește ca vaccin.
- 4. Construct ADN, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se folosește într-o metodă de inducere a răspunsului imun specific la virusul influenza, care cuprinde următoarele etape:a) izolarea genei influenza;b) legarea genei influenza în mod operativ de secvențele reglatoare din constructul ADN, astfel, încât gena este legată operativ la secvențele de control care la introducerea (direct) într-un țesut viu, direcționeazâ inițierea transcripției și ulterior, translația genei;c) introducerea constructului ADN care conține gena influenza într-un țesut viu și opțional,d) adăugarea unui construct aditional care conține gena influenza.
- 5. Compoziție imunogenă, caracterizată prin aceea că, aceasta cuprinde constructul ADN, definit în revendicarea 1, împreună cu o soluție acceptabilă farmaceutic, cu lipozomi sau cu un adjuvant acceptabil și, opțional, cu agenți care facilitează transfecția.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3238393A | 1993-03-18 | 1993-03-18 | |
| US8998593A | 1993-07-08 | 1993-07-08 | |
| PCT/US1994/002751 WO1994021797A1 (en) | 1993-03-18 | 1994-03-14 | Nucleic acid pharmaceuticals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO117710B1 true RO117710B1 (ro) | 2002-06-28 |
Family
ID=26708344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO95-01622A RO117710B1 (ro) | 1993-03-18 | 1994-03-14 | Construct adn si compozitie imunogena cu acesta |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0620277A1 (ro) |
| JP (2) | JP2812352B2 (ro) |
| CN (1) | CN1119458A (ro) |
| AU (1) | AU676258B2 (ro) |
| BG (1) | BG63126B1 (ro) |
| BR (1) | BR9406007A (ro) |
| CA (1) | CA2119175A1 (ro) |
| CZ (1) | CZ290315B6 (ro) |
| DZ (1) | DZ1759A1 (ro) |
| FI (1) | FI954329A (ro) |
| HR (1) | HRP940175A2 (ro) |
| HU (1) | HUT73397A (ro) |
| IL (1) | IL108915A0 (ro) |
| NO (1) | NO953649L (ro) |
| NZ (1) | NZ263680A (ro) |
| PL (1) | PL178626B1 (ro) |
| RO (1) | RO117710B1 (ro) |
| SI (1) | SI9420014A (ro) |
| SK (1) | SK114295A3 (ro) |
| UA (1) | UA42715C2 (ro) |
| WO (1) | WO1994021797A1 (ro) |
| YU (1) | YU12894A (ro) |
Families Citing this family (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5849719A (en) | 1993-08-26 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Method for treating allergic lung disease |
| US6911216B1 (en) | 1994-10-12 | 2005-06-28 | Genzyme Corporation | Targeted delivery via biodegradable polymers |
| US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
| DE19512142A1 (de) * | 1995-03-31 | 1996-10-02 | Immuno Ag | Infektiöser cDNA-Klon des Tick-Borne Enzephalitis (TBE)-Virus, davon abgeleiteter rekombinanter Impfstoff und Herstellung desselben sowie ein pharmazeutisches Produkt, das eine replizierbare Nukleinsäure enthält |
| US6017897A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-25 | Pasteur Merieux Connaught Canada | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6019980A (en) | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6083925A (en) * | 1995-06-07 | 2000-07-04 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6537776B1 (en) | 1999-06-14 | 2003-03-25 | Diversa Corporation | Synthetic ligation reassembly in directed evolution |
| FR2751225B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique aviaire |
| US6204250B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-03-20 | The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York | Immunization of infants |
| AU722326B2 (en) * | 1997-02-14 | 2000-07-27 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| US6517843B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US6693087B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-17 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia |
| US6686339B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-03 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia |
| EP1105490A1 (en) | 1998-08-20 | 2001-06-13 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia |
| US6881723B1 (en) | 1998-11-05 | 2005-04-19 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid constructs |
| US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7618797B2 (en) | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| WO2000047227A2 (en) | 1999-02-09 | 2000-08-17 | Powderject Vaccines, Inc. | Mycobacterium tuberculosis, immunization |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| JP2001151698A (ja) * | 1999-09-10 | 2001-06-05 | Nichiko Pharmaceutical Co Ltd | インフルエンザワクチン |
| EP1964573B1 (en) | 1999-10-22 | 2014-11-26 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
| US7196066B1 (en) | 1999-11-03 | 2007-03-27 | Powderject Vaccines, Inc. | DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens |
| US6852705B2 (en) | 2000-01-21 | 2005-02-08 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| US7078388B2 (en) | 2000-01-21 | 2006-07-18 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| EP1792995A3 (en) | 2000-05-08 | 2007-06-13 | Sanofi Pasteur Limited | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof |
| US7851212B2 (en) | 2000-05-10 | 2010-12-14 | Sanofi Pasteur Limited | Immunogenic polypeptides encoded by MAGE minigenes and uses thereof |
| US20060024670A1 (en) | 2004-05-18 | 2006-02-02 | Luke Catherine J | Influenza virus vaccine composition and methods of use |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| US20100273156A1 (en) | 2007-05-31 | 2010-10-28 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detecting influenza a and influenza b virus |
| US8354230B2 (en) * | 2007-12-21 | 2013-01-15 | Quest Diagnostics Investments Inc. | Multiplex detection assay for influenza and RSV viruses |
| KR101707569B1 (ko) | 2008-08-01 | 2017-02-16 | 감마 백신즈 피티와이 리미티드 | 인플루엔자 백신 |
| CA2760553A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Jr. James E. Crowe | Monoclonal antibodies to influenza h1n1 virus and uses thereof |
| SG168423A1 (en) * | 2009-07-13 | 2011-02-28 | Agency Science Tech & Res | Influenza detection method and kit therefor |
| AR078253A1 (es) | 2009-09-02 | 2011-10-26 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad |
| AR083533A1 (es) | 2010-10-22 | 2013-03-06 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe |
| AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
| WO2013033092A2 (en) | 2011-09-03 | 2013-03-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Streptococcus suis pilus antigens |
| WO2013138118A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-19 | The Regents Of The University Of California | Treatment of inflammatory disorders in non-human mammals |
| ES2689878T3 (es) | 2013-02-21 | 2018-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Proteínas H5 del virus de la gripe H5N1 para su uso como un medicamento |
| JP2016520534A (ja) * | 2013-03-18 | 2016-07-14 | イマクシオＩｍａｘｉｏ | インフルエンザ核タンパク質ワクチン |
| KR102319843B1 (ko) | 2013-09-25 | 2021-10-29 | 조에티스 서비시즈 엘엘씨 | Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법 |
| JP6395855B2 (ja) | 2014-04-03 | 2018-09-26 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | ブタ流行性下痢ウイルスワクチン |
| KR20180042167A (ko) | 2015-08-31 | 2018-04-25 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 선천성 진전을 위한 페스티바이러스 백신 |
| US20170072042A1 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Salmonella choleraesuis-salmonella typhimurium vaccines |
| MX2019003116A (es) | 2016-09-20 | 2019-08-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nueva vacuna contra la gripe porcina. |
| MX2019003160A (es) | 2016-09-20 | 2019-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nuevos promotores. |
| UY37406A (es) | 2016-09-20 | 2018-03-23 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nuevo sitio de inserción orf70 de ehv |
| MX2019003158A (es) | 2016-09-20 | 2019-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vectores de adenovirus canino. |
| UA127859C2 (uk) | 2016-11-03 | 2024-01-31 | Бьорінгер Інгельхайм Ветмедіка Гмбх | Вакцина проти свинячого парвовірусу |
| PT3534939T (pt) | 2016-11-03 | 2023-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacina contra parvovírus porcino e vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina e métodos da sua produção |
| CA3046684A1 (en) | 2017-01-30 | 2018-08-02 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Porcine coronavirus vaccines |
| CN110869047A (zh) | 2017-07-12 | 2020-03-06 | 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 | 塞内卡病毒a免疫原性组合物及其方法 |
| AU2018335252A1 (en) | 2017-09-23 | 2020-02-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Paramyxoviridae expression system |
| WO2019092027A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof |
| EP3668988A1 (en) | 2018-02-23 | 2020-06-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom |
| WO2019179998A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New ehv with inactivated ul18 and/or ul8 |
| EA202092165A1 (ru) | 2018-03-19 | 2021-02-25 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх | Новый ehv сайт инсерции ul43 |
| CA3091982A1 (en) | 2018-03-26 | 2019-10-03 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Method of producing an immunogenic composition |
| KR20210062015A (ko) | 2018-09-20 | 2021-05-28 | 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 | 변형된 pedv 스파이크 단백질 |
| US10905758B2 (en) | 2018-09-20 | 2021-02-02 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea |
| IT201900007060A1 (it) | 2019-05-21 | 2020-11-21 | St Superiore Di Sanita | Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi |
| IT201900012540A1 (it) | 2019-07-22 | 2021-01-22 | Humanitas Mirasole Spa | Inibitori di CHI3L1 e loro usi |
| CN115768784A (zh) | 2020-02-06 | 2023-03-07 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 用于检测抗弹状病毒抗体的多肽 |
| TW202229314A (zh) | 2020-10-05 | 2022-08-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質 |
| CN116438202A (zh) | 2020-10-05 | 2023-07-14 | 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 | 包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒 |
| WO2023194913A1 (en) | 2022-04-05 | 2023-10-12 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL86354A0 (en) * | 1987-05-22 | 1988-11-15 | Orion Yhtymae Oy | Episomal vector for the expression of selected dna fragments coding for optional polypeptides in mammalian cells and methods for the production thereof |
| DE69032284T2 (de) * | 1989-03-21 | 1998-10-08 | Vical, Inc., San Diego, Calif. | Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren |
| US5643578A (en) * | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
-
1994
- 1994-03-09 IL IL10891594A patent/IL108915A0/xx unknown
- 1994-03-09 EP EP94200605A patent/EP0620277A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-14 BR BR9406007A patent/BR9406007A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-03-14 SI SI9420014A patent/SI9420014A/sl not_active IP Right Cessation
- 1994-03-14 PL PL94310677A patent/PL178626B1/pl unknown
- 1994-03-14 NZ NZ263680A patent/NZ263680A/en unknown
- 1994-03-14 UA UA95094152A patent/UA42715C2/uk unknown
- 1994-03-14 WO PCT/US1994/002751 patent/WO1994021797A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-14 SK SK1142-95A patent/SK114295A3/sk unknown
- 1994-03-14 RO RO95-01622A patent/RO117710B1/ro unknown
- 1994-03-14 HU HU9502702A patent/HUT73397A/hu unknown
- 1994-03-14 CZ CZ19952373A patent/CZ290315B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-03-14 CN CN94191485A patent/CN1119458A/zh active Pending
- 1994-03-16 DZ DZ940021A patent/DZ1759A1/fr active
- 1994-03-16 CA CA002119175A patent/CA2119175A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-17 YU YU12894A patent/YU12894A/sh unknown
- 1994-03-17 AU AU57889/94A patent/AU676258B2/en not_active Ceased
- 1994-03-17 HR HR08/089,985A patent/HRP940175A2/xx not_active Application Discontinuation
- 1994-03-18 JP JP6049102A patent/JP2812352B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-09-14 FI FI954329A patent/FI954329A/fi unknown
- 1995-09-15 NO NO953649A patent/NO953649L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-09-18 BG BG100006A patent/BG63126B1/bg unknown
-
1997
- 1997-10-22 JP JP29013797A patent/JP3608642B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1119458A (zh) | 1996-03-27 |
| IL108915A0 (en) | 1994-06-24 |
| CZ290315B6 (cs) | 2002-07-17 |
| EP0620277A1 (en) | 1994-10-19 |
| CA2119175A1 (en) | 1994-09-19 |
| BR9406007A (pt) | 1996-01-02 |
| CZ237395A3 (en) | 1996-02-14 |
| SI9420014A (en) | 1996-08-31 |
| HU9502702D0 (en) | 1995-11-28 |
| AU676258B2 (en) | 1997-03-06 |
| DZ1759A1 (fr) | 2002-02-17 |
| JP3608642B2 (ja) | 2005-01-12 |
| NZ263680A (en) | 1997-05-26 |
| WO1994021797A1 (en) | 1994-09-29 |
| JPH10113194A (ja) | 1998-05-06 |
| SK114295A3 (en) | 1996-02-07 |
| PL310677A1 (en) | 1995-12-27 |
| BG100006A (bg) | 1996-12-31 |
| PL178626B1 (pl) | 2000-05-31 |
| FI954329A0 (fi) | 1995-09-14 |
| HRP940175A2 (en) | 1997-04-30 |
| UA42715C2 (uk) | 2001-11-15 |
| NO953649L (no) | 1995-11-17 |
| FI954329A (fi) | 1995-09-14 |
| JPH0795888A (ja) | 1995-04-11 |
| JP2812352B2 (ja) | 1998-10-22 |
| BG63126B1 (bg) | 2001-04-30 |
| HUT73397A (en) | 1996-07-29 |
| YU12894A (sh) | 1997-12-05 |
| NO953649D0 (no) | 1995-09-15 |
| AU5788994A (en) | 1994-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU676258B2 (en) | Nucleic acid pharmaceuticals | |
| CA2482946C (en) | Multi plasmid system for the production of influenza virus | |
| AU696148B2 (en) | Coordinate (in vivo) gene expression | |
| Subbarao et al. | Sequential addition of temperature-sensitive missense mutations into the PB2 gene of influenza A transfectant viruses can effect an increase in temperature sensitivity and attenuation and permits the rational design of a genetically engineered live influenza A virus vaccine | |
| DK1748790T3 (en) | Multiplasmidsystem for the production of influenza | |
| MX2007005818A (es) | Vectores recombinantes de la influenza con unidades de transcripcion en tandem. | |
| KR102557390B1 (ko) | 비-구조 단백질의 단편으로 구성된 뎅기 바이러스 키메라 폴리에피토프 및 이의 뎅기 바이러스 감염에 대한 면역원성 조성물에서의 용도 | |
| US20040087521A1 (en) | Nucleic acid pharmaceuticals-influenza matrix | |
| CN115867561A (zh) | SARS-CoV蛋白、核酸构建体、病毒样蛋白(VLP)的表达及其相关方法 | |
| Kuwano et al. | Cross-reactive protection against influenza A virus infections by an NS1-specific CTL clone | |
| CA2842055C (en) | Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene | |
| AU3723099A (en) | Attenuated influenza viruses | |
| Parkin et al. | Temperature sensitive mutants of influenza A virus generated by reverse genetics and clustered charged to alanine mutagenesis | |
| RU2193065C2 (ru) | Конструкция днк (варианты), днк-вектор, иммуногенная композиция против вируса гриппа, способ индукции иммунного ответа, вакцина и способ вакцинации | |
| Saikh et al. | Protective cross-reactive epitope on the nonstructural protein NS1 of influenza A virus | |
| Song et al. | Recombinant influenza viruses as delivery vectors for hepatis B virus epitopes | |
| WO2023057766A1 (en) | Influenza vaccines | |
| MXPA05012700A (en) | Recombinant influenza vectors with a polii promoter and ribozymes |