CZ290315B6 - Konstrukty DNA, jejich pouľití a polynukleotidová vakcína - Google Patents
Konstrukty DNA, jejich pouľití a polynukleotidová vakcína Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290315B6 CZ290315B6 CZ19952373A CZ237395A CZ290315B6 CZ 290315 B6 CZ290315 B6 CZ 290315B6 CZ 19952373 A CZ19952373 A CZ 19952373A CZ 237395 A CZ237395 A CZ 237395A CZ 290315 B6 CZ290315 B6 CZ 290315B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- dna
- mice
- gene
- influenza virus
- Prior art date
Links
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 198
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 165
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 162
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims abstract description 149
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 114
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 99
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims abstract description 81
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 76
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 60
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 48
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 70
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 36
- 241000845082 Panama Species 0.000 claims description 35
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 11
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 8
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 57
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 205
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 116
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 80
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 78
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 75
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 73
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 58
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 58
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 36
- 230000004044 response Effects 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 32
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 26
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 21
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 241000894007 species Species 0.000 description 18
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 101710102873 Polymerase basic protein 2 Proteins 0.000 description 12
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 102100037516 Protein polybromo-1 Human genes 0.000 description 11
- 101710085035 RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 10
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 10
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 10
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 9
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 9
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 8
- 230000034994 death Effects 0.000 description 8
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 7
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 6
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 6
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 6
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 6
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 6
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 6
- -1 neuro-amidase (NM) Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 5
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 5
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 4
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 101150109178 M1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 3
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 3
- 102100029241 Influenza virus NS1A-binding protein Human genes 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 101150002210 34 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000021438 curry Nutrition 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102100022524 Alpha-1-antichymotrypsin Human genes 0.000 description 1
- 101100322085 Arabidopsis thaliana CAC3 gene Proteins 0.000 description 1
- AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O AIFHRTPABBBHKU-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001185363 Chlamydiae Species 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane-1,2-diaminetetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1CCCCC1N(CC(O)=O)CC(O)=O FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150040523 EN gene Proteins 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000252870 H3N2 subtype Species 0.000 description 1
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000678026 Homo sapiens Alpha-1-antichymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000847017 Homo sapiens Tetratricopeptide repeat protein 23 Proteins 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150046652 M2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101150080862 NA gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 101150103639 PB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150030427 PB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100514477 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MSI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100031452 Tetratricopeptide repeat protein 23 Human genes 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940038444 antibody-based vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002888 effect on disease Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009950 felting Methods 0.000 description 1
- 238000011832 ferret model Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229940033326 influenza DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007787 long-term memory Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150027243 pb gene Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000012857 repacking Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005549 size reduction Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 229940126581 whole-virion vaccine Drugs 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
DNA konstrukt, kter² obsahuje nukleovou kyselinu k duj c gen ch°ipkov ho viru pro nukleoprotein, hemaglutinin, polymer zu, matrix nebo nestrukturn genov² produkt ch°ipkov ho viru, p°i em konstrukt DNA je schopn² vyvolat expresi antigenn ho produktu genu ch°ipkov ho viru, indukuj c ho po aplikaci tohoto DNA konstruktu a po v²sledn m p° jmu tohoto DNA konstruktu bu kami exprimuj c mi k dovan² ch°ipkov² gen specifickou imunitn odpov . Uveden² DNA konstrukt je tvo°en a) oblast promotoru CMVIntA a oblast BGH pro ukon en transkripce ze SEKV.ID:11, b) prokaryotick²m po tkem replikace, c) genem pro odolnost proti antibiotik m a d) otev°en²m tec m r mcem, ulo en²m mezi promotor a sign l pro ukon en transkripce ze slo ky a) ° d c expresi genu ch°ipkov ho viru. Sou st °e en tvo° tak polyneukleotidov vakc na s obsahem t chto konstrukt a pou it konstrukt pro v²robu uveden vakc ny.\
Description
Oblast techniky
Vynález se vztahuje na konstrukty nukleových kyselin, které při přímé aplikaci do živé tkáně obratlovců indukují imunitní reakci specificky zaměřenou na lidský chřipkový virus. Vynález se rovněž týká polynukleotidové vakcíny s obsahem těchto konstruktů.
Dosavadní stav techniky
Chřipka je akutní horečnaté onemocnění způsobené infekcí respiračního traktu chřipkovým virem typu A nebo B. Na celém světě dochází téměř každý rok k hromadnému výskytu chřipky ve formě opakujících se epidemií nebo pandemií. Chřipka může způsobit vážné poruchy systémů lidského organismu, vážná onemocnění (jako virový zánět plic) vyžadující hospitalizaci a komplikace takového typu, jako je druhotný bakteriální zánět plic. Nedávné epidemie ve Spojených státech amerických vedly pravděpodobně kviče než 10 000 (až k 40 000) úmrtím ročně a k 5 000-10 000 úmrtím ročně vletech bez epidemií. Nej lepší strategií v prevenci vysoké úmrtnosti a nemocnosti spojené s chřipkou je očkování.
Současné vakcíny jsou odvozeny od virů pěstovaných na kuřecích zárodcích a pak inaktivovaných. Tyto vakcíny zahrnují tři kmeny chřipkových virů (dva kmeny A a jeden B kmen). V současné době jsou k dispozici tři typy dosud patentovaných vakcín: vakcíny obsahující celý virus, virové segmenty nebo samotný povrchový antigen. Pro očkování dětí se používají pouze vakcíny obsahující virové segmenty nebo povrchové antigeny vzhledem k bouřlivé horečnaté reakci dětského organismu na vakcíny obsahující celé viry. U dětí mladších 9ti let je nutné provést dvojí očkování, u dospělých stačí pouze jednorázová aplikace vakcíny. Bylo však navrženo [viz Medical Letter 32: 89-90, 17. září, 1993], že by pro „pacienty očkované na podzim byla výhodná další dávka vakcíny v zimě nebo na začátku jara“, vzhledem ke zjištění u některých starších pacientů, která ukazují, že titr protilátek po očkování se může během čtyř měsíců nebo i méně snížit pod hladinu obranyschopnosti. Tyto vakcíny jsou nově sestavovány každý rok podle předpokladu, který kmen viru bude v onom roce klinicky cirkulovat, a na základě odhadu, který z virů bude v nadcházejícím období převládat. PřeoČkování se doporučuje provádět každý rok.
A. Omezení vyráběných vakcín j sou následuj ícr:
1) Variabilita antigenů vede zvláště u chřipkového viru kmene A ke vzniku virů, které nejsou neutralizovány protilátkami vytvořenými předchozím očkováním (nebo předchozí infekcí). Nové kmeny vznikají bodovou mutací (driftem antigenů) a přeskupením (shiftem antigenů) genů kódujících povrchové glykoproteiny (hemaglutinin [HA] a neuroamidázu), zatímco vnitřní proteiny jsou ve velké míře konzervovány v driftovaných i shiftovaných kmenech. Očkování vyvolává imunitu na základě „homologních“ kmenově specifických protilátek, a nikoli na základě „heterologní“ skupinové imunity zprostředkovávané buňkami.
2) I když převládající kmen viru během roku nijak významně nedriftuje ani neshiftuje, musí se očkování provádět každý rok znovu, protože titr protilátek se snižuje. Ačkoli některé zdroje uvádějí, že protilátky inhibující hemaglutinin (HI) a neutralizující protilátky vydrží od několika měsíců až po několik let, kdy se pak jejich titr postupně snižuje, předpisy Advisory Committee on Immunization Practices uvádějí pokles titru protilátek v roce po očkování jako důvod pro každoroční přeočkování, a to i tehdy, jestliže nedošlo k žádnému významnému driftu nebo shiftu. (HI protilátky snižují schopnost chřipkového viru aglutinovat červené krvinky. Podobně jako neutralizující protilátky jsou tyto HI protilátky namířené proti antigenu HA. Testy inhibice hemaglutininu jsou snazší na provedení a levnější než testy na neutralizaci, takže jsou častěji
-1 CZ 290315 B6 používány jakožto metody pro vyhodnocování schopnosti protilátek vytvořených proti jednomu kmeni chřipkového viru reagovat s odlišným kmenem.) Jak již bylo dříve uvedeno v Medical
Letter, navrhuje se, že by vysoce rizikoví starší pacienti měli být očkováni dvakrát za sezónu vzhledem k jejich krátkodobému titru obranných protilátek.
3) Účinnost očkování není optimální. Vytvoření vakcíny na další období je založeno na odhadu přicházejícího cirkulujícího kmene (prostřednictvím vyhodnocování vzorků v Asii), což je nepřesné a může vést k neúplné shodě mezi kmeny použitými pro vakcínu a mezi těmi, které pak v terénu skutečně kolují. Navíc mohou nastat situace, jako během chřipkové sezóny roku 1992-1993, kdy se nový kmen H3N2 (A/Beijing/92) klinicky projevil až na konci chřipkové sezóny. Jeho výskyt vyvolal okamžitou změnu složení vakcíny pro rok 1994-1994, protože křížová reakce A/Beijing/92 s protilátkami vytvořenými podle dřívějšího kmene H3N2 (A/Beijing/89) byla velice slabá právě z důvodu proběhlého antigenního shifitu. Avšak vzhledem k délce doby potřebné pro přípravu a formulaci současné patentované vakcíny, nemohla být vakcína proti novému kmeni zavedena během sezóny 1992-1993 i přes četné důkazy slabé ochrany poskytované používanou vakcínou a přes zvyšující se virulenci nově kolujícího viru kmene H3N2.
I když taková vakcína je v souladu s kmenem viru, proti kterému je vytvořena, poskytuje současná patentovaná vakcína ochranu přes onemocněním pouze okolo 70 % zdravých dětí a dospělých v mladém věku a 30-40 % oslabených starších dospělých osob. Proto jsou pro vyhodnocení účinnosti vakcíny vytvořené proti kmeni, který v populaci koluje, používána jiná kritéria. Tato kritéria zahrnují prevenci vážného onemocnění a druhotných komplikací, která se odráží v prevenci hospitalizace (70 % starších osob žijících ve svých domovech proti 50-60 % starších osob žijících v domovech důchodců) a prevenci úmrtí (80 % pro obyvatele domovů důchodců). Hromadná imunita vedoucí ke snižování rozšíření infekce v domovech důchodců je rovněž považována za další přínos očkování.
B. Charakteristika ideální univerzální vakcíny proti chřipkovému viru (předmět vynálezu):
1) Vytvoření obrany proti skupině virů (heterologní obrana). Univerzální vakcína by byla schopná ochránit proti různým kmenům viru, například v rozmezí subtypů H3N2, a možná i proti jiným subtypům, jako např. od H1N1 k H3N2. Obrana by byla pravděpodobně zprostředkována cytotoxickými T-lymfocyty (CTL) rozpoznávajícími antigeny z vnitřních konzervovaných virových proteinů, i když určitou roli by mohly hrát i neutralizující protilátky vytvořené proti konzervované části proteinů vázaných na membrány.
2) Rozšíření rozsah reakce protilátek. Protože se předpokládá, že CTL mají vliv na uzdravení z nemoci, měla by vakcína založená výhradně na odpovědi CTL zkracovat dobu nemoci (snad až do zachycení subklinických projevů nemoci), ale neposkytovala by kompletní ochranu proti onemocnění. Experimenty ukázaly, že současný výrobní postup pro vakcínu proti chřipkovému viru pasážováním v kuřecích zárodcích má schopnost selekce virové subpopulace, která změnila HA antigenitu. Tak může být snížena účinnost vakcíny, protože protilátky vyvolané takovou vakcínou nemusí být zcela účinné proti právě převládajícímu kmeni. Proto by bylo výhodné vytvořit protilátky, které by vyvolávaly v porovnání se současnými vakcínami rozšířenou imunitní odpověď. Chřipková sezóna 1992-1993 poskytla výborný příklad omezení současných vakcín, a to na vakcíně využívající pro tvorbu protilátek kmen A/Beijing/89. Takto vytvořené protilátky byly málo reaktivní při křížové reakci (a měly tudíž slabé ochranné účinky) s novým a mnohem virulentnějším kmenem A/Beijing/92. Oba kmeny jsou typu H3N2, tj. stejný subtyp. Pokud se však jedná o sekvenci aminokyselin, liší se kmeny podobné A/Beijing/92 od kmenu podobných A/Beijing/89 pouze v 11 bodových mutacích (místa 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193, 225 a 262) v oblasti HA1. Není známo, zda současný výrobní postup ovlivnil nedostatečnou odpověď v křížové reakci, ale je zcela jasné, že je potřeba rozšířit rozsah reakce protilátek.
-2CZ 290315 B6
3) Prodloužené trvání protilátkové odpovědi. Protože skupiny, které jsou v největším nebezpečí, pokud jde o onemocnění chřipkovým virem a úmrtnost, (tj. starší lidé), jsou rovněž skupiny, ve kterých titr obranných protilátek klesá příliš prudce na to, aby bylo očkování jednou ročně účinné, měla by vylepšená vakcína vytvořit protilátky, jejichž titr by vydržel déle.
C. Polynukleotidy j ako vakcína.
Ukázalo se, že nitrosvalová aplikace polynukleotidových konstruktů, tj. DNA plazmidů kódujících proteiny, vede in silu k tvorbě těchto proteinů ve svalových buňkách. Použitím plazmidů cDNA kódujících virové proteiny se dosáhlo jak tvorby protilátek, tak tvorby CTL, které poskytovaly homologní i heterologní ochranu proti následné infekci některým homologním nebo zkříženým kmenem. Každý typ imunitní odpovědi poskytuje nějakou potenciální výhodu proti současným očkovacím strategiím. Použití PNV k produkci protilátek může vést k prodloužení doby imunitní odpovědi a ke vzniku antigenů, které mohou obsahovat jak přesnou sekvenci klinicky kolujícího kmene viru, tak vhodné post-translační úpravy a konformace nativního proteinu (viz rekombinantní protein). Vznik odpovědi CTL tímto způsobem přináší výhodu v podobě ochrany před zkříženými kmeny bez použití živých a potenciálně patogenních vektorů nebo oslabených virů.
D. Proto hlavním nepřítelem vývoje vakcín proti takovým virům, jako je chřipkový virus (tj. virům, proti kterým se vytvářejí neutralizující protilátky), je různorodost obalových proteinů různých izolovaných virů nebo kmenů. Protože jak myší, tak lidské cytotoxické T-lymfocyty, mají schopnost rozpoznávat epitopy odvozené od konzervovaných vnitřních virových proteinů [J. W. Yewdell a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 82, 1785 (1985); A. R. M. Townsend a kol., Cell 49, 959 (1986); A. J. McMichael a kol., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J.Bastin a kol., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A. R. M. Townsend a H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601 (1989)] a hrají patrně významnou roli v imunitní reakci na viry [Y. L. Lin a B. A. Askonas, J. Exp. Med. 154, 225 (1981); I. Gardner a kol., Eur. J. Immunol. 4, 68 (1974); K. L. Yap a G. L. Ada, Nátuře 273, 238 (1978); A. J. McMichael a kol., New Engl. J. Med. 309,13 (1983); P. M. Taylor a B. A. Askonas, Immunol. 58, 417 (1986)], bylo úsilí zaměřeno na vývoj CTL vakcín schopných poskytovat heterologní obranu proti různým virovým kmenům.
CD8+CTL buňky zabíjejí buňky infikované virem, jestliže receptory těchto T-lymfocytů rozpoznají virové peptidy spojené s MHC proteiny I. třídy [R. M. Zinkemagel a P. C. Doherty, tamtéž 141, 1427 (1975); R. N. Germain, Nátuře 353, 605 (1991)]. Tyto peptidy jsou odvozeny od endogenně syntetizovaných virových proteinů bez ohledu na umístění a funkci proteinu ve viru. Tak mohou CTL poskytnout zkříženou ochranu před jinými kmeny tím, že rozpoznají epitopy konzervovaných virových proteinů. Peptidy mající schopnost se spojovat sMHC proteiny I. třídy, což je důležité pro další rozpoznávání cytotoxickými T-lymfocyty, jsou odvozeny od proteinů, které jsou přítomny v cytoplazmě či endoplazmatickém retikulu nebo jimi procházejí [J. W. Yewdell a J. R. Bennink, Science 244,1072 (1989); A. R. M. Townsend a kol., Nátuře 340, 443 (1989); J. G. Nuchtem a kol., Nátuře 339, 223 (1989)]. Obecně řečeno nejsou tedy exogenní proteiny, které vstupují do endozomálního procesu (jako v případě MHC proteinů 2. třídy), účinné pro vyvolání CD8+CTL odpovědi.
Úsilí o vyvolání CTL reakcí bylo většinou zaměřeno na použití buď replikačních faktorů pro tvorbu proteinového antigenu v buňce [J.R. Bennink a kol., tamtéž 311, 578 (1984); J. R. Bennink a J. W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C. K. Stover a kol., Nátuře 351, 456 (1991); A. Aldovini a R. A. Young, Nátuře 351, 479 (1991); R. Schafer a kol., J. Immunol. 149, 53 (1992); C. S. Hahn a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 89, 2679 (1992)], nebo se zaměřilo na zavedení peptidů docytosolu [F. R. Carbone a M. J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Dereš a kol., Nátuře 342, 561 (1989); H. Takahashi a kol., tamtéž, 344, 873 (1990); D. S. Collins a kol., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M. J. Newman a kol., tamtéž, 148, 2357 (1992)]. Oba tyto přístupy mají svá omezení, která mohou snižovat jejich využití pro vakcinaci. Retrovirové vektory jsou omezeny ve své velikosti a struktuře
-3CZ 290315 B6 polypeptidů, které mohou být exprimovaný jako fuzní proteiny při zachování schopnosti replikace rekombinantního viru [A. D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)] a účinnost takových vektorů jako je vakcína pro následnou imunizaci může být ohrožena imunitními reakcemi proti samotným vektorům [E. L. Cooney a kol., Lancet 337, 567 (1991)].. Virové vektory a upravované patogeny s sebou nesou rizika, která mohou být překážkou jejich použití pro lidské organismy [R. R. Redfield a kol., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola a kol., Arch. Intem. Med. 149, 1569 (1989)]. Výběr epitopů, které mají být vystaveny, je závislý na struktuře jednotlivých MHC proteinů, takže účinnost peptidové vakcíny může být limitována vzhledem k různorodosti MHC haplotypů v outbredních populacích.
Benvenisty, N. a Reshef, L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] ukázal, že DNA vysrážená CaCl2 a zavedená do myší intraperitoneálně, nitrožilně či nitrosvalově, se může exprimovat. Nitrosvalově injekce (i.m.) DNA expresivních vektorů aplikované myším vedly k příjmu DNA svalovými buňkami a k expresi genů nesených danou DNA [J. A. Wolff a kol., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi a kol., Nátuře 352, 815 (1991)]. Ukázalo se, že plazmidy byly udržovány epizomálně a nereplikovaly se. Další trvalá exprese byla pozorována po nitrosvalově injekci do kosterního svalstva laboratorních krys, ryb a primátů, a dále do srdečního svalstva laboratorních krys [H. Lin a kol., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88,4138 (1991); E. Hansen a kol., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao a kol., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Wolff a kol., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)]. Techniky pro využití nukleových kyselin jako léčivých prostředků byly popsány ve WO 90/11092 (4. října 1990). V tomto projektu byly nukleové kyseliny použity pro očkování obratlovců.
Pro úspěšnost metody není bezpodmínečně nutná nitrosvalová aplikace vakcíny. Tang a kol. [Nátuře 356, 152-154 (1992)] popsali zavedení zlatých mikroprojektilů povlečených DNA kódující růstový hormon skotu (BGH) do kůže myší, které u těchto myší vedlo k produkci protilátek proti BGH. Furth a kol. [Analytical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)] prokázal, že pro transfekci kůže, svalu, tuku a tkáně mléčných žláz u živých zvířat může být použito tryskových injekcí. V poslední době Friedman, T., [Science 244, 1275-1281 (1989)] souhrnně popsal různé metody zavádění nukleových kyselin. Viz také Robinson a kol., soubor abstract uvedených u příležitosti setkání 1992 Modem Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, str. 92, která popisují nitrosvalovou, nitrožilní a intraperitoneální aplikaci DNA viru ptačí chřipky do kuřat, které vedlo k údajné obraně proti smrtelnému vývoji onemocnění. Tyto materiály však nepopisují, které geny viru ptačí chřipky byly použity a navíc se zde uvádějí pouze specifické imunitní odpovědi H7 bez jakékoli zmínky o indukci zkřížené obrany proti jiným kmenům.
Podstata vynálezu
Tento vynález tedy není založen na žádné ze známých metod pro zavádění nukleových kyselin do živé tkáně za účelem vyvolání exprese proteinů. Tento vynález popisuje způsob zavádění virových proteinů do dráhy zpracování antigenů za účelem vytvoření cytotoxických T-lymfocytů specifických pro určitý virus. Proto tento vynález uspokojuje potřebu volající po specifických léčebných prostředcích proti chřipkovému viru, které by měly schopnost vyvolat požadovanou profylaktickou imunitní odpověď na virové patogeny. Obzvlášť důležitou částí tohoto léčebného postupu je možnost indukce imunitní odpovědi prostřednictvím T buněk, která může zabránit infekci i v takových případech, kdy je kmen viru heterogenní s kmenem, ze kterého byl antigen získán. Vynález popisuje DNA konstrukty kódující virové proteiny nukleoproteinu lidského chřipkového viru (NP), hemaglutininu (HA), neuro-amidázy (NM), matricového proteinu (M), nestruktumí protein (NS), polymerázu (PB1 a PB2 = bazické polymerázy 1 a 2; PA= kyselá polymeráza) nebo další geny chřipkového viru kódující produkty, které vyvolávají tvorbu specifických CTL.
-4CZ 290315 B6
Podstatu vynálezu tvoří DNA konstrukt, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující gen chřipkového viru pro nukleoprotein, hemaglutinin, polymerázu, matrix nebo nestruktumí genový produkt chřipkového viru, přičemž konstrukt DNA je schopný vyvolat expresi antigenního produktu genu chřipkového viru, indukujícího po aplikaci tohoto DNA konstruktu a po výsledném příjmu tohoto DNA konstruktu buňkami exprimujícími kódovaný chřipkový gen specifickou imunitní odpověď, uvedený DNA konstrukt je tvořen
a) oblastí promotoru CMVIntA a oblastí BGH pro ukončení transkripce ze SEKV.ID: 11,
b) prokaryotickým počátkem replikace,
c) genem pro odolnost proti antibiotikům a
d) otevřeným čtecím rámce, uloženým mezi promotor a signál pro ukončení transkripce ze složky a) řídící expresi genu chřipkového viru.
Podstatu vynálezu tvoří polynukleotidová vakcína, obsahující konstrukt DNA, která indukuje tvorbu neutralizujících protilátek proti chřipkovému viru, tvorbu cytotoxických T-lymfocytů, specifických proti chřipkovému viru, tvorbu cytotoxických T-lymfocytů, specifických proti chřipkovému viru nebo obranné imunitní odpovědi při aplikaci DNA konstruktu in vivo u obratlovců, přičemž polynukleotidová vakcína kóduje gen chřipkového viru, který je po zavedení do tkání uvedených živočichů exprimován in vivo, vakcína obsahuje konstrukt podle nároku 1 a je tvořena
a) oblastí promotoru CMVIntA a oblastí BGH pro ukončení transkripce ze SEKV.ID: 11,
b) prokaryotickým počátkem replikace,
c) genem pro odolnost proti antibiotikům a
d) otevřeným čtecím rámce, uloženým mezi promotor a signál pro ukončení transkripce ze složky a) řídící expresi genu chřipkového viru.
Ve výhodném provedení obsahuje polynukleotidová vakcína jeden nebo větší počet následujících konstruktů:
a) VIJ-PR-NP, jehož 5' koncem je SEKV. ID:12:,
b) VIJ-PR-PB1, jehož 5' koncem je SEKV. ID:13:,
c) V1J-PR-NS, jehož 5'koncem je SEKV. ID:14:,
d) VIJ-PR-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID:15:,
e) V1J-PR-PB2, jehož 5' koncem je SEKV. ID:16:,
f) VIJ-PR-M1, jehož 5' koncem je SEKV. ID:17:,
g) VIJneo-BJ-NP, jehož 5' koncem je SEKV. ID:20: a 3' koncem je SEKV. ID: 21:,
h) VIJneo-TX-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID:24: a 3' koncem SEKV. ID:25 a
i) VlJneo-PA-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID:26: a 3' koncem je SEKV. ID:27:
-5CZ 290315 B6
j) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:46: a 3' koncem je SEKV. ID:47:,
k) VUns-TX-HA (A/Texas/36/91), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:48: a 3' koncem je SEKV. ID:49:
l) VlJns-PA-HA (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:50: a 3' koncem je SEKV. ID:51:,
m) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), o velikosti konstruktu 6,42 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:52: a 3' koncem je SEKV. ID:53:,
n) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), o velikosti konstruktu 5,62 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:54: a 3' koncem je SEKV. ID:55:,
o) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,54 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:56: a 3' koncem je SEKV. ID:57:,
p) VIJns-PA.Ml (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 5,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID:58: a 3' koncem je SEKV. ID:59:.
Chřipkový virus má genom tvořený ribonukleovou kyselinou (RNA) složený z několika segmentů RNA. Každý segment RNA kóduje alespoň jeden genový produkt. NP genový produkt se váže na RNA a zprostředkovává přemístění virové RNA do jádra infikované buňky. Sekvence tohoto produktu je konzervovaná a za 50 let se v její sekvence aminokyselin objevilo pouze 7% odchylek. Produkty genu P (PB1, PB2, PA) jsou odpovědné za syntézu nových virových RNA. Tyto geny jsou dokonce ještě více konzervovány než gen NP. HA je hlavním produktem virového genu pro obal viru. Je méně konzervován než NP. Váže buněčný receptor a slouží tudíž k iniciaci nové chřipkové infekce. Hlavní reakce neutralizačních protilátek je zaměřená proti produktu tohoto genu. Zároveň je proti tomuto proteinu zaměřena výrazná reakce T-lymfocytů. Současné vakcíny proti lidskému chřipkovému viru obsahují tři druhy chřipkového viru nebo jejich HA proteiny. Avšak vzhledem ke zmíněné variabilitě sekvence HA proteinů u různých druhů chřipkových virů musí být tyto vakcíny neustále upravovány podle tohoto druhu patogenního viru, který právě koluje v populaci. Hemaglutinin má však některé zakonzervované elementy pro generace cytotoxických T-lymfocytů, jestliže je správně prezentován. Biologické funkce produktů genů NS1 a NS2 nejsou ještě zcela objasněny, ale tyto proteiny mohou hrát významnou roli ve vyvolání obranné reakce CTL. Konečně produkty genů Ml a M2, které jsou poněkud více konzervovány než HA, vyvolávají hlavní reakci cytotoxických leukocytů. Ml protein je velice hojný produkt virových genů.
Účinnost ochrany vakcínou DNA před následným napadením virem lze prokázat očkováním nereplikujícího se plazmidu DNA kódujícího jeden nebo více zvýše uvedených virových proteinů. Tento způsob je velice výhodný, protože do postupu není začleněna žádná infekční složka, není zapotřebí sestavit žádné virové částice a je umožněn rozhodující výběr. Protože sekvence nukleoproteinu a několika dalších virových produktů jsou konzervované v několika různých druzích chřipkového viru, poskytuje taková vakcína navíc obranu proti následnému napadení virulentním druhem chřipkového viru, který je homologní nebo heterologní s druhem viru, ze kterého byl gen získán a klonován.
DNA konstrukty mající schopnost exprese po přímém zavedení buď injekcí nebo jiným způsobem do živočišné tkáně jsou novými profylaktickými léčebnými přípravky. Indukují tvorbu specifických cytotoxických T-lymfocytů, které na rozdíl od protilátek zaměřených většinou na jediný druh viru rozpoznávají virové antigeny a reagují na různé druhy virů. Tvorba takovýchto CTL in vivo obyčejně vyžaduje endogenní expresi daného antigenu, jako tomu je v případě
-6CZ 290315 B6 virové infekce. Pro tvorbu virového antigenu, který by byl prezentován imunitnímu systému bez omezení daných přímou dopravou peptidu nebo použitím virových vektorů, byla plazmidová DNA kódující proteiny lidského chřipkového viru vstříknuta do čtyřhlavého svalu myší BALB/c. Tyto injekce vyvolaly tvorbu virově specifických CTL a obranu proti následnému napadení heterologním kmenem chřipkového viru. Obranyschopnost byla zobrazena snižujícím se titrem viru v plicích, potlačením úbytku tělesné hmotnosti a zvýšeným počtem přežívajících zvířat. U opic Macaccus rhesus se dosáhlo vysokého titru protilátek proti hemaglutininu a protilátek proti nukleoproteinu a u fretek byl pozorován snížený titr viru v nosním výplachu po napadení homologními i heterologními druhy.
Klíčová pozorování vztahující se k předmětnému vynálezu:
1) Důkaz účinnosti. Po imunizaci DNA pro nukleoprotein (NP) je možno prokázat heterologní ochranu, která se projevuje zvýšeným počtem přežívajících zvířat, sníženým titrem plicních virů a inhibici úbytku tělesné hmotnosti u myší napadených druhem chřipkového viru odlišného od druhu viru, který sloužil jako zdroj genů NP. V tomto případě byly povrchové proteiny těchto dvou kmenů značně odlišné (H1N1 vs. H3N2) a současný druh vznikl 34 let po vzniku počátečního druhu viru. Imunizace fretek DNA genů NP a DNA pro matricový protein (Ml) buď odděleně, společně, nebo ve spojení s HA DNA, poskytovala ochranu (snížené šíření nosních virů) proti napadení pozměněným druhem (klinickým izolátem). Zejména obrana poskytovaná směsí DNA (NP a Ml DNA kódující proteiny Beijing/89 a HA DNA kódující bud’ Beijing/89 nebo Hawaii/91 HA) byla u fretek proti driftovanému druhu (Georgia/93) vyšší, než jakou poskytují patentové vakcíny (obsahující Beijing/89). Ukázalo se, že směs obsahující HA DNA z Hawaii/91 byla o něco účinnější než směs obsahující HA DNA z Beijing/89. Ochrana získaná pomocí směsi zahrnující HA DNA pro Hawaii/91 vedla kochraně totožné stou, která byla pozorována u homologní HA DNA (Georgia/93), zatímco směs s HA DNA pro Beijing/89 se od této homologní ochrany lišila, i když byla stále výrazně lepší než u patentových vakcín. Protilátky HI se tvořily u všech testovaných druhů včetně myší, fretek, makaků a afrických opic.
2) Doba účinnosti. Studie používající DNA kódující reportérový gen popisují přetrvávání DNA a expresi proteinu po dobu nejméně 1,5 roku (nejdéle přetrvávala v testovaných myších; Wolff a kol., Human Mol. Genet., 1992). Takže pokud jsou produkty genů chřipkových virů rovněž trvale exprimovány, pak by i výsledná imunitní odpověď měla být stálá. Protilátky a CTL (Yankauckas a kol., DNA & Cell Biol., 1993) a homologní ochranná imunita (údaje MRL) vyvolané injekcemi DNA u myší rovněž přetrvávaly po dobu delší než jeden rok. Dosavadní testy makaků prokázaly přetrvávání protilátek po dobu nejméně jednoho roku. Délka reakce CTL a heterologní ochrany (vyšší počet přežívajících) je 6 měsíců (zatím dosud nejdelší doba). Došlo k mírnému poklesu stupně heterologní ochrany, ale tuto obraňuje možno zvýšit.
3) Dávkování. Testy prováděné na opicích (Macaccus rhesus) ukázaly, že dvojí dávka o 100 pg HA DNA vedla k dobrému titru protilátek HI, které přetrvávají dosud po dobu jednoho roku. Tvorba obranných látek (zvýšený počet přežívajících po následném heterologním napadení) u myší byla pozorována již při dávkách 6 pg (podané 3krát) a po jediné injekci obsahující 200 pg. Obecně lze říci, že vyšší počet injekcí (až na 3) zvyšoval stupeň ochrany. Prvotní studie ukázaly, že 2 injekce o 10 pg nebo 100 pg DNA kódující 3 HA, NP a Ml (pro geny H3N2 Beijing/89) vedly k titru HI protilátek podobnému titru vyvolanému dosud patentovanými vakcínami. Je velice důležité si uvědomit, že veškerá testovaná zvířata nepřišla s chřipkovým virem nikdy do styku, zatímco cílová klinická populace (starší lidé) má s chřipkou již zkušenosti. (Je nutno zdůraznit, že děti mladší 9 let dostávají 2 injekce dosud patentovaných vakcín.)
-7CZ 290315 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Detekce NP plazmidu DNA ve svalu pomocí technik PCR. Myším byla aplikována třikrát (ve třech týdenních intervalech) injekce obsahující RSV-NP DNA nebo prázdný vektor (100 pg/noha) do čtyřhlavého svalu myší BALB/c a poté byly myši vystaveny chřipkové infekci. Po čtyřech týdnech a po konečné infekci byly svaly vyjmuty a zmraženy v tekutém dusíku. Potom byly rozdrceny v lyzovacím pufru [25mM Tris-HjPO.) pH8,2mM trans-l:2-kyselina diamionocyklohexan-tetra-octová (CDTA), 2mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100] v MIKRODISMEMBRATOR™ (Braun Instruments) a vysokomolekulámí DNA byla extrahována fenol-chloroformovou precipitací. Pro detekci NP plazmidu ve svalu byla použita 40ti cyklová reakce PCR (PCR reakce byla používána podle návodu soupravy Perkin Elmer Cetus GENEAMP™). PCR produkt o délce 772 párů bází (viz šipka) vedoucího od CMV promotoru přes většinu 5' části vloženého NP genu byl vytvořen z negativního oligonukleotidů o 18 bázích s počátkem v promotorové oblasti. (GTGTGCACCTCAAGCTGG, SEKV. ID:1:) a z pozitivního oligonukleotidového priméru o délce 23 bází umístěného v 5' Části vložené NP sekvence (CCCTTTGAGATGTTGCACATTC, SEKV. ID:2:). Tento 772 bp dlouhý produkt je viditelný u vybraných vzorků svalů injektovaných NPDNA a testovaných na agarózovém gelu barveném etidium-bromidem, ale není přítomen u prázdného kontrolního vektoru (600L). Označení každého proužku udává rozlišovací číslo myši a pravou nebo levou končetinu.
Obr. 2. Tvorba NP protilátek u myší, kterým byly aplikovány injekce NP DNA. Myším byly aplikovány injekce obsahující 100 pg Vl-NP DNA do každé končetiny v čase 0, 3 a 6 týdnů. Krev byla odebírána za 0, 2, 5 a 8 týdnů. Přítomnost anti-NP IgG protilátek v séru byla zjišťována pomocí ELISA testů (J. J. Dinnelly a kol., J. Immunol. 145,3071 (1990)) s použitím NP purifíkovaného z hmyzích buněk transfektovaných bakulovirovým expresivním vektorem. Výsledky jsou zakresleny jako střední hodnota logio titru ELISA +/- SEM (n=10) proti času po první injekci NP DNA. Myši imunizované prázdným vektorem nevytvářely žádné zjistitelné NP protilátky.
Obr. 3. Procenta specifické lýzy určená čtyřhodinovým testem uvolňování 51Cr z CTL získaných z myší imunizovaných DNA. Myši byly imunizovány 400 pg Vl-NP DNA (plná kolečka) nebo prázdnými vektory (plné čtverečky) a po 3-4 týdnech usmrceny. Negativní kontrola pro CTL byla získána z neimunizovaných myší (prázdné trojúhelníčky), které se zotavily z infekce A/HK/68 prodělané 4 týdny před odběrem (plné trojúhelníčky). Grafy uvádějí údaje o reprezentativních vzorcích myší. Pro každou sérii podmínek bylo testováno nejméně 8 myší. Graf A: Slezinné buňky opakovaně stimulovanými buňkami ze stejného orgánu pulzovanými NP147-155 a poté vyhodnocené proti buňkám P815 pulzovaným NP147-155. Graf B: Slezinné buňky opakovaně stimulované buňkami ze stejného orgánu pulzovanými NP147-155 a vyhodnocené proti P815 infikovaným chřipkovým virem A/Victoria/73 (H3N2) po dobu 6 hodin před přidáním k CTL. Graf C: Slezinné buňky opakovaně stimulované ConA a IL-2 bez dalšího antigenu a vyhodnocené proti buňkám P815 pulzovaným NP147-155. Panel D: Myším bylo aplikováno 200pg Vl-NP DNA nebo prázdného vektoru v každé injekci třikrát v třítýdenních intervalech. Sleziny byly odebrány 4 týdny po poslední imunizaci, slezinné buňky byly kultivovány s IL-2 a Con A po dobu Ί dní. CTL byly vyhodnoceny proti P815 cílovým buňkám infikovaným A/Victoria/73.
Obr. 4 Ztráta hmotnosti (v gramech) a uzdravení u myší imunizovaných DNA po intranasální infekci (bez anestetik) 104TdD50 A/HK/68. Myši byly imunizovány třikrát
-8CZ 290315 B6 v třítýdenních intervalech Vl-NPDNA nebo prázdným vektorem, nebo jim nebyly aplikovány žádné injekce a byly vystaveny infekci 3 týdny po posledním očkování. Hmotnost 10ti myší byla stanovena v době styku s infekcí a od 4. dne každý den u myší po injekci NP DNA (plná kolečka), kontrolních myší po injekci prázdného vektoru (prázdné trojúhelníčky) a kontrolních myší bez jakékoli injekce (prázdná kolečka). Graf ukazuje střední hodnoty hmotnosti +/- SEM. Myši, kterým byly aplikovány injekce NP DNA, vykazovaly podle t-testů výrazně nižší úbytek váhy ode dne 8 až do dne 13 v porovnání s myšmi po injekcích prázdného vektoru (p<0,005) a myšmi bez injekcí (p<0,01). Mezi kontrolami nebyly pozorovány žádné výrazné rozdíly (p = 0,8 pomocí t-testu).
Obr. 5. Přežívání myší imunizovaných DNA po intranasální infekci (při anestezii) 102'5TCIDso A/HK/68. Myši imunizované třikrát v třítýdenních intervalech Vl-NPDNA (plná kolečka) nebo prázdným vektorem (prázdná kolečka) a kontrolní myši bez injekcí (prázdné trojúhelníčky) byly vystaveny infekci tři týdny po posledním očkování. Procento přežívajících je uvedeno pro skupiny 9ti nebo 10ti myší. Počet přežívajících byl u myší po injekci NP DNA značně vyšší než u kontrolních myší (p=0,0004 podle analýzy χ čtverců).
Obr. 6. Sekvence expresívního vektoru VIJ, SEKV. ID:10:.
Obr. 7. Sekvence expresívního vektoru VIJneo, SEKV. LD: 18:.
Obr. 8. Sekvence CMVintA-BGH promotor-terminátorové sekvence, SEKV.ID: 11.
Obr. 9. Opičí protilátky anti-NP.
Obr. 10. Inhibice hemaglutininu fretek. Tečkovaná čára označuje minimální titr obranných protilátek. Průměrná hodnota je označena přeškrtnutým kroužkem.
Obr. 11 IgG protilátky proti NP u fretek po imunizaci DNA.
Obr. 12. Šíření viru po infekci chřipkovým virem u fretek po očkování a bez očkování.
Obr. 13. Diagram vektorů pRSV-PR-NP a VI-NP. Písmeno X označuje vloženou kódující oblast.
Obr. 14. Diagram chřipkových proteinů a kmenů.
Obr. 15. Schéma zpracování očkované DNA v buňce.
Obr. 16. Rezistence fretek proti chřipce A/RP/8/34 vyvolaná očkováním HA a geny pro vnitřní proteiny.
Obr. 17. Schéma vektoru VI Jns.
Obr. 18. Africké opice byly očkovány směsí DNA sestávající z HA DNA (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texas/91), NPDNA (A/PR/34) a Ml DNA (A/PR/34) a Ml DNA (A/PR/34). Každá složka byla obsažena v množství buď 10 pg (plné čtverečky) nebo 100 pg (plná kolečka) aplikovaných dvakrát v šestitýdenních intervalech (viz šipky). Pro srovnání byla další zvířata očkována vakcínami se subviriony (prázdné čtverečky) a viriony (prázdná kolečka) v plné dávce určené pro lidský organismus (45 pg ekvivalentních proteinů; 15 pg na HA). Vzorky séra byly odebírány každé dva týdny po dobu 18 týdnů a byl zjišťován titr Hl proti A/Beijing/89 HA. Údaje jsou udány jako střední geometrické hodnoty Hl +/- SEM, kde n = 3.
-9CZ 290315 B6
Obr. 19. Samice myší BALB/c (4-6 týdnů) byly očkovány A/PR/34 NP DNA (200 pg) třikrát v třítýdenních intervalech. Skupiny myší pro negativní kontrolu zahrnovaly myši očkované kontrolní DNA (200 pg), rekombinantním NP proteinem (10 pg) a neimunizované myši bez očkování. Pro srovnání byly testovány rovněž myši infikované chřipkovým virem A/HK/68. CTL byly získány 6 měsíců po dávce a byly opětovně stimulovány in vitro slezinnými syngenními buňkami infikovanými virem. Poté byly testovány proti buňkám P815 pulzovaným NP peptidem v poměru efektor: recipient 10:1. Uvedená čísla představují % specifické lýzy +/- sd, kde n = 3.
Obr. 20. Myši C3H/HeN byly očkovány normálními myoblasty C2Ci2 (1 x 107 buněk). Toto množství NP proteinu (2 pg) bylo dostatečné k vyvolání tvorby protilátek a rovnalo se přibližně stonásobnému množství NP proteinu přítomného v transplantovaných myoblastech transfektovaných NP. CTL byly z těchto myší připraveny šest týdnů pro reakci a opětovně stimulovány in vitro syngenními slezinnými buňkami infikovanými chřipkovým virem. Jako pozitivní kontrola byly připraveny CTL z myší, které byly infikovány chřipkovým virem A/HK/68. Jako cílové buňky byly použity myoblasty transfektované NP (tečkované sloupce), neošetřené buňky (plné sloupce) a myoblasty infikované chřipkovým virem A/Victoria/73 (proužkované sloupce) v poměru efektor : recipient 25:1. Údaje jsou uváděny v % specifické lýzy +/- sd, kde n = 3.
Obr. 21. Čtyřtýdenním samicím myší BALB/c bylo očkováno do svalu 200 pg NP DNA třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po třetím očkování byly myši vystaveny v anestezii celkové infekci dýchacího traktu 300 TCID50 A/HK/68. Podíl přežívajících myší (10 myší/skupina) je vyznačen tečkovanou čarou proti délce doby od styku s infekcí.
Obr. 22. Čtyřtýdenní samice myší BALB/c byly očkovány do svalu trojí dávkou 100 pg NP DNA v třítýdenních intervalech. Po třetím očkování byly myši podrobeny anestezii a aplikaci 300 TCID50 A/HK/68 (napadení celkového dýchacího traktu). Myši byly každý den váženy a byl počítán hmotnostní poměr k jejich počáteční hmotnosti. Střední hodnota procent z původní hmotnosti byla pak spočítána pro každou přežívající myš. Střední hodnota procent počáteční hmotnosti je vyjádřena proti délce doby od vystavení infekci +/- SEM.
Obr. 23. Čtyřtýdenní samice myší BALB/c byly očkovány do svalu 200 pg NP DNA třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po třetím očkování byly myši vystaveny 200 TCID50 A/HK/68 aplikovaného bez anestezie (horní cesty dýchací). Sedm dní po styku s infekcí byly myši utraceny, byly jim odebrány a homogenizovány plíce. Titr viru byl určen sérií titrací na buňkách MDČK.
Obr. 24. Čtyřtýdenní samice myší BALB/c byly očkovány do svalu dávkami 6,25, 25, 100 nebo 200 pg NP DNA třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po posledním očkování byly myši vystaveny 300 TCID50 A/HK/68 v anestezii (napadení celkového dýchacího traktu). Podíl přežívajících myší (10 myší na skupinu) je vyznačen proti délce doby od provedení infekce.
Obr. 25. Čtyřtýdenní samice myší BALB/c byly očkovány do svalu třikrát v třítýdenních intervalech 200 pg A/PR/34 NP DNA, kontrolní DNA nebo fingovanými injekcemi. Myši byly vystaveny v anestezii 300 TCID50 A/HK/68 v době 6, 12 a 25 týdnů po třetí injekci DNA. Vybrané myši byly opětovně imunizovány 200 pg NP DNA ve 22. týdnu a pak v 25. týdnu („Reboost“). Střední hodnoty hmotností jsou uvedeny jako procento počáteční celkové hmotnosti každé skupiny. Uvedená kontrolní hmotnost je střední hodnotou hmotností všech kontrolních skupin od 6., 12. a 25 týdne po infekci,
-10CZ 290315 B6 tj. celkového počtu 6 skupin, které obdržely kontrolní DNA nebo fiktivní injekce.
Skupiny zpočátku obsahovaly každá 10 zvířat. Hmotnost uhynulých zvířat nebyla do celkového rozboru zahrnuta.
Obr. 26. Dospělí samci fretek (staří 22-28 týdnů) byli dne 0 a 42 očkováni do svalu 1 mg DNA kódující NP z A/Beijing/89, 1 mg DNA kódující Ml z A/Beijing/89 nebo 1 mg DNA kombinované zobou typů. Kontrolní fretky dostaly nekódující DNA nebo plnou lidskou dávku (15 pg/druh) patentované vakcíny z celých chřipkových virů (formulace 92-93) obsahující A/Beijing/89. Očkování proběhlo v den 0 a 42. V den 56 byly fretky vystaveny infekci A/Georgia/93. Šíření virů v nosních sekretech bylo stanoveno podle výše uvedených metod. Toto šíření bylo ve dnech 3-5 porovnání metodou dvousměmé analýzy variance s šířením nákazy u fretek, kterým byla podána kontrolní DNA. Šíření virů u fretek, kterým byla podána NP DNA, Ml DNA, nebo NP+M1 DNA bylo výrazně nižší (p<0,0001, p<0,0016 a p<0,0001) než u kontrolních fretek. Šíření viru u fretek, kterým byla podánaNP (čísla nejsou uváděna), Ml nebo NP+M1 DNA nebylo nijak výrazně odlišné od šíření u fretek, kterým byla podána patentovaná vakcína (p=0,104. 0,533 a 0,145). Očkovací dávka byla vybrána náhodně. Studie dávkování byly provedeny na člověku nepříbuzných primátech.
Obr. 27. Skupina 8 samců fretek starých 22-25 týdnů byla očkována do svalu kontrolní DNA, fyziologickým roztokem nebo DNA kódující proteiny chřipky A/PR/8/34 ve dnech 0,21 a 121. V den 148 byli tito samci vystaveni intranasální infekci 200TCID50 A/PR/8/34. Očkovaná zvířata obdržela lmg NP DNA nebo 2 mg NP, NS1, PB1, PB2 a kombinované Ml DNA (400 pg každého konstruktu). Kontrolní zvířata dostala fyziologický roztok nebo 1 mg kontrolní DNA v množství 0,5 ml na jednu končetinu. Pro účely další analýzy byly skupiny, které obdržely fyziologický roztok a kontrolní DNA, zkombinovány (Kontrola) stejně jako skupiny, které dostaly samotnou NP DNA nebo v kombinaci s dalšími geny pro vnitřní proteiny (Vnitřní). Graf ukazuje, že infekčnost nosních sekretů je vyjádřena titrem TCID50 na 50 ml ve 3ml objemu nazální tekutiny. Předpokládalo se, že neředěná nosní tekutina (testováno nejmenší ředění) je v poměru 1:10 k původnímu nosnímu výměšku, pozitivní neředěný vzorek byl vyhodnocován jako hodnota 1 log. Titry nad 1 log byly vyhodnoceny podle interpolace Reed-Muench se třemi opakováními při dosažení konečné infekčnosti 50%. Vzorkům, které byly negativní v neředěném stavu, byla přiřazena hodnota 0 log. Hodnoty p uvedené v grafu jsou počítány pro očkované fretky versus kontroly ve vyznačených dnech pomocí T-testů. Hodnoty p pro celkovou křivku byly počítány dvousměmou analýzou variance a byly pro <0,0001 pro NP versus kontrola a <0,001 pro kombinované DNA versus kontrola.
Obr. 28. Přežití myší očkovaných DNA a pak vystavených chřipkovému viru. Myši byly očkovány do svalu 200 pg DNA kódující HA z A/PR/34 nebo kontrolní (nekódující) DNA třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po posledním očkování bylo myším v anestezii nakapáno do celkového dýchacího traktu 1000 TCID50 A/PR/34. Hodnoty jsou uváděné jako % přežívajících proti délce času po zavedení infekce (n= 9 nebo 10 myší na skupinu).
Obr. 29. Úbytek hmotnosti myší očkovaných DNA a pak vystavených infekci chřipkovým virem. Myši byly očkovány 200 pg DNA kódující HA z A/PR/34 nebo kontrolní (nekódující) DNA, třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po posledním očkování bylo myším v anestezii nakapáno do celkového dýchacího traktu 1000TCID50 A/PR/34. Hodnoty jsou vyjádřeny jako % původní hmotnosti u každého jednotlivého zvířete, zprůměrované pro každou skupinu a vynesené proti času. (Uhynulá zvířata byla vyjmuta ze středních hodnot).
-11 CZ 290315 B6
Obr. 30. Přežívání myší očkovaných DNA a pak vystavených infekci chřipkovým virem. Myši byly očkovány do svalu 1, 10 nebo 100pg DNA kódující HA z A/PR/34 nebo kontrolní (nekódující) DNA, třikrát v třítýdenních intervalech. Tři týdny po posledním očkování bylo myším v anestezii nakapáno do celkového dýchacího traktu 1000 TCID50 A/PR/34. Hodnoty jsou vyjádřeny jako % přežívajících proti času po infekci (n = 9 nebo 10 na skupinu).
Obr. 31. Skupiny po 8 samcích fretek starých 22-25 týdnů byly ve dnech 0, 21 a 121 očkovány do svalu kontrolní DNA, fyziologickým roztokem nebo DNA kódující proteiny chřipky A/PR/34. Stočtyřicátýosmý den bylo fretkám aplikováno do nosního traktu 200 TCID50 A/PR/34. Očkovaná zvířata dostala 1 mg HA DNA nebo 2 mg HA, NP, NS1, PB1, PB2 a Ml DNA kombinovaných v množstvích 330 pg z každého konstruktu. Kontrolní fretky dostaly 0,5 ml/noha fyziologického roztoku nebo kontrolní DNA. Pro účely analýzy byly zkombinovány skupiny, které dostaly fyziologický roztok nebo kontrolní DNA (Kontrola), a skupiny které dostaly samotnou HA DNA nebo v kombinaci s geny pro ostatní vnitřní proteiny (HA, HA+vnitřní). Graf ukazuje titr infekčnosti nosní tekutiny v TCID50 na 50 μΐ v 3 ml objemu nosní tekutiny (po výplachu). Neředěná nosní tekutina (testováno nejnižší ředění) byla brána jako ředění původního nosního výměšku 1 : 10 a pozitivnímu neředěnému vzorku byla přiřazena hodnota 1 log. Titry nad 1 log byly přiřazeny podle interpolace Reed-Muench mezi třemi opakováními pro získání konečné 50% infekčnosti. Negativním vzorkům testovaným v neředěném stavu byla přiřazena hodnota 0 log. Hodnoty p pro celé křivky byly počítány dvousměmou analýzou variance a byly pro HA versus kontrola <0,0001 pro kombinovanou DNA versus kontrola <0,0001.
Obr. 32. Dospělí samci fretek ve stáří 22-28 týdnů byli očkováni do svalu 1 mg DNA kódující HA z A/Georgia/93 ve dnech 0 a 42. Kontrolní fretky dostaly nekódující DNA nebo plnou lidskou dávku (15 pg/kmen) patentované vakcíny s celými chřipkovými viry (formulace 92-93) obsahující A/Beijing/89 rovněž ve dnech 0 a 42. Fretky byly 56. den vystaveny působení A/Georgia/93. Výskyt viru v nosním výplachu byl určen metodami uvedenými výše. Koncentrace viru ve dnech 1-6 byla srovnána se stavem viru u fretek, kterým byla podána kontrolní DNA, metodou dvousměmé analýzy variance. Výskyt u fretek, které dostaly HA DNA, byl výrazně nižší (p<0,0001) než u kontrolních fretek.
Obr. 33. Dospělí samci fretek ve stáří 22-28 týdnů byli očkováni do svalu 1 mg DNA kódující HA z A/Hawaii/91 nebo A/Beijing/89 (neuváděné údaje) ve dnech 0 a 42. Kontrolní fretky dostaly nekódující DNA nebo plnou lidskou dávku (15 pg/kmen) patentované vakcíny s celými chřipkovými viry (formulace 92-93) obsahující A/Beijing/89 rovněž ve dnech 0 a 42. Fretky byly 56. den vystaveny působení A/Georgia/93. Výskyt viru v nosním výplachu byl určen metodami uvedenými výše. Koncentrace viru ve dnech 1-6 byla srovnána se stavem viru u fretek, kterým byla podána kontrolní DNA, metodou dvousměmé analýzy variance. Výskyt u fretek, které dostaly HA DNA z A/Hawaii/91, byl výrazně nižší (p<0,0001) než u kontrolních fretek. Výskyt u fretek, které dostaly HA DNA z A/Hawaii/91 byl výrazně nižší než u fretek, které dostaly patentované výrobky (p=0,021 pro A/Hawaii/91 HA DNA, dvousměmá ANOVA pro dny 1-6). Výskyt u fretek, které dostaly A/Beijing/89 HA DNA (neuváděné údaje) nebyl nijak výrazně odlišný od hodnot získaných u fretek, kterým byl aplikován patentovaný výrobek (p=0,058, dvousměmá ANOVA pro dny 1-6).
Obr. 34. Dospělí samci fretek ve stáří 22-28 týdnů byli očkováni do svalu 1 mg DNA kódující HA z A/Hawaii/91 (viz obr. 13) nebo 330 pg každé DNA kódující HA z A/Hawaii/91 aNP a Ml z A/Beijing/89. Očkování proběhlo ve dnech 0 a 42. Kontrolní fretky dostaly nekódující DNA nebo plnou lidskou dávku (15 pg/druh) patentované vakcíny obsahující celé chřipkové viry (formulace 92-93)
-12CZ 290315 B6
Obr. 35. Dospělí samci fretek ve stáří 22-28 týdnů byli očkováni do svalu 1 mg DNA kódující HA z A/Georgia/93 nebo po 330 pg DNA kódující HA z A/Hawaii/91, NP a Ml z A/Beijing/89 ve dnech 0 a 42. Kontrolní fretky dostaly v den 0 a 42 nekódující DNA nebo plnou lidskou dávku (15 pg/druh) patentované vakcíny z celých virů (formulace 92-93) obsahující A/Beijing/89. Padesátý šestý den byly fretky vystaveny infekci A/Georgia/93. Výskyt viru v nosním výplachu byl stanoven výše uvedenými metodami. Výskyt ve dnech 1-6 byl porovnán s výskytem viru u fretek, kterým byla podána kontrolní DNA, metodou dvousměmé analýzy variance. Výskyt u fretek očkovaných HA+NP+M1 DNA se příliš nelišil od hodnot zjištěných u fretek očkovaných homologní HA DNA (p = 0,064).
Obr. 36. Sekvence VIR.
Tento vynález popisuje léčebné přípravky znukleových kyselin, které, jsou-li zavedeny do živočichů včetně obratlovců jako savců a člověka, v nich vyvolají expresi proteinů kódovaných těmito kyselinami. Těmito proteiny jsou ty proteiny, které se v živočišném organismu za normálních okolností nevyskytují kromě patologického stavu. Jedná se například o proteiny jako chřipkový nukleoprotein, neuroamidázu, hemaglutinin, polymerázu, matricový protein nebo nestruktumí proteiny, ale nejen o ně. Imunitní systém živočicha je po těchto přípravcích aktivován ke tvorbě obranné reakce. Protože tyto exogenní proteiny jsou produkovány vlastními tkáněmi daného živočicha, jsou exprimované proteiny v organismu zpracovány a prezentovány prostřednictvím hlavního histokompatibilního komplexu, MHC. Toto rozpoznávání je totožné s mechanismy, které probíhají při skutečné infekci daného organismu. Výsledkem je indukce imunitní odpovědi, která chrání proti virové infekci. Dokumentace k těmto výsledkům je uvedena v příloze.
Tento vynález popisuje nukleové kyseliny, které po zavedení do tkání živočicha in vivo očkováním, inhalací nebo na základě podobného mechanismu (viz Dosavadní stav techniky) vyvolají expresi genů lidského chřipkového viru. Tak například očkováním konstruktu DNA podle tohoto vynálezu do svalu myší vyvolá expresi kódovaných genových produktů. Podobně tomu je u fretek a makaků. U živočichů očkovaných polynukleotidovou vakcínou byla po napadení virulentním chřipkovým virem v dávkách, které jednoznačně usmrcovaly kontrolní zvířata, prokázána nižší nemocnost i úmrtnost. Tento vynález tudíž popisuje očkování použitelné pro lidský organismus a zabraňující nákaze chřipkovým virem.
Ukázali jme, že DNA konstrukty kódující proteiny chřipkových virů vyvolávají u zvířat imunitní odpověď. Jak bude dále blíže popsáno, imunitní odpovědi myší zahrnovaly tvorbu protilátek a CTL, u fretek a primátů tvorbu protilátek, a poskytovaly u myší a fretek obranu proti napadení homologními, tj. driftovanými nebo shiftovanými, kmeny chřipkových virů. Pravděpodobně nejpřekvapivějším výsledkem očkování DNA kódující virové proteiny byla schopnost poskytnout obranu proti odlišným typům chřipkového viru. Z toho vyplývá, že přidání složek vyvolávajících tvorbu CTL do vakcíny by mělo sloužit pro potlačení účinku nových variant virů, které se objevují v průběhu sezóny nebo o které nejsou v době přípravy vakcíny, která se připravuje pro další následující rok, ještě známy. Důležitým faktem je, že očkování vektory cDNA kódujícími geny HA, NP a Ml poskytovalo fretkám obranu proti driftovanému druhu viru, která byla účinnější než u již patentovaných vakcín. Tato skutečnost hovoří ve prospěch používání konstruktů kódujících celé geny v PNV.
Jedním z provedení tohoto vynálezu je vakcína obsahující samostatné plazmidy DNA, například ze tří převládajících klinických kmenů představovaných viry A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) a B (B/Panama/90) a z konstruktů DNA kódujících vnitřní konzervované proteiny NP a Ml (matrix) jak z druhu A (Beijing/89; H3N2), tak z kmenů B, aby tak poskytovala současnou obranu proti driftovaným i shiftovaným antigenům. Molekuly HA DNA povedou k tvorbě HA a k výsledným neutralizačním protilátkám proti HA. Toto působení bude
-13CZ 290315 B6 druhově specifické se širším záběrem obrany proti driftovaným druhům v porovnání sjiž patentovanými vakcínami založenými na proteinech. Konstrukty NP a Ml povedou k tvorbě CTL, které budou poskytovat obranu proti různým druhům virů při potenciálně nižším virovém zatížení a s rychlým průběhem uzdravení z onemocnění. Předpokládané přetrvávání DNA konstruktů (v epizomální, nereplikující se a neintegrující se formě ve svalových buňkách) by mělo v porovnání se současnými vakcínami poskytnout prodlouženou ochranu.
Předpokládané výhody oproti současným vakcínám zahrnují: širší záběr obrany vzhledem k tvorbě CTL +/- větší šíře protilátek, prodloužená délka trvání ochrany. Použití PNV nevyžaduje vytvoření, selekci a rozmnožování určitého druhu viru, tak jak se to provádí pro současné vakcíny, protože nové konstrukty DNA mohou být vytvořeny přímo z izolátů z klinické praxe.
V jednom z provedení tohoto vynálezu je nukleoprotein lidského chřipkového viru NP a jeho sekvence získán z druhu A/PR/8/34 a klonován do expresivního vektoru. Vektor obsahuje promotor pro transkripci RNA polymerázy a terminátor transkripce sekvence kódující NP.
V jednom z provedení je tímto promotorem LTR část viru RSV (Rous sarcoma virus), která je silným transkripčním promotorem. Častějším promotorem je promotor cytomegaloviru s intronovou sekvencí A (CMT-intA). Používaným terminátorem transkripce je terminátor hovězího růstového hormonu, BGH. Zvláště výhodná je jako terminátor kombinace obou terminátorů CMVintA-BGH. Dále pro usnadnění farmaceutické přípravy přípravku je do expresivního vektoru většinou zahrnut signální znak pro rezistenci na antibiotika. Pro tyto účely lze použít geny pro rezistenci na antibiotika. Pro tyto účely lze použít geny pro rezistenci vůči ampicilinu, neomycinu nebo jakýkoli další signální znak pro rezistenci vůči dalším farmaceuticky přijatelným antibiotikům. V upřednostňovaném provedení tohoto vynálezu kóduje signální znak pro rezistenci na antibiotika produkt pro neomycinovou rezistenci. Dále je výhodné pro účely farmaceutické výroby v prokaryotických organismech, aby vektor obsahoval počátek replikace a byl přítomen ve vysokém počtu kopií. Tyto vlastnosti má kterýkoli komerčně dostupný prokaryotický klonovací vektor. V uváděném provedení tohoto vynálezu byly tyto funkce zabezpečeny komerčně dostupnými vektory označovanými pUC. Je vhodné odstranit nedůležité sekvence DNA, proto jsou v jednom z provedení tohoto vynálezu zpUC plazmidu odstraněny sekvence kódující lacZ a láci.
V jednom z provedení tohoto vynálezu je použit jako expresivní vektor pnRSV, přičemž LTR sekvence RSV je použita jako promotor. V jiném provedení tohoto vynálezu, VI, je použit mutovaný vektor pBR322, do kterého byly klonovány CMV promotor a transkripční terminátor BGH. Konstrukt Vl-NP byl použit kočkování myší a indukci CTL, které ochraňují proti různorodé nákaze. Ve zvláště upřednostňovaném provedení tohoto vynálezu byly složky VI kombinovány při přípravě expresivního vektoru označeného VIJ. Do VIJ je klonován gen chřipkového viru jako třeba A/PR/8/334 NP, PB1, NS1, HA, PB2 nebo gen Ml. V jiném provedení vynálezu je však gen pro ampicilinovou rezistenci v VIJ nahražen genem pro neomycinovou rezistenci, čímž vznikl vektor VIJ-neo (SEKV.ID:18:, obr. 7), do kterého bylo pro účely tohoto vynálezu klonováno několik různých genů chřipkových virů. V dalším provedení tohoto vynálezu byl použit vektor VIJns, který je stejný jako VIJ až na to, že do jednoduchého restrikčního místa KpnI v poloze 2114 v VIJ-neo bylo vloženo unikátní restrikční místo Sfil. Výskyt míst Sfil v lidské genomové DNA je velice nízký (přibližně 1 místo na 100000 bází). Tak tento vektor umožňuje pečlivé sledování integrace expresivního vektoru do hostitelské DNA pouhým štěpením extrahované DNA pomocí restriktázy Sfil. V další úpravě je vektorem VIR. V tomto vektoru bylo odstříháno co možná největší množství nepotřebné DNA, aby se získal vysoce kompaktní vektor. Tento vektor je odvozen od VIJns a je uveden na obrázku 36 (SEKV.ED.:45:). Tento vektor umožňuje zavedení větších inzertů se sníženým rizikem nežádoucích kódujících sekvencí a optimalizuje příjem buňkami, když je konstrukt kódující specifické geny chřipkových virů zaveden do okolní tkáně. Na obrázku 36 jsou části VIJ-neo (obr. 7), které byly odejmuty, označeny jako mezera, a vložené sekvence jsou uvedeny tučnými písmeny, avšak číslování VIJ-neo zůstává nezměněno. Pomocí technik známých pro
-14CZ 290315 B6 odborníky v tomto oboru lze dosáhnout dalších úprav vektoru a nových vývojových metod. Zde uváděné výrobky jsou pro ty účely, ke kterým byly vytvořeny, obzvláště vhodné, i když byly připraveny pomocí konvenčních prostředků.
Ačkoli jedno z provedení tohoto vynálezu využívá NP gen chřipkového viru z druhu A/PR/8/34, více upřednostňovaná provedení využívají NP gen, HA gen, NA gen, PB gen, Mgen nebo NS gen z nedávnějších izolátů chřipkových genů. Provedení zahrnuje přípravu kopií DNA virových genů a následné subklonování jednotlivých genů. Sekvence genů mnoha chřipkových virů jsou v současné době přístupné veřejnosti v GENBANK (kolem 509 těchto sekvencí pro geny chřipky A). Proto jsou v tomto vynálezu přednostně používány geny klonované ze současných virových izolátů Texas, Beijing nebo Panama, což jsou druhy doporučované Centrem pro kontrolu nemocí (Center for Disease Control) pro použití v očkovacích vakcínách proti chřipce (viz FLI-IMMUNE® vakcína proti chřipkovému viru Lederle, Physicians Desk Reference, 1993, str. 1232, vakcína s purifíkovaným trivalentním povrchovým antigenem chřipkového viru obsahující hemaglutininový protein z A/Texas/36/91, H1N1; A/Beijing/353/89, H3N2; a B/Panama/45/90). Abychom používali stejnou terminologii, přijali jsme pro popisy DNA konstruktů následující konvenci: „označení vektoru - druh chřipky - gen“. Tak je konstrukt, který obsahuje NP gen z kmene A/PR/8/34 a který je klonován do expresivního vektoru VIJneo označen: „VIJneo-PR-NP“. Avšak protože se etiologický druh viru mění, může se přirozeně změnit i gen, který je pro inkorporaci do farmaceutického přípravku nejvhodnější. Jak však uvádíme dále v tomto dokumentu, mají indukované imunitní odpovědi cytotoxických lymfocytů schopnost obrany proti heterologním druhům, takže u nových vakcín podle tohoto vynálezu není proměnlivost druhů chřipkových virů v porovnání s dosavadními vakcínami založenými na celých virech nebo jejich podjednotkách tak kritickým problémem. Ve prospěch nových vakcín podle tohoto vynálezu navíc hovoří i skutečnost, že tyto přípravky jsou snadno použitelné při inzerci nových genů a tato jejich vlastnost umožňuje jejich snadné úpravy pomocí standardních technik molekulární biologie.
Protože je sekvence nukleoproteinu konzervována v různých druzích chřipkových virů, bylo tak dosaženo obrany proti následné nákaze virulentním kmenem viru chřipky A, který byl heterologní s kmenem, ze kterého byl gen pro nukleoprotein klonován. Porovnání nukleoproteinů NP z mnoha druhů chřipky A neukázalo žádné významné rozdíly v jejich sekundární struktuře [M. Gammelin a kol., Virol. 170, Ί1, 1989] a v sekvenci aminokyselin bylo zjištěno pouze pár změn [O. T. Gorman a kol., J. Virol. 65, 3704, 1991]. V průběhu přibližně 50ti let se u nukleoproteinů lidských chřipkových virů objevují změny v aminosekvenci v míře pouhých 0,66 aminokyseliny za rok. Naše výsledky navíc ukazují, že A/HK/68-specifické CTL rozpoznávají cílové buňky pulzované syntetickým peptidem NP(147-155) odvozeným od sekvence nukleoproteinu z A/PR8/34, což znamená, že tyto H-2Kd-omezení epitopy CTL zůstaly funkčně nedotčeny přes 34 let (viz obr. 2). Je třeba si rovněž uvědomit, že tam, kde geny kódují povrchový antigen viru, jako je třeba hemaglutinin nebo dokonce neuramidázu, vzniká kromě velice důležité odpovědi cytotoxických lymfocytů rovněž i výrazná imunitní odpověď neutralizačních humorálních protilátek.
Nitrosvalová injekce expresivního DNA vektoru kódujícího konzervovaný vnitřní protein chřipky A vedl k tvorbě výrazné obranné odpovědi při následné virové nákaze. Především došlo k tvorbě NP-specifíckých protilátek a primárních cytotoxických lymfocytů. Očkování NP DNA vedlo v porovnání s kontrolními objekty ke snížením titrům virů v plicích, potlačení úbytku tělesné hmotnosti a zvýšenému počtu přežívajících. Nedostatečná účinnost samotných NP protilátek uvedená v příkladu 4 potvrzuje, že obranná imunitní odpověď při boji s virovou nákazou nebyla zprostředkována NP-specifickými protilátkami, ale spíše prostřednictvím NP-specifické buněčné imunity. Navíc se vytvořily významné hladiny primárních cytotoxických leukocytů zamířených proti NP. Obrana byla proti virulentnímu druhu chřipky A, který byl heterologní k druhu, ze kterého byla klonována DNA. Napadající druh viru vznikl po více než třiceti letech po druhu A/PR/8/34, což dokazuje, že imunitní odpověď namířená proti konzervovaným proteinům může být účinná i přes antigenní posun nebo drift u různých proteinů
-15CZ 290315 B6 virového obalu. Protože každý genový produkt virů vykazuje určitý stupeň konzervace a protože se cytotoxické leukocyty tvoří na základě vnitrobuněčné exprese a zpracování MHC, dá se předpokládat, že geny ostatních chřipkových virů vyvolají odpověď analogickou té, která byla dosažena pro NP. Metody pro rozpoznávání imunogenních epitopů jsou v současné době mezi odborníky dobře známy [viz např. Shirai a kol., J. Immunol 148, 1657-1667, 1992; Choppin a kol., J. Immunol. 147- 575-583, 1991; Calin-Laurens a kol., Vaccine lk. 974-978, 1993]. Jak ukazuje klonované a sekvenované místo v expresivním vektoru (viz níže), bylo mnoho těchto genů klonováno tak, aby byly tyto léčebné přípravky k dispozici ve vhodné formě.
Tento vynález tudíž popisuje expresivní vektory kódující protein chřipkového viru jako imunogen. Tento vynález poskytuje prostředky pro indukci obranyschopnosti proti různým virovým kmenům bez potřeby samostatně se replikující přísady nebo pomocné látky. Očkování DNA navíc poskytuje mnoho dalších výhod. Za prvé, tento očkovací postup byl mohl být použit pro nádorová onemocnění stejně jako pro infekci, protože imunitní odpověď CD8 CTL hraje důležitou úlohu u obou těchto patofyziologických procesů [K. Tanaka a kol., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Vyvolání imunitní odpovědi proti proteinu se zásadním významem pro transformační proces může tedy být účinným prostředkem v imunoléčbě nebo obraně proti rakovině. Za druhé, tvorba vysokého titru protilátek proti proteinům exprimovaným po injekci virového proteinu (NP nebo hemaglutininu) a DNA pro lidský růstový hormon [viz např. D.-c. Tang a kol., Nátuře 356, 152, 1992] naznačuje, že toto je jednoduchý a vysoce účinný prostředek pro přípravu vakcín založených na protilátkách buď samostatných, nebo v kombinaci s vakcínami cytotoxických T-lymfocytů zaměřených na konzervované antigeny.
Jednoduchost přípravy a purifíkace konstruktů DNA je srovnatelná zvláště s tradiční purifíkací proteinů a umožňuje přípravu kombinovaných vakcín. Mohou být tak připraveny násobné konstrukty, jako například konstrukty kódující NP, HA, Ml, PB1, NI nebo kterékoli jiné geny chřipkových virů, které mohou být dále míchány nebo aplikovány společně. A konečně, protože exprese proteinů je prováděna po injekci DNA [H. Lin a kol., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen a kol., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao a kol. Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Wolf a kol., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)], může být zvýšena dlouhodobá paměť buněk B a T [D. Gray a P. Matzinger, J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S. Oehen a kol., tamtéž 176, 1273 (1992)], a tudíž vytvořena dlouhodobá humorální imunita i imunita zprostředkovávaná buňkami.
Omezení současných vakcín tím více zdůrazňují potřebu rozvoje nových účinných prostředků pro prevenci proti infekci a zmírnění onemocnění. Starší vakcíny poskytují pouze omezenou obranu, jsou účinné proti pouze několika vybraným kmenům virů a jejich účinnost mizí po krátké době. Proto musí být současné očkovací látky přeformulovány pro časnou inokulaci, aby mohly být účinné. Tvorba zvýšené odpovědi CTL proti vnitřním proteinům by pravděpodobně poskytla značnou dlouhodobou imunitu proti různým kmenům, kterou v současné době podávané vakcíny zdaleka neposkytují.
Předvedli jsme expresi proteinů z PNV konstruktů u myší, fretek a primátů člověku nepříbuzných pomocí detekce imunitní odpovědi hostitelského organismu namířené proti antigenům chřipkových virů. Očkování myší DNA kódující chřipkové NP vedlo ke zvýšenému počtu přežívajících objektů, sníženému plicnímu titru virů a menšímu úbytku tělesné hmotnosti v porovnání s kontrolními zvířaty vystavenými infekci subtypů chřipkových virů (posunutých kmenů) odlišných od těch, které byly použity pro DNA konstrukty. Rovněž jsme pozorovali snížené šíření viru po infekci posunutými kmeny u fretek, které byly očkovány NP DNA. Tyto výsledky ukazují, že obrana proti hlavním posunům v kmenech chřipkových virů je zprostředkována vakcínou obsahující DNA sgeny kódujícími NP. Očkování HA DNA a následná infekce experimentálních zvířat driftovanými virovými kmeny vedla k ještě výraznějšímu snížení šíření viru. Přidáním DNA pro vnitřní protein ještě mírně zvýšilo již tak vysoký stupeň obrany pozorované po očkování samotnou HA DNA.
-16CZ 290315 B6
Imunitní odpověď na chřipkovou DNA byla u myší pozorována ještě šest měsíců po aplikaci injekce společně s přetrváváním protilátek, aktivitou CTL a obranou in vivo. Opakovaná injekce DNA ještě dále zvýšila počet přežívajících po následné infekci chřipkovým kmenem odlišného subtypu za 25 týdnů a ukázala možnost zvýšení obranyschopnosti zprostředkovávané buňkami. Přetrvávání protilátek bylo rovněž pozorováno po dobu nejméně jednoho roku po dvou injekcích HA DNA, přičemž u afrických opic protilátky přetrvávaly po dobu nejméně devíti měsíců po jediné injekci HA DNA.
Výsledky těchto experimentů prováděných na zvířatech ukazují, že přímé injekce DNA poskytují moderní metodu ochrany lidského organismu proti chřipkové infekci a onemocnění. Experimentální ochrany pomocí injekcí DNA bylo dosaženo očkováním myší a fretek, které před tím nepřišly s infekcí do styku. Lidé očkovaní DNA budou mít za sebou již předchozí zkušenost s chřipkou. Tyto osoby budou po očkování konstrukty DNA vykazovat ještě výraznější imunitní odpověď a možná i s delším trváním.
Pro optimalizaci použité koncentrace je rozsah dávek porovnán s imunogenicitou. V pokusech s malými savci vyvolalo odpovědi cytotoxických leukocytů již tak malé množství jako 1 pg NP DNA. Očkování afrických opic vyvolalo protilátkovou odpověď u dvou zvířat ze dvou při dávkách 100 pg a 1000 pg HA DNA (A/PR/08/34), zatímco jedno zvíře ze dvou reagovalo na samostatnou dávku 10 pg. V oddělených experimentech byly africké opice, které ještě nepřišly do styku s infekcí, očkovány směsí pěti různých konstruktů DNA kódujících HA ze tří virových subtypů spolu sDNA kódující NP a Ml z chřipkového viru typu A. Tři ze tří opic v každé skupině reagovaly na očkování, které obsahovalo lOpg nebo 100 pg každého z pěti konstruktů. Na základě těchto zjištění lze předpokládat, že dávky účinné pro lidský organismus jsou 10, 50, 100 a 200 pg DNA.
Prevence proti infekci pomocí současných patentovaných inaktivovaných vakcín koreluje se sérem a hladinami slizničních protilátek proti HA, ale nekoreluje s protilátkovou odpovědí na vnitřní proteiny chřipkových virů. Proto musí být HA zahrnut do vývoje protichřipkových DNA vakcín. Imunitní odpověď na NP však zvyšuje odpověď protilátek na HA a vnitřní proteiny chřipkových virů vyvolávají odpověď cytotoxických leukocytů na antigenně odlišné kmeny chřipkových virů. Jak již bylo uvedeno výše, experimenty na zvířatech ukázaly zvýšenou imunogenicitu a ochranu tam, kde injekce obsahovaly DNA konstrukty kódující vnitřní proteiny chřipkových virů současně s HA. Začlenění DNA konstruktů kódujících vnitřní proteiny by pravděpodobně zvýšilo účinnost DNA vakcín u lidí. Protože dávky budou pravděpodobně záviset na interakci těchto složek, rutinní testování umožní odborníkům stanovení dávky DNA pro směsi HA, NP a Ml DNA konstruktů. Odpovědi hostitelů na každou z těchto složek mohou být měřeny odděleně s porovnáním snížení titru hemaglutininu (HI) a neutralizačních protilátek proti složkám HA a odpovědi cytotoxických lymfocytů na epitopy Ml aNP. Výsledky jsou porovnány s protilátkovou odpovědí po injekci obsahující konstrukty, které exprimují pouze HA. Tyto studie umožňují vyhodnocení potenciální zvýšené odpovědi na vakcínu obsahující jak DNA kódující HA, tak vnitřní proteiny chřipkových virů.
Účinnost na lidský organismus byla vyzkoušena na dobrovolnících, kteří obdrželi DNA vakcínu proti chřipce, po které následovala intranasální infekce, aby se projevila účinnost vakcíny proti podobným kmenům virů a chřipkovým kmenům různých subtypů. Složení, dávka a aplikace této vakcíny jsou založeny na již uvedených studiích. Klinická účinnost byla hodnocena podle míry infekce, počtu nemocných a průběhu nemoci. Tyto klinické výsledky byly porovnány s laboratorním vyhodnocením imunitní odpovědi a šíření viru, aby mohly být určeny náhradní signální znaky, které korelují s ochranou.
Standardní techniky molekulární biologie pro přípravu a purifikaci DNA konstruktů umožňují přípravu DNA léčebných přípravků, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Zatímco jsou standardní techniky molekulární biologie dostatečně vyhovující pro přípravu výrobků, které jsou předmětem tohoto vynálezu, poskytují zde popisované specifické konstrukty nové léčebné
-17CZ 290315 B6 přípravky, které překvapivě poskytují ochranu proti různým kmenů virů, což je výsledek, kterého se zatím pomocí dosud patentovaných vakcín nepodařilo dosáhnout.
Množství exprimovatelné DNA, které má být příjemci aplikováno, bude záviset na síle transkripčních a translačních promotorů použitých v DNA konstruktu a na imunogenicitě exprimovaného genového produktu. Obecně řečeno je účinná dávka aplikovaná přímo do svalu od 1 pg do 1 mg, lépe od 10 pg do 300 pg. Podkožní injekce, nitrokožní aplikace, zavedení přes pokožku a další způsoby aplikace jako intraperitoneální, intravenózní nebo inhalace jsou rovněž možné. Rovněž se předpokládá, že budou poskytovány revakcinace.
DNA může být holá, tj. bez jakýchkoli asociovaných proteinů, přísad nebo dalších pomocných látek, které působí na imunitní systém příjemce. V takovém případě je žádoucí, aby DNA byla ve fyziologicky přijatelném roztoku, jako je třeba sterilní fyziologický roztok nebo fyziologický roztok tlumený fosfátem, avšak výčet roztoků se neomezuje pouze na tyto dva roztoky. DNA může být alternativně asociována s lipozomy, jako jsou lecitinové lipozomy nebo další lipozomy známé mezi odborníky, a mít tedy formu DNA-lipozomální směsi (viz např. WO 93 24 640) nebo může být DNA asociována s přísadami, které jsou odborníkům známy pro své schopnosti zesílit imunitní odpověď, jako jsou proteiny nebo jiné nosiče. S výhodou mohou být rovněž použity látky, které přispívají k příjmu DNA buňkami. Mezi jinými to jsou vápenné ionty, virové proteiny nebo další látky zprostředkovávající transfekci. Tyto látky jsou obecně označovány jako transfekci zprostředkovávající látky a jako farmaceuticky přijatelné nosiče. V tomto vynálezu označuje termín gen segment nukleové kyseliny, který kóduje samostatný protein. Termíny léčebný přípravek a vakcína jsou vzájemně zaměnitelné a označují přípravky vhodné pro indukci imunitní odpovědi. Termíny konstrukt a plazmid jsou používány opět zaměnitelně. Termín vektor je používán pro označení DNA, do které mohou být klonovány geny použitelné podle metod popsaných v tomto vynálezu.
Proto jedním z provedení tohoto vynálezu je metoda pro použití genů chřipkových virů pro indukci imunitních odpovědí in vivo u takových obratlovců, jako jsou savci včetně člověka. Tato metoda zahrnuje:
a) izolaci genu,
b) připojení genu k regulačním sekvencím tak, že gen je funkčně připojen ke kontrolní sekvenci, která, je-li zavedena do živé tkáně, řídí iniciaci transkripce a následnou translaci genu,
c) zavedení genu do živé tkáně a
d) volitelně i zvýšení reakce přidáním dalšího chřipkového genu.
Upřednostňovaným provedením tohoto vynálezu je metoda poskytující ochranu proti různorodým kmenům chřipkového viru. Této ochrany se docílí aplikací imunologicky účinného množství nukleové kyseliny, která kóduje konzervovaný epitop chřipkového viru. Tuto funkci poskytuje například celý gen chřipkového viru pro nukleoprotein a předpokládá se, že kódující sekvence pro další geny chřipkových virů nebo jejich části takto kódující epitopy konzervované v těchto genech tudíž poskytují ochranu proti různým kmenům těchto virů.
V dalším provedení tohoto vynálezu kóduje DNA ve vakcíně nukleoprotein lidského chřipkového viru, hemaglutinin, matricový protein, nestruktumí proteiny nebo polymerázový genový produkt. Specifické příklady provedení tohoto vynálezu jsou uvedeny níže. V těchto provedeních kóduje gen chřipkového viru nukleoprotein, bazickou polymerázu 1, nestruktumí protein 1, hemaglutinin, matrix 1, bazickou polymerázu 2 izolátu lidského chřipkového viru typu A/PR/8/34, nukleoprotein izolátu chřipkového viru typu A/Beijing/3 53/89, hemaglutinový gen izolátu chřipkového viru A/Texas/36/91 nebo hemaglutinový gen izolátu lidského chřipkového viru B/Panama/46/90.
-18CZ 290315 B6
Specifická provedení tohoto vynálezu, tj. DNA konstrukty kódující geny chřipkových virů, jejichž DNA konstrukty mají schopnost exprese po zavedení do živočišné tkáně in vivo a vyvolávají imunitní odpověď proti exprimovaným produktům těchto genů chřipkových virů. Navíc kombinace obsahující takové konstrukty s polynukleotidy, kódujícími další antigeny nepříbuzné s chřipkovými viry jsou v tomto vynálezu jasně popsány. Příklady doporučovaných DNA konstruktů kódujících chřipkové geny:
a) pnRSV-PR-NP,
b) Vl-PR-NP,
c) V1J-PR-NP, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:12:,
d) V1J-PR-PB1, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:13:,
e) VIJ-PR-NS, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:14:,
f) V1J-PR-HA, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:15:,
g) V1J-PR-PB2, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:16:,
h) V1J-PR-M1, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:17:,
i) VlJneo-BJ-NP, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:20: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:21:,
j) VIJneo-TX-NP, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:24 a 3'koncová sekvence je SEKV.ID:25: a
k) VIJneo-PA-HA, jehož 5' koncová sekvence je SEKV.ID:26 a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:27:
l) 6.56 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:46: a 3' koncová sekvence konstruktu je SEKV.ID:47:,
m) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), velikost konstruktu je 6.56 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:48: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:49:,
n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), velikost konstruktu je 6.61 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:50: a
o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/3 53/89), velikost konstruktu je 6.42 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:52: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:53:,
p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), velikost konstruktu je 5.62 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:54: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:55:,
q) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), velikost konstruktu je 6.54 Kb, 5'koncová sekvence je SEKV.ID:56: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:57:,
r) VIJns-PA-Ml (B/Panama/45/90), velikost konstruktu je 5.61 Kb, 5' koncová sekvence je SEKV.ID:58: a 3' koncová sekvence je SEKV.ID:59:,.
-19CZ 290315 B6
Příklady provedení vynálezu
Uvádíme následující příklady pro další upřesnění tohoto vynálezu, přičemž tento vynález neomezujeme na specifická provedení uvedená v těchto příkladech.
Příklad 1
Příprava DNA konstruktů kódujících proteiny lidských chřipkových virů:
i) . pnRSV-PRNP: Izoláty genu A/PR/8/34 byly získány z pAPR-501 [J. F. Young a kol., The Origin of Pandemic Influenza Viruses, W. G. Laver, Ed. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1983)] jako fragment EcoRI dlouhý 1565 párů bází, vyplněný Klenowem a klonovaný do místa Xbal vpRSV-BL, které bylo doplněno Klenowem a ošetřeno fosfatázou. pRSV-BL byl konstruován nejdříve štěpením vektoru pBL-CAT3 [B. Luckow a C. Schutz, Nuc. Acid. Res. 15, 5490 (1987)] Xhol a Ncol za účelem odstranění CAT kódující sekvence, a dále ošetřené Klenowem a ligací. RSV promotorový fragment byl izolován jako fragment Ndel a Asp718 zpRshgmx [V. Giguere a kol., Nátuře 330, 624 (1987)], doplněný Klenowem a klonovaný do místa HindlII intermediátorového vektoru uvedeného výše (pBL-CAT postrádajícího CAT sekvenci).
ii) Vl-NP: Expresivní vektor Vl byl zkonstruován z pCMVDE-AKI-DHFR [Y. Whang a kol., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Geny AKI a DHFR byly odstraněny štěpením vektoru pomocí EcoRI a zpětnou ligací. Tento vektor neobsahuje intron A v promotoru CMV, takže tam byl tento intron přidán jako PCR fragment, který měl deletováno vnitřní místo Sací [v pozici 1855 podle číslování v publikaci B. S. Chapman a kol., Nuc. Acid. Res. 19, 3979 (1991)]. Templátem pro PCR reakci byl pCMVintA-Lux vytvořený ligací fragmentů HindLU a Nhel zpCMV6al20 [vizB. S. Chapman a kol., tamtéž], který obsahuje hCMV-IEl enhancer/promotor a intron A, a jejich ligací do míst HindlU a Xbal vpBL3, čímž vznikl pCMVIntBL. Fragment luciferázového genu o délce 1881 pb (HindlII - Smál doplněné Klenowem) z RSV-Lux [J. R. de Wet a kol., Mol. Cell Biol. 7, 725 (1987)] byl klonován do místa Sáli v pCMVIntBL, které bylo doplněno Klenowem a ošetřeno fosfatázou.
Primery pro překlenutí intronu:
5'primer, SEKV.ID:5: 5'CTATATAAGCAGA CTAGTTTAG-3'.
3'primer, SEKV.ID:6: 5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3'.
Primery použité pro odstranění Sací místa:
negativní primer, SEKV.ID:7: 5'-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3' a pozitivní primer, SEKV.ID:8: 5'-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3'.
PCR fragment byl štěpen Sací a Bgin a vložen do vektoru, který byl naštěpen stejnými enzymy. NPgen z chřipky A (A/PR/8/34) byl vyštěpen zpAPR501 [J.F. Young kol., The Origin of Pandemic Influenza Viruses, W. G. Laver, ed. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1983)]
-20CZ 290315 B6 jako fragment EcoRI o 1565 pb, jeho konce byly zarovnány. Vložením do VI v místě BglII se zarovnanými konci vznikl Vl-NP. Plazmid byl rozmnožen v E. coli a purifikován metodou alkalické lýzy [J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, druhé vydání (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. DNA rozdělená CsCl byla precipitována ethanolem a resuspendována v 0,9%ním fyziologickém roztoku do injekcí 2mg/ml.
Příklad 2
Test na cytotoxické T-lymfocyty proti lidskému chřipkovému viru.
Cytotoxické T-lymfocyty byly získány z myší, které byly imunizovány DNA nebo které se zotavily z nákazy A/HK/68. Kontrolní kultury byly odebrány od myší, které byly očkovány kontrolní DNA a z myší bez očkování. Byly připraveny suspenze jednotlivých buněk, červené krvinky byly odstraněny lýzou chloridem amonným a slezinné buňky byly pěstovány v RPMI 1640 s přídavkem 10% hovězího fetálního séra (FBS), penicilinem v množství 100 U/ml, streptomycinem v množství 100 pg/ml, 0,01MHEPES (pH7,5) a 2mM 1-glutaminem. Ke stejným množstvím totožných ozářených stimulujících buněk, které byly pulzovány po dobu 60 min epitopem NP147-155 restringovaným v místě H-2Kd (Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val, SEKV.ID:9:) v koncentraci 10 μΜ nebo infikovanými chřipkou A/PR8/34 (HINI), bylo přidáno 10 U/ml rekombinantního lidského IL-2 (Cellular Products, Buffalo, NY) a kultury byly pěstovány po dobu 7 dnů při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO2 a v 100% relativní vlhkosti. Ve vybraných experimentech byly na místo autologních stimulátorových buněk přidány rhIL-2 (20 U/ml) a Con A (2 pg/ml). Efektorová aktivita cytotoxických T-buněk byla určena buňkami P815 značenými 3 h izotopem 51Cr v intenzitě 60 pCi na 106 buněk a pulzováním NP147-155 podle výše uvedeného postupu nebo infekcí chřipkou A/Victoria/73 (H3N2). Kontrolní buňky (označené buňky P815 bez peptidu nebo viru) nebyly lyžovány. Recipientní buňky byly umístěny do 96ti-oddílových misek v množství 1 x 104 na kruhovou komůrku a inkubovány s efektory po dobu 4 hod ve třech provedeních. Supematant (30 μΐ) byl odebrán z každé komůrky a spočítán na scintilačním odečítači Bateplate (LKB-Wallac, Turku, Finland). Pro každou konečnou přípravu byly určeny maximální impulzy uvolněné přidáním 6M HC1 a spontánní impulzy uvolněné bez CTL. Procenta specifické lýzy byla počítána následovně:
[(experimentální - spontánní)/(maximální - spontánní)] x 100
Příklad 3
Příprava NP-specifických cytotoxických T-lymfocytů in vivo·. Myši BALB/c byly očkovány do čtyřhlavého svalu na obou končetinách plazmidem cDNA kódujícím A/PR/8/34 nukleoprotein odvozený od promotoru buď z Rous sarcoma viru nebo cytomegaloviru.
Byly použity tyto expresívní vektory:
i) pnRSV-PRNP, viz příklad 1, ii) V1-NP, viz příklad 1.
Použitými laboratorními zvířaty byly myši BALB/c získané z laboratoří Charles River Laboratories, Raleigh, NC. Myši byly získány ve věku 4-5 týdnů a byly poprvé očkovány DNA ve věku 5-6 týdnů. Pokud není uvedeno jinak, byla DNA vždy aplikována do čtyřhlavého svalu obou končetin, přičemž každá končetina obdržela 50 μΐ sterilního fyziologického roztoku obsahujícího 100 pg DNA. Myši dostaly 1, 2 nebo 3 sady očkování v třítýdenních intervalech.
-21 CZ 290315 B6
Negativní zvířecí kontroly nebyly buď vůbec očkovány, nebo byly očkovány vhodným prázdným vektorem, do kterého nebyl vložen gen NP.
Přítomnost nebo absence NP plazmidů DNA ve svalech vybraných zvířat byla zjišťována metodami PCR (obr. 1). Plazmidová DNA (buď NP nebo luciferázy) byla nalezena u 44 ze 48 očkovaných svalů. U myší očkovaných DNA pro luciferázu byla určena exprese proteinu aktivitou luciferázy v extraktech ze svalů získaných podle metod odborníkům v oboru dostatečně známých [J. A. Wolff a kol., Science 247,1465 (1990); G. Ascadi a kol., Nátuře 352, 815 (1991); H. Lín a kol., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen a kol., FEBS Lett., 290, 73 (1991); S. Jiao a kol., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Wolff a kol., Human Mol. Genet. 1,363 (1992)].
Exprese NP ve svalech po injekci NP DNA byla pod hladinou detekovatelnosti analýzou Western blotu (< 1 ng), ale byla zjištěna tvorbou NP-specifických protilátek (viz obr. 2). Pro analýzu tvorby NP-specifických cytotoxických T-lymfocytů byly 1-4 týdny po imunizaci odebrány pokusným zvířatům sleziny a slezinné buňky byly restimulovány autologními slezinnými buňkami, které byly buď infikovány chřipkou A (A/PR/8/34) nebo pulzovány peptidovým epitopem H-2K0- (NP zbytek 147-155, viz O.K. Rotzscke a kol., Nátuře 348, 252 (1990)), plus rekombinantním lidským IL-2. Slezinné buňky, které byly restimulovány syngenními buňkami infikovanými virem nebo pulzovanými epitopem, byly schopné zabíjet recipientní buňky pulzované nukleoproteinovým epitopem (obr. 3A). To naznačuje, že nitrosvalové injekce NP DNA vytvořily peptid odvozený od NP v asociaci s MHC proteiny I. třídy vhodný pro indukci odpovědi specifických cytotoxických T-lymfocytů. Tyto CTL byly schopny rozpoznat a lyžovat cílové buňky nakažené virem, (obr. 3B), nebo buňky pulzované peptidovým epitopem nukleoproteinu H-2Kd* a virem infikované buňky. To dokazuje jejich specifitu a jejich schopnost rozpoznat epitop vytvořený přirozenou cestou v infikovaných buňkách.
Mnohem přísnějším měřením imunogenicity NP DNA vakcíny bylo hodnocení odpovědi primárních CTL. Slezinné buňky odebrané myším očkovaným NP DNA byly aktivovány stykem s Con A A IL-2, ale neprodělaly před testem na jejich schopnosti zabíjet patřičné cílové buňky restimulaci in vitro buňkami exprimujícími antigen. Slezinné buňky myší očkovaných NP DNA byly po in vitro aktivaci pomocí ConA a IL-2 bez restimulace na specifický antigen schopny lyžovat jak cílové buňky pulzované epitopem, tak buňky infikované virem (obr. 3C a D). Tato lytická aktivita restimulovaných i aktivovaných slezinných buněk je srovnatelná s podobným způsobem zpracovanými slezinnými buňkami myší, které byly předem infikovány chřipkou A/HK/68 a virulentním kmenem H3N2 přizpůsobeným pro myši, který se objevil 34 let po A/PR/8/34 (H1N1). Takže očkování NP DNA vyvolalo tvorbu cytotoxických T-lymfocytů, které byly specifické pro epitop nukleoproteinu a které byly schopny rozpoznat přirozenou cestou zpracovaný antigen (tj. mohly zabíjet buňky infikované virem). NP CTL byly rovněž vytvořeny v transgenních myších C3H a B6 exprimujících lidský HLA-A2.
NP CTL byly zjištěny ve slezinách myší BALB/c očkovaných tak malými dávkami jako je 1 dávka 1 pg NP DNA (nej menší testovaná dávka) (tabulka 3-IV).
-22CZ 290315 B6
Tabulka 3-IV
Odpovědi cytotoxických T-lymfocytů u myší po jediné injekci NP DNA.
| inokulum | dávka (pg) | % specifické lýzy | sd |
| NPDNA | 400 | 52,5 | 10,7 |
| 400 | 80,4 | 10,3 | |
| NPDNA | 200 | 75,6 | 5,4 |
| 200 | 44,6 | 4,4 | |
| NPDNA | 100 | 76,7 | 2,9 |
| 100 | 35,6 | 8,9 | |
| NPDNA | 50 | 62,9 | 0,6 |
| 50 | 76,7 | 7,4 | |
| NPDNA | 10 | 83,2 | 10,1 |
| 10 | 37,7 | 2,5 | |
| NPDNA | 1 | 44,2 | 0,3 |
| 1 | 13 | 2 | |
| Kontrolní DNA | 100 | 4,9 | 1 |
| Chřipka | 79,3 | 8,3 |
Tabulka 3-IV: Samice myší BALB/c (4-6 týdnů) byly očkovány jedinou dávkou A/PR/34 NP DNA (VIJNP) nebo kontrolní DNA (V1JNP) v dávkách vyznačených v tabulce. Pro srovnání byly myši infikovány chřipkovým virem A/PR/34. Po osmi týdnech byly získány CTL, 10 restimulovány in vitro syngenními slezinnými buňkami pulzovanými NP peptidem a testovány proti buňkám P815 pulzovaným NP peptidem v poměru efektor:cílová buňka 50:1. Výsledky jsou uvedeny jako specifická lýza pro jednotlivé zástupce myší.
Následující experimenty ukázaly, že myši, které obdržely jedinou dávku 1 pg NP DNA, si 15 udržovaly NP CTL po nejméně 4,5 měsíce (nejdelší testované období). Síla odpovědí CTL po injekci DNA byla srovnatelná s odpovědí u myší infikovaných chřipkou. Je však třeba upozornit, že analýza CTL po antigenní restimulaci in vitro není zcela kvantitativní. Proto v současné době vyvíjíme testy s omezenými ředěními, abychom mohli přesněji určit hladiny NP-specifických CTL u myší. Myši, které byly očkovány 3 dávkami NP DNA po 100 pg, vykazovaly přítomnost 20 odpovědi CTL ještě nejméně 6 měsíců po očkování (obr. 19). Chřipková PNV má tudíž schopnost vyvolat dlouhodobé odpovědi CTL namířené proti konzervovaným antigenům chřipkových virů.
Očkování myší NP DNA vedlo ke vzniku velkého titru protilátek IgG anti-NP (obr. 2). Tvorba 25 vysokého titru IgG protilátek u myší tudíž vyžaduje CD4+T pomocné buňky (P. Vieira aK. Rajewsky, Int. Immunol. 2, 487 (1990)). To dokazuje, že NP exprimovaný z plazmidu in šitu byl zpracován oběma třídami MHC, tj. třída I a Π.
Příklad 4
Obrana myší při nákaze virulentním virem lidské chřipky:
Úloha NP protilátek v obranné imunitě při chřipce je demonstrována na dvou přístupech: za prvé, 35 titr viru v plicích byl určen v experimentech pasivního přenosu. Samice myší BALB/c ve věku 10 týdnů nebo mladší byly očkovány intraperitoneálně 0,5 ml séra (ředěného v 2,0 ml PBS) odebraného od myší, které byly třikrát očkovány 200 μg NP DNA. Kontrolní myši byly očkovány stejným množstvím (rovněž ředěným v 2,0 ml PBS) sebraného normálního myšího séra nebo sérem odebraným od myší, které prodělaly infekci A/HK/68. Dávka imunitního séra
-23CZ 290315 B6 proti A/HK/68 byla upravena tak, aby titr anti-NP protilátek v ELISA testu shodný s titrem uséra myší očkovaných NP DNA. Myši byly infikovány bez anestezie 1O4TCIDso z A/HK/68 hodiny po injekci séra a další injekce stejného množství séra jim byly aplikovány o 3 dny později. Myši byly utraceny 6 a 7 dní po infekci a byl změřen plicní titr viru v TCID5o na ml metodou popsanou výše [J. Immunol. 146, 321, 1991].
Myším, které ještě nepřišly do styku s infekcí, bylo infuzí aplikováno anti-NP sérum a pak byly vystaveny infekci A/HK/68. Pro virovou infekci byl vybrán kmen A/HK/68 upravený pro myši a následně udržovaný pasážováním v myších in vivo (Dr. I. Mbawuike, osobní rozhovor). Použitý zdroj nákazy byl homogenát plic infikovaných myší mající titr infekčnosti 5 x 108 TCID5o/ml na buňkách MDCK. Pro určení plicního titru viru a studie úbytku tělesné hmotnosti byla nákaza prováděna na slepo intranazálním zavedením 20 μΐ obsahujícím 104 TCID50 do chřípí neuspaných myší, což vede k progresivní infekci plic virem, ale není pro myši BALB/c smrtelné [Yetter, R. A. a kol., Infect. Immunity 29, 654, 1980]. V experimentech s počty přežívajících myší byly myši vystaveny infekci 20 μΐ obsahujících 102,5 TCID50 zavedených do chřípí myší při totální anestezii ketaminem a xylazinem. Nákaza uspaných myší touto dávkou způsobuje rychlou infekci plic s úmrtností 90-100 % u neimunizovaných myší [J. L. Schulman a E. D. Kilnoume, J. Exp. Med. 118, 257, 1963; G. H. Scott a R. J. Sydiskis, Infect, Immunity 14, 696, 1976; R. A. Yetter a kol., Infect. Immunity 29, 654, 1980)]. Titr viru v plicích byl určen sériovou titrací na buňkách MDCK (získaných z ATCC, Rockville, MD) v 96-komůrkových destičkách podle metody popsané Moranem a kol., [tamtéž].
U myší, které obdržely anti-NP antisérum (6,3+/-0,2; střední hodnota +/- SEM; n = 4), nebylo zjištěno žádné snížení titru viru v plicích v porovnání s kontrolními myšmi, které obdržely normální sérum (6,1 +/- 0,3; střední hodnota +/- SEM; n= 4). Jako pozitivní kontrola bylo myším, které byly infikovány A/HK/68, odebráno sérum a pasivně přeneseno do myší, které ještě nepřišly do styku s infekcí. Po infekci A/HK/68 nebyla v jejich plicích nalezena žádná virová infekce, což naznačuje, že toto sérum proti celým virům poskytovalo kompletní ochranu proti infekci homologními viry. V druhém přístupu byly myši, které ještě nepřišly do styku s infekcí, očkovány purifikovaným NP (5 pg/sval, 3krát v průběhu 6 týdnů) aplikovaným nitrosvalovou injekcí. Tyto myši vykazovaly vysoký titr NP-specifických protilátek, avšak nevytvořily NP-specifické CTL a nebyly chráněny proti smrtelným dávkám virů. Kolující IgG anti-NP protilátky, na rozdíl od neutralizačního účinku protilátek na celý virus, neposkytují myším obrannou imunitu.
Obranná účinnost očkování NP DNA in vivo byla vyhodnocena proto, aby ukázala, zda imunitní odpověď zprostředkovávaná buňkami měla nějakou funkční významnost. Jedním přímým měřením účinnosti imunitní odpovědi byla schopnost myší poprvé imunizovaných NP DNA vyčistit se od progresivní subletální infekce plic heterologním kmenem chřipky (A/HK/68; H3N2). Virové infekce byly prováděny postupem uvedeným výše. Myši očkované NP DNA měly 7. den po nákaze titr viru v plicích (1,0+/—1,0; střední hodnota +/- SEM; n = 4) nižší o tři řády než jaký byl u kontrolních myší, které nebyly očkovány (4,1+/-0,3; střední hodnota +/-SEM; n= 4) nebo u myší, které byly očkovány prázdným vektorem (4,5+/-0,0; střední hodnota +/- SEM; n = 4). Ve skutečnosti měly tři ze čtyř očkovaným myší nezjistitelný titr viru v plicích, zatímco žádná z kontrolních myší se v té době viru nezbavila. Výrazný rozdíl v titru viru v plicích pozorovaný v tomto experimentu a šesti dalších ukazuje, že imunitní odpověď urychluje odstranění viru z organismu. Nedostatečný obranný účinek kontroly s prázdným vektorem potvrzuje, že DNA sama o sobě nebyla za imunitní odpověď odpovědná. Navíc, protože napadající kmen viru A/HK/678 (virulentní H3N2 kmen přizpůsobený pro myši) byl heterologní ke kmeni A/PR/8/34 (H1N1), ze kterého byl NP gen klonován, byla imunita jasně heterotypní.
Jako měřítko úmrtnosti způsobené virem byl sledován úbytek hmotnosti u myší, které byly subletálně nakaženy chřipkou A/HK/68 po očkování NP DNA (obr. 4). Neočkované myši (nebo myši očkované prázdným vektorem) byly použity jako kontrola. Myši imunizované NP DNA
-24CZ 290315 B6 vykazovaly v porovnání s kontrolními myšmi menší úbytek tělesné hmotnosti a rychleji se po infekci navracely ke své původní hmotnosti před očkováním.
Intranazální infekce myší chřipkou při totální anestezii způsobí rychlé rozšíření replikujících se virů v plicích a smrt za 6-8 dní, pokud není tato infekce pod kontrolou (R. A. Yetter a kol., Infect. Immunity 29, 654 (1980)). Přežívání myší vystavených této metodě odráží jejich schopnost omezovat nebezpečnost akutní infekce plic. Byla studována schopnost myší přežít infekci dvěma různými kmeny chřipky, A/HK/68 (viz obr. 5) a A/PR/8/34. Myši předem očkované NP DNA vykazovaly 90 % přežívajících jedinců v porovnání s 0 % přežívajících myší očkovaných prázdným vektorem a 20 % u neočkovaných myší (obr. 5). V celkovém počtu 14 těchto studií vykazovaly myši očkované NP DNA přinejmenším o 50 % vyšší počet přežívajících zvířat než kontrolní skupiny. Takže imunitní odpověď vyvolaná NP DNA účinně zrychluje uzdravení a zmírňuje onemocnění způsobené virem jiného kmene, vzniklého až o 34 let později, podporuje princip zaměření na konzervované proteiny za účelem tvorby odpovědi cytotoxických T-lymfocytů.
Příklad 5
Izolace genů z izolátů chřipkových virů.
V ATCC je uloženo mnoho starších kmenů chřipkových virů (Katalog živočišných virů a antisér 1990, Chlamydiae & Rickettsiae, 6. vyd., uvádí 20 chřipek kmene A a 14 chřipek kmene B).
A. Kmeny virů a purifikace:
Chřipkové kmeny, které zahrnují současnou vakcínu chřipkové sezóny 1992, byly získány od Dr. Nancy J. Cox z Division of Viral and Reckettsial Diseases, Centers of Disease Control, Atlanta, GA. Jsou to tyto kmeny: (1) A/Beijing/353/89 (H3N2); (2) A/Texas/36/91 (H1N1); (3) B/Panama/45/90 a (4) A/Georgia/03/93.
Všechny tyto viry byly pěstovány pasážováním v 9-11 týdenních kuřecích zárodcích (kromě A/Georgia, který byl pěstován v buňkách MDCK) v množství 100-200 na virový přípravek a čištěny upravenou metodou popisovanou Massicotem a kol. (Virology 101, 242-249 (1980)). Stručně řečeno, suspenze virů byly purifikovány centrifugací při 8 000 ot/min (centrifuga Sorwall RC5C, rotor GS-3), a potom peletovány centrifugací při 18 000 ot/min po dobu 2 hodin v centrifuze Beckman rotor 19. Peletovaný virus byl resuspendován v STE (0,1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4, lmM EDTA) a centrifugován při 4 000 ot/min (centrifuga Hermle Z 360), aby se odstranily agregáty. 2 ml supematantu byly navrstveny na nespojitý sacharózový gradient obsahující 2 ml 60%ní sacharózy převrstvené 7 ml 30%ní sacharózou tlumenou STE a centrifugovány při 36 000 ot/min (rotor SW-40, centrifuga Beckman) po dobu 90 minut. Vázaný virus se nashromáždil na mezifázi, byl rozpuštěn v desetinásobku STE a peletován při 30 000 ot/min po dobu 2 hodin (Beckman, rotor Ti45). Vysrážený virus byl poté zmražen na -70 °C.
B. Extrakce virové RNA a syntéza cDNA:
Virová RNA byla purifikována ze zmraženého viru pomocí guanidin thiokyanátové extrakce s použitím komerčně dodávaného setu (Stratagene, La Jolla, CA) používající metodu Chomczynského a Sacchi (Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). Dvouvláknová cDNA byla připravena z virové RNA s použitím komerčně dodávané soupravy cDNA synthesis kit (Pharmacia) podle návodu dodavatele s několika úpravami. První řetězec cDNA byl připraven s použitím syntetického oligodeoxyribonukleotidu, 5 -AGCAAAAGCAGG-3', SEKV.ID:30:, který je komplementární ke konzervované sekvenci umístěné na 3'-konci virové RNA genů
-25CZ 290315 B6 kmene A. Tato sekvence je běžná u všech RNA chřipkových virů typu A a tudíž poskytuje metodu pro klonování genů jakéhokoli chřipkového viru typu A. Po ukončení syntézy prvního a druhého řetězce cDNA reakce pokračovala spíše fenol/chloroformovou extrakcí a precipitací ethanolem než podle instrukcí v návodu soupravy. Zarovnané konce molekul cDNA byly ligovány přímo do vektoru VIJneo nebo VIJns, které byly štěpeny restrikčním enzymem BglII, jejich konce zatupeny T4 DNA a vystaveny reakci telecí intestinální alkalické fosfatázy.
Pro vyhledání určitých virových genů v plné délce jsou použity syntetické oligodeoxyribonukleotidy, které byly navrženy tak, aby komplementovaly 3'-konec konce translačního otevřeného čtecího rámce daného virového genu. Vzorky, které se zdály být celými geny pomocí restrikčního mapování a určení velikosti v elektroforéze na agarózovém gelu, byly ověřeny sekvenováním dideoxynukleotidy obou spojů každého virového genu s VIJneo. Sekvence spojů každého tohoto genu klonovaného z těchto virů jsou uvedeny níže v příkladu 8.
Podobná strategie byla použita pro klonování cDNA z každého viru uvedeného výše kromě B/Panama/45/90, který nemá tuto společnou sekvenci na každém konci virové RNA. Pro syntézu prvního řetězce cDNA byla použita směs oligodeoxyribonukleotidů. Toto jsou použité příměry:
(1) 5-AGCAGAAGCGGAGC-3’, SEKV.ID:31: proPB1 aPB2, (2) 5-AGCAGAAGCAGAGCA-3', SEKV.ID: 19: pro NS a HA, (3) 5-AGCAGAAGCACGCAC-3', SEKV.ID:22: pro M a (4) 5-AGCAGAAGCACAGCA-3', SEKV.ID:23: pro NP.
Pro geny klonované PCR byl jako templátová DNA použit DNA roztok cDNA se zatupenými konci přímo pro použití v PCR reakci. Primery použité pro klonování 6 chřipkových genů získaných PCR jsou následující:
1. HA gen z A/Georgia/03/93 negativní primer: SEK.V.ID:33:
5'GCT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC3' pozitivní primer: SEKV.ID-.34:
5'CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G3'
2. HAgenzA/Texas/36/91 negativní primer: SEKV.ID:35:
5'GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TG 3' pozitivní primer: SEKV.ID:36:
5'CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG 3'
3. HA gen z B/Panama/45/90 negativní primer: SEKV.ID:37:
5'GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG 3' pozitivní primer: SEKV.ED:38:
5'CCA CAT TTA TAG ACA GAT GGA GCA AGA AAC ATT GTC 3'
4. Ml gen z A/Beijing/353/89 negativní primer: SEKV.ID:39:
5'GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC3' pozitivní primer: SEKV.ID:40:
5'CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC3’
-26CZ 290315 B6
5. NP gen z B/Panama/45/90 negativní primer: SEKV.ID:41:
5'GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGC 3' pozitivní primer: SEKV.ID:42:
5'CCA CAT GCA TCC TTA ATA ATC GAG GTC ATC ATA ATC CTC 3'
6. Ml gen z B/Panama/45/90 negativní primer: SEKV.ID:43:
5'GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC 3' pozitivní primer: SEKV.ID:44:
5'CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA TTT CTT CAC AAG AGC TG 3'
Všechny chřipkové geny, ať už cDNA, nebo vytvořené PCR, byly ověřeny sekvenováním v místech ligací v genech a geny byly exprimovány v transfektovaných RD buňkách. Exprese byla zjišťována imunobloty.
Konstrukty NP a Ml pro kmen A/H3N2 (vektory 4 a 5) byly vytvořeny z genu z A/Beijing/353/89. Tyto geny byly vybrány z důvodu jejich dostupnosti a na základě předpokladu vysoké konzervace obou NP a Ml genů.
Z předchozího výzkumu byla vybrána skupina 7 zvláště vhodných expresivních vektorů, které jsou kombinovány při přípravě vakcíny:
1. VIJns-HA (A/Georgia/03/93)
2. VIJns-HA (ATTexas/36/91)
3. VIJns-HA (B/Panama/45/90)
4. VIJns-NP (A/Beijing/353/89)
5. VIJns-Ml (A/Beijing/353/89)
6. VIJns-NP (B/Panama/45/90)
7. VIJns-Ml (B/Panama/45/90)
6,56 Kb
6,56 Kb
6.61 Kb
6,42 Kb
5.62 Kb
6,54 Kb
5,61 Kb
Důležité sekvence spojení těchto genů v daných expresivních vektorech jsou uvedeny dále. Pouze malá část konstruktů vyžadovala sekvenování pro potvrzení správnosti genu, který byl klonován. Porovnáním s podobnými známými geny bylo snadné potvrdit, zda daný gen je NP gen, HA en nebo Ml gen, atd. Například sekvence HA genu A/Texas je velice podobná sekvenci HA genu z A/Kiev/59/79, která je k dispozici vGENBANK pod registračním číslem M38353. Podobně HA sekvence z B/Panama je velice podobná HA sekvenci z B/England/222/82, která je v GENBANK dostupná pod registračním číslem Ml 8384. Podobným způsobem byla potvrzena totožnost jakékoli sekvence daných genů z kteréhokoli lidského chřipkového viru. V každém z níže uvedených případů byly potvrzeny jak 5'sekvence, tak 3'sekvence, aby bylo zaručeno, že je přítomen celý gen. V každém případě označuje tučné ATG počáteční kodon chřipkového genu, zatímco tučná sekvence na 3'konci označuje terminační kodon:
1. VIJns-HA (A/GEORGIA/03/93) 6,56 Kb:
5'sekvence: (SEKV.ID:46:)
...TCA CCG TCC TTA GAT C/GG TAC AAC CAT GAA GAC TAT CAT TGC TTT GAC CTA CAT TTT ATG TCT GGT TTT CGC...
-27CZ 290315 B6
3'sekvence: (SEKV.ID:47:)
...TCA TGC TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GG TTC ATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTG TGC...
2. VIJns-HA (A/Texas/36/91) 6,56 Kb:
5'sekvence: (SEKV.ID:48:)
...TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA...
3'sekvence: (SEKV.ID:49:)
...CTG GTG CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT...
3. VIJns-HA (B/Panama/45/90) 6,61 Kb:
5'sekvence: (SEKV.ID:50:)
...CCT TAG ATC/ GGT ACA ACC ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG...
3'sekvence: (SEKV.ID:51:)
...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GCT TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATC ATC TGT CTA TAA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT...
4. VIJns-NP (A/Beijing/353/89) 6,42 Kb
5'sekvence: (SEKV.ID:52:)
...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG AAT GCA ACT...
-28CZ 290315 B6
3'sekvence: (SEKV.ID:53:)
...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...
5. VIJns-Ml (A/Beijing/353/89) 5,62 Kb
5'sekvence: (SEKV.ID:54:)
...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...
3'sekvence: (SEKV.ID:55:)
...GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT GAT CTT CTT GAA AAT TTG GAG ACC TAT CAG ACC TAT CAG AAA CGA ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCT ATG TGG/ GAT CTG CTG TGC CTT...
6. VIJns-NP (B/Panama/45/90) 6,54 Kb
5'sekvence: (SEKV.ID:56:)
...CTT AGA TC/C ACC A TG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT...
3'sekvence: (SEKV.ID:57:)
...GTT GAA ATT CCA ATT AAGCAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG.....
-29CZ 290315 B6
7. VIJns-Ml (B/Panama/45/90) 5,61 Kb
5'sekvence: (SEKV.ID:58:)
...CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGC AAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA...
3'sekvence: (SEKV.ID:59:)
...AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAAA GGA ATT GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGC TCT ATG GGA AAT TCA GCT CTT GTG AAG AAA TAC CTA TAA G/GA TCT GCT GTG...
Příklad 6
VIJ expresívní vektor, SEKV.ID:10:
Naším záměrem při konstrukci VIJ bylo odstranit z našeho vektoru Vl promotor a terminátor transkripce, abychom je mohli umístit do výhodnějších pozic a vytvořit tak celistvější vektor a získat vyšší výtěžky při jeho purifikaci.
VIJ je odvozen od vektorů Vl (viz příklad 1) a pUC18, který je běžným komerčně dodávaným plazmidem. Vl byl štěpen restrikčními enzymy SspI a EcoRI dávajícími dva fragmenty DNA. Menší z těchto fragmentů obsahující promotor CMVintA a terminátor hovězího růstového hormonu (BGH), které kontrolují expresi heterologních genů (SEKV.ID: 11:), byl získán elektroforézou v agarózovém gelu a následnou purifikaci. Konce tohoto fragmentu pak byly zarovnány T4 DNA polymerázou, aby mohly být ligovány se zarovnanými konci jiného DNA fragmentu.
pUC18 byl zvolen, aby vytvořil „páteř“ expresivního vektoru. Je znám pro vysoké výtěžky, které poskytuje, jeho sekvence a funkce jsou dobře prostudovány a má minimální velikost. Z tohoto vektoru jsme částečným štěpením restrikčním enzymem Haell odstranili celý lac operon, což nebylo pro naše účely nezbytné a může být na škodu pro výtěžky plazmidu a expresi heterologních genů. Zbylý plazmid byl purifikován z agarózového gelu, jeho konce byly zatupeny T4 DNA polymerázou, podroben reakci s intestinální telecí fosfatázou a ligován k výše popsané CMVinA/BGH části. Získali jsme tak plazmidy, které vykazovaly některou z možných orientací promotorových částí v páteři pUC. Jeden z těchto plazmidů dával mnohem vyšší výtěžky DNA v E. coli a byl označen VIJ (SEKV.ID: 10:). Struktura tohoto plazmidu byla ověřena sekvenční analýzou oblastí spojů. Tento plazmid potom ve srovnání sVl vykazoval srovnatelnou nebo vyšší expresi heterologních genů.
Příklad 7
Konstrukty genů chřipkového viru ve vektoru VIJ:
Z chřipkového viru kmene A/PR/8/34 bylo do expresivního vektoru VIJ klonováno mnoho těchto genů, čímž, jak uvádí příklad 4, se zvedla hladina exprese na stejnou nebo i vyšší úroveň než u vektoru Vl. Sekvence genu PR8 jsou dostupné v databázi GENBANK. U všech fragmentů
-30CZ 290315 B6 níže uvedených klonovaných genů byla jejich velikost ověřena gelovou elektroforézou a u každé sekvence je uvedeno registrační číslo sekvence v GENBANK, podle které byly fragmenty porovnávány. Metody získávání genů z virových kmenů jako například u viru získaného z ATCC (A/PR/8/34 je ATCC VR-95; v ATCC je k dispozici mnoho dalších kmenů) jsou uvedeny v příkladu 5.
A. Subklonování genů PR8 do V1J:
1. NP gene
NP gen byl subklonován zpAPR501 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Gen byl získán excizí pAPR501 pomocí EcoRI, fragment byl purifikován a konce zarovnány T4 DNA polymerázou. Zatupený fragment byl vložen do VIJ štěpeného BglII a rovněž zatupeného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment byl dlouhý 1,6 kb.
2. NS
NS gen byl subklonován zpAPR801 (J.F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138) excizí pAR801 pomocí EcoRI, fragment byl purifikován z gelu a zatupen T4 DNA polymerázou. Zatupený fragment byl vložen do VIJ rovněž štěpeného BglII a rovněž zarovnaného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment byl dlouhý 0,9 kb (kompletní kódující oblast NS obsahuje NS1 a NS2).
3. HA
HA gen byl subklonován zpJZ102 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138) excizí pJZ102 pomocí HindlII, fragment byl purifikován z gelu a zatupen T4DNA polymerázou. Zatupený fragment byl vložen do VIJ rovněž štěpeného BglII a rovněž zarovnaného 14 DNA polymerázou. Klonovaný fragment byl dlouhý 1,75 kb.
4. PB1
PB1 gen byl subklonován zpGeml-PBl (5'koncové a 3'koncové spoje těchto genů s vektorem byly sekvenovány, aby se potvrdila jejich totožnost. Viz J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Excizí pGem-PBl pomocí HindlU byl získán fragment, který byl purifikován z gelu a zatupen T4 DNA polymerázou. Zatupený fragment byl vložen do VIJ rovněž štěpeného BglII a rovněž zarovnaného T4DNA polymerázou. Klonovaný fragment byl dlouhý 2,3 kb.
5. PB2
PB2 gen byl subklonován z pGeml-PB2 (5'koncové a 3'koncové sekvence spojů těchto genů s vektory byly sekvenovány, aby se ověřila jejich totožnost, viz J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Excizí pGem-PB2 pomocí BamHI, fragment byl purifikován z gelu. Fragment s přesahujícími konci byl vložen do VIJ rovněž štěpeného BglII. Klonovaný fragment byl dlouhý 2,3 kb.
-31 CZ 290315 B6
6. Ml
Ml gen byl vytvořen technikami PCR z plazmidu p8901 ΜΙΤΕ. M sekvence v tomto plazmidu byly vytvořeny PCR zpAPR701 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, 5 A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. W. G.
Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138) s použitím oligomeru 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC-3', SEKV.ID:3: pro negativní primer a oligomeru 5'-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC-3', SEKV.ID:4: pro pozitivní primer. PCR fragment byl purifíkován gelovou elektroforézou, štěpen BglII a ligován 10 do VIJ štěpeného rovněž BglII. Klonovaný fragment byl dlouhý 0,7 kb. Konečná aminokyselina kódovaná Ml je v negativním priméru uvedena jako „ATG“ kodon, zatímco terminační kodon translace Ml je kódován obráceným kodonem „TCA“, který je v negativním směru terminačním kodonem „TGA“.
B. Expresivní konstrukty VIJ chřipkového genu.
V každém případě jsou uvedeny spojové sekvence z oblasti 5'-koncového promotoru (CMVintA). Sekvence byly vytvořeny sekvenováním primerů:
CMVintA primer 5'-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3' SEKV.ID:28:, který tvoří sekvenci kódující sekvence. Poloha, ve které se toto spojení vyskytuje, je označena“/“, kteréžto označení neznamená žádnou nespojitost v dané sekvenci. Způsob přípravy těchto konstruktů je uveden za výčtem všech daných sekvencí. Každá vytvořená sekvence představuje kompletní, přístupný, exprimovatelný konstrukt DNA pro žádaný chřipkový gen.
Každým konstruktem byly transfektovány buňky RD(ATCC CCL136), buněčná linie lidského rabdomyosarkomu v kultuře. Čtyřicet hodin po transfekci byly buňky sklizeny, lyžovány a proveden Western blot (kromě konstruktu Vl J-PR-HA, který byl testován na myších a poskytl anti-HA specifické protilátky ještě před provedením Western blotu, čímž zanikla potřeba 30 provádět blot, protože exprese byla pozorována in vivo). Specifické protilátky proti PB1, PB2 a NS proteinům byly dodány panem Stephenem Inglisem z University of Cambridge, který při přípravě polyklonálního antiséra používal purifíkované proteiny exprimované jako β-galaktosidázové fuzní proteiny. Anti-NP polyklonální antisérum bylo vytvořeno imunizací králíků celými viiy A/PR/8/34. Protilátky anti-Ml jsou komerčně dodávané zBiodesign v podobě 35 kozího anti-chřipka A antiséra pod katalogovým číslem B65245G. V každém případě byl pozorován protein předpokládané délky potvrzující expresi kódovaného chřipkového proteinu probíhající in vitro.
Nomenklatura těchto konstruktů se řídí konvencemi: „název vektoru - kmen chřipky - gen“. 40 V každém případě byla sekvence klonovaných a sekvenovaných genových sekvencí A/PR/8/34 porovnána se známými sekvencemi zGENBANK. Biologická účinnost každého z těchto konstruktů je uvedena v předchozích příkladech 2, 3 a 4.
Sekvence 5'spojů CMVintA a chřipkových genů z A/PR/8/34:
1. Vl J-PR-NP, SEKV.ID: 12:, GENBANK registrační číslo: M38279
5'GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA AAA GCA GGG CMVintA NP.,..
TAG ATA ATC ACT CAC TGA GTC ACA TCA AAA TCA TG
-32CZ 290315 B6
2. V1J-PR-PB1, SEKV.ID:13., GENBANK registr, č. J02151
5'ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC
CMVintA PB1
CAT TTG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTT AAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTT CCC TTA TAC
3. V1J-PR-NS, SEKV.ID:14:, GENBANK reg. č. J02150
5'GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG
CMVintA NS...
TGA CAA AAA CAT AAT GGA TCC AAA CAC TGT GTC AAG CTT TCA GGT AGA TTG CTT TCT TTG GCA TGT CCG CAA ACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG TGA T...
4. V1J-PR-HA, SEKV.ID:15:, GENBANK reg. č. J02143
5'TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG AGC AAA
CMVintA HA...
AGCAGG GCA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA ACC TAC TGG TCC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG ACA CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA ACA ATT CAA CC....
-33CZ 290315 B6
5. VIJ-PR-PB2, SEKV.ID: 16:, GENBANK reg. č. J02153
TTT TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/C CGA ATT CCA
CMVintA PB2...
GCA AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAA TAA AAG AAC TAA GAA ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCA CCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG
TGG ACC ATA TGG CCA TAA TCA AGA AGT....
6. VIJ-PR-M1, SEKV.ID:17:, GENBANK reg. č. J02145
5'GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ ACC ATG AGT CTT CTA ACC
CMVintA Ml...
GAG GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAA GAG TTG ACG GAA GA...
Dále uvádíme, jak byly tyto fragmenty pospojovány:
1. VIJ-PR-NP: zatupený BglII (vektor) konec k zatopenému EcoRI konci (NP).
2. V1J.PR-PB1: zatopený BglII (vektor) konec k zatopenému HindUI (PB1).
3. V1J-PR-NS: zatopený BglII (vektor) konec k zatopenému EcoRI konci (NS1).
4. V1J-PR-HA: zatopený BglII (vektor) konec k zatopenému Hindlll konci (HA).
5. V1J-PR-PB2: přesahující konec BglII (vektor) k přesahujícímu konci BamHI (PB2).
6. V1J-PR-M1: přesahující konec BglII (vektor) k přesahujícímu konci BglII (Ml). Ml byl získán technikami PCR s použitím p8901-MlTE jako templáto a primerů, které přidávají BglII místa na oba konce, začínají 3 báze před ATG a končí hned za terminačním kodonem pro Ml (TGA).
Příklad 8
Expresivní vektor VIJneo, SEKV.ID: 18:
Bylo nutné z bakterií nesoucích VIJ odstranit gen ampr pro selekci na rezistenci na antibiotika, protože ampicilin nelze použít ve velkoobjemových fermentátorech. Gen ampr byl odstraněn z pUC páteře vektoru VIJ štěpením restrikčními enzymy SspI a Eaml 1051. Zbytek plazmidu byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu, jeho konce byly zarovnány působením T4 DNA polymerázy, a pak k nim byla přidána alkalická telecí intestinální fosfatáza. Komerčně dodávaný gen kanr odvozený od transpozonu 903 a obsažený v plazmidu pUC4K byl vyštěpen pomocí
-34CZ 290315 B6 restrikčního enzymu Pstl, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu a jeho konce byly zarovnány T4 DNA polymerázou. Tento fragment byl ligován s kostrou VIJ, čímž vznikly plazmidy s genem kanr v obou možných orientacích. Tyto plazmidy byly označeny VIJneo č. 1 a 3. Každý tento plazmid byl potvrzen analýzou štěpení restrikčními enzymy, sekvenováním DNA spojových oblastí. Tyto plazmidy dávaly podobné výtěžky jako VIJ. Exprese produktů heterologních genů vektorů VIJneo byla rovněž srovnatelná s expresí u VIJ. Vybrali jsme vektor VlJneo#3, který je dále označován jako VIJneo (SEKV.ID:18:) a který obsahuje gen kanr ve stejné orientaci jako je gen ampr v expresivním konstruktu VIJ.
Geny z každého kmene A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91 a B/Panama/46/90 byly klonovány jako cDNA do vektoru VIJneo. V každém případě byly spojové sekvence z 5'-promotorové oblasti (CMVintA) klonovaného genu sekvenovány s použitím primeru:
CMVintA primer 5'-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3', SEKV.ID:28:, který tvoří sekvenci této kódující sekvence. Tato sekvence přiléhá k sekvenci kódující terminátor, jehož sekvence je zde rovněž uvedena. Tato sekvence byla vytvořena použitím primeru: BGH primer 5'-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3', SEKV.ID:29:, který vytváří sekvenci nekódujícího řetězce. Každá sekvence genů klonovaných a sekvenovaných z izolátů těchto nebo jiných chřipkových virů byla zkontrolována proti známým sekvencím z GENBANK. Pozice, ve které se objevuje spoj, je označena což neoznačuje žádnou nespojitost v sekvenci. V případě spoje VIJneo-TX-HA byl sekvenační gel stlačen a bylo nesnadné přečíst počáteční sekvenci. Proto je prvních 8 bází tohoto spoje označeno jako „N“. Tyto nukleotidy byly potvrzeny a uvádíme zde určené nukleotidy. První „ATG“, objevující se v každé sekvenci, je iniciačním kodonem translace pro příslušný klonovaný gen. Každá uvedená sekvence představuje kompletní, lehce dostupný, exprimující se konstrukt DNA pro určitý chřipkový gen. Nomenklatura se řídí konvencí: „název vektoru - kmen chřipky - gen“. Biologická účinnost každého tohoto konstruktu je uvedena stejným způsobem jako ve výše uvedených příkladech 2, 3 a 4.
Sekvence 5'-spoje mezi CMVintA a geny chřipky a 3'-spoje chřipkových genů a konstruktem BGH terminátoru exprese s použitím různých chřipkových kmenů a proteinů:
I. A/Beijing/353/89
A. VIJneo-BJ-NP:
Promotor, SEKV.ID:20:
5'TCA CCG TCC TTA GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC
CMVintA
ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA AGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT
Terminátor, SEKV.ID:21:
5'GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT / ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA
BGH
-35CZ 290315 B6
II. A/Texas/36/91
A. VIJneo-TX-HA
Promotor, SEKV.ID:24
5'CCT TAG ATC/ GGA AAT AAA AAC AAC CAA AAT GAA
CMVintA HA...
AGC AAA ACT ACT AGT CC..
Terminátor, SEKV.ID:25:
5'GCA GAT C/CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC... BGH HA...
TCA GAT...
ίο III. B/Panama/46/90
A. VIJneo-PA-HA
Promotor, SEKV.ID:26: (prvních 1080 bází této sekvence je dostupných v GENBANK pod 15 registračním číslem M65171; níže uvedená sekvence je totožná se známou sekvencí; 3'sekvence SEKV.ID:27: níže nebyla předem zaznamenána.
5'ACC GTC CTT AGA TC/C AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT
CMVintA HA
ATC CAC AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC
ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC
Terminátor, SEKV.ID:27:
5'GGC ACA GCA GAT C/TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT
BGH HA....
AAT GGT AAC...
-36CZ 290315 B6
Příklad 9
Nitrokožní injekce chřipkových genů:
Postup nitrokožní aplikace genů byl stejný jako pro nitrosvalové injekce: tři injekce Vl-PR-NP každá po 200 pg, v intervalech po třech týdnech. Slezinné buňky byly pro testování in vitro sklizeny 55 dnů po třetí injekci a restimulovány nonapeptidem epitopu nukleoproteinu 147-155, SEKV.ID:9:. Cílové buňky (buňky P815, myší mastocym, syngenní s myšmi BALB/c H2d) byly infikovány heterologním virem A/Victoria/73, při lýze byl použit poměr mezi efektorem a cílovou buňkou v rozsahu mezi 5:1 a 40:1. Negativní kontroly byly provedeny měřením lýzy cílových buněk, které nebyly chřipkovým virem infikovány. Pozitivní kontroly byly provedeny měřením lýzy cílových buněk infikovaných chřipkovým virem prostřednictvím slezinných buněk získaných z myši, která byla třikrát očkována 130 pg Vl-PR-NP a která přežila infekci živým chřipkovým virem kmene A/HK/68.
Výsledky: specifické lýzy se dosáhlo použitím slezinných buněk z myší očkovaných nitrokožně ve všech možných poměrech efektor:cílová buňka. U slezinných buněk použitých jako efektoru získaných z myší, které nebyly očkovány nebo byly očkovány vektorem VI bez PR-NP genu, nebyla pozorována žádná lýza. Specifická lýza dosažená použitím nitrokožní aplikace byla navíc ve všech poměrech efektoncílová buňka srovnatelná s lýzou dosaženou při nitrosvalové aplikaci. U myší očkovaných nitrokožně nebo nitrosvalové byl změřen titr viru v plicích. Výsledky experimentů používajících 5 myší ve skupině, dávky 3 x200pg aplikované po třítýdenních intervalech a následnou infekci 3 týdny po poslední dávce byly následující:
| Vakcína | Způsob aplikace | Titr v plicích myši* | |
| Den 5. | Den 7. | ||
| Vl-PR-NP | nitrokožní | 5,2+/-0,2 | 4,1+/-1 ** |
| VI | nitrokožní | 5,9+/-1 | 6,6+/-0,3 |
| Vl-PR-NP | nitrosvalová | 4,6+/-0,4 | 4,5+/-1,1 ** |
| žádná | — | 6,2+/-0,3 | 5,9+/-0,3 |
*střední log titru +/- SEM **jedna z myší neměla žádný virus
Procento přežívajících myší bylo hodnoceno až do 28. dne. Do 28. dne přežilo 89 % příjemců očkovaných Vl-NP-PR do svalu a 50 % očkovaných nitrokožně. Z myší očkovaných vektorem VI nepřežila žádná a z neočkovaných myší přežilo 30 %. Tyto pokusy ukazují, že DNA kódující nukleoprotein z kmene A/PR/8/34 měla schopnost indukovat CTL rozpoznávající nukleoprotein z heterologního kmene A/Victoria/73 a vyvolávající obrannou imunitní odpověď proti heterolognímu kmeni A/HK/68.
Příklad 10
Polynukleotidová vakcína pro primáty.
1. Protilátky proti NP u makaků: makakové (006 NP, 009 NP nebo kontrola 101; 021) byli očkováni nitrosvalové RSV-NP 1 mg/místo do tří míst 1. den. Injekce obsahující každá 1 mg RSV-LUX a CMV-int-LUX, konstrukty pro expresi luciferázy světlušek, byly zvířatům aplikovány ve stejný den do jiných míst.Patnáctého dne byla zvířata očkována stejnou DNA jako předtím a zároveň pD5-CAT v dávkách 1 mg do každého místa, což je konstrukt pro reportérový gen pro expresi chloramfenykol-acetyl transferázy. Svaly obsahující reportérové geny byly testovány na aktivitu těchto reportérových genů. V období 3, 5, 9, 11, 13 a 15 týdnů po první injekci bylo sebráno sérum. První pozitivní vzorky anti-NP protilátek byly odebrány v 11. týdnu,
-37CZ 290315 B6 další pozitivní vzorky byly z 13. a 15. týdne. Anti-NP protilátky byly stanoveny ELIS A testem.
Výsledky jsou uvedeny na obr. 9.
2. Hemaglutinin inhibující (HI) protilátky u makaků: Opice byly v den 1 očkovány do svalu injekcemi V1J-PR-HA. Každé ze dvou zvířat obdrželo 1 mg, 100 pg nebo 10 pg DNA do každého čtyřhlavého svalu. Každá injekce byla podána v objemu 0,5 ml. Zvířatům byla odebrána krev před aplikací první injekce. Všechna zvířata byla přeočkována DNA 15. den a krev jim pak byla odebírána v 2-4 týdenních intervalech. Titr inhibice hemaglutininu (HI) proti A/PR/8/34 byl pozitivní za 5 týdnů, 9 týdnů a 12 týdnů pro první injekci V1J-PR-HA DNA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10—I:
Tabulka 10—I
TITR HI PROTILÁTEK U MAKAKŮ OČKOVANÝCH V1J-PR-HA DNA
| makak č. | dávka | Titr HI protilátek v týdnu č. | ||||
| před | 3 | 5 | 9 | 12 | ||
| 88-010 | 1 MG | <10 | <10 | 320 | 320 | 320 |
| 88-0200 | <10 | <10 | <10 | 40 | 40 | |
| 88-021 | 100 UG | <10 | <10 | <10 | 40 | 20 |
| 90-026 | <10 | <10 | 20 | 20 | 40 | |
| 88-084 | <10 | 20 | 40 | 20 | 10 | |
| 90-028 | <10 | <10 | 20 | <10 | <10 |
Přikladli
Studie polynukleotidové vakcíny pro fretky.
1. Výzkum polynukleotidového očkování fretek byl započat s úmyslem určit, zda by mohla být zvířata chráněna před chřipkou A očkováním geny kódujícími buď HA (povrchový protein schopný indukovat kmenově-specifické neutralizující protilátky) nebo vnitřními proteiny NP, NSI, PBI, M (zřejmě schopných indukovat imunitní na kmeni nezávislou odpověď zprostředkovanou buňkami). Zvířata byla očkována DNA kódující různé chřipkové geny v našem VIJ-vektoru:
Tabulka 11-1
| skupina | konstrukt | dávka | počet očk. zvířat | infekce H1N1 | infekce H3N2 |
| 1 | V1J-HA | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 2 | V1J-NP | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 3 | V1J+NP+ NS1+PB1 +PB2+M | celkem 2000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 4 | V1J-HA+ NP+NS1+ PB1+PB2+M | celkem 2000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 5 | VIJ- | 1000 mg | 16 | 8 | 8 |
| 6 | zadny | žádná | 10 | 5 | 5 |
| celkem | 90 | 45 | 45 |
-38CZ 290315 B6
2. Od očkovaných zvířat bylo odebráno 22. a 43. den po imunizaci sérum a testováno ELISA testem na neutralizující protilátky (inhibující hemaglutinin - Hl) a na protilátky na nukleoprotein (NP). Zvířata očkovaná DNA exprimovala protilátky na odpovídající geny. Tyto údaje jsou uvedeny na obrázcích 10, 11 a 16.
3. Vybraná očkovaná zvířata byla 128. den infikována 1200 TCID50 chřipky A/HK/68. Tento kmen je heterologní s kmenem A/PR/8/34, který byl zdrojem kódujících sekvencí použitých při očkování, a tudíž ochrana představuje imunitu založenou na mechanizmu imunity zprostředkované buňkami a nezávislé na druhu kmene. Obrázek 12 ukazuje statisticky významné snížení šíření viru v organismu v porovnání s kontrolními zvířaty u zvířat očkovaných DNA kódující vnitřní proteiny, čímž se potvrdilo, že očkování polynukleotidy vyvolává u fretek imunitní odpověď a že tato odpověď je ochranného charakteru.
4. Homologní infekce A/PR/8/34 byla testována podobně a podobně je zde i demonstrována účinnost ochrany neutralizujícími protilátkami indukovanými polynukleotidovou vakcinací.
Příklad 12
Příprava VI Jns
Pro provedení pokusů s integrací genů bylo do VIJneo přidáno restrikční místo Sfil. Komerčně dodávaný spojovník Sfil dlouhý 13 bází (New England BioLabs) byl přidán do místa KpnI v sekvenci BGH daného vektoru. VIJneo byl linearizován KpnI, purifikován gelovou elektroforézou, konce zarovnány T4 DNA polymerázou a ligován se zatupeným spojovníkem Sfil. Izoláty pro klonování byly vybrány restrikčním mapováním a ověřeny sekvenováním přes spojovník. Nový vektor byl označen VIJns (obr. 17). Exprese heterologních genů vVIJns (s Sfil) bylo srovnatelná s expresí stejných genů v VIJneo (s KpnI).
Příklad 13
Imunogenicita
1. Humorální imunitní odpověď
Injekce DNA kódující chřipkové HA, NP a Ml vedla u myší, fretek nebo člověku nepříbuzných primátů (včetně afrických zelených opic a makaků) k humorální imunitní odpovědi. Do dnešního dne bylo dokázáno, že tvorbu protilátek vyvolává PNV obsahující geny HA klonované z A/PR/34, B/Panama/90, A/Beijing/89, A/Texas/91, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93.
a) Myši; ELISA testy byly stanoveny protilátky na NP a Ml v séru myší po očkování DNA. Výrazné litry protilátek (104-106) se u myší vytvořily již po tak nízkých dávkách, jako je 1 μg NP DNA (A/PR/34) aplikovaných jednou (nejmenší testovaná dávka), a již po 2 týdnech po injekci (nejčastější testovaný termín) a nesnižovaly se po dobu nejméně 6 měsíců. Tyto NP protilátky nejsou neutralizující a neúčastní se obrany. Avšak po injekci DNA vykazují in vivo expresi NP proteinu. Naproti tomu protilátky na HA poskytují obrannou imunitu proti homologním kmenům chřipkového viru. Injekce HA DNA klonovaná z kmene A/PR/34 vedla k tvorbě neutralizujících protilátek, které byly ověřeny in vitro testy inhibice hemaglutininu (Hl). U mnoha myší byl po třech dávkách 100 pg HA DNA naměřen titr ΗΊ >1280 a některých zvířat, která obdržela pouze dvě dávky 0,1 pg, byl zjistitelný titr protilátek. Byla zjištěna souvislost mezi dávkami DNA a výškou titru Hl protilátek a zároveň mezi Hl titrem a počtem injekcí (tabulka 13—1):
-39CZ 290315 B6
Tabulka 13
Tvorba humorální imunitní odpovědi u myší
| dávka (pg) | GMTHI | ||
| počet dávek | |||
| 1 | 2 | 3 | |
| HA DNA (100) | 75 | 106 | 260 |
| HA DNA (10) | 37 | 69 | 86 |
| HA DNA (1) | <10a | 13 | 24 |
| HA DNA (0,1) | <10b | <10a | <10a |
| kontrolní DNA (100) | <10b | <10b | <10b |
| bez očkování | <10b |
Tabulka 13-1: Samice myší BALB/c (4-6 týdnů) byly očkovány A/PR/34 HA DNA (V1JHA) uvedenými dávkami buď jednou, dvakrát nebo třikrát v třítýdenních intervalech. Negativní kontrolou byly myši očkované kontrolní DNA sestávající z vektoru bez inzertu genu (VIJ) a neočkované a dosud nenakažené myši. Vzorky séra byly odebírány 7 týdnů po dávce a byly testovány na přítomnost hemaglutinin inhibujících protilátek (HI). Tyto údaje jsou uvedeny jako geometrická střední hodnota titru HI, kde n = 10.
“některé z testovaných myší měly pozitivní titr HI, bvšechny myši.
Ve všech testovaných myších korelovala přítomnost HI protilátek s obranou v modelu se stejnorodou infekcí. HI protilátek u myší očkovaných HA DNA (A/PR/34) zůstaly bez podstatných změn po dobu nejméně 6 měsíců. HA protilátky se podle měření ELISA testy rovněž tvořily u myší, na kterých byla použita HA DNA z A/Beijing/89, B/Panama/90 a A/Texas/91 kmenů chřipkového viru.
Na základě informací z literatury, uvádějících nižší exprese reportérových genů u starších myší po injekcích DNA, jsme rovněž testovali vliv věku na humorální imunitní odpověď na HA. Z důvodu nedostatku starších dosud neoplozených myších samic byly použity odrostlé matky ve věku přibližně 10 měsíců. Byly porovnány odrostlé matky s 4-6titýdenními dosud neoplozenými samicemi vzhledem kjejich schopnostem vytvářet HA protilátky. Starší myši byly schopny vytvářet protilátky již po tak nízkých dávkách HA DNA jako je 1 pg (nejnižší testovaná dávka), i když měly nižší titr protilátek než mladé myši (tabulka 13-Π):
Tabulka 13-Π
Vliv věku na humorální imunitní odpověď
| inokulum | dávka (pg) | GMT (4-6 týdnů) | GMT (10 měsíců) |
| HA DNA | 100 | 1,034 | 110 |
| HA DNA | 10 | 338 | 68 |
| HA DNA | 1 | 80 | 20 |
| kontr. DNA | 100 | <5a | <5a |
| neočkované | — | <5a | <5a |
| chřipka | - | 538 | 36 |
-40CZ 290315 B6
Tabulka 13-11: Samice myší BALB/c (4-6týdenní nikdy neoplodněné samice a 10ti měsíční odrostlé chovné samice) byly očkovány A/PR/34 HA DNA (V1JHA) uvedenými dávkami třikrát v třítýdenních intervalech. Negativní kontroly zahrnovaly myši očkované kontrolní DNA (VIJ) a myši neočkované, které nepřišly do styku s chřipkou. Pro srovnání byly další myši infikovány subletální dávkou chřipky A/PR/34. Za devět týdnů po první dávce bylo myším odebráno sérum, které bylo poté testováno na titr HI. Údaje jsou uváděny jako geometrická střední hodnota HI titru, kde n = 15.
“všechny testované myši s negativním HI titrem
Toto však nebylo výsledkem samotné PNV, ale spíše sníženou schopností starších myší tvořit humorální imunitní odpověď obecně, protože starší myši rovněž vykazovaly po infekci živým virem A/PR/34 nižší HI odpovědi než mladší myši. Ve skutečnosti byly HI protilátky u starších myší očkovaných DNA méně potlačeny než u starších myší infikovaných chřipkou. Starší chovné samice použité v těchto pokusech byly navíc přibližně o 50 % těžší než typické stejně staré nikdy neoplodněné samice, což mohlo mít podle studií o využití diet pro omezení kalorií u myší neblahý účinek na imunitní odpověď těchto zvířat. Z těchto i dalších důvodů možná nebyla imunitní odpověď těchto zvířat charakteristická. Nicméně věk (až do nejméně 10 měsíců věku) nijak významně nesnižoval schopnost polynukleotidové vakcinace indukovat humorální imunitní odpověď, a to i v tak nízkých dávkách jako je 1 pg.
b) Fretky: humorální imunitní odpověď se vytvořila u fretek očkovaných HA DNA z kmenů chřipkových virů A/PR/34, A/Beijing/89, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93. HI protilátky proti A/PR/34 a ELISA protilátky proti HA z jiných kmenů byly vytvořeny příslušnou PNV. Zjistilo se, že v sérech fretek očkovaných HA DNA z A/Beijing/89, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93 jsou HI protilátky a neutralizující protilátky, protože tato zvířata byla chráněna před virovou nákazou.
c) Primáti nepříbuzní člověku: (viz rovněž příklad 10)
Makakové byli dvakrát imunizováni HA DNA (A/PR/34) dávkami 10, 100 a 1000 pg na každou nohu. Byl naměřen titr HI až do 320 u zvířat, která obdržela dávky 100 nebo 1000 pg a jedno zvíře ze skupiny s dávkami 10 pg mělo titr HI 80. Až do této doby bylo testováno sérum až do doby 13 měsíců, HI titr se nesnižoval přibližně od 6-13 měsíců (tabulka 13-III):
Tabulka 13-ΠΙ
Tvorba HI protilátek u makaků
| dávka mg | před | 1 měsíc | 2 měsíce | 5,5 měs. | 13 měs. |
| 2000 | <10 | 640 | 320 | 160 | 80 |
| 2000 | <10 | 40 | 40 | 20 | 20 |
| 200 | <10 | 80 | 40 | 40 | 80 |
| 200 | <10 | 80 | 80 | 40 | 20 |
| 20 | <10 | 40 | 20 | 20 | 20 |
| 20 | <10 | < 10 | <10 | <10 | <10 |
Tabulka 13-III: Makakové (samci i samice) o velikosti od 4,3 do 8,8 kg byli očkováni HA DNA z A/PR/34 (V1JHA) v uvedených dávkách v 0. a 2. týdnu. Vzorky séra byly odebírány ve vyznačených dnech po dávkách a testovány na titr HI. Údaje představují titr ΗΊ u jednotlivých zvířat.
-41 CZ 290315 B6
Africké zelené opice očkované kombinovanou PNV obsahující 100 pg HA DNA (A/Beijing/89). Vyhodnocení séra 4-6 týdnů po první dávce ukázalo GMT 29 (8/9). Tyto výsledky jsou lepší než u obou dosud dodávaných subvirionových vakcín (GMT 16 pro 5/6) a vakcín s celými viry (GMT=36, 6/6) při stejných testech (obr. 18.). Značný vylepšovací účinek druhého očkování byl pozorován u zvířat s dávkami 10 pg HA DNA (GMT = 1,9 po jedné dávce a 199 po druhé dávce). Patentované vakcíny s celými viriony vykazovaly podobný podpůrný účinek, zatímco titry HI vytvořených druhou dávkou vakcínou subvirionů byly pouze přechodné. Až do dnešního dne byly měřeny podobné hladiny HI protilátek až do 18. týdne u zvířat očkovaných dávkami jak 10 pg tak 100 pg HA DNA v porovnání s dosud dodávanými vakcínami (s celými viry). Tyto výsledky ukazují, že PNV byla přinejmenším stejně účinná při tvorbě protilátek jako vakcína s celými viry, která předcházela subvirionové vakcíně. Imunogenicita purifikovaných subjednotkovaných vakcín nebyla u myší zjistitelná, takže se u primátů netestovala. V tomto pokuse obsahovala PNV pětivalentní směs DNA kódující HA z A/Beijing/89, B/Panama/90 a A/Texas/91, a NPA Ml z A/PR/34, aby připomínaly zkoušenou vakcínu. Rovněž jsme testovali zvířata na tvorbu humorální imunitní odpovědi proti ostatním složkám vakcíny a zjistily jsme protilátky na HA z B/Panama/90 a NP z A/PR/34. V oddělených experimentech byly indukovány proti A/Texas/91 jak HI tak neutralizující protilátky indukované injekcemi dvou dávek HA DNA klonované PCR.
2. Imunitní odpověď zprostředkovaná buňkami
Viz výše uvedený příklad 3.
3. Tvorba imunitní odpovědi.
a) Humorální imunita: mechanismy vyvolávající po injekci DNA tvorbu humorální a buněčné imunitní odpovědi ještě nebyly objasněny. Při tvorbě neutralizujících protilátek (např. proti HA chřipkového viru) musí buňky pravděpodobně exprimovat antigen na plazmatické membráně nebo ho sekretovat do mimobuněčného prostředí. Transfekované buňky by měly navíc exprimovat HA v sekundární, terciární i kvartémí struktuře podobné HA ve virionu. V rozetových testech byla povrchová exprese HA ukázána na RD buňkách (rabdomyosarkom, myoblastický původ) přechodně transfekovaných HA DNA. Červené krvinky aglutinovaly s povrchem buněk transfektovaných HA, ale nikoli s povrchem buněk transfekovaných imitací HA, čímž se prokázalo, že HA nebyl pouze exprimován na povrchu, ale ponechal si rovněž patřičnou konformaci nutnou pro vazbu na protein obsahující sialovou kyselinu.
b) Buněčná imunita: tvorba buněčné imunitní odpovědi (např. na NP chřipkového viru) vyžaduje proteolytické zpracování a prezentaci odvozených peptidů ve spojení s MHC třídy I. Povaha buněk prezentujících antigen vedoucí k tvorbě imunitní odpovědi po injekci DNA není dosud známa. Svalové buňky exprimují nízké hladiny MHC třídy I a předpokládá se o nich, že na svých površích neexprimují kostimulační molekuly. Svalové buňky nejsou tudíž považovány za buňky, které byl prezentovaly antigeny. Nicméně několik pokusů ukazuje, že svalové buňky se účastní tvorby imunitní odpovědi po nitrosvalové injekci DNA. V první řadě to bylo limitované testování tkání schopných intemalizovat holou plazmidovou DNA do exprese proteinů in šitu, které ukázalo, že mnoho typů buněk může exprimovat reportérové geny po injekci plazmidu přímo do tkáně, ale všechny buňky byly obecně méně účinné než svalové buňky. Kompletní analýza příjmu DNA jinými než svalovými buňkami po nitrosvalové injekci nebyla ještě publikována, ale je pravděpodobné, že takový příjem by měl ještě nižší účinnost. Za druhé byla prokázána exprese reportérových genů po nitrosvalové injekci DNA do kostních buněk a buněk srdeční svaloviny u různých živočichů. Ve třetím případě bylo zjištěno, že ačkoli odpovědi CTL se mohou vytvořit po injekci DNA jinými cestami (intravenózní a nitrokožní), byly nejlepší imunitní odpovědi u myší vytvořeny po nitrosvalové injekci DNA. Za čtvrté, CTL mohou rozpoznávat a lyžovat myoblasty a myocyty in vitro a tato lýza může být posílena předchozí reakcí s γ-interferonem, který příznivě reguluje expresi proteinů MHC I. třídy. A konečně transplantace stabilně transfekovaných myoblastů exprimujících NP do nikdy neinfikovaných
-42CZ 290315 B6 syngenních myší vedla k tvorbě obranné buněčné imunitní odpovědi in vivo (obr. 20). Takže exprese antigenů svalovými buňkami je dostatečná pro indukci obranné imunitní odpovědi pozorované po injekci DNA. Navíc příjem a exprese DNA jinými než svalovými buňkami nemusí být požadovaným příspěvkem při vytvoření obranné imunity. Z hlediska polynukleotidových vakcín by bylo do budoucna výhodně omezit příjem DNA buňkami. V první řadě protože jsou myocyty diferencované a nedělí se. Tato skutečnost může být důležitá při snižování možnosti integrace plazmidové DNA do chromozomální DNA a udržení permanentní prezentace antigenů, která vede k dlouhotrvající imunitní odpovědi. Za druhé jsou myocyty velké buňky s násobnými jádry, které je možno vytvořit fúzí myoblastů. Tím se může vysvětlit proč vedou injekce DNA k expresi proteinů, která může trvat po dlouhá časová období bez žádného důkazu o cytolytické destrukci CTL.
Příklad 14
Studie ochrany
Očkování DNA kódující antigeny chřipkového viru poskytovalo ochranu před onemocněním a úmrtím a snižovalo virové zatížení u četných kombinací chřipkových kmenů při použití dvou obecně přijímaných modelů pro nákazu lidskou chřipkou (myší a fretky).
1. Heterologní (heterotypická, skupinová) ochrana - současnými patentovanými vakcínami s usmrcenými viry není poskytována dostatečná heterologní ochrana, ale je poskytována očkováním DNA prováděném na živočišných modelech. Tato ochrana se projevila u laboratorních zvířat očkovaných DNA kódující NP nebo Ml. Buněčná imunitní křížová (CMI) odpověď indukovaná očkováním DNA vyvolávala ochranné odpovědi.
a. Myši: BALB/c a C3H očkované do svalu injekcemi DNA kódující NP zA/PR/34 byly ochráněny před úmrtím a rozvinutím choroby (hodnoceno podle snížení úbytku tělesné hmotnosti) po kompletní infekci dýchacího traktu LD90 z A/HongKong/68 (H3N2) aheterotypickým kmenem (H3 vs H1 pro A/PR/34). Obr. 21 ukazuje počty přežívajících myší BALB/c očkovaných třikrát NP DNA (200 pg/dávka) v třítýdenních intervalech a infikovaných 3 týdny po posledním očkování. Obrázek 22 ukazuje potlačení úbytku tělesné hmotnosti po nákaze u očkovaných myší porovnány se značnými ztrátami tělesné hmotnosti zaznamenanými z kontrolních myší. Obrázek 23 ukazuje snížení virové zátěže v plicích myší očkovaných NP DNA 7 dnů po infekci horního dýchacího traktu v porovnání s myšmi, kterým byla očkována kontrolní nekódující DNA. Myši očkované NP DNA byly kompletně chráněny před smrtí, vykazovaly snížené úbytky tělesné hmotnosti a nižší virové zatížení v plicích v porovnání s kontrolními myšmi. Množství NP DNA potřebné k ochraně myší a ke snížení úbytku tělesné hmotnosti bylo stanoveno na <6,25 pg na jednu injekci při počtu tří injekcí DNA (obr. 24). Ochrana poskytovaná očkováním NP DNA trvala u očkovaných myší bez významných změn po dobu nejméně 3 měsíců. Hladina obranných látek přetrvávala do 6ti měsíců, ale mírně se snižovala mezi 3. a 6. měsícem po posledním očkování. Avšak jediná injekce NPDNA opakovaná v 22. týdnu, tj. tři týdny před infekcí v 25. týdnu, obnovila plnou ochranu (obr. 25). Toto očkování myší NP DNA vytvořilo dlouhodobou, zvyšovatelnou heterologní obranu. Schopnost vytvořit předchorobní odpověď při revakcinaci těchto zvířat naznačuje, že imunologická paměť byla indukována očkováním NP DNA.
b. Fretky: Fretky jsou obecně používaným modelem pro infekci lidskou chřipkou, protože jsou citlivé na infekci velkou škálou izolátů lidských chřipkových virů. Replikace viru u fretek probíhá především v nozdrách a tracheách, v menší míře také v plicích, na rozdíl od myší, u kterých dochází ke značnému zatížení plic viry. Infekce u fretek se dá snadno pozorovat titrací víru v nosním výplachu u fretek. Fretky imunizované NP DNA nebo Ml DNA, samostatnou nebo v kombinaci, z kmene získaného v nedávné době od lidí (A/Beijing/89, H3N2) vykazovaly značně snížené šíření viru ve dnech 1-6 od infekce izolátu z terénu, A/Georgia/93 (H3N2)
-43CZ 290315 B6 (obr. 26). U tohoto izolátu z terénu došlo k antigennímu driftu od kmene typu A/Beijing/89, takže patentovaná vakcína proti A/Beijing/89 poskytovala lidem pouze malou nebo žádnou ochranu proti onemocnění způsobenému A/Georgia/93. Fretky očkované DNA kódující vnitřní proteiny zA/PR/34 vykazovaly značně snížené šíření viru v nosním výplachu 5. a 6. den po infekci stejnorodným kmenem A/PR/34 (obr. 27). Snížené šíření viru bylo pozorováno po infekci A/Georgia/93 krátce po ní i v delším časovém odstupu, zatímco u nákazy A/PR/34 bylo pozorováno pozdní snížení šíření viru, což mohlo být způsobeno rozdílnou virulencí těchto dvou kmenů pro fretky.
2. Homologní (homotypický, typově specifická) obrana byla snadno zjistitelná jak u myší tak fretek očkovaných HA DNA.
a. Myši: BALB/c myši očkované HA DNA (A/PR/34) byly plně chráněny proti nákaze LD90 z A/PR/34. U očkovaných myší se po infekci neobjevovala ani úmrtí (obr. 28), ani úbytky tělesné váhy vyšší než 5 % (obr. 29), zatímco 90-100 % kontrolních myší umíralo a vykazovalo veliké ztráty tělesné hmotnosti. Titrace dávek HA DNA potřebných pro dosažení ochrany ukázaly, že tři injekce obsahující 1 pg HA DNA byly dostatečné k dosažení plné ochrany (obr. 30).
b. Fretky: Fretky očkované DNA kódující HA zA/PR/34 měly značně nižší šíření viru 1.-6. den po nákaze homologní infekcí než fretky, kterým byla očkována kontrolní DNA (obr. 31). Podobně fretky očkované A/Georgia/93 HA DNA měly 1. den a pak 3.-7. den snížené šíření viru po infekci homologním kmenem (obr. 32). U obou příslušných kmenů byla v séru všech očkovaných fretek pozorována přítomnost HI protilátek proti těmto kmenům (vide supra). Tak očkování HA DNA vytvořilo homologní ochranu.
3. Kombinace vakcín: Na fretkách byla otestována schopnost HA DNA poskytnou rozsáhlou ochranu, je-li tato kombinována s NP a Ml DNA.
a. Šíře ochrany proti variantám s antigenním driftem: antigenní drift, ke kterému došlo mezi kmeny A/Beijing/89 a A/Beijing/92, měl takový rozsah, že lidé očkovaní vakcínou obsahující A/Beijing/89 nebyli chráněni proti onemocnění způsobenému kmenem A/Beijing/92. V Severní Americe bylo rozšíření onemocnění způsobeno A/Beijing/92 podobnému izolátům z terénu, např. A/Georgia/93. Izoláty ze Severní Ameriky mají antigeny podobné kmeni typu A/Beijing/92, ale liší se geografickým místem izolace a historií pasážování, protože byly pasážovány spíše v savčích organismech než v kuřecích zárodcích. Pokud jde o aminosekvenci HA jsou však kmeny podobné A/Beijing/92 odlišné od kmenů A/Beijing/89 pouze v 11 bodových mutacích (polohy 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193, 226 a 262) v oblasti HA1. Snažili jsme se tudíž určit, zda by kombinování homotypických imunitních odpovědí indukovaných HA DNA s křížem reagujícími odpověďmi CMI indukovanými DNA pro NP a Ml poskytovalo vyšší stupeň ochrany proti variantám s antigenním driftem. Očkování fretek patentovanými vakcínami obsahujícími kmen A/Beijing/89 nebo sHA DNA buď z A/Beijing/89 nebo izolát z terénu podobný Beijing 89 (A/Hawaii/91) přineslo snížení šíření viru po infekci fretek A/Georgia/93 (obr. 33). U fretek, které byly očkovány kombinovanou PNV obsahující NP, Ml a HA DNA se významnou měrou snížilo šíření viru v porovnání s fretkami očkovanými dosud patentovanou vakcínou nebo vakcínou obsahující samotnou HA DNA (obr. 34). V případě HA DNA z A/Hawaii/91 kombinované sNP a Ml DNA z A/Beijing/89 nebyla výsledná ochrana výrazně odlišná od maximální ochrany poskytované homologní HA DNA z A/Georgia/93 (obr. 35). Tak kombinace HA, NP a Ml DNA poskytovala zvýšenou ochranu proti variantám s antigenním driftem vzhledem k dosud patentovaným vakcínám.
b. Účinek historie pasážování antigenu vakcíny: fretky, které byly očkovány vakcínou obsahující sekvence HA DNA odvozené z izolátu z terénu z USA pasážovaného v buňkách MDCK ve tkáňové kultuře (A/Hawaii/91) prokazovaly nižší (p=0,021 dvoucestným ANOVA testem) šíření viru než fretky, kterým byla podána patentovaná vakcína obsahující usmrcené viry A/Beijing/89 pasážované v kuřecích zárodcích po nákaze kmenem /A/Georgia/93 s antigenním
-44CZ 290315 B6 driftem (obr. 33). Oproti tomu fretky, kterým byla aplikována HA DNA z A/Beijing/89, neukazovaly odlišné šíření viru (p=0,058) po nákaze A/Georgia/93 v porovnání s fretkami, kterým byla aplikována dosud patentovaná vakcína obsahující stejný virus. Kmeny pěstované na kuřecích zárodcích a pasážované v savcích se liší ve dvou bodových mutacích v HA1 části oblasti HA (pozice 186 a 193), které jsou obě umístěny v antigenním místě B poblíž vrcholu HA monomeru v oblasti, která je pravděpodobně důležitá pro vazbu HI a neutralizujících protilátek. V některých případech je schopnost některých izolátů lidské chřipky vázat se na kuřecí RBC zpočátku velmi nízká, ale zvýší se následným pasážováním v kuřecích zárodcích, což může znamenat, že oblast HA pro vazbu receptorů může procházet růstem v ptačích buňkách značnou selekcí. Vliv malých sekvenčních variací na účinek chřipkových vakcín založených na HA na laboratorní zvířata podtrhuje možný důležitý požadavek držet se při přípravě vakcíny co nejblíže sekvenci divokého typu viru.
c. Primáti nepříbuzní člověku: Primáti nepříbuzní člověku nejsou pro svoje nízké klinické odpovědi na infekci obecně používáni jako modely pro chřipkové nákazy. My jsme však prozkoumali imunogenicitu kombinací vakcíny PNV u primátů nepříbuzných člověku v porovnání s dosud patentovanými vakcínami obsahujícími usmrcený virus. Titr protilátek vyvolaných kombinací PNV obsahující geny pro HA a vnitřní proteiny byl přinejmenším totožný s titrem HI protilátek a s délkou odpovědi (vide supra).
Africké zelené opice, které byly očkovány PNV odpovídaly na HA PNV pro varianty s antigenním driftem, čímž se ukázalo, že typově-specifické odpovědi na PNV mohou být vytvořeny u předem očkovaných subjektů.
Opice, které byly očkovány PNV, rovněž odpovídaly na následné očkování konvenčními vakcínami s usmrcenými viry.
4. Závěr: Polynukleotidové vakcíny proti chřipce jsou účinné na modelech laboratorních zvířat pro chřipková onemocnění. Homologní ochrany může být dosaženo použitím DNA vektorů kódujících HA nejspíše imunologickými mechanismy analogickými s mechanismy indukovanými HA proteinem použitým v současné době používaných chřipkových vakcínách. Heterologní ochrany může být dosaženo proti kmenům s antigenním driftem i posunem rovněž současným použitím DNA kódující konzervované vnitřní proteiny chřipkových virů. Kombinace těchto přístupů v jediném očkování poskytuje v porovnání se současnými patentovanými vakcínami zvýšenou ochranu proti variantám s antigenním shiftem i driftem v modelech na fretkách.
Příklad 15
Příprava V1R vektoru
Ve snaze pokračovat v optimalizaci základních vektorů pro očkování jsme připravili derivát VIJns, který byl navržen jako VIR. Účelem konstrukce tohoto vektoru bylo získat očkovací vektor o minimální velikosti, tj. bez nezbytných sekvencí DNA, který by si stále ponechával celkové vlastnosti pro expresi různorodých genů a stejné výtěžky plazmidu jako byly získány u VIJ a VIJns. Na základě literatury a vlastních zjištění jsme určili, že (1) oblast v základní kostře pUC obsahující počátek replikace v E. coli může být odstraněna, aniž by to nějak ovlivnilo výtěžek plazmidu v bakteriích, (2) oblast 3'- genu kari následující po otevřeném čtecím rámci pro kanamycin může být rovněž odstraněna a místo ní vložen terminační kodon pro bakterie, a že (3) ~ 300 bp z 3'- poloviny terminačního kodonu BGH může být odstraněno, aniž by byla ovlivněna jeho regulační funkce (následující po původním místě pro restrikční enzym KpnI v rámci části BGH).
-45CZ 290315 B6
VIR byl zkonstruován s použitím technik PCR pro syntézu tří fragmentů DNA zVIJns reprezentujících CMVintA promotor/BGH terminátor, počátek replikace a prvky rezistence na kanamycin. Ke každému konci segmentu byla s použitím PCR oligomerů přidána unikátní místa pro restrikční enzymy: SspI a Xhol pro CMVintA/BGH, EcoRI a BamHI pro gen kari a Bell a Sáli pro orf. Tato místa pro restrikční enzymy byla vybrána, protože umožňují přímou ligaci každého tohoto DNA segmentu odvozeného PCR s následnou ztrátou každého tohoto místa: EcoRI a SspI zanechávají DNA se zarovnanými konci které jsou kompatibilní pro ligaci, zatímco BamHI a Bell zanechávají komplementární přesahující konce jako Sáli a Xhol. Po obdržení těchto segmentů technikami PCR byl každý segment štěpen příslušnými restrikčními enzymy uvedenými výše a pak byly segmenty ligovány dohromady v jednoduché reakční směsi obsahující všechny tři segmenty DNA. 5'-konec orf byl navržen tak, aby obsahoval T2 rho nezávislou sekvenci terminátoru, která se normálně v této oblasti vyskytuje, aby poskytoval informaci pro terminaci genu pro rezistenci na kanamycin. Ligovaný produkt byl potvrzen digescí restrikčním enzymem (> 8 enzymů) a sekvenováním DNA v místech ligačních spojů. Výtěžky DNA plazmidů a heterologní exprese s použitím virových genů v rámci VIR se zdají být podobné výtěžkům u VIJns. Čistá dosažená redukce ve velikosti vektoru byla 1346 bp (VI Jns = 4,86 kb; VIR = 3,52 kb), viz obr. 36, SEKV.ID:45:.
Sekvence PCR oligomerů použitého pro syntézu VIR (restrikční místa jsou podtržená a vyznačená v závorce za sekvencí):
(1) 5'- GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [SspI] SEKV.ID:60:, (2) 5'- CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC ACC-3' [Xhol] SEKV.ID:61:, (pro CMVintA/BGH segment) (3) 5'- GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3' [EcoRI] SEKV.ID: 62:.
(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamHI] SEKV.ID:63:, (pro segment genu pro rezistenci na kanamycin) (5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3' [Bell] SEKV.ID-.64:
(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [Sáli] SEKV.ID:32:
(pro počátek replikace v E. coli)
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) ŽADATEL: Donnelly, John J.
Dwarki, Varavani J Liu, Margaret A Montgomery, Donna L Parker, Suezanne E Shiver, John W
-46CZ 290315 B6 (íi) NÁZEV VYNÁLEZU: Léčebné přípravky obsahují nukleovou kyselinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 64 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Měrek & Co., Inc.
(B) ULICE: P.O. Box 2000 (C) MĚSTO: Rahway (D) STÁT: NewJersey (E) ZEMĚ: Spojené státy americké (F) PSČ: 07065 (v) POČÍTAČOVÝ FORMÁT (A) TYP MÉDIA: pružný disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPER. SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Parentln Release # 1,0, verze # 1,25 (vi) ÚDAJE SOUČASNÉ PŘIHLÁŠKY:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM REGISTRACE:
(C) KLASIFIKACE:
(vii) ÚDAJE O PŘEDCHOZÍ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/089,985 (B) DATUM REGISTRACE: 8. července, 1993 (viii) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/AGENTOVI:
(A) JMÉNO: Bencen, Gerard H (B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 35,746 (C) ODKAZOVÉ/JEDN. ČÍSLO: 18972Y (ix) INFORMACE O SPOJENÍ:
(A) TELEFON: (908) 594 - 3901 (B) TELEFAX: (908) 594-4720 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-47CZ 290315 B6
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 1: |
GTGTGCACCT CAAGCTGG18 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 23 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 2: |
CCCTTTGAGA ATGTTGCACA TTC23 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 33 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID.Č.3: |
GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC33 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 4:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 36 párů bází |
| (B) TYP: | nukleová kyselina -48- |
| (C) POČET ŘETĚZCŮ: | jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 4: |
CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC 36 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 5:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 23 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 5: |
CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG 23 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 6:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 30 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 6: |
GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG
-49CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 7:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 39 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 7: |
GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC 39 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 8:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 39 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 8: |
GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC 39 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 9:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 9 párů bází aminokyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | peptid |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
-50CZ 290315 B6 (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 9:
Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val
5 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 10:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 4432 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 10: |
TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT
GCACCTCCCG
GAGACGGTCA
CACCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGCGCGCG TCAGCGGGTG
120
TTGGCGGGTG TCGCGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA
GCAGATTGTA
CTGAGAGTGC
1B0
ACCATATGCG
GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC
ATCAGATTGG
240
CTATTGGCCA TTCCATACCT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA
TTC
300
TCCAACATTA CCCCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT
AATCAATTAC
360
-51 CZ 290315 B6
CATATATGGA
GTTCCCCGTT
CGw * ΓΛΛ . UO
420
CATAG7AAC3
TGACCGCCCA iccattgacg
430
CCAATAGGGA
GTGGAGTA*
TACG<* · AAA C
540
AACTGTATCA
TATGCCAAGT
600
660
ACT
TAC
CCAGTACATC
| TTGGCAGTAC | ATCTACGTAT | TAGTCATCGC ' | TATTACCATG GTGATGCGGT ' | TTŤGGCAGT A | 720 | |
| CATCAATCGG | CCTGGATAGC | GCTTTGACTC | ACGGGGATTT < | ccaagtctcc . | ACCCCATTGA | 78C |
| CG7CAATGGG | AGTTTGTTTT | GCCACCAAAA | TCAACGGGAC ' | TTTCCAAAAT | GTCSTAACAA | 840 |
| CTCCGCCCCA | TTGACSCAAA | TGGGCGGTAG | GCGTGTACGG | TCCGACGTCT | ATATAAGCAC | 900 |
| AGCTCGTTTA | GTGAACCGTC | AGATCGCCTG | GAGACGCCAT | CCACGCTGTT | TTGACCTCCA | 960 |
| TAGAAGACAC | CGGGACCGAT | CCAGCCTCCG | CGGCCGGGAA | CGGTCCATTG | GAACGCGGAT | 102C |
| TCCCCGTCCC | AAGACTCACC | TAAGTACCGC | CTATAGACTC | TATAGGCCCA | CCCCCTTGGC | 1080 |
| TTCTTATGCA | TGCTATACTG | TTTTTGGCTT | GGGGTCTATA | CACCCCCGCT | TCCTCATGTT | 1140 |
| ATAGGTGATG | GTATACCTTA | GCCTATAGGT | CTGGGTTATT | GACCATTATT | GACCACTCCC | 1200 |
| CTATTGGTGA | CGATACTTTC | CATTACTAAT | CCATAACATG | GCTCTTTGCC | ACAACTCTCT | 1260 |
| TTATTCGCTA | TATGCCAATA | CACTGTCCTT | CAGAGACTGA | CACGGACTCT | GTATTTCTAC | 1320 |
| AGGATGGGGT | CTCATTTATT | ATTTACAAAT | TCACATATAC | AACACCACCG | TCCCCAGTGC | 13B0 |
| CCGCAGTTTT | TATTAAACAT | AACGTGGGAT | CTCCACGCGA | ATCTCGGCTA | CGTGTTCCGG | 1440 |
| ACATGGGCTC | TTCTCCGGTA | GCGGCGGAGC | TTCTACATCC | GAGCCCTGCT | CCCATGCCTC | 1500 |
| CAGCGACTCA | TGGTCGCTCG | GCACCTCCTT | GCTCCTAACA | GTCGAGGCCA | GACTTAGGCA | 1560 |
| CAGCACCATG | CCCACCACCA | CCAGTGTGCC | GCACAAGGCC | ctggcggtag | GGTATGTGTC | 1620 |
| TGAAAATGAG | CTCGGGGAGC | GGGCTTCCAC | CGCTGACCCA | TTTGGAAGAC | TTAAGGCAGC | 1680 |
| GGCAGAAGAA | GATCCAGGCA | CCTCAGTTGT | TGTGTTCTGA | TAAGAGTCAG | AGGTAACTCC | 1740 |
| CGTTGCGGTG | CTGTTAACGG | TGGAGGGCAG | TGTAGTCTGA | GCAGTACTCG | TTGCTGCCGC | 1800 |
| GCGCGCCACC | ACACATAATA | GCTCACAGAC | TAACAGACTG | TTCCTTTCCA | TGGCTCCTTT | IBňO |
| CTGCAGTCAC | CGTCCTTAGA | TCTGCTGŤGC | CTTCTAGTTG | CCAGCCATCT | CTTGTTTGCC | 1920 |
| CCTCCCCCGT | GCCTTCCTT3 | ACCCTCGAAG | GTGCCACTCC | CACTGTCCTT | TCCTAATAAA | 1980 |
| ATGAGGAAAT | TGCATCQCAT | TGTCTGAGTA | CGTGTCATTC | TATTCTGGGG | GGTGGGCTGC | 2040 |
| GGCAGCACAG | CAACCGGGAG | GATTGGGAAG | ACAATAGCAG | GCATCCTGGG | GATGCGGTGG | 2100 |
| GCTCTATGGG | TAČCCAGGTG | CTCAAGAATT | gacccggttc | CTCCTGGGCC | AGAAAGAAGC | 21b0 |
| AGGCACATCC | CCTTCTCTGT | CACACACCCT | GTCCACGCCC | CTGGTTCTTA | GTTCCAGCCC | 2220 |
| CACTCATAGG | ACACTCATAG | CTCACGAGGG | CTCCCCCTTC | AATCCCACCC | CCTAAAGTAC | 2280 |
| TTGGAGCGGT | CTCTCCCTCC | CTCATCAGCC | CACCAAACCA | AACCTAGCCT | CCAACACTCG | 2340 |
| CAAGAAATTA | AAGCAAGATA | CGCTATTAAG | TGCAGAGGGA | gagaaaatcc | CTCCAACATC | 2400 |
| TGAGGAAGTA | ATGAGAGAAA | TCATAGAATT | TcrrccGCTT | CCTCGCTCAC | TGACTCGCTG | 2460 |
-52CZ 290315 B6
TTCGGCTCCG
GCCAGCGGTA
TCACCTCACT
AATACGGTTA
2520
TCCACAGAA7
CAGGGGA7AA
CGCAGGAAAG
AACATGTGAG
CAAAAGGCCA
GCAAAAGG
2580
AGGAACCG7A
AAAAGGCCGC
G7TGCTGGCG
T7T7TCCA7A
2540
CAGGCGT7
AAC7CAGAG
7GGCGAAACC
CGACACGAC'
ATAAAGATAC
2700
CGCTCTCCTG
TTCCGACCC7 ‘AC
2750 tttctcaatg
CCCTTCGGCA
GGATACCTGT
| AGGTA7CTCA | GGTCGITCGC TCCAAGCTCC ( | 2930 | ||||
| GT7CAGCCCG | ACCGCTGCGC | C77ATCCGG7 AAC7ATCGTC TTGAG7CCAA i | ZCCGSTAAGA | 2940 | ||
| CACGAC7TA7 | CGCCAC7GGC | AGCAGCCAC7 ' | GGTAACAGGA ' | T7AGCAGAGC < | GACGTATGTA | 3000 |
| GGCGGTGCTA | CAGAG7TCTT | GAAGTGGTGG < | CC7AACTACG i | GCTACAC7AG | AAGGACAG7A | 3060 |
| 77TGGTA7C7 | GCCCTC7GC7 | GAAGCCAGT7 , | ACCTTCGGAA | AAAGAGTTGG ' | TAGCTCTTGA | 3120 |
| 7CCGGCAAAC | AAACCACCGC | TGGTAGCGGT | GG7T7TT7TG | T77GCAAGCA | GCAGA77ACG | 3180 |
| CGCAGAAAAA | AACGA7C7CA | AGAAGA7CC7 | TTGATCT7T7 | C7ACGGGG7C | 7GACGC7CAG | 3240 |
| TCGAACGAAA | ACTCACGTTA | AGGGATTTTG | GTCATGAGAT | TA7CAAAAAG | GATCT7CACC | 3300 |
| TAGATCC777 | 7AAA77AAAA | ATGAAGTTTT AAATCAATCT | AAAG7A7ATA | 7GAG7AAAC7 | 336Q | |
| TGG7CTGACA | GTTACCAATG | CT7AA7CAGT | GAGGCACC7A | TCTCAGCGAT | C7G7C7ATT7 | 3420 |
| CGTTCA7CCA | 7AGT7GCC7G | ACTCCCCG7C | GTGTAGATAA | C7ACGA7ACG | GGAGGGC77A | 3480 |
| CCATC7CGCC | CCAGTGCTGC | AA7GA7ACCG | CGAGACCCAC | CCTCACCGGC | TCCAGATTTA | 3540 |
| TCAGCAATAA | ACCAGCCAGC | CGGAACGGCC | GAGCGCACAA | GTGGTCCTCC | AACTTTA7CC | 360C |
| GCCTCCATCC | AGTCTATTAA | 77GTTGCCGG | GAACCTAGAG | TAAGTAGTTC | GCCAGT7AA7 | 3660 |
| AGTttGCCCA | ACGTTGTTGC | CA7TGC7ACA | GGCATCGTCG | TG7CACGCTC | U 5 ieU í i l · | 372^ |
| A7GGC77CA7 | 7CAGCTCCGG | TTCCCAACGA | 7CAAGGCCAC | TTACATGA7C | CCCCA7G7TG | 3780 |
| TGCAAAAAAC | CGGTTAGCTC | C77CGG7CCT | CCGATCGTTG | TCAGAAGTAA | GTlT GG^-> CGCn | 3840 |
| GTG77A7CAC | TCATCGT7A7 | CGCAGCAC7G | CATAATTCTC | T7AC7GTCAT | GCCATCCGTA | 3900 |
| AGATGCTTTT | C7G7GAC7GG | TGAG7AC7CA | ACCAAG7CA7 | 7C7GAGAATA | G7G7A7CCGG | 3960 |
| CGACCGAGTT | CCTCTTCCCC | GCCGTCAATA | CCGGATAA7A | CCGCGCCACA | TAGCACAACT | 4020 |
| 77AAAAGTGC | TCATCAT7CG | AAAACCTTCT | TCGGCGCGAA | AACTCTCAAG | GATCTTACCG | 4080 |
| C7G77GAGA7 CCAGTTCGAT | G7AACCCAC7 | CGTCCACCČA | ACTGATCTTC | AGCA7CTT7T | 4140 | |
| AC7T7CACCA | GCGTT7CTGG | GTGAGCAAAA | ACAGGAAGGC | AAAATGCCGC | AAAAAAGGGA | 4200 |
| ATAAGGGCGA | CACGGAAATG | T7CAA7AC7C | A7AC7C77CC | TTTTTCAATA | TTATTGAAGC | 4260 |
| A7T7A7CAGG | GTTAT7GTC7 CATÚAGCGGA | TACATATTTG | AA7G7A777A | GAAAAATAAA | 4320 | |
| CAAATAGGGG | TTCCGCCCAC ATTTCCCCGA | AAAGTGCCAC | CTGACGTCTA | AGAAACCA7T | 4380 | |
| ATTATCATGA | CATTAACCTA TAAAAATAGG | CGTATCACGA | . GGCCC777CG | i TC | 4432 |
-53CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 11:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| 5 | (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 2196 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| 10 | (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE | |
| 15 | (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 11: |
AiTCGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CCATATCATA ATATGTACAT TTA TAIiGou TCATGTCCAA CATTACCGCC ATCTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TACCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTCGCTCACC GCCCAACCAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACCCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT
CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT ATTGACGTCA ATGGGACTTT CTTTTGGCAC AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC AGCAGACCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC CTCCATAGAA GACÁCCGGGA CCGATCCACC CGGATTCCCC GTCCCAACÁG TGACGTAAGT TTGGGTTCTT ATGCATGCTA TACTGTTTTT ATGTTATACG TCATGGTATA GCTTAGCCTA CTCCCCTATT CGTGACGATA CTTTCCATTA TCTCTTTATT GGCTATÁTGC CAATACACTG TTTACAGGAT GGGGTCTCAŤ TTATTATTTA AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC CCCTCCAGCG ACTCATGGTC CCTCGGCAGC
ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CACTCACCGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTCTTTTGAC CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG ACCCCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC tagctgtggg TTATTGACCA TTATTGACCA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTCCCACAAC TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACCTGT GGAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT TCCTTGCTCC TAACACTGGA GGCCAGACTT
120
180
240
300
360
420
480
540
6GC
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
-54CZ 290315 B6
CACCACCAGT
GTGCCGCACA
1380
ATGAGCTCGG
TGCACCCCTG acgcatttgg
1440
GCACCCGCAG
AAGAAGATG;
AGGCACCTGA
TCTGATAAGA
CCACCAGACA 'AATAGCTGA
GCCAGTGTAG
TC7GAGCAGT
1560
CAGAC7AACA
GACTGTTCC
1600
1680
ACTCCCAC7G
1740
ATAAAATGAG
GAAATTGCAT
CGCATTGTCT
TGGGGGGTGG
1800
GGTCCGGCAG
CACAGCAAGG
GGAAGACAAT
AGCAGGCATG
CTCGGGATCC
1860
GGTGGGCTCT
AGGTGCTGAA
GAATTGACCC ggg;
ACAAA
1920
GAAGCAGGCA
CATCCCCTTC
TCTGTGACAC
ACCCTGTCCA
CGCCCCTGGT
TCTTAGTTCC
1930
ATAGGACACT
CATAGCTCAG
GAGGGCTCCG
CCTTCAATCC
2040
AGTACTTGGA
GCGGTCTCTC
CCTCCCTCAT
CAGCCCACGA
AACCAAACCT
2100
AGTGGGAAGA
AATTAAAGCA
AGATAGGCTA
TTAAGTGCAG
AGGGAGAGAA
AATGCCTC CA
2160
ACATGTGAGG
AAGTAATGAG
AGAAATCATA
2196 (2) INFORMACE O SEKV. ID. C.: 12:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 71 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 12: |
GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA TAATCACTCA CTGAGTGACA TCAAAATCAT G (2) INFORMACE O SEKV. ID. C.: 13:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA:
(B) TYP:
(C) POČET ŘETĚZCŮ:
(D) TOPOLOGIE:
117 párů bází nukleová kyselina dva oba
-55CZ 290315 B6 (ii) TYP MOLEKULY:
(iii) HYPOTETICKÁ:
(iv) POZITIVNÍ:
(xi) POPIS SEKVENCE:
cDNA
NE
NE
SEKV. ID. Č. 13:
ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT40
TGAATGGATG TCAATCCGAC CTTACTTTTC TTAAAAGTGC80
CAGCACAAAA TGCTATAAGC ACAACTTTCC CTTATAC117
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 14: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 136 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 14: |
GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC40
AAAAACATAA TGGATCCAAA CACTGTGTCA AGCTTTCAGG80
TAGATTGCTT TCTTTGGCAT GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA120
CCAAGAACTA CGTGAT136
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 15: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 152 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 15: |
-56CZ 290315 B6
TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG AGCAAAAGCA 40
GGGGAAAATA AAAACAACCA AAATGAAGGC AAACCTACTG 80
GTCCTGTTAA GTGCACTTGC AGCTGCAGAT GCAGACACAA 120
TATGTATAGG CTACCATGCG AACAATTCAA CC 152 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 16:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 162 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 16: |
TTTTCTGCAG TCACCGTCCT TAGATCCCGA ATTCCAGCAA40
AAGCAGGTCA ATTATATTCA ATATGGAAAG AATAAAAGAA80
CTAAGAAATC TAATGTCGCA GTCTGCCACC CCGGAGATAC120
TCACAAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT 162 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 17:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 122 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 17: |
TCGAAACGTA CGTACTCTCT ATCATCCCGT CAGGCCCCCT80
CAAAGCCGAG ATCGCACAGA GACTTGAAGA GTTGACGGAA G A122 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 18:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4864 párů bází
-57CZ 290315 B6
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 18: |
CGGTGATGAC
GTAACCGGAT
TCGGGGCTCG
ACGATATGCG
CTATTCGCCA
TTGCATACGT
CTTCATACCC
CCCGCCTCGC
TCACCGCCCA
CCAATAGGGA
TGCCCACTTG
CCAGTACATC
TGACGCTAAA
TGGCCCCCCT
TTCGCAGTAC
ATCTACGTAT
CATCAATGCG
CGTGCATACC
CGTCAATGGG
AGTTTGTTTT
CTCCCCCCCA
TTGACGCAAA
CCGCACAGA7
TGTATCCA7A
GACATTGATT
CA7AŤATCOA
ACGACCCCCG
CT7TCCATTG
AAGTGTATCA
GGCATTATGC
TAGTCATCCC
GGTTTCACTC
GGCACCAAAA
TCCGCGC7AC
GCCGGGACCA
| GACAACCCCG | TCAGGGCwGG TCAG\-*/«vj i v | 120 |
| CGGCATCAGA | GCAGATTGTA .CVGA^ak* lG*- | 180 |
| GCCTAACGAC | AAAATACCSC ATCAGAT7GG | 240 |
| TCA7AATATG | TACATT7ATA TTGGCTCATC | 300 |
| ATTGAC7AGT | TATTAATAG7 AA7CAAT7AC | 360 |
| GTTCCGCGTT | ACATAAC77A CCGTAAATCO | 420 |
| CCCATTCACG | TCAATAATGA CCTATGT7CC | 480 |
| ACGTCAA7GG | GTGGACTATT TACGG7AAAC | 540 |
| TATCCCAAGT | ACCCCCCCTA TTGACG7CAA | 600 |
| CCAGTACATC | ACCTTATGCG ACTTTCCTAC | 660 |
| TATTACCATG | CTGATGCCGT TTTGOCAGTA | 720 |
| ACGGCGATTT | CCAAG7CTCC ACCCCATTCA | 780 |
| TCAACGGGAC | TTTCCAAAAT GTCG7AACAA | 840 |
| i CCGTGTACCÚ | TGGGAGGTCT ATATAACCAG | 900 |
TTGACCTCCA
CCACCCTC7T
GACACCCCAT
AGCTCGTTTA
GTGAACCGTC AGATCGCCTG
TAGAAGACAC
CGGGACCGAT
CCAGCCTCCG
CGGCCGGGAA
CCGTGCATTG
GAACGCGGAT
1020
TCCCCGTGCC
AAGAGTGACC
TAAGTACCGC
CTATAGAGTC
TATAGGCCCA
CCCCC77GOO
TTCTTATGCA
TGCTATACTG
TTT7TGGC7T
GGGGTCTATA
CACCCCCGCT
TCCTCATCTT
1140
-58CZ 290315 B6
A*TACGT GA'
123C •A“GGTGA
CATTACTAA7 CCATAACATG GCTCTT acaa:
UťO
GG^AGAAGAA ccrcccecs·
TATCCCAATA
CTCATTTATr
ΤΑΤΤ AAACA‘
ATGAGGAAAT
GGCAGCACAG
AGGCACATC:
<**
CACGGACT'
Zl.
ΆΤ m:
Α » «· acaaa*
AACACCAC .wv :cat
GCAC “AAGAGTCA μ» u:·;
16oC
CTGTTAACGG
AGACATAATA
TGGAGGGCAG
TCTAGTCTGA
1S00
GCTGACAGAC
TAACAGACTG
TG:
CCTCCTTACA TCTGCTGTCC
CTTCTAGTTG
CCACCCA' «ν'·
1920
GCCTTCCTTG
ACOCTGGAAG
GTGCCACTCC
CACTGTC:
1930
CACTCATACG
GAACAAATTA
TGCATCGCAT
TGTCTGAGTA
GGTGTCATTC tattctggg;
CAAGGGGGAG
GATTGGGAAG
TACCCAGGTG
CCTTCTCTGT
ACACTCATAG
CTCTCCCTCC
CTGAAGAATT
GACACACCCT
CTCAGGAGGG
CTCATCAGC!
AAGCAAGATA
CCCTATTAAG
TGACGAACTA
ATGAGAGAAA
TCATACAATT
CGCTCGGTCG
TTCCGCTGCG
GCGAGCGGTA
TCCACAGAAT
CAGGGGATAA
CGCAGGAAAG
AGGAACCGTA
AAAAGCCCGC
GTTGCTGCCG
2040
ACAATAGCAG
GACCCGGTTC
GTCCAGGCCC
CTCCGCCTTC
CACCAAACCA
TGCAGAGGGA
TCTTcescTT
TCACCTCACT
AACATGTGAC
TTTTTCCATA
| gcatgctggg | GATGCGGTGG | 2100 |
| CTCCTGCGCC | agaaagaacc | 2160 |
| CTGGTTCTTA | GTTCCAGCCC | 2220 |
| AATCCCACCC | GCTAAAGTAC | 2280 |
| AACCTACCCT | CCAAGAGTGG | 2340 |
| GAGAAAATCC | ctccaacatg | 2400 |
| CCTCGCTCAC | TGACTCGCTG | 2460 |
| CAAAGGCGGT | aatacggtta | 2520 |
| CAAAAGCCCA | GCAAAAGGCC | 2580 |
| . GGCTCCGCCC | CCCTGACGAG | 2640 |
2700
CGACAGGACT ATAAAGATAC
CATCACAAAA
ATCGACGCTC
AAGTCAGAGG
TGGCGAAACC
CAGGCGTTTC
CCCCTGGAAG CTCCCTCGTC
CGCTCTCCTG
CGATACCTGT
CCCCCTTTCT CCCTTCGGGA
AGGTATCTCA
GTTCCGTGTA
GGTCGTTCGC
GTTCAGCCCG
ACCCCTGCCC
CTTATCCGGT
CACGACTTAT
CGCCACTGCC
AGCAGCCACT
GGCGCTGCTA
CAGACTTCTT
GAACTGGTCC tttggtatct·
GCGCTCTGCT
GAACCCAGTT tccgccaaac
AAACCACCGC
TGGTAGCGGT
CGCAGAAAAA
AAGGATCTCA
AGAAGATCCT
TGGAACGAAA
ACTCACGTTA ACGGATTTTG
2700
TTCCGACCCT OCCGCTTACC
TCCAAGCTGG
AACTATCGTC
GGTAACAGGA
CCTAACTACG accttcggaa
CGWTTTTG
TTGATCTTTT
GTCATGAGAT
AGCGTGGCGC
| TTTCTCAATG CTCACGCTGT | 2820 |
| GCTCTGTCCA CGAACCCCCC | 2880 |
| TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA | 2940 |
| TTAGCAGAGC GAGGTA7GTA | 3000 |
| GCTACACTAG AAGGACAGTA | 3060 |
| AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA | 3120 |
| TTTGCAAGCA GCAGATTACG | 3180 3240 |
| CTACGGGGTC TGACGCTCAG | |
| TATCAAAAAG CATCTTCACC | 3300 |
-59CZ 290315 B6
1AUA.
ATGAAGTTTT * WW »ACA
CT7AATGAGT
Cw CA' :agtxcctg
TGAG;
Aw<
WW
GCCACGw
ATGAGAGC
7G77w.AGG7
G7GA'
WA
AC
CC:
TaCAACGaAT
TAACCAATTC
TGA7TACAAA
TTATTCATA'
CAGGATTATC
AATACCATA'
TTTTGAAAAA
CAAAACTCAC
CGAGGCACTT
CCATAGGATG
GGAAGA7CCT
AC'
JAA
CATCAATACA
ACCTATTAAT
GAGAAATCAC
CATGACTGAC
GACTGAAT:
GwTCAGAATG
TTCCAGACrr
GTTCAACAGG
AAACCGTTAT
TCATTCGTCA
GGACAATTAC
AAACAGGAAT
ATAT7TTCAC
CTGAATCAGG
CCAGTGGTGA
CTAACCATGC
GGCATAAATT
CCGTCAGCCA
CATGTTTCAG
ATTGTCGCAC
CTGATTGCCC
TCCATGTTGG
AATTTAATCG
ACACCCCTTC
TTATCTTGTG
CATTATTGAA
TAGAAAAATA tga·:
wA
GCATCAAATO caaaaataag
ACTCAGCAAA
AAACCwwAa .
ATGCA“
CCAGCCATTA CGCTCGTCAT
TTGCGCCTGA GCGAGACGAA
CGAATGCAAC
TATTACTGTT
CCGCGCAGGA
CAAAATCACT
ATACGCGAT:
ACACTGCCAG
GGTGTTAAAA
CGCATCAACA atattcttc
AATACCTGGA
ATGCTGTTTT
CCCGGGGA'
ATCATCAGGA
GTTTAGTCTG
AAACAACTGT
GACATTATCG
CAATGTAACA
GCATTTATCA
AACAAATAGC
GTACGGATAA
ACCATCTCAT
GGCGCATCGG
CGAGCCCATT
AATGCTTGAT
CTGTAACATC
CCTTCCCATA
TA7ACCCATA
CGGCCTCGAG CAAGACGTTT CCCGTTGAA'
TATGTAAGCA
TCAGAGATTT
CGGTTATTGT
CGTTCCGCGC
GACAGTTTTA
TCAGACACAA
CTCATGAGCG
ACATTTCCCC
CAACCGATAG
TAAATCAGCA
ATGGCTCATA
TTGTTCATGA
CGTGCCTTTC
GATACATATT
GAAAAGTGCC
TGATA7ATTT
CCCCCCCCGC
ACCTGACGTC
TAAGAAACCA TTATTATCAT
GACATTAACC
TATAAAAATA
GGCGTATCAC
GAGGcccrrr
CGTC
360
34Z:
o3640 3600 3660 3?:: 3“30 3340 39C0 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500
4560
4620
4660
4740
4800 4860 4864
-60CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. C.: 19:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 15 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 19: |
AGCAGAAGCA GAGCA (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 20:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 119 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 20: |
TCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT40
GAGTGACATC AAAATCATGG CGTCCCAAGG CACCAAACGG80
TCTTATGAAC AGATGGAAAC TGATGGGGAA CGCCAGATT119 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 21:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 67 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO -61- |
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 21:
GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG40
C AGATATTTT TTCCTTAATT GTCGTAC67 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 22:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 15 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 22: |
| AGCAGAAGCA CGCAC | |
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 23: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 15 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 23: |
AGCAGAAGCA CAGCA15 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 24:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 33 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 24: |
CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA (2) INFORMACE O SEKV. ID. C.: 25:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 36 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 25: |
GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT36 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 26:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 102 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 26: |
ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT TCTAATATCC40
ACAAAATGAA GGCAATAATT GTACTACTCA TGGTAGTAAC80
ATCCAACGCA GATCGAATCT GC102 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 27:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
-63CZ 290315 B6
| (A) DÉLKA: 42 párů bází | |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 27: |
GGCACAGCAG ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC 42 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 28:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 23 párů bází nukleová kyselina jeden oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 28: |
| CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG | |
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 29: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 18 párů bází nukleová kyselina jeden lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | ANO |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 29: |
GGAGTGGCAC CTTCCAGG
-64CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 30:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 12 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 30: |
| AGCAAAAGCA GG | 12 |
(2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 31:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 14 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č.31: |
AGCAGAAGCG GAGC 14 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 32:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 35 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 32: |
-65CZ 290315 B6
CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 33:
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 33 párů bází nukleová kyselina jeden i dva lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 33: |
GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 34:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| 25 | (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 37 párů bází nukleová kyselina jeden i dva lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA | |
| 30 | (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE | |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 34: |
CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 35:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden i dva (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
| CZ 290315 B6 | |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č.35: |
GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG38 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 36:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 32 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 36: |
CCACATTCAG ATGCATATTC TACACTGCAA AG32 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 37:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 36 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 37: |
GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG36 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 38:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 36 párů bází |
| (B) TYP: | nukleová kyselina |
(C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden i dva (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE:
SEKV. ID. Č. 38:
CCACATTTAT AGACAGATGG AGCAAGAAAC ATTGTC (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 39:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 33 párů bází nukleová kyselina jeden i dva lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 39: |
GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 40:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 36 párů bází nukleová kyselina jeden i dva lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 40: |
CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC
-68CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 41:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 39 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 41: |
GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 42:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 39 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 42: |
CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC 39 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 43:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 42 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
-69CZ 290315 B6
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 43: |
| GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG | |
| INFORMACE 0 SEKV. ID. Č.: | 44: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: | 38 párů bází |
| (B) TYP: | nukleová kyselina |
| (C) POČET ŘETĚZCŮ: | jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | lineární |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 44: |
| CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCITCAC AAGAGCTG | |
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 45: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: | 3553 párů bází |
| (B) TYP: | nukleová kyselina |
| (C) POČET ŘETĚZCŮ: | dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 45: |
-70CZ 290315 B6 oO
120
ΆΟΤ
CGCCTGGCTG
CATTGAC
AA7AATGAC
240
TAGTAACGGC
AA7AGGGACT
TTCCATTCAC
GTCAATGG“
CGACTATT·A
30C
CČGTAAACTC
AGTACATCAA
GTGTATCATA
TG\.GAAG . Ak.
36Í
CACGTCAATG
ACGGTAAA’
GCOCGCCTGG
GGGAGTACAT
GTCATCGCTA
TGGCAGTACA
TCGATAGCGG
TTTGAC7CAC
TCAATGGGAC
CACCAAAATG
GACGCAAATG
GGCGG7AGGC
A7AAGCAGAG
CTCG77TACT
GAACCGTGAG
ATCGCCTGGA
GAGCTCCATA
GAAGACACCG
GGACCGAÍCC
AGCCTCCCCG
ACGCGGATTC
CCCGTGCCAA
GAGTGACGTA
AGTACCCCCT
CTTATGCATG
C7ATACTCTT
TTTGGCTTGG
C7CA7GTTAT
ACGTGATCGT
ATAGCTTAC;
CTATAGGTCT
CCACTCCCCT
ATACTTTCCA
TTACTAATCC
AACTCTCTIT
ATTGGCTATA tgccaataca
CTGTCCTTCA
ATTTTTACAG
GATGGGGTCT
CATTTATTAT
TTACAAATTC
CCCAGTGCCC
GCÁCTTTTTA
TTAAACATCC
TAACGTGGCA
AACGGGAC'
ATAGAG7C7A
GG7CTA7ACA
GGGTTATTGA
ATAACATGS:
GAGACTGACA
ACATATACAA 'β * I Λ »
CAC3CCATC
| 3A · * í | 480 |
| AAGTG7CCAC | $40 |
| TCCAAAA7G7 | 600 |
| GGAGGTCTAT | 660 |
| ACuL ·«♦»'♦ · | 720 |
| G7GCA7TCGA | 780 |
| TAGGCCCACC | 840 |
| cccccgcttc | 900 |
| CCATTATTGA | 960 |
| TC777GCCAC | 1020 |
| (.LAjtAU * | 1080 |
| CACCACCG7C | 1140 |
| : AA7CTCGGGŤ | 1200 |
1260
CGAGTCC7GC
ACGTGTTCCG
GACATGGGCT
CTTCTCCGCT
AGCGGCGGAG
CTTCTACA7C
TCCCATGCCT
CCAGCCACTC
ATCGTCGCTC
GGCAGCTCCT
TGCTCCTAAC
AGTGGAGGCC
1320
AGACTTAGGC
ACAQCACGAT
GCCCACCACC
ACCAGTGTGC
CGCACAAGGC cgtggcggta
1380
GCCTATGTCT
CTGAAAATGA
GCTCGGGGAG
CCGGCTTGCA
CCCCTGACGC
ATTTGGAAGA
1440
CTTAAGGCAG
CGGCAGAAGA
AGATGCAGGC
ACCTCAG7TG
TTGTGTTCTG
ATAAGAGTCA
1S00
GAGGTAACTC
CCGTTGCGGT
GCTGTTAACG
CTGGAGGGCA
GTGTAGTCTG
AGCAGTACTC
1560
GTTCCTCCCG
CGCGCGCCAC
CAGACATAAT
AGCTGACAGA
CTAACAGACT
GTTCCTTTCC
1620
-71CZ 290315 B6 * AAA GATAC!
·Λ
TCTCCAGTCA
CCCTCCCCCC
CGGCAGCACA
GCCTCTATGG
ACCCwTTTC·
CCGTCCTTTAG
GATACCTGTC
GCTATCTCAG
GAACCCCCCG
ACGACTTATC
TGAAGGACAG
GGTAGCTCTT
CTCAAAAATA
ATCAAAATCA
AAATACGCGA
GAACACTGCC aaaatccttg
ATCTGTAACA
CGCCTTCCCA
TTTATACCCA
TTCCCGTTGA
TATTGTTCAT
AACGTGGCTT
ATCXCTCTC CCTTCTAGTT GCCAGÍCAT!
GACCCTGGAA ggtgccact:
CCA!
1630
1740
T 7 mCATCGCA
GCAAGGGGGA
AAAGGCCGCG TCoACSCTCA
CCCTGCAAGC
GCCGTGCTAC ttgtctgagt ΑοατσΧλττ
GCCACTGGCA
AGAGTTCTTG
1800
GGATTGGGAA
AG7CAGAGG?
CCTTCGGGAA
GACAATAGCA
CCCACGTGCT
GC
CCAAGC. GGG
ACTATCGT
GGCA'
GAACAA..CA
GCAGCCAC7G
AAGTGGTGCC
GTAACAGGAT
CTAACTACGG
TAGCAGAGCG
CTACACTAGC
TATTTGGTAT CTGCGCTCTG
CTGAAGCCAG
TTACCTTCGG
AAAAACAGTT
GATCCGGCAA
CCCGCAGAAA
CTCTGCCAGT tgaaactgca
TGTAATGAAG
TCTGCGATTC
ACAAACCACC
AAAAGGATC?
GTTACAACCA
ATTTATTCAT
GAGAAAACTC
CGACTCGTCC
ACGTTATCAA GTGAGAAATC
TTATCCATTT CTTTCCAGAC
CTCGCATCAA
TCGCTCTTAA
AGCQCAŤCAA
ATGGTCGGAA
TCATTCGCAA
GCTCGTAGCG
AT7AACCAAT
ATCAGGATTA
ACCCAGGCAG
AACATCAATA
TCTGATTAGA
TCAATACCA'
TTCCATAGGA
CAACCTATTA
TGTTTGCAAG
AAAACTCATC
ATTTTTGAAA
ACCATGAGTG ACGACTGAAT
CCCGTGAGAA
TTGTTCAACA CGCCAGCCAT TACCCTCGTC
CCAAACCGTT
AAGGACAATT
CAATATTTTC
TCGCAGTGGT
CAGGCATAAA
CGCTACCTTT
TACAATCGAT AGATTGTCGC
ATTCATTCGT
ACAAACAGGA
ACCTGAATCA
GATTCCGCCT
ATCGAATGCA
GGAŤATTCTT
CAGTAACCAT GCATCATCAG
TTCCCTCAGC
GCCATGTTTC
ACCTGATTGC
TATAAATCAG CATCCATGTT GGAATTTAAT
GAGCGAGACG
ACCGGCGCAG
CTAATACCTG
CAOTTTAGTC
AGAAACAACT
CCGACATTAT
CGCGGCCTCG
ATATOGCTCA TAACACCCCT TGTATTACTC TTTATGTAAG
GATGATATAT TTTTATCTTG TGCAATGTAA CATCAGAGAT
TCC
TGACCATCTC
CTGGCGCATC
CGCGAGCCCA
ACCAAGACGT
CAGACAGTTT
TTTGAGACAC
1360 .Uu
2220
2340
2400
2460
2520
2530
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3553
-72CZ 290315 B6
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | : 46: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 72 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 46: |
TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT40
GCTTTGAGCT ACATTrTATG TCTGGTTTTC GC72 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 47:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 111 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 47: |
TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA40
TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC AACATTAGGT GCAACATTTG80
CATTTGAAGA TCTATGTGGG ATCGCTGTG C111 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 48:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 63 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden i dva (D) TOPOLOGIE: oba (ii) TYP MOLEKULY: cDNA
-73CZ 290315 B6
TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTA GTCCTGTTAT 60
GTGCATTTAC AGCTACATAT GCA 63 (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iv) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE:
SEKV. ID. Č. 48:
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 49: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 102 párů bází nukleová kyselina dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 49: |
CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA40
TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG CAGTGTAGAA TATGCATCTG80
AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT102 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 50:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 108 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 50: |
CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ÁTTGTACTAC40
TCATGGTAGT AACATCCAAC GCAGATCGAA TCTGCACTGG80
GATAACATCT TCAAACTCAC CTCATGTG108
-74CZ 290315 B6
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 51: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 102 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č.51: |
TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTT ATTGTTTATA40
TGGTCTCCAG AGACAATGTT TCTTGCTCCA TCTGTCTATA80
AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT102 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 52:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 84 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 52: |
GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCAAGGC ACCAAACGGT40
CTTATGAACA GATGGAAACT GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT 84 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 53:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 108 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
-75CZ 290315 B6
GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA 40
GTAATGAAGG ATCTTATTTC TTCGGAGACA ATGCAGAAGA 80
GTACGACAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT 108 (iv) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 53:
(2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 54:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| 10 | (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 132 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| 15 | (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE | |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE | |
| 20 | (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 54: |
CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG40
AAACGTATGT TCTCTCTATC GTTCCATCAG GCCCCCTCAA80
AGCCGAAATC GCGCAGAGAC TTGAAGATGT CTTTGCTGGG120
AAAAACACAG AT132 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 55:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 129 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 55: |
GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGATGATC40
TTC TTG A AAA TTTGCAGACC TATCAGAAAC GAATGGGGGT80
GCAGATGCAA CGGTTCAAGT GAAGATCTAT GTGGGATCTG120
CTGTGCCTT129
-76CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 56:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 81 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 56: |
CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA40
ACACTGGGAC AATTGACAAA ACACCGGAAG AAATAACTTC T81 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 57:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 96 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 57: |
GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT40
TTGGGAGGGA CACAGCAGAG GATTATGATG ACCTCGATTA80
TTAAGGATCT GCTGTG (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 58:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden i dva (D) TOPOLOGIE: oba (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: NE
-77CZ 290315 B6
CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT 40
ACCTGCTTTC ATTGACAGAA GATGGAGAAG GCAAAGCAGA 80
ACTAGCAGAA AAATTA 96 (iv) POZITIVNÍ: NE (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID. Č. 58:
(2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 59:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 123 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 59: |
AGATCTCTTG GGGCAAGTCA AGAGAATGGG GAAGGAATTG40
CAAAGGATGT GATGGAAGTG CTAAAGCAGA GCTCTATGGG80
AAATTCAGCT CTTGTGAAGA AATACCTATA AGGATCTGCT GTG123
| INFORMACE O SEKV. ID. Č.: | 60: |
| (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: | |
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 33 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 60: |
GGTACAAATA TTGGCTATG GCC ATTGCAT ACG3 3 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 61:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
-78CZ 290315 B6
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 36 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 61: |
CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC36 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 62:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 38 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 62: |
GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC38 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 63:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: (D) TOPOLOGIE: | 37 párů bází nukleová kyselina jeden i dva oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 63: |
CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC37
-79CZ 290315 B6 (2) INFORMACE O SEKV. ID. Č.: 64:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
| (A) DÉLKA: | 39 párů bází |
| (B) TYP: (C) POČET ŘETĚZCŮ: | nukleová kyselina jeden i dva |
| (D) TOPOLOGIE: | oba |
| (ii) TYP MOLEKULY: | cDNA |
| (iii) HYPOTETICKÁ: | NE |
| (iv) POZITIVNÍ: | NE |
| (xi) POPIS SEKVENCE: | SEKV. ID. Č. 64: |
GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG 39
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNA konstrukt, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující gen lidského chřipkového viru pro nukleoprotein, hemaglutinin, polymerázu, matrix nebo nestruktumí genový produkt chřipkového viru, přičemž konstrukt DNA je schopný vyvolat expresi antigenního produktu genu chřipkového viru, indukujícího po aplikaci tohoto DNA konstruktu a po výsledném příjmu tohoto DNA konstruktu buňkami exprimujícími kódovaný chřipkový gen specifickou imunitní odpověď, uvedený DNA konstrukt je tvořena) oblastí promotoru CMVIntA a oblastí BGH pro ukončení transkripce ze SEKV. ID: 11,b) prokaiyotickým počátkem replikace,c) genem pro odolnost proti antibiotikům ad) otevřeným čtecím rámcem, uloženým mezi promotor a signál pro ukončení transkripce ze složky a), řídící expresi genu chřipkového viru.
- 2. Polynukleotidová vakcína, obsahující konstrukt DNA, vyznačuj ící se tím, že indukuje tvorbu neutralizujících protilátek proti chřipkovému viru, tvorbu cytotoxických T-lymfocytů, specifických proti chřipkovému viru, tvorbu cytotoxických T-lymfocytů, specifických proti chřipkovému viru nebo ochranné imunitní odpovědi při aplikaci DNA konstruktu in vivo u obratlovců, přičemž polynukleotidová vakcína kóduje gen chřipkového viru, který je po zavedení do tkání uvedených živočichů exprimován in vivo, vakcína obsahuje konstrukt podle nároku 1 a je tvořenaa) oblastí promotoru CMVIntA a oblastí BGH pro ukončení transkripce ze SEKV. ID: 11,b) prokaryotickým počátkem replikace,-80CZ 290315 B6c) genem pro odolnost proti antibiotikům ad) otevřeným čtecím rámcem, uloženým mezi promotor a signál pro ukončení transkripce ze složky a) řídící expresi genu chřipkového viru.
- 3. Polynukleotidová vakcína podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje DNA konstrukt, zvolený z jednoho nebo více následujících konstruktů:a) V1J-PR-NP, jehož 5'koncem je SEKV. ID: 12:,b) V1J-PR-PB1, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 13:,c) V1J-PR-NS, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 14:,d) V1J-PR-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 15:,e) VIJ-PR-PB2, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 16:,f) V1J-PR-M1, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 17:,g) VIJneo-BJ-NP, jehož 5' koncem je SEKV: ID: 20: a 3' koncem je SEKV. ID: 21:,h) VlJneo-TX-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 24: a 3' koncem SEKV. ID: 25 ai) VIJneo-PA-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 26: a 3' koncem je SEKV: ID: 27:j) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 46: a 3' koncem je SEKV. ID: 47:,k) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 48: a 3' koncem je SEKV. ID: 49:l) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 50: a 3' koncem je SEKV. ID: 51:,m) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/3 53/89), o velikosti konstruktu 6,42 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 52 a 3' koncem je SEKV. ID: 53:,n) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), o velikosti konstruktu 5,62 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 54, a 3'koncem je SEKV. ID: 55:,o) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,54 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 56: a 3' koncem je SEKV: ID: 57:,p) VlJns-PA.Ml (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 5,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 58: a 3' koncem je SEKV: ID: 59:.
- 4. Konstruktu DNA podle nároku 1 ze skupinya) V1J-PR-NP, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 12:,b) V1J-PR-PB1, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 13:,c) VIJ-PR-NS, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 14:,d) VIJ-PR-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 15:,e) V1J-PR-PB2, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 16:,f) V1J-PR-M1, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 17:,g) VIJneo-BJ-NP, jehož 5' koncem je SEKV: ID: 20: a 3' koncem je SEKV. ID: 21:,h) VlJneo-TX-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 24: a 3' koncem SEKV. ID: 25 ai) VIJneo-PA-HA, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 26: a 3' koncem je SEKV: ID: 27:j) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 46: a 3' koncem je SEKV. ID: 47:,k) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), o velikosti konstruktu 6,56 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 48: a 3' koncem je SEKV. ID: 49:l) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 50: a 3' koncem je SEKV. ID: 51:,m) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), o velikosti konstruktu 6,42 Kb, jehož 5' koncem je sekv. ID: 52 a 3' koncem je SEKV. ID: 53:,-81CZ 290315 B6n) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), o velikosti konstruktu 5,62 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 54, a 3' koncem je SEKV. ID: 55:,o) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 6,54 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 56: a 3' koncem je SEKV: ID: 57:,
- 5 p) VIJns-PA.Ml (B/Panama/45/90), o velikosti konstruktu 5,61 Kb, jehož 5' koncem je SEKV. ID: 58: a 3' koncem je SEKV: ID: 59:.5. Použití konstruktu DNA podle nároku 1 a 4 pro výrobu polynukleotidové vakcíny podle nároku 2 a 3 pro imunizaci proti infekci lidským chřipkovým virem.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3238393A | 1993-03-18 | 1993-03-18 | |
| US8998593A | 1993-07-08 | 1993-07-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ237395A3 CZ237395A3 (en) | 1996-02-14 |
| CZ290315B6 true CZ290315B6 (cs) | 2002-07-17 |
Family
ID=26708344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19952373A CZ290315B6 (cs) | 1993-03-18 | 1994-03-14 | Konstrukty DNA, jejich pouľití a polynukleotidová vakcína |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0620277A1 (cs) |
| JP (2) | JP2812352B2 (cs) |
| CN (1) | CN1119458A (cs) |
| AU (1) | AU676258B2 (cs) |
| BG (1) | BG63126B1 (cs) |
| BR (1) | BR9406007A (cs) |
| CA (1) | CA2119175A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ290315B6 (cs) |
| DZ (1) | DZ1759A1 (cs) |
| FI (1) | FI954329A (cs) |
| HR (1) | HRP940175A2 (cs) |
| HU (1) | HUT73397A (cs) |
| IL (1) | IL108915A0 (cs) |
| NO (1) | NO953649L (cs) |
| NZ (1) | NZ263680A (cs) |
| PL (1) | PL178626B1 (cs) |
| RO (1) | RO117710B1 (cs) |
| SI (1) | SI9420014A (cs) |
| SK (1) | SK114295A3 (cs) |
| UA (1) | UA42715C2 (cs) |
| WO (1) | WO1994021797A1 (cs) |
| YU (1) | YU12894A (cs) |
Families Citing this family (69)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5849719A (en) * | 1993-08-26 | 1998-12-15 | The Regents Of The University Of California | Method for treating allergic lung disease |
| US6911216B1 (en) | 1994-10-12 | 2005-06-28 | Genzyme Corporation | Targeted delivery via biodegradable polymers |
| US5736524A (en) | 1994-11-14 | 1998-04-07 | Merck & Co.,. Inc. | Polynucleotide tuberculosis vaccine |
| DE19512142A1 (de) * | 1995-03-31 | 1996-10-02 | Immuno Ag | Infektiöser cDNA-Klon des Tick-Borne Enzephalitis (TBE)-Virus, davon abgeleiteter rekombinanter Impfstoff und Herstellung desselben sowie ein pharmazeutisches Produkt, das eine replizierbare Nukleinsäure enthält |
| US6019980A (en) | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6017897A (en) * | 1995-06-07 | 2000-01-25 | Pasteur Merieux Connaught Canada | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6083925A (en) * | 1995-06-07 | 2000-07-04 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6537776B1 (en) | 1999-06-14 | 2003-03-25 | Diversa Corporation | Synthetic ligation reassembly in directed evolution |
| FR2751225B1 (fr) * | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique aviaire |
| US6204250B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-03-20 | The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York | Immunization of infants |
| EP1017283B1 (en) * | 1997-02-14 | 2004-12-15 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
| US6517843B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| CA2340330A1 (en) | 1998-08-20 | 2000-03-02 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein c of chlamydia |
| US6686339B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-03 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding inclusion membrane protein C of Chlamydia |
| US6693087B1 (en) | 1998-08-20 | 2004-02-17 | Aventis Pasteur Limited | Nucleic acid molecules encoding POMP91A protein of Chlamydia |
| US6881723B1 (en) | 1998-11-05 | 2005-04-19 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid constructs |
| US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| US7618797B2 (en) | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
| AU3593200A (en) | 1999-02-09 | 2000-08-29 | Powderject Vaccines, Inc. | (mycobacterium tuberculosis), immunization |
| US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
| JP2001151698A (ja) * | 1999-09-10 | 2001-06-05 | Nichiko Pharmaceutical Co Ltd | インフルエンザワクチン |
| WO2001030847A1 (en) | 1999-10-22 | 2001-05-03 | Aventis Pasteur Limited | Modified gp100 and uses thereof |
| US7196066B1 (en) | 1999-11-03 | 2007-03-27 | Powderject Vaccines, Inc. | DNA-vaccines based on constructs derived from the genomes of human and animal pathogens |
| US6852705B2 (en) | 2000-01-21 | 2005-02-08 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| US7078388B2 (en) | 2000-01-21 | 2006-07-18 | Merial | DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines |
| EP1792995A3 (en) | 2000-05-08 | 2007-06-13 | Sanofi Pasteur Limited | Chlamydia secretory locus orf and uses thereof |
| AU5810201A (en) | 2000-05-10 | 2001-11-20 | Aventis Pasteur | Immunogenic polypeptides encoded by mage minigenes and uses thereof |
| AU2005248361B2 (en) | 2004-05-18 | 2010-03-11 | Vical Incorporated | Influenza virus vaccine composition and methods of use |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| WO2008150998A1 (en) * | 2007-05-31 | 2008-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Sequences and methods for detecting influenza a and influenza b virus |
| US8354230B2 (en) * | 2007-12-21 | 2013-01-15 | Quest Diagnostics Investments Inc. | Multiplex detection assay for influenza and RSV viruses |
| CN102170902B (zh) | 2008-08-01 | 2015-07-15 | 伽玛疫苗有限公司 | 流感疫苗 |
| WO2010127252A2 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Vanderbilt University | Monoclonal antibodies to influenza h1n1 virus and uses thereof |
| SG168423A1 (en) * | 2009-07-13 | 2011-02-28 | Agency Science Tech & Res | Influenza detection method and kit therefor |
| TWI627281B (zh) | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物 |
| AR083533A1 (es) | 2010-10-22 | 2013-03-06 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas de hemaglutinina 5 (h5) para el tratamiento y prevencion de las infecciones de gripe |
| AR088028A1 (es) | 2011-08-15 | 2014-05-07 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Proteinas h5, de h5n1 para un uso medicinal |
| WO2013033092A2 (en) | 2011-09-03 | 2013-03-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Streptococcus suis pilus antigens |
| US10383835B2 (en) | 2012-03-14 | 2019-08-20 | The Regents Of The University Of California | Treatment of inflammatory disorders in non-human mammals |
| WO2014127825A1 (en) | 2013-02-21 | 2014-08-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | H5 proteins of h5n1 influenza virus for use as a medicament |
| JP2016520534A (ja) * | 2013-03-18 | 2016-07-14 | イマクシオＩｍａｘｉｏ | インフルエンザ核タンパク質ワクチン |
| WO2015048115A1 (en) | 2013-09-25 | 2015-04-02 | Zoetis Llc | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
| AU2015241107B2 (en) | 2014-04-03 | 2019-10-03 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Porcine epidemic diarrhea virus vaccine |
| ES2778649T3 (es) | 2015-08-31 | 2020-08-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vacunas pestivirales para temblores congénitos |
| MX2018003173A (es) | 2015-09-16 | 2018-05-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc | Vacunas de salmonella choleraesuis-salmonella typhimurium. |
| AR109540A1 (es) | 2016-09-20 | 2018-12-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Moléculas promotoras para expresar antígenos virales |
| EP3515480A1 (en) | 2016-09-20 | 2019-07-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | New swine influenza vaccine |
| CN109715204B (zh) | 2016-09-20 | 2023-08-22 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 新的ehv插入位点orf70 |
| TW201823467A (zh) | 2016-09-20 | 2018-07-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 犬腺病毒載體 |
| WO2018083154A1 (en) | 2016-11-03 | 2018-05-11 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine against porcine parvovirus |
| MY191895A (en) | 2016-11-03 | 2022-07-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof |
| JP2020506915A (ja) | 2017-01-30 | 2020-03-05 | ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド | ブタコロナウイルスワクチン |
| WO2019014144A1 (en) | 2017-07-12 | 2019-01-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS BASED ON SENECAVIRUS TYPE A AND CORRESPONDING METHODS |
| CA3072553A1 (en) | 2017-09-23 | 2019-03-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Paramyxoviridae expression system |
| WO2019092027A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof |
| AU2019223768A1 (en) | 2018-02-23 | 2020-08-27 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom |
| CA3091960A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New ehv insertion site ul43 |
| AR115002A1 (es) | 2018-03-19 | 2020-11-18 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Ehv con ul18 y/o ul8 inactivados |
| JP7162072B2 (ja) | 2018-03-26 | 2022-10-27 | ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド | 免疫原性組成物を製造する方法 |
| CN112867506A (zh) | 2018-09-20 | 2021-05-28 | 勃林格殷格翰动物保健有限公司 | 抗猪流行性腹泻的鼻内载体疫苗 |
| EP3852797A1 (en) | 2018-09-20 | 2021-07-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Modified pedv spike protein |
| IT201900007060A1 (it) | 2019-05-21 | 2020-11-21 | St Superiore Di Sanita | Cellule tumorali ingegnerizzate e loro usi |
| IT201900012540A1 (it) | 2019-07-22 | 2021-01-22 | Humanitas Mirasole Spa | Inibitori di CHI3L1 e loro usi |
| EP4100420A1 (en) | 2020-02-06 | 2022-12-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Polypeptides useful for detecting anti-rhabdovirus antibodies |
| WO2022076979A1 (en) | 2020-10-05 | 2022-04-14 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Fusion protein useful for vaccination against rotavirus |
| WO2022076977A1 (en) | 2020-10-05 | 2022-04-14 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Fusion protein comprising circoviridae capsid protein, and chimeric virus-like particles composed thereof |
| US20240050555A1 (en) | 2022-04-05 | 2024-02-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL86354A0 (en) * | 1987-05-22 | 1988-11-15 | Orion Yhtymae Oy | Episomal vector for the expression of selected dna fragments coding for optional polypeptides in mammalian cells and methods for the production thereof |
| WO1990011092A1 (en) * | 1989-03-21 | 1990-10-04 | Vical, Inc. | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
| US5643578A (en) * | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
-
1994
- 1994-03-09 IL IL10891594A patent/IL108915A0/xx unknown
- 1994-03-09 EP EP94200605A patent/EP0620277A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-14 HU HU9502702A patent/HUT73397A/hu unknown
- 1994-03-14 SK SK1142-95A patent/SK114295A3/sk unknown
- 1994-03-14 SI SI9420014A patent/SI9420014A/sl not_active IP Right Cessation
- 1994-03-14 BR BR9406007A patent/BR9406007A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-03-14 WO PCT/US1994/002751 patent/WO1994021797A1/en active IP Right Grant
- 1994-03-14 CN CN94191485A patent/CN1119458A/zh active Pending
- 1994-03-14 UA UA95094152A patent/UA42715C2/uk unknown
- 1994-03-14 NZ NZ263680A patent/NZ263680A/en unknown
- 1994-03-14 CZ CZ19952373A patent/CZ290315B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-03-14 RO RO95-01622A patent/RO117710B1/ro unknown
- 1994-03-14 PL PL94310677A patent/PL178626B1/pl unknown
- 1994-03-16 CA CA002119175A patent/CA2119175A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-16 DZ DZ940021A patent/DZ1759A1/fr active
- 1994-03-17 AU AU57889/94A patent/AU676258B2/en not_active Ceased
- 1994-03-17 HR HR08/089,985A patent/HRP940175A2/xx not_active Application Discontinuation
- 1994-03-17 YU YU12894A patent/YU12894A/sh unknown
- 1994-03-18 JP JP6049102A patent/JP2812352B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-09-14 FI FI954329A patent/FI954329A/fi unknown
- 1995-09-15 NO NO953649A patent/NO953649L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-09-18 BG BG100006A patent/BG63126B1/bg unknown
-
1997
- 1997-10-22 JP JP29013797A patent/JP3608642B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HRP940175A2 (en) | 1997-04-30 |
| EP0620277A1 (en) | 1994-10-19 |
| CA2119175A1 (en) | 1994-09-19 |
| NO953649D0 (no) | 1995-09-15 |
| NO953649L (no) | 1995-11-17 |
| CZ237395A3 (en) | 1996-02-14 |
| YU12894A (sh) | 1997-12-05 |
| SI9420014A (en) | 1996-08-31 |
| FI954329A0 (fi) | 1995-09-14 |
| UA42715C2 (uk) | 2001-11-15 |
| BR9406007A (pt) | 1996-01-02 |
| NZ263680A (en) | 1997-05-26 |
| SK114295A3 (en) | 1996-02-07 |
| FI954329A (fi) | 1995-09-14 |
| DZ1759A1 (fr) | 2002-02-17 |
| HUT73397A (en) | 1996-07-29 |
| BG100006A (bg) | 1996-12-31 |
| JPH10113194A (ja) | 1998-05-06 |
| PL310677A1 (en) | 1995-12-27 |
| HU9502702D0 (en) | 1995-11-28 |
| RO117710B1 (ro) | 2002-06-28 |
| IL108915A0 (en) | 1994-06-24 |
| AU5788994A (en) | 1994-09-22 |
| BG63126B1 (bg) | 2001-04-30 |
| CN1119458A (zh) | 1996-03-27 |
| AU676258B2 (en) | 1997-03-06 |
| JPH0795888A (ja) | 1995-04-11 |
| JP2812352B2 (ja) | 1998-10-22 |
| JP3608642B2 (ja) | 2005-01-12 |
| WO1994021797A1 (en) | 1994-09-29 |
| PL178626B1 (pl) | 2000-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ290315B6 (cs) | Konstrukty DNA, jejich pouľití a polynukleotidová vakcína | |
| US20210252130A1 (en) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses | |
| AU2006236910B2 (en) | Vaccine against pandemic strains of influenza viruses | |
| MXPA04007914A (es) | Senal para empaquetado de vectores de virus de influenza. | |
| US20070003576A1 (en) | Vaccines for the rapid response to pandemic avian influenza | |
| CN114014937A (zh) | 稳定化的流感血凝素茎区三聚体及其用途 | |
| CZ259096A3 (en) | Polynucleotide, method of provoking immune response and vaccine | |
| BRPI0706913A2 (pt) | vacina com base em levedura para induzir uma reação imune | |
| CN108026515B (zh) | 用于预防和/或治疗感染性疾病以及用于治疗肿瘤疾病的减毒流感病毒载体 | |
| US20070122430A1 (en) | Influenza vaccine compositions and methods of use thereof | |
| US20040087521A1 (en) | Nucleic acid pharmaceuticals-influenza matrix | |
| US20230043128A1 (en) | Multivalent influenza vaccines | |
| Kuwano et al. | Cross-reactive protection against influenza A virus infections by an NS1-specific CTL clone | |
| CA2842055C (en) | Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene | |
| RU2193065C2 (ru) | Конструкция днк (варианты), днк-вектор, иммуногенная композиция против вируса гриппа, способ индукции иммунного ответа, вакцина и способ вакцинации | |
| AU3723099A (en) | Attenuated influenza viruses | |
| US20020103145A1 (en) | Immunization of infants | |
| Saikh et al. | Protective cross-reactive epitope on the nonstructural protein NS1 of influenza A virus | |
| CN117716036A (zh) | 用于病毒性疾病的温度可控型自我复制rna疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20040314 |