HUT73397A - Dna constructs that contain influenza-virus genes, vaccines containing them and expression vectors - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft.

Influenzavírus-géneket tartalmazó DNS-konstrukciók, valamint a DNS-konstrukciókat tartalmazó oltóanyagok és expressziós vektorok

A találmány tárgyát influenzavírus-géneket tartalmazó DNSkonstrukciók, valamint a DNS-konstrukciókat tartalmazó oltóanyagok és expressziós vektorok képezik. A találmány szerinti DNS-konstrukciók és oltóanyagok alkalmasak immunválasz kiváltására és immunológiai védettség előidézésére influenzavírusokkal szemben emberekben és más gerincesekben.

A jelen bejelentés az USSN 08/089 985 számú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi bejelentés részben folytatólagos bejelentése, melyet 1993. július 8.-án nyújtottunk be, és amely folytatólagos bejelentése az USSN 08/032 383 számú amerikai egyesült államokbeli függő szabadalmi bejelentésnek, melyet 1993. március 18.-án nyújtottunk be.

Az influenza akut lázas megbetegedés, melyet a légutak influenza-A vagy -B vírussal történő fertőződése okoz. Influenza-járványok világszerte csaknem minden évben előfordulnak, periodikusan jelentkező epidémiák vagy pandémiák (több országra vagy világra kiterjedő járványok) formájában. Az influenza jelentős mértékű szisztémás tüneteket okozhat, kiválthat súlyos, kórházi kezelést igénylő megbetegedést [például vírus-pneumóniát (tüdőgyulladást)], valamint szövődményekkel, például másodlagos bakteriális pneumóniával járhat. Az U.S.A-ban nemrégiben lezajlott járványok évente több, mint 10 000 (40 000-ig terjedő) halálesetet okoztak, járványmentes években pedig az influenza 5 000-10 000 halálesetért tehető felelősAktaszámunk: 82324-2037/PÁ

• · il

- 2 sé. Az influenzával kapcsolatos morbiditás (megbetegedés) és mortalitás (halálozás) megelőzésére a legjobb stratégia a vakcinázás. A jelenleg engedélyezett vakcinákat tojásban tenyésztett, majd inaktivált vírusból állítják elő, ezek három vírustörzset (két A-törzset és egy B-törzset) tartalmaznak. Három vakcina típus áll rendelkezésre: teljes vírust, szubviriont (vírusalegységet), valamint tisztított felületi antigént tartalmazó vakcinák. Gyermekekben csak a két utóbbit alkalmazzák, mivel a teljes vírust tartalmazó vakcina számottevő lázas válaszreakciót okoz. Kilenc év alatti gyerekeket két alkalommal kell immunizálni, míg a felnőtteknél csak egyetlen injektálásra van szükség. Egyes vélemények szerint azonban, “a koraősszel vakcinázott egyéneknél télen vagy koratavasszal egy második dózist ajánlatos beadni” [lásd, Medical Letter 32, 89 (1993)], mivel megfigyelték, hogy idősebb betegekben a vakcinázást követően az ellenanyag-titer négy hónap alatt vagy még rövidebb idő alatt a védettség fenntartásához szükséges szint alá csökken. A vakcinákat minden évben újra formulázzák az arra vonatkozó előrejelezések alapján, hogy mely jelenlegi vírustörzs klinikai elterjedése várható és a következő influenza-időszakban várhatóan melyik új virulens törzs lesz túlsúlyban. Az vakcinázás ismétlése évente ajánlott.

A. A jelenleg engedélyezett vakcinák korlátái:

1) Az antigénszerkezetben található variációk, különösen az A-törzs esetében, olyan vírusokat eredményeznek, melyeket egy megelőző vakcina (vagy megelőző fertőződés) hatására keletkező ellenanyagok nem neutralizálnak. A felszíni glikoproteineket [hemagglutinint (HA) és neuraminidázt] kódoló génekben létrejövő pontmutációk (“antigén-drift”; antigénszerkezetimódosulás) és a gének átrendeződése (“antigén-shift”; antigénszerkezetiváltozás) következtében új törzsek jönnek létre, míg a belső proteinek az antigénszerkezeti módosuláson és antigénszerkezeti változáson átment törzsek között nagyfokú állandóságot mutatnak. Az immunizálás ellenanyag • <·· ·

-3által közvetített, “homológ”, törzs-specifikus immunitást vált ki és nem sejt által közvetített immunitáson alapuló, csoport-specifikus, “heterológ” immunitást.

2) Az ellenanyag-titerek csökkenésének következtében az immunizálást minden évben meg kell ismételni, még akkor is, ha a túlsúlyban levő elterjedt influenza-törzsek egyik évről a másikra nem mentek át jelentős antigénszerkezeti módosuláson vagy antigénszerkezeti változáson. Bár több közlemény szerint, a hemagglutináció-gátló (Hl) és neutralizáló ellenanyagok hónapoktól évekig terjedő időszakon át kimutathatóak, majd szintjük fokozatosan csökken, az Immunizálási Gyakorlati Tanácsadó Bizottság (“Advisory Committee on Immunization Practices”) az ellenanyag-titemek a vakcinázást követő évben történő csökkenésével indokolja az évenkénti vakcinázás szükségességét, még abban az esetben is, ha nem történt nagyobb mértékű antigénszerkezeti módosulás vagy antigénszerkezeti változás. (A ΗΙ-ellenanyagok gátolják az influenzavírus vörösvértesteket agglutináló képességét. A neutralizáló ellenanyagokhoz hasonlóan, azok elsődlegesen a HI-antigén ellen irányulnak. A hemagglutináció-gátláson alapuló vizsgálati eljárások kivitelezése könnyebb és kevésbé költséges, mint a neutralizációs vizsgálati eljárásoké, ezért gyakran alkalmazzák annak megállapítására, hogy egy adott influenza-törzzsel szemben előállított ellenanyagok képesek-e más törzzsel reagálni.) Amint azt a fentiekben említettük, a “The Medical Letter” azt ajánlja, hogy bizonyos veszélyeztetett idős egyéneknél a védettséghez elegendő ellenanyag-titer rövid ideig tartó fennmaradása következtében a vakcinázást egy évben kétszer meg kell ismételni.

3) A vakcina hatékonysága elmarad az optimálistól. A következő influenza-szezonban alkalmazandó vakcinák kifejlesztése azon alapszik, hogy mennyire sikerül előre jelezni a következő évben elterjedő törzset (Ázsiában történő “őr-mintavételekkel”), mely eljárás nem pontos és a vakcinában al- íi

-4kalmazott törzsek, valamint az aktuálisan elterjedt mezei törzsek között gyenge egyezést eredményezhet. Ezenkívül, amint az az 1992-1993. évi influenza-járvány során történt, az influenza-szezon késői fázisában klinikailag nyilvánvalóvá vált egy új H3N2-törzs (A/Beijing/92) megjelenése. Ez az 1993-1994.-évi vakcina összetételének megváltoztatását tette szükségessé, mivel az A/Beijing/92 törzs antigénszerkezeti változás következtében gyenge keresztreaktivitást mutatott a korábbi H3N2-törzs (A/Beijing/89) által kiváltott ellenanyagokkal. Mivel azonban az új engedélyezett vakcina előállításához és formulázásálioz hosszú időre volt szükség, az új vakcina-törzs alkalmazását az 1992-1993. évadban nem tudták elkezdeni, annak ellenére, hogy az alkalmazott vakcina az új törzzsel szemben nyilvánvalóan gyenge védettséget hozott létre és az újonnan elterjedt H3N2-törzs fokozott virulenciával rendelkezett.

Még ha a vakcinában található törzs és az elterjedt törzs megfelelő egyezést mutat is, az engedélyezett vakcina a megbetegedést egészséges gyerekeknél és fiatal felnőtteknél csak körülbelül 70 %-ban, gyenge, idős felnőtteknél csupán 30-40 %-ban képes megelőzni. Amennyiben tehát a vakcinában található törzsek megfelelnek az elterjedt törzseknek, a vakcina hatékonyságának jellemzésére más ismérveket kell alkalmaznunk. Ezek az ismérvek a súlyos megbetegedés és másodlagos szövődmények kialakulásának megakadályozása, melyet a kórházi kezelés szükségességének megelőzése, (ami az otthonukban lakó időseknél 70 %, míg az idősek otthonában lakóknál 50-60 %) és a halálozás megelőzése, (amely idősek otthonában lakóknál 80 %-ot is elér), tükröz. Az idősek otthonában a fertőzés terjedésének esélyét csökkentő csoport-immunitás az immunizálás további előnyei közé sorolható.

-5w

B. Az ideális univerzális influenza vakcina jellemzői

1) Csoport-specifikus (heterológ) védettség létrehozása. Egy univerzális vakcinának képesnek kell lennie például egy H3N2-altípuson belül különböző törzsekkel szembeni védettség létrehozására és esetleg még altípusok közötti, például Hl NI és H3N2 törzsek közötti védettség létrehozására is. Ez a védettség feltehetően olyan citotoxikus T-limfociták (CTL) közvetítésével jön létre, melyek belső, nem változékony vírusproteinekből származó antigéneket ismernek fel, bár abban membránhoz kötött proteinek nem változékony részei ellen irányuló neutralizáló ellenanyagok is szerepet játszhatnak.

2) Az ellenanyag-válasz kitérj edtségének növelése. Mivel a CTL-k feltehetően szerepet játszanak a betegségből való felgyógyulásban, egy csupán CTL-válaszon alapuló vakcina várhatóan lerövidítené a betegség tartamát (esetleg addig a pontig, hogy a betegség klinikailag felismerhetetlenné válna), de a betegség kialakulását nem akadályozná meg teljesen. Az aktuális influenza-vakcinák előállítására alkalmazott, tojásokon történő passzáláson alapuló eljárásról kísérletesen kimutatták, hogy az alkalmas megváltozott HA-antigenitással rendelkező vírus-szubpopulációk szelekciójára. Ennek eredményeképp, a vakcina hatékonysága elveszhet, mivel a vakcina által kiváltott ellenanyagok nem teljesen hatékonyak a túlsúlyban levő elterjedt törzzsel szemben. Előnyös lenne tehát olyan ellenanyagok termelődésének kiváltása, melyek az aktuális vakcinához képest szélesebb körű válaszreakciót mutatnak. Az 1992-93. influenza-szezon kiváló esettanulmányul szolgált az aktuálisan alkalmazott vakcina korlátainak vizsgálatára, amennyiben az A/Beijing/89-törzsből származó vakcina olyan ellenanyagok termelődését váltotta ki, melyek gyenge keresztreaktivitást mutattak az új A/Beijing/92 törzzsel szemben (és azzal szemben gyenge védettséget hoztak létre), mely utóbbi törzs fokozottan virulens is volt. Mindkét törzs

-6H3N2-törzs, azaz ugyanabba az altípusba tartoznak. Aminosav-szekvencia tekintetében azonban, az A/Beijing/92 törzshöz hasonló törzsek a HA1régióban létrejött 11 pontmutációban (a 133., 135., 145., 156., 157., 186., 190., 191., 193., 226. és 262. pozíciókban található pontmutációban) különböztek a A/Beijing/92-törzshöz hasonló törzsektől. Nem ismert, hogy az alkalmazott termelési folyamat befolyásolta-e a keresztreaktivitás hiányának létrejöttét, de nyilvánvalóan szükség van az ellenanyag-válasz kiterjedtségének javítására.

3) Az ellenanyag-válasz tartósságának fokozása. Mivel éppen azon csoportok egyike, amely az influenza fertőzés következtében fellépő morbiditás és mortalitás tekintetében a leginkább veszélyeztetett (az idősek csoportja) egyszerre az a csoport, melyben a védettség fenntartásához szükséges ellenanyag-titer túl gyorsan csökken ahhoz, hogy az évenkénti immunizálás hatékony legyen, egy javított vakcinának hosszabb ideig fennmaradó védettséggel járó ellenanyag-titert kell kiváltania.

C. Polinukleotid-vakcinák.

Polinukleotid-konstrukciók, például proteint kódoló DNS-plazmidok izomba történő beoltásáról kimutatták, hogy az az ízomsejtekben a protein in situ termelődését idézte elő. Vírus-proteineket kódoló cDNS-plazmidok alkalmazásával mind ellenanyag-, mind CTL-választ sikerült kiváltani, mely az azt követő kísérletes fertőzéssel szemben mind a homológ, mind a heterológ törzzsel szemben keresztvédettséget eredményezett. Mindkét fenti típusú immunválasz potenciális előnnyel jár az eddig alkalmazott vakcinázási stratégiákkal szemben. A polinukleotid-vakcinák (PNV-k) alkalmazása ellenanyag-termelődés kiváltására hosszabb ideig fennmaradó ellenanyagválaszt eredményezhet, valamint olyan antigén áll rendelkezésre, mely a klinikai tüneteket kiváltó, elterjedt vírustörzzsel pontosan megegyező szekvenciával, a megfelelő transzlációt követően létrejövő módosításokkal és

• ·· ·

-7 (szemben egy rekombináns proteinnel), a natív protein konformációjával rendelkezik. A CTL-válasz fenti módon történő létrehozásának az az előnye, hogy egy esetlegesen patogén élő vektor vagy gyengített (attenuált) vírus alkalmazása nélkül törzsek közti keresztvédettség létrehozásához vezet.

D. További háttérínformációk

Az olyan vírusok, mint az influenzavírus, elleni vakcina kifejlesztésében, melyek ellen neutralizáló ellenanyagok termelődnek, a nagy kihívást a vírus burokproteinjeinek változatossága jelenti a különböző vírusizolátumok vagy törzsek között. Mivel a citotoxikus T-limfociták mind egerekben, mind emberben képesek a nem változékony belső vírus proteinekből származó epitópok felismerésére [J.W. Yewdell és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1785 (1985); A.R.M. Townsend és mtsai.: Cell 44, 959 (1986); A.J. McMichael és mtsai.: J. Gén. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin és mtsai.: J. Exp. Med.: 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend és H. Bodmer: Annu. Rév. Immunoi. 7, 601 (1989)] és fontosnak tartjuk őket a vírusok elleni immunválasz kialakulásában [Y.L. Lin és B.A. Askonas: J. Exp. Med. 154, 225 (1981); I. Gardner és mtsai.: Eur. J. Immunoi. 4, 68 (1974); K.L. Yap és

G.L. Ada: Natúré 273, 238 (1978); A.J. McMichael és mtsai.: New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P.M. Taylor és B.A. Askonas: Immunoi. 58, 417 (1986)] az erőfeszítések különböző vírustörzsekkel szembeni heterológ védettség létrehozására alkalmas CTL-vakcinák kifejlesztésére irányultak.

A CD8⁺-CTL-k, amennyiben T-sejt receptoraik I-osztályú MHCmolekulákkal kapcsolt víruspeptideket ismernek fel, képesek a vírusfertőzött sejtek elpusztítására [R.M. Zinkemagel és P.C. Doherty: ibid. 141, 1427 (1975); R.N. Germain: Natúré 353, 605 (1991)]. Ezek a peptidek endogén szintetizált vírusproteinekből származnak, tekintet nélkül a proteinnek a vírusban történő elhelyezkedésére vagy funkciójára. A nem változékony vírusproteinekből származó epitópok felismerése által tehát a CTL-k törzsek

··· ·** ·♦· ··· · · · .. .

-8közti keresztvédettséget hozhatnak létre. A CTL-k által felismert, I.-osztályú MHC-antigénnel kapcsolódni képes peptidek olyan proteinekből származnak, melyek a citoplazmában vagy endoplazmás retikulumban találhatók vagy azokon áthaladnak [J.W. Yewdel és J.R. Bennink: Science 244. 1072 (1989); A.R.M. Townsend és mtsa.: Natúré 340. 443 (1989); J.G. Nuchtem és mtsai.: ibid 339. 223 (1989)]. Általánosságban tehát, az endoszómában érési (“processing”) folyamaton átmenő exogén proteinek, (mint például a II.-osztályú MHC-molekulák által prezentált antigének), nem hatékonyak CD8⁺-CTL-válasz létrehozására.

A CTL-válasz kiváltására tett legtöbb próbálkozás vagy a proteinantigént a sejtekben termelő replikálódó vektorok alkalmazásán alapul [J.R. Bennink és mtsai.: ibid 311. 578 (1984); J.R. Bennink és J.W. Yewdell: Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 163. 153 (1990); C.K. Stover és mtsai.: Natúré 351. 456 (1991); A. Aldovini és R.A. Young: Natúré 351. 479 (1991); R. Schafer és mtsai.: J. Immunoi. 149, 53 (1992); C.S. Hahn és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 2679 (1992)] vagy a peptideknek a citoszolba történő juttatására összpontosít [F.R. Carbone és M. J. Bevan: J. Exp. Med. 169.603 (1989); K. Deres és mtsai.: Natúré 342. 561 (1989); H. Takahashi és mtsai.: ibid 344, 873 (1990); D.S. Collins és mtsai.: J. Immunoi. 148, 3336 (1992); M.J. Newman és mtsai.: ibid 148. 2357 (1992)]. Mindkét megközelítési mód olyan hátrányokkal rendelkezik, melyek csökkentik vakcinaként történő alkalmazhatóságuk esélyét. Retrovírusvektorok alkalmazása esetében a rekombináns vírus replikációs képességének fenntartása mellett korlátozott az általuk fúziós proteinekként expresszálható polipeptidek mérete és struktúrája, [A.D. Miller Curr. Top. Microbiol. Immunoi. 158, 1 (1992)], valamint az imunizálásra felhasználható vektor-vakcina alkalmazásának hatékonyságát veszélyeztetheti magával a vektorral szemben létrejövő immunválasz [E.L. Cooney és mtsai.: Láncét

337. 567 (1991)]. Ezenkívül, vírus-vektorok és módosított kórokozók alkalmazása olyan veszélyt hordoz magában, mely hátráltatja emberben történő felhasználásukat [R.R. Redfield és mtsai.: New Engl. J.Med. 316. 673 (1987)]; L. Mascola és mtsai.: Arch. Intem. Med. 149, 1569 (1989)]. Továbbá, a prezentálódó peptid-epitópok szelekciója az adott MHC-antigének struktúrájától függ, ezért egy nem beltenyésztett populációban a peptidvakcinák az MHC-haplotípusok változatosságának következtében korlátozott hatékonysággal rendelkezhetnek.

Benvenisty N. és Reshef L. [PNAS 83, 9551-9555 (1986)] kimutatták, hogy egérbe intraperitoneálisan (hasüregbe), intravénásán vagy intramuszkulárisan (izomba) bejuttatott CaCl₂-dal precipitált DNS expresszálódni képes. Egérben igazolták, hogy DNS-expressziós vektorok izomba történő injektálása a DNS izomsejtekbe történő felvételéhez és a DNS által kódolt protein expresszálódásához vezet [ J.A. Wolff és mtsai.: Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi és mtsai.: Natúré 352, 815 (1991)]. Kimutatták, hogy a plazmidok episzómaként fennmaradtak és nem replikálódtak. Ezenkívül, patkányok, halak és főemlősök vázizmába, valamint patkányok szívizmába történő intramuszkuláris injektálást követően tartós expresszálódás volt megfigyelhető [H. Lin és mtsai.: Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 4138 (1991); E. Hansen és mtsai.: FEBS Lett. 290. 73 (1991); S. Jiao és mtsai.: Hűm. Gene Therapy 3,21 (1992); J.A. Wolff és mtsai.: Humán Mól. Génét. 1, 363 (1992)]. Nukleinsavak terápiás szerként történő felhasználását írja le a W090/11092 számú nemzetközi szabadalmi leírás (1990, október 4.), mely szerint önmagukban beadott polinukleotidokat alkalmaztak gerincesek vakcinázására.

Az eljárás sikeréhez nem szükségszerű, hogy az immunizálás intramuszkulárisan történjék. így például Tang és munkatársai leírták, hogy szarvasmarha növekedési hormont (BGH-t) kódoló DNS-sel bevont arany-

-10mikrolövedékek egerek bőrébe történő beültetése az egerekben anti-BGH ellenanyagok termelődését váltotta ki [Natúré 356. 152-154 (1992)]. Furth és mtsai. [Analytical Biochemistry 205. 365 (1992)] kimutatták, hogy “jetinjektor” alkalmazásával élő állatban bőr, izom, zsírszövet és emlőszövet transzferálható. Nemrégiben Friedman T. összefoglalójában írt le nukleinsav bejuttatására alkalmazható különböző eljárásokat [Science 244. 1275 (1989)]. Lásd még, Robinson és mtsai.: “Abstracts of Papers Presented at the 1992 meeting on Modem Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS” (“Cold Spring Harbor”, 92. oldal), mely szerint madárinfluenza-DNS intramuszkuláris, intraperitoneális és intravénás beadásával csirkékben letális hatású kísérletes fertőzéssel szemben védettséget hoztak létre. A leírás nem tartalmazta azonban, mely madár-influenzavírus géneket alkalmazták. Ezenkívül, csak H7-specifikus immunválasz létrejöttéről tudósítanak, anélkül, hogy törzsek közti keresztvédettség kialakulásáról bármely említés történne.

Ezért, a találmány szerinti megoldás szempontjából protein-expresszió kiváltása céljából nukleinsavaknak élő szövetekben történő bejuttatására alkalmazható bármely ismert módszer számításba jöhet. A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás vírusproteineknek az antigén feldolgozó (“antigénprocessing”) útra történő juttatása, vírusspecifíkus CTL-k keletkezésének kiváltása céljából. A találmány szerinti megoldás tehát az influenza-vírus esetében kielégíti a víruspatogénekkel szemben a kívánt profílaktikus immunválasz kiváltására alkalmas specifikus terápiás szerek iránti igényt. A fenti terápiás megközelítésben különösen lényeges a T-sejtes immunválasz kiváltására való képesség, amely még olyan vírustörzsek esetében is megelőzheti a fertőzést, melyek eltérnek attól a törzstől, melyből az antigén-gén származik. A találmány tárgyát képezik tehát humán influenzavírus nukleoprotein (NP), hemagglutinin (HA), neuraminidáz (NM), mátrixprotein

-11 (M), nem strukturális protein (NS), polimeráz (PB1 és PB2 = 1. és 2. bázikus polimerázok) vírusproteineket kódoló DNS-konstrukciók vagy bármely más, specifikus CTL-k keletkezését kiváltó terméket kódoló influenzagének.

Az influenza vírus több RNS szegmensből álló ribonukleinsav (RNS) genommal rendelkezik. Mindegyik RNS legalább egy génterméket kódol. Az NP-géntermék az RNS-hez kötődik és a vírus-RNS-t a fertőzött sejt magjába juttatja. A szekvencia nem változékony, annak aminosavszekvenciájában 50 év alatt csupán körülbelül 7 % eltérés jött létre. A Pgéntermékek (PB1, PB2 és PA) új vírus-RNS-ek szintéziséért felelősek. Ezek a gének még kevésbé változékonyak, mint az NP-gén. A HA a fő vírusburok géntermék. Ez kevésbé állandó, mint az NP. A HA egy sejtreceptorhoz kötődik, ezáltal új influenza-fertőzés létrejöttében játszik szerepet. A neutralizáló ellenanyag-válasz elsősorban a fenti antigén ellen irányul. Ezzel a proteinnel szemben jelentős citotoxikus T-limfocita válasz is létrejön. A humán influenzavírus ellen jelenleg alkalmazott vakcinák három influenzavírus-törzset vagy azokból származó HA-proteineket tartalmaznak. A HA protein-szekvenciájában a különböző törzsek között található variábilitás következtében azonban, a vakcinát állandóan az adott időszakban betegséget okozó törzsekhez kell igazítani. A HA tartalmaz néhány, megfelelő prezentálás esetén CTL-k keletkezésének kiváltására alkalmas állandó elemet. Az NS1 és NS2 géntermékek biológiai funkcióját nem jellemezték teljesen, de lényegesek lehetnek védettséget jelentő CTL-válasz kiváltásában. Végül, az Ml és M2 géntermékek, melyek kissé állandóbbak, mint a HA, jelentős mértékű CTL-választ váltanak ki. Az Ml-protein nagy mennyiségben jelenlevő vírus-géntermék.

A DNS-vakcinázás hatékonyságát egy későbbi vírusfertőzéssel szembeni védettség létrehozására a fenti vírusproteinek egyikét kódoló, nem replikálódó plazmid-DNS-sel történő immunizálással szemléltethetjük. A

- 12fenti eljárás előnyös, mivel fertőző ágenst nem alkalmazunk, nincs szükség a vírusrészecskék összeépülésére és megfelelő antigéndetennináns kiválasztását teszi lehetővé. Továbbá, mivel a nukleoprotein és több más vírusgén szekvenciája különböző influenza-törzsek esetében állandó, lehetőség van egy későbbi virulens influenzatörzzsel történő fertőzéssel szembeni védettség létrehozására, akár homológ, akár heterológ a törzs ahhoz a törzshöz képest, melyből a klónozott gént nyertük.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

Az állati szövetekbe injektálással vagy más módon közvetlenül bejuttatott, expresszálódásra képes DNS-konstrukciók új gyógyászati készítményeket képviselnek. Ezek olyan vírusantigénre specifikus citotoxikus Tlimfociták (CTL-k) keletkezését váltják ki, melyek a vírus különböző törzseivel reagálnak, ellentétben az ellenanyagokkal, melyek általában törzsspecifikusak. Az ilyen CTL-k keletkezésének in vivő kiváltásához rendszerint az antigén endogén expresszálódására van szükség, amint az vírusfertőzés esetén történik. Abból a célból, hogy az immunrendszer számára prezentálható vírusantigéneket állítsunk elő, anélkül, hogy a peptid közvetlen bejuttatásának vagy vírus-vektorok alkalmazásának korlátaiba ütköznénk, humán influenzavírus-proteineket kódoló plazmid DNS-t injektáltunk BALB/cegerek quadriceps izmába (a négyfejű combizomba), ez influenzavírusspecifikus CTL-k keletkezéséhez vezetett és heterológ influenzavírustörzzsel történő későbbi fertőzéssel szemben védettséget hozott létre, melyet a tüdőben mérhető vírustiter csökkenése, a testtömegvesztés gátlása és fokozott túlélési arány alapján mértünk. Rhesus-majmokban hemagglutininnal szemben magas neutralizáló ellenanyag-titerek, valamint nukleoproteinnel szemben termelődött ellenanyagok jöttek létre, és vadászmenyétekben homológ vagy heterológ kísérletes fertőzést követően az orrváladékban csökkent vírustitereket mértünk.

- 13 A találmányra vonatkozólag az alábbi lényeges megfigyeléseket tettük:

1) A hatékonyság kimutatása: Miután egereket nukleoprotein (NP) DNS-sel ünmunizáltunk, az NP-gén forrásától eltérő influenza-törzzsel történő kísérletes fertőzést követően heterológ védettség létrejöttét figyeltük meg, melyet fokozott túlélési arány, a tüdőben a vírustiter csökkenése és a testtömegvesztés gátlása jelzett. Ebben az esetben a két törzs felszíni proteinjei igen különbözőek voltak (H1N1, valamint H3N2), és a kísérletes fertőzésnél alkalmazott törzs a kiindulási törzs létrejöttét követően 34 évvel később jött létre. Vadászmeny étek immunizálása NP-DNS-sel vagy mátrix(Ml) DNS-sel, külön-külön vagy együtt vagy HA-DNS-sel együttesen, védettséget (az orron át történő csökkent vírusszóródást) eredményezett egy antigénszerkezeti módosuláson átment törzzsel (egy klinikai izolátummal) történő kísérletes fertőzéssel szemben.

Figyelemreméltó, hogy vadászmeny étekben a víruskoktél (a Beijing/89 proteinjeit kódoló NP- és Ml-DNS-t, valamint a Beijing/89 vagy a Hawaii/91 HA-t kódoló HA-DNS-t tartalmazó koktél) az antigénszerkezeti módosuláson átment (Georgia/93) törzzsel szemben nagyobb mértékű védettséget váltott ki, mint az engedélyezett (Beijing/89-törzset tartalmazó) vakcina által létrehozott védettség. A Hawaii/91-törzsből származó HADNS-t tartalmazó koktél kissé hatékonyabbnak tűnt, mint a Beijing/89törzsből származó HA-DNS-t tartalmazó koktél. A Hawaii/91-törzsből származó HA-DNS-t tartalmazó koktél által kiváltott védettség azonos mértékű volt, mint a homológ (Georgia/93) HA-DNS-sel létrehozott védettség, míg a Beijing/89-törzsből származó HA-DNS-t tartalmazó koktél által kiváltott védettség mértéke eltért a homológ védettségtől, de lényegesen jobb volt, mint az engedélyezett termékkel létrehozott. Valamennyi vizsgált fajban, ezen belül egerekben, vadászmenyétben, Rhesus-majmokban és Afrikai zöldmajmokban HI-ellenanyagok létrejöttét észleltük.

2) Az ellenanyagválasz tartóssága. Riportegént kódoló DNS alkalmazásával végzett vizsgálatokban a DNS jelenléte és a protein-expresszió legalább 1,5 évig (az egerekben vizsgált leghosszabb ideig) kimutatható volt [Wolf és mtsai.: Humán Mól. Génét. (1992)]. Ha tehát az influenzagéntermékek tartósan expresszálódnak, az általuk eredményezett immunválasznak is fenn kell maradnia. Egerekben kimutatták, hogy az influenzaDNS injektálásával létrehozott ellenanyagok és CTL-k, valamint a homológ védettséget létrehozó immunitás (MRL-adatok) több, mint egy évig fennmaradtak [Yankauckas és mtsai.: DNA & Cell Bioi. (1993)]. Rhesusmajmokban megfigyelték, hogy az ellenanyagok legalább egy évig kimutathatóak voltak. A CTL-válasz és heterológ védettség (fokozott túlélési arány) 6 hónapig maradt fenn, (ami eddig a leghosszabb vizsgált időtartam). A heterológ védettség mértéke kismértékben csökkent, de a védettség megerősíthető volt.

3) Dózis-meghatározás. Rhesus-majmokban végzett adagolási vizsgálatok azt mutatták, hogy két alkalommal beadott 100 pg HA-DNS megfelelő HI-ellenanyag-titert hozott létre, amely legalább egy évig fennmaradt. Egerekben már 6 pg DNS-dózis (3 alkalommal ismételve) vagy egyetlen alkalommal injektált 200 pg DNS alkalmazásával sikerült védettséget (heterológ kísérletes fertőzést követően megnövekedett túlélési arányt) kiváltani, általánosságban azonban több injektálás (3 injektálásig) javította a védettség fokát. Főemlősökben végzett vizsgálatok szerint, 3 HA-t, valamint NP-t és Ml-et kódoló (az utóbbiak a Beijing/89-törzs H3N2 génjeit kódolták) 10 pg vagy 100 pg DNS két alkalommal történő injektálásával az engedélyezett vakcinával létrehozott HI-ellenanyag-titerhez hasonló mértékű titer hozható létre. Emlékeztetnünk kell arra, hogy egyik vizsgált állat sem találkozott még influenzavírussal, míg a célzott klinikai populáció (idősebb egyének) mindegyike átesett már influenzán. (Emlékeztetünk arra is, hogy 9 év alatti ···

- 15gyermekeket a szabadalmi védelem alatt álló vakcinával két alkalommal kell injektálni.)

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrák leírását.

Az 1. ábra NP plazmid-DNS izomban történő kimutatását szemlélteti PCR-eljárás alkalmazásával. A BALB/c-egereket három alkalommal, három hetes időközökben RSV-NP DNS-sel vagy üres vektorral injektáltuk (100 pg/láb) mindkét quadriceps izomba, majd influenzával fertőztük őket. Az izmokat az utolsó injekciót követően négy héttel eltávolítottuk és folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztottuk. Azokat egy MIKRODISMEMBRATOR™ készülékkel (B. Braun Instruments) lízis-pufferben (25 mmól/1 Tris-H₃PO₄ pH: 8,0; 2 mmól/1 transz-1:2-diaminociklohexántetra-ecetsav (CTDA), 2 mmól/1 DTT, 10 % glicerin, 1 % Triton-X-100) szétzúztuk , majd fenol/kloroform extrakcióval és etanol precipitációval nagy molekulatömegü DNS-t állítottunk elő. Az NP plazmid-DNS izomban való jelenlétének kimutatására 40 ciklusból álló PCR-reakciót végeztünk (a PCR-reakciót a Perkin Elmer Cetus GENAMP™ reagenskészlet előírásai szerint végeztük). A promóter régióban hibridizálódó, 18 bázisból álló szensz-oligonukleotid (GTGTGCACCTCAAGCTGG, 1. azonosítószámú szekvencia), valamint az inszertált NP-szekvencia 5’-irányú részének belsejében hibridizálódó, 23 bázis hosszúságú antiszensz láncindító oligonukleotid (CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC, 2. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával, a CMV-promótertől kezdődő és az inszertált NP-gén 5’-régiójának nagy részét átfedő, 772 bázispár hosszúságú PCRterméket állítottunk elő (nyíllal jelölve). Az etidium-bromiddal megfestett agarózgélen a 772 bázispár hosszúságú PCR-termék látható az NP DNS-sel injektált válogatott izommintákon, de nem látható az üres vektonal injektált kontroll mintán (600L). A jelölés mindegyik csík felett az egerek azonosítószámát, valamint a jobb vagy bal lábat jelenti.

··« ···· il

-16A 2. ábra NP-ellenanyagok termelődését mutatja NP DNS-sel injektált egerekben. Az egereket 0, 3 és 6 hetes korban, mindegyik lábba, 100 pg VI-NP DNS-sel injektáltuk, 0, 2, 5 és 8 hét elteltével vért vettünk. A szérumban az anti-NP IgG jelenlétét ELISA-eljárással [J.J. Donnely és mtsai.: J. Immunoi. 145, 3071 (1990)], baculovírus expressziós vektorral transzfektált rovarsejtekből tisztított NP alkalmazásával mutattuk ki. Az eredményeket az első NP-DNS injektálástól eltelt idővel szemben, átlagos loglO ELISA-titerekként ábrázoltuk (+/- átlagos standard hibaszórás; SEM) (n = 10). Az üres (inszertet nem tartalmazó) vektorral immunizált egerekben nem termelődött kimutatható mennyiségű NP-ellenanyag.

A 3. ábra DNS-sel immunizált egerekből nyert CTL-k alkalmazásával, a 4 óra alatt történő ⁵¹CR-kibocsátás alapján meghatározott specifikus lizálódást szemlélteti százalékban megadva. Az egereket 400 pg VI-NP DNS-sel (satírozott körök) vagy üres vektorral (satírozott négyzetek) immunizáltuk és 3-4 héttel később leöltük őket. Negatív kontrollként szolgáló CTL-kat influenzavírussal nem találkozott egérből nyertünk (üres háromszögek), pozitív kontrollként szolgáló CTL-kat négy héttel korábban A/HK/68vírussal fertőzött egérből nyertünk (satírozott háromszögek). A grafikonokon egyetlen egérre vonatkozó adatokat ábrázoltunk a szemléltetés kedvéért. Valamennyi kísérleti feltétel mellett legalább nyolc egeret vizsgáltunk. A

3.A ábra olyan rövid ideig NP147-155-kezelt, autológ lépsejtekkel ismételten stimulált lépsejtek alkalmazásával kapott eredményeket mutat, melyeket rövid ideig NP147-155-kezelt P815-sejtekkel szemben vizsgáltunk. A 3.B. ábra olyan rövid ideig NP147-155-kezelt, autológ lépsejtekkel ismételten stimulált lépsejtek alkalmazásával kapott eredményeket mutat, melyeket a CTL-k hozzáadását megelőzően 6 órával influenza A/Victoria/73 (H3N2) vírussal fertőzött P815-célsejtekkel szemben vizsgáltunk. A 3.C ábra antigén hozzáadása nélkül, ConA-val és IL-2-vel stimulált lépsejtekkel kapott ered-

- 17ményeket mutat, melyeket rövid ideig NP147-155-kezelt P815-sejtekkel szemben vizsgáltunk. A 3.D. ábrán három hetes időközönként, három alkalommal, egyenként 200 pg VI-NP DNS-sel injektált egerekben kapott eredményeket mutatunk be. A lépeket az utolsó immunizálást követően három héttel kivettük, a lépsejteket 7 napig, IL-2 és ConA jelenlétében tenyésztettük és a CTL-kat A/Victoria/73 vírussal fertőzött P815-célsejtekkel szemben vizsgáltuk.

A 4. ábra DNS-sel immunizált egerek testtömeg-vesztését (grammban megadva) és felgyógyulását mutatja anesztézia nélkül alkalmazott 10⁴ TCID50 Α/ΗΚ/68-vírussal orron át történő kísérletes fertőzést követően. Az egereket három hetes időközökben, három alkalommal VI-NP DNS-sel vagy üres (inszertet nem tartalmazó) vektorral injektáltuk vagy egyáltalán nem injektáltuk és az utolsó immunizálást követően három héttel kísérletesen fertőztük. A kísérletes fertőzés napján és a 4. naptól fogva naponta meghatároztuk az NP DNS-sel injektált (satírozott körök), üres vektor-kontroli (üres háromszögek), és nem injektált (üres körök), egyenként 10 egérből álló csoportok testtömegét. Az átlagos testtömegeket ábrázoltuk +/- átlagos standard hibaszórással (SEM). Az NP DNS-sel injektált egereknél a 8-13. nap között t-próba alapján szignifikánsan kisebb testtömeg-vesztést tapasztaltunk, mint az üres vektorral injektált (p<= 0, 005) és a nem injektált egereknél (p<= 0, 001). A két kontroll között nem volt szignifikáns eltérés kimutatható (a t-próba alapján p = 0,8).

Az 5. ábra DNS-sel immunizált egerek túlélési arányát mutatja (anesztéziában) végzett 10^2,5 TCID₅₀ Α/ΗΚ/68-vírussal orron át történő kísérletes fertőzést követően. Az egereket három hetes időközökben, három alkalommal VI-NP DNS-sel (satírozott körök) vagy üres vektorral (üres körök) injektáltuk vagy egyáltalán nem injektáltuk (üres háromszögek) és az utolsó immunizálást követően három héttel kísérletesen fertőztük. 9-10

-18egérböl álló csoportok százalékos túlélési arányát ábrázoltuk. Az NP DNSsel injektált egerek túlélési aránya szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontrolioké (χ²-próba alapján p= 0,0004), míg az üres vektorral injektált és nem injektált egerek között nem volt szignifikáns eltérés kimutatható (x²-próba alapján p= 0,17).

A 6. ábra a VIJ expressziós vektor szekvenciáját mutatja (10. azonosítószámú szekvencia).

A 7. ábra a VIJneo expressziós vektor szekvenciáját mutatja (18. azonosítószámú szekvencia).

A 8. ábra a CMVintA-BGH promóter-terminátor szekvenciát mutatja (11. azonosítószámú szekvencia).

A 9. ábra az anti-NP ellenanyagok alakulását mutatja majmokban.

A 10. ábra vadászmenyétekben végzett hemagglutunáció-gátlási vizsgálat eredményeit mutatja, a pontozott vonal a védettséghez szükséges minimális ellenanyagtitert jelzi, az átlagértéket áthúzott karikával jelöltük.

All. ábra vadászmenyétekben DNS-immunizálást követően meghatározott anti-NP IgG-ellenanyagok szintjét mutatja.

A 12. ábra vadászmenyétekben DNS-immunizálást követően vagy anélkül az influenzavírus-szóródás mértékét szemlélteti.

A 13. ábra a pRSV-PR-NP- és VI-NP-vektorok diagrammját ábrázolja. X az inszertált kódoló régiót jelöli.

A 14. ábra az influenza proteineket és törzseket szemlélteti sematikusan.

A 15. ábra az injektált DNS sejten belüli feldolgozódását (“processing”) szemlélteti sematikusan.

A 16. ábra HA- és belső protein-génekkel immunizált vadászmenyétek influenza-A/RP/8/34 törzzsel szembeni rezisztenciáját mutatja.

A 17. ábrán a VlJns-vektort ábrázoltuk sematikusan.

il ·«: ·’··. :.. *' ·♦· ··*«·«*

- 19Α 18. ábra afrikai zöldmajmokat injektáltunk olyan DNS-koktéllal, amely HA-DNS-t (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texas/91), NP-DNS-t (A/PR/34) és Ml-DNS-t (A/PR/34) tartalmazott. Mindegyik összetevőt 10 gg (sötét négyzetek) vagy 100 gg (sötét karikák) mennyiségben, hat hetes időközzel, két alkalommal adtunk be (lásd a nyilakat). Összehasonlításul, más állatokat szubviriont (üres négyzetek) vagy teljes viriont (üres karikák) tartalmazó engedélyezett vakcinával injektáltunk a teljes humán dózis alkalmazásával (45 gg proteinnek megfelelő mennyiséggel; 15 gg HA). 18 héten át, két hetente szérummintákat gyűjtöttünk és azokban az A/Beijing/89 HA-nal szemben meghatároztuk a HI-titert. Az adatokat a HI-titerek mértani középarányosaként adtuk meg, +/- átlagos standard hibaszórás (SEM), ahol n=3.

A 19. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Nőstény (4-6 hetes korú) BALB/c-egereket A/PR/34 NP-DNS-sel injektáltunk (200 gg) három hetes időközökben, három alkalommal. Negatív kontrollokként kontrollDNS-sel (200 gg) és rekombináns NP-proteinnel (10 gg) oltott egereket, valamint nem injektált, influenzavírussal nem találkozott (ál-immunizált) egereket alkalmaztunk. Összehasonlításképp, Α/ΗΚ/68-influenzavírussal fertőzött egereket is vizsgáltunk. Az első dózist követően 6 hónappal CTLkat nyertünk, azokat in vitro szingén lépsejtekkel újból stimuláltuk és rövid ideig NP-peptiddel kezelt P815-sejtekkel szemben vizsgáltuk 10:1 eífektorsejt: célsejt arány mellett. Az adatok specifikus lizálódást jelentenek %-ban megadva, ahol n=3.

A 20. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. C3H/HeNegereket injektáltunk normális CiC^-mioblasztokkal (lxlO⁷ sejttel), rekombináns NP-proteinnel (2 pg) vagy NP-nel transzfektált mioblasztokkal (lxlO⁷ sejttel). Az NP-protein mennyisége elegendő volt ahhoz, hogy ellenanyag-választ váltson ki és az körülbelül 100-szor nagyobb volt, mint a

-20transzplantált NP-nel transzfektált mioblasztokban található NP mennyisége. A kezelést követően hat héttel a fenti egerekből CTL-kat nyertünk és azokat in vitro szingén lépsejtekkel újból stimuláltuk. Pozitív kontrollként Α/ΗΚ/68-influenzavírussal fertőzött egerekből nyert CTL-kat használtunk. Célsejtekként kezeletlen (sötét oszlopok), A/Victoria/73-influenzavírussal fertőzött (csíkozott oszlopok) és NP-nel transzfektált mioblasztokat alkalmaztunk 25:1 effektorsejt : célsejt arány mellett. Az adatok specifikus lizálódást jelentenek %-ban megadva (+/- átlagos standard hibaszórás), ahol n=3.

A 21. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Négy hetes korú nőstény BALB/c-egereket immunizáltunk izomba adva 200 gg NP-DNS-sel három hetes időközökben, három alkalommal. Az egereket a harmadik immunizálást követően 3 héttel, anesztézia mellett, 300 TCID50 A/HK/68vírussal kísérletesen fertőztük (a teljes légúti rendszer kísérletes fertőzése). A kísérletes fertőzéstől eltelt idővel szemben ábrázoltuk a túlélő egerek arányát (csoportonként 10 egeret használtunk).

A 22. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Négy hetes korú nőstény BALB/c-egereket immunizáltunk izomba adva, 100 gg NP-DNSsel, három hetes időközökben, három alkalommal. Az egereket a harmadik immunizálást követően 3 héttel, anesztézia mellett, 300 TCID₅₀ A/HK/68vírussal kísérletesen fertőztük (a teljes légúti rendszer kísérletes fertőzése). Az egerek testtömegét naponta lemértük és valamennyi túlélő egér esetében kiszámítottuk a testtömegnek kiindulási testtömeghez viszonyított arányát. A kísérletes fertőzést követően eltelt idővel szemben ábrázoltuk az átlagos testtömegnek a kiindulási testtömeghez viszonyított százalékos arányát (+/átlagos standard hibaszórás; +/-SEM).

A 23. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Négy hetes korú nőstény BALB/c-egereket immunizáltunk izomba adva 200 gg NP-DNS-sel, ♦ · ···«

-21 három hetes időközökben, három alkalommal. Az egereket a harmadik immunizálást követően 3 héttel, anesztézia nélkül, 2000 TCID50 A/HK/68vírussal kísérletesen fertőztük (a felső légutak kísérletes fertőzése). A kísérletes fertőzést követően 7 nappal az egereket fájdalommentesen leöltük, a tüdőket eltávolítottuk és homogenizáltuk, majd MDCK-sejteken végzett sorozathigításos titrálással a vírustitereket meghatároztuk.

A 24. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Négy hetes korú nőstény BALB/c-egereket immunizáltunk izomba adva 6,25, 25, 100, vagy 200 pg NP-DNS-sel három hetes időközökben, három alkalommal. Az egereket a harmadik immunizálást követően 3 héttel, anesztézia mellett, 300 TCID50 Α/ΗΚ/68-vírussal kísérletesen fertőztük (a teljes légúti rendszer kísérletes fertőzése). A kísérletes fertőzéstől eltelt idővel szemben ábrázoltuk a túlélő egerek arányát (csoportonként 10 egeret használtunk).

A 25. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Négy hetes korú nőstény BALB/c-egereket immunizáltunk három hetes időközökben, három alkalommal izomba adva 200 pg A/PR/34 NP-DNS-sel, kontroll-DNS-sel vagy az egereket “ál-injektáltuk”. Ezt követően, az egereket harmadik DNSinjektálást követően 6, 12 vagy 25 héttel, anesztézia mellett, 300 TCID50 Α/ΗΚ/68-vírussal kísérletesen fertőztük. Kiválasztott egereket a 22. héten 200 pg NP-DNS-sel újból immunizáltunk (emlékeztető oltásban részesítettünk), majd a 25. héten kísérletesen fertőztünk. Mindegyik csoport esetében megadtuk az átlagos testtömegnek a kiindulási össz-testtömeg százalékában kifejezett értékét. Kontroll testtömegekként a 6., 12. és 25. héten végzett kísérletes fertőzéshez tartozó valamennyi kontroli-csoport, azaz összesen 6 csoport testtömegének átlagát ábrázoltuk, mely csoportok kontroll-DNS-t kaptak vagy “ál-injektáltak” voltak. Valamennyi csoport kezdetben 10 állatot tartalmazott; az egereket pusztulást követően a további testtömeganalízisből kizártuk.

- 22 »’*. !*” ·· ···« ......... ί·. .....·

A 26. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Felnőtt (22-28 hetes korú) hím vadászmenyéteket immunizáltunk a 0. és 42. napon, izomba adva, 1 mg A/Beijing/89-törzsből származó NP-t kódoló DNS-sel, 1 mg A/Beijing/89-törzsből származó Ml-et kódoló DNS-sel, valamint mindkét DNS kombinációját tartalmazó 1 mg DNS-sel. Kontroll vadászmenyétek a 0. és 42. napon nem kódoló DNS-t vagy az engedélyezett, A/Beijing/89törzsből származó teljes vírust tartalmazó influenza-vakcinát kaptak a teljes humán dózisnak (15 pg/törzs) megfelelő mennyiségben. A vadászmenyéteket az 56. napon A/Georgia/93-törzzseI kísérletesen fertőztük. Az orr mosófolyadékában a fent leírtak szerint meghatároztuk a vírusszóródás mértékét. Az orr mosófolyadékában a 3-5. napokon meghatározott vírusszóródás mértékét kétdimenziós varianciaanalízissel összehasonlítottuk a kontrollDNS-t kapott vadászmenyétekben meghatározott vírusszóródással. Az NPDNS-t, Ml-DNS-t vagy NP+Ml-DNS-t kapott vadászmenyétekben a vírusszóródás szignifikánsan alacsonyabb volt (p < 0,0001, 0,0016 és < 0,0001), mint a kontroll vadászmenyétekben mért vírusszóródás. Az NP-t (az adatokat nem tüntettük fel), Ml-et vagy NP+Ml-et kapott vadászmenyétekben mért vírusszóródás mértéke nem tért el szignifikánsan az engedélyezett vakcinát kapott vadászmenyétek esetében mért értéktől (p=0,104, 0,533 és 0,145). Az 1 mg immunizációs dózist önkényesen választottuk; különböző dózisok hatását nem-humán főemlősökben vizsgáltuk.

A 27. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Egyenként nyolc hím vadászmenyétből álló csoportokat kontroll-DNS-sel, fiziológiás sóoldattal vagy influenza-A/PR/8/34-proteint kódoló DNS-sel immunizáltunk a 0.,

21. és 121. napokon izomba adva, majd azokat a 148. napon orron át, 200 TCIDso-nek megfelelő A/PR/8/34-gyel kísérletesen fertőztük. Az immunizált állatok 1 mg NP-DNS-t vagy 2 mg NP-, NS1-, PB1-, PB2- és Ml-DNS kombinációt (valamennyi konstrukcióból 400 pg-ot) kaptak. A kontrollok :··· .·*. ....

......... ·«, ·· ···’ ..·

-23lábanként 0,5 ml fiziológiás sóoldatot vagy 1 mg kontroll-DNS-t kaptak. Az analízis céljából a fiziológiás sóoldatot és kontroll-DNS-t kapott csoportok (“kontrollok”), valamint a csak NP-DNS-sel vagy annak más belső proteingénekkel történő kombinációjával oltott csoportok (“belső”) eredményeit összesítettük. A grafikon 3 ml orr-mosófolyadék 50 μΐ térfogatában meghatározott fertőző vírustitert mutat TCIDso-ben megadva. A hígítatlan mosófolyadékról (a legalacsonyabb vizsgált hígításról) feltételeztük, hogy az az eredeti orrváladék 1:10 hígításának felel meg és egy pozitív hígítatlan mintát lóg 1-értéknek vettünk. A logl feletti titereket három replikátumból a ReedMuench interpoláció alapján határoztuk meg, hogy az 50 %-os fertőzési végpontot megkapjuk. A hígítás nélkül negatívnak bizonyult mintákat logOértéknek vettük. A grafikonon ábrázolt p-értékeket a jelzett napokon két mintás T-próbával számítottuk ki a kontrollal szemben az immunizált vadászmeny étekre. A teljes görbére vonatkozó p-értékeket két dimenziós varancia-analízissel számítottuk ki és az NP versus kontroll esetében <0,0001 értéket, a kombinált DNS versus kontroll esetében <0,001 értéket kaptunk.

A 28. ábra DNS-sel immunizált, majd kísérletesen fertőzött egerek túlélési arányát mutatja. Az egereket A/PR34-böl származó HA-t kódoló 200 gg DNS-sel vagy kontroll-DNS-sel (nem kódoló DNS-sel) immunizáltuk izomba adva, három hetes időközökben, három alkalommal. Az utolsó immunizálást követően 3 héttel az egerek teljes légúti rendszerét 1000 TCID50 A/PR/34-vírussal kísérletesen fertőztük (orron át történő instillációval, anesztézia mellett). A kísérletes fertőzést követően eltelt idővel szemben ábrázoltuk a százalékos túlélési arányt (n= 9-10 egérből álló csoportokat alkalmaztunk).

A 29. ábrán DNS-sel immunizált, majd kísérletesen fertőzött egerek testtömeg-vesztését szemléltetjük. Az egereket 200 gg, A/PR34-ből szárma·’\ :··· .*». ···· ·· ··· «.*

-24ζ,ύ HA-t kódoló DN3-scl vagy kvntroll-DNS-scl (nem kódoló DNS-scl) immunizáltuk izomba adva, három hetes időközökben, három alkalommal. Az utolsó immunizálást követően 3 héttel, az egerek teljes légúti rendszerét 1000 TCID50 A/PR/34-vírussal kísérletesen fertőztük (orron át történő instillációval, anesztézia mellett). A csoportok esetében átlagolva ábrázoltuk az eltelt idővel szemben az egyes állatok testtömegének a kiindulási testtömeghez viszonyított százalékos arányát. (Az elpusztult állatokat az átlagolásból kizártuk.)

A 30. ábra DNS-sel immunizált, majd kísérletesen fertőzött egerek túlélési arányát mutatja. Az egereket 1,10 vagy 100 pg, A/PR34-ből származó HA-t kódoló DNS-sel vagy kontroll-DNS-sel (nem kódoló DNS-sel) immunizáltuk izomba adva, három hetes időközökben, három alkalommal. Az utolsó immunizálást követően 3 héttel az egerek teljes légúti rendszerét 1000 TCID50 A/PR/34-vírussal kísérletesen fertőztük (orron át történő instillációval, anesztézia mellett). A kísérletes fertőzést követően eltelt idővel szemben ábrázoltuk a százalékos túlélési arányt (n= 9-10 egérből álló csoportokat alkalmaztunk).

A 31. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Egyenként nyolc hím vadászmenyétből álló csoportokat a 0., 21. és 121. napokon kontrollDNS-sel, fiziológiás sóoldattal vagy influenza-A/PR/8/34-proteint kódoló DNS-sel immunizáltunk izomba adva, majd azokat a 148. napon orron át, 200 TCID₅o-nek megfelelő A/PR/8/34-gyel kísérletesen fertőztük. Az immunizált állatok 1 mg HA-DNS-t vagy 2 mg HA-, NP-, NS1-, PB1-, PB2- és Ml-DNS kombinációt (valamennyi konstrukcióból 330 pg-ot) kaptak. A kontrollokat lábanként 0,5 ml fiziológiás sóoldattal vagy 1 mg kontrollDNS-sel oltottuk. Az analízis céljából a fiziológiás sóoldatot és kontrollDNS-t kapott csoportok (kontrollok) eredményeit, valamint a csak HADNS-t vagy annak más belső protein-génekkel történő kombinációját kapott

-25 csoportok (HA, HA+belsö) eredményeit összesítettük. A grafikonon 3 ml orr-mosófolyadék 50 μΐ térfogatában meghatározott fertőző vírustitert ábrázoltunk TCID₅₀-ben megadva. A hígítatlan mosófolyadékról (a legalacsonyabb vizsgált hígításról) feltételeztük, hogy az az eredeti orrváladék 1:10 hígításának felel meg és egy pozitív hígítatlan mintát logl-értéknek vettünk. A logl feletti titereket három replikátumból a Reed-Muench interpoláció alapján határoztuk meg, hogy az 50 %-os fertőzési végpontot megkapjuk. A hígítás nélkül negatívnak bizonyult mintákat logO-értéknek vettük. A teljes görbére vonatkozó p-értékeket két dimenziós varancia-analízissel számítottuk ki és az NP versus kontroll esetében <0,0001 értéket, a kombinált DNS versus kontroll esetében <0,0001 értéket kaptunk.

A 32. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Felnőtt (22-28 hetes korú) hím vadászmenyéteket immunizáltunk a 0. és 42. napon, izomba adva 1 mg A/Georgia/93-törzsböl származó HA-t kódoló DNS-sel. Kontroll vadászmenyétek a 0. és 42. napon nem kódoló DNS-t vagy az engedélyezett, A/Beijing/89-törzsből származó teljes vírust tartalmazó influenzavakcinát kaptak a teljes humán dózisnak (15 gg/törzs) megfelelő mennyiségben. A vadászmenyéteket az 56. napon A/Georgia/93-törzzsel kísérletesen fertőztük. Az orr mosófolyadékából a fent leírtak szerint meghatároztuk a vírusszóródás mértékét. Az orr mosófolyadékában az 1-6. napokon meghatározott vírusszóródást kétdimenziós varianciaanalízissel összehasonlítottuk a kontroll-DNS-t kapott vadászmenyétekben meghatározott vírusszóródás mértékével. A HA-DNS-t kapott vadászmenyétekben a vírusszóródás mértéke szignifikánsan alacsonyabb volt (p < 0,0001), mint a kontroll vadászmenyétekben mért vírusszóródás.

A 33. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Felnőtt (22-28 hetes korú) hím vadászmenyéteket a 0. és 42. napon 1 mg A/Hawaii/91törzsből vagy A/Beijing/89-törzsből származó HA-t kódoló DNS-sel immu-26nizáltunk izomba adva. Kontroll vadászmenyétek a 0. és 42. napon nem kódoló DNS-t vagy az A/Beijing/89-törzsből származó teljes vírust tartalmazó engedélyezett influenza-vakcinát (92-93 formulázás) kaptak a teljes humán dózisnak (15 pg/törzs) megfelelő mennyiségben. A vadászmenyéteket az 56. napon A/Georgia/93-törzzsel kísérletesen fertőztük. Az orr mosófolyadékából a fent leírtak szerint meghatároztuk a vírusszóródás mértékét. Az orr mosófolyadékában az 1-6. napokon meghatározott vírusszóródást kétdimenziós varianciaanalízissel összehasonlítottuk a kontroll-DNS-t kapott vadászmenyétekben meghatározott vírusszóródással. Az A/Hawaii/91 HADNS-t kapott vadászmenyétekben a vírusszóródás mértéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az engedélyezett terméket kapott vadászmenyétekben mért vírusszóródás (az A/Hawaii/91 HA-DNS esetében p = 0,021; két dimenziós ANOVA az 1-6. napokra számítva). Az A/Beijing/89 HA-DNS-t (az adatokat nem tüntettük fel) kapott vadászmenyétekben mért vírusszóródás mértéke nem tért el szignifikánsan az engedélyezett terméket kapott vadászmenyétek esetében mért értéktől (p=0,058; két dimenziós ANOVA az 1-6. napokra számítva).

A 34. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Felnőtt (22-28 hetes korú) hím vadászmenyéteket a 0. és 42. napon 1 mg A/Hawaii/91 törzsből származó HA-t kódoló DNS-sel vagy egyenként 330 pg A/Hawaii/91-törzsből származó HA-t kódoló DNS-sel, valamint A/Beijing/89-törzsből számlázó NP-t és Ml-et kódoló DNS-sel immunizáltunk izomba adva. Kontroll vadászmenyétek a 0. és 42. napon nem kódoló DNS-t vagy az A/Beijing/89-törzsből származó teljes vírust tartalmazó engedélyezett influenza-vakcinát (92-93 formulázás) kaptak a teljes humán dózisnak (15 pg/törzs) megfelelő mennyiségben. A vadászmenyéteket az 56. napon A/Georgia/93-törzzsel kísérletesen fertőztük. Az orr mosófolyadékából a fent leírtak szerint meghatároztuk a vírusszóródás mértékét. Az orr mosófolyadékában a 1-6. napokon meghatározott vírusszóródást kétdimenziós varianciaanalízissel összehasonlítottuk a kontroll-DNS-t kapott vadászmenyétekben meghatározott vírusszóródással. A HA+NP+M1 DNS-t kapott vadászmenyétekben a vírusszóródás mértéke szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az engedélyezett terméket kapott (p<0,0001) vagy csak HA-DNS-t (p=0,0053) kapott vadászmenyétekben mért vírusszóródás mértéke.

A 35. ábra az alábbi kísérlet eredményeit szemlélteti. Felnőtt (22-28 hetes korú) hím vadászmenyéteket a 0. és 42. napon 1 mg A/Georgia/93törzsből származó HA-t kódoló DNS-sel vagy egyenként 330 pg A/Hawaii/91 -törzsből származó HA-t kódoló DNS-sel, valamint A/Beijing/89-törzsből származó NP-t és Ml-et kódoló DNS-sel immunizáltunk izomba adva. Kontroll vadászmenyétek a 0. és 42. napon nem kódoló DNS-t vagy az A/Beijing/89-törzsből származó teljes vírust tartalmazó engedélyezett influenza-vakcinát (92-93 formulázás) kaptak a teljes humán dózisnak (15 pg/törzs) megfelelő mennyiségben. A vadászmenyéteket az 56. napon A/Georgia/93-törzzsel kísérletesen fertőztük. Az orr mosófolyadékából a fent leírtak szerint meghatároztuk a vírusszóródás mértékét. Az orr mosófolyadékában a 1-6. napokon meghatározott vírusszóródást kétdimenziós varianciaanalízissel összehasonlítottuk a kontroll-DNS-t kapott vadászmenyétekben meghatározott vírusszóródással. A HA+NP+M1 DNS-t kapott vadászmenyétekben a vírusszóródás mértéke nem tért el szignifikánsan a homológ HA-DNS-t kapott vadászmenyétekben mért vírusszóródás mértékétől (p=0,064).

A 36. ábra a V1R szekvenciáját mutatja.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány tárgyát képezik nukleinsav-tartalmú gyógyászati készítmények, melyek közvetlenül állatokba, például gerincesekbe, mint például em-28lősökbe és emberbe juttatva, azokban az általuk kódolt protein expresszálódását eredményezik. Amennyiben a protein az adott állatban normális körülmények között nem, csak kóros állapotokban fordul elő, mint például az influenzavírussal kapcsolódó proteinek, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - az influenza-nukleoprotein, neuraminidáz, -hemagglutmin, -polüneráz, -mátrix vagy nem strukturális proteinek, az állat immunrendszere aktiválódik és védettséget eredményező válaszreakció indul meg. Mivel ezek az exogén proteinek az állat saját szöveteiben termelődnek, az expresszálódott proteinek érési folyamaton (“processingen”) mennek át és a fő hisztokompatibilitási komplex, az MHC prezentálja őket. Ez a felismerési folyamat megfelel a szóbanforgó organizmussal történő fertőzéskor végbemenő folyamatnak. Az eredmény, amint az a leírásból kitűnik, a virulens fertőzéssel szemben védettséget eredményező immunválasz létrejötte.

A találmány tárgyát olyan nukleinsavak képezik, melyek injektálással, inhalációval, vagy egy megfelelő bejuttatási móddal (lásd fent) in vivő állati szövetekbe juttatva humán influenzavírus-géntermék expresszálódását eredményezik. Például a találmány szerinti DNS-konstrukciók injektálása egerek izomszövetébe a kódolt géntermékek expresszálódásához vezet. Hasonlóképp történik vadászmenyétekben és Rhesus-majmokban is. Egy későbbi, a kontroll állatokat egységesen elpusztító dózisban alkalmazott virulens influenzavírussal történő kísérletes fertőzést követően a polinukleotidvakcinával injektált állatok esetében lényegesen csökkent morbiditást és mortalitást tapasztaltunk. A találmány tárgyát képezi tehát egy influenzavírussal történő fertőzés megelőzésére alkalmas, emberben alkalmazható vakcina.

Kimutattuk, hogy influenza-vírusproteineket kódoló DNS-konstrukciók állatokban védettséggel járó immunválaszt váltanak ki. Amint azt az alábbi-29akban részletesen leírjuk, az állatokban létrehozott immunválasz egérben ellenanyagok és CTL-k keletkezésének kiváltására, vadászmenyétekben és főemlősökben ellenanyagok keletkezésének kiváltására, valamint egerekben és vadászmenyétekben homológ-, valamint antigénszerkezeti módosuláson átment vagy antigénszerkezeti változáson átment influenza-vírustörzsekkel történő kísérletes fertőzéssel szembeni védettség létrehozására vonatkozik. A vírusproteineket kódoló DNS-sel végzett immunizálás talán legmeglepőbb eredménye az volt, hogy védettséget tudtunk létrehozni a vírus különböző altípusaival szemben. Ez arra utal, hogy CTL-k keletkezését kiváltó összetevő hozzáadása a vakcinához csökkentheti az év közben jelentkező új variánsok hatását vagy az olyan variánsok hatását, melyek elterjedését az alkalmazandó vakcinatörzs kiválasztásakor az adott évben nem várták. Figyelemreméltó, hogy a HA-, NP- vagy Ml-gént kódoló cDNS-vektorokkal végzett immunizálással vadászmenyétekben az antigénszerkezeti módosuláson vagy antigénszerkezeti változáson átment vírustörzsekkel szemben sokkal hatékonyabb védettséget tudtunk kiváltani, mint az engedélyezett vakcinával. Ez indokolja belső géneket kódoló konstrukciók alkalmazását a PNV-ban.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a vakcinakészítmény például az A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) és B (B/Panama/90) vírusokat képviselő 3 fő klinikai törzsből származó HA-t kódoló különálló DNS-plazmidokat, valamint az A(A/Beijing/89; H3N2) és B- törzsekből származó belső, nem változékony NP- és Ml- (mátrix-) proteineket kódoló DNS-konstrukciókat tartalmaz, hogy az antigénszerkezeti módosuláson vagy antigénszerkezeti változáson átment vírustörzsekkel szemben csoport-specifikus védettséget hozzunk létre. A HA-DNS-ek HA keletkezéséhez vezetnek és HA elleni neutralizáló ellenanyagok termelődését váltják ki. Ez a védettség típus-specifikus és a jelenleg alkalmazott, engedélyezett protein-alapú vakcinával összehasonlítva • · · ·

-30az antigénszerkezeti módosuláson átment törzsekkel szemben valamivel szélesebb körű védettséget jelent. Az NP- és Ml-konstrukciók a törzsek közötti keresztvédettséget létrehozó CTL-k keletkezéséhez vezetnek, mely valószínűleg alacsonyabb vírusterhelést és a betegségből történő gyorsabb felgyógyulást eredményez. A DNS-konstrukciók várhatóan tartós jelenléte (az izomsejtekben episzómális, nem replikálódó, nem integrálódó formában) a jelenleg alkalmazott vakcinákkal szemben a védettség tartamának várható növekedését teszi lehetővé.

A jelenleg alkalmazott, engedélyezett vakcinákkal szemben várható előnyök az alábbiak; a CTL-válasz + a szélesebb körű ellenanyagválasz következtében szélesebb körű, valamint hosszabb ideig tartó védettség jön létre. A PNV alkalmazása szükségtelenné teszi az átrendeződésen átment törzsek előállítását, kiválasztását és szaporítását, ami a jelenleg alkalmazott, engedélyezett vakcinák esetében történik, mivel egy új DNS-konstrukció sokkal közvetlenebb módon előállítható a klinikai tüneteket okozó mezei izolátumból.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az A/PR/8/34törzsből származó humán influenzavírus nukleoprotein-, azaz NPszekvenciát egy expressziós vektorba klónozzuk. A vektor tartalmaz egy, az RNS-polimeráz transzkripcióhoz szükséges promótert, valamint az NP-t kódoló szekvencia végén egy transzkripciós terminátort. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a promóter a Rous-szarkóma vírus (RSV) hosszú terminális ismétlődése (LTR), amely erős transzkripciós promóter. A találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, a promóter az intron-A szekvenciát (CMV-intA) tartalmazó citomegalovírus promóter. A találmány szerinti előnyös transzkripciós terminátor a szarvasmarha növekedési hormon terminátor. Különösen előnyös a CMV-intA-BGH-terminátor kombináció alkalmazása. Ezenkívül, az expressziós vektor előnyösen a ll ........

-31 gyógyászati készítmény előállítását elősegítő antibiotikumrezisztenciamarkert is tartalmaz. Alkalmazhatók ampicillinrezisztenciagének, neomycin-rezisztencíagének, vagy bármely gyógyászatilag elfogadható antibiotikum-rezisztenciamarker. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az antibiotikum-rezisztenciagén neomycinrezisztenciát létrehozó géntennéket kódol. A gyógyászati készítménynek prokarióta organizmusokban végzett fermentációval, nagy mennyiségben történő előállítása szempontjából előnyös továbbá, ha a vektor egy replikációs origót is tartalmaz és nagy kópiaszámban van jelen. Számos, kereskedelemben hozzáférhető prokarióta klónozó-vektor rendelkezik a fenti előnyös tulajdonságokkal. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, ezeket a sajátságokat a kereskedelemben hozzáférhető pUCplazmidvektor szolgáltatja. Kívánatos a nem esszenciális DNS-szekvenciák eltávolítása. A találmány egy megvalósítási módja szerint tehát, a pUCplazmidból a lacZ- és /ací-kódoló szekvenciákat eltávolítottuk.

A találmány egy megvalósítási módja szerint, a pnRSV expressziós vektort alkalmazzuk, melyben a Rous-szarkóma vírus (RSV) hosszú terminális ismétlődése (LTR) alkotja a promótert. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, a VI-vektort alkalmazzuk, amely egy olyan mutációt hordozó pBR322-vektor, melybe a CMV-promótert és a BGH transzkripciós terminátort klónoztuk. A Vl-NP-konstrukciót alkalmaztuk egerekben immunizálásra és heterológ kísérletes fertőzéssel szemben védettséget létrehozó CTL-k keletkezésének kiváltására. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a VI-vektor elemeinek felhasználásával a V1J expressziós vektort állítottuk elő. A VIJ-vektorba egy influenzavírusból származó gént, például az A/PR/8/34-törzs NP-, PB1-, NS1-, HA-, PB2- vagy Ml-génjét klónoztuk. A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a VI J-vektorból az ampicillin-rezisztenciagént eltávolítót··* · • « · « il ·· .......

-32tuk és azt egy neomycin-rezisztenciagénnel helyettesítettük, így kaptuk a VIJ-neo-vektort (18. azonosítószámú szekvencia, 7. ábra), melybe a találmány szerinti alkalmazás céljából több különböző influenzavírus-gént klónoztunk. A találmány egy további megvalósítási módja szerint, a VlJnsvektort alkalmaztuk, amely megegyezik a VIJ-vektorral, azzal az eltéréssel, hogy a VIJ-neo-vektorba génsebészeti eljárással a 2114. pozícióban található egyedi KpnI hasítási helyre egy egyedi Stíl restrikciós helyet iktattunk be. A humán genomi DNS-ben a Stíl hasítási helyek előfordulási aránya nagyon kicsi (körülbelül 1 hasítási hely jut 100 000 bázisra). Ez a vektor tehát egyszerűen az extrahált genomi DNS Sfíl-enzimmel végzett emésztésével lehetővé teszi az expressziós vektor gazda-DNS-be történő beépülésének pontos figyelemmel követését. Egy további finomítás szerint, a V1R expressziós vektort alkalmazzuk. Ebből a vektorból annyi nem esszenciális DNS-t távolítottunk el, amennyi csak lehetséges, hogy egy igen “kompakt” vektort kapjunk. Ez a vektor a VIJns származéka, melyet a 36. ábrán mutatunk be (45. azonosítószámú szekvencia). A fenti vektor nagyobb méretű inszertek alkalmazását teszi lehetővé, anélkül, hogy nem kívánt szekvenciák is kódolódnának és optimalizálja a környező szövetekbe juttatott specifikus influenzavírus-géneket kódoló konstrukcióknak a sejtek által történő felvételét. A 36. ábrán a VIJneo (lásd, 7. ábra) deletált részét kihagyással, az inszertált szekvenciát vastag betűvel jelöltük, de a VIJneo-plazmid szerinti számozást nem változtattuk meg. A fenti vektor-módosításokat és a vektorok kifejlesztését szakember számára jól ismert eljárásokkal végezhetjük. A leírt termékek azonban, bár azokat szokásos módszerekkel állítottuk elő, különösen alkalmasak az adott célra, melyre kifejlesztettük őket.

Bár a találmány egyik megvalósítási módja szerint, az A/PR/8/34törzsből származó NP-gént alkalmaztuk, a találmány egy előnyösebb megvalósítási módja szerint, egy újabb influenzavírus izolátumokból származó NP-33gént, HA-gént, NA-gént, PB-gént, M-gént vagy NS-gént alkalmazunk. Ezt oly módon valósíthatjuk meg, hogy a vírusgénekből DNS-kópiákat állítunk elő, majd az egyes géneket szubklónozzuk. Számos influenzavírus-törzs számos génjének szekvenciája mindenki számára hozzáférhető a “GENBANK” adatbázisban (az influenza-A gének esetében körülbelül 509 ilyen szekvencia ismert). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, előnyös tehát az újabb keletű, Texas, Beijing vagy Panama vírusizolátumokból klónozott fenti gének bármelyikének alkalmazása, mely törzsek a Betegségmegelőző Központ (“Center fór Disease Control”) által anti-influenza vakcinák előállítására javasolt törzsek [lásd, a FLUIMMUNE® influenzavírus vakcinát, Lederle: “Physicians Desk Reference”, 1232. oldal (1993); amely olyan tisztított influenza felszíni antigéneket tartalmazó trivalens vakcina, mely az A/Texas/36/91-törzsből (H1N1), az A/Beijing/353/89-törzsből (H3N2) és a B/Panama/45/90-törzsből származó hemagglutinin proteineket tartalmazza). Az elnevezések egyértelmű használata érdekében a DNS-konstrukciók említésénél a leírásban az alábbi használati módot követtük: “vektor neve-influenzatörzs-gén” Tehát egy olyan konstrukció esetében, ahol az A/PR/8/34-törzs NP-génjét a VIJneo expressziós vektorba klónoztuk, az alábbi elnevezést alkalmaztuk: “VI JneoPR-NP” Nyilvánvaló, hogy ha kórokozó vírustörzs megváltozik, a gyógyászati készítményben optimálisan alkalmazandó gén is változhat. Amint azt azonban az alábbiakban bemutatjuk, mivel a találmány szerinti új vakcinák heterológ törzsekkel szemben védettséget létrehozó citotoxikus limfocitaválasz kiváltására képesek, azok esetében a törzsek variabilitása kevésbé lényeges, mint a teljes vírus vagy alegység-polipeptidek alkalmazásán alapuló vakcinák esetében. Továbbá, mivel a gyógyászati készítmény új gének inszertálása céljából könnyen módosítható, azok alkalmazása szokásos mo··«· ·· ·«·· · · • · · · · · ······ ··· ·

Ί · · • · · · · ·· «

-34lekuláris-biológiai eljárásokkal könnyen megvalósítható hozzáigazítást tesz lehetővé.

Mivel a nukleoprotein szekvenciája a különböző influenzatörzsek között állandó, alkalmazásával egy virulens influenza-A-törzzsel végzett későbbi kísérletes fertőzéssel szemben olyan védettséget sikerült létrehozni, amely heterológ jellegű volt ahhoz a törzshöz képest, melyből a nukleopotein-gént klónoztuk. Számos influenza-A-törzsből származó NP összehasonlítása alapján megállapították, hogy másodlagos szerkezetük nem tér el szignifikánsan [M.Gammelin és mtsai.: Virol. 170, 71 (1989)] és aminosav-szekvenciájukban nagyon kevés különbség van [Ο. T. Gorman és mtsai.: J. Virol. 65, 3704 (1991)]. Körülbelül 50 éves időszak során a humán törzsekben található NP szekvenciájában évente csak 0,66 aminosavváltozás jött létre. Továbbá eredményeink szerint, melyek azt mutatták, hogy az Α/ΗΚ/68-specifikus CTL-k felismerik az A/PR/8/34-törzsben található NP szekvenciája alapján előállított NP(147-155) szintetikus pepiiddel kezelt célsejteket, megállapítottuk, hogy ez a H-2K^d-korlátozott CTL-epitóp 34 éven át funkcionálisan intakt maradt (lásd, a 2. ábrát). Meg kell jegyeznünk azt is, hogy amennyiben a gén egy vírus-felszíni antigént, például hemagglutinint vagy esetleg neuraminidázt kódol, a nagyon fontos citotoxikus limfocita-válaszon felül jelentős neutralizáló (ellenanyagok termelődésén alapuló) Immorális immunválasz is létrejön.

Az influenza-A nem változékony, belső proteinjét kódoló DNS expressziós vektor izomba történő injektálása egy későbbi vírusfertőzéssel szemben jelentős mértékű immunvédettséget hozott létre. Közelebbről, NPspecifikus ellenanyagok és elsődleges CTL-k keletkeztek. Az NP-DNS-sel végzett immunizálás a kontrollokhoz képest csökkentette a tüdőben mérhető vírustitereket, gátolta a testtömeg-csökkenést és növelte a túlélési arányt. A védettséget létrehozó immunválaszt nem az NP-specifikus ellenanyagok •·· ···

-35közvetítették, kimutattuk, hogy az NP-ellenanyagok egyedül nem voltak képesek a vírusfertőzés legyőzésére (lásd 4. példa), a védettség tehát valószínűleg NP-specifíkus, sejt által közvetített immunitásnak volt tulajdonítható. Ezenkívül, jelentős mennyiségű NP ellen irányuló elsődleges CTL keletkezett. A védettség olyan virulens influenza-A törzzsel szemben is kimutatható volt, mely heterológ volt ahhoz a törzshöz képest, melyből a DNS-t klónoztuk. Továbbá, a kísérletes fertőzésre használt törzs több mint három évtizeddel később jelentkezett, mint az A/PR/8/34-törzs, ami azt jelenti, hogy nem változékony proteinekkel kiváltott immunválasz a különböző burokproteinek antigénszerkezeti módosulása és antigénszerkezeti változása ellenére hatékony lehet. Mivel valamennyi influenzavírus-géntermék bizonyos mértékű állandóságot mutat, és mivel a sejten belül végbemenő expresszálódás és “MHC-processing” hatására CTL-k keletkezhetnek, megjósolható, hogy más influenzavírus-gének az NP-nel létrehozott válaszhoz hasonló választ váltanak ki. Immunogén epitópok azonosítására szolgáló eljárások a technika állása szerint jól ismertek [lásd például: Shirai és mtsai.: J. Immunoi. 148, 1657 (1992); Choppin és mtsai.: J. Immunoi. 147, 575 (1991); Calin-Laurens és mtsai.: Vaccine U, 974 (1993)]. A fenti gének közül számos gént klónoztunk, amint azt az expressziós vektorban található klónozott és szekvenált kapcsolódási régiók mutatják (lásd az alábbiakban), úgy, hogy ezek a konstrukciók jelenlegi formájukban profílaktikus szerekként alkalmazhatók.

A találmány tárgyát képezik tehát influenzavírus-proteint kódoló, immunogénként alkalmazható expressziós vektorok. A találmány tárgyát képezik továbbá, önállóan replikálódó ágens vagy adjuvánsok alkalmazása nélkül, védettséggel járó, törzsek közti keresztimmunitás létrehozására szolgáló eljárások. A DNS-sel történő immunizálás számos más előnnyel is jár. Először, a fenti vakcinázási eljárás tumorok esetében valamint fertőző ágén• * 9

-36sek esetében is alkalmazható lehet, mivel a CD8⁺CTL-válasz mindkét patofíziológiai folyamatban fontos szerepet játszik [K. Tanaka és mtsai.: Annu. Rév. Immunoi. 6, 359 (1988)]. A transzformációs folyamatban lényeges szerepet játszó proteinnel szembeni immunválasz kiváltása tehát hatékony módszer lehet a tumormegelőzésben vagy a tumorok immunoterápiájában. Másodszor, vírusproteineket (NP-t és hemagglutinint), valamint szarvasmarha növekedési hormont kódoló DNS injektálását követően az expresszált proteinekkel szemben kimutatható magas titerű ellenanyagválasz arra utal, hogy a fenti eljárás könnyen alkalmazható és igen hatékony módszer ellenanyag-válaszon alapuló vakcinák előállítására, egyedül alkalmazva vagy nem változékony antigének ellen irányuló citotoxikus Tlimfociták keletkezésén alapuló vakcinákkal kombinálva.

A DNS-konstrukciók előállítása és tisztítása a hagyományos proteintisztítási eljárásokkal összehasonlítva egyszerűbb, ami megkönnyíti a kombinációs vakcinák előállítását. így több konstrukciót, például NP-t, HA-t, Ml-et, PBl-et, NSl-et vagy bármely más influenzavírus-gént kódoló konstrukciót állíthatunk elő, elegyíthetünk és azokat együtt adhatjuk be. Végül, mivel a DNS-injektálást követően a protein-expresszió fennmarad [H. Lili és mtsai.: Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 4138 (1991); E. Hansen és mtsai.: FEBS Lett. 290, 73 (1991);

S. Jiao és mtsai.: Hűm. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolf és mtsai.: Humán Mól. Génét. 1, 363 (1992)], a B-sejtes és T-sejtes memória tartósabb lehet [D. Gray és P. Matzinger: J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S. Oehen és mtsai.: ibid 176, 1273 (1992)], ezáltal hosszú távú humorális és sejt által közvetített immunitás jöhet létre.

Az engedélyezett influenza-vakcinák jelenlegi hátrányai alaposan indokolják a fertőzés megelőzésére és betegség lefolyásának enyhítésére alkalmazható hatékonyabb eljárások iránti igény jelentkezését. A régebbi vakci• Μ • · · « ·♦ ,*· ·ν·

U

-37nák korlátozott mértékű védettséget hoznak létre, csak néhány válogatott vírustörzzsel szemben hatékonyak és rövid idő elteltével hatékonyságuk csökken. A jelenleg alkalmazott vakcinákat tehát hatékonyságuk fenntartása érdekében az oltáshoz évente újból kell formulázni. Belső proteinekkel szembeni javított CTL-válasz létrehozásával várhatóan olyan jelentős, hosszú távú keresztimmunitás hozható létre, melyet a jelenleg engedélyezett vakcinák nem képesek kiváltani.

PNV-konstrukciók alkalmazásával egerekben, vadászmenyétekben és nem-humán főemlősökben protein-expressziót hoztunk létre, melyet a gazdaszervezetben létrejött, influenza-antigének ellen irányuló immunválasz alapján mutattunk ki. Egerekben az influenza-NP-t kódoló DNS-sel végzett injektálás a DNS-konstrukcióban találhatótól eltérő influenza altípusokkal (antigénszerkezeti változáson átment törzsekkel) történő későbbi fertőzést követően a kontroll állatokhoz képest növelte a túlélési arányt, csökkentette a tüdőben mérhető vírustitereket és gátolta a testtömeg-csökkenést. Ugyancsak megfigyelhető volt NP-DNS-sel beoltott vadászmenyétekben antigénszerkezeti változáson átment törzsekkel történő fertőzést követően a vírusszóródás mértékének csökkenése. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy NP-t kódoló géneket tartalmazó DNS-vakcinával nagymértékű antigénszerkezeti változáson átment influenzatörzsekkel szemben védettség hozható létre. A kísérleti állatok HA-DNS-sel végzett injektálása még nagyobb mértékben csökkentette az antigénszerkezeti módosuláson átment vírustörzsekkel történő fertőzését követően mérhető vírusszóródást. A belső proteint kódoló DNS hozzáadása kis mértékben fokozta a HA önmagában történő injektálását követően megfigyelhető magas fokú védettséget.

Az egerekben az influenza-DNS hatására létrejött immunválaszt az injektálást követően hat hónapig követtük, az ellenanyagszint, a CTL-aktivitás és az in vivő védettség fennmaradása alapján. A DNS ismételt injektálása

-38tovább növelte a 25. héten, egy eltérő altípusú influenzatörzzsel végzett kísérletes fertőzést követően megfigyelhető túlélési arányt, ez azt jelezte, hogy a védettséggel járó, sejt által közvetített immunitás emlékeztető oltással megerősíthető. Afrikai zöldmajmokban két alkalommal végzett HA-DNS injektálást követően az ellenanyagok termelődésének fennmaradását szintén legalább egy éves időszak során igazoltuk, egyetlen HA-DNS injektálást követően pedig legalább kilenc hónapon át.

A fenti állatkísérletek eredményei szerint, DNS közvetlen injektálása emberekben influenza-fertőzéssel és megbetegedéssel szembeni védettség létrehozására alkalmazható javított eljárást képvisel. Megjegyezzük, hogy a DNS-injektálással kísérletesen kiváltott védettséget a vírussal korábban nem találkozott egerek és vadászmenyétek vakcinázásával hoztuk létre. A DNSsel vakcinázandó felnőtt emberek korábban már találkoztak influenzával. Ezek a személyek a DNS-konstrukcióval történő immunizálást követően valószínűleg hosszabb ideig tartó, még erősebb immunválasszal fognak reagálni.

Az alkalmazandó koncentráció optimalizálása céljából összehasonlítottuk különböző dózisok immunogenitását. Kisemlösökben végzett kísérletekben már 1 gg NP-DNS-sel ellenanyag- és CTL-választ sikerült kiváltani. Rhesus-majmok immunizálása során 100 és 1000 gg HA-DNS-dózisok (A/PR/08/34) alkalmazásával két állatból kettőben ellenanyag-válasz volt kimutatható, míg két állat közül egyben egyetlen 10 gg-os injektálás hatására ellenanyag-válasz jött létre. Más kísérletek során, influenzavírussal korábban nem találkozott afrikai zöldmajmokat injektáltunk öt különböző DNS-konstrukció elegyével, melyek három vírus altípusból származó HA-t, valamint influenza-A vírusból származó NP-t és Ml-et kódoltak. Mindegyik csoport esetében az egyes konstrukciókból 10 gg vagy 100 gg mennyiséget tartalmazó vakcinával három majomból háromban immunválaszt tudtunk ki• · · · · • · ♦ ··· »·· «·· • · « il..........

-39váltani. A fenti eredmények alapján, 10, 50, 100 és 200 gg DNS-dózisok alkalmazása várhatóan hatékony lesz emberben.

A fertőzésnek a jelenleg engedélyezett inaktivált vakcinák alkalmazásával történő megelőzése a HA ellen irányuló szérum- és nyálkahártyaellenanyagszintekkel kapcsolatos, de nem függ össze belső influenzaproteinekkel szemben létrejött ellenanyag-válasszal. Az influenza elleni DNSvakcináknak tehát tartalmaznia kell HA-t. Áz NP-re adott immunválasz azonban fokozza a HA-nel szemben létrejövő ellenanyag-választ, és belső influenzaproteinek antigénszerkezetileg eltérő influenzatörzsekkel keresztreakciót eredményező CTL-válasz létrejöttéhez vezetnek. Amint azt a fentiekben említettük, az állatkísérletek szerint belső proteineket, valamint HA-t kódoló DNS-konstrukciókkal történő injektálás fokozott immunogenitást és nagyobb fokú védettséget eredményezett. Belső proteineket kódoló DNSkonstrukciók alkalmazása várhatóan fokozza a DNS-vakcina hatékonyságát emberben. Mivel az alkalmazandó dózisszintek valószínűleg a fenti összetevők kölcsönhatásától függnek, szakember rutinszerűen végzett vizsgálatokkal meghatározhatja a HA-, NP- és Ml-DNS-konstrukciók elegyének előállításához a vakcinában alkalmazandó DNS mennyiségét. A gazdaszervezet által valamennyi fenti összetevőre adott válasz külön-külön meghatározható a HA-összetevőkre adott hemagglutináció-gátlási-titerek (Hl) és neutralizációs titerek, valamint az Ml-, valamint NP-epitópokra létrejött CTL-válasz összehasonlítása alapján. A válaszokat a csak HA-t expresszáló konstrukciók injektálását követően létrejött ellenanyag-válaszokkal hasonlíthatjuk öszsze. A fenti vizsgálatok lehetővé teszik egy HA-t, valamint belső proteineket kódoló DNS-t tartalmazó vakcina alkalmazásával létrehozható fokozott immunválasz értékelését.

A vakcina hatékonyságát emberben olyan önként vállalkozókban mutathatjuk ki, akik először influenza-DNS vakcinázásban részesülnek, majd il

-40akiknél orron át kísérletes fertőzést végzünk, hogy a vakcina hasonló vírustörzsekkel, valamint eltérő altípushoz tartozó influenzatörzsekkel szembeni hatékonyságát igazoljuk. A vakcinázásnál alkalmazott készítmény típusát, a dózisokat és az adagolás menetét a fenti vizsgálatok alapján határozhatjuk meg. A klinikai hatékonyságot a fertőzési ráta, a betegség súlyosságát jelző pontszámok és a betegség tartama alapján ítélhetjük meg. A klinikai tüneteket a gazdaszervezet immunválaszának és a vírusszóródás mértékének laboratóriumi értékelésével hasonlítjuk össze, hogy meghatározzuk a védettség létrejöttével összefüggő, annak jellemzésére alkalmas markereket.

A találmány szerinti DNS-tartalmú gyógyászati készítmények előállíthatok a molekuláris biológiában DNS-konstrukciók előállítására és tisztítására alkalmazott szokásos technikákkal. Míg tehát a molekuláris biológiában alkalmazott szokásos technikák elegendőek a találmány szerinti termékek előállítására, a leírásban ismertetett közelebbi konstrukciók olyan új terápiás készítmények, melyek meglepő módon alkalmasak törzsek közti keresztvédettség létrehozására, mely eredményt a szokásos, inaktivált teljes vírust tartalmazó vakcinákkal vagy proteinalegység-vakcinákkal mindeddig nem sikerült elérni.

Az expresszálódásra képes DNS vakcina-recipiensbe juttatandó menynyisége a DNS-konstrukcióban alkalmazott transzkripciós és transzlációs promóterek erősségétől és az expresszált géntennék immunogenitásától függ. Általánosságban, körülbelül 1 pg-1 mg immunológiailag vagy profílaktikusan hatékony dózist, előnyösen 10 pg-300 pg dózist adunk be közvetlenül az izomszövetbe. Alkalmazhatók bőr alá adott injekció, bőrbe történő bejuttatás, a bőrön keresztül nyomással történő bejuttatás és a beadás más módjai is, mint például hasüregbe, vénába történő bejuttatás vagy inhalációval történő beadás. Mérlegelendő az emlékeztető vakcinázás végzése is.

-41 A DNS-t alkalmazhatjuk önmagában, azaz hozzákapcsolódó proteintól, adjuvánstól vagy más, a recipiens immunrendszerére ható ágenstól mentesen. Ebben az esetben előnyös, ha a DNS egy fiziológiásán elfogadható oldatban például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, steril fiziológiás sóoldatban vagy steril pufferolt sóoldatban található. Más eljárás szerint, a DNS liposzómákkal, mint például lecitin-liposzómákkal vagy más, a technika állása szerint ismert liposzómákkal kapcsolódhat DNSliposzóma elegyet képezve (lásd a WO/9324640 sz. nemzetközi szabadalmi leírást) vagy a DNS-t az immunválasz megerősítése céljából a technika állása szerint ismert adjuvánssal, például proteinnel vagy más hordozóanyaggal együtt adjuk be. Előnyös továbbá, a DNS sejtekbe történő felvételét elősegítő anyagok, például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, kálcium ionok vírusproteinek és más transzfekciót elősegítő anyagok alkalmazása. Ezeket az anyagokat általában transzfekciót elősegítő anyagoknak, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagoknak nevezzük. A leírásban gén alatt különálló polipeptidet kódoló nukleinsav-szegmenst értünk. A gyógyászati készítmény és vakcina elnevezéseket a leírásban felcserélhető módon alkalmazzuk immunválasz kiváltására alkalmas készítmények jelölésére. A konstrukció és plazmid kifejezéseket szintén felcserélhető módon alkalmazzuk. A leírásban vektor alatt olyan DNS-t értünk, melybe gének klónozhatok a találmány szerinti eljárásban történő alkalmazás céljára.

A találmány tárgyát képezi tehát egy eljárás immunválasz in vivő létrehozására gerincesekben, például emlősökben, ezen belül emberben, influenzavírus-gének alkalmazásával, mely eljárás szerint:

a) a gént izoláljuk;

b) a gént szabályozó szekvenciákkal kapcsoljuk össze oly módon, hogy a gén olyan szabályozó szekvenciákkal kapcsolódjon funkcionálisan, melyek il

-42élő szövetekbe juttatva a gén transzkripciójának megindítását majd transzlációját irányítják;

c) a gént élő szövetekbe juttatjuk; és

d) kívánság szerint, az immunválaszt további influenzagén beadásával megerősítjük.

A találmány egy előnyös megvalósítási módját heterológ influenzavírus törzsekkel szembeni védettség létrehozására szolgáló eljárás képezi. Ezt oly módon érjük el, hogy egy nem változékony influenzavírus-epitópot kódoló nukleinsav immunológiailag hatékony mennyiségét adjuk be. Alkalmazható például a nukleoproteint kódoló teljes influenzagén, és feltehetően más influenzagének kódoló szekvenciái, valamint a fenti gének nem változékony epitópjait kódoló részek hasonló, törzsek közötti keresztvédettséget eredményeznek.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, a DNS-vakcina humán influenzavírus nukleoproteint, hemagglutinint, mátrix-proteint, nem strukturális proteint vagy polimeráz génterméket kódol. A találmány fenti megvalósítási módjának közelebbi példáit ismertetjük az alábbiakban, melyek szerint a humán influenzavírus-gén A/PR/8/34 humán influenzavírus izolátumból származó nukleoproteint, bázikus polimeráz-l.-et, nem strukturális protein-l.-et, hemagglutinint, mátrixprotein-l.-et, bázikus polimeráz-2.t, valamint az A/Beijing/3 53/89 humán influenzavírus izolátumból származó nukleoproteint, az A/Texas/36/91 humán influenzavírus izolátumból származó hemagglutinin-gént vagy a B/Panama/46/90 humán influenzavírus izolátumból származó hemagglutinin-gént kódol.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a DNSkonstrukció egy influenzavírus-gént kódol és a DNS-konstrukció állati szövetbe történő bejuttatását követően képes in vivő expresszálódni, majd az általa kódolt influenzagén alapján expresszálódott termékkel szemben im-43munválaszt kiváltani. A találmány tárgyát képezik továbbá, az ilyen konstrukciókon felül influenzavírussal nem kapcsolatos egyéb antigéneket kódoló polinukleotidokat tartalmazó kombinációk. Előnyös influenzagéneket kódoló DNS-konstrukciók például a következők:

a) pnRSV-PR-NP;

b) Vl-PR-NP;

c) V1J-PR-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 12. azonosítószámú szekvenciával;

d) V1J-PR-PB1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 13. azonosítószámú szekvenciával;

e) V1J-PR-NS, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 14. azonosítószámú szekvenciával;

f) V1J-PR-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 15. azonosítószámú szekvenciával;

g) V1J-PR-PB2, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 16. azonosítószámú szekvenciával;

h) V1J-PR-M1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 17. azonosítószámú szekvenciával;

i) VIJneo-BJ-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 20. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 21. azonosítószámú szekvenciával;

j) VIJneo-TX-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 24. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 25. azonosítószámú szekvenciával;

k) VIJneo-PA-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 26. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 27. azonosítószámú szekvenciával;

• ·

l) VI Jns-GA-HA (A/Georgia/03/93), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 46. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 47. azonosítószámú szekvenciával;

m) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 48. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 49. azonosítószámú szekvenciával;

n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 50. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 51. azonosítószámú szekvenciával;

o) VlJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 6,42 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 52. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 53. azonosítószámú szekvenciával;

p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 5,62 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 54. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 55. azonosítószámú szekvenciával;

q) VI Jns-PA-NP, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,54 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 56. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 57. azonosítószámú szekvenciával;

r) VIJns-PA-Ml, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 5,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 58. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 59. azonosítószámú szekvenciával.

A találmány szerinti megoldást a pontosabb értelmezhetőség céljából a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

-45* · ···· ·· ···· • · · · · · ··· ··· ··· ··· • · « k

l. példa

Humán influenzavírus-proteineket kódoló DNS-konstrukciók előállítása

i) pnRSV-PR-NP: Az A/PR/8/34-NP-gént pAPR-501-plazmidból izoláltuk [J.F. Young és mtsai.: “The Origin of Pandemic Influenza Viruses”, szerk.: W.G. Laver, “Elsevier Science Publishing Co.”, Inc. (1983)] egy 1565 bázispárból álló EcoRI-ffagmensként, azt Klenow-enzimmel feltöltöttük, majd Klenow-enzimmel feltöltött, valamint foszfatázzal kezelt pRSVBL-plazmid Xbal hasítási helyére klónoztuk. A pRSV-BL-plazmidot oly módon állítottuk elő, hogy a pBL-CAT3-vektort [B. Luckow és G. Schutz: Nuc. Acids. Rés. 15, 5490 (1987)] a CAT kódoló szekvencia eltávolítása céljából Xhol- és Ncol-enzimekkel emésztettük, Klenow-enzimmel feltöltöttük és önmagával ligáltuk. kz RSV-promóter-fragmenst egy Ndel-Asp718 fragmensként izoláltuk pRshgmx-plazmidból [V. Giguere és mtsai.: Natúré 330, 624 (1987)], Klenow-enzimmel feltöltöttük és a fent leírtak szerint előállított közti-vektor (CAT-szekvenciát nem tartalmazó pBL-CAT) Hindin hasítási helyére klónoztuk.

ii) VI-NP: A VI expressziós vektort a pCMVIE-AKI-DHFR-vektorból állítottuk elő [Y. Whang és mtsai.: J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Az AKI- és DHFR-géneket a vektor EcoRI-enzimmel történő emésztésével eltávolítottuk és a vektort önmagával ligáltuk. Ez a vektor a CMV-promóterben nem tartalmaz intron-A szekvenciát, így azt egy deletált belső Sacl-hasítási helylyel rendelkező PCR-fragmensként adtuk hozzá [B.S. Chapman és mtsai. számozása szerint az 1855. pozícióban: Nucl. Acids Rés. 19, 3979 (1991)]. A PCR-reakcióban a pCMVintA-Lux-plazmidot alkalmaztuk templátként, melyet úgy állítottunk elő, hogy a pCMV6al20-plazmidból a hCMV-IEl enhanszer/promóter szekvenciát és intron-A-t tartalmazó HindlII-Nhelffagmenst (lásd, B.S. Chapman és mtsai: ibid.) a pBL3-plazmid HindlII és Xbal hasítási helyei közé ligáltuk, így kaptuk a pCMVIntBL-plazmidot. A

-46pCMVIntBL-plazmid Klenow-enzimmel feltöltött és foszfatázzal kezelt Sáli hasítási helyére ligáltuk az RSV-Lux-ból származó [J.R. de Wet és mtsai.: Mól. Cell Bioi. 7, 725 (1987)] 1881 bázispárból álló luciferáz-génfragmenst (Klenow-fragmenssel feltöltött HindlII-Smal-ffagmenst).

Az intron-A áthidalására az alábbi láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:

5’-végi láncindító oligonukleotid, 5. azonosítószámú szekvencia: 5’-CTATATAAGCAGAG CTCGTTTAG-3’.

3’-végi láncindító oligonukleotid, 6. azonosítószámú szekvencia: 5’-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3’.

A SacI hasítási hely eltávolítására az alábbi láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:

szensz láncindító oligonukleotid, 7. azonosítószámú szekvencia:

’ -GT ATGTGTCTG AAAATG AGCGTGG AGATTGGGCTCGC AC-3 ’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 8. azonosítószámú szekvencia:

’ -GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACA TAC-3 ’.

A PCR-fragmenst SacI és BglII enzimekkel emésztettük és a fentiekkel megegyező enzimekkel hasított vektorba inszertáltuk. Az influenza-A vírusból származó NP-gént pAPR501-plazmidból vágtuk ki [J.F.Young és mtsai.: “The Origin of Pandemic Influenza Viruses”, szerk.: W.G. Laver, “Elsevier Science Publishing Co.”, Inc. (1983)] egy 1565 bázispárból álló EcoRIffagmensként, majd tompa végűvé alakítottuk. A fragmenst VI-vektor tompa végűvé alakított BglII hasítási helyére inszertáltuk, így kaptuk a VI-NP expressziós vektort. A plazmidokat E. co/z-ban szaporítottuk, alkalikus lizálásos eljárással tisztítottuk [J. Sambrook, E.F. Fritsch és T. Maniatis: “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”; második kiadás, “Cold Spring Harbor Laboratory Press” (1989)]. A CsCl-gradiensben csíkot képző DNS-t « ··· il .. ... .. ...

-47etanollal precipitáltuk és az injektálás céljára 0,9 %-os fiziológiás sóoldatban, 2 mg/ml koncentrációban szuszpendáltuk.

2. példa

Eljárás humán influenzavírussal szemben keletkezett citotoxikus Tlimfociták vizsgálatára

Citotoxikus T-limfocitákat DNS-sel immunizált vagy Α/ΗΚ/68-törzzsel történő fertőzésből felgyógyult egerekből nyertünk. Kontroll tenyészeteket kontroll-DNS-sel injektált, valamint nem injektált egerekből nyertünk. Különálló sejteket tartalmazó szuszpenziót készítettünk, a vörösvérsejteket ammónium-kloriddal végzett lizálással eltávolítottuk, a lépsejteket 10 % borjúszérummal (FBS), 100 egység/ml penicillinnel, 100 pg/ml streptomycinnel, 0,01 mól/1 HEPES-sel (pH 7,5) és 2 mmól/1 glutaminnal kiegészített RPMI-1640 tápfolyadékban tenyésztettük. A tenyészetekhez 60 percig, 10 pmól/l koncentráció mellett, rövid ideig H-2K^d-korlátozott NP147-155 peptid-epitóppal (Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Alá Leu Val; 9. azonosítószámú szekvencia) kezelt vagy influenza A/PR8/34-törzzsel (HlNI) fertőzött azonos számú, autológ, besugárzott stimulátor sejtet, valamint 10 egység/ml rekombináns humán IL-2-t (Cellular Products, Buffalo, NY) adtunk és a tenyésztést 7 napig, 37 °C-on, 5 % CO₂ és 100 %-os relatív páratartalom mellett tovább folytattuk. Egyes kísérletekben a tenyészetekhez autológ stimulátor sejtek helyett rhIL-2-t (20 egység/ml), valamint ConA-t (2 pg/ml) adtunk. A citotoxikus T-sejtek effektor aktivitását 3 órán keresztül, 10⁶ sejtre számítva 60 pCi⁵'Cr-mal jelölt, majd a fentiek szerint rövid ideig NP147-155-epitóppal kezelt P815-sejtek vagy A/Victoria/73influenzatörzzsel (H3N2) fertőzött P815-sejtek alkalmazásával határoztuk meg. A kontroll célsejtek (pepiiddel vagy vírussal nem kezelt, jelölt P815sejtek) nem lizálódtak. A célsejteket lxlO⁴ sejt/rekesz sűrűségben, lekerekí«4·· · · ·♦♦·

-48tctt fenekű, 96 rekeszti lemezekre oltottuk ús triplikátumokbun, 4 órán keresztül effektorsejtekkel inkubáltuk. Valamennyi rekeszből eltávolítottuk a felülúszót (30 μΐ) és azokban “Betaplate” szcintillációs számlálóval (LKBWallac, Turku, Finnország) a beütésszámot meghatároztuk. Valamennyi célsejt-készítmény esetében meghatároztuk a 6 mól/1 HC1 hozzáadását követően mérhető maximális beütésszámot és a CTL hozzáadása nélkül mérhető spontán beütésszámot. A specifikus lizálódás %-ban megadott értékét az alábbi képlet szerint számítottuk ki: [kísérletben meghatározottspontán)/(maximális-spontán)]x 100.

3. példa

NP-specifikus CTL-k és NP-specifikus-ellenanyagok ín vivő előállítása BALB/c egereket injektáltunk mindkét lábba, a négyfejű combizomba adva a Rous-szarkómavírus-promóter vagy citomegalovírus-promóter szabályozása alatt A/PR/8/34-nukleoproteint kódoló cDNS-sel.

Az alábbi expressziós vektorokat alkalmaztuk:

i) pnRSV-PRNP. lásd 1. példa;

ii) VI-NP, lásd 1. példa.

Nőstény BALB/c-egereket használtunk, melyeket a “Charles River Laboratories” cégtől szereztünk be (Raleigh, NC) Az egereket 4-5 hetes korban kaptuk és először 5-6 hetes korban injektáltuk DNS-sel. Amennyiben másképp nem jeleztük, a DNS-injekciót mindkét lábba, a négyfejü combizomba adtuk, mindkét lábba 100 pg DNS-t tartalmazó 50 pl fiziológiás sóoldatot adtunk be. Az egerek 1, 2 vagy 3 oltásban részesültek 3 hetes időközökben. A negatív kontrollként szolgáló állatokat nem injektáltuk vagy azokat a megfelelő, inszertált NP-gént nem tartalmazó üres vektorral injektáltuk.

il

-49Αζ ΝΡ plazmid-DNS jelenlétét vagy hiányát a kiválasztott állatok izomszövetében PCR-eljárással határoztuk meg (1. ábra). Plazmid-DNS-t (NP- vagy luciferáz-DNS-t) 48 vizsgált injektált izomból 44-ben tudtunk kimutatni. A luciferáz-DNS-sel injektált egerekben a protein-expressziót az izomszövet-kivonat luciferáz-aktivitása alapján mutattuk ki a technika állása szerint ismert eljárások alkalmazásával [ J.A. Wolff és mtsai.: Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi és mtsai.: Natúré 352. 815 (1991); H. Lin és mtsai.: Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 4138 (1991); E. Hansen és mtsai.: FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao és mtsai.: Hűm. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff és mtsai.: Humán Mól. Génét. 1, 363 (1992)].

Az NP-DNS injektálását követően az NP-expresszió az izomszövetben Westem-blot-analízissel vizsgálva a kimutathatóság határa alatt maradt (< 1 ng) de NP-specifíkus ellenanyagok termelődése jelezte azt (lásd, 2. ábra). NP-specifíkus CTL-k keletkezésének analízise céljára 1-4 héttel az immunizálást követően lépsejteket távolítottunk el és azokat rekombináns humán IL-2-vei és A/PR/8/34 influenza-A törzzsel fertőzött vagy rövid ideig H2K^d-korlátozott nukleoprotein peptid-epitóppal [147-155. NP aminosavszekvenciával, lásd O.K. Rötzscke és mtsai.: Natúré 348, 252 (1990)] kezelt autológ lépsejtekkel újból stimuláltuk. A vírussal fertőzött vagy rövid ideig epitóppal kezelt szingén sejtekkel ismételten stimulált lépsejtek képesek voltak a rövid ideig nukleoprotein-epitóppal kezelt célsejtek elölésére (lásd,

3.A ábra). Ez arra utal, hogy az NP-DNS izomba történő injektálása következtében a megfelelő NP-eredetű peptid I.-osztályú MHC-vel kapcsolódott és specifikus CTL-válasz keletkezését váltotta ki. Ezek a CTL-k képesek voltak a vírussal fertőzött célsejtek vagy a rövid ideig H-2K^d-korlátozott nukleoprotein-peptid-epitóppal kezelt célsejtek, valamint vírussal fertőzött célsejtek felismerésére és lizálására (3.B ábra). Ez specifitásukat, valamint • ·· · ··· ···

- 50 azt a képességüket szemlélteti, hogy felismerik a fertőzött sejtekben természetes úton létrejött epitópokat.

Az NP-DNS-vakcina immunogenitásának egy sokkal szigorúbb mércéje az elsődleges CTL-válasz értékelése. NP-DNS-sel injektált egerekből nyert lépsejteket Con-A, valamint IL-2 kezeléssel aktiváltunk, de a megfelelő célsejteket elölő képességük vizsgálatát megelőzően in vitro nem stimuláltunk újból antigént expresszáló sejtekkel. AZ NP-DNS-sel immunizált egerekből nyert, antigénnel történő újbóli stimuláció nélkül Con-A-val, valamint IL-2 kezeléssel in vitro aktivált lépsejtek mind a rövid ideig epitóppal kezelt, mind a vírussal fertőzött célsejteket lizálták (3.C és 3.D ábra). Mind az ismételten stimulált, mind az aktivált lépsejtek litikus aktivitásának öszszehasonlítása a korábban influenza-A/HK/68-törzzsel - egy, az A/PR/8/34 (H1N1) törzs után 34 évvel később keletkezett virulens, egerekhez adaptált H3N2-törzzsel - fertőzött egerekből származó, hasonló módon kezelt lépsejtek aktivitásával az előbbiek javára dől el előnyösen. Az NP-DNS injektálása tehát olyan CTL-k keletkezéséhez vezetett, melyek specifikusak voltak a nukleoprotein-epitópra és amelyek képesek voltak a természetes úton feldolgozott antigén felismerésére (azaz, képesek voltak vírusfertőzött sejtek elölésére). NP-CTL-kat humán HLA-A2-t expresszáló C3H- és Bó-jelzésű transzgenikus egerekben is létrehoztunk.

NP-CTL-kat még egyszeri dózisban, 1 pg NP-DNS-sel (a legalacsonyabb vizsgált dózissal) injektált BALB/c-egerek lépőben is sikerült kimutatnunk (3-IV táblázat).

-51 3-IV, táblázat

Egerekben létrejött CTL-válasz NP-DNS egyszeri injektálását követő-

en.
inokulum	dózis (pg)	specifikus lizálódás kifejezve	standard deviáció %-ban (sd)
NP-DNS	400	52,5	10,7
	400	80,4	10,3
NP-DNS	200	75,6	5,4
	200	44,6	4,4
NP-DNS	100	76,7	2,9
	100	35,6	8,9
NP-DNS	50	62,9	0,6
	50	76,7	7,4
NP-DNS	10	83,2	10,1
	10	37,7	2,5
NP-DNS	1	44,2	0,3
	1	13	2
kontroll-DNS		4,9	1
influenzafertőzés		79,3	8,3

3-IV. táblázat: Nőstény BALB/c-egereket (4-6 hetes korú állatokat) egyetlen dózis A/PR/34 NP-DNS-sel (V1J-NP) vagy kontroll-DNS-sel injektáltunk a jelzett dózis alkalmazásával. Összehasonlításképp egereket A/PR/34 influenzavírussal fertőztünk. Nyolc hét elteltével CTL-kat nyertünk, azokat rövid ideig in vitro NP-peptidel kezelt szingén lépsejtekkel ismételten stimuláltuk, és 50:1 célsejt:effektorsejt arány mellett rövid ideig ··♦ • · ♦ · · « • · · ··· ··· ··· • · · · ·· ··· ·· ···

- 52 NP-peptidel kezelt P815-sejtekkel szemben vizsgáltuk. Az adatokat a szemléltetés kedvéért egyes egerek esetében, a specifikus lizálódás %-ban kifejezett értékével adtuk meg.

Az utánkövetéses vizsgálatok szerint, 1 pg NP-DNS egyszeri dózisát követően az egerekben legalább 4,5 hónapig (a legkésőbbi vizsgált időpontig) NP-CTL-k voltak kimutathatóak. Az NP-DNS injektálását követően létrejött CTL-válasz hasonló mértékű volt, mint az influenzával fertőzött egerekben létrejött válasz mértéke. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy az antigénnel történő ismételt in vitro stimulálást követően végzett CTL-analízis nem szigorúan kvantitatív. Ezért, az egerekben létrejött NP-specifikus CTLszint kvantitatívabb értékelése céljából jelenleg határhigításos vizsgálati eljárást próbálunk kifejleszteni. Három alkalommal 100 pg NP-DNS-sel injektált egerekben az immunizálást követően létrejött CTL-válasz legalább 6 hónapig kimutatható volt (19. ábra). Influenza-PNV alkalmazásával tehát nem változékony influenza-antigénekkel szemben létrejövő, hosszú ideig fennmaradó CTL-választ lehet kiváltani.

Egerek NP-DNS-sel történő injektálása magas titerű anti-NP IgGellenanyagok termelődéséhez vezetett (2. ábra). Az egerekben a magas titerü IgG-ellenanyagok termelődéséhez CD4⁺-T-sejtek közreműködésére van szükség [P. Vieira és K. Rajewsky: Int. immunoi. 2, 487 (1990); J.J. Donelly és mtsai.: J. Immunoi. 145, 3071 (1990)]. Ez azt mutatja, hogy a plazmid alapján in situ expresszálódott NP mind I.-, mind II.-osztályú MHC-antigének számára prezentálható formában feldolgozódon.

-53• · · · • · ·*· ·· · · · (I

4. példa

Védettség létrehozása egerekben virulens, humán influenzavírussal történő kísérletes fertőzéssel szemben

Az influenzával szemben védettséget jelentő immunitás létrehozásában az NP-ellenanyagok szerepét kétféle megközelítés alkalmazásával igazoltuk: először, egy “passzív-transzfer” kísérlet során maghatároztuk a tüdőben mérhető vírustitereket. Tíz hetes vagy annál idősebb, nőstény BALB/cegereket injektáltunk intraperitoneálisan (a hasüregbe), három alkalommal 200 pg NP-DNS-sel injektált egerekből származó 0,5 ml (2,0 ml PBS-ben hígított) összegyűjtött szérummal. A kontroll egereket azonos térfogatú, normális egerekből származó összegyűjtött szérummal vagy A/HK/68törzzsel történő fertőzésen átesett egerekből számlázó összegyűjtött szérummal injektáltuk, szintén 2,0 ml PBS-ben hígítva. Az A/HK/68immunszérum adagját úgy állítottuk be, hogy az anti-NP-ellenanyagok ELISA-titere megegyezzen az NP-DNS-sel injektált egerekből származó összegyűjtött szérumban kimutatott titerrel. Az egereket vak vizsgálatban, 2 órával a szérum injektálását követően, érzéstelenítés nélkül, 10⁴ TCID50 Α/ΗΚ/68-vírussal kísérletesen fertőztük, 3 nappal később az injektálást azonos mennyiségű szérummal megismételtük. Az egereket 6-7 nappal az injektálást követően leöltük és Mórán eljárása szerint [J. Immunoi. 146, 321 (1991)] a tüdőben meghatároztuk a TCIDso/ml egységben kifejezett vírustitereket.

Influenzavírussal nem találkozott egereket NP-DNS-sel injektált egerekből származó anti-NP-antiszérummal iníundáltunk, majd A/HK/68törzzsel kísérletesen fertőztünk. A vírusfertőzést az Α/ΗΚ/68-törzs egy egérszövethez adaptálódott majd egerekben történő in vivő passzázsokkal fenntartott változatával végeztük (Dr. I. Mbawuike, személyes közlés). Az alkalmazott vírus-törzstenyészet fertőzött egerek tüdejéből készített • 9 ·♦*· j ·· ·*· «« .Μ

-54homogenízátum volt, amely MDCK-sejteken meghatározva 5xl0⁸ TdD₅₀/ml fertőző titerrel rendelkezett. A tüdőben mérhető vírustiter meghatározására és a testtömeg-veszteség vizsgálatára a vírusfertőzést vak vizsgálatban végeztük, érzéstelenítés nélkül, 20 μΐ térfogatú, 10⁴ TCIDso-et tartalmazó szuszpenziónak az egerek orrlyukába történő becseppentésével, mely a tüdők vírussal történő progresszív fertőződéséhez vezet, de a BALB/cegerekre nem letális hatású [Yetter R.A. és mtsai:. Infect. Immunity 29, 654 (1980)]. A túlélési arány meghatározása céljából az egereket ketaminnal és xylazinnal végzett teljes anesztézia mellett, 20 pl térfogatú, IO^2,3 TCIDso-et tartalmazó szuszpenziónak az egerek orrlyukába történő becseppentésével fertőztük; az anesztézia mellett az egerek fenti dózissal történő fertőzése gyors lefolyású tüdőfertőzéshez vezet, amely nem immunizált egerekben 90100 %-ban letális hatású [J.L. Schulman és E.D. Kilboume: J. Exp. Med. 118, 257 (1963); G.H. Scott és R.J. Sydiskis: Infect. Immunity L4, 696 (1976); R.A. Yetter és mtsai.: Infect. Immunity 29, 654 (1980)]. A tüdőben mérhető vírustitereket 96 rekeszti lemezeken tenyésztett MDCK-sejteken, sorozathigításos titrálással határoztuk meg Mórán és munkatársai eljárása szerint [ibíd.].

Az anti-NP-antiszérummal kezelt egerek tüdejében nem volt megfigyelhető a vírustiter csökkenése (6,3 +/- 0,2; átlag +/-SEM; n=4) összehasonlítva a normál szérumot kapott kontroll egerekkel (6,1 +/- 0,3; átlag +/SEM; n=4). Pozitív kontrollként az Α/ΗΚ/68-törzzsel fertőzött egerekből szérumot gyűjtöttünk és azt passzív módon négy, influenzavírussal nem találkozott egérbe vittük át. Az Α/ΗΚ/68-törzzsel történő kísérletes fertőzést követően az egerek tüdejében nem volt vírusfertőzés kimutatható, ami azt jelzi, hogy a teljes vírussal szemben termelődött fenti szérum teljes mértékű védettséget hozott létre a homológ vírussal történő kísérletes fertőzéssel szemben. Másodszor, influenzavírussal nem találkozott egereket tisztított <· il · ...

-55NP-vel immunizáltunk (5gg/láb, 6 hetes időszak során 3 alkalommal) izomba adott injekcióval. Ezekben az egerekben magas titerü NP-specifikus ellenanyagok termelődtek, azonban NP-specifikus CTL-k nem keletkeztek és az egerek a vírus letális dózisával szemben nem voltak védettek. Tehát a teljes vírussal szemben termelődött ellenanyagok neutralizáló hatásától eltérően, a keringésben található anti-NP IgG-k nem hoztak létre az egerekben védettséggel járó immunitást.

Annak meghatározása céljából, hogy a sejt által közvetített immunválasz funkcionálisan szignifikáns volt-e, értékeltük az NP-DNS-sel történő injektálás in vivő védettséget kiváltó hatékonyságát. Az immunválasz hatékonyságának közvetlen mutatójaként azt vizsgáltuk, hogy az előzőleg NPDNS-sel immunizált egerek képesek-e egy heterológ influenzatörzzsel (A/HK/68; H3N2) történő szubletális (pusztulást nem okozó) tüdöfertőzés legyőzésére. A vírusfertőzést a fentiekben leírtak szerint végeztük. A kísérletes fertőzést követően az NP-DNS-sel immunizált egerek tüdejében a 7. napon meghatározott vínistiterek (1,0 +/- 1,0; átlag +/- SEM; n=4) három nagyságrenddel kisebbek voltak, mint a nem immunizált kontroll egerekben (4,1 +/- 0,3; átlag +/- SEM; n=4) vagy az üres (inszertet nem tartalmazó) vektorral immunizált egerekben (4,5 +/- 0,0; átlag +/- SEM; n=4). Valójában, a vírustiter négy közül három egér tüdejében nem érte el a kimutathatóság szintjét, míg a fenti időpontig a kontroll egerek egyike sem volt képes a vírusfertőzés legyőzésére. A tüdőben meghatározott vínistiterek vonatkozásában a fenti kísérlet, valamint hat további kísérlet során megfigyelt jelentős különbségek azt mutatták, hogy az immunválasz felgyorsította a vírusfertőzés legyőzését. /Azzal, hogy az inszertet nem tartalmazó vektor-kontroli nem váltott ki védettséget, bizonyítottuk azt, hogy az immunválasz létrejöttéért nem maga a DNS volt felelős. Továbbá, mivel a kísérletes fertőzésnél alkalmazott vírustörzs (A/HK/68, egy egérhez adaptált vinilens törzs) il

-56heterológ volt ahhoz a törzshöz képest, amelyből az NP-gént klónoztuk (A/PR8/34, H1N1) az immunitás nyilvánvalóan heterotípusos jellegű volt.

A vírus által kiváltott morbiditás mércéjeként NP-DNS-sel immunizált, majd Α/ΗΚ/68-influenzatörzs szubletális dózisával fertőzött egerekben követtük a testtömeg-csökkenést (4. ábra). Kontrollként nem injektált egereket, valamint inszertet nem tartalmazó vektorral injektált egereket alkalmaztunk. Az influenza-A-törzzsel történő fertőzést követően az NP-DNS-sel immunizált egerekben kisebb testtömeg-csökkenés jött létre, mint a kontroliokban és testtömegük sokkal gyorsabban visszatért a kísérletes fertőzést megelőző szintre, mint a kontroll egereké.

A teljes anesztéziában, az orron keresztül influenza-A-val fertőzött egerek tüdejében kiterjedt, gyors vírusreplikáció megy végbe és 6-8 napon belül pusztulás következik be, amennyiben a fertőzés nem szabályozott [Yetter R.A. és mtsai:. Infect. Immunity 29, 654 (1980)]. A fenti módszenei fertőzött egerek túlélése az egerek azon képességét tükrözi, hogy egy akut tüdöfertőzés súlyosságát mérsékelni tudják. Két különböző influenzatörzzsel (A/HK/68, lásd 5. ábra; és A/PR/8/34) történő kísérletes fertőzést követően vizsgáltuk az egerek túlélési képességét. A megelőzően NP-DNS-sel immunizált egerek 90 %-os túlélési arányt mutattak, míg az inszertet nem tartalmazó vektorral injektált egerek túlélési aránya 0 %, a nem injektált kontroll egerek túlélési aránya 20 % volt (5. ábra). Összesen 14 ilyen vizsgálat során az NP-DNS-sel immunizált egereknél legalább 50 %-kal nagyobb túlélési arányt figyeltünk meg, mint a kontrolioknál. Az NP-DNS-sel kiváltott immunválasz azon képessége tehát, hogy hatékonyan csökkentette egy 34 évvel később keletkezett eltérő vírustörzs által okozott betegség súlyosságát és gyorsította a felgyógyulást, alátámasztja annak az ésszerűségét, hogy citotoxikus T-limfocita-válasz kiváltása céljából nem változékony proteineket alkalmazzunk.

5. példa

Gének izolálása influenzavírus-izolátumokból

Számos korábbi influenzavírus-törzset letétbe helyeztek az ATCC gyűjteményében [lásd, az “1990 Cataloge of Animál Viruses & Antisera,

Chlamydiae & Rickettsiae” című kiadványt, (6. kiadás), melyben 20 influenza-A-törzset és 14 influenza-B-törzset sorolnak fel].

A. Vírustörzsek és azok tisztítása:

A jelenlegi, 1992.-évi influenza időszakban alkalmazott vakcinában található influenzatörzseket Dr. Nancy J. Cox-tól kaptuk (“Division of Viral and Rickettsial Diseases”, “Centers of Diseases Control”, Atlanta, GA.). Ezek az alábbi törzsek voltak: (1) A/Beijing/353/89 (H3N2); (2) A/Texas/36/91 (H1N1); (3) B/Panama/45/90; és (4) A/Georgia/03/93.

Valamennyi fenti vírust 9-11 napos korú embrionált tyúktojásokon szaporítottuk és passzáltuk (egy-egy víruskészítmény előállításához 100-200 darabot használtunk), (kivéve az A/Georgia-törzset, melyet MDCK-sejteken tenyésztettünk), majd a vírusokat Massicot és mtsai. módosított eljárása szerint tisztítottuk [Virology 101, 242 (1980)]. Röviden, a vírusszuszpenziókat 8000 ford/perc mellett végzett centrifúgálással feltisztítottuk (Sorvall-RC5C-centrifúgában, GS-3-rotor alkalmazásával), majd “Beckman Type-19”-rotorban, 2 órán át, 18 000 ford/perc mellett végzett centrifugálással ülepítettük. Az ülepített vírust STE-pufferben szuszpendáltuk [0,1 mól/1 NaCl, 20 mmól/1 Tris (pH 7,4), 1 mmól/1 EDTA] és az aggregátumok eltávolítása céljából 10 percig, 4 000 ford/perc mellett (egy Hermle-Z-360-Κcentrifugában) centrifugáltuk. Két ml felülúszót olyan szakaszos szacharózgradiensre rétegeztünk, melyben STE-pufferrel pufferolt 2 ml 60 %-os szacharózra 7 ml 30 %-os szacharózt rétegeztünk, majd 90 percig, 36 000 ford/perc mellett (egy Beckman SW-40-rotorban) centrifugáltuk. A határfelületen rétegződött vírusokat összegyűjtöttük, STE-ben 10-szeresére hígítót··· *

«·· *· ··!· «» • · · » · ♦*· «·« ««·

- * · · ·· ··· ··

-58tuk és 2 órán át, 30 000 ford/perc mellett (egy Beckman ΊΪ45-rotorban) ülepítettük. Az ülepített vírust -70 °C-on lefagyasztottuk.

B. Vírus-RNS extrahálása és cDNS-szintézis:

A fagyasztott vírusokból guanidinium-izotiocianát extrakcióval, a kereskedelemben hozzáférhető reagenskészlet alkalmazásával (Stratagene, LaJolla, CA), Chomczynski és Sacchi eljárása szerint [Anal. Biochem. 162, 156 (1987)] vírus-RNS-t tisztítottunk. A vírus-RNS alapján kettősszálú cDNS-t állítottunk elő a kereskedelemben hozzáférhető cDNS-szintézis reagenskészlet alkalmazásával (Pharmacia) lényegében a gyártó utasításai szerint, azonban néhány módosítással. Az első cDNS-szál szintézisét a vírus-RNS 3’-végén található, valamennyi A-törzs-génben állandó szekvenciával komplementer szintetikus oligo-dezoxiribonukleotid (5’AGCAAAAGCAGG-3’, 30. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával indítottuk meg. Ez a szekvencia valamennyi influenza-A-törzsbe tartozó vírus-RNS-ben közös, így bármely influenza-A vírustörzsből származó vírusgén klónozásához felhasználható. Az első és második cDNS-szál szintézisét követően ahelyett, hogy a reagenskészlet utasításait tovább követtük volna, a reakcióelegyet fenol/kloroform eleggyel extraháltuk és etanollal precipitáltuk. Ezt követően a tompa végű cDNS-szálakat közvetlenül a BglII restrikciós enzimmel emésztett, T4-DNS polimerázzal tompa végűvé alakított és boíjú intesztinális alkalikus foszfatázzal kezelt VIJneo- vagy VlJnsvektorba ligáltuk.

Teljes hosszúságii, meghatározott vírusgének klónozása céljából olyan szintetikus oligo-dezoxiribonukleotidokat alkalmaztunk, melyeket úgy terveztünk, hogy azok az adott vírusgén transzlációs nyílt olvasási fázisa végének 3’-terminusával komplementerek legyenek. A restrikciós térképezés, valamint agarózgél-elektroforézissel történő méret-meghatározás alapján teljes hosszúságú géneket képviselő minták azonosságát a vírusgén és a :·♦· :··· ·»· ··· ··· ··· ·· ··« ·«*

-59VlJneo mindkét kapcsolódási helyének didezoxinukleotid-szekvenálásával igazoltuk. A fenti vírusokból klónozott valamennyi gén kapcsolódási régiójának szekvenciáját az alábbiakban, a 8. példában ismertetjük.

A fenti vírusok mindegyike esetében hasonló stratégiát alkalmaztunk a cDNS klónozására, kivéve a B/Panama/45/90-törzset, mely a virus-RNS egyik végén sem tartalmaz közös szekvenciát, ebben az esetben az első cDNS-szál szintézisének megindítására oligo-dezoxiribonukleotidok elegyét alkalmaztuk. Az alábbi láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk:

(1) 5’-AGCAGAAGCGGAGC-3’, 31. azonosítószámú szekvencia: a PB 1 és a PB2 klónozásához);

(2) 5’-AGCAGAAGCAGAGCA-3’, 19. azonosítószámú szekvencia: az NS és a HA klónozásához);

(3) 5’-AGCAGAAGCACGCAC-3’, 22. azonosítószámú szekvencia: az M klónozásához);

(4) 5’-AGCAGAAGCACAGCA-3’, 23. azonosítószámú szekvencia: az NP klónozásához).

A PCR-eljárással klónozott gének esetében a tompa végű cDNS-t tartalmazó oldatot használtuk közvetlenül DNS-templátként a PCRreakciókban. A hat PCR-eljárással kapott influenzagén klónozásánál alkalmazott láncindító oligonukleotidok az alábbiak voltak:

1. Az A/Georgia/03/93-törzsből származó HA-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 33. azonosítószámú szekvencia: 5’-GGT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC 3’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 34. azonosítószámú szekvencia: 5’-CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G-3’

2. Az A/Texas/36/91-törzsből származó HA-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 35. azonosítószámú szekvencia:

il

-605’-GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA

TG 3’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 36. azonosítószámú szekvencia: 5’-CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG 3’

3. A B/Panama/45/90-törzsből származó HA-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 37. azonosítószámú szekvencia: 5’-GGT ACA ACC ATG AAG GCA ΑΤΑ ATT GTA CTA CTC ATG -3 ’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 38. azonosítószámú szekvencia: 5’-CCA CAT TTA TAG ACA GAT GGA GCA AGA AAC ATT GTC -3’

4. Az A/Beijing/353/89-törzsből származó Ml-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 39. azonosítószámú szekvencia: 5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC -3’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 40 azonosítószámú szekvencia: 5’- CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC-3’

5. A B/Panama/45/90-törzsből származó NP-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 41. azonosítószámú szekvencia:

5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGC-3’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 42. azonosítószámú szekvencia:

5’ CCA CAT GGA TCC TTA ATA ATC GAG GTC ATC ATA ATC CTC-3’

6. A B/Panama/45/90-törzsből származó Ml-génhez:

szensz láncindító oligonukleotid, 43. azonosítószámú szekvencia:

5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA

ATTGCC-3’ antiszensz láncindító oligonukleotid, 44. azonosítószámú szekvencia:

-61 5’-CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA TTT CTT CAC AAG AGC

TG-3’.

Valamennyi influenzagén-klón azonosságát, akár cDNS-, akár PCReljárással előállított szekvenciáról van szó, a ligálás helyén át a gén belseje felé történő szekvenálással, valamint a génnek transzferált RD-sejtekben történő expresszálásával igazoltuk. Az expressziót immunblot-eljárással mutattuk ki.

Az A/H3N2-törzs esetében az NP- és Ml-konstrukciókat (a 4. és 5. vektorokat) az A/Beijing/353/89-génekből állítottuk elő. Azért választottuk ezeket a géneket, mivel mind az NP-, mind az Ml-gének várhatóan nagyfokú állandóságot mutatnak, valamint mivel ezek rendelkezésre álltak.

A fenti vizsgálatok alapján, vakcinában kombinálható különösen előnyös expressziós vektorokat tartalmaz az alábbi 7 expressziós vektorból álló csoport:

1. VIJns-HA (A/Georgia/03/93) 6,56 kb

2. VIJns-HA (A/Texas/36/91) 6,56 kb

3. VIJns-HA (B/Panama/45/90) 6,61 kb

4. VIJns-NP (A/Beijíng/3 5 3/89) 6,42 kb .

5. VIJns-Ml (A/Beijing/353/89) 5,62 kb

6. VIJns-NP (B/Panama/45/90) 6,54 kb

7. VIJns-Ml (B/Panama/45/90)5,61 kb

A fenti gének expressziós vektorral történő kapcsolódási régióinak szekvenciáját az alábbiakban ismertetjük. Annak bizonyítására, hogy a megfelelő gént klónoztuk, elegendő volt a konstrukció csak egy kis részének szekvenálása. Hasonló ismert génekkel történő összehasonlítás alapján könnyű igazolni, hogy az adott gén egy HA-gén, egy NP-gén, egy Ml-gén, stb. Például az A/Texas/HA-gén szekvenciája nagyon hasonló az A/Kiev/59/79 HA-génjének szekvenciájához, mely szekvencia M38353 • ·

-62nyilvántartási szám alatt megtalálható a GENBANK gyűjteményében. Hasonlóképp, a B/Panama/45/90 HA-szekvencia igen hasonló a B/England/222/82 HA-szekvenciához, mely Ml 8384 nyilvántartási szám alatt megtalálható a GENBANK gyűjteményében. Hasonló eljárással bármely humán influenzavírusból származó adott gén esetében megerősíthető valamely klónozott szekvencia azonossága. Valamennyi alábbi esetben a teljes gén jelenlétének igazolására mind az 5’-végi szekvencia, mind a 3’végi szekvencia helyességét ellenőriztük. A vastag betűvel jelölt ATG valamennyi esetben az influenzagén startkódonját, a 3’-végen a vastag betűvel jelölt szekvencia a stopkódont jelöli.

1. VIJns-HA (A/Georgia/03/93) 6,56 kb:

5’-szekvencia (46, azonosítószámú szekvencia):

...TCA CCG TCC TTA GAT C/GG TAC AAC CAT GAA GAC TAT

CAT TGC TTT GAG CTA CAT TTT ATG TCT GGT TTT CGC... 3’-szekvencia (47, azonosítószámú szekvencia):

...TCA TGC TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GGG TTC ATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTG TGC...

2. VIJns-HA (A/Texas/36/91) 6,56 kb:

5’-szekvencia (48, azonosítószámú szekvencia):

...TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA...

3’-szekvencia (49, azonosítószámú szekvencia):

...CTG GTG CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT...

3. VIJns-HA (B/Panama/45/90) 6,61 kb:

5’-szekvencia (50. azonosítószámú szekvencia):

ι!

-63...CCT TAG ATC/ GGT ACA ACC ATG AAG GCA ΑΤΑ ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG...

3’-szekvencia (51. azonosítószámú szekvencia):

...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATC TGT CAT TAA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT...

4. VI Jns-NP (A/Beijing/3 53/89) 6,42 kb

5’-szekvencia (52. azonosítószámú szekvencia):

...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAGAAT GCA ACT...

3’-szekvencia (53, azonosítószámú szekvencia):

...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATG GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...

5. VI Jns-Ml (A/Beijing/353/89) 5,62 kb

5’-szekvencia (54, azonosítószámú szekvencia):

...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...

3’-szekvencia (55, azonosítószámú szekvencia):

GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT GAT CTT CTT GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGA ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCT ATG TGG/ GAT CTG CTG TGC CTT...

6. VI Jns-NP (B/Panama/45/90) 6,54 kb • ·

-645’-szekvencia (56. azonosítószámú szekvencia).

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT...

3’-szekvencia (57, azonosítószámú szekvencia):

...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTG GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...

7. V1JNS-M1 (B/Panama/45/90) 5,61 kb

5’-szekvencia (58. azonosítószámú szekvencia):

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGC AAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA...

3’-szekvencia (59, azonosítószámú szekvencia):

...AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAA GGA ATT GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGC TCT ATG GGA AAT TCA GCT CTT GTG AAG AAA TAC CTA TAA G/GA TCT GCT GTG

6. példa

A VIJ-expressziós vektor (10, azonosítószámú szekvencia)

A V1J-vektort abból a célból állítottuk elő, hogy VI-vektorunkból eltávolítsuk a promótert és a transzkripciós terminátor elemeket, hogy azokat jobban meghatározott környezetbe helyezzük, kompaktabb vektort nyerjünk és javítsuk a plazmid-tisztítás hatásfokát.

A VIJ-vektort a VI-vektorból (lásd 1. példa) és a kereskedelemben hozzáférhető pUC18-plazmidból állítottuk elő. A VI-vektort Sspl és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztettük, mely emésztéssel két DNS-fragmenst * ·

-65kaptunk. Ezek közül a kisebbik fragmenst, amely a heterológ gének expresszióját szabályozó CMVintA-promótert és a szarvasmarha növekedési hormon (BGH) transzkripciós terminátor elemeket tartalmazta, agarózelektroforézis-gélből tisztítottuk (11. azonosítószámú szekvencia). Ennek a DNS-fragmensnek a végeit T4 DNS polimeráz enzimmel “tompa végűvé” alakítottuk, hogy annak egy másik tompa végűvé alakított DNSfragmenssel történő ligálását megkönnyítsük.

Az expressziós vektor “vázát” a pUC18-plazmid szolgáltatta. Erről ismeretes, hogy nagy mennyiségű plazmid termelődését eredményezi, szekvenciája és funkciója jól jellemzett és minimális méretű. A vektorból Haell restrikciós enzimmel végzett részleges emésztéssel eltávolítottuk a teljes /űc-operont, mely céljaink szempontjából felesleges volt és melynek jelenléte a plazmid termelődésének hatásfoka és a heterológ gén expresszálódása szempontjából hátrányos lehet. A plazmid megmaradt részét agarózelektroforézis-gélből tisztítottuk, T4 DNS polimeráz enzimmel “tompa végűvé” alakítottuk, borjú intesztinális alkalikus foszfatázzal kezeltük és a fent leírt módon nyert CMVintA/BGH-elemmel ligáltuk. A promoter elemeket a pUC-plazmidvázban mindkét lehetséges orientációban tartalmazó plazmidokat kaptunk. Ezek közül az egyik E. coli-ban sokkal nagyobb DNS-mennyiséget eredményezett, ezt VIJ-plazmidnak neveztük (10. azonosítószámú szekvencia). A fenti vektor szerkezetének helyességét a kapcsolódási régiók szekvencia-analízisével igazoltuk, majd kimutattuk, hogy a VI-vektorral összehasonlítva, azzal összehasonlítható vagy annál nagyobb mértékű heterológ génexpresszióhoz vezet.

• · · · • · « ·

-667. példa

A VIJ expressziós vektorban található influenzavírus-gén konstrukciók

Számos fenti gént az A/PR/8/34 influenzavírus törzsből klónoztunk a VIJ expressziós vektorba, amely, amint azt a 4. példában említettük, a VI expressziós vektorral megegyező vagy annál magasabb szintű expressziót eredményez. A PR8 génszekvenciák ismertek és hozzáférhetők a GENBANK adatbázisában. Valamennyi alább ismertetett klónozott gén esetében, a klónozott fragmens méretét a méret meghatározására alkalmas gélen ellenőriztük, és megadtuk azt a GENBANK nyilvántartási számot, mellyel a szekvencia részletet összehasonlítottuk. A fenti géneknek vírustörzsekből, például az ATCC gyűjteményéből kapott vírusból történő előállítására szolgáló eljárás leírását (az A/PR/8/34-törzs ATCC VR-95-törzs; számos más törzset szintén letétbe helyeztek az ATCC gyűjteményében), lásd az 5. példában.

A. A PR8-gének szubklónozása VI J-vektorba.

1. NP-gén.

Az NP-gént pAPR501-plazmidból szubklónoztuk [J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M.Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses”, szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”, Amszterdam), 129-138. oldal (1983)]. A gént a pAPR501-plazmid EcoRl enzimmel történő hasításával kivágtuk, a fragmenst gélen tisztítottuk és T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított fragmenst BglII enzimmel hasított és szintén tompa végűvé alakított VI J-vektorba inszertáltuk. A klónozott fragmens 1,6 kb hosszúságú volt.

2. NS.

Az NS-gént pAPR801-plazmidból szubklónoztuk [J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M.Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses”, szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”,

-67Amszterdam), 129-138. oldal (1983)]. A gént a pAPR801 -plazmid EcoRI enzimmel történő hasításával kivágtuk, a fragmenst gélen tisztítottuk és T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított fragmenst BglII enzimmel hasított és szintén tompa végűvé alakított V1J-vektorba inszertáltuk. A klónozott fragmens 0,9 kb hosszúságú volt, (amely a teljes NS kódoló régiót, ezen belül .az NS1- és NS2-régiókat is tartalmazta).

3. HA

A HA-gént pJZ102-plazmidból szubklónoztuk [J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M. Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses” szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”, Amszterdam), 129-138. oldal (1983)]. A gént a pJZ102-plazmid HindlII enzimmel történő hasításával kivágtuk, a fragmenst gélen tisztítottuk és T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított fragmenst BglII enzimmel hasított és szintén tompa végűvé alakított VI J-vektorba inszertáltuk. A klónozott fragmens 1,75 kb hosszúságú volt.

4. PB1

A PB 1-gént pGeml-PBl-plazmidból szubklónoztuk, (a gén azonosságának megerősítése céljából a génnek a vektorral alkotott 5’- és 3’-végi kapcsolódási régióit szekvenálással ellenőriztük) [lásd: J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M.Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses” szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”, Amszterdam), 129-138. oldal (1983)]. A gént a pGeml-PB 1-plazmid HindlII enzimmel történő hasításával kivágtuk, a fragmenst gélen tisztítottuk és T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk. A tompa végűvé alakított fragmenst BglII enzimmel hasított és szintén tompa végűvé alakított VI J-vektorba inszertáltuk. A klónozott fragmens 2,3 kb hosszúságú volt.

• · ♦ · ···· • · • · · · · · íl

5. ΡΒ2

A PB2-gént pGeml-PB2-plazmidból szubklónoztuk, (a gén azonosságának megerősítése céljából a génnek a vektorral alkotott 5’- és 3’-végi kapcsolódási régióit szekvenáltuk) [lásd: J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M.Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses” szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”, Amszterdam), 129-138. oldal (1983)]. A gént a pGeml-PB2-plazmid BamHI enzimmel történő hasításával kivágtuk és a fragmenst gélen tisztítottuk. A ragadós végekkel rendelkező fragmenst BglII enzimmel hasított V1J-vektorba inszertáltuk. A klónozott fragmens 2,3 kb hosszúságú volt.

6. Ml

Az Ml-gént PCR-eljárással állítottuk elő a p8901-MITE-plazmid alapján. A fenti plazmidban található M-szekvenciát PCR-eljárással állították elő a pAPR701-plazmid alapján [J.F.Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman és M.Rosenberg: “The Origins of Pandemic Influenza Viruses” szerk.: W.G. Laver, (“Elsevier”, Amszterdam), 129-138. oldal (1983)], “szensz” láncindító oligonukleotidként az 5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC-3’ oligomer (3. azonosítószámú szekvencia), “antiszensz” láncindító oligonukleotidként az 5’-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC-3’ (4. azonosítószámú szekvencia) oligomer alkalmazásával. A PCR-fragmenst gélen tisztítottuk, BglII enzimmel hasítottuk és szintén BglII enzimmel hasított VIJ-vektorba ligáltuk. A klónozott fragmens 0,7 kb hosszúságú volt. A kódolt Ml-gén amino-terminális végét a fenti “szensz” láncindító oligonukleotidon található “ATG”-kódon kódolja, míg az Ml-gén transzlációs stopkódonját reverz módon a “TCA”-kódon kódolja, mely szensz irányban olvasva a “TGA”-stopkódonnak felel meg.

-69B. Influenzádén-VIJ expressziós konstrukciók:

Valamennyi esetben az 5’-végi promóter régiótól (CMVintA) a gén belseje felé haladva a kapcsolódási régió szekvenciáját mutatjuk be. A szekvenciákat az alábbi, CMVintA láncindító oligonukleotiddal kezdődően határoztuk meg:

5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3’ (28. azonosítószámú szekvencia), mely a kódoló szekvencia szekvenciáját eredményezi. A kapcsolódás helyét “/” jellel jelöltük, amely a szekvencia folyamatosságának semmiféle megszakítását nem jelenti. Ezen konstrukciók előállításának módját a szekvenciák felsorolását követően összegeztük. Valamennyi így előállított szekvencia a nevezett influenzagén expresszálására alkalmas teljes, rendelkezésre álló DNS-konstrukciót képvisel.

Valamennyi konstrukciót tranziens módon RD-sejtekbe (ATCC CCL136), egy humán rhabdomioszarkóma-sejtvonal tenyészetbe transzfektáltunk.

A transzfekciót követően 48 órával a sejteket összegyűjtöttük, lizáltuk és Westem-blot céljára futtatást végeztünk (kivéve a V1J-PR-HAkonstrukció esetében, melyet a Westem-blot futtatást megelőzően egérben vizsgáltunk és ily módon anti HA-specifikus ellenanyagok termelődését mutattuk ki, mivel tehát az expresszálódás in vivő megfigyelhető volt, feleslegessé vált a Westem-blot végzése). A PB1-, PB2- és NS-proteinekre specifikus ellenanyagokat Stephen Inglis-től kaptuk (University of Cambridge) aki b-galaktozidázzal fuzionált proteinekként expresszált tisztított proteineket alkalmazott poliklonális antiszérum előállítására. Anti-NP poliklonális antiszérumot nyulak teljes A/PR/8/34-vírussal történő immunizálásával nyertünk. Az anti-Ml ellenanyag kecskében termelt anti-influenza-A antiszérumként a kereskedelemben hozzáférhető a “Biodesign” cégtől (katalógusszám: B65245G). Valamennyi esetben a várakozásnak megfelelő

-70méretű protein volt megfigyelhető, igazolva a kódolt influenza-protein in vitro expresszálódását.

A fenti konstrukciók elnevezésében az alábbi egységes megoldást követtük: “vektor neve-influenzatőrzs-gén” A klónozott és szekvenált A/PR/8/34-génszekvenciát valamennyi esetben a GENBANK adatbankjában található ismert szekvenciával történő összehasonlítással ellenőriztük. Valamennyi fenti konstrukció biológiai hatékonyságát a 2., 3. és 4. példákban fent leírtak szerint mutattuk ki.

A CMVintA és az A/PR/8/34-törzsből származó influenzagének 5’végi kapcsolódási régióinak szekvenciája:

1. V1J-PR-NP, 12. azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: M38279,

5’-GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG

CMVintA NP....

TAG ATA ATC ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG

2. V1J-PR-PB1, 13. azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: J02151.

5’-ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC

CMVintA PB1...

CAT TTG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTT AAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTT CCC TTA TAC

3. V1J-PR-NS, 14. azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: J02150.

5’-GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA

GGG <1 ·· ··.

-71 CMVintA NS...

TGA CAA AAA CAT AAT GGA TCC AAA CAC TGT GTC AAG CTT TCA GGT AGA TTG CTT TCT TTG GCA TGT CCG CAA ACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG TGA T...

4. V1J-PR-HA: 15. azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: J02143.

5’-TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG AGG AAA

CMVintA HA...

AGCAGG GGA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA ACC TAC TGG TCC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG ACA CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA ACA ATT CAA CC...

5. V1J-PR-PB2: 16, azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: J02153.

5’-TTT TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/C CGA ATT CCA CMVintA PB2...

GCA AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAA TAA AAG AAC TAA GAA ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCA CCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG TGG ACC ATA TGG CCA TAA TCA AGA AGT...

6. V1J-PR-M1: 17. azonosítószámú szekvencia; GENBANK nyilvántartási szám: J02145.

5’-GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ ACC ATG AGT CTT CTA ACC CMVintA Ml...

GAG GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAA GAG TTG ACG GAA GA...

*·; ··♦, *·»· ·«« ·· ···* ...

-72Az alábbiakban ismertetjük a fragmensek összekapcsolásának módját:

1. V1J-PR-NP: a BglII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított vektort EcoRI enzimmel hasított és tompa végűvé alakított NP-génnel ligáltuk.

2. V1J-PR-PB1: a V1J-PR-NP: BglII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított vektort HindlII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított PB 1-génnel ligáltuk.

3. V1J-PR-NS: a BglII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított vektort EcoRI enzimmel hasított és tompa végűvé alakított NS1-génnel ligáltuk.

4. V1J-PR-HA: a BglII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított vektort HindlII enzimmel hasított és tompa végűvé alakított HA-génnel ligáltuk.

5. V1J-PR-PB2: a BglII enzimmel hasított, ragadós végekkel rendelkező vektort BamHI enzimmel hasított, ragadós végekkel rendelkező PB2génnel ligáltuk.

6. V1J-PR-M1: a BglII enzimmel hasított, ragadós végekkel rendelkező vektort BglII enzimmel hasított, ragadós végekkel rendelkező MI-génnel ligáltuk. Az Ml-gént PCR-eljárással kaptuk, templátként a p8901-MITEplazmid felhasználásával, valamint olyan láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyek a szekvencia mindkét végéhez BglII hasítási helyet adtak hozzá, a szekvencia 3 bázissal az ATG-kódon előtt kezdődött és közvetlenül az Ml-gén terminációs kódonját követően (TGA) fejeződött be.

8. példa

A VIJneo expressziós vektor, 18. azonosítószámú szekvencia

A VIJ-plazmidot hordozó baktériumok antibiotikummal történő szelekciójára alkalmazott amp^r-gérú. a vektorból el kellett távolítanunk, mivel az

-73ampicillin nem alkalmazható nagy léptékű fermentáció során. A V1J-vektor pUC-vázából az amp^r-gént Sspl és Eaml 1051 restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel eltávolítottuk. A plazmid megmaradó részét agarózgélelektroforézissel tisztítottuk, T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk, majd borjú intesztinális alkalikus foszfatázzal kezeltük. A 903jelzésü transzpozonból származó és a pUC4K-plazmidban található, kereskedelemben hozzáférhető ÁaG-gént PstI restrikciós enzimmel kivágtuk, agarózgél-elektroforézissel tisztítottuk és T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk. Ezt a fragmenst a VIJ-vázzal ligáltuk, a to^r-gént mindkét orientációban tartalmazó plazmidokat kaptunk, melyeket VlJneo-1, és VlJneo-3 plazmidoknak neveztünk. Mindkét plazmid azonosságát restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel és a kapcsolódási régió szekvenálásával igazoltuk, és kimutattuk, hogy a VIJ-vektorhoz hasonló mennyiségű plazmid termelődéséhez vezetnek. A VIJ-vektorba és a VIJneo-vektorokba klónozott heterológ géntermékek expressziója szintén hasonló mértékű volt. Expressziós konstrukciók előállítása céljára önkényesen kiválasztottuk a VI Jneo#3-plazmidot, melyet a továbbiakban VlJneovektomak nevezünk (18. azonosítószámú szekvencia), amely a /bW-gént a VI J-vektorban található űw/X-génnel megegyező orientációban tartalmazza.

Az A/Beijing/353/89, az A/Texas/36/91 és a B/Panama/45/90 törzsekből származó géneket cDNS-ként klónoztuk a VIJneo-vektorba. Valamenynyi esetben az 5’-végi promóter régiótól (CMVintA) a gén belseje felé haladva meghatároztuk a kapcsolódási régió szekvenciáját az alábbi láncindító oligonukleotid alkalmazásával: CMVintA láncindító oligonukleotid: 5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3’ (28. azonosítószámú szekvencia), mely a kódoló szekvencia szekvenciáját eredményezte. Ezt a terminátor/kódoló szekvencia követi, melyek kapcsolódási régióját szintén bemutatjuk. Ezt a szekvenciát a BGH láncindító oligonukleotid alkalmazó··· ··· ·· ···*

-74sával kaptuk: 5’-GGA GTG GCA CCT TCC AGG-3’ (29. azonosítószámú szekvencia), amely a nem-kódoló szál szekvenciáját eredményezi. A szekvenciát valamennyi esetben a GENBANK adatbázisában található, a fenti és más influenza-izolátumokból származó klónozott és szekvenált gének ismert szekvenciáival hasonlítottuk össze. A kapcsolódás helyét “/” jellel jelöltük, amely a szekvencia folyamatosságában semmiféle megszakítását nem jelent. A VIJneo-TX-HA kapcsolódási régió esetében a szekvenáló gél összenyomódott és a szekvencia eleje nehezen volt olvasható. Ezért ebben a kapcsolódási régióban található első nyolc bázist “N”-betüvel jelöltük. A fenti nukleotidokat meghatároztuk és az azonosított nukleotidokat megadtuk. Valamennyi szekvenciában az első “ATG”-kódon az adott klónozott gén transzlációs kezdőkódonjának felel meg. Valamennyi így előállított szekvencia a nevezett influenzagén expresszálására alkalmas, teljes, rendelkezésre álló DNS-konstrukciót képvisel.

A fenti konstrukciók elnevezésében az alábbi egységes megoldást követtük: “vektor neve-influenzatörzs-gén”. Valamennyi fenti konstrukció biológiai hatékonyságát a 2., 3. és 4. példákban fent leírtakkal azonos módon mutattuk ki:

A CMVintA és az influenzagének 5’-yégi kapcsolódási régióinak, valamint az influenzagének és a BGH-terminátor 3’-végi kapcsolódási régióinak szekvenciái különböző influenzatörzsekből és proteinekből álló expressziós konstrukciókban:

I. A/Beiiing/353/89

A. VIJneo-BJ-NP:

Promoter, 20. azonosítószámú szekvencia:

5’-TCA CCG TCC TTA GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC

CMVINTA

NP...

·♦ ···» ' · 4 ·4· «·«

-75ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT

Terminátor, 21, azonosítószámú szekvencia:

5’-GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT/ ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...

BGH NP...

II. A/Texas/36/91

A. VI Jneo-TX-HA

Promóter, 24. azonosítószámú szekvencia:

5’-CCT TAG ATC/ GGA AAT AAA AAC AAC CAA AAT GAA

CMVintA HA...

AGC AAA ACT ACT AGT CC...

Terminátor, 25. azonosítószámú szekvencia:

5’-GCA GAT C/CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC

BGH HA...

TCA GAT...

III. B/Panama/46/90

A. VIJneo-PA-HA

Promóter, 26. azonosítószámú szekvencia: [Ennek a szekvenciának az első 1080 bázisa M65171 nyilvántartási szám alatt hozzáférhető a GENBANK adatbázisában; az alább kapott szekvencia megegyezik az ismert szekvenciával; a 3’-szekvencia (27. azonosítószámú szekvencia, lásd az alábbiakban) korábban nem volt ismert.]

5’-ACC GTC CTT AGA TC/C AGA AGC AGA GCA TTT TCT

CMVintA HA...

AAT ATC CAC AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC

ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC...

·· «· ί

-76Terminátor, 27. azonosítószámú szekvencia:

5’-GGC ACA GCA GAT C/TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT

BGH HA...

AAT GGT AAC...

9. Példa

Influenzagének intradermális (bőrbe történő) injektálása

A gének intradermális bejuttatására alkalmazott eljárás megegyezett az intramuszkuláris beadáséval: Három hetes időközökben, három alkalommal 200-200 gg Vl-PR-NP-t injektáltunk. A harmadik injektálást követően 55 nappal a lépet in vitro vizsgálat céljára eltávolítottuk, és a sejteket a 147155.-jelzésű nonapeptid (kilenc aminosavból álló) nukleoprotein-epitóppal (9. azonosítószámú szekvencia) ismételten stimuláltuk. Célzott sejteket (P815 egér masztocitóma sejteket, melyek a H-2^d BALB/c-egerekkel szingén sejtek) az A/Victoria/73-jelzésű heterológ vírussal fertőztünk és a lépsejteket effektorsejtekként alkalmazva, 5:1-40:1 effektorsejt:célzott sejt arány mellett meghatároztuk a specifikus lizálódást. Negatív kontrollként influenzavírussal nem fertőzött célzott sejtek lizálódását határoztuk meg. Pozitív kontrollként influenzavírussal fertőzött célzott sejtek lizálódását határoztuk meg, három alkalommal 130 gg Vl-PR-NP-nel injektált és az élő, virulens A/HK/68 influenzavírus-törzzsel végzett fertőzést túlélt egerekből nyert lépsejtek alkalmazásával.

Eredmények: Az intradermálisan injektált egerekből nyert lépsejtek alkalmazásával valamennyi effektorsejt:célsejt arány mellett specifikus lizálódás volt megfigyelhető. A nem injektált egerek vagy az inszertált PRNP-gént nem tartalmazó VI-vektorral injektált egerek lépéből nyert eífektorsejtek alkalmazásával nem volt specifikus lizálódás kimutatható. Ezenkívül, az intradermális bejuttatással elért specifikus lizálódás valameny- 77 nyi effektorsejt: célsejt arány mellett hasonló mértékű volt, mint az intramuszkuláris beadással elért eredmények. Mind az intradermálisan, mind az intramuszkulárisan injektált egerekben meghatároztuk a tüdőben mérhető influenzavírus-titereket. Csoportonként 5 egeret, három hetes időközökben 3 x 200 pg dózissal oltottunk, az utolsó dózist követően három héttel végzett kísérletes fertőzéssel az alábbi eredményeket kaptuk:

vakcinaa beadás módja egér tüdőtiter*

		5. nap	7. nap
Vl-PR-NP	intradermális	5,2+/-0,2	4,1+/-1“
VI	intradermális	5,9+/-1	6,6+/-0,3
Vl-PR-NP	intramuszkuláris	4,6+/-0,4	4,5+/-1,1
Semmi		6,2+/-0,3	5,9+/-0,3

* Logaritmusban kifejezett titer átlaga +/- SEM. “ Egy egérben egyáltalán nem tudtunk vírust kimutatni.

Végül, 28 napig követtük az egerek túlélését, melyet százalékban kifejezve adtunk meg. A 28. napra az intramuszkuláris Vl-NP-PR injektálásban részesült egerek 89 %-a, az intradermálisan oltott recipiensek 50 %-a maradt életben. A VI-vektorral oltott egerek közül egy sem, a kezeletlen egerek 30 %-a maradt életben. A fenti kísérlet azt mutatta, hogy az A/PR/8/34-törzsből származó nukleoproteint kódoló DNS képes olyan CTL-k keletkezésének kiváltására, melyek a heterológ A/Victoria/7 3-törzsből származó nukleoproteint felismerik és képes a heterológ Α/ΗΚ/68-törzzsel szemben védettséggel járó immunválasz létrehozására.

10. példa

Polinukleotiddal végzett vakcinázás főemlősökben

1. NP-nel szembeni ellenanyagok termelődése Rhesus-majmokban: az

1. napon Rhesus-majmokat (006: NP; 009: NP vagy 101: kontroll; 021:

-78kontroll) injektáltunk intramuszkulárisan, összesen három helyen, egy-egy helyre 1 mg RSV-NP beadásával. Ugyanabban az időben, más helyekre 1-1 mg, a szentjánosbogár luciferázt kódoló RSV-LUX- és CMV-int-LUXkonstrukciókat injektáltunk. A 15. napon az állatokat egy-egy helyen a fentivel megegyező mennyiségű DNS-sel, valamint 1 mg, a kloramfenikol acetil transzferázt expresszáló riportergént hordozó pD5-CAT-plazmiddal injektáltuk. A riportergént tartalmazó izomrészletekből biopszia-mintákat vettünk és azokat a riportergén aktivitására nézve vizsgáltuk. Az első injektálást követően 3, 5, 9, 11, 13 és 15 nappal szérumot gyűjtöttünk. Az első anti-NPellenanyag tartalmú pozitív mintát all. héten kaptuk és pozitív mintákat gyűjtöttünk a 13., valamint a 15 héten. Az anti-NP-ellenanyagokat ELISAeljárással határoztuk meg. Az eredményeket a 9. ábra mutatja.

2. Hemagglutináció-gátló (Hl) ellenanyagok Rhesus-majmokban: A majmokat az 1. napon intramuszkulárisan 100 pg V1J-PR-HAkonstrukcióval injektáltuk. Két-két állat mindkét négyfejű combizomba adva 1 mg, 100 pg és 10 pg DNS-t kapott. Mindegyik injektálást 0,5 ml térfogatban végeztünk. Az állatoktól az injektálást megelőzően az 1. napon vért vettünk. A 15. napon valamennyi állatot újból injektáltuk a DNS-sel, és ezután 2-4 hetes időközökben vért vettünk. A hemagglutináció-gátló (Hl) ellenanyagok titere az A/PR/8/34-törzzsel szemben vizsgálva a V1J-PR-HA DNS első injektálását követően az 5., a 9. és a 12. héten volt pozitív. Az eredményeket az alábbi 10-1. táblázatban összegeztük:

10-1. táblázat

V1J-PR-HA DNS-sel injektált Rhesus-majmokban meghatározott HIellenanyag-titer.

Rhesus# dózis HI-ellenanyag-titer a megadott heteken

		kezelés	3. hét	5. hét	9. hét	12. hét
		előtt
88-010	1 mg	<10	<10	320	320	320
88-0200		<10	<10	<10	40	40
88-021	100 pg	<10	<10	<10	40	20
90-026		<10	<10	20	20	40
88-084	10 pg	<10	20	40	20	10
90-028		<10	<10	20	<10	<10

11. példa

Vadászmenyétekben végzett polinukleotid-vakcinázási vizsgálatok

1. A vadászmenyétekben végzett polinukleotid-vakcinázást annak meghatározása céljából végeztük, hogy az állatokban HA-proteint (törzsspecifikus neutralizáló ellenanyagok termelődését kiváltó felszíni proteint) vagy az NP, NS1, PB1, M belső proteineket (feltételezetten törzstől független, sejt által közvetített immunválaszt kiváltó proteineket) kódoló génekkel végzett immunizálás védettséget hoz-e létre influenza-A-fertőzéssel szemben. Az állatokat a különböző influenzagéneket kódoló DNS-eket tartalmazó VIJ-vektorral injektáltuk az alábbiakban ismertetettek szerint:

il

-8011-1. táblázat

csoport	konstrukci ó	dózis	az immunizált álatok száma	kísérletes fertőzés H1N1törzzsel	kísérletes fertőzés H3N2törzzsel
1	V1J-HA	1000 mg	16	8	8
2	V1J-NP	1000 mg	16	8	8
3	V1J-	összesen	16	8	8
	NP+NS1+	2000 mg
	PB1+PB2
	+M
4	V1J-	összesen	16	8	8
	HA+NP+	2000 mg
	NS1+PB1
	+PB2+M
5	V1J-	1000 mg	16	8	8
6	semmi	semmi	10	5	5
állatok			90	45	45

összesített száma

2._Az immunizálást követően a 22. és 43. napokon az immunizált állatokból szérumot gyűjtöttünk és azt ELISA-eljárással neutralizáló (hemagglutináció-gátló, HI-) ellenanyagok, valamint nukleoproteinnel (NP) szemben termelődött ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk. A DNS-sel injektált állatokban a megfelelő génekkel szemben ellenanyagok termelődtek. A fentieket a csatolt 10., 11. és 16. ábrák szemléltetik.

• · • ·

3. A 128. napon, kiválasztott immunizált állatokat 1200 TCID50 influenza-AZHK/68-törzzsel kísérletesen fertőztünk. Ez a törzs heterológ az A/PR/8/34-törzshöz képest, melyből az immunizálásnál alkalmazott kódoló szekvenciák származtak, a védettség tehát törzstől független, sejt által közvetített immun-mechanizmusokon alapuló immunitás létrejöttét jelenti. Amint azt a csatolt 12. ábra mutatja, a belső proteineket kódoló DNS-sel immunizált állatokban a vírusszóródás mértéke a kontrolihoz képest statisztikailag szignifikáns módon csökkent, ami azt bizonyítja, hogy a polinukleotid-immunizálás a vadászmenyétekben képes immunválasz kiváltására és az így létrejött válasz védettséggel jár.

4. Hasonló módon vizsgáltuk az A/PR/8/34-törzzsel végzett homológ kísérletes fertőzés hatását és hasonlóképp kimutattuk, hogy a polinukleotidvakcinázással kiváltott neutralizáló ellenanyag tennelődés védettséget hozott létre.

12. példa

A VI Jns-vektor előállítása

Az integrációs vizsgálatok megkönnyítésére a VIJneo-vektorhoz egy Sfil hasítási helyet adtunk. A vektor BGH-szekvenciájában található KpnI hasítási helyre egy, a kereskedelemben hozzáférhető, 13 bázispárból álló Sfíl-linkert kapcsoltunk (New England BioLab). A VIJneo-vektort KpnI enzimmel linearizáltuk, gélen tisztítottuk, T4 DNS polimeráz enzimmel tompa végűvé alakítottuk és a tompa végű Sfil-linkerrel ligáltuk. Restrikciós térképezés alapján izolált kiónokat választottunk és azokat a linkeren át végzett szekvenálással ellenőriztük. Az új vektort VIJns-vektomak neveztük (17. ábra). A VIJns-vektorba (az Sfil hasítási helyet tartalmazó vektorba) klónozott heterológ gének expressziója összehasonlítható mértékű volt a

-82megfelelő géneket tartalmazó VIJneo-vektor (a KpnI hasítási helyet tartalmazó vektor) által eredményezett expresszióval.

13. példa

Immuno genitás

1. Humorális immunválasz.

A HA-, NP- és Ml-influenzagéneket kódoló DNS injektálása egerekben, vadászmenyétekben és nem-humán főemlősökben, (ezen belül afrikai zöldmajmokban és Rhesus-majmokban) humorális immunválasz létrejöttét eredményezte. Mostanáig, az A/PR/34, a B/Panama/45/90, az A/Beijing/89, a A/Texas/91, a A/Hawaii/91 és az A/Georgia/93 influenzavírus-törzsekből klónozott HA-géneket tartalmazó PNV-król mutatták ki, hogy ellenanyagok termelődését váltják ki.

a) Egerek: DNS-sei injektált egerek szérumában NP-nel és Mlproteimiel szemben termelődött ellenanyagok jelenlétét ELISA-eljárással mutattuk ki. Már 1 pg NP-DNS (A/PR/34) egyszeri beadásával (a legalacsonyabb vizsgált dózissal) jelentős mértékű ellenanyag-titert (10⁴-10⁶) tudtunk kiváltani, amely az injektálást követően már 2 héttel (a legkorábbi vizsgált időpontban) kimutatható volt és az injektálást követően legalább hat hónapig nem csökkent. Ezek az NP-ellenanyagok nem neutralizáló ellenanyagok és nem játszanak szerepet a védettség létrehozásában. Azok jelenléte azonban a DNS-injektálást követően az NP-protein in vivő expresszálódására utal. Ezzel szemben, a HA-nel szemben termelődő ellenanyagok a homológ influenzavírus-törzzsel szemben védettséget hoznak létre. Az A/PR/34-törzsből klónozott HA-DNS injektálása neutralizáló ellenanyagok termelődését váltotta ki, amit in vitro hemagglutináció-gátlási (Hl) vizsgálattal mutattunk ki. Számos, három alkalommal, egyenként 100 pg HA-DNS-sel injektált egérben a HI-titer >= 1280 volt és több, két alkalom- • « « · · · • · · · · · · · · » .

-83mal, csupán 0,1 pg dózissal injektált állatban kimutatható mértékű titereket észleltünk. Dózis-válasz kapcsolat volt kimutatható HI-titer és a DNS-dózis között, és összefüggést lehetett kimutatni a HI-titer és az injektálások száma között (13-1. táblázat):

13-1, táblázat

Humorális immunválasz létrehozása egerekben.

dózis (pg)	HI-GMT (GMT = “geometric mean titer”; a titerek mér-
tani középarányosa)	3
dózisok száma 1	2
HA-DNS (100)	75	106	260
HA-DNS (10)	37	69	86
HA-DNS (1)	<10a	13	24
HA-DNS (0,1)	<10b	<10a	<10a
kontroll-DNS	<10b	<10b	<10b
(100)
nem injektált		<10b

13-1. táblázat: Nőstény BALB/c-egereket (4-6 hetes korú egereket) A/PR/34 HA-DNS-sel injektáltunk (V1JHA) egy, két vagy három alkalommal, három hetes időközökben, a jelzett dózisok alkalmazásával. Negatív kontroliokként inszertált gént nem tartalmazó vektort (V1J) tartalmazó kontroll DNS-sel injektált egereket, valamint influenzavírussal nem találkozott, nem injektált egereket alkalmaztunk. Az első dózis beadását követően hét héttel szérummintákat vettünk és azokat hemagglutináció-gátló (HI-) ellenanyagok jelenlétére vizsgáltuk. Az adatokat a HI-titerek mértani középarányosaként adtuk meg, ahol n=10.

^a a vizsgált egerek közül több pozitív HI-titerrel rendelkezett.

^b valamennyi egér.

-84A HI-ellenanyagok jelenléte valamennyi vizsgált egérben összefüggést mutatott a homológ kísérletes fertözéses modellben létrejött védettséggel. A HA-DNS-sel (A/PR/34) injektált egerekben a HI-ellenanyagválasz legalább hat hónapig lényegében változatlan maradt. Ugyancsak HA-ellenanyagok termelődését tudtuk kimutatni az egerekben ELISA-eljárással az A/Beijing/89, a B/Panama/45/90 és a A/Texas/91 influenzavírus-törzsekből származó HA-DNS alkalmazását követően.

A szakirodalomban közölt eredmények alapján, melyek szerint DNSinjektálást követően idősebb egerekben a riportergén expressziója csökkent, vizsgáltuk a kor és a HA-ra adott humorális immunválasz összefüggését. Mivel öregedő szűz nőstény egerek nem álltak rendelkezésre, körülbelül 10 hónapos korú kiöregedett tenyészegereket használtunk. Kiöregedett tenyészegerek és 4-6 hetes korú szűz egerek HA-nel szembeni ellenanyagtermelő képességét hasonlítottuk össze. Az idősebb egerek már 1 pg HADNS dózis (a legalacsonyabb vizsgált dózis) injektálását követően képesek voltak HA-ellenanyagok termelésére, bár annak titere alacsonyabb volt, mint a fiatalabb egerekben mért titerek (13-11. táblázat):

13-11. táblázat

Az életkor hatása a humorális immunválaszra.

inokulum	dózis (pg)	GMT (4-6 hetes)	GMT (10 hónapos)
HA-DNA	100	1034	110
HA-DNA	10	338	68
HA-DNA	1	80	20
kontroll DNS	100	<5a	<5a
nem injektált	-	<5a	<5a
influenza-fertőzés		538	36

-85..· ...- ..- ...·

13-11. táblázat: Nőstény BALB/c-egereket (4-6 hetes korú szűz egereket és 10 hónapos kiöregedett tenyészállatokat) A/PR/34 HA-DNS-sel injektáltunk (V1JHA) a jelzett dózisok alkalmazásával, három alkalommal, három hetes időközökben. Negatív kontroliokként kontroll DNS-sel (VIJvektorral) injektált egereket, valamint influenza vírussal nem találkozott, nem injektált egereket alkalmaztunk. Összehasonlításképp, más egereket az A/PR/34-influenzatörzs szubletális (pusztulást még nem okozó) dózisával injektáltunk. Az első dózis beadását követően kilenc héttel szérummintákat vettünk és azok HI-titerét meghatároztuk. Az adatokat a HI-titerek mértani középarányosaként adtuk meg, ahol n=15.

^a a vizsgált egerek közül valamennyi negatív volt HI-ellenanyagokra nézve.

Ez azonban nem magának a PNV-nak a következménye volt, hanem inkább annak, hogy az idősebb egerekben általában csökkent a Immorális immunválaszra való képesség, hiszen az idősebb korú egerek élő A/PR/34vírussal történő fertőzésre is alacsonyabb ΗΙ-válasszal reagáltak, mint a fiatalabb egerek. Valójában, a DNS-sel vakcinázott idős egerekben a HIellenanyagok szintje látszólag kevésbé maradt el a fiatalabbakban meghatározott szinttől, mint az influenzával fertőzött idős egerekben. Továbbá, a vizsgálatokban felhasznált kiöregedett tenyészállatok testtömege körülbelül 50 %-kal nagyobb volt, mint a hasonló korú tipikus szűz egereké, mely mások eredményei alapján, akik az egereknél kalória-megszorításos étrendet alkalmaztak, hátrányosan befolyásolhatta ezen állatok immunválaszát. A fenti és más okok figyelembevételével, a fenti állatok immunválasza nem tekinthető reprezentatívnak. Mindamellett, a kor (legalább 10 hónapos korig) úgy tűnik még 1 pg dózis mellett sem csökkenti szignifikánsan a polinukleotid-vakcinázással kiváltott humorális immunválaszt.

il

b) Vadászmenvétek: Humorális immunválaszt váltottunk ki vadászmenyétekben az A/PR/34, az A/Beijing/89, az A/Hawaii/91 és az A/Georgia/93 influenzavírus-törzsekből származó HA-DNS injektálásával. A megfelelő PNV az A/PR/34 törzzsel szemben ΗΙ-ellenanyagok és a többi törzsből származó HA-nel szemben ELISA-eljárással kimutatható HI-ellenanyagok termelődését váltotta ki. Az A/Beijing/89, az A/Hawaii/91 és az A/Georgia/93 influenzavírus-törzsekből származó HA-DNS-sel injektált vadászmenyétek széruma HI-ellenanyagokat és neutralizáló ellenanyagokat tartalmazott, tehát ezekben az állatokban a vírusfertőzéssel szemben védettségjött létre.

c) Nem-humán főemlősök: (lásd fent, a 10. példát is). Rhesusmajmokat immunizáltunk két alkalommal HA-DNS-sel (A/PR/34), egy-egy lábba 10 gg, 100 gg és 1000 gg dózis injektálásával. A 100 gg vagy 1000 gg dózissal oltott állatokban a HI-titerek 320-as értéket értek el és a 10 gg dózist kapott két majom közül az egyikben a HI-titer értéke 80 volt. A szérumokat 13 hónapon át vizsgáltuk; a HI-titerek a 6-13. hónapok folyamán nem csökkentek jelentős mértékben (13-III. táblázat):

13-III. táblázat

HI-ellenanyagok termelődésének kiváltása Rhesus-maimokban,

dózis (gg)	immunizál	1 hónap
2000	ást megelőzőé n <10	640
2000	<10	40
200	<10	80
200	<10	80
20	<10	40
20	<10	<10

2 hónap	5,5 hónap	13 hónap
320	160	80
40	20	20
40	40	80
80	40	20
20	20	20
<10	<10	<10

il

-8713-IIL táblázat: 4,3-8,8 kg testtömegü (vegyesen nőstény és hím) Rhesus-majmokat injektáltunk A/PR/34-DNS-sel (V1JHA) a 0. és a 2. héten, a jelzett dózisok alkalmazásával. Az első dózis beadását követően a jelzett időpontokban szérummintákat vettünk és azokban a HI-titereket meghatároztuk. Az adatok az egyes állatokban meghatározott HI-titereket jelentik.

Afrikai zöldmajmokat 100 pg HA-DNS-t (A/Beijing/89) tartalmazó PNV-kombinációval injektáltunk, a dózist követően 4-6 héttel vett szérumokban meghatározott GMT-érték 29 volt (9 állatból 8 válaszreakciót mutatott). Ez mind az engedélyezett, szubviriont (virion-alegységet) tartalmazó vakcinákra (GMT=16; 6-ból 5 válaszreakció), mind az engedélyezett, teljes viriont tartalmazó vakcinákra (GMT=36; 6-ból 6 válaszreakció) azonos időpontban adott válaszreakciókkal összehasonlítva előnyösebb (18. ábra). A 10 pg HA-DNS dózist kapott állatokban második immunizálásnak jelentős immunválaszt megerősítő hatása volt (az 1. dózist követően a GMT=1,9; a

2. dózist követően a GMT=199). Az engedélyezett, teljes viriont tartalmazó vakcinák az előbbihez hasonló, immunválaszt megerősítő hatást mutattak, míg a szubvirion-vakcinák második dózisával elért HI-titerek csak átmenetinek bizonyultak. Eddig, a legjobb engedélyezett vakcinával (teljes viriont tartalmazó vakcinával) összehasonlítva, a 10 pg és 100 pg HA-DNS dózissal immunizált állatokban 18 hetes időszakon át vizsgálva az előbbi vakcinával elérhetőhöz hasonló HI-ellenanyagszinteket tudtunk kimutatni. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a neutralizáló ellenanyagok termelődésének kiváltásában a PNV legalább olyan hatékony volt, mint a teljes viriont tartalmazó vakcina, és jobb volt, mint a vírus-alegységet tartalmazó vakcina. Tisztított alegység-vakcinák alkalmazásával egerekben nem sikerült kimutatható immunválaszt kiváltani; ezért nem-humán főemlősökben azokat nem vizsgálták. Ebben a vizsgálatban, 5 féle DNS-t tartalmazó PNV-koktélt al- ι!

- 88 kalmaztunk, melyek A/Beijing/89-, B/Panama/90- és A/Texas/91-törzsekből származó HA-DNS-t, valamint A/PR/34-törzsből származó NP- és MlDNS-t kódoltak, hogy egy vakcina-jelölthöz hasonló vakcinát kapjunk. Ugyancsak vizsgáltuk az állatokban a vakcina egyéb összetevőivel szemben létrejött immunválaszt, ellenanyagok jelenlétét tudtuk kimutatni a B/Panama/90-HA-nel és az A/PR/34-NP-nel szemben. Egy másik kísérletben, PCR-eljárással klónozott HA-DNS két dózisának injektálásával az A/Texas/91-HA-nel szemben mind HI-, mind neutralizáló ellenanyagok termelődését tudtuk kimutatni.

2. Sejt által közvetített immunválasz.

Lásd, a 3. példát fent.

3. Immunválasz kiváltása.

a) Humorális immunitás: A DNS-injektálást követően Immorális és sejt által közvetített immunválasz keletkezéséhez vezető folyamatok még nem tisztázottak. A neutralizáló ellenanyagok előállításához (például az influenzavírus HA-nel szemben), a sejteknek az antigént valószínűleg plazmamembránon kell expresszálnia vagy az extracelluláris közegbe kell kiválasztania. Ezenkívül, a transzfektált sejteknek a HA-t a virionban található struktúrához hasonló másodlagos, harmadlagos és negyedleges struktúrával kell expresszálnia. HA-DNS-sel tranziens módon transzfektált RD-sejtek (rhabdomioszarkóma; mioblaszt eredetű sejtek) alkalmazásával, rozetta vizsgálati eljárásban a HA sejtfelszíni expresszálódását mutattuk ki. A vörösvérsejtek a transzfektált sejtek felszínére agglutinálódtak, de nem agglutinálódtak az “ál-transzfektált” sejtek felszínére, ami nemcsak arra utal, hogy a HA a felszínen expresszálódott, hanem arra is, hogy megtartotta a sziálsav-tartalmú proteinekhez történő kötődéshez szükséges megfelelő konformációt.

b) Sejt által közvetített immunitás: A sejt által közvetített immunválasz keletkezéséhez (például az influenzavírus NP-nel szemben), a peptidek proteolitikus feldolgozására (“processing”) és a belőlük származó peptidek

I.-osztályú MHC-antigénnel kapcsoltan történő prezentálására van szükség. A DNS injektálását követően immunválasz keletkezéséhez vezető antigénprezentáló sejtek természete még nem ismert. Az izomsejtekben az I.osztályú MHC-antigének expressziója alacsony szintű, és felszínükön feltehetően nem expresszálnak stimulációt elősegítő molekulákat. Az izomsejteket ezért általában nem tekintik antigén-prezentáló sejteknek. Bizonyítékok sora támasztja alá azonban azt, hogy az izomsejtek a DNS intramuszkuláris injektálását követően szerepet játszanak az immunválasz létrejöttében. Először, csupasz plazmid-DNS befogadására, ezáltal in situ proteinexpresszióra képes szövetekre vonatkozó korlátozott vizsgálatok, azt mutatták, hogy a plazmidnak közvetlenül a szövetbe történő injektálását követően számos sejttípus képes riportergének expresszálására, de lényegesen kevésbé hatékonyan, mint az izomsejtek. A intramuszkuláris injektálást követően a nem-izomsejtek DNS-felvételére vonatkozó teljes analízist nem közöltek, de valószínű, hogy azokban a felvétel hatékonysága még kisebb. Másodszor, a DNS intramuszkuláris injektálását követően a riportergének expresszióját vázizom- és szívizomsejtekben számos különböző faj esetében kimutatták. Harmadszor, bár DNS injektálását követően CTL-válasz kiváltható más úton is (intravénás és intradermális beadással), a leghatékonyabb védettséget létrehozó immunválaszt egerekben a DNS intramuszkuláris injektálásával értük el. Negyedszer, a CTL-k in vitro képesek mioblasztok és miociták felismerésére és lizálására és a lizálódás fokozható g-interferonnal történő előzetes kezeléssel, mely kezelés fokozza az I.-osztályú MHC-antigének expresszióját. Végül, stabilan transzferált, NP-t expresszáló mioblasztok transzplantációja influenzavírussal nem találkozott szingén egerekbe in vivő »··· ··

-90védettséggel járó, sejt által közvetített immunválasz létrejöttéhez vezetett (20. ábra). A DNS injektálást követően az izomsejtekben történő antigénexpresszió tehát elegendő a védettséggel járó immunválasz kiváltásához. Lehetséges továbbá, hogy a nem-izomsejtek által történő DNS-felvétel és az azokban végbemenő expresszió nem játszik szerepet a védettség kiváltásában. A polinukleotidok vakcinaként történő alkalmazása szempontjából előnyös lenne a DNS-felvételt az izomsejtekre korlátozni. Először, az izomsejtek teljesen differenciálódtak és nem osztódnak. Ez lényeges lehet abból a szempontból, hogy a plazmid-DNS kromoszómába történő beépülésének lehetőségét csökkentsük és az antigén folyamatos expresszióját fenntartsuk, ami tartós immunitáshoz vezethet. Másodszor, a miociták nagy méretű, többmagvú sejtek, melyek mioblasztok fuzionálódásával regenerálódásra képesek. Ez magyarázatul szolgálhat arra, hogy a DNS injektálása mért vezet olyan protein-expresszióhoz, amely CTL-k által történő citolitikus károsodásra utaló jel nélkül hosszú ideig fennmaradhat.

14. példa

Vizsgálatok védettség létrehozására

Influenzavírus-antigéneket kódoló DNS-sel történő immunizálás a humán influenzafertözés tanulmányozására széles körben elfogadottan használt két állatmodellben (egerekben és vadászmenyétekben) influenzatörzsek különböző kombinációja által okozott pusztulással és betegséggel szemben védettséget hozott létre, valamint csökkentette a vírusterhelést.

1. Heterológ (heterotípusos, csoportspecifikus) védettséget állatmodellekben az engedélyezett, elölt vírusvakcinák alkalmazásával nem sikerült hatékonyan létrehozni, DNS-vakcinázással azonban igen. A védettséget NP-t vagy Ml-et kódoló DNS laboratóriumi állatokba történő injektálásával *··· · · »···

-91 mutattuk ki. A fenti DNS-ek által kiváltott keresztreaktív, sejt által közvetített immunválasz (CMI) védettséggel járt.

a. Egerek: A/PR/34-törzsböl származó NP-t kódoló DNS-sel intramuszkulárisan injektált BALB/c- és C3H-egerekben a teljes légzőrendszemek egy heterotípusos törzs (az A/PR/34-törzsben található Hl- helyett H3-antigént tartalmazó törzs), a A/Hong Kong/68-törzs (H3N2) LD90 (az egerek 90 %-ának pusztulását okozó) mennyiségével történő kísérletes fertőzését követően, a vírus által okozott pusztulással és megbetegedéssel szemben, (melyet a testtömeg-csökkenés alapján értékeltünk), védettség jött létre. A 21. ábra mutatja a 3 hetes időközökben, 3 alkalommal NPDNS-sel (200 pg/dózis) immunizált, majd az utolsó immunizálást követően 3 héttel kísérletesen fertőzött BALB/c-egerek túlélési arányát. A 22. ábra a kísérletes fertőzést követően az immunizált egerekben a testtömegcsökkenés gátlását szemlélteti, összehasonlítva a kontroll egerekben tapasztalt súlyos testtömeg-veszteséggel. A 23. ábra NP-DNS-sel immunizált egerekben a felső légutak kísérletes fertőzését követően 7 nappal a tüdőben mért vírusterhelés csökkenését mutatja összehasonlítva a nem kódoló kontroll DNS-sel immunizált egerekkel. Az NP-DNS-sel immunizált egerek öszszehasonlítva a kontroll egerekkel a pusztulással szemben teljes mértékű védettséget mutattak, valamint az előbbiekben csökkent a testtömeg-veszteség és tüdejükben alacsonyabb vírusterhelést mértünk. A pusztulással és testtömeg-csökkenéssel szembeni védettség létrehozására 3 DNS-injektálás alkalmazása esetén injekciónként <=6,25 pg NP-DNS-re volt szükség (24. ábra). Az NP-DNS-sel történő immunizálással létrehozott védettség az immunizált egerekben legalább 3 hónapig lényegében változatlan maradt. A védettség szintje az utolsó immunizálást követően 6 hónapig fennmaradt, de a 3-6. hónapok között kis mértékben csökkent. Egyetlen NP-DNS dózissal a

22. héten, három héttel a 25. héten történő kísérletes fertőzést megelőzően

-92végzett ismételt vakcinázás azonban visszaállította a teljes védettséget (25. ábra). Az egerek NP-DNS-sel történő immunizálása tehát tartós, megerősíthető, heterológ védettséget eredményezett. Az, hogy a fenti állatok újraoltása anamnesztikus (memórián alapuló) választ váltott ki arra utal, hogy az NP-DNS-sel történő immunizálással az immunrendszer memóriáját is kiváltottuk.

b. Vadászmenvétek: A vadászmenyéteket gyakran alkalmazzák modellként humán influenzafertőzés vizsgálatára, mivel azok humán iníluenzavírus-izolátumok széles körével történő fertőzéssel szemben fogékonyak. A vadászmenyétekben a vírusreplikáció elsősorban az orrüregben és a légcsőben, sokkal kisebb mértékben a tüdőben megy végbe, ellentétben az egerekkel, melyekben a tüdők vírusterhelése nagy. A vadászmenyétekben létrejött vírusfertőzést legkönnyebben az orr mosófolyadékában meghatározott vírustiterek alapján követhetjük. A nemrégiben emberből izolált törzsből (A/Beijing/89, H3N2) származó NP-DNS-sel vagy Ml-DNS-sel egyedül vagy kombinációban immunizált vadászmenyétekben egy mezei izolátummal, az A/Georgia/93-törzzsel (H3N2) történő kísérletes fertőzést követően az 1-6. napokon szignifikánsan csökkent a vírusszóródás mértéke (26. ábra). Ez a mezei izolátum az A/Beijing/89-típusú törzshöz képest olyan antigénszerkezeti módosuláson ment át, hogy az A/Beijing/89-törzs alapú engedélyezett vakcinák az A/Georgia/93-törzs által okozott betegséggel szemben emberben kis mértékű védettséget nyújtottak vagy egyáltalán nem nyújtottak védettséget. Az A/PR/34-törzs belső proteinjeit kódoló DNS-sel immunizált vadászmenyétek orrában az azonos típusú A/PR/34törzzsel történő fertőzést követően az 5-6. napokon szignifikánsan csökkent a vírussszóródás mértéke (27. ábra). Az A/Georgia/93-törzzsel történő kísérletes fertőzést követően mind a korai, mind a későbbi időpontokban a vírusszóródás csökkenését figyeltük meg, míg az A/PR/34-törzzsel történő kísér- ·· ··· · ·· »«·· • · · * · · ··«··· ····«· ,ί · · · · « · · · · · · « « A«

-93letes fertőzést követően a vírusszóródás csökkenését későbbi időpontokban észleltük, ami a vadászmenyétekben a két törzs eltérő virulenciájával lehet magyarázható.

2. Homológ (homotípusos, típus-specifikus) védettség létrejötte könynyen kimutatható volt HA-DNS-sel immunizált egerekben, valamint vadászmenyétekben.

a. Egerek: A/PR/34-törzsből származó HA-DNS-sel immunizált BALB/c-egerekben teljes védettség jött létre az A/PR/34-törzs LD90 (az egerek 90 %-ának pusztulását okozó) mennyiségével történő kísérletes fertőzéssel szemben. Az immunizált egereknél a kísérletes fertőzést követően sem pusztulást (28. ábra) sem 5 %-ot meghaladó testtömeg-csökkenést nem tapasztaltunk (29. ábra), míg a kontroll állatok 90-100%-a elpusztult és azoknál súlyos testtömeg-csökkenést észleltünk. A védettség létrehozásához szükséges dózis titrálása azt mutatta, hogy 1 pg HA-DNS három alkalommal történő injektálása elegendő volt a teljes védettség kiváltásához (30. ábra).

b. Vadászmenvétek: az A/PR/34-törzsből származó HA-DNS-sel immunizált vadászmenyétekben a homológ törzzsel történő kísérletes fertőzést követően az 1-6. napokon szignifikánsan alacsonyabb volt a vírusszóródás mértéke, mint a kontroll DNS-sel injektált állatokban (31. ábra). Hasonlóképp, az A/Georgia/93-törzsből származó HA-DNS-sel immunizált vadászmenyétekben a homológ törzzsel végzett kísérletes fertőzést követően az 1. napon és a 3-7. napokon szignifikánsan alacsonyabb vírusszóródást figyeltünk meg (32. ábra). Valamennyi immunizált .vadászmenyét szérumában a megfelelő törzzsel szemben termelődött HI-ellenanyagok voltak kimutathatók (lásd fent). A HA-DNS-sel végzett immunizálás tehát homológ védettséget hozott létre.

« · · ·

3. Vakcina-kombinációk: A HA-DNS azon képességét, hogy NP- és Ml-DNS-sel kombinálva szélesebb körű védettséget hoz létre, vadászmenyétekben vizsgáltuk:

a. Antigénszerkezeti módosuláson átment variánsokkal szemben létrejött védettség köre: Az A/Beijing/92-törzsben az A/Beijing/89-típusú törzshöz képest olyan antigénszerkezeti módosulás jött létre, amely elegendő mértékű volt ahhoz, hogy sok, az A/Beijing/89-törzset tartalmazó engedélyezett vakcinával immunizált ember nem volt védett az A/Beijing/92variáns által okozott megbetegedéssel szemben. Észak-Amerikában az A/Beijing/92-törzshöz hasonló mezei izolátumok, például az A/Georgia/93törzs a betegség széles körű elterjedését okozták. Az Észak-Amerikai mezei izolátumok antigénszerkezetileg hasonlók az A/Beijing/92-típustörzshöz, de különböznek attól az izolátumok földrajzi megoszlásában, valamint passzálási előzményeikben, nevezetesen, ezeket tojások helyett emlős sejttenyészetben passzálták. Az A/Beijing/92-törzshöz hasonló törzsek HA aminosav-szekvenciáj a az AZBeijing/89-törzshöz hasonló törzsektől azonban csak a HAl-régióban található 11 pontmutációban tér el (a 133., 135., 145., 156., 157., 186., 190., 191., 193., 226. és 262. pozíciókban). Ezért megkíséreltük annak meghatározását, hogy a HA-DNS-sel kiváltott homotípusos immunválasz kombinálása az NP- és Ml-DNS által indukált keresztreaktív CMI-válasszal nagyobb fokú védettséget hoz-e létre a fenti antigénszerkezeti módosuláson átment variánssal szemben. Vadászmeny étek immunizálása az A/Beijing/89-törzset tartalmazó engedélyezett vakcinával vagy az A/Beijing/89-törzsből vagy az A/Beijing/89-törzshöz hasonló mezei törzsből (A/Hawaii/91) származó HA-DNS-sel csökkentette a vírusszóródás mértékét a vadászmenyétek A/Georgia/93-törzzsel történő fertőzését követően (33. ábra). Azokban a vadászmenyétekben, melyeket NP-, Ml- és HADNS-t tartalmazó kombinált PNV-vakcinával immunizáltunk szignifikánsan

Il ··: ···. ··; ···.

«* ··· «· ·«·

-95alacsonyabb volt a vírusszóródás mértéke, mint az engedélyezett termékkel vagy csak HA-DNS-sel immunizált vadászmenyétekben (34. ábra). Az A/Hawaii/91 HA-DNS-t, valamint az A/Beijing/89-törzsböl származó NPés Ml-DNS-t tartalmazó kombinált vakcina alkalmazásával kapott védettség nem tért el szignifikánsan a homológ A/Georgia/93-törzsből származó HADNS-sel kiváltott maximális védettségtől (35. ábra). A HA-, NP- és MlDNS kombinációja tehát jobb védettséget hozott létre egy antigénszerkezeti módosuláson átment variánssal szemben, mint az engedélyezett vakcina.

b. A vakcina-antigén passzálási előzményeinek hatása: Az MDCKsejteken szövettenyészetben passzált, amerikai egyesült államokbeli mezei izolátumból (A/Hawaii/91) szánnazó HA-DNS-szekvenciát tartalmazó vakcinával immunizált vadászmenyétekben az antigénszerkezeti módosuláson átment A/Georgia/93-törzzsel történő kísérletes fertőzést követően kisebb mértékű vírusszóródást tapasztaltunk (két dimenziós ANOVA-eljárással p=0,021), mint a tojáson passzált A/Beijing/89-törzshöz tartozó elölt vírust tartalmazó engedélyezett vakcinával immunizált vadászmenyétekben (33. ábra). Ezzel szemben, az A/Georgia/93-törzzsel történő kísérletes fertőzést követően az A/Beijing/89-törzsből származó HA-DNS-t kapott vadászmenyétekben tapasztalt vírusszóródás mértéke nem tért el szignifikánsan (p=0,058) az azonos vírust tartalmazó engedélyezett vakcinával immunizált vadászmenyétekben mért értékektől. A tojáson és emlősszöveten szaporított törzsek a HA HA 1-régiójában létrejött két pontmutációban különböznek (a 186. és 193. pozíciókban), mindkettő a B-antigénhelyen található, közel a HA-monomer csúcsához, mely régióról feltételezzük, hogy lényeges szerepet játszik a Hl- és a neutralizáló ellenanyagokhoz történő kötődésben. Esetenként, néhány humán influenza-izolátum csirke-vörösvérsejthez (RBC) való kötődési képessége kezdetben nagyon kis fokú volt, de a tojásokon végzett sorozatos passzálások során javult, ami arra utal, hogy a HA recep• · • · ·4

-96tor-kötő régiója a csirkesejteken történő szaporítás közben jelentős szelekción megy át. Kis szekvencia-variációk HA-alapú influenzavakcinák hatékonyságára kifejtett hatásának laboratóriumi állatokban végzett vizsgálata aláhúzza annak fontosságát, hogy a vakcinák előállításánál olyan közel kell maradnunk a vad-típusú vírus szekvenciájához, amennyire ez csak lehetséges.

c. Nem-humán főemlősök: Nem-humán főemlősöket nem használnak gyakran kísérletes influenza-fertőzés modellezésre, mivel a fertőzésre nem reagálnak klinikai tünetekkel. Nem-humán főemlősökben vizsgáltuk azonban, a PNV vakcina-kombinációk immunogén hatását összehasonlítva az elölt vírust tartalmazó engedélyezett vakcinák hatásával. A HA-gént, valamint belső protein-géneket tartalmazó PNV-kombinációval kiváltott ellenanyag-titerek a HI-ellenanyag-titer, valamint a válasz tartósságának vonatkozásában legalább megfeleltek az engedélyezett tennék által kiváltott titereknek (lásd fent). PNV-val immunizált afrikai zöldmajmok egy' antigénszerkezeti módosuláson átment variánsból származó HA-PNV-ra válaszreakcióval reagáltak, ami azt mutatja, hogy korábban immunizált egyedekben PNV-ra típus-specifikus válasz váltható ki.

PNV-val immunizált majmokban a későbbiekben szokásos elölt vírusvakcinákkal történő immunizálással is válaszreakciót tudtunk kiváltani.

4. Következtetések: Influenza elleni polinukleotid-vakcinák influenzafertőzés vizsgálatára alkalmazott laboratóriumi állatmodellekben hatékonynak bizonyultak. HA-t kódoló DNS-vektorok alkalmazásával homológ védettség hozható létre, legvalószínűbben a jelenlegi, engedélyezett influenzavakcinákban található HA-proteinnel kiváltotthoz hasonló immunológiai mechanizmus szerint. Nem változékony, belső influenza-proteineket kódoló DNS-t is tartalmazó vakcinával mind az antigénszerkezeti módosuláson, mind az antigénszerkezeti változáson átment törzsekkel szemben heterológ » *· ·

-97védettség hozható létre. A fenti megközelítési módok egyetlen immunizálásban történő kombinációja vadászmenyét-modellben az antigénszerkezeti módosuláson átment variánsokkal szemben a jelenlegi, engedélyezett vakcinával összehasonlítva fokozott védettséget eredményez.

15. példa

A VIR-vektor előállítása

Vakcinázásra felhasznált alapvektorunk további optimalizálása céljából a VIJns-vektor egy származékát állítottuk elő, amelyet VÍR-vektornak neveztünk. A fenti vektor-konstrukció előállításának az volt a célja, hogy olyan, felesleges DNS-szekvenciáktól mentes, minimális méretű vakcinavektort kapjunk, amelyben még megmaradtak a V1J- és VIJns-vektorok heterológ génexpressziót szolgáló, összességében optimalizált tulajdonságai és az azokra jellemző nagy hatásfokú plazmid-termelődés. A szakirodalmi adatok, valamint kísérleteink alapján megállapítottuk, hogy: (1) az E. coli replikációs origót tartalmazó pUC-vázból régiók eltávolíthatók anélkül, hogy az a baktériumban termelődő plazmid-mennyiséget befolyásolná; (2) a kanamycin nyitott olvasási keretét követő kan^r-gm 3 ’-régió eltávolítható, ha helyébe bakteriális terminátort inszertáltunk; (3) a BGH-tenninátor 3’feléből körülbelül 300 bázispár (a BGH-elemben található eredeti KpnI restrikciós hasítási helyet követő régió) eltávolítható anélkül, hogy annak szabályozó funkciója károsodna.

A VÍR-vektort PCR-eljárással állítottuk elő a VIJns-vektorból származó három DNS-szegmens szintézisével, melyek a CMVintA-promóter / BGH-tenninátor, a replikációs origo és a kanamycin-rezisztencia elemeket képviselték. Valamennyi szegmens végéhez az egyes szegmensek esetében egyedi restrikciós hasítási helyeket kapcsoltunk az alábbi PCR-oligomerek alkalmazásával: a CMVintA/BGH-szegmenshez Sspl és Xhol hasítási he• » · 9 % · ··· ··♦ ··· ··· • · · · ·· ·♦· «♦ ··e

-98lyeket kódoló, a kűn^r-génhez EcoRV és BamHI hasítási helyeket kódoló, az orz^r-génhez Bell és Sáli hasítási helyeket kódoló oligomereket kapcsoltunk. Azért választottuk a fenti enzim-hasítási helyeket, mivel azok a PCReljárással előállított szegmensek megfelelő orientációban történő ligálását teszik lehetővé a ligálást követően a hasítási helyek megszüntetésével: Az EcoRV- és a Sspl-enzimek tompa végű DNS-t hagynak vissza, melyek ligálás szempontjából kompatibilisek, a BamHI- és BclI-enzimek, valamint a Sáli- és Xhol-enzimek komplementer ragadós végeket képeznek. A szegmensek PCR-eljórással történő előállítását követően mindegyiket a fent jelölt megfelelő restrikciós enzimmel emésztettük, majd mindhárom DNSszegmenst tartalmazó, egyetlen reakcióelegyben egymással ligáltuk. Az ori^r 5’-végét úgy terveztük, hogy az tartalmazza a T2-rho független terminátorszekvenciát, amely eredetileg is ebben a régióban található, így az a kanamycin-rezisztenciagén számára terminációs információt szolgáltathat. A ligáit tennék azonosságát restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel (> 8 enzimmel), valamint a ligációs kapcsolódási régiók DNS-szekvenálásával igazoltuk. A DNS-plazmid termelődésének hatásfoka és a VIR-vektorba inszertált heterológ vírusgének expressziója hasonló volt, mint a VlJnsvektor esetében. A vektor méretét összesen 1346 bázispárral sikerült csökkenteni (VIJns = 4,86 kb; V1R=3,52 kb) (lásd a 36. ábrát; 45. azonosítószámú szekvencia).

A V ÍR-vektor szintézisénél alkalmazott PCR láncindító oligonukleotidok szekvenciája a következő volt (a restrikciós hasítási helyeket aláhúzással jelöltük és a szekvenciát követően zárójelbe téve megneveztük):

(1) 5’-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G3’ [Sspl], 60. azonosítószámú szekvencia;

(2) 5’-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3’ [Xhol], 61. azonosítószámú szekvencia (a CMVintA-szegmenshez);

(3) 5’-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAATC-3’ [EcoRV], 62. azonosítószámú szekvencia;

(4) 5’-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3’ [BamHI], 63. azonosítószámú szekvencia (a kanamycin-rezisztenciát kódoló génszegmenshez);

(5) 5’-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3’ [Bell], 64. azonosítószámú szekvencia;

(6) 5’-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3’ [Sáli], 32. azonosítószámú szekvencia (az E. coli replikációs origóhoz).

-100SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTGTGCACCT CAAGCTGG 18

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCTTTGAGA ATGTTGCACA TTC 23

- 101 *· ···» ♦· ···» • · · » · 4 ··· ··♦ ·«· _ν·· _ ♦ · · « ·· ·»· «« ^99 ll

Α 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC 33

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC ·· ··»» ·· ···· • * · · * 4 •·· ··· ··· V·· ’ · · · •· ··· ·· ίί

- 102 AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI.

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ; egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG 23

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐIHOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG ίί

-103 A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC 39

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC 39

-104 Α 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 9 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

FRAGMENS TÍPUSA: intemális

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Alá Leu Val

5

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 4432 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

-105Α 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCGCGCGTTT	CGGTGATCAC	GCTCAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	60
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	TCAGCGGGTG	120
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTCG	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC	180
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAATACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300
TCCAACATTA	CCCCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
GGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	CGGTAAATGG	420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACC	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCACTACATC	AAGTGTATCA	TATCCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACGGTAAA	TGCCCCGCCT	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	ACTTTCCTAC	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780
CGTCAATGGG	AGTTTGTTTT	GGCACCAAAA	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	GTCGTAACAA	840
CTCCGCCCCA	TTGACGCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAGGTCT	ATATAAGCAG	900
AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	960
T AGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTGGC	1080
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	atctcgggta	CGTGTTCCGG	1440
ACATGCGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCACCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC	GGCCTTCCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680

* « · ·

- 106-

GGCACAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAGGGCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTGCTGCCGC	1800
GCCCGCCACC	AGACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGCCTCTTTT	1 8n0
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	gccttccttg	ACCCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
GCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	2160
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	2460
CGCTCGGTCG	TTCGGGTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	2640
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CAGGCGTTTC	CCCGTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCCCTTACC	2760
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTG-	2820
AGGTATCTCA	GTTOGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	2940
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	3180
CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACCCTCAG	3240
TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTC	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	gatcttcacc	3300
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTCTATTT	3420
CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCCCGTC	GTGTAGATAA	CTACGATACG	GGAGGGCTTA	3480
CCATCTGGCC	CCAGTGCTGC	AATGATACCG	CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	3540

- 107-

TCAGCAATAA	ACCAGCCAGC	CGGAAGGGCC	CAGCGCAGAA	GTGGTCCTGC	AACTTTATCC	360C
GCCTCCATCC	AGTCTATTAA	TTGTTGCCGG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	36b0
AGTTTGCGCA	ACCTTGTTGC	CATTGCTACA	GGCATCGTGG	TGTCACGCTC	GTCCTTTGGT	372Γ
ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAAGGCGAG	TTACATGATC	CCCCATGTTG	3780
TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCCT	CCGATCGTTG	TCAGAAGTAA	GTTGGCCGCA	3840
GTGTTATCAC	TCATCGTTAT	GGCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTGTCAT	GCCATCCGTA	3900
AGATGCTTTT	CTGTGACTGG	TGAGTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTGTATGCGG	3960
CGACCGAGTT	GCTCTTGCCC	GGCGTCAATA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	TAGCAGAACT	4020
TTAAAAGTGC	TCATCATTGG	AAAACGTTCT	TCGGGGCGAA	aactctcaag	GATCTTACCG	4080
CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GTAACCCACT	CGTGCACCCA	ACTGATCTTC	AGCATCTTTT	4140
ACTTTCACCA	GCCTTTCTGG	GTGAGCAAAA	ACAGGAACGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	4200
ATAAGGGCGA	CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC	4260
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	GAAAAATAAA	4 3 20
CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	CTGACGTCTA	AGAAACCATT	4380
ATTATCATGA	CATTAACCTA	TAAAAATAGG	CGTATCACGA	GGCCCTTTCG	TC	4 4 32

Α 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2196 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTGGCTATT	GGCCATTGCA	TACGTTGTAT	CCATATCATA	ATATGTACAT	TTATATTGGC	60
TCATGTCCAA	CATTACCGCC	ATGTTGACAT	TGATTATTGA	CTAGTTATTA	ATAGTAATCA	120
ATTACGGGGT	CATTAGTTCA	TAGCCCATAT	ATGGAGTTCC	GCGTTACATA	ACTTACGGTA	180
AATGGCCCGC	CTGGCTGACC	GCCCAACGAC	CCCCGCCCAT	TGACGTCAAT	AATGACGTAT	240
GTTCCCATAG	TAACGCCAAT	AGGGACTTTC	CATTGACGTC	AATGGGTGGA	GTATTTACGG	300
TAAACTGCCC	ACTTGGCAGT	ACATCAAGTG	TATCATATGC	CAAGTACGCC	CCCTATTGAC	360
GTCAATGACG	GTAAATGGCC	CGCCTGGCAT	TATGCCCAGT	ACATGACCTT	ATGGGACTTT	420

- 108-

CCTACTTGGC	AGTA	CATCTA	CGTATTAGTC	ATCGCTATTA	CCATGGTGAT	GCGGTTTTGG	480
CACTACATCA	ATGG	GCGTGG	ATAGCGGTTT	GACTCACGGG	GATTTCCAAG	TCTCCACCCC	540
ATTGACCTCA	ATGGGAGTTT	GTTTTGGCAC	CAAAATCAAC	GGGACTTTCC	AAAATGTCGT	600
AACAACTCCG	CCCC	ATTGAC	GCAAATGGGC	GGTAGGCGTG	TACGGTGGGA	GGTCTATATA	660
AGCAGAGCTC	GTTT	AGTGAA	CCGTCAGATC	GCCTGGAGAC	GCCATCCACG	CTGTTTTGAC	720
CTCCATAGAA	GACA	CCGGGA	CCGATCCAGC	CTCCGCGGCC	GGGAACGGTG	CATTGGAACG	780
CGGATTCCCC	GTGC	CAAGAG	TGACGTAAGT	ACCGCCTATA	GAGTCTATAG	GCCCACCCCC	840
TTGGCTTCTT	ATGG	ATGCTA	TACTGTTTTT	GGCTTGGGGT	CTATACACCC	CCGCTTCCTC	900
ATGTTATAGG	TGAT	GGTATA	GCTTAGCCTA	TAGGTGTGGG	TTATTGACCA	TTATTGACCA	960
CTCCCCTATT	GGTGACGATA	CTTTCCATTA	CTAATCCATA	ACATGGCTCT	TTGCCACAAC	1020
TCTCTTTATT	GGCT	ATATGC	CAATACACTG	TCCTTCAGAG	ACTGACACGG	ACTCTGTATT	1080
TTTACAGGAT	GGGGTCTCAT	TTATTATTTA	CAAATTCACA	TATACAACAC	CACCGTCCCC	1140
AGTGCCCGCA	GTTT	TTATTA	AACATAACGT	GGGATCTCCA	CGCGAATCTC	GGGTACGTGT	1200
TCCGGACATG	GGCT	CTTCTC	CGGTAGCGGC	GGAGCTTCTA	CATCCGAGCC	CTGCTCCCAT	1260
GCCTCCAGCG	ACTC	ATGGTC	GCTCGGCAGC	TCCTTGCTCC	TAACAGTGGA	GGCCAGACTT	1320
AGGCACAGCA	CGAT	GCCCAC	CACCACCAGT	GTGCCGCACA	AGGCCGTGGC	GGTAGGGTAT	1380
GTGTCTGAAA	ATG A	GCTCGC	GGAGCGGGCT	TGCACCGCTG	ACGCATTTGG	AAGACTTAAG	1440
GCAGCGGCAG	AAGAAGATGC	AGGCAGCTGA	GTTGTTGTGT	TCTGATAAGA	GTCAGAGGTA	1500
actcccgttg	CGGT	GCTGTT	AACGGTGGAG	GGCAGTGTAG	TCTGAGCAGT	ACTCGTTGCT	15-0
GCCGCGCGCG	CCAC	CAGACA	TAATAGCTGA	CAGACTAACA	GACTGTTCCT	TTCCATGGGT	1620
CTTTTCTGCA	GTCA	CCGTCC	TTAGATCTGC	TGTGCCTTCT	AGTTGCCAGC	CATCTGTTGT	1680
TTGCCCCTCC	CCCGTGCCTT	CCTTGACCCT	GGAAGGTGCC	ACTCCCACTG	TCCTTTCCTA	1740
ATAAAATGAG	GAA--.	T7GCAT	CGCATTGTCT	GAGTAGGTGT	CATTCTATTC	TGGGGGGTGG	1800
GGTGGGGCAG	CACA	GCAAGG	GGGAGGATTG	GGAAGACAAT	AGCAGGCATG	CTGGGGATGC	1860
GGTGGGCTCT	ATGG	GTACCC	AGGTGCTGAA	GAATTGACCC	GGTTCCTCCT	GGGCCAGAAA	1920
GAAGCAGGCA	CATC	CCCTTC	TCTGTGACAC	ACCCTGTCCA	CGCCCCTGGT	TCTTAGTTCC	1980
AGCCCCACTC	ATAGGACACT	CATAGCTCAG	GAGGGCTCCG	CCTTCAATCC	CACCCGCTAA	2040
AGTACTTGGA	GCGG	TCTCTC	CCTCCCTCAT	CAGCCCACCA	AACCAAACCT	AGCCTCCAAG	2100
AGTGGGAAGA	AAT7	.AAAGCA	AGATAGGCTA	TTAAGTGCAG	AGGGAGAGAA	AATGCCTCCA	2160

ACATGTGAGG AAG7AATGAG AGAAATCATA GAATTC

2196

- 109 Α 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 71 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS. cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA

TAATCACTCA CTGAGTGACA 60

TCAAAATCATG 71

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 117 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS·, nem

ANTISZENSZ: nem ···»

- 110Α 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT

TGAATGGATG TCAATCCGAC 60

CTTACTTTTC TTAAAAGTGC CAGCACAAAATGCTATAAGC

ACAACTTTCC CTTATAC 117

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 136 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC

AAAAACATAA TGGATCCAAA60

CACTGTGTCA AGCTTTCAGG TAGATTGCTT TCTTTGGCAT

GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA120

CCAAGAACTA GGTGAT136

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 152 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő ·· ···* ·· ···· • · « · · · ··· ··· ··· ··· • · · · ** ♦ ·· «· ··♦

- 111 TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG	AGCAAAAGCA
GGGGAAAATA AAAACAACCA	60
AAATGAAGGC AAACCTG GTCCTGTTAA	GTGCACTTGC
AGCTGCAGAT GCAGACACAA	120
TATGTATAGG CTACCATGCG AACAATTCAA CC	152

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 162 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTTTCTGCAG TCACCGTCCT TAGATCCCGA ATTCCAGCAA

AAGCAGGTCA ATTATATTCA 60

ATATGGAAAG AATAAAAGAA CTAAGAAATC TAATGTCGCA

GTCTGCCACC CCGGAGATAC 120

TCACAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT 162

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 122 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

-112 ♦ * 4·*4 ·· * · · 4 • · · · · ·«· ··· · · · ··· • · · · · ·«· ·· ···

TOPOLÓGIÁJA; mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCACCGTCC TTAGATCTAC CATGAGTCTT

TCGAAACGTA CGTACTCTCT

ATCATCCCGT CAGGCCCCCT CAAAGCCGAG

CTAACCGAGG

ATCGCACAGA

GACTTGAAGA GTTGACGGAA

120

GA

122

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 4864 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCGCGCGTTT	CGGTCATGAC	GGTGAAAACC	TGTGACACAT	GCAGCTCCCG	CAGACGOTCA	60
CAGCTTGTCT	GTAAGGGGAT	GCCGGGAGCA	GAGAAGCCCG	TCAGGGCGCG	TCAGCGGGTG	120
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTGG	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC	180
ACCATATGCG	CTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GGGTAAGGAG	AAAATACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300
TCCAACATTA	CCGCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
GGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	CGGTAAATGG	420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	actttcctac	660
TTGGCAGTAC	ATCTAGGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780
CGTCAATGGG	AGTTTGTTTT	GGCACCAAAA	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	GTCGTAACAA	840
CTCCCCCCCA	TTGAGGCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAGGTCT	ATATAAGCAG	900

• · * · · ·

-113-

AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GACACGCCAT	CCACGCTCTT	TTGACCTCCA	9o0
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCCC	CTATAGAGTC	TATACGCC'.’A	CCCCCTTGG·'	1 o u .
TTCTTATGCA	TGCTATACTC	TTTTTGGCTT	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGCTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTCCT	CCCATGCCTU	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680
GGCAGAAGAA	GATGCACGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAG^>GCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTGCTGCCGC	1800
GCGCGCCACC	AGACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGGGTCTTTT	1860
CTGCAGTCAC	CCTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACCCTGGAAG	CTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATGGCAT	Τ' j . — - jAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	C AA j j^j.jGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
GCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	2160
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	2460
CCCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	CTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCCCCC	CCCTGACGAG	2640
CATCACAAAA	ATCCACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CAGGCGTTTC	CCCCCGGAAG	CTCCCTCGTC	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	27oC

• · « · · · « « «

- 114-

GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	CGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	CCTCTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	ACCGCTCGGC	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	2Q4n
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGCTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	3180
CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	3240
TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTCTATTT	3420
CGTTCATCCA	TAGT7GCCTG	ACTCCGGGGG	GGGGGGGCGC	TGAGGTCTGC	CTCGTGAAGA	3480
AGGTGTTGCT	GACTCATACC	AGGCCTGAAT	CGCCCCATCA	TCCAGCCAGA	AAGTGAGGGA	3540
GCCACGGTTG	ATGAGAGCTT	TGTTGTAGGT	GGACCAGTTG	GTGATTTTGA	ACTTTTGCTT	3600
TGCCACGGAA	CGGTCTGCCT	TG i CG<j<.AAG	ATGCGTGATC	TGATCCTTCA	ACTCAGCAAA	3660
AGTTCGATTT	ATTCAACAAA	GCCGCCGTCC	CGTCAAGTCA	GCGTAATGCT	CTGCCAGTGT	3720
TACAACCAAT	TAACCAATTC	TGATTAGAAA	AACTCATCGA	GCATCAAA7G	AAACTGCAAT	3780
TTATTCATAT	CAGGATTATC	AATACCATAT	TTTTGAAAAA	GCCGTTTCTG	TAATGAAGGA	3840
GAAAACTCAC	CGAGGCAGTT	CCATAGGATG	GCAAGATCCT	GGTATCGGTC	TGCGATTCCG	3900
ACTCGTCCAA	CATCAATACA	ACCTATTAAT	TTCCCCTCGT	CAAAAATAAG	GTTATCAAGT	3960
GAGAAATCAC	CATGAGTGAC	GACTGAATCC	GGTGAGAATG	GCAAAAGCTT	ATGCATTTCT	4020
TTCCAGACTT	GTTCAACAGG	CCAGCCATTA	CGCTCGTCAT	CAAAATCACT	CGCATCAACC	4080
AAACCGTTAT	TCAT7CGTGA	TTGCGCCTGA	GCGAGACGAA	ATACGCGATC	GCTGTTAAAA	4140
GGACAATTAC	AAACAGGAAT	CGAATGCAAC	CGGCGCAGGA	ACACTGCCAG	CGCATCAACA	4200
ATATTTTCAC	CTGAATCAGG	ATATTCTTCT	AATACCTGGA	atgctgtttt	CCCGGGGATC	4260
GCAGTGGTGA	GTAACCATGC	ATCATCAGGA	GTACGGATAA	AATGCTTGAT	GGTCGGAAGA	4320
GGCATAAATT	CCGTCAGCCA	GTTTAGTCTG	ACCATCTCAT	CTGTAACATC	ATTGGCAACG	4380
CTACCTTTGC	CATGTTTCAG	AAACAACTCT	GGCGCATCGG	GCTTCCCATA	CAATCGATAG	4440
ATTGTCGCAC	CTGAT7GCCC	GACATTATCG	CGAGCCCATT	TATACCCATA	TAAATCAGCA	4500
TCCATGTTGG	AATT7AATCG	CGGCCTCGAG	CAAGACGTTT	CCCGTTGAAT	ATGGCTCATA	4560
ACACCCCTTG	TATTAGTGTT	TATGTAAGCA	GACAGTTTTA	TTGTTCATGA	TGATATATTT	4620

•·· <·* • · 4 · · * ····*« ····*♦ • · · · ·« ««« ·· ·» ·

-115-

TTATCTTGTG	CAATGTAACA	TCAGAGATTT	TGAGACACAA	CGTCGCTTTC	cccccccccc	4680
CATTATTGAA	GCATTTATCA	GGGTTATTGT	CTCATGAGCG	GATACATATT	TGAATGTATT	4740
TACAAAAATA	AACAAATAGG	GGTTCCGCGC	ACATTTCCCC	GAAAAGTGCC	ACCTGACGTC	4800
TAAGAAACCA	TTATTATCAT	GACATTAACC	TATAAAAATA	GGCGTATCAC	GAGGCCCTTT	4860
CCTC						4864

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAGAAGCA GAGCA 15

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 119 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem ·· ···· *· ···· • · 9 ·» 9 ··» ·*· ·«· ··· • 9 ·· • · ·«· «4··*

- 116Α 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT

GAGTGACATC AAAATCATGG60

CGTCCCAAGG CACCAAAACGG TCTTATGAAC AGATGGAAAC

TGATGGGGAA CGCC AGATT119

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 67 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG

CAGATATTTT TTCCTTAATT 60

GTCGTAC 67

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

-117ANTISZENSZ: nem

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAGAAGCA CGCAC 15

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAGAAGCA C AGC A 15

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA

-118Α 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT 36

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 102 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT TCTAATATCC

ACAAAATGAA GGCAATAATT 60

GTACTACTCA TGGTAGTAAC ATCCAACGCA GATCGAATCT GC 102

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

- 119HOSSZA: 42 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCACAGCAG ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC 42

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 23 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG 23

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

- 120TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: igen

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGAGTGGCAC CTTCCAGG 18

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 12 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAAAAGCAGG 12

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

- 121 ANTISZENSZ: nem

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAGAAGCG GAGC 14

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC il • · · · · ··· ··« ·*· ··· • · · ·

-122 A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 37 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG 37

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG 38

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

-123HOSSZA: 32 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATTCAG ATGCATATTC TACACTGCAA AG 32

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG 36

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

- 124HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATTTAT AGACAGATGG AGCAAGAAAC ATTGTC

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC 33

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS • ·

- 125 HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC 36

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 41. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC 39

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 42. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC 39

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő il

- 126 TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 43. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG CC 42

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 44. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCTTCAC AAGAGCTG 38

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 3553 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 45. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT 60

GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA

120

- 127-

TCAATTACGG	GGTCATTAGT	TCATAGCCCA	TATATGGACT	TCCCCGTTAC	ATAACTTACG	180
GTAAATGGCC	CGCCTGGCTG	ACCGCCCAAC	GACCCCCGCC	CATTGACCTC	AATAATGACG	240
TATGTTCCCA	TACTAACCCC	AATAGGGACT	TTCCATTGAC	GTCAATGGGT	GGAGTATTTA	300
CCCTAAACTG	CCCACTTGGC	AGTACATCAA	GTGTATCATA	TGCCAAGTAC	GCCCCCTATT	360
GACCTCAATG	ACGGTAAATG	GCCCGCCTGG	CATTATGCCC	AGTACATGAC	CTTATGGGAC	420
TTTCCTACTT	GGCAGTACAT	CTACGTATTA	GTCATCGCTA	TTACCATGGT	GATGCGGTTT	480
TGGCAGTACA	TCAATGGGCG	TCGATACCCG	TTTGACTCAC	GGGGATTTCC	AAGTCTCCAC	540
CCCATTGACG	TCAATGGGAG	TTTGTTTTGG	CACCAAAATC	AACGGGACTT	TCCAAAATGT	600
CGTAACAACT	CCGCCCCATT	GACGCAAATG	GGCGGTAGGC	GTGTACGGTG	GGAGGTCTAT	660
ATAAGCAGAG	CTCGTTTAGT	GAACCGTCAG	ATCGCCTGGA	GACGCCATCC	ACGCTGTTTT	720
GACCTCCATA	GAAGAGACCG	GGACCGATCC	AGCCTCCGCG	GCCGGGAACG	GTGCATTGGA	780
ACGCGGATTC	CCCGTGCCAA	GAGTGACGTA	AGTACCGCCT	ATAGAGTCTA	TAGGCCCACC	840
CCCTTGGCTT	CTTATGCATG	CTATACTGTT	TTTGGCTTGG	GGTCTATACA	CCCCCGCTTC	900
CTCATGTTAT	AGGTGATGGT	ATAGCTTAGC	CTATAGGTGT	GGGTTATTGA	CCATTATTGA	960
CCACTCCCCT	ATTGGTGACG	ATACTTTCCA	TTACTAATCC	ATAACATGGC	TCTTTGCCAC	1020
AAC7CTCTTT	ATTGGGTATA	TGCCAATACA	CTGTCCTTCA	GAGACTGACA	CGGACTCTGT	1080
ATTTTTACAG	GATGGGGTCT	CATTTATTAT	TTACAAATTC	ACATATACAA	CACCACCGTC	1140
CCCAGTGCCC	GCAGTTTTTA	TTAAACATGC	TAACGTGGGA	TCTCCACGCG	AATCTCGGGT	1200
ACGTGTTCCG	GACATGGGCT	CTTCTCCGGT	AGCGGCGGAG	CTTCTACATC	CGAGrcCTGC	1260
TCCSATGCCT	CCAGCGACTC	ATGGTCGCTC	GGCAGCTCCT	TGCTCCTAAC	AGTGGAGGCC	1320
AGACTTAGGC	ACAGCACGAT	GCCCACCACC	ACCAGTGTGC	CGCACAAGGC	CGTGGCGGTA	1380
GGGTATGTGT	CTGAAAATGA	GCTCGGGGAG	CGGGCTTGCA	CCGCTGACGC	ATTTGGAAGA	1440
CTTAAGGCAG	CGGCAGAAGA	AGATGCAGGC	AGCTGAGTTG	TTGTGTTCTG	ATAAGAGTCA	1500
GAGGTAACTC	CCGTTGCGGT	GCTCTTAACG	GTGGAGGGCA	GTGTAGTCTG	AGCAGTACTC	1560
GTTGCTGCCG	CGCGCGCCAC	CAGACATAAT	AGCTGACAGA	CTAACAGACT	GTTCCTTTCC	1620
ATGGGTCTTT	TCTGCAGTCA	CCGTCCTTAG	ATCTGCTGTG	CCTTCTAGTT	GCCAGCCATC	1680
TGTTGTTTGC	CCCTCCCCCG	TGCCTTCCTT	GACCCTGGAA	GGTGCCACTC	CCACTGTCCT	1740
TTCCTAATAA	AATGAGGAAA	TTGCATCGCA	TTGTCTGAGT	AGGTGTCATT	CTATTCTGGG	1800
GGGTGGGGTG	GGGCAGCACA	GCAAGGGGGA	GGATTGGGAA	GACAATAGCA	GGCATGCTGG	1860
GGATGCGGTG	GGCTCTATGG	GTACGGCCGC	AGCGGCCGTA	CCCAGGTGCT	GAAGAATTGA	1920
CCCGGTTCCT	CGACCCGTAA	AAAGGCCGCC	TTGCTGGCGT	TTTTCCATAG	GCTCCGCCCC	1980

il

- 128 -

CCTGACGAGC	ATCACAAAAA	TCGACGCTCA	AGTCAGAGGT	GGCGAAACCC	GACAGGACTA	2040
TAAAGATACC	AGGCGTTTCC	CCCTGGAAGC	TCCCTCGTGC	GCTCTCCTGT	TCCGACCCTG	2100
CCGCTTACCG	GATACCTGTC	CGCCTTTCTC	CCTTCGGGAA	GCGTGGCGCT	TTCTCAATGC	2160
TCACGCTGTA	GGTATCTCAG	TTCGGTGTAG	GTCGTTCGCT	CCAAGCTGGC	CTGTGTGCAC	2220
GAACCCCCCG	TTCAGCCCGA	CCGCTGCGCC	TTATCCGGTA	ACTATCGTCT	TGAGTCCAA'.'	2280
CCGGTAAGAC	ACGACTTATC	GCCACTGGCA	GCAGCCACTG	GTAACAGGAT	TAGCAGAGCG	2340
AGGTATGTAG	GCGGTGCTAC	AGAGTTCTTG	AAGTGGTGGC	CTAACTACGG	CTACACTAGC	2400
TGAAGGACAG	TATTTGGTAT	CTGCGCTCTG	CTGAAGCCAG	TTACCTTCGG	AAAAAGAGTT	2460
GGTAGCTCTT	GATCCGGCAA	ACAAACCACC	GCTGGTAGCG	GTGGTTTTTT	TGTTTGCAAG	2520
CAGCAGATTA	CGCGCAGAAA	AAAAGGATCT	CAAGAAGATC	CTTTGATCTT	TTCTACGTGA	2580
TCCCGTAATG	CTCTGCCAGT	GTTACAACCA	ATTAACCAAT	TCTGATTAGA	AAAACTCATC	2640
GAGCATCAAA	TGAAACTGCA	ATTTATTCAT	ATCAGGATTA	TCAATACCAT	ATTTTTGAAA	2700
AAGCCGTTTC	TGTAATGAAG	GAGAAAACTC	ACCGAGGCAG	TTCCATAGGA	TGGCAAGATC	2760
CTGGTATCGG	TCTGCGATTC	CGACTCGTCC	AACATCAATA	CAACCTATTA	ATTTCCCCTC	2820
GTCAAAAATA	AGGTTATCAA	GTGAGAAATC	ACCATGAGTG	ACGACTGAAT	CCGGTGAGAA	2880
TGGCAAAAGC	TTATGCATTT	CTTTCCAGAC	TTGTTCAACA	GGCCAGCCAT	TACGCTCGTC	2940
ATCAAAATCA	CTCGCATCAA	CCAAACCGTT	ATTCATTCGT	GATTGCGCCT	GAGCGAGACG	3000
AAAT.ACGCGA	TCGCTOTTAA	AAGGACAATT	ACAAACAGGA	ATCGAATGCA	ACCGGCGCAG	3060
GAACACTGCC	AGCGCATCAA	CAATATTTTC	ACCTGAATCA	GGATATTCTT	CTAATACCTG	3120
GAATOCTCTT	TTCCCGGGGA	TCGCAGTGGT	GAGTAACCAT	GCATCATCAG	GAGTACGGAT	3180
AAAA7GCTTG	ATGGTCGGAA	GAGGCATAAA	TTCCGTCAGC	CAGTTTAGTC	TGACCATCTC	3240
ATCTGTAACA	TCATTGGCAA	CGCTACCTTT	GCCATGTTTC	AGAAACAACT	CTGGCGCATC	3300
GGGCTTCCCA	TACAATCGAT	AGATTGTCGC	ACCTGATTGC	CCGACATTAT	CGCGAGCCCA	3360
TTTATACCCA	TATAAATCAG	CATCCATGTT	GGAATTTAAT	CGCGGCCTCG	AGCAAGACGT	3420
TTCCCGTTGA	ATATGGCTCA	TAACACCCCT	TGTATTACTG	TTTATGTAAG	CAGACAGTTT	3480
TATTGTTCAT	GATGATATAT	TTTTATCTTG	TGCAATGTAA	CATCAGAGAT	TTTGAGACAC	3540

AACGTGGCTT TCC

3553

-129A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

• 4 · 4 4 4 «4 *44« «V * « * ·«« ·«« 4< · · · · • · « · • · ··· ·· ··· í

HOSSZA: 72 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 46. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT

GCTTTGAGCT ACATTTATG

TCTGGTTTTC GC

A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 111 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem »» ···« ·

·«· *·· • Μ»

-130 A 47. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA

TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC 60

AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAAGA TCTATGTGGG

ATCTGCTGTGC 111

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 63 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 48. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTAGTCCTGTTAT

GTGCATTTAC AGCTACATAT 60

GCA 63

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 102 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

Λ ·« 4»

-131 HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 49. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA

TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG 60

CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT 102

A 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 108 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 50. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC

TCATGGTAGT AACATCCAAC 60

GCAGATCGAA TCTGCACTGG GATAACATCT

TCAAACTC ACCTC ATGTG 108

A 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 102 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő il

-132 TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 51. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTTT ATTGTTTATA

TGGTCTCCAG AGACAATGTT 60

TCTTGCTCCA TCTGTCTATA AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT 102

A 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 84 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 52. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT

CTTATGAACA GATGGAAACT 60

GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT 84

A 53. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 108 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

- 133HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 53. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA

GTAATGAAGG ATCTTATTTC 60

TTCGGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGGATCTG

CTGTGCCT 108

A 54. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 132 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 54. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG

AAACGTATGT TCTCTCTATC

GTTCCATCAG GCCCCCTCAA

TTGAAGATGT CTTTGCTGGG

AAAAACACAG AT

AGCCGAAATCGCGCAGAGAC

120

132

- 134Α 55. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 129 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 55. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA

TTCTTGAAAA TTTGCAGACC60

TATCAGAAAC GAATGGGGGT GCAGATGCAA

GAAGATCTAT GTGGGATCTG120

CTGTGCCTT129

A 56. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 81 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

AAAGATGATC

CGGTTCAAGT • ·

-135 A 56. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA

ACACTGGGAC AATTGACAAA 60

ACACCGGAAG AAATAACTTC T 81

A 57. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 57. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT

TTGGGAGGGA CACAGCAGAG 60

GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG 96

A 58. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 96 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

- 136 ANTISZENSZ: nem

A 58. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA.

CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT

ACCTGCTTTC ATTGACAGAA 60

GATGGAGAAG GCAAAGCAGA ACTAGCAGAA AAATTA 96

A 59. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 123 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 59. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATCTCTTG GGGCAAGTCA AGAGAATGGG GAAGGAATTG

CAAAGGATGT GATGGAAGTG60

CTAAAGCAGA GCTCTATGGG AAATTCAGCT CTTGTGAAGA

AATACCTATA AGGATCTGCT120

GTG123

A 60. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő • ·

- 137TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 60. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG 33

A 61. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 61. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC 36

A 62. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

-138HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 62. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAATC 3 8

A 63. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 37 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 63. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC 37

A 64. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 39 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy és kettő

TOPOLÓGIÁJA: mindkettő

MOLEKULATÍPUS: cDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem • ·

-139Α 64. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA.

GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG

- 140 -

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Influenzavírus-génterméket kódoló nukleinsavat tartalmazó DNSkonsrukció, azzal jellemezve, hogy a DNS-konstrukció állati szövetekbe történő bejuttatását és felvételét követően képes in vivő influenzavírus-gén expresszálódását indukálni és a géntermék képes influenzavírus-specifikus immunválaszt kiváltani.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy influenzavírus-géntermékként humán influenzavírus-eredetű nukleoprotein-, hemagglutinin-, polimeráz-, mátrixprotein- vagy nem strukturális protein géntermékeket kódoló nukleinsavat tartalmaz.
3. 3. Polinukleotid-vakcina, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti DNS-konstrukciót tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti polinukleotid-vakcina, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-konstrukciók bármelyikét vagy azok bármely kombinációját tartalmazza:

   a) pnRSV-PR-NP;

   b) Vl-PR-NP;

   c) V1J-PR-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 12. azonosítószámú szekvenciával;

   d) V1J-PR-PB1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 13. azonosítószámú szekvenciával;

   e) V1J-PR-NS, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 14. azonosítószámú szekvenciával;

   f) VU-PR-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 15. azonosítószámú szekvenciával;

   - 141 -

   g) V1J-PR-PB2, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 16. azonosítószámú szekvenciával;

   h) V1J-PR-M1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 17. azonosítószámú szekvenciával;

   i) VIJneo-BJ-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 20. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 21. azonosítószámú szekvenciával;

   j) VIJneo-TX-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 24. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 25. azonosítószámú szekvenciával;

   k) VIJneo-PA-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 26. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 27. azonosítószámú szekvenciával;

   l) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 46. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 47. azonosítószámú szekvenciával;

   m) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 48. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 49. azonosítószámú szekvenciával;

   n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 50. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 51. azonosítószámú szekvenciával;

   o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 6,42 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 52. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 53. azonosítószámú szekvenciával;

   p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 5,62 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 54. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 55. azonosítószámú szekvenciával;

   q) VlJns-PA-NP, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,54 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 56. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 57. azonosítószámú szekvenciával;

   r) VIJns-PA-Ml, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 5,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 58. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 59. azonosítószámú szekvenciával.
5. 5. Expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az alábbi vektorok bármelyike:

   V1J (10. azonosítószámú szekvencia);

   VIJ-neo (18. azonosítószámú szekvencia);

   VIJns;

   és VIJR (45. azonosítószámú szekvencia).
6. 6. Eljárás influenzavírussal szembeni védettség létrehozására, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezetet az 1. igénypont szerinti DNSkonstrukció profilaktikusan hatékony mennyiségével immunizáljuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t in vivő közvetlenül a szövetekbe juttatjuk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNSkonstrukciót hordozóanyag nélkül, fiziológiás sóoldatban, önmagában alkalmazott DNS-ként adjuk be vagy liposzómák és DNS elegyeként vagy adjuvánssal vagy transzfekciót elősegítő szerrel együtt adjuk be.
9. 9. Eljárás immunválasz kiváltására állatokban influenzavírus-gének alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy

   a) a gént izoláljuk;

   b) a gént szabályozó szekvenciákkal kapcsoljuk össze oly módon, hogy a gén olyan szabályozó szekvenciákkal kapcsolódjon össze funkcionálisan, melyek élő szövetekbe juttatva a gén transzkripciójának megindulását majd transzlációját irányítják;

   -143-

   c) a gént élő szövetbejuttatjuk; és

   d) kívánt esetben, a gén élő szövetbe történő juttatását megismételjük.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy influenzavírus-génként humán influenzavírus nukleoprotein-, hemagglutinin-, mátrixprotein-, nem strukturális protein vagy polimeráz-géntermékeket kódoló gént alkalmazunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy influenzavírus-génként A/PR/8/34, A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91, A/Georgia/03/93 és B/Panama/45/90 törzsekből származó nukleoprotein-, bázikus polimeráz1, nem strukturális protein-1, hemagglutinin-, mátrix-protein-1-, bázikus polimeráz-2 géntermékeket kódoló gént alkalmazunk.
12. 12. A 6-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárással emberi szervezet kezelünk.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, azzal jellemezve, hogy szekvenciája megegyezik az alább felsorolt nukleinsav-molekulák szekvenciáinak bármelyikével vagy azok bármely kombinációjával:

    a) pnRSV-PR-NP;

    b) Vl-PR-NP;

    c) V1J-PR-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 12. azonosítószámú szekvenciával;

    d) V1J-PR-PB1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 13. azonosítószámú szekvenciával;

    e) V1J-PR-NS, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 14. azonosítószámú szekvenciával;

    f) V1J-PR-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 15. azonosítószámú szekvenciával;

    g) V1J-PR-PB2, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 16. azonosítószámú szekvenciával;

    • » · · · ·

    - 144 -

    h) V1J-PR-M1, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 17. azonosítószámú szekvenciával;

    i) VIJneo-BJ-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 20. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 21. azonosítószámú szekvenciával;

    j) VIJneo-TX-NP, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 24. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 25. azonosítószámú szekvenciával;

    k) VIJneo-PA-HA, melynek 5’-végi szekvenciája megegyezik a 26. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 27. azonosítószámú szekvenciával;

    l) VI Jns-GA-HA (A/Georgia/03/93), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 46. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 47. azonosítószámú szekvenciával;

    m) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 48. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 49. azonosítószámú szekvenciával;

    n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 50. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 51. azonosítószámú szekvenciával;

    o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 6,42 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 52. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 53. azonosítószámú szekvenciával;

    p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 5,62 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 54. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 55. azonosítószámú szekvenciával;

    il ♦ ♦♦

    - 145 -

    q) VIJns-PA-NP, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,54 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 56. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 57. azonosítószámú szekvenciával;

    r) VIJns-PA-Ml, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 5,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 58. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 59. azonosítószámú szekvenciával.
14. 14. Nukleinsav-konstrukciókat tartalmazó készítmény, azzal jellemezve, hogy mind A-típusú, mind B-típusú humán influenzavírus-törzsből származó géntermékeket kódoló nukleinsav-konstrukciókat tartalmaz.
15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább három influenzavírus-törzsből származó hemagglutinin-génterméket, legalább két influenzavírus-törzsből származó nukleoprotein-génterméket és legalább két influenzavírus-törzsből származó mátrixprotein-génterméket kódoló nukleinsavakat tartalmaz.
16. 16. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy H1N1-, H2N2-, H3N2- és B-típusú influenzavírus-törzsekből származó influenzavírus-génermékeket tartalmaz.
17. 17. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alábbi konstrukciók bármelyikét vagy azok bármely kombinációját tartalmazza:

    a) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 46. azonosítószámú szekvenciával, 3’-végi szekvenciája pedig megegyezik a 47. azonosítószámú szekvenciával;

    b) VlJns-TX-HA (A/Texas/36/91), mely konstrukció mérete 6,56 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik a 48. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik a 49. azonosítószámú szekvenciával;

    - 146-

    c) VlJns-PA-HA (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 50. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 51. azonosítószámú szekvenciával;

    d) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 6,42 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 52. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 53. azonosítószámú szekvenciával;

    e) VI Jns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), mely konstrukció mérete 5,62 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 54. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 55. azonosítószámú szekvenciával;

    f) VIJns-PA-NP, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 6,54 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 56. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 57. azonosítószámú szekvenciával;

    g) VIJns-PA-Ml, (B/Panama/45/90), mely konstrukció mérete 5,61 kb, 5’-végi szekvenciája megegyezik az 58. azonosítószámú szekvenciával, 3’végi szekvenciája pedig megegyezik az 59. azonosítószámú szekvenciával.