SK114295A3 - Dna construction and pharmaceutical agent containing them - Google Patents

Description

Oblasť techniky <>

* ₄ Tento vynález sa vzťahuje na výrobu a použitie nových liečivých prípravkov, nukleových kyselín, ktoré pri priamej

Λ aplikácii do živého tkaniva stavovcov indukujú imunitnú reakciu špecificky zameranú na ľudský chrípkový vírus.

Doterajší stav techniky

Chrípka je akútne horúčkovité ochorenie spôsobené * infekciou respiračného traktu chrípkovým vírusom typu A alebo B. Na celom svete dochádza takmer každý rok k hromadnému výskytu chrípky vo forme opakujúcich sa epidémií alebo pandémií. Chrípka môže spôsobiť vážne poruchy systémov ľudského organizmu, vážne ochorenie (ako vírusový zápal pľúc) vyžadu. júci hospitalizáciu a komplikácie takého typu, ako je druhotný bakteriálny zápal pľúc. Nedávne epidémie v Spojených . štátoch amerických viedli pravdepodobne k viac než 10 000 (až k 40 000) úmrtiam ročne a k 5 000 až 10 000 úmrtiam ročne v rokoch bez epidémií. Najlepšou stratégiou v prevencii vysokej úmrtnosti a v ochorení spojenom s chrípkou je očkovanie. Súčasné vakcíny sú odvodené od vírusov pestovaných na kuracích zárodkoch a potom inaktivovaných. Tieto vakcíny zahrňujú tri kmene chrípkových vírusov (dva kmene A a jeden B kmeň). V súčasnej dobe sú k dispozícii tri typy dosiaľ patentovaných vakcín: Vakcíny obsahujúce celý vírus, vírusové segmenty alebo samotný povrchový antigén. Na očkovanie 'ti detí sa používajú len vakcíny obsahujúce len vírusové segs ? menty alebo povrchové antigény vzhľadom na búrlivé horúčkovité reakcie detského organizmu na vakcíny obsahujúce celé vírusy. U detí mladšie ako 9 rokov je nutné vykonať dvojité očkovanie, u dospelých stačí len jednorázová aplikácia vakcíny. Bolo však navrhnuté (viď. Medical Letter 32: 89 až 90,

17. september 1993), že by bola pre pacientov, očkovaných na jeseň výhodná ďalšia dávka vakcíny v zime alebo na začiatku jari, vzhľadom na zistenia u niektorých starších « pacientov, ktoré ukazujú, že titer protilátok po očkovaní sa

4, môže počas štyroch mesiacov alebo aj menej znížiť pod hladií nu obranyschopnosti. Tieto vakcíny sú zostavované každý rok . podľa predpokladu, ktorý kmeň vírusu bude v tom roku klinicky cirkulovať a na základe odhadu, ktorý z vírusov bude , v nadchádzajúcom období prevládať. Preočkovanie sa doporučuje vykonávať každý rok.

A. Obmedzenia vyrábaných vakcín sú nasledujúce:

'N

1) Variabilita vedie zvlášť u chrípkového kmeňa A k vzniku í vírusov, ktoré nie sú neutralizované protilátkami vytvorenými predchádzajúcim očkovaním (alebo predchádzajúcou infekciou) . Nové kmene vznikajú bodovou mutáciou (driftom antigénov) a preskupením (shiftom antigénov), kódujúcich povrchové ‘ glykoproteíny (hemaglutinín [HA] a neuroamidázu), zatiaľ čo vnútorné proteíny sú vo veľkej miere konzervované v driftovaných a shiftovaných kmeňoch. Očkovanie vyvoláva imunitu na základe homológnych kmeňovo špecifických protilátok a nie na základe heterológnej” skupinovej imunity sprostredkovanej bunkami.

2) Aj keď prevládajúci kmeň vírusu počas roka nijako významne nedriftuje ani neshiftuje musí sa očkovanie vykonávať každý rok znova, pretože titer protilátok sa znižuje. Hoci niektoré zdroje uvádzajú, že protilátky inhibujúce hemaglutinín (Hl) a neutralizujúce protilátky vydržia od niekoľkých mesiacov až po niekoľko rokov, kedy sa potom ich titer postupne znižuje, predpisy Advisory Committee on Iramunization Practices uvádzajú pokles titra protilátok v roku po očkovaní ako dôvod na každoročné preočkovanie, a to aj vtedy, ak nedošlo k žiadnemu významnému driftu alebo shiftu. (Hl protilátky znižujú schopnosť chrípkového vírusu aglutinovať červené krvinky. Podobne ako neutralizujúce protilátky sú tieto Hl protilátky namierené proti antigénu HA. Testy inhibície hemaglutinínu sú ľahšie na vykonanie a lacnejšie než testy na neutralizáciu, takže sú častejšie používané ako metódy na vyhodnocovanie schopnosti protilátok vytvorených proti jednému kmeňu chrípkového vírusu reagovať s odlišným kmeňom). Ako už bolo vyššie uvedené, viď. Medical Letter, mali by byť vysoko rizikoví starší pacienti očkovaní dvakrát za sezónu vzhľadom na ich krátkodobý titer obranných protilátok.

3) Účinnosť očkovania nie je optimálna. Vytvorenie vakcíny na ďalšie obdobie je založené na odhade prichádzajúceho cirkulujúceho kmeňa (prostredníctvom vyhodnocovania vzoriek v Ázii), čo je nepresné a môže viesť k neúplnej zhode medzi kmeňmi použitými pre vakcínu a medzi tými, ktoré potom v teréne skutočne kolujú. Naviac môžu nastať situácie, ako počas chrípkovej sezóny roku 1992 až 1993, kedy sa nový kmeň H3N2 (A/Beijing/92) klinicky prejavil až na konci chrípkovej sezóny. Jeho výskyt vyvolal okamžitú zmenu zloženia vakcíny pre rok 1993 až 1994, pretože krížová reakcia A/Beijing/92 s protilátkami, vytvorenými podľa predchádzajúceho kmeňa H3N2 (A/Beijing/89) bola veľmi slabá práve z dôvodu prebehnutého antigénneho shiftu. Avšak vzhľadom na dĺžku doby potrebnú na prípravu a formuláciu súčasnej patentovanej vakcíny, nemohla byť vakcína proti novému kmeňu zavedená počas sezóny 1992 až 1993 aj napriek početným dôkazom slabej ochrany poskytovanej používanou vakcínou a aj napriek zvyšujúcej sa virulencii nového kolujúceho vírusu kmeňa H3N2.

Aj keď táto vakcína súhlasí s kmeňom vírusu, proti ktorému je vytvorená, poskytuje súčasná patentovaná vakcína ochranu len pred približne 70 % ochorení zdravých detí ξ

i ι rf a dospelých v mladom veku a 30 až 40 % oslabených starších ' dospelých osôb. Preto sú na vyhodnotenie účinnosti vakcíny vytvorenej proti kmeňu, ktorý v populácii koluje, používané iné kritéria. Tieto kritéria zahrňujú prevenciu vážneho ochorenia a druhotných komplikácii, ktoré sa odrážajú v prevencii hospitalizácie (70 % starších osôb, žijúcich vo svojich domovoch proti 50 až 60 % starších osôb, žijúcich v domovoch dôchodcov) a v prevencii úmrtia (80 % pre obyvateľov domovov dôchodcov). Hromadná imunita vedúca k znižovaniu

- rozšírenia infekcie v domovoch dôchodcov je taktiež považovaná za ďalší prínos očkovania.

V

B. Charakteristika ideálnej univerzálnej vakcíny proti chrípkovému vírusu (predmet vynálezu):

1) Vytvorenie obrany proti skupine vírusov (heterológna obrana). Univerzálna vakcína by bola schopná ochrániť proti rôznym kmeňom vírusu, napríklad v rozmedzí subtypov H3N2 a možno aj proti všetkým subtypom, ako nap. od H1N1 k H3N2.

' Obrana by bola pravdepodobne sprostredkovaná cytotoxickými

T-lymfocytmi (CTL) rozpoznávajúcimi antigény z vnútorných konzervovaných vírusových proteínov aj keď určitú úlohu by mohli hrať aj neutralizujúce protilátky vytvorené proti konzervovanej časti proteínov viazaných na membrány.

2) Rozšírená reakcia protilátok. Pretože sa predpokladá, že CTL majú vplyv na uzdravenie z choroby, mala by vakcína založená výhradne na odpovedi CTL skracovať dobu choroby (snáď až do zachytenia subklinických prejavov choroby), ale neposkytovala by kompletnú ochranu proti ochoreniu. Experimenty ukázali, že súčasný výrobný postup pre vakcínu proti chrípkovému vírusu pasážovaním v kuracích zárodkoch má schopnosť selekcie vírusovej subpopulácie,, ktorá zmenila svoje HA antigény. Tak môže byť znížená účinnosť vakcíny, pretože protilátky vyvolané takouto vakcínou nemusia byť celkom účinné proti práve prevládajúcemu kmeňu. Preto by bolo výhodné vytvoriť protilátky, ktoré by mali v porovnaní (so súčasnými vakcínami rozšírený záber imunitnej odpovede.

Chrípková sezóna 1992 až 1993 poskytla výborný príklad obmedzenia súčasných vakcín a to na vakcíne využívajúcej na tvorbu protilátok kmeň A/Beijing/89. Takto vytvorené protilátky potom zle reagovali v krížovej reakcii (a mali preto slabé ochranné účinky) s novým a ovela virulentnejším kmeňom A/Beijing/92. Oba kmene sú typy H3N2, t.j. rovnaký subtyp. Pokiaľ sa však jedná o sekvenciu aminokyselín, líšia sa kmene podobné A/Beijing/92 od kmeňov podobných A/Beijing/89 s len v 11 bodových mutáciách (miesta 133, 135, 145, 156, 157,

186, 190, 191, 193, 226 a 262) v oblasti ΗΑ1. Nie je známe, či súčasný výrobný postup ovplyvnil nedostatočnú odpoveď i

v krížovej reakcii, ale je celkom jasné, že je potrebné rozšíriť rozsah reakcie protilátok.

3) Predĺžené trvanie protilátkovej odpovede. Pretože skupiny, ktoré sú v najväčšom nebezpečenstve, pokiaľ ide o ochorenie chrípkovým vírusom a úmrtnosť, (t.j. starší ľudia), sú [ taktiež skupiny, v ktorých titer obranných protilátok klesá [t príliš prudko na to, aby bolo očkovanie raz ročne účinné, mala by vylepšená vakcína vytvoriť protilátky, ktorých titer by vydržal dlhšie.

C. Polynukleotidy ako vakcína

I

Ukázalo sa, že vnútrosvalová aplikácia polynukleotidových konštrukcií, t.j. DNA plazmidov kódujúcich proteíny, vedie in situ k tvorbe týchto proteínov v svalových bunkách. Použitím plazmidov cDNA kódujúcich vírusové proteíny sa dosiahla tak tvorba protilátok, ako aj tvorba CTL, ktoré poskytovali homológnu a heterológnu ochranu proti následnému útoku niektorého homológneho alebo kríženého kmeňa. Každý typ imunitnej odpovede poskytuje nejakú potenciálnu výhodu proti súčasným očkovacím stratégiám. Použitie PNV na produkciu protilátok môže viesť k predĺženiu doby imunitnej odpovede a k poskytovaniu antigénov, ktoré môžu obsahovať nielen presnú sekvenciu klinicky kolujúceho kmeňa vírusu, ale aj vhodné post-translačné úpravy a konformácie natívneho proteínu (viď. rekombinantný proteín). Vznik odpovede CTL týmto spôsobom prináša výhodu v podobe ochrany pred kríženými kmeňmi bez použitia živých a potenciálne patogénnych vektorov alebo oslabených vírusov.

D. Preto hlavným nepriateľom vývoja vakcín proti takýmto vírusom ako je chrípkový vírus (t.j. vírusom, proti ktorým sa vytvárajú neutralizujúce protilátky), je rôznorodosť proteínov vírusových obalov rôznych izolovaných vírusov alebo kmeňov. Pretože tak myši, ak aj ľudské cytotoxické T-lymfocyty, majú schopnosť rozpoznávať epitopy odvodené od konzervovaných vnútorných vírusových proteínov [J. V. Yewdell a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 1785 (1985); A. R. M. Townsend a kol., Celí 49, 959 (1986); A. J. McMichael a kol., J. Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin a kol., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A. R. M. Townsend a H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7, 601 (1989)] a hrajú zrejme významnú úlohu v imunitnej reakcii na vírusy [Y. L. Lin a B. A. Askonas, J. Exp. Med. 154, 225 (1981); I.

Gardner a kol., Eur. J.

a G. L. Ada, Náture 273,

New Engl. J. Med. 309,

Immunol. 4, 68 (1974); K. L. Yap

238 (1978); A. J. McMichael a kol., (1983); P. M. Taylor a B. A.

Askonas. Immunol. 58, 417 (1986)], bolo úsilie zamerané na vývoj CTL vakcín schopných poskytovať heterológnu obranu proti rôznym vírusovým kmeňom.

CD8⁺ CTL bunky zabíjajú bunky infikované vírusom, ak receptory týchto T-lymfocytov rozpoznávajú vírusové peptidy, pripojené na MHC proteíny I. triedy [R. M. Zinkernagel a P. C. Doherty, tiež tam 141, 1427 (1975); R. N. Germain, Náture 353, 605 (1991)]. Tieto peptidy sú odvodené od endogénne syntetizovaných vírusových proteínov bez ohľadu na umiestnenie a funkciu proteínu vo víruse. Tak môžu CTL poskytnúť ochranu pred skríženými kmeňmi tým, že rozpoznávajú epitopy konzervovaných vírusových proteínov. Peptidy majúce schopnosť spojenia s MHC proteínmi I. triedy, ktoré je dôležité na ďalšie rozpoznávanie cytotoxickými T-lýmfocytmi, sú odvo'í >(

Λdené od proteínov, ktoré sú prítomné v cytoplazme alebo endoplazmatickom retikule alebo nimi prechádzajú [J. V. Yewdell a J. R. Bennink, Science 244, 1072 (1989); A. R. M. Townsend a kol., Náture 340, 443 (1989); J, G. Nuchtern a kol., Náture 339, 223 (1989)]. Všeobecne povedané nie sú teda exogénne proteíny, ktoré vstupujú do endozomálneho procesu (ako v prípade MHC proteínov 2. triedy), účinné na vyvolávanie CD8⁺ CTL odpovede.

Úsilie o vyvolanie CTL reakcie bolo väčšinou zamerané na použitie buď replikačných faktorov na tvorbu proteínov antigénu v bunke [J. R. Bennink a kol, tiež tam 311, 578 (1984); J. R. Bennink a J. V. Yewdell, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C. K. Stover a kol, Náture 351, 456 (1991); A. Aldovini a R. A. Young, Náture 351, 479 (1991); R. Schafer a kol., J. Immunol. 149, 53 (1992); C. S. Hahn a kol., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89, 2679 (1992)] alebo sa zameralo na zavedenie peptidov do cytozolu [F. R. Carbone a M. J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Dereš a kol., Náture 342, 561 (1989); H. Takahashi a kol., tiež tam, 344, 873 (1990); D. S. Collins a kol., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M. J. Newman a kol. tiež tam, 148, 2357 (1992)]. Oba tieto prístupy majú svoje obmedzenia, ktoré môžu znižovať ich využitie na vakcináciu. Retrovírusové vektory sú obmedzené vo svojej veľkosti a štruktúre polypeptidov, ktoré môžu byť exprimované ako fúzne proteíny pri zachovaní schopnosti replikácie rekombinantného vírusu [A. D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)] a účinnosť takýchto vektorov ako je vakcínia pre následnú imunizáciu môže byť ohrozená imunitnými reakciami proti samotným vektorom [E. L. Cooney a kol., Lancet 337, 567 (1991)]. Vírusové vektory a upravované patogény so sebou nesú riziká, ktoré môžu byť prekážkou ich použitia pre ľudské organizmy [R. R. Redfield a kol., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola a kol., Árch. Intern. Med. 149, 1569 (1989)]. Výber epitopov, ktoré majú byť vystavené, je závislý na štruktúre jednotlivých MHC proteínov, takže účinnosť peptidovej vakcíny môže byť limitovaná vzhľadom na rôznorodosť MHC haplotypov v outbredných populáciách. Benvenisty, N. a Reshef, L. [PNAS 83, 9551 až 9555, (1986)] ukázali, že DNA precipitovaná CaC12 a zavedená do myší intraperitoneálne, vnútrožilovo alebo vnútrosvalovo, sa môže exprimovať. Vnútrosvalové injekcie (i.m.) DNA expresívnych vektorov aplikované na myšiach viedli k príjmu DNA svalovými bunkami a k expresii génov nesených danou DNA [J. A. Volff a kol., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi a kol., Náture 352, 815 (1991)]. Ukázalo sa, že plazmidy boli udržované epizomálne a nereplikovali sa. Ďalšia vytrvalá expresia bola pozorovaná po vnútrosvalovej injekcii do kostrového svalstva laboratórnych potkanov, rýb a primátov a ďalej do srdcového svalstva laboratórnych potkanov [H. Lin a kol., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis a kol., Proc.

Natl. Acad. Sci (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen a kol.,

FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao a kol., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A, Volff a kol., Huraan Mol. Genet. 1, 363 (1992)]. Techniky na využitie nukleových kyselín ako liečivých prostriedkov boli opísané vo V090/11092 (4. októbra 1990). V tomto projekte boli nukleové kyseliny použité na očkovanie stavovcov.

Pre úspešnosť metódy nie je bezpodmienečne nutná vnútrosvalová aplikácia vakcíny. Táng a kol. [Náture 356, 152 až 154 (1992)] opísali zavedenie zlatých mikroprojektílov obalených DNA kódujúcou rastový hormón hovädzieho dobytka (BGH) do kože myší, ktoré u týchto myší viedlo k produkcii protilátok anti-BGH. Furth a kol. [Analytical Biochemistry, 205, 365 až 368, (1992)] dokázal, že na transfekcíu kože, svalu, tuku a tkaniva mliečnych žliaz u živých zvierat môžu byť použité tryskové injekcie. V poslednej dobe Friedman, T., [Science. 244, 1275 až 1281 (1989)] opísal rôzne metódy zavádzania nukleových kyselín. Viď. napríklad Robinson a kol., Súbor abstraktov, uvedených pri príležitosti stretnutia 1992 Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, str. 92, ktoré opisujú vnútrosvalovú, vnútrožilovú a intraperitoneálnu aplikáciu DNA vtáčej chrípky do kurčiat, ktorá viedla k údajnej obrane proti smrteľnému vývoju ochorenia. Tieto materiály však neopisujú, ktoré gény vírusu vtáčej chrípky boli použité a naviac sa tu uvádzajú len špecifické imunitné odpovede H7 bez akejkoľvek zmienky o indukcii obrany proti kríženým kmeňom.

Podstata vynálezu

Tento vynález teda nie je založený na žiadnej zo známych metód na zavádzanie nukleových kyselín do živého tkaniva za účelom vyvolania expresie proteínov. Tento vynález opisuje metódu zavádzania spracovania antigénov za T-lymfocytov špecifických vynález uspokojuje potrebu vírusových proteínov do dráhy účelom vytvorenia cytotoxických pre určitý vírus. Preto tento volajúcu po špecifických liečeb ných prostriedkoch proti chrípkovému vírusu, ktoré by mali schopnosť vyvolávať požadovanú profylaktickú imunitnú odpo veď na vírusové patogény. Zvlášť dôležitou časťou tohto liečebného postupu je možnosť indukcie imunitnej odpovede prostredníctvom T buniek, ktorá môže zabrániť infekcii aj v takých prípadoch, kedy je kmeň heterológny s kmeňom, z ktorého bol antigén konštrukcie kódujúce ľudského chrípkového získaný. Tento vynález opisuje DNA vírusové proteíny nukleoproteínu vírusu (NP), hemaglutinínu (HA), neuro-amidázy (NM), matricového proteínu (M), neštruktúrny proteín (NS), polymerázu (PB1 a PB2 = bázické polymerázy a 2; PA = kyslá polymeráza) alebo ďalšie gény chrípkového vírusu kódujúce produkty, ktoré vyvolávajú tvorbu špecifických CTL.

Chrípkový virus má genón tvorený ribonukleovou kyselinou (RNA) zložený z niekoľkých segmentov RNA. Každý segment RNA kóduje aspoň jeden génový produkt. NP génový produkt sa viaže na RNA a sprostredkováva premiestnenie vírusovej RNA do jadra infikovanej bunky. Sekvencia tohto produktu je konzervovaná a za 50 rokov sa v jej sekvencii aminokyselín objavilo len 7 % odchyliek. P génové produkty (PB1, PB2, PA) sú zodpovedné za syntézu nových vírusových RNA. Tieto gény

sú dokonca ešte viac konzervované než gén NP. HA je hlavným produktom vírusového génu pre obal vírusu. Je menej konzervovaný než NP. Viaže bunkový receptor a slúži teda na iniciáciu novej chrípkovej infekcie. Hlavná reakcia neutralizačných protilátok je zameraná proti produktu tohto génu. Zároveň je proti tomuto proteínu zameraná výrazná reakcia T-lýmfocytov. Súčasné vakcíny proti ľudskému chrípkovému vírusu obsahujú tri druhy chrípkového vírusu alebo ich HA proteíny. Avšak vzhľadom na zmienenú variabilitu sekvencie HA proteínov v rôznych druhoch chrípkových vírusov musia byť tieto vakcíny neustále upravované podľa toho druhu patogénneho vírusu, ktorý práve koluje v populácii. Hemaglutinín má však niektoré zakonzervované elementy pre generácie cytotoxických T-lýmfocytov, ak je správne prezentovaný. Biologické funkcie génových produktov NS1 a NS2 nie sú celkom objasnené, ale tieto proteíny môžu hrať významnú úlohu vo vyvolávaní obrannej reakcie CTL. Konečne produkty génov Ml a M2, ktoré sú trochu viac konzervované než HA, vyvolávajú hlavnú reakciu cytotoxických leukocytov. Ml protein je veľmi výdatný produkt vírusových génov.

Účinnosť ochrany vakcínou DNA pred následným napadnutím vírusom sa prejaví očkovaním nereplikujúceho sa plazmidu DNA, kódujúceho jeden alebo viac z vyššie uvedených vírusových proteínov. Tento spôsob je veľmi výhodný, pretože do postupu nie je začlenená žiadna infekčná zložka, nie je potrebné zostavenie žiadnych vírusových partikúl a je umožnený rozhodujúci výber. Pretože sekvencie nukleoproteínu a niekoľkých ďalších vírusových produktov sú konzervované v niekoľkých rôznych druhoch chrípkového vírusu, poskytuje takáto vakcína naviac obranu proti následnému napadnutiu virulentným druhom chrípkového vírusu, ktorý je homológny alebo heterológny s druhom vírusu, z ktorého bol gén získaný a klonovaný.

DNA konštrukcie majúce schopnosť expresie po priamom zavedení buď injekciou alebo iným spôsobom do živočíšneho tkaniva, sú novými profylaktickými liečebnými prípravkami.

Indukuj ú tvorbu špecifických cytotoxických T-lymfocytov, [ ktoré na rozdiel od protilátok, zameraných na jediný druh vírusu rozpoznávajú vírusové antigény a reagujú na rôzne druhy vírusov. Tvorba takýchto CTL in vivo obyčajne vyžaduje

Í í endogénnu expresiu daného antigénu, ako je tomu v prípade vírusovej infekcie. Na tvorbu vírusového antigénu, ktorý by bol prezentovaný imunitným systémom bez obmedzení, daných priamou dopravou peptidu alebo použitím vírusových vektorov, bola plazmidová DNA kódujúca proteíny ľudského chrípkového vírusu injektovaná do štvorhlavého svalu myší BALB/c. Tieto injekcie vyvolali tvorbu vírusovo špecifických CTL a obranu

- proti následnému napadnutiu heterológnym kmeňom chrípkového vírusu. Obranyschopnosť bola zobrazená znižujúcim sa titrom ‘ vírusu v pľúcach, potlačením úbytku telesnej hmotnosti a zvýšeným počtom prežívajúcich. U makakov rhesus sa dosiahol vysoký titer protilátok proti hemaglutinínu a protilátok proti nukleoproteínu a u fretiek bol pozorovaný znížený * titer vírusu v nosnom výplachu po napadnutí homológnymi aj f

j heterológnymi druhmi.

í

I ' Kľúčové pozorovania vzťahujúce sa k vynálezu:

j 1) Dôkaz účinnosti. Po imunizácii DNA pre nukleoproteín (NP) je pozorovateľná heterológna ochrana, ktorá sa prejavuje zvýšeným počtom prežívajúcich, zníženým titrom pľúcnych vírusov a inhibíciou úbytku telesnej hmotnosti u myší napadnutých druhom chrípkového vírusu odlišného od druhu vírusu, ktorý slúžil ako zdroj NP génov. V tomto prípade boli povrchové proteíny týchto dvoch kmeňov značne odlišné (H1N1 vs. H3N2) a súčasný druh vznikol 34 rokov po vzniku počiatočného druhu vírusu. Imunizácia fretiek DNA NP génov a DNA pre matricový proteín (Ml) buď oddelene, spolu alebo v spojení s HA DNA, poskytovala ochranu (znížené šírenie nosných vírusov) proti napadnutiu pozmeneným druhom (klinickým izolátom). Najmä obrana poskytovaná zmesou DNA (NP a Ml DNA, kódujúca proteíny Beijing/89 a HA DNA, kódujúca buď Beijing/89 alebo Hawaii/91 HA) bola u fretiek proti driftovanému druhu (Georgia/93) vyššia, než akú poskytujú patento- 12 Ivané vakcíny (obsahujúce Beijing/89). Ukázalo sa, že zmes obsahujúca HA DNA z Hawaii/91 bolo o niečo účinnejšia než zmes obsahujúca HA DNA z Beijing/89. Ochrana získaná pomocou zmesi zahrňujúcej HA DNA pre Hawaii/91 viedla k ochrane totožnej s tou, ktorá bola pozorovaná u homológnej HA DNA (Georgia/93), zatiaľ čo zmes s HA DNA pre Beijing/89 sa od tejto homológnej ochrany líšila, aj keď bola stále výrazne lepšia než u patentovaných vakcín. Protilátky Hl sa tvorili u všetkých testovaných druhov vrátane myší, fretiek, makakov a afrických opíc.

2) Doba účinnosti. Štúdie používajúce DNA kódujúcu reporté• rový gén opisujú pretrvávanie DNA s expresiu proteínu po dobu najmenej 1,5 roka (najdlhšie pretrvávala v testovaných • myšiach; Volff a kol. Human Mol. Genet., 1992). Takže pokiaľ sú produkty génov chrípkových vírusov taktiež vytrvalo * exprimované, potom by aj výsledná imunitná odpoveď mala

J vydržať. protilátky a CTL (Yankauckas a kol., DNA & Celí í Biol., 1993) a homológna ochranná imunita (údaje MRL) vyvolané injekciami DNA u myší taktiež pretrvávali po dobu dlhšiu než jeden rok. Doterajšie testy makakov dokázali ί pretrvávanie protilátok po dobu najmenej jedného roku. Dĺžka f

’ ‘ reakcie CTL a heterológnej ochrany (vyšší počet prežívajú^! cich) je 6 mesiacov (zatiaľ najdlhšia doba). Došlo k miernemu poklesu stupňa heterológnej ochrany, ale táto obrana sa dá zvýšiť.

3) Dávkovanie. Testy vykonávané na opiciach (makak rhesus) <Í ukázali, že dve dávky so 100 pg HA DNA viedli k dobrému titru protilátok Hl, ktoré pretrvávajú dosiaľ po dobu jedného roku. Tvorba obranných látok (zvýšený počet prežívajúcich po následnom heterológnom napadnutí) u myší bola pozorovaná už pri dávkach 6 pg (podané 3 krát) a po jedinej injekcii obsahujúcej 200 pg. Všeobecne sa dá povedať, že vyšší počet injekcií (až na 3) zvyšoval stupeň ochrany. Prvotné štúdie ukázali, že 2 injekcie s 10 pg alebo 100 pg DNA kódujúcej 3 HA, NP a Ml (pre gény H3N2 Beijing/89) viedli k titru Hl í

protilátok podobnému titru vyvolanému dosiaľ patentovanými j vakcínami. Je veľmi dôležité si uvedomiť, že všetky testovali né zvieratá neprišli s chrípkovým vírusom nikdy do styku, í

zatiaľ čo cieľová klinická populácia (starší ľudia) má s chrípkou už skúsenosti. (Nezabudnite, že deti mladšie ako 9 rokov dostávajú 2 injekcie dosial patentovaných vakcín).

Tento vynález opisuje liečebné prípravky z nukleových kyselín, ktoré ak sú zavedené do živočíchov vrátane stavovcov ako cicavcov a človeka, v nich vyvolávajú expresiu proteínov kódovanými týmito kyselinami. Týmito proteínmi sú s tie proteíny, ktoré sa v živočíšnom organizme za normálnych okolností nevyskytujú okrem patologického stavu. Jedná sa ^? o proteíny ako chrípkový nukleoprotein, neuroamidázu, hemaglutinín, polymerázu, matricový proteín alebo neštruktúrne proteíny, ale nielen oni. Imunitný systém živočícha je po týchto prípravkoch aktivovaný na tvorbu obrannej reakcie. Pretože tieto exogénne proteíny sú produkované vlastnými tkanivami daného živočícha, sú exprimované proteíny v organizme spracované a prezentované prostredníctvom hlavného histokompatibilného komplexu, MHC. Toto rozpoznávanie je totožné s mechanizmami, ktoré prebiehajú pri skutočnej infekcii daného organizmu. Výsledkom je indukcia imunitnej odpovede, ktorá chráni proti vírusovej infekcii. Dokumentácia k týmto výsledkom je uvedená v prílohe.

Tento vynález opisuje nukleové kyseliny, ktoré po zavedení do tkaniva živočícha in vivo očkovaním, inhaláciou alebo na základe podobného mechanizmu (viď. Doterajší stav . techniky) vyvolajú expresiu génov ľudského chrípkového vírusu. Tak napríklad očkovaním konštrukcie DNA podľa tohto vynálezu do svalu myší vyvolá expresiu kódovaných génových produktov. Podobne tomu je u fretiek a makakov. U živočíchov očkovaných polynukleotidovou vakcínou bola po napadnutí virulentným chrípkovým vírusom v dávkach, ktoré jednoznačne usmrcovali kontrolné zvieratá, dokázaná nižšia chorobnosť aj úmrtnosť. Tento vynález teda opisuje očkovanie použiteľné pre ľudský organizmus a zabraňujúci nákaze chrípkovým vírusom .

Ukázali sme, že DNA konštrukcie kódujúce proteíny chrípkových vírusov vyvolávajú u zvierat imunitnú odpoveď. Ako bude ďalej bližšie vysvetlené, imunitné odpovede myší zahrňovali tvorbu protilátok a CTL, u fretiek a primátov tvorbu protilátok a poskytovali u myší a fretiek obranu proti napadnutiu homológnymi, t.j. driftovanými alebo shiftovanými, kmeňmi chrípkových vírusov. Pravdepodobne naj prekvapujúcejším výsledkom očkovania DNA kódujúcou vírusové proteíny bola schopnosť poskytnúť obranu proti odlišným typom chrípkového vírusu. Z tohto vyplýva, že pridanie zložiek vyvolávajúcich tvorbu CTL do vakcíny by malo slúžiť na potlačenie účinku nových variant vírusov, ktoré sa objavujú v priebehu sezóny alebo ktoré nie sú dobe prípravy vakcíny, ktorá sa pripravuje pre ďalší nasledujúci rok, ešte známe. Dôležitým faktorom je, že očkovanie vektormi cDNA kódujúcimi gény HA, NP a Ml poskytovalo fretkám obranu proti driftovanému druhu vírusu, ktorá bola účinnejšia než u už patentovaných vakcín. Táto skutočnosť hovorí v prospech používaných konštrukcií kódujúcich celé gény v PNV.

Jedným z uskutočnení tohto vynálezu je vakcína, obsahujúca samotné plazmidy DNA, napríklad z troch prevládajúcich klinických kmeňov predstavovaných vírusmi A/H1N1 (A/Texas/91), A/H3N2 (A/Georgia/93) a B (B/Panama/90) a z konštrukcii DNA kódujúcich vnútorné konzervované proteíny NP a Ml (matrix) tak z druhov A (Beijing/89; H3N2), ako aj z kmeňov B, aby tak poskytovali súčasnú obranu proti driftovaným a shiftovaným antigénom. Molekuly HA DNA povedú k tvorbe HA a k výsledným neutralizačným protilátkam proti HA. Toto pôsobenie bude druhovo špecifické so širším záberom obrany proti driftovaným druhom v porovnaní s už patentovanými vakcínami, založenými na proteínoch. Konštrukcie NP a Ml povedú k tvorbe CTL, ktoré budú poskytovať obranu proti rôznym druhom vírusov pri potenciálne nižšom vírusovom zaťažení a s rýchlym priebehom uzdravenia z ochorenia. Predpokladané pretrvávanie DNA konštrukcií (v epizomálnej, nereplikujúcej sa a neintegrujúcej sa forme v svalových bunkách) by malo v porovnaní so súčasnými vakcínami poskytnúť predĺženú ochranu.

Predpokladané výhody oproti súčasným vakcínam zahrňujú: širší záber obrany vzhľadom na tvorbu CTL +/- väčšiu šírku ^: protilátok, predĺženú dĺžku trvania ochrany. Použitie PNV nevyžaduje vytvorenie, selekciu a rozmnožovanie určitého druhu vírusu, tak ako sa to vykonáva pre súčasné vakcíny, pretože nové konštrukcie DNA môžu byť vytvorené priamo z izolátov z klinickej praxe.

V jednom z uskutočnení tohto vynálezu je nukleoproteín ľudského chrípkového vírusu NP a jeho sekvencia získaný • z druhu A/PR/8/34 a klonovaný do expresívneho vektora. Vektor obsahuje promótor na transkripciu RNA polymerázy a ter^: minátor transkripcie sekvenciu kódujúcu NP. V jednom uskutočnení je týmto promótorom LTR časť vírusu RSV (Rous ' sarcoma vírus), ktorá je silným transkripčným promótorom.

Častejším promótorom je promótor cytomegalovírusu s intróno, ’ vou sekvenciou A (CMT-intA). Používaným terminátorom transί kripcie je terminátor hovädzieho rastového hormónu, BGH.

j Zvlášť výhodná je ako terminátor kombinácia oboch terminátorov CMVintA-BGH. Ďalej na uľahčenie farmaceutickej prípravy prípravku je do expresívneho vektora väčšinou zahrnutý signálny znak pre rezistenciu na antibiotiká. Na tieto účely je možné použiť gény na rezistenciu voči ampicilínu, neomycínu alebo akýkoľvek ďalší signálny znak na rezistenciu voči ďalším farmaceutický prijateľným antibiotikám. Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu kóduje signálny znak na rezistenciu na antibiotiká produkt na neomycínovú rezistenciu. Ďalej je výhodné na účely farmaceutickej výroby v prokaryotických organizmoch, aby vektor obsahoval začiatok replikácie a bol prítomný vo vysokom počte kópií. Tieto vlastnosti má ktorýkoľvek komerčne dostupný prokaryotický klonovací vektor. V uvedenom uskutočnení tohto vynálezu boli tieto funkcie i zabezpečené komerčne dostupnými vektormi označovanými pUC.

Je vhodný odstrániť nedôležité sekvencie DNA, preto sú v jednom z uskutočnení tohto vynálezu z pUC plazmidu odstránené sekvencie kódujúce lacZ a lacl.

V jednom z uskutočnenia tohto vynálezu je použitý ako

J expresívny vektor pnRSV, pričom LTR sekvencia RSV je použitá ‘ ako promótor. V inom uskutočnení tohto vynálezu, VI, je pouf žitý mutovaný vektor pBR322, do ktorého bolí klonované CMV promótor a transkripčný terminátor BGH. Konštrukcia VI-NP bola použitá na očkovanie myší a indukciu CTL, ktoré ochraňujú proti rôznorodej nákaze. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení tohto vynálezu boli zložky VI kombinované pri príprave expresívneho vektora označeného VIJ. Do VIJ je klonovaný gén chrípkového vírusu ako napríklad A/PR/8/34 NP, PB1, NS1, HA, PB2 alebo gén Ml. V inom uskutočnení vynálezu je však gén , pre ampicilínovú rezistenciu vo V1J nahradený génom pre neomycínovú rezistenciu, čím vznikol vektor VIJ-neo • (SEKV.ID:18:, obr. 7), do ktorého bolo na účely tohto vynálezu klonovaných niekoľko rôznych génov chrípkových vírusov.

- V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu bol použitý vektor

VlJns, ktorý je rovnaký ako VIJ až na to, že do jednoduchého • reštrikčného miesta KpnI v polohe 2114 vo VIJ-neo bolo vložené reštrikčné miesto Sfil. Výskyt miest Sfil v ľudskej í genómovej DNA je veľmi nízky (približne 1 miesto na 100 000 ’ báz). Tak tento vektor umožňuje starostlivé sledovanie ¹ integrácie expresívneho vektora do hostiteľskej DNA len , štiepením extrahovanej DNA pomocou reštriktázy Sfil. V ďalK šej úprave je vektorom VÍR. V tomto vektore bolo odstrihnuté čo najväčšie množstvo nepotrebnej DNA, aby sa získal vysoko kompaktný vektor. Tento vektor je odvodený od VlJns a je uvedený ba obrázku 36 (SEKV.ID:45:). Tento vektor umožňuje zavedenie väčších inzertov so zníženým rizikom nežiadúcich kódujúcich sekvencii a optimalizuje príjem bunkami, keď je konštrukcia kódujúca špecifické gény chrípkových vírusov zavedená do okolitého tkaniva. Na obrázku 36 sú časti VIJ-neo (obr. 7), ktoré boli odobraté, označené ako medzera a vložené sekvencie sú uvedené tučnými písmenami, avšak čís;< lovanie VIJ-neo zostáva nezmenené. Pomocou techník známych pre odborníkov danej oblasti techniky je možné dosiahnuť ďalšie úpravy vektora a nových vývojových metód. Tu uvádzané výrobky sú na tie účely, pre ktoré boli vytvorené, obzvlášť vhodné, aj keď boli pripravené pomocou konvenčných pro• - 17 striedkov.

Hoci jedno z uskutočnení tohto vynálezu využíva NP gén chrípkového vírusu z druhu A/PR/8/34, viac uprednostňované uskutočnenia využívajú NP gén, HA gén, NA gén, PB gén, M gén alebo NS gén z nedávnych izolátov chrípkových génov. Uskutočnenie zahrňuje prípravu kópií DNA vírusových génov a následné subklonovanie jednotlivých génov. Sekvencie génov mnohých chrípkových vírusov sú v súčasnej dobe prístupné verejnosti v GENBANK (okolo 509 týchto sekvencií pre gény chrípky A). Preto sú v tomto vynáleze výhodne používané gény klonované za súčasných vírusových izolátov Texas, Beijing alebo Panama, čo sú druhy doporučované Centrom na kontrolu choroby (Center for Disease Control) na použitie v očkovan cích vakcínach proti chrípke (viď. FLI-IMMUNE vakcína proti chrípkovému vírusu Lederle, Physicians Desk Reference, 1993, str. 1232, vakcína s purifikovaným trivalentným povrchovým antigénom chrípkového vírusu obsahujúca hemaglutinínový proteín z A/Texas/36/91, H1N1; A/Beijing/353/89, H3N2;

a B/Panama/45/90). Aby sme používali rovnakú terminológiu, prijali sme pre opisy DNA konštrukcií nasledujúcu konvenciu: označenie vektora - druh chrípky - gén. Tak je konštrukcia, ktorá obsahuje NP gén z kmeňa A/PR/8/34 a ktorá je klonovaná do expresívneho vektora VIJneo označená VIJneo-PR-NP. Avšak pretože sa etiologický druh vírusu mení, môže sa prirodzene zmeniť aj gén, ktorý je na inkorporáciu do farmaceutického prípravku najvhodnejší. Ako však uvádzame ďalej v tomto dokumente, majú indukované imunitné odpovede cytotoxických lymfocytov schopnosť obrany proti heterológnym druhom, takže u nových vakcín podľa tohto vynálezu nie je premenlivosť druhov chrípkových vírusov v porovnaní s doterajšími vakcínami založenými na celých vírusoch alebo ich podjednotkách takým kritickým problémom. V prospech nových vakcín podľa tohto vynálezu naviac hovorí aj skutočnosť, že tieto prípravky sú ľahko použiteľné pri inzercii nových génov a táto ich vlastnosť umožňuje ich ľahké úpravy pomocou štandardných techník molekulárnej biológie .

nukleoproteínu konzervovaná dosiahnutá obrana vírusu chrípky A, bol gén pre nukPretože je v rôznych chrípkových proti následnej nákaze ktorý bol heterológny leoproteín klonovaný. hých druhov chrípky v ich sekundárnej štruktúre [M. Gammelin a kol., Virol. 71, 1989] a v sekvencii zmien [0. T. Gorman a sekvencia vírusoch, bola tak virulentným kmeňom s kmeňom, z ktorého

Porovnanie nukleoproteínov NP z mnoA neukázalo žiadne významné rozdiely 170, aminokyselín bolo zistených len pár kol., J. Virol. 65, 3704, 1991].

V priebehu približne 50-tich rokov sa u nukleoproteínov ľudských chrípkových vírusov objavujú zmeny a aminosekvencii v miere len 0,66 aminokyseliny za rok. Naše výsledky naviac ukazujú, že Α/ΗΚ/68-špecifické CTL rozpoznávajú cieľové bunky pulzované syntetickým peptidom NP (147 až 155) odvodeným od sekvencie nukleoproteínu z A/PR8/34, čo znamená, že tieto H-2K*^-obmedzené epitopy CTL zostali funkčne nedotknuté počas 34 rokov (viď. obr. 2). Je potrebné si taktiež uvedomiť, že tam, kde gény kódujú povrchový antigén vírusu, ako je napríklad hemaglutinín alebo dokonca neuramidáza, vzniká okrem veľmi dôležitej odpovede cytotoxických lymfocytov taktiež aj výrazná imunitná odpoveď neutralizačných humorálnych protilátok .

Vnútrosvalová injekcia expresívneho DNA vektora kódujúceho konzervovaný vnútorný proteín chrípky A viedla k tvorbe výraznej obrannej odpovedi pri následnej vírusovej nákaze. Predovšetkým došlo k tvorbe NP-špecifických protilátok a primárnych cytotoxických lymfocytov. Očkovanie NP DNA viedlo v porovnaní s kontrolnými objektami k zníženým titrom vírusov v pľúcach, potlačeniu úbytku telesnej hmotnosti a zvýšenému počtu prežívajúcich. Nedostatočná účinnosť samotných NP protilátok uvedená v príklade 4 potvrdzuje, že obranná imunitná odpoveď pri boli s vírusovou nákazou nebola sprostredkovaná NP-špecifickými protilátkami, ale skôr prostredníctvom NP-špecifickej bunkovej imunity. Naviac sa vytvorili významné hladiny primárnych cytotoxických leukocytov zameraných proti NP. Obrana bola proti virulentnému dru hu chrípky A, ktorý bol heterológny k druhu, z ktorého bola

I klonovaná DNA. Napadajúci druh vírusu vznikol po viac než tridsiatich rokoch po druhu A/PR/8/34, čo dokazuje, že imu,nitná odpoveď namierená proti konzervovaným proteínom môže byť účinná aj napriek antigénnemu posunu alebo driftu u rôznych proteínov vírusového obalu. Pretože každý génový produkt vírusu vykazuje určitý stupeň konzervácie a pretože sa cytotoxické leukocyty tvoria na základe vnútrobunkovej expresie a spracovania MHC, dá sa predpokladať, že gény ostatných chrípkových vírusov vyvolajú odpoveď analogickú tej, ktorá bola dosiahnutá pre NP. Metódy na rozpoznávanie imunogénnych epitopov sú v súčasnej dobe medzi odborníkmi v danej oblasti techniky dobre známe [viď. napríklad Shirai a kol., J. Immunol. 148, 1657 až 1667, 1992; Choppin a kol., J. Immunol. 147, 575 až 583, 1991; Calin-Laurens a kol.,

Vaccine 11, 974 až 978, 1993], Ako ukazuje klonované a sek: ventované miesto v expresívnom vektore (viď. nižšie), bolo mnoho týchto génov klonovaných tak, aby boli tieto liečebné prípravky k dispozícii vo vhodnej forme.

í ; Tento vynález teda opisuje expresívne vektory kódujúce proteín chrípkového vírusu ako imunogén. Tento vynález post kytuje prostriedky na indukciu obranyschopnosti proti rôznym ž vírusovým kmeňom bez potreby samostatne sa replikujúcej prí< - sady alebo pomocnej látky. Očkovanie DNA naviac poskytuje ^! mnoho ďalších výhod. Za prvé, tento očkovací postup by mohol byť použitý pre nádorové ochorenia rovnako ako pre infekciu, pretože imunitná odpoveď CD8⁺CTL hrá dôležitú úlohu u oboch týchto patofyzio’logických procesoch [K. Tanaka a kol., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Vyvolanie imunitnej odpovede proti proteínu so zásadným významom pre transformačmý proces, môže teda byť účinným prostriedkom v imunoliečbe alebo v obrane proti rakovine. Za druhé, tvorba vysokého titra protilátok proti proteínom exprimovaným po injekcii vírusoví vého proteínu (NP alebo hemaglutinínu) a DNA pre ľudský rastový hormón [viď. napríklad D.-c. Táng a kol., Náture 356, 152, 1992] naznačuje, že toto je jednoduchý a vysoko účinný prostriedok na prípravu vakcín založených na protilátkach buď samostatných alebo v kombinácii s vakcínami cytotoxic20 kých T-lymfocytov zameraných na konzervované antigény.

Jednoduchosť prípravy a purifikácie konštrukcií DNA je porovnateľná zvlášť s tradičnou purifikáciou proteínov a umožňuje prípravu kombinovaných vakcín. Môžu byť tak pripravené násobné konštrukcie, ako napríklad konštrukcie kódujúce NP, HA, Ml, PB1, NS1 alebo ktorékoľvek iné gény chrípkových vírusov, ktoré môžu byť ďalej miešané alebo aplikované spoločne. A konečne, pretože expresia proteínov je vyko návaná po injekcii DNA [H. Lin a kol., Circulation 82, 2217

Kitsis a kol., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S.

Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Volf

Mol. Genet. 1, 363 (1992)] môže byť zvýšená buniek B a T [D. Gray a P. Matzinger, J. Exp.

(1991); S. Oehen a kol., tiež tam 176, 1273 vytvorená dlhodobá humorálna imunita a imuni(1990) ; R. N. Jiao a kol. , a kol., Human dlhodobá pamäť Med. 174, 969 (1992)] a teda ta sprostredkovaná bunkami.

Obmedzenie súčasných vakcín tým viac zdôrazňuje potrebu rozvoja nových účinných prostriedkov na prevenciu proti infekcii a zmierneniu ochorenia. Staršie vakcíny poskytujú len obmedzenú obranu, sú účinné len proti niekoľkým vybraným kmeňom vírusov a ich účinnosť mizne po krátkej dobe. Preto musia byť súčasné očkovacie látky preformulované pre včasnú inokuláciu, aby mohli byť účinné. Tvorba zvýšenej odpovede CTL proti vnútorným proteínom by pravdepodobne poskytla značnú dlhodobú imunitu proti rôznym kmeňom, ktorú v súčas nej dobe podávané vakcíny zďaleka neposkytujú.

Predviedli sme expresiu proteínov z PNV konštrukcií u myši, fretiek a primátov človeku nepríbuzných pomocou detekcie imunitnej odpovede hostiteľského organizmu namierenej proti antigénom chrípkových vírusov. Očkovanie myši DNA kódujúcou chrípkovej NP viedlo k zvýšeniu počtu prežívajúcich objektov, zníženému pľúcnemu titru vírusov a menšiemu úbytku telesnej hmotnosti v porovnaní s kontrolnými zvieratami vystavenými infekcii subtypov chrípkových vírusov (posunutých kmeňov) odlišných od tých, ktoré boli použité pre DNA konštrukcie. Taktiež sme pozorovali zníženie šírenia vírusu po infekcii posunutými kmeňmi u fretiek, ktoré boli

- 2Í očkované NP DNA. Tieto výsledky ukazujú, že obrana proti hlavným posunom v kmeňoch chrípkových vírusov je sprostredkovaná vakcínou obsahujúcou DNA s génmi kódujúcimi NP. Očkovanie HA DNA a následná infekcia experimentálnych zvierat driftovanými vírusovými kmeňmi viedla k ešte výraznejšiemu zníženiu šírenia vírusu. Pridaním DNA pre vnútorný proteín ešte mierne zvýšilo už aj tak vysoký stupeň obrany pozorovanej po očkovaní samotnou HA DNA.

Imunitná odpoveď na chrípkovú DNA bola u myší pozorovaná ešte šesť mesiacov po aplikácii injekcie spoločne s pretrvávaním protilátok, aktivitou CTL a obranou in vivo. Opakovaná injekcia DNA ešte ďalej zvýšila počet prežívajúcich po následnej infekcii chrípkovým kmeňom odlišného subtypu za 25 týždňov a ukázala možnosť zvýšenia obranyschopnosti sprostredkovanej bunkami. Pretrvávanie protilátok bolo taktiež pozorované po dobu najmenej jedného roka po dvoch injekciách HA DNA, pričom u afrických opíc protilátky pretrvávali po dobu najmenej deviatich mesiacov po jedinej injekcii HA DNA.

Výsledky týchto experimentov vykonávaných na zvieratách ukazujú, že priame injekcie DNA poskytujú modernú metódu ochrany ľudského organizmu proti chrípkovej infekcii a ochoreniu. Experimentálna ochrana pomocou injekcií DNA bola dosiahnutá očkovaním myší a fretiek, ktoré predtým neprišli do styku s infekciou. Ľudia očkovaní DNA budú mať za sebou už predchádzajúce skúsenosti s chrípkou. Tieto osoby budú po očkovaní konštrukciami DNA vykazovať ešte výraznejšiu imunitnú odpoveď a možno aj s dlhším trvaním.

Na optimalizáciu použitej koncentrácie je rozsah dávok porovnaný s imunogenicitou. V pokusoch s malými cicavcami vyvolalo odpovede cytotoxických leukocytov už také malé množstvo ako 1 gg NP DNA. Očkovanie afrických opíc vyvolalo protilátkovú odpoveď u dvoch zvierat z dvoch pri dávkach 100 gg a 1000 gg HA DNA (A/PR/08/34), zatiaľ čo jedno zviera z dvoch reagovalo na samotnú dávku 10 gg. V oddelených experimentoch boli africké opice, ktoré ešte neprišli do . styku s infekciou, očkované zmesou piatich rôznych konštrukcií DNA kódujúcich HA z troch vírusových subtypov spolu s DNA kódujúcou NP a Ml z chrípkového vírusu typu A. Tri z troch opíc v každej skupine reagovali na očkovanie, ktoré obsahovalo 10 gg alebo 100 gg každej z piatich konštrukcii. Na základe týchto zistení je možné predpokladať, že dávky účinné pre ľudský organizmus sú 10, 50, 100 a 200 gg DNA.

Prevencia proti infekcii pomocou súčasných patentovaných inaktivovaných vakcín koreluje so sérom a hladinami sliznicových protilátok proti HA, ale nekoreluje s protilátkovou odpoveďou na vnútorné proteíny chrípkových vírusov. Preto musí byť HA zahrnutý do vývoja protichrípkových DNA vakcín. Imunitná odpoveď na NP však zvyšuje odpoveď protilátok na HA a vnútorné proteíny chrípkových vírusov vyvolávajú odpoveď cytotoxických leukocytov na antigénne odlišné kmene chrípkových vírusov. Ako už bolo uvedené vyššie, experimenty na zvieratách ukázali zvýšenú imunogenicitu a ochranu tam, kde injekcie obsahovali DNA konštrukcie kódujúce vnútorné proteíny chrípkových vírusov súčasne s HA. Začlenenie DNA konštrukcií kódujúcich vnútorné proteíny by pravdepodobne zvýšilo účinnosť DNA vakcín a ľudí. Pretože dávky budú pravdepodobne závisieť na interakcii týchto zložiek, rutinné testovanie umožní odborníkom stanovenie dávky DNA pre zmesi HA, NP a Ml DNA konštrukcii. Odpovede hostiteľov na každú z týchto zložiek môžu byť merané oddelene s pozorovaním zníženia titra hemaglutinínu (Hl) a neutralizačných protilátok proti zložkám HA a odpovede cytotoxických lymfocytov na epitopy Ml a NP. Výsledky sú porovnané s protilátkovou odpoveďou po injekcii, obsahujúcej konštrukcie, ktoré exprimujú len HA. Tieto štúdie umožňujú vyhodnotenie potenciálnej zvýšenej odpovede na vakcínu, obsahujúcu tak DNA kódujúcu HA, tak vnútornú proteíny chrípkových vírusov.

Účinnosť na ľudský organizmus bola vyskúšaná na dobrovoľníkoch, ktorí obdržali. DNA vakcínu proti chrípke, pó ktorej nasledovala intranazálna infekcia, aby sa prejavila účinnosť vakcíny proti podobným kmeňom vírusov a chrípkovým kmeňom rôznych subtypov. Zloženie, dávka a plikácie tejto vakcíny sú založené na už uvedených štúdiách. Klinická účin- 23 ι b ί nosť bola hodnotená podľa miery infekcie, počtu chorých i’ a priebehu choroby. Tieto klinické výsledky boli porovnané

I s laboratórnym vyhodnotením imunitnej odpovede a šírením } vírusu, aby mohli byť určené náhradné signálne znaky, ktoré korelujú s ochranou.

Štandardné techniky molekulárnej biológie na prípravu a purifikáciu DNA konštrukcií umožňujú prípravu DNA liečebných prípravkov, ktoré sú predmetom tohto vynálezu. Zatiaľ čo sú štandardné techniky molekulárnej biológie dostatočne vyhovujúce na prípravu výrobkov, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, poskytujú tu opisované špecifické konštrukcie nové liečebné prípravky, ktoré prekvapivo poskytujú ochranu proti , rôznym kmeňom vírusov, čo je výsledok, ktorý sa zatiaľ pomocou dosial patentovaných vakcín nepodarilo dosiahnuť.

s Množstvo exprimovanej DNA, ktoré má byť príjemcovi aplikované, bude závisieť na sile transkripčných a translač• ných promótoroch použitých v DNA konštrukcii a na imunogenicite exprimovaného génového produktu. Všeobecne povedané je . účinná dávka aplikovaná priamo do svalu od 1 gg do 1 mg, lepšie od 10 gg do 300 gg. Podkožné injekcie, vnútrokožné aplikácie zavedené cez pokožku a ďalšie spôsoby aplikácie i

j ako intraperitoneálne, intravenózne alebo inhalácie sú tak• - tiež možné. Taktiež sa predpokladá, že budú poskytované revakcinácie.

DNA môže byť holá, t.j. bez akýchkoľvek asociovaných proteínov, prísad alebo ďalších pomocných látok, ktoré pôsobia na imunitný systém príjemcu. V takomto prípade je žiadúce, aby DNA bola vo fyziologicky prijateľnom roztoku, ako je napríklad sterilný fyziologický roztok alebo fyziologický roztok tlmený fosfátom, avšak výpočet roztokov sa neobmedzuje len na tieto dva roztoky. DNA môže byť alternatívne asociovaná s lipozómami, ako sú lecitínové lipozómy alebo ďal; šie lipozómy známe medzi odborníkmi v danej oblasti techniky, a mať teda formu DNA-lipozomálnej zmesi (viď. napríklad V09324640) alebo môže byť DNA asociovaná s prísadami, ktoré sú odborníkom v danej oblasti techniky známe pre svoje schopnosti zosilniť imunitnú odpoveď, ako sú proteíny alebo iné nosiče. S výhodou môžu byť taktiež použité látky, ktoré prispievajú k príjmu DNA bunkami. Medzi inými to sú vápenaté ióny, vírusové proteíny alebo ďalšie látky sprostredkovávajúce transfekciu. Tieto látky sú všeobecne označované ako transfekciu sprostredkovávajúce látky a ako farmaceutický prijateľné nosiče. V tomto vynáleze označuje termín gén segment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje samostatný proteín. Termíny liečebný prípravok a vakcína sú vzájomne zameniteľné a označujú prípravky vhodné Termíny konštrukcia a plazmid Termín vektor je používaný na byť klonované gény použiteľné vynáleze.

na indukciu imunitnej odpovede, sú používané opäť zameniteľné, označenie DNA, do ktorej môžu podľa metód opísaných v tomto

Preto jedným z uskutočnení tohto vynálezu je metóda na použitie génov chrípkových vírusov na indukciu imunitných odpovedí in vivo u takých stavovcov, ako sú cicavci vrátačloveka. Táto metóda zahrňuje:

izoláciu génu, pripojenie génu k regulačným sekvenciám tak, že gén je funkčne pripojený ku kontrolnej sekvencii, ktorá, ak je zavedená do živého tkaniva, riadi iniciáciu a transláciu génu, zavedenie génu do živého tkaniva a voliteľne aj zvýšenie reakcie pridaním ďalšieho vého génu.

Výhodným j úca ochranu Táto ochrana množstva nukleovej kyseliny, top chrípkového vírusu, celý gén chrípkového vírusu sekvencie častí ne

a)

b)

c)

d) následnú chrípkoposkytukmeňom chrípkového vírusu, aplikáciou imunologický účinného ktorá kóduje konzervovaný epiTúto funkciu poskytuje napríklad pre nukleoproteín a predpokladá pre ďalšie gény chrípkových vírutakto kódujúce epitopy konzervované teda poskytujú ochranu proti rôznym kmeňom uskutočnením tohto vynálezu je metóda proti rôznorodým sa docieli sa, že kódujúce sov alebo ich v týchto génoch týchto vírusov.

V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu kóduje DNA vo vakcíne neukleoproteín ľudského chrípkového vírusu, hemagluti25

ί.ί í j

I

J nín, matricový protein, neštruktúrne proteíny alebo polymerázový génový produkt. Špecifické príklady uskutočnenia tohto vynálezu sú uvedené nižšie. V týchto uskutočneniach kóduje gén chrípkového vírusu nukleoproteín, bázickú polymerázu 1, neštruktúrny protein 1, hemaglutinín, matrix 1, bázickú polymerázu 2 izolátu ľudského chrípkového vírusu typu A/PR/8/34, nukleoproteín izolátu chrípkového vírusu typu A/Beijing/353/89, hemaglutinínový gén izolátu chrípkového vírusu A/Texas/36/91 alebo hemaglutinínový gén izolátu ľudského chrípkového vírusu B/Panama/46/90.

Špecifické uskutočnenia tohto vynálezu, t.j. DNA konštrukcie kódujúce gény chrípkových vírusov, ktorých DNA konštrukcie majú schopnosť expresie po zavedení do živočíšneho tkaniva in vivo a vyvolávajú imunitnú odpoveď proti exprimovaným produktom týchto génov chrípkových vírusov. Naviac kombinácie obsahujúce takéto konštrukcie s polynukleotidmi, kódujúcimi ďalšie antigény nepríbuzné s chrípkovými vírusmi sú v tomto vynáleze jasne opísané, príklady doporučovaných DNA konštrukcií kódujúcich chrípkové gény:

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h)

i)

j)

k)

l)

m) pnRSV-PR-NP,

Vl-PR-NP,

V1J-PR-NP, ktorého 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:12 : , V1J-PR-PB1, ktorého 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:13:, V1J-PR-NS, ktorého 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:14:, V1J-PR-HA, ktorého 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:15:,

V1J-PR-PB2, ktorého 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:16:,

V1J-PR-M1, ktorého 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:17:,

VIJneo-BJ-NP, ktorého 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:20: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:21:,

VIJneo-TX-NP, ktorého 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:24: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:25:,

VIJneo-PA-HA, ktorého 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:26:

a 3'koncová sekvencia je SEKV.ID:27:,

VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), veľkosť konštrukcie je

6,56 Kb, 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:46: a 3’koncová sekvencia konštrukcie je SEKV.ID:47:,

VlJns-TX-HA (A/Texas/36/91), veľkosť konštrukcie je

6,56 Kb , 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:48: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:49:,

n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je

6.61 Kb, 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:50: a 3'koncová sekvencia je SEKV.ID:51:,

o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), veľkosť konštrukcie je

6,42 Kb, 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:52: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:53:,

p) VlJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), veľkosť konštrukcie je

5.62 Kb, 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:54: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:55:,

q) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je 6,54 Kb, 5'koncová sekvencia je SEKV.ID:56: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:57:,

r) VIJns-PA-Ml (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je

5,61 Kb, 5’koncová sekvencia je SEKV.ID:58: a 3’koncová sekvencia je SEKV.ID:59:.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 Detekcia NP plazmidu DNA vo svale pomocou techník PCR. Myšiam boli aplikované trikrát (v troch týždňových intervaloch) injekcie obsahujúce RSV-NP DNA alebo prázdny vektor (100 pg/noha) do štvorhlavého svalu myší BALB/c a potom boli myši vystavené chrípkovej infekcii. Po štyroch týždňoch a po konečnej infekcii boli svaly vybraté a zmrazené v tekutom dusíku. Potom boli rozdrvené v lyzovacom pufri [25 mM Tris-H₃P0₄ pH 8, 2 mM trans-1:

2-kyselina diaminocyklohexán-tetra-octová (CDTA), 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% Triton X-100] v MIKRODISMEMBRATOrTM (Braun Instruments) a vysokomolekulárna DNA bola extrahovaná fenol-chloroformovou precipitáciou. Na detekciu NP plazmidu vo svale bola použitá 40 cyklová reakcia PCR (PCR reakcia bola používaná podľa návodu súpravy Perkin Elmer Cetus GENEAMpTM) pqr produkt s dĺžkou 772 párov báz (viď. šípka) vedúci od CMV promótora cez väčšinu 5’ časti vloženého NP génu bol vytvorený z negatívneho oligonukleotidu s 18 bázami s počiatkom v promótorovej oblasti, (GTGTGCACCTCAAGCTGG, SEKV.ID:1:) a z pozitívneho oligonukleotidového priméru s dĺžkou 23 báz umiestneného v 5’ časti vloženej NP sekvencie (CCCTTTGAGATGTTGCACATTC, SEKV.ID:2: ). Tento 772 bp dlhý produkt je viditeľný u vybraných vzoriek svalov injektovaných NP DNA a testovaných na agarózovom géli farbenom etidium-bromidom, ale nie je prítomný v prázdnom kontrolnom vektore (600L). Označenie každého prúžku udáva rozlišovacie číslo myši a pravú alebo ľavú končatinu.

Obr. 2 Tvorba NP protilátok u myší, ktorým boli aplikované injekcie NP DNA. Myšiam boli aplikované injekcie, obsahujúce 100 pg (VI-NP DNA do každej končatiny v čase 0, 3 a 6 týždňov. Krv bola odoberaná za 0, 2, 5a 8 týždňov. Prítomnosť anti-NP IgG protilátok v sére bola zisťovaná pomocou ELISA testov (J.J. Donnelly a kol., J. Immunol. 145, 3071 (1990)) za použitia NP purifikovaného z buniek hmyzu transfektovaných baculovírusovým expresívnym vektorom. Výsledky sú zakreslené ako stredná hodnota logtitra ELISA +/- SEM (n = 10) proti času po prvej injekcii NP DNA. Myši imunizované prázdnym vektorom nevytvárali žiadne zistiteľné NP protilátky.

Obr. 3 Percenta špecifickej lýzy, určené štvorhodinovým testom uvoľňovania ³⁴Cr z CTL získaných z myší imunizovaných DNA. Myši boli imunizované 400 pg VI-NP DNA (plné krúžky) alebo prázdnymi vektormi (plné štvorčeky) a po 3 až 4 týždňoch usmrtené. Negatívna kontrola pre CTL bola získaná z neimunizovaných myší (prázdne trojuholníky), ktoré sa zotavili z infekcie A/HK/68 prekonanej 4 týždne pred odberom (plné trojuholníky). Grafy uvádzajú údaje o reprezentačných vzorkách myší. Pre každú sériu podmienok bolo testovaných najmenej 8 myší. Graf A: Slezinové bunky opa28

I kované stimulované bunkami z rovnakého orgánu pulzovanými NP1247-155 a potom vyhodnotené proti bunkám P815 pulzovaným NP147-155. Graf B: Slezinové bunky opakovane stimulované bunkami z rovnakého orgánu pulzovanými NP147-155 a vyhodnotené proti P815 infikovaným chrípkovom vírusom A/Victoria/73 (H3N2) po dobu 6 hodín pred pridaním k CTL. Graf C: Slezinové bunky opakovane stimulované Con A a IL-2 bez ďalšieho antigénu a vyhodnocované proti bunkám P815 pulzovaným NP147-155. Panel D: Myšiam bolo aplikovaných 200 pg Vl-NP DNA alebo prázdny vektor v každej • injekcii trikrát v trojtýždňových intervaloch. Sleziny boli odobraté 4 týždne po poslednej imunizácii, slezinové bunky boli kultivované s IL-2 a Con A po dobu 7 dni. CTL boli vyhodnotené proti P815 cieľovým bunkám infikovaným A/Victoria/73.

Obr. 4 Strata hmotnosti (v gramoch) a uzdravenie u myší imunizovaných DNA po intranazálnej infekcii (bez anestetík) IO^TCID^q A/HK/68. Myši boli imunizované trikrát v trojtýždňových intervaloch Vl-NP DNA alebo prázdnym vektorom alebo im neboli aplikované žiadne • injekcie a boli vystavené infekcii 3 týždne po k

» . poslednom očkovaní. Hmotnosť 10 myší bola stanovená ‘ v dobe styku s infekciou a od 4. dňa každý deň u myší po injekcii NP DNA (plné krúžky), kontrolných myší po injekcii prázdneho vektora (prázdne trojuholníky) a kontrolných myší bez akejkoľvek injekcie (prázdne krúžky). Graf ukazuje stredné hodnoty hmotnosti +/- SEM. Myši, ktorým boli aplikované injekcie NP DNA, vykazovali podľa t-testov výrazne nižší úbytok váhy odo dňa 8 až do dňa 13 v porovnaní s myšami po injekciách prázdneho vektora (p<0,005) a myšami bez injekcií (p<0,01). Medzi kontrolami neboli pozo!

rované žiadne výrazné rozdiely (p =0,8 pomocou t-testu).

’ Obr. 5 Prežívanie myší imunizovaných DNA po intranazálnej : infekcii (pri anestézii) IO^’^TCID^q A/HK/68. Myši

I!

imunizované trikrát v trojtýždňových intervaloch VI-NP DNA (plné krúžky) alebo prázdnym vektorom (prázdne krúžky) a kontrolné myši bez injekcií (prázdne trojuholníky) boli vystavené injekcii tri týždne po poslednom očkovaní. Percento prežívajúcich je uvedené pre skupiny 9-tich alebo 10-tich myší. Počet prežívajúcich bol u myší po injekcii NP DNA značne vyšší než u kontrolných myší (p = 0,0004 podlá analýzy -X štvorcov).

Obr. 6 Sekvencia expresívneho vektora V1J, SEKV.ID:10:.

Obr. 7 Sekvencia expresívneho vektora VIJneo SEKV.ID:18:.

Obr. 8 Sekvencia CMVintA-BGH promótor-terminátorovej sekvencie, SEKV.ID:11:.

Obr. 9 Opičie protilátky anti-NP.

Obr. 10 Inhibícia hemaglutinínu fretiek. Bodkovaná čiara označuje minimálny titer obranných protilátok. Priemerná hodnota je označená preškrtnutým krúžkom.

Obr. 11 IgG protilátky proti NP u fretiek po imunizácii DNA.

Obr. 12 Šírenie vírusu po infekcii chrípkovým vírusom u fretiek po očkovaní a bez očkovania.

Obr. 13 Diagram vektorov pRSV-PR-NP a VI-NP. Písmeno X označuje vloženú kódujúcu oblasť.

Obr. 14 Diagram chrípkových proteínov a kmeňov. Obr. 15 Schéma spracovania očkovanej DNA v bunke.

Obr. 16 Rezistencia fretiek proti chrípke A/RP/8/34 vyvolaná očkovaním HA a génmi pre vnútorné proteíny.

Obr. 17 Schéma vektora VIJns.

Obr. 18 Africké opice boli očkované zmesou DNA pozostávajúcou z HA DNA (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texas/91), NP DNA (A/PR/34) a Ml DNA (A/PR/34) a Ml DNA (A/PR/34). Každá zložka bola obsiahnutá v množstve buď 10 gg (plné štvorčeky) alebo 100 gg (plné krúžky) aplikovaných dvakrát v šesťtýždňových intervaloch (viď. šípky). Na porovnanie boli ďalšie zvieratá očkované vakcínami so subviriónmi (prázdne štvorčeky) a viriónmi (prázdne krúžky) v plnej dávke určenej pre ľudský organizmus (45 gg ekvivalentných proteínov; 15 gg na HA). Vzorky séra boli odoberané každé dva týždne po dobu 18 týždňov a bol zisťovaný titer Hl proti A/Beijing/89 HA. Údaje sú udané ako stredné geometrické hodnoty Hl +/- SEM, kde n = 3.

Obr. 19 Samice myší BALB/c (4 až 6 týždňov) boli očkované A/PR/34 NP DNA (200 μβ) trikrát v trojtýždňových intervaloch. Skupiny myší pre negatívnu kontrolu zahrňovali myši očkované kontrolnou DNA (200 gg), rekombinantným NP proteínom (10 gg) a neimunizované myši bez očkovania. Na porovnanie boli testované taktiež myši infikované chrípkovým vírusom A/HK/68. CTL boli získané 6 mesiacov po dávke a boli opätovne stimulované in vitro slezinovými syngénnymi bunkami infikovanými vírusom. Potom boli testované proti bunkám P815 pulzovaným NP peptidom v pomere efektor:recipient 10:1. Uvedené čísla predstavujú % špecifickej lýzy +/- sd, kde n = 3.

Obr. 20 Myši C3H/HeN boli očkované normálnymi myoblastami ^2^12 í³· ^x buniek), rekombinantným NP proteínom (2 gg) alebo myoblastami transformovanými NP (1 x 10 buniek). Toto množstvo NP proteínu (2 gg) bolo dostatočné na vyvolanie tvorby protilátok a rovnalo sa približne stonásobnému množstvu NP proteínu prítomného v transplantovaných myoblastoch transfektovaných NP. CTL boli z týchto myší pripravené šesť týždňov po reakcii a opätovne stimulované in vitro syngénnymi slezinovými bunkami infikovanými chrípkovým vírusom. Ako pozitívna kontrola boli pripravené CTL z myší, ktoré boli infikované chrípkovým vírusom A/HK/68. Ako cieľové bunky boli použité myoblasty transfektované NP (bodkované stĺpce), neošetrené bunky (plné stĺpce) a myoblasty infikované chrípkovým vírusom A/Victoria/73 (prúžkované stĺpce) v pomere e.fektor : recipient 25:1. Údaje sú uvádzané v % špecifickej lýzy +/- sd, kde n = 3.

Obr. 21 Štvortýždňovým samiciam myší BALB/c bolo očkované do svalu 200 gg NP DNA trikrát v trojtýždňových inter valoch. Tri týždne po treťom očkovaní boli myši vystavené v anestézii celkovej infekcii dýchacieho traktu 300 TCID^q A/HK/68. Podiel prežívajúcich myší (10 myší/skupina) je vyznačený bodkovanou čiarou proti dĺžke doby od styku s infekciou.

Obr. 22 Štvortýždňové samice myši BALB/c boli očkované do svalu trikrát dávkou 100 gg NP DNA v trojtýždňových intervaloch. Po treťom očkovaní boli myši podrobené anestézii a aplikácii TCID^q A/HK/68 (napadnutie celkového dýchacieho traktu). Myši boli každý deň vážené a bol počítaný hmotnostný pomer k jej počiatočnej hmotnosti. Stredná hodnota percent z pôvodnej hmotnosti bola potom spočítaná pre každú prežívajúcu myš. Stredná hodnota percent počiatočnej hmotnosti je vyjadrená proti dĺžke doby od vystavenia infekcii +/- SEM.

Obr. 23 Štvortýždňové samice myší BALB/c boli očkované do svalu 200 gg NP DNA trikrát v trojtýždňových intervaloch. Tri týždne po treťom očkovaní boli myši vystavené 2000 TCID^q A/HK/68 aplikovaného bez anestézie (horné cesty dýchacie). Sedem dni po styku s infekciou boli myši utratené, boli im odobrané a homogenizované pľúca. Titer vírusu bol určený sériou titrácii na bunkách MDCK.

Obr. 24 Štvortýždňové samice myší BALB/c boli očkované do svalu dávkami 6,25, 25, 100 alebo 200 gg NP DNA trikrát v trojtýždňových intervaloch. Tri týždne po poslednom očkovaní boli myši vystavené 300 TCID^q A/HK/68 v anestézii (napadnutie celkového dýchacieho traktu) . Podiel prežívajúcich myši (1.0 myší na skupinu) je vyznačený proti dĺžke doby od vykonania infekcie.

Obr. 25 štvortýždňové samice myší BALB/c boli očkované do svalu trikrát v trojtýždňových intervaloch 200 gg A/PR/34 NP DNA, kontrolnou DNA alebo fingovanými injekciami. Myši boli vystavené v anestézii 300 TCID^q A/HK/68 v dobe 6, 12 a 25 týždňov po tretej

I injekcii DNA. Vybrané myši boli opätovne imunizované | 200 pg NP DNA v 22. týždni a potom v 25. týždni

I (Reboost). Stredné hodnoty hmotnosti sú uvedené ako percento počiatočnej celkovej hmotnosti každej skupiny. Uvedená kontrolná hmotnosť je strednou hodnotou hmotnosti všetkých kontrolných skupín od 6.,

12. a 25. týždňa po infekcii, t.j. celkového počtu 6 skupín, ktoré obdržali kontrolnú DNA alebo fiktívne injekcie. Skupiny zo začiatku obsahovali 10 zvierat . Hmotnosť uhynutých zvierat nebola do celkového rozboru zahrnutá.

Obr. 26 Dospelí samci fretiek (vek 22 až 28 týždňov) boli v nultom dni a 42. dni očkovaní do svalu 1 mg DNA kódujúcou NP z A/Beijing/89, 1 mg DNA kódujúcou Ml z A/Beijing/89 alebo 1 mg DNA kombinovanú z oboch typov. Kontrolné fretky dostali nekódujúcu DNA alebo . ’ plnú ľudskú dávku (15 pg/druh) patentovanej vakcíny i' z celých chrípkových vírusov (formulácie 92 až 93) obsahujúce A/Beijing/89. Očkovanie prebehlo v nultom dni a v 42. dni. V 56. dni boli fretky vystavené . · infekcii A/Georgia/93. Šírenie vírusu v nosných sek; rétoch bolo stanovené podľa výšky uvedených metód.

Toto šírenie bolo v dňoch 3 až 5 porovnané metódou dvojsmernej analýzy variancie so šírením nákazy u fretiek, ktorým bola podaná kontrolná DNA. Šírenie vírusov u fretiek, ktorým bola podaná NP DNA, Ml DNA alebo NP+M1 DNA bolo výrazne nižšie (p < 0,0001, . p < 0,0016 a p < 0,0001) než u kontrolných fretiek.

Šírenie vírusu u fretiek, ktorým bola podaná NP (čísla nie sú uvádzané), Ml alebo NP+M1 DNA nebolo nijako výrazne odlišné od šírenia u fretiek, ktorým bola podaná patentovaná vakcína (p=0,104, 0,533 a 0,145). Očkovacia dávka bola vybraná náhodne. Štúdie dávkovania boli vykonané na človeku nepríbuzných primátoch.

Obr. 27 Skupina 8 samcov fretiek vo veku 22 až 25 týždňov bola očkovaná do svalu kontrolnou DNA, fyziologickým !1 roztokom alebo DNA kódujúcou proteíny chrípky | A/PR/8/34 v nultom, 21. a 121. dni. V 148. deň boli t! títo samčí vystavení intranazálnej infekcii 200

TCID^q A/PR/8/34. Očkované zvieratá obdržali 1 mg NP DNA alebo 2 mg NP, NS1, PB1, PB2 a kombinovanej Ml DNA (400 gg každej konštrukcie). Kontrolné zvieratá dostali fyziologický roztok alebo 1 mg kontrolnej DNA v množstve 0,5 ml na jednu končatinu. Na účely ďalšej analýzy boli skupiny, ktoré obdržali fyziologický roztok a kontrolnú DNA, skombinované (Kontrola) rovnako ako skupiny, ktoré dostali samotnú NP DNA alebo v kombinácii s ďalšími génmi pre vnútorné . proteíny (Vnútorné). Graf ukazuje, že infekčnosť nosných sekrétov je vyjadrená titrom TCID^q na 50 ml v 3 ml objemu nazálnej tekutiny. Predpokladalo sa, že neriedená nosná tekutina (testované najmenšie riedenie) je v pomere 1:10 k pôvodnému nosnému výlučku, pozitívna neriedená vzorka bola vyhodnocovaná ako hodnota 1 log. Titre nad 1 log boli vyhodnotené podľa interpolácie Reed-Muench s tromi opakovaniami pri dosiahnutí konečnej infekčnosti 50 %. Vzorkám, ktoré boli negatívne v neriedenom stave, bola priradená hodnota 0 log. Hodnoty p uvedené v grafe sú počítané pre očkované fretky versus kontroly vo vyznačených dňoch pomocou T-testov. Hodnoty _; p pre celkovú krivku boli počítané dvojsmernou analýzou variancie s boli <0,0001 pre NP versus kontro* la a <0,001 pre kombinované DNA versus kontrola.

Obr. 28 Prežitie myší očkovaných DNA a potom vystavených chrípkovému vírusu. Myši boli očkované do svalu 200 gg DNA kódujúcou HA z A/PR/34 alebo kontrolnou (nekódujúcou) DNA trikrát v trojtýždňových intervaloch.

Tri týždne po poslednom očkovaní bolo myšiam v anestézii nakvapkané do celkového dýchacieho traktu 1000 TCID^q A/PR/34. Hodnoty sú uvádzané ako % prežívajúcich proti dĺžke času po zavedení infekcie (n = 9 alebo 10 myší na skupinu).

Obr. 29 Úbytok hmotnosti myší očkovaných DNA a potom vystavených infekcii chrípkovým vané 200 gg DNA kódujúcou trolnou (nekódujúcou) DNA, intervaloch. Tri týždne po vírusom. Myši boli očkoHA z A/PR/34 alebo kontrikrát v trojtýždňových poslednom očkovaní bolo myšiam v anestézii nakvapkané do celkového dýchacieho traktu 1000 TCID^q A/PR/34. Hodnoty sú vyjadrené ako % pôvodnej hmotnosti u každého jednotlivého zvieraťa, urobené priemery pre každú skupinu s vynesené proti času. (Uhynuté zvieratá boli vybraté zo stredných hodnôt).

Obr. 30 Prežívanie myší očkovaných DNA a potom vystavených infekcii chrípkovým vírusom. Myši boli očkované do svalu 1, 10 alebo 100 gg DNA kódujúcou HA z A/PR/34 alebo kontrolnou (nekódujúcou) DNA, trikrát v trojtýždňových intervaloch. Tri týždne po poslednom očkovaní bolo myšiam v anestézii nakvapkané do celkového dýchacieho traktu 1000 TCID^q A/PR/34. Hodnoty sú vyjadrené ako % prežívajúcich proti času po infekcii (n = 9 alebo 10 na skupinu).

Obr. 31 Skupiny 8 samčích fretiek vo veku 22 až 25 týždňov boli v dňoch 0, 21 a 121 očkované do svalu kontrolnou DNA, fyziologickým roztokom alebo DNA kódujúcou proteíny chrípky A/PR/34. 148. deň bolo fretkám aplikované do nosného traktu 200 TCID^q A/PR/34. Očkované zvieratá dostali 1 mg HA DNA alebo 2 mg HA, NP, NS1, PB1, PB2 a Ml DNA kombinovaných v množstvách 330 gg z každej konštrukcie. Kontrolné fretky dostali 0,5 ml/nohu fyziologického roztoku alebo kontrolnej DNA. Na účely analýzy boli skombinované skupiny, ktoré dostali fyziologický roztok alebo kontrolnú DNA (Kontrola), a skupiny, ktoré dostali samotnú HA DNA alebo v kombinácii s génmi pre ostatné vnútorné proteíny (HA, HA+vnútorné). Graf ukazuje titer infekčnosti nosnej tekutiny v TCID^q na 50 gl v 3 ml objemu nosnej tekutiny (po výplachu). Neriedená nosná tekutina (testované najnižšie riedenie)

- 35 bola braná ako riedenie pôvodného nosného výlučku 1: 10 a pozitívnej neriedenej vzorke bola priradená hodnota 1 log. Titre nad 1 log boli priradené podľa interpolácie Reed-Muench medzi tromi opakovaniami na získanie konečnej 50% infekčnosti. Negatívnym vzorkám, testovaným v neriedenom stave bola priradená hodnota 0 log. Hodnoty p pre celé krivky boli počítané dvoj smernou analýzou variancie a boli pre HA versus kontrola <0,0001, pre kombinovanú DNA versus kontrola <0,0001.

Obr. 32 Dospelí samci fretiek vo veku 22 až 28 týždňov boli očkovaní do svalu 1 mg DNA kódujúcou HA z A/Georgia/93 v dňoch 0 a 42. Kontrolné fretky dostali nekódujúcu DNA alebo plnú ľudskú dávku (15 gg/kmeň) patentovanej vakcíny s celými chrípkovými vírusmi (formulácie 92 až 93) obsahujúce

A/Beijing/89 taktiež v dňoch 0 a 42. Fretky boli 56. deň vystavené pôsobeniu A/Georgia/93. Výskyt vírusu v nosnom výplachu bol určený metódami uvedenými vyššie. Koncentrácia vírusu v dňoch 1 až 6 bola porovnaná so stavom vírusu u fretiek, ktorým bola podaná kontrolná DNA, metódou dvojsmernej analýzy

variancie. Výskyt u fretiek, ktoré	dostali HA DNA,
bol výrazne	nižší	(p<0,0001)	než	u kontrolných
fretiek.
Obr. 33 Dospelí samci	fretiek	vo veku 22	až	28 týždňov boli
očkovaní do	svalu	1 mg	DNA	kódujúcou HA
z A/Hawaii/91	alebo	A/Beij ing/89	(neuvádzané údaje)

v. dňoch 0 a 42. Kontrolné fretky dostali nekódujúcu DNA alebo plnú ľudskú dávku (15 gg/kmeň) patentovanej vakcíny s celými chrípkovými vírusmi (formulácie 92 až 93) obsahujúce A/Beijing/89 taktiež v dňoch 0 a 42. Fretky boli 56. deň vystavené pôsobeniu A/Georgia/93. Výskyt vírusu v nosnom výplachu bol určený metódami uvedenými vyššie. Koncentrácia vírusu v dňoch 1 až 6 bola porovnaná so stavom vírusu u fretiek, ktorým bola podaná kontrolná DNA, metódou

dvojsmernej analýzy variancie. Výskyt u fretiek, ktoré dostali HA DNA z A/Hawaii/91, bol výrazne nižší (p<0,0001) než u kontrolných fretiek. Výskyt u fretiek, ktoré dostali HA DNA z A/Hawaii/91 bol výrazne nižší než u fretiek, ktoré dostali patentované výrobky (p=0,021 pre A/Hawaii/91 HA DNA, dvojsmerná ANOVA pre dni 1 až 6). Výskyt u fretiek, ktoré dostali A/Beijing/89 HA DNA (neuvádzané údaje) neboli nijako výrazne odlišné od hodnôt, získaných u fretiek, ktorým bol aplikovaný patentovaný výrobok (p=0,058, dvojsmerná ANOVA pre dni 1 až 6).

Obr. 34 Dospeli samci fretiek vo veku 22 až 28 týždňov boli očkovaní do svalu 1 mg DNA kódujúcou HA z A/Hawaii/91 (viď. obr. 13) alebo 330 pg každej DNA kódujúcou HA z A/Hawaii/91 a NP a Ml z A/Beijing/89. Očkovanie prebehlo v dňoch 0 a 42. Kontrolné fretky dostali nekódujúcu DNA alebo plnú ľudskú dávku (15 pg/druh) patentovanej vakcíny obsahujúcej celé chrípkové vírusy (formulácie 92 až 93).

Obr. 35 Dospeli samci fretiek vo veku 22 až 28 týždňov boli

očkovaní do	svalu	1
z A/Georgia/93	alebo	Ρθ
z A/Hawaii/91,	NP a	Ml

mg DNA kódujúcou HA

330 pg DNA kódujúcou HA z A/Beijing/89 v dňoch 0 a 42. Kontrolné fretky dostali v deň 0 a 42 nekódujúcu DNA alebo plnú ľudskú dávku (15 pg/druh) patentovanej vakcíny z celých vírusov (formulácie 92 až 93) obsahujúce A/Beijing/89. 56. deň boli fretky vystavené infekcii A/Georgia/93. Výskyt vírusu v nosnom výplachu bol stanovený vyššie uvedenými metódami. Výskyt v dňoch 1 až 6 bol porovnaný s výskytom vírusu u fretiek, ktorým bola podaná kontrolná

DNA, metódou dvojsmernej analýzy variancie. Výskyt u fretiek očkovaných HA+NP+M1 DNA sa príliš nelíšil od hodnôt zistených u fretiek očkovaných homológnou HA DNA (p=0,064).

Obr. 36 Sekvencia VÍR.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Uvádzame nasledujúce príklady na ďalšie upresnenie tohto vynálezu, pričom tento vynález neobmedzujeme na špecifické uskutočnenia uvedené v týchto príkladoch.

Príklad 1

Príprava DNA konštrukcií kódujúcich proteíný ľudských chrípkových vírusov

i) pnRSV-PRNP: Izoláty génu A/PR/8/34 boli získané ' z pAPR-501 [J. F. Young a kol., The Origin of Pandemic

Influenza Viruses, V. G. Laver, Ed. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1983)] ako fragment EcoRI dlhý 1565 párov báz, vyplnený Klenowom a klonovaný do miesta Xbal ; v pRSV-BL, ktoré bolo doplnené Klenowom a ošetrené fosfatái zou. pRSV-BL bol konštruovaný najskôr štiepením vektora | pBL-CAT3 [B. Luckow a C. Schutz, Nuc. Acid. Res. 15, 5490 (1987)] Xhol a Ncol za účelom odstránenia CAT kódujúcej sek; ·· vencie a ďalej ošetrené Klenowom a ligáciou. RSV promótorový ; fragment bol izolovaný ako fragment Ndel a Asp718 z pRšhgrnx [V. Giguere a kol., Náture 330, 624 (1987)], doplnený Klenowom a klonovaný do miesta HindlII intermediátorového vektora uvedeného vyššie (pBL-CAT) bez CAT sekvencie).

ii) Vl-NP: Expresívny vektor VI bol skonštruovaný z pCMVIE-AKI-DHFR [Y. Vhang a kol., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Gény AKI a DHFR boli odstránené štiepením vektora pomocou EcoRI a spätnou ligáciou. Tento vektor neobsahuje intrón A v promótore CMV, takže tam bol tento intrón pridaný ako PCR fragment, ktorý mal deletované vnútorné miesto Sací [v pozícii 1855 podľa číslovania v publikácii B. S. Chapman a kol., Nuc. Acid. Res. 19, 3979 (1991)]. Templátom pre PCR reakciu bol pCMVintA-Lux vytvorený ligáciou fragmentov HindlII a NheI z pCMV6al20 [viď. B. S. Chapman a kol., tiež tam], ktorý obsahuje hCMV-IEl enhancer/promótor a intrón

S A a ich ligáciu do miest HindlII a Xbal v pBL3, čim vznikol pCMVIntBL. Fragment luciferázového génu s dĺžkou 1881 pb (HindlII - Smal doplnenej Klenowom) z RSV-Lux [J. R. de Vet • a kol., Mol. Celí Biol. 7, 725, (1987)] bol klonovaný do • miesta Sali v pCMVIntBL, ktoré bolo doplnené Klenowom t a ošetrené fosfatázou.

Priméry na preklenutie intrónu:

5’primér, SEKV.ID.-5:

5’CTATATAAGCAGA CTAGTTTAG-3’.

3’primér, SEKV.ID:6:

’ 5 ’ -GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGA CTGCAG-3 ’ .

Priméry použité na odstránenie Sací miesta:

negatívny primér, SEKV.ID:7:

5’-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3’ a pozitívny primér, SEKV.ID:8:

5’-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3’.

š PCR fragment bol štiepený Sací a BglII a vložený do vektora, ktorý bol naštiepený rovnakými enzýmami. NP gén z chrípky A (A/PR/8/34) bol vyštiepený z pAPR501 [J. F.

; Young a kol., The Origin of Pandemic Influenza Viruses, ’ΐ · V. G. Laver, ed. (Elsevier Science Publishing Co. , Inc. , j 1983)] ako fragment EcoRI s 1565 pb, jeho konce boli zarovt nané. Vložením do VI v mieste BglII so zarovnanými koncami vznikol VI-NP. Plazmid bol rozmnožený v E. coli a purifikovaný metódou alkalickej lýzy [J. Sambrook, E. F. Tritsch a T. Maniatis, Molecular Clloning, A Laboratory Manual, druhé vydanie (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. DNA .. rozdelená CsCl bola precipitovaná etanolom a resuspendovaná v 0,9%-nom fyziologickom roztoku do injekcie 2 mg/ml.

Príklad 2 ’ Test na cytotoxické T-lymfocyty proti ľudskému chrípkovému vírusu.

.i ‘i t

’jl Cytotoxické T-lymfocyty boli získané z myší, ktoré boli i imunizované DNA, alebo ktoré sa zotavili z nákazy A/HK/68.

IF v ϊ

Kontrolné kultúry bolí odobrané z myší, ktoré boli očkované kontrolnou DNA a z myší bez očkovania. Boli pripravené suspenzie jednotlivých buniek, červené krvinky boli odstránené lýzou chloridom amónnym a slezinové bunky boli pestované v RPMI 1640 s prídavkom 10% hovädzieho fetálneho séra (FBS), penicilínom v množstve 1000 U/ml, streptomycínom v množstve 100 gg/ml, 0,01 M HEPES (pH 7,5) a 2 mM 1-glutamínom. K rovnakým množstvám totožných ožiarených stimulujúcich buniek, ktoré boli pulzované po dobu 60 minút epitopom NP147-155 prístupným v mieste H-2K*^ (Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val, SEKV.ID:9:) v koncentrácii 10 μΜ alebo infikovanými chrípkou A(PR/8/34 (H1N1), bolo pridaných 10 U/ml rekombinantného ľudského IL-2 (Cellular Products, Buffalo, NY) a kultúry boli pestované po dobu 7 dní pri teplote 37 °C v atmosfére 5% CO2 a v 100% relatívnej vlhkosti. Vo vybraných experimentoch boli na miesto autológnych stimulátorových buniek pridané rhIL-2 (20 U/ml) a Con A (2 gg/ml). Efektorová aktivita cytotoxických T-buniek bola určená bunkami P815 značenými 3 h izotopom ^^Cr v intenzite 60 gCi na 10^ buniek a pulzovaním NP147-155 podľa vyššie uvedeného postupu alebo infekciou chrípkou A/Victoria/73 (H3N2). Kontrolné bunky (označené bunky P815 bez peptidu alebo vírusu) neboli lyzované. Recipientné bunky boli umiestnené do misiek s 96 oddeleniami v množstve 1 x 10⁴ na kruhovú komôrku a inkubované s efektormi po dobu 4 hodiny v troch uskutočneniach. Supernatant (30 μΐ) bol odobratý z každej komôrky a spočítaný na scintilačnom odčítači Bateplate (LKB-Vallac, Turku, Finland). Pre každú konečnú prípravu boli určené maximálne impulzy uvoľnené pridaním 6 M HC1 a spontánne impulzy uvoľnené bez CTL. Percenta špecifickej lýzy boli počítané následovne:

[(experimentálne-spontánne)/(maximálne-spontánne)] x 100

Príklad 3

Príprava NP-špecifických cytotoxických T-lymfocytov in vivo:

Myši BALB/c boli očkované do štvorhlavého svalu na oboch končatinách plazmidom cDNA kódujúcim A/PR/8/34 nukleoproteín odvodený od promótora buď z Rous sarcoma vírusu alebo cytomegalovírusu.

Boli použité tieto expresívne vektory:

1) pnRSV-PRNP, viď. príklad 1, ii) Vl-NP, viď príklad 1.

Použitými laboratórnymi zvieratami boli myši BALB/c získané z laboratória Charles River Laboratories, Raleigh, NC. Myši boli získané vo veku 4 až 5 týždňov a boli prvýkrát očkované DNA vo veku 5 až 6 týždňov. Pokiaľ nie je uvedené inak, bola DNA vždy aplikovaná do štvorhlavého svalu oboch končatín, pričom každá končatina obdržala 50 μΐ sterilného fyziologického roztoku obsahujúceho 100 pg DNA. Myši dostali 1, 2 alebo 3 sady očkovania v trojtýždňových intervaloch. Negatívne zvieracie kontroly neboli buď vôbec očkované alebo boli očkované vhodným prázdnym vektorom, do ktorého nebol vložený gén NP.

Prítomnosť alebo absencia NP plazmidu DNA vo svaloch vybratých zvierat bola zisťovaná metódami PCR (obr. 1). Plazmidovéi DNA (buď NP alebo luciferázy) bola nájdená u 44 zo 48 očkovaných svalov. U myší, očkovaných DNA pre luciferázu bola určená expresia proteínu aktivitou luciferázy v extraktoch zo svalov získaných podľa metód odborníkom v danej oblasti techniky dostatočne známych [J. A. Volff a kol., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi a kol., Náture 352, 815 (1991); H. Lin a kol., Circulation 82, 2217 (1990); R. N. Kitsis a kol., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen a kol., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao a kol., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J. A. Volff a kol., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)].

Expresia NP vo svaloch po injekcii NP DNA bola pod hladinou detekovatelnosti analýzou Vestern blot (< 1 ng), ale bola zistená tvorbou NP-špecifických protilátok (viď. obr.

2) . Na analýzu tvorby NP-špecifických cytotoxických

T-lýmfocytov boli 1 až 4 týždne po imunizácií odobraté pokusným zvieratám sleziny a slezinové bunky boli restimulované autológnymi slezinovými bunkami, ktoré boli buď indikované chrípkou A (A/PR/8/34) alebo pulzované peptidovým epitopom H-2K^^_ (NP zvyšok 147 až 155, viď. 0. K. Rotzscke a kol., Náture 348, 252 (1990)), plus rekombinantným ľudským IL-2. Slezinové bunky, ktoré boli restimulované syngénnymi bunkami infikovanými vírusom alebo pulzovanými epitopom, boli schopné zabíjať recipientné bunky pulzované nukleoproteínovým epitopom (obr. 3A). To naznačuje, že vnútrosvalové injekcie NP DNA vytvorili peptid odvodený od NP v asociácii s MHC proteínmi Γ. triedy vhodný na indukciu odpovede špecifických cytotoxických T-lýmfocytov. Tieto CTL boli schopné rozpoznať a lyžovať cieľové bunky nakazené vírusom, (obr. 3B) alebo bunky pulzované peptidovým epitopom nukleoproteínu H-2K*^^- a vírusom infikované bunky. To dokazuje ich špecifickosť a ich schopnosť rozpoznať epitop vytvorený prirodzenou cestou v infikovaných bunkách.

Oveľa prísnejším meraním imunogenicity NP DNA vakcíny bolo hodnotenie odpovedí primárnych CTL. Slezinové bunky odobrané myšiam očkovaným NP DNA boli aktivované stykom s Con A a IL-2, ale neprekonali pred testom na ich schopnosť zabíjať patričné cieľové bunky restimuláciu in vitro bunkami exprimujúcimi antigén. Slezinové bunky myší, očkovaných NP DNA boli po in vitro aktivácii pomocou ConA a IL-2 bez restimulácie na špecifický antigén schopný lyžovať tak cieľové bunky pulzované epitopom, ako aj bunky infikované vírusom (obr. 3C a D). Táto lytická aktivita restimulovaných a aktivovaných slezinových buniek je porovnateľná s podobným spôsobom spracovanými slezinovými bunkami myší, ktoré boli vopred infikované chrípkou A/HK/68 a virulentným kmeňom H3N2 prispôsobeným pre myši, ktorý sa objavil 34 rokov po A/PR/8/34 (H1N1). Takže očkovanie NP DNA vyvolalo tvorbu cytotoxických T-lýmfocytov, ktoré boli špecifické pre epitop nukleoproteínu a ktoré boli schopné rozpoznať prirodzenou cestou spracovaný antigén (t.j. mohli zabíjať bunky infikované vírusom). NP CTL boli taktiež vytvorené v transgénnych myšiach C3H a B6 exprimujúcich ľudský HLA-A2.

NP CTL boli zistené v slezinách myší BALB/c očkovaných takými malými dávkami ako je 1 dávka 1 pg NP DNA (najmenšia testovaná dávka) (tabuľka 3-IV).

Tabuľka 3-IV

Odpovede cytotoxických T-lymfocytov u myši po jedinej injekcii NP DNA.

inokulum	dávka(pg)	% Špecifickej lýzy	sd
NP DNA	400	52,5	10,7
	400	80,4	10,3
NP DNA	200	75,6	5,4
	200	44,6	4,4
NP DNA	100	76,7	2,9
	100	35,6	8,9
NP DNA	50	62,9	0,6
	50	76,7	7,4
NP DNA	10	83,2	10,1
	10	37,7	2,5
NP DNA	1	44,2	0,3
	1	13	2
Kontrolná DNA	100	4,9	1
Chrípka		79,3	8,3

Tabuľka 3-IV: Samice myší BALB/c (4 až 6 týždňov) boli očkované jedinou dávkou A/PR/34 NP DNA (V1JNP) alebo kontrolnou DNA (V1JNP) v dávkach vyznačených v tabuľke. Na porovnanie boli myši infikované chrípkovým vírusom A/PR/34. Po ôsmich týždňoch boli získané CTL, restimulované in vitro syngénnymi slezinovými bunkami pulzovanými NP peptidom a testované proti bunkám P815 pulzovanými NP peptidom v pomere efektor:cieľová bunka 50:1. Výsledky sú uvedené ako špecifická lýza pre jednotlivých zástupcov myší.

Nasledujúce experimenty ukázali, že myší, ktoré obdržali jedinú dávku 1 pg NP DNA, si udržovali NP CTL počas najmenej 4,5 mesiaca (najdlhšie testované obdobie). Sila odpovede CTL po injekcii DNA bola porovnateľná s odpoveďou u myší infikovaných chrípkou. Je však potrebné upozorniť, že analýza CTL po antigénnej restimulácii in vitro nie je celkom kvantitatívna. Preto v súčasnej dobe vyvíjame testy s obmedzenými riedeniami, aby sme mohli presnejšie určiť hladiny NP-špecifických CTL u myší. Myši, ktoré boli očkované 3 dávkami NP DNA po 100 pg, vykazovali prítomnosť odpovedi CTL ešte najmenej 6 mesiacov po očkovaní (obr. 19). Chrípková PNV má teda schopnosť vyvolať dlhodobé odpovede

CTL namierené proti konzervovaným antigénom chrípkových vírusov.

Očkovanie protilátok IgG myší NP DNA viedlo k vzniku veľkého titra anti-NP (obr. 2). Tvorba vysokého titra IgG protilátok u myší teda vyžaduje CD4+T pomocné bunky (P.

Vieira a K. Rajewsky, Int. Immunol. 2, 487 (1990)). To dokazuje, že NP exprimovaný z plazmidu in situ bol spracovaný oboma triedami MHC, t.j. trieda I a II.

Príklad 4

Obrana myší pri nákaze virulentným vírusom ľudskej chrípky:

Úloha NP protilátok v obrannej imunite pri chrípke je demonštrovaná na dvoch prístupoch: po prvé, titer vírusu v pľúcach bol určený v experimentoch pasívneho prenosu. Samice myší BALB/c vo veku lo týždňov alebo mladšie boli očkované intraperitoneálne 0,5 ml séra (riedeného v 2,0 ml PBS) odobratého od myší, ktoré boli trikrát očkované 200 gg NP DNA. Kontrolné myši boli očkované rovnakým množstvom (tiež riedeným v 2,0 ml PBS) zobratého normálneho myšieho séra alebo sérom odobraným od myší, ktoré prekonali infekciu A/HK/68. Dávka imunného séra proti A/HK/68 bola upravená tak, aby bol titer anti-NP protilátok v ELISA teste rovnaký s titrom u séra myší očkovaných NP DNA. Myši boli infikované . - 44 í i bez anestézie 10⁴ TCID^q z A/HK/68 2 hodiny po injekcii séra

Ia ďalšie injekcie rovnakého množstva séra im boli aplikované o 3 dni neskoršie. Myši boli utratené 6 a 7 dní po infekcii ! a bol zmeraný pľúcny titer vírusu v TCID^q na ml metódou opísanou vyššie [J. Immunol. 146, 321, 1991].

Myšiam, ktoré ešte neprišli do styku s infekciou, bolo infúziou aplikované anti-NP sérum a potom boli vystavené infekcii A/HK/68. Pre vírusovú infekciu bol vybratý kmeň A/HK/68 upravený pre myši a následne udržovaný pasážovanim v myšiach in vivo (Dr. I. Mbawuike, osobný rozhovor). Použitý zdroj nákazy bol homogenát pľúc infikovaných myší majúci titer infekčnosti 5 x 10® TCID^g/ml na bunkách MDCK. Na ^: určenie pľúcneho titra vírusu a štúdie úbytku telesnej hmotnosti bola nákaza vykonávaná na slepo intranazálnym zavede* ním 20 μΐ obsahujúcich 10⁴ TCID^q do nozdier neuspaných myší, čo vedie k progresívnej infekcii pľúc vírusom, ale nie í. ' je pre myší BALB/c smrteľná [Yetter, R. A. a kol. , Infect.

Immunity 29, 654, 1980]. V experimentoch s počtami prežíva| júcich myší boli myši vystavené infekcii 20 μΐ obsahujúcimi ) 10 ’ TCID^q zavedenými do nozdier myší pri totálnej aneste; - zii ketamínom a xylazínom. Nákaza uspaných myší touto dávkou í spôsobuje rýchlu infekciu pľúc s úmrtnosťou 90 až 100 % ‘ ‘ u neimunizovaných myší [J. L. Schulman a E. D. Kilnourne, J.

Exp. Med. 118, 257, 1963; G. H. Scott a R. J. Sydiskis,

Infect. Immunity 29, 654, 1980)]. Titer vírusu v pľúcach bol určený sériou titrácií na bunkách MDCK získaných z ATCC, Rockville, MD) v 96-komôrkových doštičkách podľa metódy opí, sanej Moranom a kol., (tiež tam).

U myší, ktoré obdržali anti-NP antisérum (6,3 +/-0,2; stredná hodnota +/- SEM; n = 4), nebolo zistené žiadne zníženie titra v pľúcach v porovnaní s kontrolnými myšami, ktoré obdržali normálne sérum (6,1 +/- 0,3; stredná hodnota

J +/- SEM; n =4). Ako pozitívna kontrola bolo myšiam, ktoré boli infikované A/HK/68, odobraté sérum a pasívne prenesené do myší, ktoré ešte neprišli do styku s infekciou. Po infekcii A/HK/68 nebola v ich pľúcach nájdená žiadna vírusová infekcia, čo naznačuje, že toto sérum proti celým vírusom

poskytovalo kompletnú ochranu vírusmi. V druhom prístupe boli proti infekcii homológnymi myši, ktoré ešte neprišli do styku s infekciou, očkované purifikovaným NP (5 gg/sval, 3 krát v priebehu 6 týždňov) aplikovaným vnútrosvalovou injekciou. Tieto myši vykazovali vysoký titer NP-špecifických protilátok, avšak nevytvorili NP-špecifické CTL a neboli chránené proti smrteľným dávkam vírusov. Kolujúce IgG anti-NP protilátky, na rozdiel od neutralizačného účinku protilátok na celý vírus, neposkytujú myšiam obrannú imunitu.

Obranná účinnosť očkovania NP DNA in vivo bola vyhodnotená preto, aby ukázala, či imunitná odpoveď sprostredkovaná bunkami mala nejakú funkčnú významnosť. Jedným priamym meraním účinnosti imunitnej odpovede bola schopnosť myší prvýkrát imunizovaných NP DNA vyčistiť sa od progresívnej subletálnej infekcie pľúc heterológnym kmeňom chrípky (A/HK/68; H3N2). Vírusové infekcie boli vykonávané postupom uvedeným vyššie. Myši očkované NP DNA mali 7. deň po nákaze titer vírusu v pľúcach (1,0 +/-1,0; stredná hodnota .+/- SEM; n = 4) alebo u myší, ktoré boli očkované prázdnym vektorom (4,5 +/- 0,0; stredná hodnota +/- SEM; n = 4). V skutočnosti mali tri zo štyroch očkovaných myší nezistiteľný titer vírusu v pľúcach, zatiaľ čo žiadna z kontrolných myší sa v tejto dobe vírusu nezbavila. Výrazný rozdiel v titre vírusu v pľúcach pozorovaný v tomto experimente a šiestich ďalších ukazuje, že imunitná odpoveď urýchľuje odstránenie vírusu z organizmu. Nedostatočný obranný účinok kontroly s prázdnym vektorom potvrdzuje, že DNA sama osebe nebola za imunitnú odpoveď zodpovedaná. Naviac, pretože napádajúci kmeň vírusu A/HK/68 (virulentný H3N2 kmeň prispôsobený pre myši) bol heterológny ku kmeňu A/PR/8/34 (H1N1), z ktorého bol NP gén klonovaný, bola imunita jasna heterotypová.

Ako meradlo úmrtnosti spôsobené vírusom bol sledovaný úbytok hmotnosti chrípkou A/HK/68 myši (alebo myši u myší, ktoré boli subletálne nakazené po očkovaní NP DNA (obr. 4). Neočkované očkované prázdnym vektorom) boli použité ako kontrola. Myši imunizované NP DNA vykazovali v porovnaní í

í i;

Is kontrolnými myšami menši úbytok telesnej hmotnosti a rýchlejšie sa po infekcii vracali k svojej pôvodnej hmotnosti pred očkovaním.

/ Intranazálna infekcia myší pri totálnej anestézii spôsobí rýchle rozšírenie replikujúcich sa vírusov v pľúcach a smrť za 6 až 8 dní, pokiaľ nie je táto infekcia pod kontrolou (R. A. Yetter a kol., Infect. Immunity 29, 654 (1980)). Prežívanie myší vystavených tejto metóde odráža ich schopnosť obmedzovať nebezpečnosť akútnej infekcie pľúc. Bola študovaná schopnosť myší prežiť infekciu dvoma rôznymi ; kmeňmi chrípky, A/HK/68 (viď. obr. 5) a A/PR/8/34. Myši vopred očkované NP DNA vykazovali 90 % prežívajúcich jedincov ^; v porovnaní s 0 % prežívajúcich myší očkovaných prázdnym vektorom a 20 % u neočkovaných myší (obr. 5). V celkovom ‘ počte 14 týchto štúdií vykazovali myši očkované NP DNA prinajmenšom o 50 % vyšší počet prežívajúcich zvierat než kon; ’ trolné skupiny. Takže imunitná odpoveď vyvolaná NP DNA účin| ne urýchľuje uzdravenie a zmierňuje ochorenie spôsobené b

' vírusom iného kmeňa vzniknutého až o 34 rokov neskoršie, i

‘ podporuje princíp zamerania na konzervované proteíny za účeI . lom tvorby odpovede cytotoxických T-lymfocytov.

Príklad 5

Izolácia génov z izolátov chrípkových vírusov

V ATCC je uložených mnoho starších kmeňov chrípkových vírusov (Katalóg živočíšnych vírusov a ntisér 1990, Chlamydiae & Rickettsiae, 6. vyd., uvádza 20 chrípok kmeňa A a 14 chrípok kmeňa B).

A. Kmene vírusov a purifikácia

Chrípkové kmene, ktoré zahrňujú súčasnú vakcínu chrípkovej sezóny 1992, boli získané od Dr. Nancy J. Cox ; z Division of Viral and Reckettsial Diseases, Center of

Disease Control, Atlanta, GA. Sú to tieto kmene: (1)

- 47 i j A/Beijing/353/89 (H3N2); (2) A/Texas/36/91 (H1N1); (3)

B/Panama/45/90 a (4) A/Georgia/03/93.

Všetky tieto vírusy boli pestované pasážovaním v 9 až

I 11 týždňových kuracích zárodkoch (okrem A/Georgia, ktorý bol pestovaný v bunkách MDCK) v množstve 100 až 200 na vírusový prípravok a čistené upravenou metódou opisovanou Massicotom a kol., (Virology 101, 242 až 249 (1980)). Stručne povedané, suspenzie vírusov boli purifikované centrifugáciou pri 8000 οΐ/min (centrifúga Sorwall RC5C, rotor GS-3), a potom peletované centrifugáciou pri 18 000 ot/min po dobu 2 hodín i v centrifúge Beckman rotor 19. Peletovaný vírus bol resuspendovaný v STE (0,1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA) * a centrifugovaný pri 4 000 οΐ/min (centrifúga Hermle Z 360), aby sa odstránili agregáty. 2 ml supernatantu boli navrstve⁴ né na nespojitý sacharózový gradient obsahujúci 2 ml ' 60%-nej sacharózy prevrstvenej 7 ml 30%-nej saicharózou tlmeŕ ’ nou STE a centrifugované pri 36 000 οΐ/min (rotor SV-40,

L ) centrifúga Beckman) po dobu 90 minút. Viazaný vírus sa í nazhromaždil na medzifáze, bol rozpustený v desaťnásobku STE , a peletovaný pri 30 000 οΐ/min po dobu 2 hodiny (Beckman,

- rotor Ti45). Vyzrážaný vírus bol potom zmrazený pri -70 ’C.

• j i

í * B. Extrakcia vírusovej RNA a syntéza cDNA

Vírusová RNA bola purifikovaná zo zmrazeného vírusu pomocou guanidíntiokyanátovej extrakcie za použitia komerčne dodávaného setu (Strategene, La Jolla, CA) používajúci metódu Chomczynského a Sacchi (Anál. Biochem. 162, 156 až 159 (1987)). Dvoj vláknová cDNA bola pripravená z vírusovej RNA za použitia komerčne dodávanej súpravy cDNA synthesis kit . (Pharmacia) podľa návodu dodávateľa s niekoľkými úpravami.

Prvý reťazec cDNA bol pripravený za použitia syntetického

:.j oligodeoxyribonukleotidu, 5 ’ -AGCAAAAGCAGG-3 ’ , SEKV.ID:30:,

- ktorý je komplementárny ku konzervovanej sekvencii umiestne! nej na 3’-konci vírusovej RNA génov kmeňa A. Táto sekvencia je bežná u všetkých RNA chrípkových vírusov typu A a teda poskytuje metódu na klonovanie génov akéhokoľvek chrípkového

I vírusu typu A. Po skončení syntézy prvého a druhého reťazca cDNA reakcia pokračovala skôr fenol/chloroformovou extrakciou a precipitáciou etanolom než podľa inštrukcií v návode súpravy. Zarovnané konce molekúl cDNA boli ligované priamo do vektora VIJneo alebo VIJns, ktoré boli štiepené reštrikčným enzýmom BglII, ich konce zatupené T4 DNA a vystavené reakcii teľacej intestinálnej alkalickej fosfatázy.

Na vyhľadanie určitých vírusových génov v plnej dĺžke sú použité syntetické oligodeoxyribonukleotidy, ktoré boli navrhnuté tak, aby komplementovali 3’-koniec konca translač¹ ného otvoreného čítacieho rámca daného vírusového génu.

Vzorky, ktoré sa zdali byť celými génmi pomocou reštrikčného ’ mapovania a určenia veľkosti v elektroforéze na agarózovom géli boli overené sekventovanim dideoxynukleotidmi oboch ^s spojov každého vírusového génu s VIJneo. Sekvencie spojov každého tohto génu klonovaného z týchto vírusov sú uvedené nižšie v príklade 8.

Podobná stratégia bola použitá na klonovanie cDNA iä z každého vírusu uvedeného vyššie okrem B/Panama/45/90, kto§ rý nemá túto spoločnú sekvenciu na každom konci vírusovej t

Ij RNA. Na syntézu prvého reťazca cDNA bola použitá zmes oligo• deoxyribonukleotidov. Toto sú použité priméry:

	(1)	5’-AGCAGAAGCGGAGC-3’,	SEKV.ID:31:	pre PB1 a PB2,
	(2)	5’-AGCAGAAGCAGAGCA-3’	, SEKV.ID:19:	: pre NS a HA,
	(3)	5’-AGCAGAAGCACGCAC-3’	, SEKV.ID:22:	pre M a
	(4)	5’-AGCAGAAGCACAGCA-3’	, SEKV.ID:23:	pre NP.

Pre gény klonované PCR bol ako templátová DNA použitý DNA roztok cDNA so zatupenými koncami priamo na použitie v PCR reakcii. Priméry použité na klonovanie 6 chrípkových génov získaných PCR sú nasledujúce:

1. HA gén z A/Georgia/03/93 negatívny primér: SEKV.ID:33: 5’GCT ACA ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC 3’ pozitívny primér: SEKV.ID:34:

5’CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G 3’ !

- 49 ιϊ j 2. HA gén z A/Texas/36/91 í negatívny primér: SEKV.ID:35:

t 5’GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TG 3’ pozitívny primér: SEKV.ID:36:

5’CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG 3’

Všetky chrípkové gény, či už cDNA alebo vytvorené PCR, boli overené sekventovaním v ligačných miestach v génoch a gény boli exprimované v transfektovaných RD bunkách.

: Expresia bola zisťovaná imunoblotmi.

«

Konštrukcie NP a Ml pre kmeň A/H3N2 (vektory 4 a 5) bo¹ li vytvorené z génu z A/Beijing/353/89. Tieto gény boli vybraté z dôvodu ich dostupnosti a na základe predpokladu vy'· sokej konzervácie oboch NP a Ml génov.

Z predchádzajúceho výskumu bola vybratá skupina 7 ^s zvlášť vhodných expresívnych vektorov, ktoré sú kombinované

pri	príprave	vakcíny:
1.	VIJns-HA	(A/Georgia/03/93)	6,56	Kb
2.	VIJns-HA	(A/Texas/36/91)	6,56	Kb
3 .	VIJns-HA	(B/Panama/45/90)	6,61	Kb
4.	VIJns-NP	(A/Beij ing/353/89)	6,42	Kb
5 .	VIJns-Ml	(A/Beij ing/353/89)	5,62	Kb
6.	VIJns-NP	(B/Panama/45/90)	6,54	Kb
7.	VIJns-Ml	(B/Panama/45/90)	5,61	Kb
	Dôležité	sekvencie spojenia týchto génov v daných

expresívnych vektoroch sú uvedené ďalej. Len malá časť konštrukcií vyžadovala sekventovanie na potvrdenie správnosti génu, ktorý bol klonovaný. Porovnaním s podobnými známymi génmi bolo ľahké potvrdiť, či daný gén je NP gén, HA gén alebo Ml gén, atď. Napríklad sekvencia HA génu A/Texas je veľmi podobná sekvencii HA génu z A/Kiev/59/79, ktorá je k dispozícii v GENBANK pod registračným číslom M38353. Podobne HA sekvencia z B/Panama je veľmi podobná HA sekvencii z B/England/222/82, ktorá je v GENBANK dostupná po registračným číslom M18384. Podobným spôsobom bola potvrdená totožnosť akejkoľvek sekvencie daných génov z ktoréhokoľvek

- 50 r.

ľudského chrípkového vírusu. V každej z nižšie príkladov boli potvrdené tak 3’sekvencie, aby bolo zaručené, že V každom prípade označuje tučné ATG uvedených ako aj celý gén.

5’sekvencie, je prítomný počiatočný kodón chrípkového génu, zatial čo tučná sekvencia na 3'konci označuje terminačný kodón:

1. VlJns-HA (A/Georgia/03/93) 6,56 Kb:

5'sekvencia: (SEKV.ID:46:)

...TCA CCG TCC TTA GAT C/GG TAC AAC CAT GAA GAC TAT CAT TGC TTT GAG CTA CAT TTT ATG TCT GGT ttt m r í; j ) l i i i

3'sekvencia: (SEKV.ID:47:)

...TCA TGC TTT TTG CTT TGT GTT GTT TTG CTG GGG TTC ATC ATG TGG GCC TGC CAA AAA GGC AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA A/GA TCT ATG TGG GAT CTG CTG TGC...

2. VlJns-HA (A/Texas/36/91) 6,56 Kb:

5’sekvencia: (SEKV.ID:48:)

... TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA ....

3'sekvencia: (SEKV.ID:49:)

...CTG GTG CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT....

3. VlJns-HA (B/Panama/45/90) 6,61 Kb:

5’sekvencia: (SEKV.ID:50:)

...CCT TAG ATC/ GGT ACA. ACC ATG AAG GCA ΑΤΑ ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG....

3’sekvencia: (SEKV.ID:51:)

...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATC TGT CTA TAA ATG TGG /GAT CTG CTG TGC CTT...

4. VIJns-NP (A/Beijing/353/89) 6,42 Kb:

5’sekvencia: (SEKV.ID:52:)

...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG AAT GCA ACT ...

3’sekvencia: (SEKV.ID:53:)

...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...

5. VIJns-Ml (A/Beijing/353/89) 5,62 Kb:

5’sekvencia: (SEKV.ID:54:)

...CTT AGA TC/C AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...

j 3'sekvencia: (SEKV.ID:55:)

I GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT í GAT CTT CTT GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGA '' ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG TTC AAG TGA AGA TCT

ATG TGG/ GAT CTG CTG ŤGC CTT...

6. VIJns-NP (B/Panama/45/90) 6,54 Kb:

5'sekvencia: (SEKV.ID:56:)

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT...

3'sekvencia: (SEKV.ID:57:)

...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...

7. VIJns-Ml (B/Panama/45/90) 5,61 Kb:

5'sekvencia: (SEKV.ID:58:)

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCG CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC TAC CTG CTT TCA TTG ACA GAA GAT GGA GAA GGC AAA GCA GAA CTA GCA GAA AAA TTA ...

3'sekvencia: (SEKV.ID:59:)

...AGA TCT CTT GGG GCA AGT CAA GAG AAT GGG GAA GGA ATT GCA AAG GAT GTG ATG GAA GTG CTA AAG CAG AGC TCT ATG GGA AAT TCA GCT CTT GTG AAG AAA TAC CTA TAA G/GA TCT GCT GTG...

j Príklad 6 | VIJ expresívny vektor, SEKV.ID.10:

Našim zámerom pri konštrukcii V1J bolo odstrániť z nášho vektora VI promótor a terminátor transkripcie, aby sme ich mohli umiestniť na výhodnejšie pozície a vytvoriť tak celistvej ši vektor a získať vyššie výťažky pri jeho purifikácii.

V1J je odvodený od vektora VI (viď. príklad 1) a pUC18, ktorý je bežným komerčne dodávaným plazmidom. VI bol štiepený reštrikčnými enzýmami SspI a EcoRI dávajúcimi dva fragmenty DNA. Menší z týchto fragmentov obsahujúci promótor CMVintA a terminátor hovädzieho rastového hormónu (BGH), ^s ktoré kontrolujú expresiu heterológnych génov (SEKV.ID:11:), bol získaný elektroforézou v agarózovom géli a následnou purifikáciou. Konce tohto fragmentu boli potom zarovnané T4 i DNA polymerázou, aby mohli byť ligované so zarovnanými koncami iného DNA fragmentu.

pUC18 bol zvolený, aby vytvoril chrbticu expresívneho | vektora. Je známy pre vysoké výťažky, ktoré poskytuje, jeho i sekvencie a funkcie sú dobre preštudované a má minimálnu veľkosť. Z tohto vektora sme čiastočným štiepením reštrikčným enzýmom HaelI odstránili celý lac operon, čo nebolo pre naše účely nevyhnutné a môže byť na škodu pre výťažky plazmidu a expresiu heterológnych génov. Zvyšný plazmid bol purif ikovaný a agarózového gélu, jeho konce boli zatupené T4 .. DNA polymerázou, bol podrobený reakcii s intestinálnou teľacou fosfatázou a ligovaný k vyššie opísanej CMVintA/BGH časti. Získali sme tak plazmidy, ktoré vykazovali niektorú z možných orientácií promótorových častí v chrbtici pUC. Jeden z týchto plazmidov dával oveľa vyššie výťažky DNA v E.

i coli a bol označený VIJ (SEKV.ID:10:). Štruktúra tohto plazmidu bola overená sekvenčnou analýzou oblastí spojov. Tento plazmid potom v porovnaní s VI vykazoval porovnateľnú alebo ' vyššiu expresiu heterológnych génov.

- §4 í Príklad 7 | Konštrukcie génov chrípkového vírusu vo vektore V1J

Z chrípkového vírusu kmeňa A/PR/8/34 bolo do expresívneho vektora V1J klonovaných mnoho týchto génov, čím, ako uvádza príklad 4, sa zvýšila hladina expresie na rovnakú alebo aj vyššiu úroveň než u vektora VI. Sekvencie génu PR8 sú dostupné v databáze GENBANK. U všetkých fragmentov nižšie uvedených klonovaných génov bola ich veľkosť overená gélovou elektroforézou a u každej sekvencie je uvedené registračné číslo sekvencie v GENBANK, podľa ktorej boli fragmenty ‘ porovnávané. Metódy získania génov z vírusových kmeňov ako napríklad u vírusu získaného z ATCC (A/PR/8/34 je ATCC ’ VR-95; v ATCC je k dispozícii mnoho ďalších kmeňov) sú uvei; dené v príklade 5 .

t í A. Subklonovanie génov PR8 do VIJ

1. NP gén

NP gén bol subklonovaný z pAPR501 (J. F. Young, U.

t j Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. V. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138). Gén bol získaný excíziou pAPR501 pomocou EcoRI, fragment bol purifikovaný a konce zarovnané T4 DNA polymerázou. Zatupený . fragment bol vložený do VIJ štiepeného BglII a taktiež zatupeného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment bol dlhý 1,6 kb.

2. NS

NS gén bol subklonovaný z pAPR801 (J. F. Young, U, l

j Desselberber, P. Graves, P, Palese, A, Shatzman a M. Rosen·, berg (1983) v The origins of Pandemic Influenza Viruses, i vyd. V. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138), ΐ

excíziou pAR801 pomocou EcoRI, fragment bol purifíkovaný z gélu a zatupený T4 DNA polymerázou. Zatupený vložený do VIJ taktiež štiepeného BglII fragment bol a taktiež zarovnaného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment bol dlhý

0,9 kb (kompletná kódujúca oblasť NS obsahuje NS1 a NS2).

3. HA

HA gén bol suklonovaný z pJZ102 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosen. berg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. E. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138) . excíziou pJZ102 pomocou HindlII, fragment bol purifikovaný z gélu a zatupený T4 DNA polymerázou. Zatupený fragment bol a vložený do V1J taktiež štiepeného BglII a taktiež zarovnaného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment bol dlhý 1,75 kb.

j j 4. PB1

PB1 gén bol subklonovaný z pGeml-PBl (5'koncové | a 3'koncové spoje týchto génov s vektorom boli sekventované, | aby sa potvrdila ich totožnosť, viď. J. F. Young, U. DesselK * berber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. V.

G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138). Excíziou s pGem-PBl pomocou HindlII bol získaný fragment, ktorý bol purifikovaný z gélu a zatupený T4 DNA polymerázou. Zatupený ⁵ fragment bol vložený do V1J taktiež štiepeného BglII a taktiež zarovnaného T4 DNA polymerázou. Klonovaný fragment bol dlhý 2,3 kb.

5. PB2 i

PB2 gén bol subklonovaný z pGeml-PB2 (5'koncové í' a 3 ’ koncové sekvencie spojov týchto génov s vektormi boli l sekventované, aby sa overila ich totožnosť, viď. , J. F.

! Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic influenza Viruses, vyd. V. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138). Excíziou pGem-PB2 pomocou BamHI, fragment bol purifikovaný z gélu. Fragment s presahujúcimi koncami bol vložený do VIJ taktiež štiepeného BglII. Klonovaný fragment bol dlhý 2,3 kb.

6. Ml

Ml gén bol vytvorený technikami PCR z plazmidu p8901 ΜΙΤΕ. M sekvencie v tomto plazmide boli vytvorené PCR z pAPR701 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Shatzman a M. Rosenberg (1983) v The Origins of Pandemic Influenza Viruses, vyd. V. G. Laver (Elsevier, Amsterdam) str. 129 až 138) za použitia oligoméru 5’-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT CTA ACC GAG GTC -3’, SEKV.ID:3: pre negatívny primér a oligoméru 5’-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA CCG TTG CAT CTG CAC -3’, SEKV.ID:4: pre pozitívny primér. PCR fragment bol purifikovaný gélovou elektroforézou, štiepený BglII a ligovaný do V1J štiepeného taktiež BglII. Klonovaný fragment bol dlhý 0,7 kb. Konečná aminokyselina kódovaná Ml je v negatívnom primére uvedená ako ATG kodón, zatiaľ čo terminačný kodón translácie Ml je kódovaný obráteným kodónom TCA, ktorý je v negatívnom smere terminačným kodónom TGA.

B. Expresívne konštrukcie V1J chrípkového génu

V každom prípade sú uvedené spojové sekvencie z oblasti 5’-koncového promótora (CMVintA). Sekvencie boli vytvorené sekventovaním primárov:

CMVintA primér 5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG -3’, SEKV.ID:28:, ktorý tvorí sekvenciu kódujúcu sekvencie. Poloha, v ktorej sa toto spojenie vyskytuje, je označená /, toto označenie neznamená žiadnu nespojitosť v danej sekvencii. Spôsob prípravy týchto konštrukcií je uvedený za zoznamom všetkých daných sekvencií. Každá vytvorená sekvencia

F

- 57 j predstavuje kompletnú, prístupnú, exprimovanú konštrukciu DNA pre žiadaný chrípkový gén.

Každou konštrukciou boli transfektované bunky RD (ATCC J ¹ CCL136), bunková línia ľudského rabdomyosarkómu v kultúre.

Štyridsať hodín po transfekcii boli bunky zobraté, lyzované a vykonaný Vestern blot (okrem konštrukcie V1J-PR-HA, ktorý bol testovaný na myšiach a poskytol anti-HA špecifické protilátky ešte pred vykonaním Vestern blotu, čím zanikla potreba vykonávať blot, pretože expresia bola pozorovaná in vivo). Špecifické protilátky proti PB1, PB2 a NS proteínom boli dodané pánom Stephenom Inglisom z University of Cambridge, ktorý pri príprave polyklonálneho antiséra použí. val purifikované proteíny exprimované ako β-galaktozidázové fúzne proteíny. Anti-NP polyklonálne antisérum bolo vytvorené imunizáciou králikov celými vírusmi A/PR/8/34. Protilátky anti-Ml sú komerčne dodávané z Biodesign v podobe kozieho , anti-chrípka A antiséra pod katalógovým číslom B65245G.

) i V každom prípade bol pozorovaný proteín predpokladanej dĺžky potvrdzujúci expresiu kódovaného chrípkového proteíriu prebiehajúceho in vitro.

Nomenklatúra týchto konštrukcií sa riadi konvenciami:

_: názov vektora - kmeň chrípky - gén. V každom prípade bola sekvencia klonovaných a sekventovaných génových sekvencií A/PR/8/34 porovnávaná so známymi sekvenciami z GENBANK. Biologická účinnosť každej z týchto konštrukcií je uvedená s v predchádzajúcich príkladoch 2, 3 a 4.

Sekvencia 5’spojov CMVintA a chrípkových génov z A/PR/8/34:

’ 1. V1J-PR-NP, SEKV.ID:12:, GENBANK registračné číslo:

M38279

5' GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG CMVintA NP....

TAG ATA ATC ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TCA TG

2. V1J-PR-PB1, SEKV.ID:13:, GENBANK registračné číslo: J02151 í

5' ACC GTC CTT AGA TC/A GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC CMVintA PB1....

CAT TTG AAT GGA TGT CAA TCC GAC CTT ACT TTT CTT AAA AGT GCC AGC ACA AAA TGC TAT AAG CAC AAC TTT CCC TTA TAC

3. V1J-PR-NS, SEKV.ID:14:, GENBANK registračné číslo:

J02150

5’ GTC ACC GTC CTT AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG

CMVintA NS....

TGA CAA AAA CAT AAT GGA TCC AAA CAC TGT GTC AAG CTT TCA GGT AGA TTG CTT TCT TTG GCA TGT CCG CAA ACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG TGA T....

4. V1J-PR-HA, SEKV.ID:15:, GENBANK registračné číslo:

J02143

5’ TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/ A GCT TGG AGC AAA CMVintA HA...

AGCAGG GGA AAA TAA AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA ACC TAC TGG TCC TGT TAA GTG CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG ACA CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA ACA ATT CAA CC...

5. V1J-PR-PB2, SEKV.ID:16:, GENBANK registračné číslo: J02153

5ΤΤΤ TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA TC/ C CGA ATT CCA CMVintA PB2....

GCA AAA GCA GGT CAA TTA TAT TCA ATA TGG AAA GAA TAA AAG AAC TAA GAA ATC TAA TGT CGC AGT CTG CCA CCC CGG AGA TAC TCA CAA AAA CCA CCG TGG ACC ATA TGG CCA TAA TCA AGA AGT...

6. V1J-PR-M1, SEKV.ID:17:, GENBANK registračné číslo J02145

5' GTC ACC GTC CTT AGA TCT/ ACC ATG AGT CTT CTA ACC CMVINTA Ml.....

GAG GTC GAA ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC GCA CAG AGA CTT GAA GAG TTG ACG GAA GA...

Ďalej uvádzame, ako boli

1. V1J-PR-NP: zatupený BglII EcoRI koncu (NP).

2. V1J-PR-PB1: zatupený BglII HindlII (PB1).

3. V1J-PR-NS: zatupený BglII EcoRI koncu (NS1).

4. V1J-PR-HA: zatupený BglII HindlII koncu (HA).

5. V1J-PR-PB2: presahujúci júcemu koncu BamHI (PB2).

tieto fragmenty pospájané:

(vektor) koniec k zatupenému (vektor) koniec k zatupenému (vektor) koniec k zatupenému (vektor) koniec k zatupenému koniec

BglII (vektor) k presahu- 60 6. V1J-PR-M1: presahujúci koniec BglII (vektor) k presahujúcemu koncu BglII (Ml). Ml bol získaný technikami PCR za použitia p8901-MlTE ako templátu a primérov, ktoré pridávajú BglII miesta na oba konce, začínajú 3 bázy pred ATG a končia hneď za terminačným kodónom pre Ml (TGA).

Príklad 8

Expresívny vektor VlJneo,’ SEKV.ID:18:

Bolo nutné z baktérií nesúcich V1J odstrániť gén amp^r na selekciu na rezistenciu na antibiotiká, pretože ampicilín nie je možné použiť vo veľkoobjemových fermentátoroch. Gén amp^r bol odstránený z pUC chrbtice vektora V1J štiepením reštrikčnými enzýmami AspI a Eamll051. Zvyšok plazmidu bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli, jeho konce boli zarovnané pôsobením T4 DNA polymerázy a potom k nim bola pridaná teľacia intestinálna fosfatáza. Komerčne dodávaný gén kan^r odvodený od transpozónu 903 a obsiahnutý v plazmide pUC4J bol vyštiepený pomocou reštrikčného enzýmu PstI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli a jeho konce boli zarovnané T4 DNA polymerázou. Tento fragment bol ligovaný s kostrou V1J, čím vznikli plazmidy s génom kan^r v oboch možných orientáciách. Tieto plazmidy boli označené VlJneo č. 1 a 3. Každý tento plazmid bol potvrdený analýzou štiepenia reštrikčnými enzýmami, sekventovaním DNA spájaných oblastí. Tieto plazmidy dávali podobné výťažky ako V1J. Expresia produktov heterológnych génov vektorov VlJneo bola taktiež porovnateľná s expresiou u V1J. Vybrali sme vektor VlJneo#3, ktorý je ďalej označovaný ako VlJneo (SEKV.ID:18:) a ktorý obsahuje gén kan^r v rovnakej orientácii ako je gén amp^r v expresívnej konštrukcii V1J.

Gény z každého kmeňa A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91 a B/Panama/46/90 boli klonované ako cDNA do vektora VlJneo. V každom prípade boli spojové sekvencie z 5’-promótorovej oblasti (CMVintA) klonovaného génu sekventované za použitia

Ipriméru:

CMVintA primér 5’-CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG -3’, SEKV.ID:28:, ktorý tvorí sekvenciu tejto kódujúcej sekven_; cie. Táto sekvencia prilieha k sekvencii kódujúcej terminátor, ktorého sekvencia je tu taktiež uvedená. Táto sekvencia bola vytvorená použitím priméru: BGH primér 5’-GGA GTG GCA CCT TCC AGG -3’, SEKV.ID:29:, ktorý vytvára sekvenciu nekódujúceho reťazca. Každá sekvencia génov klonovaných a sekventovaných z izolátov týchto alebo iných chrípkových vírusov bola skontrolovaná proti známym sekvenciám z GENBANK. Pozícia, v ktorej sa objavuje spoj, je označená /> čo neoznačuje žiadnu nespojitosť v sekvencii. V prípade spoja VIJneo-TX-HA bol sekvenačný gél stlačený a bol ťažké počítať počiatočnú sekvenciu. Preto je prvých 8 báz tohto spoja označených ako N. Tieto nukleotidy boli potvrdené a uvá dzame tu určené nukleotidy. Prvý ATG, objavujúci sa v kažíl li dej sekvencii, je iniciačným kodónom translácie pre prísluš| ný klonovaný gén. Každá uvedená sekvencia predstavuje kompletnú, ľahko dostupnú, exprimujúcu sa konštrukciu DNA pre určitý chrípkový gén. Nomenklatúra sa riadi konvenciou: názov vektora - kmeň chrípky - gén. Biologická účinnosť kaž| dej tejto konštrukcie je uvedená rovnakým spôsobom ako vo í vyššie uvedených príkladoch 2, 3 a 4.

Sekvencie 5’-spoja medzi CMVintA a génmi chrípky a 3’-spoja chrípkových génov a konštrukciou BGH terminátora expresie za _; použitia rôznych chrípkových kmeňov a proteínov:

- I. A/Beijing/353/89

A. VIJneo-BJ-NP:

Promótor, SEKV.ID:20:

5' TCA CCG TCC TTA GAT C/ AA GCA GGG TTA ATA ATC CMVintA NP....

ACT CAC TGA GTG ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT

Terminátor, SEKV.ID:21:

5' GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT / ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...

BGH NP....

II. A/Texas/36/91

A. VIJneo-TX-HA:

Promótor, SEKV.ID:24:

5' CCT TAG ATC / GGA AAT AAA AAC AAC CAA AAT GAA CMVINTA HA....

AGC AAA ACT ACT AGT CC...

Terminátor, SEKV.ID:25:

5’ GCA GAT C/ CT TAT ATT TCT GAA ATT CTG GTC...

BGH HA....

TCA GAT...

III. B/Panama/46/90

A. VIJneo-PA-HA:

Promótor, SEKV.ID:26: (prvých 1080 báz tejto sekvencie je dostupných v GENBANK pod registračným číslom M65171); nižšie uvedená sekvencia je totožná so známou sekvenciou; 3’sekvencia SEKV.ID:27: nižšie nebola vopred zaznamenaná.

5’ACC GTC CTT AGA TC/ C AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT

CMVintA HA....

ATC CAC AAA ATG AAG GCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC...

Terminátor, SEKV.ID:27:

5' GGC ACA GCA GAT C/ TT TCA ATA ACG TTT CTT TGT

BGH HA....

AAT GGT AAC...

Príklad 9

Vnútrokožné injekcie chrípkových génov

Postup vnútrokožnej aplikácie génov bol rovnaký ako pre vnútrosvalové injekcie: tri injekcie Vl-PR-NP každá po 200 pg, v intervaloch po troch týždňoch. Slezinové bunky boli na testovanie in vitro vzaté 55 dní po tretej injekcii a restimulované nonapeptidom epitopu nukleoproteínu 147 až 155, SEKV.ID:9:. Cieľové bunky (bunky P815, myšací mastocym, syngénny s myšami BALB/c H2^) boli infikované heterológnym vírusom A/Victoria/73, pri lýze bol použitý pomer medzi efektorom a cieľovou bunkou v rozsahu medzi 5:1a 40:1. Negatívne kontroly boli vykonané meraním lýzy cieľových buniek, ktoré neboli chrípkovým vírusom infikované. Pozitívne kontroly boli vykonané meraním lýzy cieľových buniek infikovaných chrípkovým vírusom prostredníctvom slezinových buniek získaných z myši, ktorá bola trikrát očkovaná 130 pg Vl-PR-NP a ktorá prežila infekciu chrípkovým vírusom kmeňa A/HK/68.

Výsledky: špecifická lýza sa dosiahla použitím slezinových buniek z myší očkovaných vnútrokožné vo všetkých možných pomeroch efektor:cieľová bunka. U slezinových buniek použitých ako efektor získaných z myši, ktoré neboli očkované alebo boli očkované vektorom VI bez PR-NP génu, nebola pozorovaná žiadna lýza. Špecifická lýza dosiahnutá použitím vnútrosvalovej aplikácie. U myší očkovaných vnútrokožné alebo vnútrosvalovo bol zmeraný titer vírusu v pľúcach. Výsledky experimentov používajúcich 5 myší v skupine, dávky 3 x 200 pg aplikované po trojtýždňových intervaloch a násled nou infekciou 3 týždne po poslednej dávke boli nasledujúce:

Vakcína Spôsob aplikácie Titer v pľúcach myši*

5. deň 7. deň

Vl-PR-NP	vnútrokožná	5,2	±	0,2	4,1	±	1**
VI	vnútrokožná	5,9	±	1	6,6	±	0,3
Vl-PR-NP	vnútrosvalová	4,6	±	0,4	4,5	±	1,1
žiadna		6,2	±	0,3	5,9	±	0,3

* stredný log titra ± SEM ** jedna z myší nemala žiadny vírus

Percento prežívajúcich myší bolo hodnotené až do 28. dňa. Do 28. dňa prežilo 89 % príjemcov očkovaných Vl-NP-PR do svalu a 50 % očkovaných vnútrokožne. Z myši očkovaných vektorom VI neprežila žiadna a z neočkovaných myší prežilo 30 %. Tieto pokusy ukazujú, že DNA kódujúca nukleoproteín z kmeňa A/PR/8/34 mala schopnosť indukovať CTL rozpoznávajúci nukleoproteín z heterológneho kmeňa A/Victoria/73 a vyvolávajúci obrannú imunitnú odpoveď proti heterológnemu kmeňu A/HK/68.

Príklad 10

Polynukleotidová vakcína pre primáty

1. Protilátky proti NP u makakov: mamakovia (006 NP, 009 NP alebo kontrola 101; 021) boli očkovaní vnútrosvalovo RSV-NP 1 mg/miesto do troch miest 1. deň. Injekcie obsahujúce každá 1 mg RSV-LUX a CMV-int-LUX, konštrukcie na expresiu luciferázy svätojánskych mušiek, boli zvieratám aplikované v rovnaký deň do iných miest. Pätnásty deň boli zvieratá očkované rovnakou DNA ako predtým a zároveň pD5-CAT v dávkach 1 mg do každého miesta, čo je konštrukcia pre reportérový gén na expresiu chloramfenykol-acetyl transferázy. Svaly obsahujúce reportérové gény boli testované na aktivitu týchto reporté65 rových génov. V období 3, 5, 9, 11, 13 a 15 týždňov po prvej injekcii bolo vzaté sérum. Prvé pozitívne vzorky anti-NP protilátok boli odobraté v 11. týždni, ďalšie pozitívne vzorky boli z 13. a 15. týždňa. Anti-NP protilátky boli stanovené ELISA testom.

2. Hemaglutinín inhibujúce (Hl) protilátky u makakov: Opice boli v 1. deň očkované do svalu injekciami V1J-PR-HA. Každé z dvoch zvierat obdržalo 1 mg, 100 pg ALEBO 10 mg DNA do každého štvorhlavého svalu. Každá injekcia bola podaná v objeme 0,5 ml. Zvieratám bola odobratá krv pred aplikáciou prvej injekcie. Všetky zvieratá boli preočkované DNA 15 deň a krv im bola potom odoberaná v 2 až 4 týždňových intervaloch. Titer inhibície hemaglutinínu (Hl) proti A/PR/8!34 bol pozitívny za 5 týždňov, 9 týždňov a 12 týždňov po prvej injekcii V1J-PR-HA DNA. Výsledky sú uvedené v tabuľke 10-1:

Tabuľka 10-I

Titer Hl protilátok u makakov očkovaných

V1J-PR-HA DNA

makak č.	dávka	Titer Hl protilátok v týždni č.
		pred	3	5	9	12
88-010	1 MG	< 10	< 10	320	320	320
88-0200		< 10	< 10	< 10	40	40
88-021	100 UG	< 10	< 10	< 10	40	20
90-026		< 10	< 10	20	20	40
88-084		< 10	20	40	20	10
90-028		< 10	< 10	20	< 10	< 10

Príkladll

Štúdie polynukleotidovej vakcíny pre fretky

1. Výskum polynukleotidového očkovania fretiek bol začatý s úmyslom určiť, či by mohli byť zvieratá chránené pred chrípkou A očkovaním génmi kódujúcimi buď HA (povrchový proteín schopný indukovať kmeňovo-špecifické neutralizujúce protilátky) alebo vnútorné proteíny NP, NSI, PB1, M (zrejme schopných indukovať imunitnú na kmeni nezávislú odpoveď sprostredkovanú bunkami). Zvieratá boli očkované DNA kódujúcou rôzne chrípkové gény v našom VIJ-vektore:

Tabuľka 11-I

skupina	konštruk- cia	dávka	počet očkovan. zvierat	infekcia H1N1	infekcia H3N2
1	V1J-HA	1000 mg	16	8	8
2	V1J-NP	1000 mg	16	8	8
3	V1J+NP+ NS1+PB1 +PB2+M	celkom 2000 mg	16	8	8
4	V1J-HA+ NP+NS1+ PB1+PB2 +M	celkom 2000 mg	16	8	8
5	V1J-	1000 mg	16	8	8
6	žiadna	žiadna	10	5	5
celkom			90	45	45

2. Od očkovaných zvierat bolo odobraté 22. a 43. deň po imunizácii sérum a testované ELISA testom na neutralizujúce protilátky (inhibujúce hemaglutinín - Hl) a na protilátky na nukleoproteín (NP). Zvieratá očkované DNA exprimovali protilátky na zodpovedajúce gény. Tieto údaje sú uvedené na obrázkoch 10, 11 a 16.

3. Vybrané očkované zvieratá boli 128. deň infikované 1200 TCID_5q chrípky A/HK/68. Tento kmeň je heterológny s kmeňom A/PR/8/34, ktorý bol zdrojom kódujúcich sekvencii použitých pri očkovaní a teda ochrana predstavuje imunitu založenú na mechanizme imunity sprostredkovanej bunkami a nezávislej na druhu kmeňa. Obrázok 12 ukazuje štatisticky významné zníženie šírenia vírusu v organizme v porovnaní s kontrolnými zvieratami u zvierat očkovaných DNA kódujúcou vnútorné proteíny, čím sa potvrdilo, že očkovanie polynukleotidmi vyvoláva u fretiek imunitnú odpoveď a že táto odpoveď je ochranného charakteru.

4. Homológna infekcia A/PR/8/34 bola testovaná podobne a podobne je tu aj demonštrovaná účinnosť ochrany neutralizujúcimi protilátkami indukovanými polynukleotidovou vakcináciou .

Príklad 12

Príprava VIJns

Na vykonanie pokusov s integráciou génov bolo do VIJneo pridané reštrikčné miesto Sfil. Komerčne dodávaný spojovník Sfil dlhý 13 báz (New England BioLabs) bol pridaný do miesta KpnI v sekvencii BGH daného vektora. VIJneo bol linearizovaný KpnI, purifikovaný gélovou elektroforézou, konce zarovnané T4 DNA polymerázou a ligovaný so zatupeným spojovníkom Sfil. Izoláty na klonovanie boli vybraté reštrikčným mapovaním a overené sekventovaním cez spojovník Nový vektor označený VIJns (obr. 17). Expresia heterológnych kmeňov vo VIJns (s Sfil) bola porovnateľná s expresiou rovnakých génov vo VlJneo (s KpnI).

Príklad 13

Imunogenicita

1. Humorálna imunitná odpoveď

Injekcia DNA, kódujúca chrípkové HA, NP a Ml viedla u myší, fretiek alebo človeku nepríbuzných primátov (vrátane afrických zelených opíc a maniakov) k humorálnej imunitnej odpovedi. Do dnešného dňa bolo dokázané, že tvorbu protilátok vyvoláva PNV obsahujúce gény HA klonované z A/PR/34, B/Panama/90, A/Beijing/89, A/Texas/91, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93.

a) Myši: ELISA testami boli stanovené protilátky na NP a Ml v sére myší po očkovaní DNA. Výrazné titre protilátok (10 až 10°) sa u myší vytvorili už po takých nízkych dávkach, ako je 1 pg NP DNA (A/PR/34) aplikovaných raz (najmenšia testovaná dávka) a už po 2 týždňoch po injekcii (najčastejší testovaný termín) a neznižovali sa po dobu najmenej 6 mesiacov. Tieto NP protilátky nie sú neutralizujúce a nezúčastňujú sa obrany. Avšak po injekcii DNA vykazujú in vivo expresiu NP proteínu. Naproti tomu protilátky na HA poskytujú obrannú imunitu proti homológnym kmeňom chrípkového vírusu. Injekcia HA DNA klonovaný z kmeňa A/PR/34 viedla k tvorbe neutralizujúcich protilátok, ktoré boli overené in vitro testami inhibície hemaglutinínu (Hl). U mnohých myši bol po troch dávkach 100 pg HA DNA nameraný titer Hl > 1280 a u niektorých zvierat, ktoré obdržali len dve dávky 0,1 pg, bol zistiteľný titer protilátok. Bola zistená súvislosť medzi dávkami DNA a výškou titru Hl protilátok a zároveň medzi Hl Litrom a počtom injekcií (tabuľka 13-1):

Tabuľka 13 í

I Tvorba humorálnej imunitnej odpovede u myší

dávka (μ§)	GMT Hl
počet dávok
1	2	3
HA DNA (100)	75	106	260
HA DNA (10)	37	69	86
HA DNA (1)	< 10a	13	24
HA DNA (0,1)	< 10b	< 10a	<10a
kontrolná DNA (100)	< 10b	< 10b	<10b
bez očkovania		< 10b

Tabuľka 13-1: Samice myší BALB/c (4 až 6 týždňov) boli očkované A/PR/34 HA DNA (V12JHA) uvedenými dávkami buď raz, dvakrát alebo trikrát v trojtýždňových intervaloch. Negatívnou kontrolou boli myši očkované kontrolnou DNA pozostávajúcou z vektora bez inzertu génu (VIJ) a neočkované a dosiaľ nenakazené myši. Vzorky séra boli odoberané 7 týždňov po dávke a boli testované na prítomnosť hemaglutinín inhibujúcich protilátok (Hl). Tieto údaje sú uvedené ako geometrická stredná hodnota titru Hl, kde n = 10.

^a niektoré z testovaných myší mali pozitívny titer Hl b všetky myši

Vo všetkých testovaných myšiach korelovala prítomnosť Hl protilátok s obranou v modeli s rovnakou infekciou. Hl protilátok u myší očkovaných HA DNA (A/PR/34) zostali bez podstatných zmien po dobu najmenej 6 mesiacov. HA protilátky sa podľa merania ELISA testami taktiež tvorili u myší, na ktorých bola použitá HA DNA z A/Beijing/89, B/Panama/90 a A/Texas/91 kmeňov chrípkového vírusu.

Na základe informácii z literatúry, uvádzajúcich nižšie expresie reportérových génov u starších myší po injekciách

I

DNA, sme taktiež testovali vplyv veku na humorálnu imunitnú

- 70 odpoveď na HA. Z dôvodu nedostatku starších dosial neoplodnených myších samíc boli použité odrastené matky vo veku približne 10 mesiacov. Boli porovnané odrastené matky so 4 až 6 týždennými dosial neoplodnenými samicami vzhľadom na ich schopnosť vytvárať HA protilátky. Staršie myši boli schopné vytvárať protilátky už po takých nízkych dávkach HA DNA ako je 1 gg (najnižšia testovaná dávka), aj keď mali nižší liter protilátok než mladé myši (tabuľka 13-11):

Tabuľka 13-II

Vplyv veku na humorálnu imunitnú odpoveď

inokulum	dávka (pg)	GMT (4-6 týždňov)	GMT (10 mesiacov)
HA DNA	100	1,034	110
HA DNA	10	338	68
HA DNA	1	80	20
kontr. DNA	100	< 5a	< 5a
neočkované	-	< 5a	< 5a
chrípka	-	538	36

Tabulka 13-11: Samice myší BALB/c (4 až 6 týždňové nikdy neoplodnené samice a 10 mesačné odrastené chovné samice) boli očkované A/PR/34 HA DNA (V1JHA) uvedenými dávkami trikrát v trojtýždňových intervaloch. Negatívne kontroly zahrňovali myši očkované kontrolnými DNA (V1J) a myši neočkované, ktoré neprišli do styku s chrípkou. Na porovnanie boli ďalšie myši infikované subletálnou dávkou chrípky A/PR/34. Za devät týždňov po prvej dávke bolo myšiam odobraté sérum, ktoré bolo potom testované na titer Hl. Údaje sú uvádzané ako geometrická stredná hodnota Hl titra, kde n = 15.

- 71 ^a všetky testované myši s negatívnym Hl Litrom

Toto však nebolo výsledkom samotnej PNV, ale skôr zníženou schopnosťou starších myší tvoriť humorálnu imunitnú odpoveď všeobecne, pretože staršie myši taktiež vykazovali po infekcii živým vírusom A/PR/34 nižšiu Hl odpoveď než mladšie myši. V skutočnosti boli Hl protilátky u starších myší očkovaných DNA menej potlačené než u starších myší infikovaných chrípkou. Staršie chovné samice použité v týchto pokusoch boli naviac približne o 50 % ťažšie než typické rovnako staré nikdy neoplodnené samice, čo mohlo mať podľa štúdií o využití diét na obmedzenie kalórií u myší neblahý účinok na imunitnú odpoveď týchto zvierat. Z týchto aj z ďalších dôvodov možno nebola imunitná odpoveď týchto zvierat charakteristická. Napriek tomu vek (až do najmenej 10 mesiacov veku) nijako významne neznižoval schopnosť polynukleotidovej vakcinácie indukovať humorálnu imunitnú odpoveď a to aj v takých nízkych dávkach ako je 1 pg.

b) Fretky: humorálna imunitná odpoveď sa vytvorila u fretiek očkovaných HA DNA z kmeňov chrípkových vírusov A/PR/34, A/Beijing/89, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93. Hl protilátky proti A/PR/34 a ELISA protilátky proti HA z iných kmeňov boli vytvorené príslušnou PNV. Zistilo sa, že v sérach fretiek očkovaných HA DNA z A/Beijing/89, A/Hawaii/91 a A/Georgia/93 sú Hl protilátky a neutralizujúce protilátky, pretože tieto zvieratá boli chránené pred vírusovou nákazou.

c) Primáty nepríbuzné človeku: (viď napríklad príklad 10) Makakovia boli dvakrát imunizovaní HA DNA (A/PR/34) dávkami 10, 100 a 1000 pg na každú nohu. Bol nameraný titer Hl až do 320 u zvierat, ktoré obdržali dávky 100 alebo 1000 pg a jedno zviera zo skupiny s dávkami 10 pg malo titer Hl 80. Až do tejto doby bolo testované sérum až do doby 13 mesiacov, Hl titer sa neznižoval približne od 6 do 13 mesiacov (tabuľka 13-III):

Tabuľka 13-11I ;ι '*( j

j < Tvorba Hl protilátok u makakov

dávka mg	pred	1 mesiac	2mesiace	5,5 mes.	13 mes.
2000	< 10	640	320	160	80
2000	< 10	40	40	20	20
200	< 10	80	40	40	80
200	< 10	80	80	40	20
20	< 10	40	20	20	20
20	< 10	< 10	< 10	< 10	< 10

Tabuľka 13-III: Makakovia (samci aj samice) s veľkosťou od 4,3 do 8,8 kg boli očkovaní HA DNA z A/PR/34 (V1JHA) v uvedených dávkach v nultom a v 2. týždni. Vzorky séra boli odoberané vo vyznačených dňoch po dávkach a testované na titer Hl. Údaje predstavujú titer Hl u jednotlivých zvierat.

Africké zelené opice očkované kombinovanou PNV obsahugg HA DNA (A/Beijing/89). Vyhodnotenie séra 4 až ukázalo GMT u oboch pre 5/6) pri rovnakých po sú júcou 100 týždňov výsledky subviriónových vírusmi (GMT = prvej dávke lepšie než vakcín (GMT

36, 6/6) (8/9) . Tieto dosiaľ dodávaných a vakcín s celými testoch (obr. 18).

Značný vylepšovací účinok druhého očkovania bol pozorovaný u zvierat s dávkami 10 gg HA DNA (GMT = 1,9 po jednej dávke a 199 po druhej dávke). Patentované vakcíny s celými vykazovali podobný vytvorené druhou len prechodné. Až hladiny Hl protilátok očkovaných dávkami tak porovnaní s dosiaľ dodávanými vakcínami podporný účinok, dávkou vakcíny dňa do dnešného až do viriónmi zatiaľ čo subviriónov titre Hl boli boli merané gg .

ako podobné zvierat týždňa a u aj 100 gg HA DNA v (s celými vírusmi).

Tieto výsledky ukazujú, že PNV bola prinajmenšom rovnako účinná pri tvorbe protilátok ako vakcína s celými vírusmi, ktorá predchádzala subviriónovej vakcíne. Imunogenicita purifikovaných subjednotkovaných vakcín nebola u myší

- 73 zistiteľná, takže sa u primátov netestovala. V tomto pokuse $ obsahovala PNV päťvalentnú zmes DNA, kódujúcu HA z j A/Beij ing/89, B/Panama/90 a A/Texas/91 a NPa Ml z A/PR/34, aby pripomínali skúšanú vakcínu. Takisto sme testovali zvieratá na tvorbu humorálnej imunitnej odpovede proti ostatným zložkám vakcíny a zistili sme protilátky na HA z B/panama/90 a NP z A/PR/34. V oddelených experimentoch boli indukované proti A/Texas/91 tak Hl, ako aj neutralizujúce protilátky indukované injekciami dvoch dávok HA DNA klonované PCR.

a

2. Imunitná odpoveď sprostredkovaná bunkami

Viď vyššie uvedený príklad 3.

i 3. Tvorba imunitnej odpovede

a) Humorálna imunita: mechanizmy, vyvolávajúce po injekcii DNA tvorbu humorálnej a bunkovej imunitnej odpovede ešte neboli objasnené. Pri tvorbe neutralizačných protilátok • (napríklad prori HA chrípkového vírusu) musiži bunky pravdei podobne exprimovať antigén na plazmatickej membráne alebo j ' ho sekrétovať do mimobunkového prostredia. Transfektované : bunky by mali naviac exprimovať HA v sekundárnej, terciárnej a kvartérnej štrukrúre podobnej HA vo virióne. V rozetových restoch bola povrchová expresia HA ukázaná na RD bunkách (rabdomyosarkóm, myoblastický pôvod) prechodne transfektovaných HA DNA. Červené krvinky aglutinovali s povrchom buniek transfektovaných HA, ale nie s povrchom buniek transfektovaných imitáciou HA, čím sa dokázalo, že HA nebol len exprimovaný na povrchu, ale ponechal si taktiež patričnú konformáciu nutnú na väzbu na proteín obsahujúci sialovú kyselinu.

. j

b) Bunková imunita: tvorba bunkovej imunitnej odpovede (napr. na NP chrípkového vírusu) vyžaduje proteolytické , v .·; spracovanie a prezentáciu odvodených peptidov v spojení : s MHC triedy I. Povaha buniek prezentujúcich antigén vedúci

Ik tvorbe imunitnej odpovede po injekcii DNA nie je dosiaľ známa. Svalové bunky exprimujú nízke hladiny MHC triedy I a predpokladá sa o nich, že na svojich povrchoch neexprimujú kostimulačné molekuly. Svalové bunky nie sú teda považované za bunky, ktoré by prezentovali antigény. Napriek tomu, niekoľko pokusov ukazuje, že svalové bunky sa zúčastňujú tvorby imunitnej odpovede po vnútrosvalovej injekcii DNA. V prvom rade to bolo limitované testovanie tkanív, schopných internalizovať holú plazmidovú DNA do expresie proteínov in situ, ktoré ukázalo, že veľa typov buniek môže ^ľ exprimovať reportérové gény po injekcii plazmidu priamo do tkaniva, ale všetky bunky boli všeobecne menej účinné než * svalové bunky. Kompletná analýza príjmu DNA inými než svalovými bunkami po vnútrosvalovej injekcii nebolel ešte publiko⁴ vaná, ale je pravdepodobné, že takýto príjem by mal ešte i nižšiu účinnosť. Po druhé bola dokázaná expresia reportéroí .

vých génov po vnútrosvalovej injekcii DNA do kostných buniek t

! a buniek srdcovej svaloviny u rôznych živočíchov. V treťom | prípade bolo zistené, že hoci odpovede CTL sa môžu vytvoriť | po injekcii DNA inými cestami (intravenózna a vnútrokožná), boli najlepšie imunitné odpovede u myší vytvorené po vnútro| svalovej injekcii DNA. Po štvrté, CTL môžu rozpoznávať ii a lýzovať myoblasty a myocyty in vitro a táto lýza môže byť ' posilnená predchádzajúcou reakciou s ^-interferónom, ktorý priaznivo reguluje expresiu proteínov MHC I. triedy. A konečne transplantácia stabilne transfektovaných myoblastov exprimujúcich NP do nikdy neinfikovaných syngénnych myší - viedlo k tvorbe obrannej bunkovej imunitnej odpovede in vivo (obr. 20). Takže expresia antigénov svalovými bunkami je dostatočná na indukciu obrannej imunitnej odpovede pozorovanej po injekcii DNÁ. Naviac príjem a expresia DNA inými než svalovými bunkami nemusí byť požadovaným príspevkom pri vy( tvorení obrannej imunity. Z hľadiska polynukleotidových vakcín by bolo do budúcna výhodné obmedziť príjem DNA bunkami. V prvom rade pretože sú myocyty diferencované a nedelia sa. Táto skutočnosť môže byť dôležitá pri znižovaní možnosti integrácie plazmidovej DNA do chromozomálnej DNA a udržaní

I permanentnej prezentácie antigénu, ktorá vedie k dlhotrvajúcej imunitnej odpovedi. Po druhé sú myocyty veľké bunky s násobnými jadrami, ktoré je možné vytvoriť fúziou myoblas.1 tov. Tým sa môže vysvetliť prečo vedú injekcie DNA k expresii proteínov, ktorá môže trvať po dlhé časové obdobie bez žiadneho dôkazu o cytolytickej deštrukcii CTL.

Príklad 14

Štúdie ochrany

Očkovanie DNA kódujúcou antigény chrípkového vírusu poskytovalo ochranu pred ochorením a úmrtím a znižovalo vírusové zaťaženie u početných kombinácií chrípkových kmeňov ^s pri použití dvoch všeobecne prijímaných modelov pre nákazu ; ľudskou chrípkou (myši a fretky).

j.

í >

L 1. Heterológna (heterotypická, skupinová) ochrana : súčasnými patentovanými vakcínami s usmrtenými vírusmi nie je

I poskytovaná dostatočná heterológna ochrana, ale je poskyto’ vaná očkovaním DNA vykonávaným na živočíšnych modeloch. Táto | ochrana sa prejavila u laboratórnych zvierat očkovaných DNA / * kódujúcich NP alebo Ml. Bunková imunitná krížová (CMI) odpoveď indukovaná očkovaním DNA vyvolávala ochranné odpovede.

a) Myši: BALB/c a C3H očkované do svalu injekciami DNA kódujúcou NP z A/PR/34 boli ochránené pred úmrtím a rozvinutím choroby (hodnotené podľa zníženého úbytku telesnej hmotnosti) po kompletnej infekcii dýchacieho traktu LD^q z A/HongKong/68 (H3N2) a heterotypickým kmeňom (H3 vs Hl pre A/PR/34). Obr. 21 ukazuje počty prežívajúcich myší BALB/c očkovaných trikrát NP DNA (200 pg/dávka) v trojtýždňových í intervaloch a infikovaných 3 týždne po poslednom očkovaní.

Obrázok 22 ukazuje potlačenie úbytku telesnej hmotnosti po nákaze u očkovaných myší porovnaný so značnými stratami telesnej hmotnosti zaznamenanými u kontrolných myší. Obr.

ukazuje zníženie vírusovej záťaže v pľúcach myší očkova76 '< ' k ι ( ných NP DNA 7 dní po infekcii horného dýchacieho traktu l

v porovnaní s myšami, ktorým bola očkovaná kontrolná nekódu·! júca DNA. Myši očkované NP DNA boli kompletne chránené pred smrťou, vykazovali znížené úbytky telesnej hmotnosti a nižšie vírusové zaťaženie v pľúcach v porovnaní s kontrolnými myšami. Množstvo NP DNA potrebné na ochranu myši a na zníženie úbytku telesnej hmotnosti bolo stanovené na <6,25 gg na jednu injekciu pri počte troch injekcií DNA (obr. 24). Ochrana poskytovaná očkovaním NP DNA trvala u očkovaných myší bez významných zmien po dobu najmenej 3 mesiacov. Hladina obranných látok pretrvávala do 6-tich mesiacov, ale mierne sa znižovala medzi 3. a 6. mesiacom po poslednom očkovaní. Avšak jediná injekcia NP DNA opakovaná v 22. týždni, t.j. tri týždne pred infekciou v 25. týždni, obnovila plnú ochranu (obr. 25). Toto očkovanie myši NP DNA vytvorilo dlhodobú, zvyšovateľnú heterológnu obranu. Schopnosť vytvo; riť predchorobnú odpoveď pri revakcinácii týchto zvierat ! naznačuje, že imunologická pamäť bola indukovaná očkovaním j NP DNA.

i

I i b) Fretky: Fretky sú všeobecne používaným modelom na infekí ciu ľudskou chrípkou, pretože sú citlivé na infekciu veľkou e

škálou izolátou ľudských chrípkových vírusov. Replikácia vírusu u fretiek prebieha predovšetkým v nozdrách a tracheách, v menšej miere tiež v pľúcach, na rozdiel od myší, . u ktorých dochádza k značnému zaťaženiu pľúc vírusmi. Infekcia u fretiek sa dá ľahko pozorovať titráciou vírusu v nosi nom výplachu u fretiek. Fretky imunizované NP DNA alebo Ml

DNA, samostatnou alebo v kombinácii, z kmeňa získaného v nedávnej dobe od ľudí (A/Beijing/89, H3N2) vykazovali značné zníženie šírenia vírusu v dňoch 1 až 6 od infekcie izolátu z terénu, A/Georgia/93 (H3N2) (obr. 26). U tohto í izolátu z terénu došlo k antigénnemu driftu od kmeňa typu

A/Beijing/89, takže patentovaná vakcína proti A/Beijing/89 poskytovala ľuďom len malú alebo žiadnu ochranu proti ochoI reniu spôsobenému A/Georgia/93. Fretky očkované DNA kódujúcou vnútorné proteíny z A/PR/34 vykazovali značné šírenie •j vírusu v nosnom výplachu 5. a 6. deň po infekcii rovnakým ä

| kmeňom A/PR/34 (obr. 27). Zníženie šírenia vírusu bolo pozod rované po infekcii A/Georgia/93 krátko po nej aj v dlhšom časovom odstupe, zatiaľ čo u nákazy A/PR/34 bolo pozorované neskoré zníženie šírenia vírusu, čo mohlo byť spôsobené rozdielnou virulenciou týchto dvoch kmeňov pre fretky.

2. Homológna (homotypická, typovo špecifická) obrana bola ľahko zistiteľná tak u myší ako aj u fretiek očkovaných HA DNA.

a) Myši: BALB/c myši očkované HA DNA (A/PR/34) boli plne chránené proti nákaze LD^q z A/PR/34. U očkovaných myší sa po infekcii neobjavovalo ani úmrtie (obr. 28), ani úbytky telesnej váhy vyššie než 5 % (obr. 29), zatiaľ čo 90 až 100 % kontrolných myší umieralo a vykazovalo veľké straty telesj. nej hmotnosti. Titrácia dávok HA DNA potrebných na dosiahnuí tie ochrany ukázali, že tri injekcie obsahujúce 1 pg HA DNA boli dostatočné na dosiahnutie plnej ochrany (obr. 30).

B ' b) Fretky: Fretky očkované DNA kódujúcou HA z A/PR/34 mali |i značne nižšie šírenie vírusu 1. až 6. deň po nákaze homológlí nou infekciou než fretky, ktorým bola očkovaná kontrolná DNA (obr. 31). Podobne fretky očkované A/Georgia/93 HA DNA mali 1. deň a potom 3. až 7. deň znížené šírenie vírusu po infek. cii homológnym kmeňom (obr. 32). U oboch príslušných kmeňov bola v sére všetkých očkovaných fretiek pozorovaná prítom₅ nosť Hl protilátok proti týmto kmeňom (vide supra). Tak očkovanie HA DNA vytvorilo homológnu ochranu.

3. Kombinácia vakcín: Na fretkách bola otestovaná schopnosť HA DNA poskytnúť rozsiahlu ochranu, ak je táto kombinovaná ! s NP a Ml DNA. i _ . i

a) Šírka ochrany proti variantom s antigénnym driftom: antigénny drift, ku ktorému došlo medzi kmeňmi A/Beijing/89 a A/Beijing/92, mal taký rozsah, že ľudia očkovaní vakcínou obsahujúcou A/Beijing/89 neboli chránení proti ochoreniu spôsobenému kmeňom A/Beijing/92. S Severnej Amerike bolo rozšírenie ochorenia spôsobené A/Beijing/92 podobnému izolátom z terénu, napríklad A/Georgia/93. Izoláty zo Severnej Ameriky majú antigény podobné kmeňu typu A/Beijing/92, ale líšia sa geografickým miestom izolácie a históriou pasážovania, pretože boli pasážované skôr v cicavčích organizmoch než v kuracích zárodkoch. Pokiaľ ide o aminosekvenciu HA sú však kmene podobné A/Beijing/92 odlišné od kmeňov A/Beijing/89 len v 11 bodových mutáciách (polohy 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190, 191, 193, 226 a 262) v oblasti HA1. Snažili sme sa teda určiť, či by kombinovanie homotypických imunitných odpovedí indukovaných HA DNA s krížom reagujúcimi odpoveďami CMI indukovanými DNA pre NP a Ml poskytovalo vyšší stupeň ochrany proti variantom s antigénnym driftom. Očkovanie fretiek patentovanými vakcínami obsahujúcimi kmeň A/Beijing/89 alebo s HA DNA buď z A/Beijing/89 alebo izolát z terénu podobný Beijing 89 (A/Hawaii/91) prinieslo zníženie šírenia vírusu po infekcii fretiek A/Georgia/93 (obr. 33). U fretiek, ktoré boli očkované kombinovanou PNV obsahujúcou NP, Ml a HA DNA sa významnou mierou znížilo šírenie vírusu v porovnaní s fretkami očkovanými dosiaľ patentovanou vakcínou alebo vakcínou obsahujúcou samotnú HA DNA (obr. 34). V prípade HA DNA z A/Hawaii/91 kombinovanej s NP a Ml DNA z A/Beijing/89 nebola výsledná ochrana výrazne odlišná od maximálnej ochrany poskytovanej homológnou HA DNA z A/Georgia/93 (obr; 35). Tak kombinácia HA, NP a Ml DNA poskytovala zvýšenú ochranu

proti variantom s patentované vakcíny.	antigénnym	driftom vzhľadom	na dosiaľ
b) Účinok	histórie	pasážovania	antigénu vakcíny:	fretky,
ktoré boli	očkované	vakcínou obsahujúcou sekvencie HA DNA
odvodené z	izolátu	z terénu z	USA pasážovaného	v bunkách

MDCK v tkanivovej kultúre (A/Hawaii/91) preukazovali nižšie

I (p=0,021 dvoj cestným ANOVA testom) šírenie vírusu než fretky, ktorým bola podaná patentovaná vakcína obsahujúca usmrtené vírusy A/Beijing/89 pasážované v kuracích zárodkoch po nákaze kmeňom A/Georgia/93 s antigénnym driftom (obr. 35). Oproti tomu fretky, ktorým bola aplikovaná HA DNA z A/Beijing/89, neukazovali odlišné šírenie vírusu (p=0,058) po nákaze A/Georgia/93 v porovnaní s fretkami, ktorým bola aplikovaná dosiaľ patentovaná vakcína obsahujúca rovnaký vírus. Kmene pestované na kuracích zárodkoch a pasážované v cicavcoch sa líšia v dvoch oblasť HA (pozícia 186 a v antigénnom mieste B blízko bodových mutáciách v HA1 časti 193), ktoré sú obe umiestnené vrcholu HA monoméru v oblasti, ktorá je pravdepodobne dôležitá pre väzbu Hl a neutralizujú cich protilátok. V niektorých prípadoch je schopnosť niekto rých izolátov ľudskej chrípky viazať sa na kurací RBC spočiatku veľmi nízka, ale zvýši sa následným pasážovaním v kuracích zárodkoch, čo môže znamenať, že oblasť HA pre väzbu receptora môže prechádzať rastom vo vtáčích bunkách značnou selekciou. Vplyv malých sekvenčných variácií na úči nok chrípkových vakcín založených na HA na laboratórne zvieratá podtrhuje možnú dôležitú požiadavku držať sa pri príprave vakcíny čo najbližšie sekvencii divokého¹ typu vírusu.

c) Primáty nepríbuzné človeku: Primáty nepríbuzné človeku nie sú pre svoje nízke klinické odpovede na infekciu všeobecne používané ako modely pre chrípkové nákazy. My sme však preskúmali imunogenicitu kombinácie vakcíny PNV u primátov nepríbuzných človeku v porovnaní s dosiaľ patentovanými vakcínami obsahujúcimi usmrtený vírus. Titer protilátok vyvolaných kombináciou PNV obsahujúcej gény pre HA a vnútorné proteíny bol prinajmenšom totožný s titrom Hl protilátok a s dĺžkou odpovede (vide supra).

Africké zelené opice, ktoré boli očkované PNV odpovedali na HA PNV pre varianty s antigénnym driftom, čím sa ukázalo, že typovo-špecifické odpovede na PNV môžu byť vytvorené u vopred očkovaných subjektov.

Opice, ktoré boli očkované PNV, taktiež odpovedali na následné očkovanie konvenčnými vakcínami s usmrtenými vírusJ mi .

4. Záver: Polynukleotidové vakcíny proti chrípke sú účinné na modeloch laboratórnych zvierat pre chrípkové ochorenia. Homológna ochrana môže byť dosiahnutá použitím DNA vektorov kódujúcich HA najskôr imunologickými mechanizmami analogickými s mechanizmami indukovanými HA proteínom použitým v súčasnej dobe používaných chrípkových vakcínach. Heterológna ochrana môže byť dosiahnutá proti kmeňom s antigénnym driftom aj posunom taktiež súčasným použitím DNA kódujúcou konzervované vnútorné proteíny chrípkových vírusov. Kombinácia týchto prístupov v jedinom očkovaní poskytuje v porovnaní so súčasnými patentovanými vakcínami zvýšenú ochranu proti variantom s antigénnym shiftom aj driftom v modeloch na fretkách.

Príklad 15

Príprava VÍR vektora

V snahe pokračovať v optimalizácii základných vektorov na očkovanie sme pripravili derivát VIJns, ktorý bol navrhnutý ako VÍR. Účelom konštrukcie tohto vektora bolo získať očkovací vektor o minimálnej veľkosti, t.j. bez nevyhnutných sekvencii DNA, ktorý by si stále ponechával celkové vlastnosti na expresiu rôznorodých génov a rovnaké výťažky plazmidu ako boli získané u V1J a VIJns. Na základe literatúry a vlastných zistení sme určili, že (1) oblasť v základnej kostre pUC, obsahujúce počiatok replikácie v E. coli môže byť odstránená bez toho, aby to nejako ovplyvnilo výťažok plazmidu v baktériách, (2) oblasť 3’-génu kan^r nasledujúca po otvorenom čítacom rámci pre kanamycín môže byť taktiež odstránená a namiesto nej vložený terminačný kodón pre baktérie a že (3) = 300 bp z 3’-polovice terminačného kodónu BGH môže byť odstránených bez toho, aby bola ovplyvnená jeho regulačná funkcia (nasledujúca po pôvodnom mieste pre reštrikčný enzým KpnI v rámci časti BGH).

VÍR bol skonštruovaný za použitia techník PCR na syntézu troch fragmentov DNA z VIJns reprezentujúcich CM/intA promótor/BGH terminátor, počiatok replikácie a prvky rezistencie na kanamycín. Ku každému koncu segmentu boli za použitia PCR oligomérov pridané unikátne miesta pre reštrikčné enzýmy: SspI a Xhol pre CMVintA/BGH, EcoRI a BamHI pre gén kan^r a Beli a Sali pre ori^r. Tieto miesta pre reštrikčné enzýmy boli vybraté, pretože umožňujú priamu ligáciu každého tohto DNA segmentu odvodeného PCR s následnou stratou každého tohto miesta: EcoRI a SspI zanechávajú DNA so zarovnanými koncami, ktoré sú kompatibilné pre ligáciu, zatiaľ čo BamHI a Beli zanechávajú komplementárne presahujúce konce ako Sali a Xhol. Po obdržaní týchto segmentov technikami PCR bol každý segment štiepený príslušnými reštrikčnými enzýmami uvedenými vyššie a potom boli segmenty ligované spolu v jednoduchej reakčnej zmesi obsahujúcej všetky tri segmenty DNA. 5’-koniec ori^r bol navrhnutý tak, aby obsahoval T2 rho nezávislú sekvenciu terminátora, ktorá sa normálne v tejto oblasti vyskytuje, aby poskytoval informáciu na termináciu génu na rezistenciu na kanamycín. Ligovaný produkt bol potvrdený digesciou reštrikčným enzýmom (> 8 enzýmov) a sekventovaním DNA v miestach ligačných spojov. Výťažky DNA plazmidov a heterológnej expresie za použitia vírusových génov v rámci VÍR sa zdajú byť podobné výťažkom u VIJns. Čistá dosiahnutá redukcia s veľkosťou vektora bola 1346 bp (VIJns = 4,86 kb; VÍR = 3,52 kb), viď obr. 36, SEKV.ID:45:.

Sekvencie PCR oligoméru použitého na syntézu VÍR (reštrikčné miesta sú podtrhnuté a vyznačené v zátvorke zá sekvenciou):

(1) 5’-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3’ [SspI]

SEKV.ID:60:, (2) 5’-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC >ACC -3’ [Xhol]

SEKV.ID:61:, (pre CMVintA/BGH segment) ^! (3) 5’-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC-3’ [EcoRI] ‘

SEKV.ID:62:, (4) 5’-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3’ [BamHI]

SEKV.ID:63:, (pre segment génu na rezistenciu na kanamycín) (5) 5’-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG-3’ [Beli]

SEKV.ID:64:, (6) 5’-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3’ [Sali]

SEKV.ID:32:

(pre počiatok replikácie v E. coli)

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie (i) Žiadateľ: Donnelly John J.

Dwarki Varavani J

Liu Margarét A. Montgomery Donna L.

Parker Suezanne E

Shiver John V.

(ii) Názov vynálezu: Konštrukcie DNA, obsahujúce nukleovú kyselinu (iii) Počet sekvencii: 64 (iv) Adresa na korešpondenciu:

(A)	Adresát:	Merck &	Co. ,	Inc
(B)	Ulica:	P.0.Box	2000
(C)	Mesto:	Rahway
(D)	Štát:	New Yersey
(E)	Kraj ina:	Spoj ené	štáty	americké
(F)	PSČ:	07065

(v) Počítačový formát:

(A) Typ média: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Oper, systém:PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Pantentln Release # 1.0.

.:

!!

verzia # 1.25

(vi)	Údaj e	súčasnej prihlášky:
	(A)	Číslo prihlášky:
	(B)	Dátum registrácie:
	(C)	Klasifikácia:
(vii)	Údaj e	o predchádzaj úcej pr	ihláške:
	(A)	Číslo prihlášky: US	08/089,985
	(B)	Dátum registrácie: 8	. júla 1993
(viii)	Informácie o právnom zástupcovi/agentovi:
	(A)	Meno:	Bencen Gerard
	(B)	Registračné číslo:	35,746
	(C)	Odkazové/jedn. číslo	: 18972Y

(ix) Informácie o spojení:

	(A)	Telefón:	(908)	594 -	3901
	(B)	Telefax:	(908)	594 -	4720
(2)	Informácie o SEKV.ID.	Č. 1:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	18 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 1:

GTGTGCACCT CAAGCTGG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 2:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	23 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	j eden
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie

(iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 2:

CCCTTTGAGA ATGTTGCACA TTC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 3:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	33 párov	báz
(B)	typ;	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 3:

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 4:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	36 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: áno (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 4:

Ί

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC

(2)	Informácie	o SEKV.ID. Č. 5:
	(i)	Charakteristika sekvencie:
		(A)	dĺžka:	23 párov	báz
		(B)	typ:	nukleová	kyselina
		(C)	počet reťazcov:	j eden
		(D)	topológia:	lineárna

J i	(ii)	Typ molekuly:	cDNA
í J	(iii)	Hypotetická:	nie
1	(iv)	Pozitívna:	nie
	(ix)	Opis sekvencie	SEKV.ID. Č. 5

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 6:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	30 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: áno (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 6:

P.

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 39 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jeden (D) topológia: lineárna

	(ii)	Typ molekuly:	cDNA
a	(iii)	Hypotetická :	nie
	(iv)	Pozitívna:	nie
	(ix)	Opis sekvencie	:: SEKV.ID. Č. 7

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC	39
(2)	Informácie o SEKV.ID.	Č. 8:
	(i) Charakteristika	sekvencie:
	(A) dĺžka:	39 párov	báz
	(B) typ:	nukleová	kyselina

(C) počet reťazcov: jeden (D) topológia: lineárna

(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	áno
(ix)	Opis sekvencie	SEKV.ID. Č. 8

GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC 39 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 9:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	9 aminokyselín
(B)	typ:	aminokyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: peptid

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (v) Typ fragmentu: vnútorný (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 9:

Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val 1 5 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 10:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	4432	párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č.	10:

TCGCGCGTTT	CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	60
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	TCAGCGCGTG	120
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTGG	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC	180·
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAAŤACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300'

í

TCCAACATTA	CCGCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
CGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATGGA	gttccgcgtt	ACATAACTTA	CGGTÄAATGG	' 420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	ACTTTCCTAC	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATC	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCAŤTGA	780
CGTCAATGGG	AGTTTGTTTT	GGCACCAAAA	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	GTCGTAACAA	840
CTCCGCCCCA	TTGACGCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAGGTCT	ATATAAGCAG	900
AGCTCGŤTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	. 960
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTGGC	1080
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	gctctttgcc	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680
GGCAGAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAGGGCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTGCTGCCGC	1800
GCGCGCCACC	ACACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGGGTCTTTT	1860
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCÄGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACCCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG	CGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
GCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	2160
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTCG	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG	2400

	TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	2460
	CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
	TCCACÁGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
	AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	2640
	CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
	CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	2760
	GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
	AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
	GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	2940
	CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
•	GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060
-	TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
*	TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	3180
•	CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	3240
	TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
«	TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AÄATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
	TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTCTATTT	3420
	CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCCCGTC	GTGTAGATAA	CTACGATACG	GGAGGGCTTA	3480
	CCATCTGGCC	CCAGTGCTCC	AATGATACCG	CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	3540
	TCAGCAATAA	ACCAGCCAGC	CGGAAGGGCC	GAGCGCAGAA	GTGGTCCTGC	AACTTTATCC	3600
t	GCCTCCATCC	AGTCTATTAA	TTGTTGCCCG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	3660
<	AGTTTGCGCA	ACGTTGTTGC	CATTGCTACA	GGCATCGTGG	TGTCACGCTC	gtcgtttggt	3720
	ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAAGGCGAG	TTACATGATC	CCCCATGTTG	3780
	TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCCT	CCGATCGTTG	TCAGAAGTAA	GTTGGCCGCA	3840
	GTGTTATCAC	TCATGGTTAT	GGCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTGTCAT	GCCATCCGTA	3900
-	AGATGCTTTT	CTGTGACTGG	TGAGTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTCTATGCGG	3960
	CGACCGAGTT	gctcttgccc	GGCGTCAATA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	TAGCAGAACT	4020
	TTAAAAGTGC	TCATCATTGG	AAAACGTTCT	TCGGGGCGAA	AACTCTCAAG	GATCTTACCG	4080
	CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GTAACCCACT	CGTGCACCCA	ACTGATCTTC	AGCATCTTTT	4140
i	actttcacca	GCGTTTCTGG	GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	4200
	ATAAGGGCGA	CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC	4260
	ATTTATCAGG	gttattgtct	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	GAAAAATAAA	4320
	CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	CTGACGTCTA	AGAAACCATT	4380

ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATACG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TC

4432

(2) Informácie o SEKV.ID. Č. 11:

(i) Charakteristika sekvencie: 2196 párov báz nukleová kyselina dva oba

(A)	dĺžka:
	(B)	typ:
	(C)	počet r	eťazcov
	(D)	topológia:
(ii)	Typ	molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie

(ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 11:

	ATTGGCTATT	GGCCATTGCA	TACGTTGTAT	CCATATCATA	ATATGTACAT	TTATATTGGC	60
*	TCATGTCCAA	CATTACCGCC	ATGTTGACAT	TGATTATTGA	CTAGTTATTA	ATAGTAATCA	120
	ATTACGGGGT	CATTAGTTCA	TAGCCCATAT	ATGGAGTTCC	GCGTTACATA	ACTTACGGTA	180
i	AATGGCCCCC	CTGGCTGACC	GCCCAACGAC	CCCCGCCCAT	TGACGTCAAT	AATGACGTAT	240
	GTTCCCATAG	TAACGCCAAT	AGGGACTTTC	CATTGACGTC	AATGGGTGGA	GTATTTACGG	300
	TAAACTGCCC	ACTTGGCAGT	ACATCAAGTG	TATCATATGC	CAAGTACGCC	CCCTATTGAC	360
	GTCAATGACG	GTAAATGGCC	CGCCTGGCAT	TATGCCCAGT	ACATGACCTT	ATGGGACTTT	420
	CCTACTTGGC	AGTACATCTA	CGTATTAGTC	ATCGCTATTA	CCATGGTGAT	GCGGTTTTGG	480
	CAGTACATCA	ATGGGCGTGG	ATAGCGGTTT	GACTCACGGG	GATTTCCAAG	TCTCCACCCC	S40
	ATTGACGTCA	ATGGGAGTTT	GTTTTGGCAC	CAAAATCAAC	GGGACTTTCC	AAAATGTCGT	600
	AACAACTCCG	CCCCATTGAC	GCAAATGGGC	GGTAGGCGTG	TACGGTCGGA	GGTCTATATA	660
	AGCAGAGCTC	GTTTAGTGAA	CCGTCAGATC	GCCTGGAGAC	GCCATCCACG	CTGTTTTGAC	720
	CTCCATAGAA	GACACCGGGA	CCGATCCAGC	CTCCGCGGCC	GGGAACGGTG	CATTGGAACG	780
♦	CGGATTCCCC	GTGCCAAGAG	TGACGTAAGT	ACCGCCTATA	GAGTCTATAG	GCCCACCCCC	840
	TTGGCTTCTT	ATGCATGCTA	TACTGTTTTT	GGCTTGGGGT	CTATACACCC	CCGCTTCCTC	900
	ATGTTATAGG	TGATGGTATA	GCTTAGCCTA	TAGGTGTGGG	TTATTGACCA	TTATTGACCA	960
	CTCCCCTATT	GGTGACGATA	CTTTCCATTA	CTAATCCATA	ACATGGCTCT	TTGCCACAAC	1020
	TCTCTTTATT	GGCTATATGC	CAATACACTG·	TCCTTCAGAG	ACTGACACGG	ACTCTGTATT	1080
	TTTACAGGAT	GGGGTCTCAT	TTATTATTTA	CAAATTCACA	TATACAACAC	CACCGTCCCC	1140
	AGTGCCCGCA	GTTTTTATTA	AACATAACGT	GGGATCTCCA	CGCGAATCTC	GGGTACGTGT	1200
	TCCGGACATG	GGCTCTTCTC	CGGTAGCGGC	GGAGCTTCTA	CATCCGAGCC	CTGCTCCCAT	1260
	GCCTCCAGCG	ACTCATGGTC	GCTCGGCAGC	TCCTTGCTCC	TAACAGTGGA	GGCCAGACTT	1320
	AGGCACAGCA	CGATGCCCAC	CACCACCAGT	GTGCCGCACA	AGGCCGTGGC	GGTAGGGTAT	1380
	GTGTCTGAAA	ATGAGCTCGG	GGAGCGGGCT	TGCACCGCTG	ACGCATTTGG	AAGACTTA-AG	1440

GCAGCGGCAG	AAGAAGATGC	AGGCAGCTGA	GTTGTTGTGT	TCTGATAAGA	GTCAGAGGTA	1500
ACTCCCGTTG	CGGTGCTGTT	AACGGTGGAG	GGCAGTGTAG	TCTGAGCAGT	ACTCGTTGCT	1560
GCCGCGCGCG	CCACCAGACA	TAATAGCTGA	CAGACTAACA	GACTGTTCCT	TTCCATGGGT	1620
CTTTTCTGCA	GTCACCGTCC	TTAGATCTGC	TGTGCCTTCT	AGTTGCCAGC	CATCTGTTGT	1680
TTGCCCCTCC	CCCGTGCCTT	CCTTGACCCT	GGAAGGTGCC	ACTCCCACTG	TCCTTTCCTA	1740
ATAAAATGAG	GAAATTGCAT	CGCATTGTCT	GAGTAGGTGT	CATTCTATTC	TCGGGGGTGG	1800
GGTGGGGCAG	CACAGCAAGG	GGGAGGATTG	GGAAGACAAT	AGCAGGCATG	CTGGGGATGC	1860
GGTGGGCTCT	ATGGGTACCC	AGGTGCTGAA	GAATTGACCC	GGTTCCTCCT	GGGCCAGAAA	1920
GAAGCAGGCA	CATCCCCTTC	TCTGTGACAC	ACCCTGTCCA	CGCCCCTGGT	TCTTAGTTCC	1980
AGCCCCACTC	ATAGGACACT	CATAGCTCAG	GAGGGCTCCG	CCTTCAATCC	CACCCGCTAA	2040
AGTACTTGGA	GCGGTCTCTC	CCTCCCTCAT	CAGCCCACCA	AACCAAACCT	AGCCTCCAAG	2100
AGTGGGAAGA	AATTAAAGCA	AGATAGGCTA	TTAAGTGCAG	AGGGAGAGAA	AATGCCTCCA	2160
ACATGTGAGG	AAGTAATGAG	AGAAATCATA	GAATTC			2196

(2)

Informácie o SEKV.ID. Č. 12:

i'

(i)	Charakteristika sekvencie:
(A)	dĺžka:	71 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	j eden
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ '	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 12:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA 40

TAATCACTCA CTGAGTGACA TCAAAATCAT G 71 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 117 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: dva (D) topológia: oba

I

j (ii)	Typ molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
Í (iv)	Pozitívna: nie
’ (ix)	Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 13

ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT 40

TGAATGGATG TCAATCCGAC CTTACTTTTC TTAAAAGTGC 80

CAGCACAAAA TGCTATAAGC ACAACTTTCC CTTATAC 117 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 14:

(i) Charakteristika sekvencie:

136 párov báz nukleová kyselina dva oba

	(A)	dĺžka:
	(B)	typ:
	(C)	počet	reťazcov
	(D)	topológia:
(ii)	Typ	molekuly	: cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie

(ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 14:

Í' . GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC40

AAAAACATAA TGGATCCAAA CACTGTGTCA AGCTTTCAGG80

TAGATTGCTT TCTTTGGCAT GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA120

CCAAGAACTA CGTGAT (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 15:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 152 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: dva (D) topológia: oba

(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	:: SEKV.ID. Č. 15

TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG AGCAAAAGCA40

GGGGAAAATA AAAACAACCA AAATGAAGGC AAACCTACTG80

GTCCTGTTAA GTGCACTTGC AGCTGCAGAT GCAGACACAA120

TATGTATAGG CTACCATGCG AACAATTCAA CC152 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 16:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	162 párov báz
	(B)	xyp:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 16:

TTTTCTGCAG TCACCGTCCT TAGATCCCGA ATTCCAGCAA 40

AAGCAGGTCA ATTATATTCA ATATGGAAAG AATAAAAGAA. 80

CTAAGAAATC TAATGTCGCA GTCTGCCACC CCGGAGATAC 120

TCACAAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT 162 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 17:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	122 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 17:

TCGAAACGTA CGTACTCTCT ATCATCCCGT CAGGCCCCCT 80

CAAAGCCGAG ATCGCACAGA GACTTGAAGA GTTGACGGAA GA 122

- 93 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 18:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	4864 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 18:

TCGCGCGTTT	CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	60
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGCCCCCG	TCAGCGGGTC	120
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTCG	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC	180
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAATACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300
TCCAACATTA	CCGCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
GGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	CGGTAAATGG	420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACCGTAAA	TGGCCCGCCT	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	ACTTTCCTAC	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780
CGTCAATGGG	AGTTTGTTTT	GGCACCAAAA	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	GTCGTAACAA	840
CTCCGCCCCA	TTGACCCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAGGTCT	ATATAAGCAG	900
AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	960
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTCCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTCG·.?	10$·'.'
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200

CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	ČCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680
GGCAGAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAGGGCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTGCTGCCGC	1800
GCGCGCCACC	AGACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGGGTCTTTT	1860
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACCCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
GCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	2160
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTŤCTTA	GTTCCAGCCC	.2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGCA.AGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATC	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	24 60
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	2640
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	27 60
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	2940
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060

	TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
j	TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCACATTACG	3180
í	CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	3240
1	TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
	TAGATCCTTT	TAAATTAÁAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
	TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTCTATTT	3420
	CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCGGGGG	GGGGGGGCGC	TGAGGTCTGC	CTCGTGAAGA	3480
	AGGTGTTGCT	GACTCATACC	AGGCCTGAAT	CGCCCCATCA	TCCAGCCAGA	AAGTGAGGGA	3540
	GCCACGGTTG	ATGAGAGCTT	TGTTGTAGGT	GGACCAGTTG	GTGATTTTGA	acttttgctt	3600
* »	TGCCACGGAA	CGGTCTGCGT	TGTCGGGAAG	ATGCGTGATC	TGATCCTTCA	ACTCAGCAAA	3660
	AGTTCGATTT	ATTCAACAAA	GCCGCCGTCC	CGTCAAGTCA	GCGTAATGCT	CTGCCAGTGT	3720
•	TACAACCAAT	TAACCAATTC	TGATTAGAAA	AACTCATCGA	GCATCAAATG	AAACTGCAAT	3780
	TTATTCATAT	CAGGATTATC	AATACCATAT	TTTTGAAAAA	gccgtttctg	TAATGAAGGA	3840
	GAAAACTCAC	CGAGGCAGTT	CCATAGGATG	GCAAGATCCT	GGTATCGGTC	TGCGATTCCG	3900
1	actcgtccaa	CATCAATACA	ACCTATTAAT	TTCCCCTCGT	CAAAAATAAG	GTTATCAAGT	3960
1 t j	GAGAAATCAC	CATGAGTGAC	GACTGAATCC	GGTGAGAATG	GCAAAAGCTT	ATGCATTTCT	4020
!	TTCCAGACTT	GTTCAACAGG	CCAGCCATTA	CGCTCGTCAT	CAAAATCACT	CGCATCAACC	4080
	AAACCGTTAT	TCATTCGTGA	TTGCCCCTGA	GCGAGACGAA	ATACGCGATC	GCTGTTAAAA	4140
	GGACAATTAC	AAACAGGAAT	CGAATGCAAC	CGGCGCAGGA	ACACTGCCAG	CGCATCAACA	4200
	ATATT.TTCAC	CTGAATCAGG	ATATTCTTCT	AATACCTGGA	ATGCTGTTTT	CCCGGGGATC	4260
	GCAGTGGTGA	GTAACCATGC	ATCATCAGGA	GTACGGATAA	AATGCTTGAT	GGTCCGAAGA	4320
	GCCATAAATT	CCGTCAGCCA	GTTTAGTCTG	ACCATCTCAT	CTGTAACATC	ATTGGCAACG	4380
	CTACCTTTGC	CATGTTTCAG	AAACAACTCT	GGCGCATCGG	GCTTCCCATA	CAATCGATAG	4440
	ATTGTCCCAC	CTGATTGCCC	GACATTATCG	CGAGCCCATT	TATACCCATA	TAAATCAGCA	4500
-	TCCATGTTGG	AATTTAATCG	CGGCCTCGAG	CAAGACGTTT	CCCGTTGAAT	ATGGCTCATA	4560
	ACACCCCTTG	TATTACTGTT	TATGTAAGCA	GACAGTTTTA	TTGTTCATGA	TGATATATTT	4620
	TTATCTTGTG	CAATGTAACA	TCAGAGATTT	TGAGACACAA	CGTGGCTTTC	cccccccccc	4680
	CATTATTGAA	GCATTTATCA	GGGTTATTGT	CTCATGAGCG	GATACATATT	TGAATGTATT	4740
	TAGAAAAATA	AACAAATAGG	GGTTCCGCGC	ACATTTCCCC	GAAAAGTGCC	ACCTGACGTC	4800
	TAAGAAACCA	TTATTATCAT	GACATTAACC	TATAAAAATA	GGCGTATCAC	GAGGCCCTTT	4860

4864

CCTC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 19:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	15 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárny
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 19:

AGCAGAAGCA GAGCA (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 20:

(i)	Charakteristika sekvencie:
(A)	dĺžka:	119 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 20:

TCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT GAGTGACATC AAAATCATGG CGTCCCAAGG CACCAAACGG TCTTATGAAC AGATGGAAAC TGATGGGGAA CGCCAGATT

119 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 21:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:		67 párov	báz
	(B)	typ:		nukleová	kyselina
	(C)	počet	reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly	: cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	áno

I (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 21:

GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATATTTT TTCCTTAATT GTCGTAC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 22:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	15 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: áno (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 22:

AGCAGAAGCA CGCAC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 23:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	15 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 23:

AGCAGAAGCA CAGCA (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: dva (D) topológia: oba

F

Ĺ t’ r'

I •a

	- 98 -
(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	>: SEKV

CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 25:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	36 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: áno
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 25:

i GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 26:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	102 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	: dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 26:

ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT TCTAATATCC 40 ACAAAATGAA GGCAATAATT GTACTACTCA TGGTAGTAAC 80 ATCCAACGCA GATCGAATCT GC 1θ (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 27:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	42 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: áno
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 27:

ggcacagcag ATCTTTCAAT AACGTTTCTT tgtaatggta ac (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 28:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	23 párov	báz
(B)	typ;	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 28:

CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG (2) Informácie o SEKV.ID. Č.' 29:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	18 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: áno (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 29:

GGAGTGGCAC CTTCCAGG ίόο -

u i

(2) Informácie o SEKV.ID. Č. 30:

(i)

Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	12 párov	báz
	(B)	typ:		nukleová	kyselina
	(C)	počet r	eťazcov:	jeden
	(D)	topológia:	lineárna
(ϋ)	Typ	molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 30:

agcaaaagca gg (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 31:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	14 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

t- (iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 31:

agcagaagcg gagc

Č. 32:

(2) Informácie o SEKV.ID.

1	(i)	Charakteristika sekvencie:
		(A)	dĺžka:	35 párov
		(B)	typ:	nukleová
		(C)	počet reťazcov:	j eden a i
		(D)	topológia:	lineárna
,Ί	(ii)	Typ	molekuly: cDNA
	(iii)	Hypotetická: nie
	(iv)	Pozitívna: nie
Λ í	(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 32
ť r	CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG

báz kyselina dva

101 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 33:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	33 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	j eden a d va
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 33:

GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 34:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	37 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a <	dva
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 34:

CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG 37 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 35:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 38 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jeden a dva (D) topológia: lineárna

(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	: SEKV.ID. Č. 35

GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG

102 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 36:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	32 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	j eden a <	dva
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 36

CCACATTCAG ATGCATATTC TACACTGCAA AG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 37:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	36 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a i	dva
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 37:

GGTACAACCA TGAAGGCAAT AATTGTACTA CTCATG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 38:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	36 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a i	dva
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie j (iv) Pozitívna: nie j (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 38: J i

CCACATTTAT AGACAGATGG AGCAAGAAAC ATTGTC 36 : - io3 :'ί j (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 39:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	33 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	j eden a i	dva
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 39

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC

(2) Informácie	o SEKV.ID. Č. 40
(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	36 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	jeden a <	dva
	(D)	topológia:	lineárna
(ii)	Typ molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 40
CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC	36

(2)	Informácie	o SEKV.ID. Č. 41
	(i)	Charakteristika sekvencie:
		(A)	dĺžka:	39 párov	báz
		(B)	typ:	nukleová	kyselina
		(C)	počet reťazcov:	jeden a <	dva
		(D)	topológia:	lineárna
	(ii)	Typ	molekuly: cDNA
	(iii)	Hypotetická: nie
	(iv)	Pozitívna: nie
	(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 41

GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGGC

104 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 42:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	39 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a <	dva
(D)	topológia:	lineárna
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 42:

CCACATGGAT CCTTAATAAT CGAGGTCATC ATAATCCTC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 43:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	42 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a <	dva
(D)	topológia:	lineárna
(ϋ) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 43:

GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG CC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 44:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 38 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jeden a dva (D) topológia: lineárna

(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	: SEKV.ID. Č. 44

CCACATGGAT CCTTATAGGT ATTTCTTCAC AAGAGCTG

105

f (2)	Informácie	o SEKV.ID. Č. 45:
	(i)	Charakteristika sekvencie:
>		(A)	dĺžka:	3553 párov báz
		(B)	typ:	nukleová kyselina
		(C)	počet reťazcov:	dva
		(D)	topológia:	oba

(ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie

(ix) GATATTGGCT GGCTCATGTC	Opis sekvencie:	SEKV.ID TATCCATATC CATTGATTAT	. Č. 45: ATAATATGTA TGACTAGTTA	CATTTATATT TTAATAGTAA	60 120
ATTGGCCATT ČAACATTACC	GCATACGTTG GCCATGTTGA
TCAATTACGG	GGTCATTAGT	TCATAGCCCA	TATATGGAGT	TCCGCGTTAC	ATAACTTACG	180
GTAAATGGCC	CGCCTGGCTG	ACCGCCCAAC	GACCCCCGCC	CATTGACGTC	AATAATGACG	; 240
TATGTTCCCA	TAGTAACGCC	AATAGGGACT	TTCCATTGAC	GTCAATGGGT	GGAGTATTTA	300
CGGTAAACTG	CCCACTTGGC	AGTACATCAA	GTGTATCATA	TGCCAAGTAC	GCCCCCTATT	360
GACGTCAATG	ACGGTAAATG	GCCCGCCTGG	CATTATGCCC	AGTACATGAC	CTTATGGGAC	420
TTTCCTACTT	GGCAGTACAT	CTACGTATTA	GTCATCGCTA	TTACCATGGT	GATGCGGTTT	: 480
TGGCAGTACA	TCAATGGGCG	TGGATAGCGG	TTTGACTCAC	GGGGATTTCC	AAGTCTCCAC	540
CCCATTGACG	TCAATGGGAG	TTTGTTTTGG	CACCAAAATC	AACGGGACTT	TCCAAAATGT	600
CGTAACAACT	CCGCCCCATT	GACGCAAATG	GGCGGTAGGC	GTGTACGGTG	GGAGGTCTAT	660
ATAAGCAGAG	CTCGTTTAGT	GAACCGTCAG	ATCGCCTGGA	GACGCCATCC	ACGCTGTTTT	720
GACCTCCATA	GAAGACACCG	GGACCGATCC	AGCCTCCGCG	GCCGGGAACG	GTGCATTGGA	' 780
ACGCGGATTC	CCCGTGCCAA	GAGTGACGTA	AGTACCGCCT	ATAGAGTCTA	TAGGCCCACC	840
CCCTTGGCTT	CTTATGCATG	CTATACTGTT	TTTGGCTTGG	GGTCTATACA	CCCCCGCTTC	900
CTCATGTTAT	AGGTGATGGT	ATAGCTTAGC	CTATAGGTGT	GGGTTATTGA	CCATTATTGA	960
CCACTCCCCT	ATTGGTGACG	ATACTTTCCA	TTACTAATCC	ATAACATGGC	TCTTTGCCAC	1020
AACTCTCTTT	ATTGGCTATA	TGCCAATACA	CTGTCCTTCA	GAGACTGACA	CGGACTCTGT	• 1080
ATTTTTACAG	GATGGGGTCT	CATTTATTAT	TTACAAATTC	ACATATACAA	CACCACCGTC	1140
CCCAGTGCCC	GCAGTTTTTA	TTAAÄCATGC	TAACGTGGGA	TCTCCACGCG	AATCTCGGGT	1200
ACGTGTTCCG	GACATGGGCT	CTTCTCCGGT	AGCGGCGGAG	CTTCTACATC	CGAGCCCTGC	'1260
TCCCATGCCT	CCAGCCACTC	ATGGTCGCTC	GGCAGCTCCT	TGCTCCTAAC	AGTGGAGGCC	1320
AGACTTAGGC	ACAGCACGAT	GCCCACCACC	ACCAGTGTGC	CGCACAAGGC	CGTGGCGGTA	1380
GGGTATGTGT	CTGAAAATGA	GCTCGGGGAG	CGGGCTTGCA	CCGCTGACGC	ATTTGGAAGA	1440 1
CTTAAGGCAG	CGGCAGAAGA	AGATGCAGGC	AGCTGAGTTG	TTGTGTTCTG	ATAAGAGTCA	'1500
GAGGTAACTC	CCGTTGCGGT	GCTGTTAACG	GTGGAGGGCA	GTGTAGTCTG	AGCAGTACTC	1560

106

GTTGCTGCCG	CGCGCGCCAC	CAGACATAAT	AGCTGACAGA	CTAACAGACT	GTTCCTTTCC	.1620
ATGGGTCTTT	TCTGCAGTCA	CCGTCCTTAG	ATCTGCTGTG	CCTTCTAGTT	GCCAGCCATC	1680
TGTTGTTTGC	CCCTCCCCCG	TGCCTTCCTT	GACCCTGGAA	GGTGCCACTC	CCACTGTCCT	'A740
TTCCTAATAA	AATGAGGAAA	TTGCATCGCA	TTGTCTGAGT	AGGTGTCATT	CTATTCTGGG	: 1800
GGGTGGGGTG	GGGCAGCACA	GCAAGGGGGA	GGATTGGGAA	GACAATAGCA	GGCATGCTGG	1860
GGATGCGGTG	GGCTCTATGG	GTACGGCCGC	AGCGGCCGTA	CCCAGGTGCT	GAAGAATTGA	1920
CCCGGTTCCT	CGACCCGTAA	AAAGGCCGCG	TTGCTGGCGT	TTTTCCATAG	GCTCCGCCCC	1980
CCTGACGAGC	ATCACAAAAA	TCGACGCTCA	AGTCAGAGGT	GGCGAAACCC	GACAGGACTA	2040
TAAAGATACC	AGGCGTTTCC	CCCTGGAAGC	TCCCTCGTGC	GCTCTCCTGT	TCCGACCCTG	.2100
CCGCTTACCG	GATACCTGTC	CGCCTTTCTC	CCTTCGGGAA	GCGTGGCGCT	TTCTCAATGC	'2160
TCACGCTGTA	GGTATCTCAG	TTCGGTGTAG	GTCGTTCGCT	CCÁAGCTGGG	CTGTGTGCAC	2220
GAACCCCCCG	TTCACCCCGA	CCGCTGCGCC	TTATCCGGTA	ACTATCGTCT	TGACTCCAAC	2280
CCGGTAAGAC	ACGACTTATC	GCCACTGGCA	GCAGCCACTG	GTAACAGGAT	TAGCAGAGCG	2340
AGGTATGTAG	GCGGTGCTAC	AGAGTTCTTG	AAGTGGTGGC	CTAACTACGG	CTACACTAGC	2400
TGAAGGACAG	TATTTGGTAT	CTGCGCTCTG	CTGAAGCCAG	TTACCTTCGG	AAAAAGAGTT	2460
GGTAGCTCTT	GATCCGGCAA	ACAAACCACC	GCTGGTAGCG	GTGGTTTTTT	TGTTTGCAAG	2520
CAGCAGATTA	CGCGCAGAAA	AAAAGGATCT	CAAGAAGATC	CTTTGATCTT	TTCTACGTGA	2580
TCCCGTAATG	CTCTGCCAGT	GTTACAACCA	AT-TAACCAAT	TCTGATTAGA	AAAACTCATC	'2640
GAGCATCAAA	TGAAACTGCA	ATTTATTCAT	ATCAGGATTA	TCAATACCAT	ATTTTTGAAA	2700
AAGCCGTTTC	TGTAATGAAG	GAGAAAACTC	ACCGAGGCAG	TTCCATAGGA	TGGCAAGATC	2760
CTGGTATCGG	TCTGCGATTC	CGACTCGTCC	AACATCAATA	CAACCTATTA	ATTTCCCCTC	2820
GTCAAAAATA	AGGTTATCAA	GTGAGAAATC	ACCATGAGTG	ACGACTGAAT	CCGGTGAGAA	2880
TGGCAAAAGC	TTATGCATTT	CTTTCCAGAC	TTGTTCAACA	GGCCAGCCAT	TACGCTCGTC	2940
ATCAAAATCA	CTCGCATCAA	CCAAACCGTT	ATTCATTCGT	GATTGCGCCT	GAGCGAGACG	3000
AAATACGCGA	TCGCTGTTAA	AAGGACAATT	ACAAACAGGA	ATCGAATGCA	ACCGGCGCAG	3060
GAACACTGCC	AGCGCATCAA	CAATATTTTC	ACCTGAATCA	GGATATTCTT	CTAATACCTG	3120
GAATGCTGTT	TTCCCGGGGA	TCGCAGTGGT	GAGTAACCAT	GCATCATCAG	GAGTAČGGAT	3180
AAAATGCTTG	ATGGTCGGAA	GAGGCATAAA	TTCCGTCAGC	CAGTTTAGTC	TGACCATCTC	3240
ATCTGTAACA	TCATTGGCAA	CGCTACCTTT	GCCATGTTTC	AGAAACAACT	CTGGCGCATC	3300
GGGCTTCCCA	TACAATCGAT	AGATTGTCGC	ACCTGATTGC	CCGACATTAT	CGCGAGCCCA	3360
TTTATACCCA	TATA-AATCAG	CATCCATGTT	GGAATTTAAT	CGCGGCCTCG	AGCAAGACGT	3420 1
TTCCCGTTGA	ATATGGCTCA	TAACACCCCT	TGTATTACTG	TTTATGTAAG	CAGACAGTTT	3480
TATTGTTCAT	GATGATATAT	TTTTATCTTG	TGCAATGTAA	CATCAGAGAT	TTTGAGACAC	1 3540

AACGTGGCTT TCC

3553

107 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 46:

(i) Charakteristika sekvencie:

	(A)	dĺžka:	72 párov	báz
	(B)	typ:		nukleová	kyselina
	(C)	počet	reťazcov:	: j eden a i	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly	: cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie: SEKV.	ID. Č. 46

TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT GCTTTGAGCT ACATTTTATG TCTGGTTTTC GC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 47:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	111 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 47:

TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA40

TGTGGGCCTG CCAAAAAGGC AACATTAGGT GCAACATTTG80

CATTTGAAGA TCTATGTGGG ATCGCTGTG CHl

(2)	Informácie	o SEKV.ID. Č. 48
	(i)	Charakteristika sekvencie:
		(A)	dĺžka:	63 párov	báz
		(B)	typ:	nukleová	kyselina
		(C)	počet reťazcov:	j eden a	dva
		(D)	topológia:	oba
	(ii)	Typ	molekuly: cDNA
	(iii)	Hypotetická: nie

108 (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 48:

TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTA GTCCTGTTAT GTGCATTTAC AGCTACATAT GCA (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 49:

(i)	Charakteristika sekvencie:
(A) (B)	dĺžka: typ:	102 párov báz nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Poži	tívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 49:

CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 50:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	108 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 50:

CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC40

TCATGGTAGT AACATCCAAC GCAGATCGAA TCTGCACTGG80

GATAACATCT TCAAACTCAC CTCATGTG108

I (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 51:

- 109 I (i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	102 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 51:

TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTT ATTGTTTATA40

TGGTCTCCAG AGACAATGTT TCTTGCTCCA TCTGTCTATA80

AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT102 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 52:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	84 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 52:

GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCAAGGC ACCAAACGGT40

CTTATGAACA GATGGAAACT GATGGGGAAC GCCAGAATGC AACT 84 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 53:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	108 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie

110 ι

í g

j (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 53:

I GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA

J GTAATGAAGG ATCTTATTTC TTCGGAGACA ATGCAGAAGA ! GTACGACAAT TAAGGATCTG CTGTGCCT

108 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 54:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	132 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(íi) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 54:

CTTAGATCCA GATCTACCAT GAGTCTTCTA ACCGAGGTCG40

AAACGTATGT TCTCTCTATC GTTCCATCAG GCCCCCTCAA80

AGCCGAAATC GCGCAGAGAC TTGAAGATGT CTTTGCTGGG120

AAAAACACAG AT132 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 55:

(i)	Charakteristika sekvencie:
	(A)	dĺžka:	129 párov báz
	(B)	typ:	nukleová kyselina
	(C)	počet reťazcov:	: jeden a dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 55:

GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGATGATC 40

TTCTTGAAAA TTTGCAGACC TATCAGAAAC GAATGGGGGT 80 í GCAGATGCAA CGGTTCAAGT GAAGATCTAT GTGGGATCTG 120 ,1 CTGTGCCTT 129

111 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 56:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	81 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 56:

CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA ACACTGGGAC AATTGACAAA ACACCGGAAG AAATAACTTC T (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 57:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	96 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 57:

GTTGAAATTC CAATTAAGCA GACCATCCCC AATTTCTTCT TTGGGAGGGA CACAGCAGAG GATTATGATG ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG

(2)	Informácie o SEKV.ID. Č. 58:
(i)	Charakteristika sekvencie:
		(A)	dĺžka:	96 párov	báz
		(B)	typ:	nukleová	kyselina
		(C)	počet reťazcov:	j eden a i	dva
		(D)	topológia:	oba
	(ii)	Typ	molekuly: cDNA
	(iii)	Hypotetická: nie

- Í12 (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 58:

CTTAGATCCA CCATGTCGCT GTTTGGAGAC ACAATTGCCT40

ACCTGCTTTC ATTGACAGAA GATGGAGAAG GCAAAGCAGA80

ACTAGCAGAA AAATTA (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 59:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	123 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
(D)	topológia:	oba
(ii) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 59:

AGATCTCTTG GGGCAAGTCA AGAGAATGGG GAAGGAATTG CAAAGGATGT GATGGAAGTG CTAAAGCAGA GCTCTATGGG AAATTCAGCT CTTGTGAAGA AATACCTATA AGGATCTGCT GTG (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 60:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 33 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jeden a dva (D) topológia: oba

(i i)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	: SEKV.ID. Č. 60

GGTACAAATA TTGGCTATG GCCATTGCAT ACG 33 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 61:

(i) Charakteristika sekvencie:

113

	(A)	dĺžka:	36 párov	báz
	(B)	typ:	nukleová	kyselina
	(C)	počet reťazcov:	jeden a dva
	(D)	topológia:	oba
(ii)	Typ	molekuly: cDNA
(iii)	Hypotetická: nie
(iv)	Pozitívna: nie
(ix)	Opis	sekvencie: SEKV.	ID. Č. 61

CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 62:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 38 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) počet reťazcov: jeden a dva (D) topológia: oba

(ii)	Typ molekuly:	cDNA
(iii)	Hypotetická:	nie
(iv)	Pozitívna:	nie
(ix)	Opis sekvencie	SEKV.ID. Č. 62:

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 63:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	37 párov	báz
(B)	typ:	nukleová	kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a <	dva
(D)	topológia:	oba
(ϋ) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie (ix) Opis sekvencie: SEKV.ID. Č. 63:

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC

114 (2) Informácie o SEKV.ID. Č. 64:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A)	dĺžka:	39 párov báz
(B)	typ:	nukleová kyselina
(C)	počet reťazcov:	j eden a dva
(D)	topológia:	oba
(ϋ) Typ	molekuly: cDNA

(iii) Hypotetická: nie (iv) Pozitívna: nie

Claims (25)

1. DNA konštrukcia, vyznačujúca satým, že obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu gén chrípkového vírusu, pričom uvedená konštrukcia DNA je schopná vyvolať expresiu antigénneho produktu génu chrípkového vírusu, ktorý pri aplikácii DNA konštrukcie do živočíšneho tkaniva in vivo indukuje špecifickú imunitnú odpoveď a výsledný príjem tejto DNA konštrukcie bunkami exprimujúcimi kódovaný chrípkový gén.

2. DNA konštrukcia podľa nároku 1, vyznačuj ú c a sa tým, že gén chrípkového vírusu kóduje nukleoproteín, hemaglutinín, polymerázu, matrix alebo neštruktúrny génový produkt chrípkového vírusu.

’

3. Polynukleotidová vakcína, obsahujúca konštrukciu DNA j· í vyznačujúca sa tým, že indukuje neutralizujúi ; ce protilátky proti ľudskému chrípkovému vírusu, cytotoxické

T-lymfocyty špecifické proti chrípkovému vírusu alebo obranné imunitné odpovede pri in vivo aplikácii DNA liečebného prípravku, pričom živočíchom je stavovec a polynukleotidová vakcína kóduje gén chrípkového vírusu, ktorý je po zavedení do tkaniva uvedených živočíchov exprimovaný in vivo.

^?

4. Polynukleotidová vakcína podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že obsahuje DNA konštrukciu zvolenú z jedného alebo viacerých nasledujúcich konštrukcií:

a) pnRSV-PR-NP,

b) Vl-PR-NP,

c) V1J-PR-NP, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:12:,

d) V1J-PR-PB1, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:13:,

e) V1J-PR-NS, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:14:,

f) V1J-PR-HA, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:15:,

g) V1J-PR-PB2, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:16:, ‘

h) V1J-PR-M1, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:17:,

i) VIJneo-BJ-NP, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:20:

116

a 3'koncom je SEKV.ID:21:, j) VIJneo-TX-NP, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:24: a 3’koncom j e SEKV.ID:25:, k) VIJneo-PA-HA, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:26: a 3’koncom j e SEKV.ID:27:, 1) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), veľkosť konštrukcie je

6.61 Kb, 5'koncom je SEKV.ID:50: 51: ,

o) VlJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), 6,42Kb, 5'koncom je SEKV.ID:52: 53 : ,

p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89),

5.62 Kb, 5’koncom je SEKV.ID:54:

6,56 Kb, 5'koncom je SEKV.ID:46: a 3’koncom je SEKV.ID: 47: ,

m) VlJns-TX-HA (A/Texas/36/91), veľkosť konštrukcie je

6,56 Kb, 5'koncom je SEKV.ID:48: a 3'koncom je SEKV.ID: 49: ,

n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je a 3'koncom je SEKV.ID:

veľkosť konštrukcie je a 3’koncom je SEKV.ID:

veľkosť konštrukcie je a 3’koncom je SEKV.ID:

55 : ,

q) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je 6,54 Kb, 5'koncom je SEKV.ID:56: a 3’koncom je SEKV.ID: 57: ,

r) VIJns-PA-Ml (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je

5,61 Kb, 5'koncom je SEKV.ID:58: a 3’koncom je SEKV.ID: 59: .

5. Expresívny vektor V1J, vyznačujúci sa tým, že obsahuje SEKV.ID:10:.

6. Expresívny vektor VIJ-neo, vyznačuj úci sa t ý m, že obsahuje SEKV.ID:18:.

7. Spôsob ochrany proti nákaze ľudským chrípkovým vírusom, vyznačujúci sa tým, že spočíva v očkovaní profylaktický účinným množstvom DNA podľa nároku 1.'

117

8. Spôsob ochrany proti nákaze ľudským chrípkovým vírusom, vyznačujúci sa tým, že spočíva v očkovaní profylaktický účinným množstvom DNA podľa nároku 3.

9. Spôsob ochrany proti nákaze ľudským chrípkovým vírusom, vyznačujúci sa tým, že spočíva v očkovaní profylaktický účinným množstvom DNA podľa nároku 4.

10. Spôsob ochrany podľa nároku 7, vyznačuj ú c i sa tým, že spočíva v priamej aplikácii DNA do tkaniva in vivo.

11. Spôsob ochrany podľa nároku 10, vyznačuj úci sa tým, že DNA je aplikovaná buď ako holá DNA vo fyziologicky prijateľnom roztoku bez nosiča alebo ako zmes DNA a lipozómu alebo ako zmes s prídavnou látkou alebo prísadou napomáhajúcou transfekcii.

12. Spôsob využitia génu chrípkového vírusu na indukciu imunitnej odpovede in vivo, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

a) izoláciu génu,

b) pripojenie génu k regulačnej sekvencii tak, že gén je funkčne pripojený ku kontrolnej sekvencii, ktorá po zavedení do živého tkaniva, riadi iniciáciu transkripcie a následné translácie tohto génu a

c) zavedenie génu do živého tkaniva.

13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje zvýšenie indukovanej imunitnej odpovede niekoľkonásobným zavedením génu chrípkového vírusu.

14. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že gén chrípkového vírusu kóduje nukleopróteín, hemaglutinín, matrix, neštruktúrny alebo polymerázový génový produkt vírusu ľudskej chrípky.

118

15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že gén vírusu ľudskej chrípky kóduje neukleoproteín, bázickú polymerázu 1, neštruktúrny proteín 1, hemaglutinín, matricový proteín 1 alebo bázickú polymerázu 2 jedného alebo viacerých izolátov vírusu ľudskej chrípky A/PR/8/34, A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91, A/Georgia/03/93 a B/Panama/45/90.

16. Spôsob indukcie imunitnej odpovede proti nákaze alebo ochoreniu spôsobenému kmeňmi chrípkového vírusu, vyznačujúci sa tým, že spočíva v zavedení nukleovej kyseliny do stavovcov kódujúcou konzervovaný epitop chrípkového vírusu špecifický pre prvý kmeň chrípkového vírusu tak, že indukovaná imunitná odpoveď ochraňuje nielen proti nákaze či ochoreniu prvým kmeňom chrípkového vírusu ale ochraňuje aj proti nákaze či ochoreniu kmeňmi, ktoré sa od prvého uvedeného kmeňa líšia.

17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek júci sa tým, že je ľudský.

v y z n a c u touto metódou

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

h) nárokov 7 až 16, z

organizmus ošetrovaný

18. DNA, pnRSV-PR-NP, Vl-PR-NP, V1J-PR-NP, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:12:, V1J-PR-PB1, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:13:, V1J-PR-NS, ktorej 5'koncom je SEKV.ID:14:, V1J-PR-HA, ktorej 5'koncom je SEKV.ID:15:, V1J-PR-PB2, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:16:, V1J-PR-M1, ktorej 5'koncom je vyznačujúci s a t ý m, že je:

SEKY.ID:17:,

i) VIJneo-BJ-NP, je SEKV.ID:21: ktorej • > 5’koncom je SEKV.ID:20: a 3’koncom j) VIJneo-TX-NP, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:24: a 3’koncom je SEKV.ID:25: k) VIJneo-PA-HA, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:26: a 3’koncom

je SEKY.ID:27:,

119

1) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93) , veľkosť konštrukcie je 6,56 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:46: a 3’koncom je SEKV.ID:47:, m) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91) , veľkosť konštrukcie je 6,56 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:48: a 3’koncom je SEKV.ID:49:, n) VIJns-PA-HA (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je 6,61 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:50: a 3’koncom je SEKV.ID:51:, o) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), veľkosť konštrukcie je 4 6,42 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:52: a 3’koncom je SEKV.ID:53:, i- p) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89) , veľkosť konštrukcie je 5,62 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:54: a 3’koncom je SEKV.ID:55:, - q) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je 6,54 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:56: a 3’koncom je SEKV.ID:57:, r) VIJns-PA-Ml (B/Panama/45/90), veľkosť konštrukcie je 5,61 Kb, ktorej 5’koncom je SEKV.ID:58: a 3'koncom je SEKV.ID:59:.

19. Prípravok konštrukcií nukleovej kyseliny, vyznačujúci sa tým, že kóduje gény chrípkových vírusov z oboch typov A aj B ľudských chrípkových vírusov.

20. Prípravok podľa nároku 19, obsahujúci konštrukcie nukleových kyselín, vyznačujúci sa tým, že kóduje gén hemaglutinínu najmenej troch kmeňov chrípkového vírusu, gén pre nukleoprotein najmenej dvoch kmeňov chrípkového vírusu a gén pre matricový proteín najmenej dvoch kmeňov chrípkového vírusu.

21. Prípravok podľa nároku 19, vyznačujúci sa t ý m, že uvedené gény chrípkového vírusu sú odvodené od chrípkových vírusov H1N1, H2N2 a H3N2 kmeňa B chrípkového vírusu. i

120

22. Prípravok podľa nároku 19, vyznačuj úci sa tým, že obsahuje:

a) VIJns-GA-HA (A/Georgia/03/93), s veľkosťou konštrukcie

6,56 Kb, ktorého 5'koncom je SEKV.ID:46: a 3'koncom je SEKV.ID:47:,

b) VIJns-TX-HA (A/Texas/36/91), s veľkosťou konštrukcie

6,56 Kb, ktorého 5'koncom je SEKV.ID:48: a 3’koncom je SEKV.ID:49:,

c) VlJns-PA-HA (B/Panama/45/90), s veľkosťou konštrukcie

6,61 Kb, ktorého 5'koncom je SEKV.ID:50: a 3'koncom je

SEKV.ID:51:,

d) VIJns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), s veľkosťou konštrukcie

6,42 Kb, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:52: a 3’koncom je SEKV.ID:53:, j

e) VIJns-BJ-Ml (A/Beijing/353/89), s veľkosťou konštrukcie

5,62 Kb, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:54: a 3'koncom je

SEKV.ID:55:,

f) VIJns-PA-NP (B/Panama/45/90), s veľkosťou konštrukcie 6,54 Kb, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:56: a 3'koncom je SEKV.ID:57:,

g) VIJns-PA-Ml (B/Panama/45/90), s veľkosťou konštrukcie 5,61 Kb, ktorého 5’koncom je SEKV.ID:58: a 3'koncom je SEKV.ID:59:.

23. Expresívny vektor VIJns.

24. Expresívny vektor V1JR, vyznačuj úci sa tým, že má SEKV.ID:45:.

25. Použitie izolovaných génov ľudských chrípkových ví- rusov, vyznačujúce sa tým, že gény chrípkových vírusov sú na začlenenie do vakcíny funkčne pripojené k jednej alebo viacerým kontrolným sekvenciám a vakcína je používaná na očkovanie proti nákaze ľudskými chrípkovými vírusmi . ;