PL178626B1

PL178626B1 - Szczepionka polinukleotydowa, konstrukt DNA i ekspresyjny wektor plazmidowy DNA

Info

Publication number: PL178626B1
Application number: PL94310677A
Authority: PL
Inventors: John J. Donnely; Varavani J. Dwarki; Margaret A. Liu; Donna L. Montgomery; Suezanne E. Parker; John W. Shiver; Jeffrey B. Ulmer
Original assignee: Merck & Co Inc; Vical Inc
Priority date: 1993-03-18
Filing date: 1994-03-14
Publication date: 2000-05-31
Also published as: JP3608642B2; YU12894A; HRP940175A2; FI954329A0; SK114295A3; PL310677A1; UA42715C2; HU9502702D0; HUT73397A; WO1994021797A1; BG63126B1; JPH10113194A; FI954329A; BG100006A; SI9420014A; AU5788994A; NZ263680A; AU676258B2; CN1119458A; NO953649D0

Abstract

1. Szczepionka polinukleotydowa, znamienna tym, ze zawiera wektor plazmidowy DNA wybrany z gru- py skladajacej sie z pnRSV, V 1, V1J, V 1R, VIJns i V1 Jneo, który obejmuje co najmniej jeden element regu- lujacy transkrypcje funkcjonalnie zwiazany z sekwencja nukleotydowa kodujaca nukleoproteine wirusa grypy, oraz farmaceutycznie dopuszczalny bufor lub nosnik. 3. Konstrukt DNA wybrany z grupy obejmujacej: (a) pn RSV-PR-NP; (b) V 1J-PR-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 12; (c) V 1 Jneo-BJ-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 20, a koniec 3' sta- nowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 21; (d) V 1 Jneo-TX-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 24, a koniec 3 sta- nowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw nr 25; (e) V 1 Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), który jest konstruktem o wielkosci 6,42 kb i którego koniec 5' sta- nowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 52, a koniec 3' stanowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 53; (f) V 1Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), który jest konstruktem o wielkosci 6,54 kb i którego koniec 5' sta- nowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 56, a koniec 3' stanowi sekwencja wedlug Identyfikatora Sekw. nr 57. 4. Ekspresyjny wektor plazmidowy DNA, którym jest VI Jns o sekwencji przedstawionej na Identyfikato- rze Sekw. nr 45 (fig. 36 i fig. 17). PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka polinukleotydowa, która wprowadzona bezpośrednio do żywych tkanek kręgowców, wywołuje powstanie odpowiedzi odpornościowej rozpoznającej swoiście wirusa grypy.

W zakres wynalazku wchodzi także konstrukt DNA i ekspresyjny wektor plazmidowy DNA.

Grypa jest ostrą chorobą gorączkową wywoływaną przez zakażenie układu oddechowego wirusem grypy typu A lub B. Nasilenie grypy występuje co roku w całym świecie, z okresowymi epidemiami lub pandemiami. Grypa wywołuje poważne objawy ogólne, ciężkie choroby (jak

178 626 wirusowe zapalenie płuc) wymagające hospitalizacji i powikłania jak wtórne bakteryjne zapalenie płuc. Uważa się, że ostatnia epidemia w Stanach Zjednoczonych spowodowała wzrost śmiertelności o ponad 10000 (do 40000) rocznie i 5000-10000 zgonów rocznie w latach nie epidemicznych. Najlepszą strategiązapobiegania chorobowości i śmiertelności związanej z grypąjest szczepienie. Obecne licencjonowane szczepionki otrzymywane sąz wirusa hodowanego na jajach kurzych, inaktywowanego i zwierajątrzy szczepy wirusa (dwa szczepy A i jeden B). Dostępne są trzy typy szczepionek: cały wirus, podjednostka wirionu i oczyszczony antygen powierzchniowy. Wyłącznie dwa ostatnie stosuje się u dzieci z powodu znacznej odpowiedzi gorączkowej powodowanej przez całego wirusa. Dzieci w wieku poniżej 9 lat wymagają dwóch szczepień, podczas gdy dorośli wymagi^rątylko pojedynczego wstrzyknięcia. Jednakże, sugeruje się (patrz Medical Letter 32:89-90, Sept. 17,1993), że „korzystne jest u pacjentów szczepionych wczesną jesieniąpodanie drugiej dawki zimą lub wczesną wiosną”, z powodu obserwowanego u starszych pacjentów spadku mian przeciwciał poniżej mian ochronnych w ciągu czterech miesięcy lub krócej. Szczepionki te modyfikuje się co roku przewidując, które z najnowszych szczepów wirusowych będą występować klinicznie i które z nowych szczepów zakaźnych będą dominowały w nadchodzącym sezonie zachorowań. Ponowne szczepienie zalecane jest co roku.

A. Ograniczenia licencjonowanych szczepionek obejmują:

1) Zmienność antygenową, szczególnie w szczepie A wirusa grypy, powoduj ącąpowstanie wirusów, które nie są neutralizowane przez przeciwciała wywołane przez poprzednią szczepionkę (lub poprzednie zakażenie). Nowe szczepy powstająprzez mutacje punktowe (dryf antygenowy) i przez rearanżację (zmiana antygenowa) genów kodujących glikoproteiny powierzchniowe (hemaglutyninę [HA] i neuraminidazę), podczas gdy białka wewnętrzne są silnie zakonserwowane pośród dryfujących i zmieniających się antygenowo szczepów. Immunizacja wywołuje szczepowo specyficzną, zależną od przeciwciał odporność „homologiczną”, a nie „heterologiczną”, wspólną dla całej grupy odporność komórkową.

2. Nawet gdy dominujące, krążące szczepy wirusa grypy nie zmieniają się i nie dryfują antygenowo z roku na rok, trzeba powtarzać immunizację co roku, ponieważ zmniejszają się miana przeciwciał. Jakkolwiek, istnieją doniesienia świadczące o utrzymywaniu się przeciwciał hamujących hemaglutyninę (HI) i przeciwciał neutralizujących przez miesiące i lata z następuj ącym stopniowym spadkiem, Advisory Committee on Immunization Practices wymienia spadek mian w roku następującym po szczepieniujako powód corocznej immunizacji, nawet gdy nie nastąpił znaczący dryf czy zmiana. (Przeciwciała HI hamują zdolność wirusa grypy do aglutynacji czerwonych krwinek. Podobnie jak przeciwciała neutralizujące skierowane są one przede wszystkim przeciwko antygenowi HA. Testy zahamowania hemaglutynacji są prostsze i tańsze w wykonaniu niż testy neutralizacji, i stąd często są wykonywane w ceiu oceny zdolności przeciwciał wywołanych przeciwko jednemu ze szczepów wirusa grypy do reagowania z innym szczepem). Jak wspomniano powyżej, Medical Letter sugeruje, ze obarczone szczególnie wysokim ryzykiem osoby starsze powinny być szczepione dwukrotnie w ciągu sezonu z powodu krótkotrwałości mian ochronnych przeciwciał.

3) Efektywność szczepionekjest suboptymalna. Opracowanie szczepionki na następny sezon polega na przewidywaniu powstających szczepów krążących (drogąpróbkowania w Azji), co jest niedokładne i może powodować słaby dobór między szczepami zastosowanymi w szczepionce i aktualnie krążącymi. Ponadto, jak to miało miejsce podczas sezonu 1992-1993, nowy szczep H3N2 (A/Beijing/92) uwidocznił się klinicznie podczas ostatniej fazy sezonu grypy. Spowodowało to zmianę składu szczepionki 1993-1994, z powodu słabej reaktywności krzyżowej ze szczepem A/Beijing/92 przeciwciał wywołanych przez wcześniejszy szczep H3N2 (A/Beijing/89) z powodu zmiany antygenowej. Jednakże, z powodu długości czasu potrzebnego do wytworzenia obecnej licencjonowanej szczepionki, nowy szczep nie mógł być wprowadzony jako szczepionika podczas sezonu 1992-1993, mimo dowodów na słabą ochronę zapewnianą przez obecną szczepionkę i zwiększoną zakaźność nowego krążącego szczepu H3N2.

178 626

Nawet gdy szczepionka i krążący szczep są dobrze dobrane, licencjonowane szczepionki chronią przed chorobą tylko 70% zdrowych dzieci i młodych dorosłych i 30-40% starszych dorosłych. Stąd inne kryteria używane są do określania efektywności gdy szczepionka odpowiada krążącym szczepom. Kryteria te obejmują ochronę przed ciężkim przebiegiem choroby i wtórnymi powikłaniami, co określa się przez zapobieżenie hospitalizacji (70% dla osób starszych mieszkających w domu w stosunku do 50-60% osób starszych mieszkających w domach opieki) i zapobieżenie śmierci (80% dla osób starszych żyjących w domach opieki). Odporność populacji zdolna zmniejszyć rozprzestrzenianie się choroby w domach opieki uważana jest za jeszcze jedną zaletę szczepień.

B. Charakterystyka idealnej uniwersalnej szczepionki przeciwko grypie (cele wynalazku),

1) Powodowanie ochrony grupowej (heterologicznej). Uniwersalna szczepionka powinna chronić przed różnymi szczepami, przykładowo w obrębie podtypu H3N2, i o ile to możliwe nawet poprzez inne podtypy np. od H1N1 do H3N2. Może to być zapewniane najlepiej przez limfocyty T cytotoksyczne (CTL) rozpoznające antygeny wewnętrznych konserwatywnych białek wirusowych, jakkolwiek przeciwciała neutralizujące skierowane przeciwko konserwowanym częściowo białek związanych z błonami mogą również odgrywać pewną rolę.

2) Zwiększenie zakresu odpowiedzi przeciwciał. Ponieważ uważa się, że CTL odgrywają rolę w zdrowieniu, szczepionka oparta w większości na odpowiedzi CTL powinna skaracać czas trwania choroby (potencjalnie aż do czynieniajej subkliniczną), ale nie zapobiegajej całkowicie. Wykazano doświadczalnie, że sposób produkcji obecnych szczepionek przeciwko grypie, polegający na pasażowaniu wirusa na jajach kurzych, jest zdolny do selekcjonowania subpopulacji wirusa posiadających zmienioną antygenność HA. W wyniku, efektywność szczepionki może być zmniejszona ponieważ wywołane przeciwciała nie mogą być całkowicie efektywne w stosunku do dominującego szczepu krążącego. Stąd próbuje się wytworzyć przeciwciała, które posiadałyby rozszerzony zakres odpowiedzi w porównaniu z obecnymi szczepionkami. Sezon grypy 1992-93 dostarczył świetnego przykładu do badania ograniczeń współczesnej szczepionki, która wykorzystując szczep A/Beijing/89, wywoływała przeciwciała słabo reagujące krzyżowo z (i słabo chroniące przed) nowym szczepem A/Beijing/92, który również był bardziej zakaźny. Oba szczepy były H3N2, tzn. były tego samego podtypu. Jednak pod względem sekwencji aminokwasowej szczepy pochodne A/Beijing/92 różniły się od szczepów A/Beijing/89 tylko 11 mutacjami punktowymi (pozycje 133,135‘, 145,156,157,186,190,191,193,226i262) w regionie HA1. Nie jest wiadome czy współczesny sposób wytwarzania wpływa na brak reaktywności krzyżowej, ale poprawa zakresu odpowiedzi przeciwciał jest pożądana.

3) Przedłużony czas trwania odpowiedzi przeciwciał. Ponieważ grupa o najwyższym ryzyku chorobowości i śmiertelności z powodu zakazenia grypą (osoby starsze) jest również gr^ipią u której poziomy ochronne przeciwciał zanikają zbyt szybko, by coroczne szczepienia były efektywne, polepszona szczepionka powinna wywoływać miana ochronne przeciwciał, utrzymujące się przez dłuższy czas.

C. Polinukleotydy jako szczepionka.

Wykazano, że domięśniowe podanie konstruktów polinukleotydowych tzn. plazmidów DNA kodujących białka powoduje tworzenie in situ białek w komórkach mięśniowych. Przy użyciu plazmidów cDNA kodujących białka wirusowe, wywoływane są odpowiedzi zarówno przeciwciał jak i CTL, dostarczając homologicznej i heterologicznej ochrony przed następową ekspozycją na wirusa, ochrony homologicznej jak i między szczepowej. Każdy z typów odpowiedzi odpornościowej zapewnia potencjalną wyzszość nad istniejącymi strategiami szczepień. Użycie pNv do wywołania przeciwciał może powodować przedłużony czas trwania odpowiedzi przeciwciał jak również dostarczanie antygenu, który może posiadać sekwencję identyczną z krążącym szczepem wirusa jak również odpowiednią modyfikację potranslacyjnąi konformację natywnego białka (w stosunku do białka rekombinowanego). Wywoływanie odpowiedzi cTl w ten sposób zapewnia korzyści ochrony między szczepowej bez użycia potencjalnie chorobotwórczych wektorów czy wirusów atenuowanych.

178 626

D. Dalszy opis podstawy:

Stąd, największym problemem w opracowaniu szczepionek przeciwko wirusomjak grypa, przeciwko którym indukowane są przeciwciała neutralizujące, jest różnorodność białek otoczki wirusa pośród izolatów lub szczepów. Ponieważ, limfocyty T, zarówno myszy jak i ludzi, zdolne są rozpoznawać epitopy uzyskane z zakonserwowanych wirusowych białek wewnętrznych [J.W. Yewdell i in., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 82,1785 (1985); A.R.M. Townsend i in., Cell 44, 959 (1986); A.J. Mc Michael i in., J. Gen. Virol. 67,719 (1986); J. Bastin i in., J. Exp. Med. 165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend i H. Bodmer, Annu. Rev. Immunol. 7,601 (1989)], i jak się uwaza, grają istotną rolę w odpowiedzi odpornościowej na wirusy [Y.-L.Lin i B.A. Askonas, J. Exp. Med. 154,225 (1981); I. Gardner i in., Eur. J. Immunol. 4,68 (1974); K.L. Yap i G.L. Ada, Nature 273, 238 (1987); A.J. McMichael i in., New Engl. J. Med. 309, 13 (1983); P. M. Taylor i B.A. Askonas, Immunol. 58,417 (1986)] wysiłki kieruje się na opracowanie szczepionki CTL zdolnej zapewnić heterologiczną ochronę przed różnymi szczepami wirusa.

CTL CD 8+ zabijają zakazone wirusem komórki gdy ich receptory limfocytów T rozpoznają peptydy wirusowe związane z cząsteczkami MHC klasy I [R.M. Zinkernagel i P.C. Doherty, ibid, 141, 1427 (1975); R.N. Germain, Nature 353 (1991)]. Peptydy te pochodząz syntetyzowanych endogennie białek wirusowych, w zależności od umiejscowienia białka lub funkcji pełnionej w wirusie. Stąd, przez rozpoznanie epitopów zakonserwowanego białka wirusowego, CTLe mogą zapewnić ochronę międzyszczepową. Peptydy zdolne do związania się z MHC klasy I rozpoznawane przez CTL, pochodzą z białek obecnych lub przechodzących przez cytoplazmę albo siateczkę wewnątrzplazmatyczną [J.W. Yewdell i J.R. Bennink, Science 244,1072 (1989); A.R.M. Townsend i in., Nature 340,443 (1989); J.G. Nuchtern i in., ibid. 339, 223 (1989)]. Tak więc, białka egzogenne, wchodzące do szlaku przemian endosomalnych (jak w przypadku antygenów prezentowanych przez cząsteczki MHC klasy II) nie są zdolne wywoływania odpowiedzi CTL CD8+.

Większość prób wywołania odpowiedzi ze strony CTL wykorzystywała bądź replikujące wektory w celu produkcji antygenu białkowego w komórce (J.R. Benink i in., ibid. 311, 578 (1984); J.R. Benink i J.W. Yewdell, Curr. Top. Microbiol, Immunol. 163,153 (1990); C.K. Stover i in., Nature 351,456 (1991); A. Aldovini i R.A. Young, Nature 351,479 (1991); R. Schafer i in., J. Immunol. 149,53 (1992); C.S. Hahn i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,2679 (1992)], lub skupiały się na wprowadzaniu peptydów do cytozolu [F.R. Carbone i M.J. Bevan, J. Exp. Med. 169, 603 (1989); K. Deres i in., Nature 342, 561 (1989); H. Takahashi i in., ibid. 344, 873 (1990);

D.S. Collins i in., J. Immunol. 148, 3336 (1992); M.J. Newman i in., ibid. 148, 2357 (1992)]. Oba podejścia posiadają ograniczenia mogące zmniejszać ich uzyteczność jako szczepionki. Wektory retrowirusowe posiadająograniczenia co do wielkości i struktury polipeptydów ekspresjonowanychjako białka fuzyjne przy zachowaniu zdolności rekombinowanego wirusa do replikacji [A.D. Miller, Curr. To. Microbiol. Immunol. 158,1 (1992)] i efektywności wektorów jako szczepionek do kolejnych immunizacji może być ograniczona przez odpowiedź odpornościową przeciwko samym wektorom [E.L. Cooney i in., Lancet 337, 567 (1991)]. Również wektory wirusowe i zmodyfikowane patogeny niosą ryzyko, które może ograniczać ich zastosowanie u ludzi [R.R. Redfield i in., New Engl. J. Med. 316, 673 (1987); L. Mascola i in., Arch. Intern. Med. 149,1569 (1989)]. Ponadto, dobór epitopów peptydowych które mają być prezentowane zależy od struktury antygenów MHC osobnika i stąd, szczepionki peptydowe mogą mieć ograniczoną efektywność z powodu różnorodności haplotypów MHC w populacji.

Benvenisty N. i Reshef L. [PNAS 83, 9551-9555, (1986)] wykazali, ze DNA precypitowane CaCl₂ wprowadzone myszom dootrzewnowo, dożylnie czy domięśniowo może być ekspresjonowane. Domięśniowe (i.m.) wstrzyknięcie myszom wektorów ekspresyjnych DNA powoduje pobieranie DNA przez komórki mięśniowe i ekspresję białka kodowanego przez DNA [J.A. Wolff i in., Science 247,1465 (1990); G. Ascadi i in.,Nature 352, 815 (1991)]. Wykazano, że plazmidy utrzymywane są episomalnie i nie replikują. Następnie, obserwowano przetrwałą ekspresję po wstrzyknięciu do mięśni szkieletowych szczurów, ryb i naczelnych oraz mięśnia se6

178 626 rcowego szczurów [H. Lin i in., Circulation 82,2217 (1990); R.N. Kitsis i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,4138 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290, 73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3,21 (1992); J.A. Wolff i in., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)]. Technika stosowania kwasów nukleinowych jako środków farmaceutycznych opisana została w W090/11092 (4 października 1990), w którym polinukleotydy zastosowano do szczepienia kręgowców.

Do powodzenia metody niejest konieczna immunizacja domięśniowa. Tak więc, Tang i in., [Nature, 356,152-154 (1992)] i opublikował, że wprowadzenie myszom do skóry koloidu złota opłaszczonego DNA kodującym wołowy hormon wzrostu (BGH) powoduje produkcję przeciwciał anty-BGH przez te myszy. Furth i in., [Analytical Biochemistry, 205,365-368 (1992)] wykazał, że urządzenie ,jet injector” może być użyte do transfekowania skóry, mięśni, tkanki tłuszczowej i tkanek sutka żywych zwierząt. Przeglądu różnych metod wprowadzania kwasów nukleinowych dokonał ostatnio Friedman T. [Science, 244, 1275-1281 (1989)]. Patrz również Robinson i in., Abstracts ofPapers Presented at the Meeting on Modem Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, str. 92, w którym podanie kurczakom DNA ptasiej grypy i.m., i.p., oraz i.v. spowodowało ochronę przed śmiertelną dawką wirusa. Jednakże, nie podano których genów ptasiego wirusa grypy użyto. Dodatkowo wywołano wyłącznie odpowiedź swoistąw stosunku do H7, nie wspominając o wywołaniu ochrony między szczepowej.

Szczepionkę według wynalazku można wprowadzać każdą ze znanych metod wprowadzania kwasów nukleinowych do żywych tkanek w celu wywołania ekspresji białek. Potrzeba swoistego czynnika leczniczego zdolnego do wywołania profilaktycznej odpowiedzi odpornościowej przeciwko patogenom wirusowym zaspokojona została przez niniejszy wynalazek dla wirusa grypy. Szczególnie ważna w tym podejściu terapeutycznym jest zdolność wywoływania odpowiedzi odpornościowej limfocytów T co może zapobiec zakazeniu nawet szczepami wirusowymi heterologicznymi do szczepu, z którego uzyskano antygen. Wynalazek dostarcza konstruktów DNA kodujących białka wirusowe nukleoproteiny (NP) ludzkiego wirusa grypy lub każdego innego genu wirusa grypy kodującego produkty, wywołujące swoiste CTLe.

Wirus grypy posiada genom rybonukleinowy (RNA) składający się z licznych segmentów RNA. Każdy z RNa koduje przynajmniej jeden produkt genu. Produkt gen NP wiąże się z RNA i przenosi RNA wirusowe do jądra zakażonej komórki. Sekwencja jest zakonserwowana, ze zmiennością rzędu 7% w sekwencji aminokwasów, która powstała w okresie 50 lat. Produkty genu P (PB1, PB2, PA) są odpowiedzialne za syntetyzowanie nowego RNA. Geny te sąjeszcze bardziej zakonserwowane niż gen NP. HA jest głównym produktem genu kodującego otoczkę wirusową. Jest mniej zakonserwowana niż NP. Wiąże się z receptorem komórkowym i odgrywa przez to kluczową rolę w zapoczątkowaniu nowego zakażenia. Główna odpowiedź przeciwciał neutralizujących skierowana jest przeciwko temu produktowi genu. Przeciwko temu białku skierowana jest również znacząca odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T. Współczesne szczepionki przeciw ludzkiemu wirusowi grypy zawieraaątrzy szczepy wirusa grypy lub ich białka HA. Jednakże, z powodu zmienności sekwencji białka HA różnych szczepów, szczepionka musi być ciągle dopasowywana do szczepów, które aktualnie wywołują chorobę. Jednakże, HA zawiera kilka zakonserwowanych elementów, które indukują CTLe, jeżeli są odpowiednio prezentowane. Produkty genów NS1 i NS2 nie mają kompletnie scharakteryzowanej funkcji biologicznej, ale mogą mieć znaczenie w wywoływaniu ochronnej odpowiedzi CTL. Na koniec, produkty genów Ml i M2, które sąnieco bardziej zakonserwowane niż HA, indukująnajwiekszą odpowiedź CTL. Białkc M1 jest bardzo powszechnym produktem genu wirusowego.

Efektywność ochronna przez szczepienie przy użyciu DNA przed następującą potem ekspozycją na wirusa zademonstrowana jest przez immunizację nie replikującym plazmidowym

DNA kodującymj edno lub więcej białek wirusowych. Jest to korzystne ponieważ niej est używany żaden czynnik zakaźny, nie jest konieczne tworzenie się cząstek wirusowych i umożliwiona

178 626 jest selekcja determinant. Ponadto, ponieważ sekwencja nukleoproteiny i kilku innych genów wirusowychjest zakonserwowana wśród różnych szczepów wirusa grypy, uzyskanajest ochrona przed następową ekspozycją na zakaźny szczep wirusa grypy homologicznego lub heterologicznego do szczepu, od którego uzyskany jest sklonowany gen.

Konstrukty DNA, które mogą ulegać ekspresji po bezpośrednim wprowadzeniu, przez wstrzyknięcie lub inaczej, do tkanek zwierzęcych, są nowymi środkami profilaktycznymi. Indukująone limfocyty T cytotoksyczne (CTLe), swoiste dla antygenów wirusowych, które odpowiadają na różne szczepy wirusów, w przeciwieństwie do przeciwciał, które są w większości szczepowo swoiste. Powstawanie CTLi in vivo zwykle wymaga endogennej ekspresji antygenu, jak ma to miejsce w przypadku zakażenia wirusowego. W celu wytworzenia antygenu wirusowego do prezentacji układowi odpornościowemu, bez ograniczeń związanych z bezpośrednim dostarczaniem peptydu lub zastosowaniem wektorów wirusowych, DnA plazmidowe kodujące białka ludzkiego wirusa grypy wstrzyknięto w mięsień czworogłowy myszy BALB/c, co spowodowało powstanie swoistych dla wirusa grypy CTLi i ochronę przed następującą później ekspozycją na heterologiczny szczep wirusa grypy, mierzoną obniżaniem mian wirusa w płucach, zahamowaniem utraty masy ciała, i zwiększeniem przeżywalności. Wysokie miana przeciwciał neutralizujących przeciwko hemaglutyninie i przeciwciał przeciwko nukleoproteine wywołane zostały u rezusów, oraz obserwowano zmniejszanie mian wirusa w nozdrzach fretek po homologicznej i heterologicznej ekspozycji.

Główne obserwacje, odnoszące się do niniejszego wynalazku, obejmowały:

1) Wykazanie efektywności. Obserwowano ochronę heterologiczną w następstwie immunizacji DNA dla nukleoproteiny (NP), mierzoną zwiększeniem przezywalności, zmniejszeniem mian wirusa w płucach i zahamowaniem utraty masy ciała u myszy poddanych ekspozycji na szczep wirusa grypy odmienny od szczepu będącego źródłem genu NP. W tym przypadku, białka powierzchniowe dwóch szczepów były nieco różne (H1N1) wobec H3N2) zaś szczep na który eksponowano zwierzęta powstał w 37 lat po szczepie pierwotnym. Immunizacja fretek DNA dla NP i DNA dla białka macierzy (M1), osobno, razem lub w połączeniu z DNA dla HA, powodowała ochronę (zmniejszenie uwalniania wirusa w nozdrzach) po ekspozycji szczepem zdryfowanym antygenowo (izolat kliniczny). Nadmienić należy, ze ochrona przez immunizację mieszaniną DNA (DNA kodujące białka NP i Ml Beijing/89 i DNA kodujące HA Beijing/89 lub Hawaii/91) była u fretek lepsza w stosunku do zdryfowanego szczepu (Georgia/93) niz uzyskana licencjonowaną szczepionką (zawierającą Beijing/89). Mieszanina zawierająca DNA HA z Hawaii/91 wydawała się nieco bardziej efektywna niz mieszanina zawierająca DNA dl HA z Beijing/89. Ochrona obserwowana po użyciu mieszaniny zawierającej DNA dla HA Hawaii/91 powodowała ochronę identyczną z uzyskiwaną przy użyciu homologicznego DNA dla HA (Georgia/93), podczas gdy mieszanina z użyciem DNA dla HA Beijing/89 różniła się od ochrony homologicznej, jednak nadal była znacznie lepsza niż licencjonowany produkt. Przeciwciała przeciwko HI wywołano u wszystkich gatunków badanych włączywszy myszy, fretki, rezusy i afrykańskie małpy zielone.

2) Trwałość. W badaniach z użyciem DNA kodującego gen reporterowy, obecność DNA i ekspresji białka utrzymywała się przez co najmniej 1,5 roku (najdłuzszy badany czas dla myszy; Wolff i in., Human Mol. Genet., 1992). Stąd, jeżeli produkty genu wirusa grypy są również ekspresjonowane trwale, powstała odporność winna również być trwała. Wykazano, że przeciwciała i CTL (Yancauckas i in., DNA & Celi Biol., 1993) oraz homologiczna odporność ochronna (dane z MLR) wywołana przez wstrzyknięcie DNA wirusa grypy trwają przez ponad rok u myszy'. Wykazano, że przeciwciała trwają u rezusów przez przynajmniej rok. Długość czasu trwania odpowiedzi CTL i ochrony heterologicznej (zwiększona przeżywalność) trwają do 6 miesięcy (najdłuższy dotąd badany czas). Wystąpiło nieznaczne obniżenie stopnia ochrony heterologicznej, ale jest ona możliwa do ponownego wywołania.

178 626

3) Gradacja dawki. Badania dotyczące dawki wykonane na rezusach wykazały, że 100 pg DNA dla HA podane dwukrotnie powodowały zadowalające miana przeciwciał, które trwały przez rok. Wywołanie ochrony (zwiększona przeżywalność w następstwie ekspozycji na wirusa heterologicznego) u myszy obserwowana była z użyciem dawek rzędu 6 pg (podawane 3 razy) oraz przy użyciu pojedynczej dawki 200 pg, ale, ogólnie, zwiększenie liczby dawek (do 3) polepszyło stopień ochrony. Badania na naczelnych wykazały, że 2 wstrzyknięcia po 10 lub 100 pg DNA kodującego 3 HA i NP i Ml (ten ostatni kodujący geny H3N2 Beijing/89) powodowały miana przeciwciał przeciwko HI przypominające wywoływane przez licencjonowane szczepionki. Ważne jest by pamiętać, że badane zwierzęta nie miały uprzednio kontaktu z grypą, podczas gdy docelowa populacja kliniczna (ludzie starsi) przechodziła grypy. (Dzieciom poniżej 9 r.z. podaje się 2 wstrzyknięcia licencjonowanej szczepionki).

Krótki opis figur.

Figura 1. Wykrywanie plazmidowego DNA dla NP w mięśniach przy użyciu PCR. Myszom BALB/c wstrzykiwano trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych, DNA dla RSV-NP lub pusty wektor (100 pg/łapę) w oba mięśnie czworogłowe, po czym zarażano grypą. Mięśnie pobierano 4 tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu i natychmiast zamrażano w ciekłym azocie. Sproszkowywano je w buforze do lizy (25 mM Tris-H₃PO₄ pH 8,2 mM kwas trans-1:2-diaminocyklohexanotetra-octowy (CDTA), 2 mM DTT, 10% glicerol, 1% Triton Χ-100) w urządzeniu MIKRODISMEMBRATOR™ (B. Braun Instruments) po czym ekstrahowano wysokocząsteczkowe DNA przez ekstrakcję mieszaniną fenolu i chloroformu i precypitację etanolem. Wykonywano 40 cykli reakcji PCR (PCR wykonywano według instrukcji zestawu GENEAMP™ Perkin Elmer Cetus) w celu wykrycia obecności DNA plazmidowego dla NP w mięśniach. Wytworzono produkt PCR wielkości 772 bp. (patrz strzałki) obejmujący obszar od promotora CMV przez większość części 5' genu NP, od oligonukleotydu sensownego długości 18 bp. startującego w regionie promotora, (GTGTGCACCTCAAGCTGG, Identyfikator Sekw. nr 1) do antysensownego oligonukleotydu długości 23 bp. w części 5' sekwencji NP (CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC, Identyfikator Sekw. nr 2). Produkt długości 722 bp. widoczny jest na żelu agarozowym barwionym bromkiem etidium w wybranych próbkach mięśni nastrzykniętych DNA dla NP, ale nie w nastrzykniętych pustym wektorem (600L). Oznaczenie powyżej każdej ze ścieżek oznacza numer identyfikacyjny myszy i prawą lub lewą łapę.

Figura 2. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko NP u myszy, którym wstrzyknięto DNA dla NP. Myszom wstrzyknięto po 100 pg DNA dla VI -NP w każdą z łap w tygodniu 0,3 i 6, oraz pobierano krew w tygodniu 0,2, 5 i 8. Obecność IgG anty-NP w surowicy badano testem ELISA (J.J. Donnelly i in., J. Immunol. 145,3071 (1990)), używając oczyszczonego NP z komórek owadzich transfekowanych wektorem ekspresyjnym bakulowirusa. Wyniki wykreślono jako średni log₁₀ miana ELISA ± SEM (n= 10) do czasu po pierwszej injekcji DNA dla NP. Myszy immunizowane pustym wektorem nie wytwarzały możliwych do stwierdzenia przeciwciał anty-NP.

Figura 3. Procent lizy specyficznej, oznaczany w 4 godzinnym teście uwalniania ⁵¹Cr, dla CTL uzyskanych z myszy immunizowanych DNA. Myszy immunizowano 400 pg DNA dla V1 -NP (wypełnione kółka) lub pustym wektorem (wypełnione kwadraty) i zabijano 3-4 tygodnie później. CTL do kontroli negatywnej uzyskano z myszy, które nie miały dotąd kontaktu z antygenem (puste trójkąty) i do kontroli pozytywnej od myszy wyzdrowiałych z zakażenia A/HK/68 cztery tygodnie wcześniej (wypełnione trójkąty). Wykresy przedstawiają dane z pojedynczych reprezentatywnych myszy. Dla każdego z zestawów warunków badano przynajmniej osiem myszy. Panel A: komórki śledziony restymulowane przy użyciu autologicznych splenocytów poddanych pulsowi NP 147-155 i badane w stosunku do komórek P815 poddanych pulsowi NP 147-155. Panel B: splenocyty restymulowane przy użyciu autologicznych splenocytów poddanych pulsowi NP 147-155 i badane w stosunku do komórek P815 stanowiących cel, zakażonych grypą A/Victoria/73 (H3N2) przez 6 godzin przed dodaniem CTL. Panel C: Splenocyty

178 626 restymulowane ConA i IL-2 bez dodatkowego antygenu i badane w stosunku do komórek P815 poddanych pulsowi NP 147-155. Panel D: Myszom wstrzyknięto 200 pg DNA V1 -NP na wstrzyknięcie, lub pusty wektor trzykrotnie w odstępie trzech tygodni. Śledziony pobierano 4 tygodnie po ostatniej immunizacji, splenocyty hodowano z IL-2 i ConA przez 7 dni po czym badano CTL w stosunku do komórek docelowych P815 zakażonych A/Victoria/73.

F igura 4. Utrata masy (w gramach) i zdrowienie u myszy immunizowanych DNA po ekspozycji donosowej, wykonanej bez znieczulenia, przy użyciu 10⁴ TCID5₀ A/HK/68. Myszy immunizowano trzykrotnie w odstępie trzech tygodni przy użyciu DNA V1-NP lub pustego wektora lub nie nastrzykiwano ich wcale, po czym poddawano ekspozycji na wirusa 3 tygodnie po ostatniej immunizacji. Wagi grup po dziesięć myszy oznaczano w momencie ekspozycji i codziennie od dnia 4 dla myszy nastrzykniętych DnA dla NP (wypełnione kółka), pustym wektorem (puste trójkąty) i nienastrzykniętej kontroli (puste kółka). Przedstawione średnie wagi ± SEM. Myszy nastrzyknięte DNA dla Np przedstawiały znacząco mniejszą utratę masy ciała od dnia 8 do 13 w porównaniu z myszami nastrzykniętymi pustym wektorem (p<0.005) i nienastrzykniętymi myszami (p<0.01) co badano testem t. Nie było różnic istotnych statystycznie pomiędzy obiema kontrolami (p=0.8 mierzone testem t).

Figura 5. Przeżywalność myszy immunizowanych DNA po ekspozycji donosowej (wznieczuleniu) przy użyciu 10²⁵ TCID50 A/HK/68. Myszy immunizowane trzykrotnie w odstępie trzech tygodni przy użyciu DNA V1-NP (wypełnione kółka), pustego wektora (puste kółka) lub nie nastrzykiwane wcale (puste trójkąty) poddawano ekspozycji na wirusa 3 tygodnie po ostatniej immunizacji. Procent przeżywalności pokazano dla grup po 9 lub 10 myszy. Przeżywalność myszy nastrzykniętych DNA dla NP była znacząco wyższa niz w kontroli (p=0.0004 badane testem Chi-kwadrat), podczas gdy nie było różnicy istotnej statystycznie pomiędzy nastrzykniętymi pustym wektorem a nienastrzykniętymi myszami (p=0.17 badane testem Chi-kwadrat).

Figura 6. Sekwencja wektora ekspresyjnego V1J, Identyfikator Sekw'. nr: 10.

Figura 7. Sekwencja wektora ekspresyjnego V1Jneo, Identyfikator Sekw. nr: 18.

Figura 8. Sekwencj apromotora-terminatora CMVintA-BGH, Identyfikator Sekw. nr: 11.

Figura 9. Małpie przeciwciało anty-NP

Figura 10. Zahamowanie hemaglutynacji u fretek, linią kropkowaną zaznaczono minimalne miano ochronne przeciwciał i średnią wartość oznaczona kółkiem z linią przechodzącą przez nie.

Figura 11. Przeciwciało IgG anty-NP u fretek po immunizacji przy użyciu DNA.

Figura 12. Uwalnianie wirusa grypy u fretek immunizowanych i nieimmunizowanych przy użyciu DNA.

Figura 13. Diagramy wektorów pRSV-PR-NP i V1-NP X oznacza wprowadzony region kodujący.

Figura 14. Schemat białek i szczepów wirusa grypy.

Figura 15. Schemat obróbki wewnątrzkomórkowej wstrzykniętego DNA.

Figura 16. Odporność fretek na wirusa grypy A/RP/8/34 wywołana przez immunizację genami dla HA i białek wewnętrznych.

Figura 17. Schemat wektora V1Jns.

Figura 18. Zielone małpy afrykańskie nastrzyknięto mieszaniną DNA zawierającą DNA dla HA (A/Beijing/89, B/Panama/90, A/Texas/91), DNA dla NP (A/PR/34) i DNA dla M1 (A/PR/34). Ilość każdego ze składników wynosiła 10 pg (wypełnione kwadraty) lub 100 pg (wypełnione kółka) podawane dwukrotnie w odstępie sześciotygodniowym (patrz strzałki). Dla porównania, inne zwierzęta otrzymały lijencjonowaną szczepionkę zawierąjącąpodjednostkę wirionu (puste kwadraty) i cały wirion (puste-kółka) w całkowitej dawce dla człowieka (ekwiwalent 45 pg białka; 15 pg na HA). Próbki surowic pobierano co dwa tygodnie przez 18 tygodni i badano na miano HI przeciwko HA A/Beijing/89. Dane przedstawiono jako średnią geometryczną miana HI ± SEM gdzie n=3.

178 626

Figura 19. Samicom myszy BALB/c (4-6 tygodniowym) wstrzykiwano DNA dla NP A/PR/34 (200 pg) trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych. Kontrola negatywna obejmowała myszy nastrzyknięte DNA kontrolnym (200 pg), rekombinowanym białkiem NP (10 pg)i myszy nienastrzyknięte niczym, które nie miały dotąd kontraktu z antygenem (mock). Dla porównania badano również myszy zakażone wirusem grypy A/HK/68. CTL uzyskano 6 miesięcy po podaniu pierwszej dawki i restymulowane in vitro zakazonymi wirusem, syngenicznymi splenocytami i badano w stosunku do komórek P815 poddanych pulsowi peptydem NP w stosunku efektorów do komórek docelowych równym 10:1. Dane przedstawiono jako % lizy specyficznej ± sd, gdzie n=3.

Figura 20. Myszom C3H/HeN wstrzyknięto normalne mioblasty C2C12 (1 x 10⁷ komórek), rekombinowane białko NP (2 pg) lub transfekowane przy użyciu NP mioblasty (1 x 107 komórek). Ilość białka NP (2 pg) była wystarczająca do wywołania odpowiedzi przeciwciał i stanowiła odpowiednik około 100 krotnej ilości białka NP obecnego w przeszczepionych, transfekowanych NP mioblastach. CTL z tych myszy przygotowano sześć tygodni po podaniu i restymulowano in vitro zakażonymi wirusem grypy splenocytami syngenicznymi. Jako kontrolę pozytywną, przygotowano CTL z myszy zakażonych wirusem grypy A/HK/68. Nietraktowane niczym (wypełnione słupki), zakażone wirusem grypy A/Victoria/73 (paskowane słupki) i transfekowane NP mioblasty (kratkowane słupki) użyto jako komórek docelowych w stosunku efektorów do komórek docelowych równym 25:1. Dane przedstawiono jako % lizy specyficznej ± sd, gdzie n=3.

Figura 21. Czterotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo przez podanie 200 pg DNA dla NP trzykrotnie z trzytygodniowymi odstępami. Myszy eksponowano trzy tygodnie po ostatniej immunizacji na 300 TCID5₀ A/HK/68 podanego w znieczuleniu (ekspozycj a całych dróg oddechowych). Proporcj ę myszy, które przeżyły (10 myszy na grupę) naniesiono w stosunku do czasu po ekspozycji.

Figura 22. Czterotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo przez podanie 100 pg DNA dla NP trzykrotnie z trzytygodniowymi odstępami. Myszy eksponowano trzy tygodnie po ostatniej immunizacji na 300 TCID5₀ A/HK/68 podanego w znieczuleniu (ekspozycja całych dróg oddechowych). Myszy ważono codziennie i obliczano proporcję wagi początkowej dla każdej myszy, która przeżyła. Wykreślono średni odsetek wagi początkowej ± SEM w stosunku do czasu po ekspozycji.

Figura 23. Czterotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo przez podanie 200 pg DNA NP trzykrotnie z trzytygodniowymi odstępami. Myszy eksponowano trzy tygodnie po ostatniej immunizacji na 2000 TCID5₀ A/HK/68 podanego bez znieczulenia (ekspozycja górnych dróg oddechowych). Myszy zabijano 7 dni po ekspozycji, pobierano płuca, homogenizowano i określano miana wirusa przez kolejne miareczkowanie na komórkach MDCK.

Figura 24. Czterotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo przez podanie 6.25,25,100 i 200 pg DNA dla NP trzykrotnie z trzytygodniowymi odstępami. Myszy eksponowano trzy tygodnie po ostatniej immunizacji na 300 TCID50 A/HK/68 podanego w znieczuleniu (ekspozycja całych dróg oddechowych). Proporcję myszy, które przeżyły (10 myszy na grupę) wykreślono w stosunku do czasu po ekspozycji.

Figura 25. Czterotygodniowe samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo przez podanie 200 pg DNA dla NP A/PR/34, DNA kontrolnego lub podanie placebo. Myszy eksponowano na 300 TCID50 A/HK/68 podanego w znieczuleniu 6,12 i 25 tygodni po trzecim wstrzyknięciu DNA. Wybrane myszy ponownie immunizowano przez podanie 200 pg DNA dla NP w 22 tygodniu i ponownie eksponowano w 25 tygodniu („Reboost”). Średnie wagi przedstawiono jako procent wagi początkowej dla każdej z grup. Waga kontroli przedstawiona zostałajako średnia wag wszystkich grup kontrolnych z ekspozycji po 6, 12 i 25-tygodniach, sumę 6 grup, które otrzymały DNA kontrolne lub placebo. Grupy zawierały początkowo po 10 zwierząt; myszy wyłączano z dalszej analizy wagi w przypadku śmierci.

178 626

Figura 26. Dorosłe (22-28 tygodniowe) samce fretek immunizowano i.m. przy użyciu 1 mg DNA kodującego NP z A/Beijing/89, 1 mg DNA kodującego Ml z A/Beijing/89 lub 1 mg obu DNA połączonych w dniu 0 i 42. Fretki kontrolne otrzymywały niekodujący DNA lub pełną ludzką dawkę (15 pg/szczep) licencjonowanej szczepionki przeciwgrypowej z całego wirusa (preparat 92-93) zawierającej A/Beijing/89 w dniu 0 i 42. Fretki eksponowano na A/Georgia/93 dnia 56. Uwalnianie wirusa w popłuczynach z nozdrzy oznaczano jak opisano powyżej. Uwalnianie wirusa dnia 3-5 porównywano z uwalnianiem u fretek, którym podano kontrolny DNA przez dwustronną analizę wariancji. Uwalnianie u fretek, którym podano DNA dla NP, Ml lub NP+M1 było znacząco mniejsze (odpowiednio p <0.0001,0.0016 i 0.0001) w porównaniu z fretkami kontrolnymi. Uwalnianie wirusa u fretek którym podawano NP (dane nie pokazane), M1 lub NP+M1 nie różniło się w sposób istotny od fretek, którym podano licencjonowaną szczepionkę (odpowiednio p=0.104,0.533 i 0.145). Dawka immunizująca 1 mg wybrana została arbitralnie; badania zależności od dawki przeprowadzono na naczelnych.

Figury 27. Grupy po 8 samców fretek, w wieku 22-25 tygodni, immunizowano przez domięśniowe podanie DNA kontrolnego, roztworu fizjologicznego soli lub DNA kodującego białka wirusa grypy A/PR/8/34, dnia 0,21 i 121, po czym poddano je ekspozycji donosowej na 200 TCID₅₀ A/pR/8/34 dnia 148. Immunizowane zwierzęta otrzymywały 1 mg DNA dla NP, lub 2 mg połączonego DNA dla NP, NS1, PB 1, PB2 i M1 (400 pg każdego z konstruktów). Zwierzęta kontrolne otrzymywały 0,5 ml/łapę soli fizjologicznej lub 1 mg DNA kontrolnego. Do analizy grupy otrzymującej sól fizjologiczną i DNA kontrolne połączono (Kontrola), takjak to zrobiono z grupą, która otrzymywała tylko DNA dla NP i połączenie innych genów białek wewnętrznych (Białka Wewnętrzne). Wykres przedstawia miana zakaźności popłuczyn z nozdrzy, w TCID50 na 50 pl z 3 ml płynu uzyskanego z płukania nozdrzy. Nierozcieńczone popłuczyny nozdrzy (naj niższe badane rozcieńczenie) uważane było za rozcieńczenie 1:10 wysięku z nozdrzy zaś pozytywną nierozcieńczoną próbkę oznaczono wartością 1 log. Miana powyżej 1 log oznaczono na podstawie interpolacji Reed-Muench wyniku trzech powtórzeń osiągających zakaźność 50%. Próbki uznawano za negatywne gdy nierozcieńczone próbki osiągały wartość 0 log. Wartości p pokazane na wykresie obliczone zostały dla fretek immunizowanych w stosunku do nieimmunizowanych w oznaczonych dniach przy użyciu testu t dla dwóch średnich. Wartości p dla całych krzywych obliczono dwustronną analizą wariancji i wynosiły one p <0.0001 dla NP w stosunku do kontroli i p <0.001 dla połączonych DNA w stosunku do kontroli.

Figura 28. Przeżywalność myszy immunizowanych DNA i poddawanych ekspozycji na wirusa grypy. Myszom wstrzykiwano i.m. 200 pg DNA kodującego HA z A/PR/34 lub kontrolny (niekodujący) DNA, trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych. Trzy tygodnie po ostatniej immunizacji myszy podawano ekspozycji całego układu oddechowego (przez wkroplenie donosowe w znieczuleniu), przy użyciu 1000 TCID50 A/PR/34. Dane wykreślono jako % przeżywalność wobec czasu po ekspozycji (n=9 lub 10 myszy na grupę).

Figura 29. Utrata wagi ciała u myszy immunizowanych DNA i poddawanych ekspozycji na wirusa grypy. Myszom wstrzykiwano i.m. 200 pg DNA kodującego HA z A/PR/34 lub kontrolny (niekodujący) DNA, trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych. Trzy tygodnie po ostatniej immunizacji myszy podawano ekspozycji całego układu oddechowego (przez wkroplenie donosowe w znieczuleniu), przy użyciu 1000 TCID50 A/PR/34. Dane wykreślonojako % początkowej wagi pojedynczych zwierząt, uśrednionej dla całej grupy, wobec czasu. (Padłe zwierzęta wyłączono ze średniej).

Figura 30. Przeżywalność myszy immunizowanych DNA i poddawanych ekspozycji na wirusa grypy. Myszom wstrzykiwano i.m. 1, 10 lun 100 pg DNA kodującego HA z A/PR/34 lub kontrolny (niekodujący) DNA, trzykrotnie w odstępach trzytygodniowych. Trzy tygodnie po ostatniej immunizacji myszy podawano ekspozycji całego układu oddechowego (prze wkroplenie donosowe w znieczuleniu), przy użyciu 1000 TCID„ A/PR/34. Dane wykreślono jako % przeżywalności wobec czasu po ekspozycji (n=9 lub 10 myszy na grupę).

Figura 31 Grupy po 8 samców fretek, w wieku 22-25 tygodni, immunizowano przez domięśniowe podanie DNA kontrolnego, roztworu fizjologicznego soli lub DNA kodującego

178 626 białka wirusa grypy A/PR/8/34, dnia 0,21 i 121, po czym poddano je ekspozycji donosowej na 200 TCID₅₀ A/PR/8/34 dnia 148. Immunizowane zwierzęta otrzymywały 1 mg DNA dla HA, lub 2 mg połączonego DNA dla HA, NP, NS1, PB1, PB2 i M 1(330 pg każdego z konstruktów). Zwierzęta kontrolne otrzymywały 0,5 ml/łapę soli fizjologicznej lub 1 mg DNA kontrolnego. Do analizy grupy otrzymujące sól fizjologiczną i DNA kontrolne połączono (Kontrola), tak jak to zrobiono z grupą, która otrzymała tylko DNA dla HA w połączeniu z innymi genami białek wewnętrznych (HA, HA+Białka Wewnętrzne). Wykres przedstawia miana zakaźności popłuczyn z nozdrzy, w TCID₅₀ na 50 μΐ z 3 ml płynu uzyskanego z płukania nozdrzy. Nierozcieńczone popłuczyny nozdrzy (najniższe badane rozcieńczenie) uważane było za rozcieńczenie 1:10 wysięku z nozdrzy zaś pozytywną nierozcieńczoną próbkę oznaczono wartością 1 log. Miana powyżej 1 log oznaczono na podstawie interpolacji Reed-Muench wyniku trzech powtórzeń osiągających zakaźność 50%. Próbki uznawano za negatywne gdy nierozcieńczone próbki osiągały wartość 0 log. Wartości p pokazane na wykresie obliczone zostały dla fretek immunizowanych w stosunku do nieimmunizowanych w oznaczonych dniach przy użyciu testu t dla dwóch średnich. Wartości p dla całych krzywych obliczono dwustronną analizą wariancji i wynosiły one <0.0001 dla HAwstosunku do kontrolii <0.0001 dla połączonych DNA w stosunku do kontroli.

Figura 32. Dorosłe (22-28 tygodniowe) samce fretek immunizowano i.m. przy użyciu 1 mg DNA kodującego HA z A/Georgia/93 w dniu 0 i 42. Fretki kontrolne otrzymywały niekodujący DNA lub pełną ludzką dawkę (15 μg/szczep) licencjonowanej szczepionki przeciwgrypowej z całego wirusa (preparat 92-93) zawierającej A/Beijmg/89 w dniu 0 i 42. Fretki eksponowano na A/Georgia/93 dnia 56. Uwalnianie wirusa w popłuczynach z nozdrzy oznaczano jak opisano powyżej. Uwalnianie wirusa dnia 1-6 porównywano z uwalnianiem u fretek, którym podano kontrolny DNA przez dwustronną analizę wariancji. Uwalnianie u fretek, którym podano DNA dla HA było znacząco mniejsze (p < 0.0001) w porównaniu z fretkami kontrolnymi.

Figura 33. Dorosłe (22-28 tygodniowe) samce fretek immunizowano i.m. przy użyciu 1 mg DNA kodującego NP z A/Hawaii/91 lub A/Beijing/89 w dniu 0 i 42. Fretki kontrolne otrzymywały niekodujący DNA lub pełną ludzką dawkę (15 μg/szczep) licencjonowanej szczepionki przeciwgrypowej z całego wirusa (preparat 92-93) zawierającej A/Beij ing/89 w dniu 0 i 42. Fretki eksponowano na A/Georgia/93 dnia 56. Uwalnianie wirusa w popłuczynach z nozdrzy oznaczano jak opisano powyżej. Uwalnianie wirusa dnia 1 -6 porównywano z uwalnianiem u fretek, którym podano kontrolny DNA przez dwustronną analizę wariancji. Uwalnianie u fretek, którym podano DNA HA A/Hawaii/91 było w sposób istotny niższe (p < 0.0001) w porównaniu z fretkami kontrolnymi. Uwalnianie wirusa u fretek którym podawano DNA HA A/Hawaii/91 różniło się w sposób istotny od fretek, którym podano licencjonowaną szczepionkę (p=0,021 dla HA A/Hawaii/91: badane dwustronnym testem ANOVA dla dni 1 -6); uwalnianie wirusa u fretek którym podawano DNA HA A/Beijing/89 (nie pokazane) nie różniło się w sposób istotny od fretek, którym podano licencjonowaną szczepionkę (p=0,058 dla HA A/Beijing/89: badane dwustronnym testem ANOVA dla dni 1-6).

Figura 34. Dorosłe (22-28 tygodniowe) samce fretek immunizowano i.m. przy użyciu 1 mg DNA kodującego HA z A/Hawaii/91 (patrz fig. 13) lub przy użyciu 330 μg każdego z DNA kodujących HA z A/Hawaii/91 i NP i Ml z A/Beijing/89, w dniu 0 i 42. Fretki kontrolne otrzymywały niekodujący DNA lub pełną ludzka dawkę (15 μg/szczep) licencjonowanej szczepionki przeciwgrypowej z całego wirusa (preparat 92-93) zawierającej A/Beijing/89 w dniu 0 i 42. Fretki eksponowano na A/Georgia/93 dnia 56. Uwalnianie wirusa w popłuczynach z nozdrzy oznaczano jak opisano powyżej. Uwalnianie wirusa dnia 1-6 porównywano z uwalnianiem u fretek, którym podano kontrolny DNA przez dwustronną analizę wariancji. Uwalnianie u fretek, którym podano DNA dla HA+NP+M1 było znacząco mniejsze (p < 0.0001) w porównaniu z fretkami kontrolnymi lub fretkami, które otrzymały DNA kodujące tylko HA (p=0.0053).

Figura 35. Dorosłe (22-28 tygodniowe) samce fretek immunizowano i.m. przy użyciu 1 mg

DNA kodującego HA z A/Georgia/93 lub przy użyciu 330 μg każdego z DNA kodującego HA z A/Hawaii/91 i NP i Ml z A/Beijing/89, w dniu 0 i 42. Fretki kontrolne otrzymywały niekodujący DNA lub pełną ludzką dawkę (15 μg/szczep) licencjonowanej szczepionki przeciwgry178 626 powej z całego wirusa (preparat 92-93) zawierającej A/Beijing/89 w dniu 0 i 42. Fretki eksponowano na A/Georgia/93 dnia 56. Uwalnianie wirusa w popłuczynach z nozdrzy oznaczano jak opisano powyżej. Uwalnianie wirusa dnia 1-6 porównywano z uwalnianiem u fretek, którym podano kontrolny DNA przez dwustronną analizę wariancji. Uwalnianie u fretek, którym podano DNA dla HA+NP+M1 nie było znacząco różne w porównaniu z fretkami, które otrzymały homologiczne DNA kodujące HA (p=0.064).

Figura 36. Sekwencja VIR.

Niniejszy wynalazek dostarcza środka farmaceutycznego, opartego na kwasach nukleinowych, mianowicie szczepionki polinukleotydowej, która po bezpośrednim wprowadzeniu do organizmu zwierzęcia, w tym kręgowców, jak ssaków i ludzie, wywołuje ekspresję kodowanych białek w organizmie zwierzęcia. Gdy białko należy do nie występujących normalnie w organizmie, z wyjątkiem sytuacji patologii, jak białko związane z wirusem grypy, nukleoproteina wirusa grypy, układ odpornościowy zwierzęcia jest aktywowany, rozwijając ochronną odporność. Ponieważ to białko egzogenne wytwarzane jest przez własne tkanki zwierzęcia, ekspresj ono wane białka obrabiane są i prezentowane przez główny układ zgodności tkankowej, MHC. Rozpoznawanie jest analogiczne do zachodzącego podczas prawdziwego zakażenia przez pokrewny mikroorganizm. Wynikiem, jak to pokazano w tym opisie, jest wywołanie odpowiedzi odpornościowej, która chroni przed zakażeniem.

Szczepionka według wynalazku zawiera wektor plazmidowy DNA wybrany z grupy składającej się z pnRSV, VI, VIJ, V1R, VI Jns i VI Jneo, który obejmuje co najmniej jeden element regulujący transkrypcję funkcjonalnie związanąz sekwencją nukleotydową koduj ącą nukleoproteinę wirusa grypy, oraz farmaceutycznie dopuszczalny bufor lub nośnik.

W zakres wynalazku wchodzą tez konstrukty DNA wybrane z (a) pn RSV-PR-NP;

(b) V1 J-PR-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 12;

(c) VI Jneo-BJ-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 20, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr. 21;

(d) V1 Jneo-TX-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 24, a koniec 3 stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 25;

(e) VI Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), któryjest konstruktem o wielkości 6,42 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 52, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 53;

(f) VI Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), któryjest konstruktem o wielkości 6,54 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 56, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 57.

W zakres wynalazku wchodzi też ekspresyjny plazmidowy wektor DNA, którym jest VI Jns o sekwencji przedstawionej w Identyfikatorze Sekw. nr 45 (fig. 36 i 17).

Wynalazek dostarcza kwasów nukleinowych, które wprowadzone do zwierzęcych tkanek in vivo przez wstrzyknięcie, inhalację czy wprowadzenie analogicznym sposobem, opisanym powyżej, prowadzą do ekspresji genów ludzkiego wirusa grypy. Tak więc, wstrzyknięcie konstruktów DNA, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, do mięśni myszy, wywołuje ekspresj ę kodowanych produktów genów. Podobnie u fretek i rezusów. W następstwie ekspozy cj i na zaraźliwego wirusa grypy, w dawkach, które zabijają zwierzęta kontrolne, zwierzęta, którym wstrzyknięto szczepionkę wykazują znacznie zmniejszoną chorobowość i śmiertelność. Stąd, wynalazek niniejszy obejmuje szczepionkę użyteczną w zapobieganiu zakażeniom wirusem grypy.

Wykazano, że konstrukty DNA kodujące białka wirusa grypy, wywołują ochronną odpowiedź odpomościowąu zwierząt. Jak to będzie opisane bardziej szczegółowo poniżej odpowiedź odpornościowa u zwierząt obejmuje wytwarzanie przeciwciał i CTL u myszy, wytwarzanie przeciwciał u fretek i naczelnych oraz ochronę przed ekspozycjąna wirusa myszy i fretek przy użyciu szczepu wirusa grypy homologicznego, zdryfowanego antygenowo i zmienionego antygenowo. Prawdopodobnie najbardziej uderzającym wynikiem immunizacji przy użyciu DNA kodującego białka wirusowe, jest zdolność do zapewniania odporności przeciwko różnym podtypom wirusa.

178 626

Sugeruje to, że dodanie do szczepionki składowej wywołującej CTL powinno służyć opanowaniu uderzenia nowych odmian powstających w trakcie sezonu lub niespodziewanych w momencie wybierania szczepów do tworzenia szczepionki na następny rok. Immunizacja fretek przy użyciu wektorów cDNA kodujących geny HA, NP i Ml zdolna była chronić bardziej efektywnie przed zdryfowanym antygenowo szczepem wirusa niz licencjonowana szczepionka. Dostarcza to przesłanek do zastosowania konstruktorów kodujących geny białek wewnętrznych w PNV.

Oczekiwane zalety nad obecnymi, licencjonowanymi szczepionkami obejmują: zwiększony zakres ochrony z powodu odpowiedzi CTL ± zwiększony zakres przeciwciał i zwiększony czas trwania ochrony. Podejście PNV unika konieczności tworzenia, wybierania i hodowaniajak ma to miejsce we współczesnych licencjonowanych szczepionkach ponieważ nowe konstrukty DNA mogą być wytwarzane bardziej bezpośrednio z izolatu klinicznego.

W jednym z wykonań wynalazku sekwencja nukleoproteiny ludzkiego wirusa grypy uzyskana ze szczepu A/PR/8/34 wklonowana została do wektora ekspresyjnego. Wektor zawiera promotor dla transkrypcji dla polimerazy RNA, i terminator transkrypcji pod koniec sekwencji kodującej NP. W korzystnym wykonaniu promotorem jest LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV) będący silnym promotorem transkrypcyjnym. W korzystniejszym wykonaniu promotora jest promotor wirusa cytomegalii wraz z sekwencją introna A (CMV-intA). Korzystnym terminatorem transkrypcyjnym jest terminator wołowego hormonu wzrostu. Połączenie CMVintA-terminator BGH jest szczególnie korzystne. Dodatkowo, w celu nadzorowania wytwarzania środka farmaceutycznego, dodany jest korzystnie do wektora ekspresyjnego, marker oporności na antybiotyk. Użyte być mogą geny oporności na ampicylinę, geny oporności na neomycynę lub inne farmaceutycznie dopuszczalne markery oporności na antybiotyk. W najkorzystniejszym wykonaniu, gen oporności na antybiotyk koduje produkt genu oporności na neomycynę. Dalej, by wspomóc wytwarzanie w dużych ilościach środka farmaceutycznego, przez fermentację z użyciem organizmów prokariotycznych, korzystne jest by wektor posiadał początek replikacji oraz by występował w licznych kopiach. Każdy z dostępnych w handlu wektorów prokariotycznych do klonowania posiada powyższe zalety. W najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku, korzyści te zapewniane są przez dostępne w handlu wektory znane jako pUC. Pożądane jest usunięcie zbędnych sekwencji DNA. Stąd, wjednym z wykonań wynalazku sekwencje kodujące lacZ i lacl usunięto z pUC.

W jednym z wykonań, użyto wektora ekspresyjnego pnRSV, w którym jako promotora użyto LTR wirusa mięsaka Rousa (RSV). W innym wykonaniu użyto V1, zmutowanego wektora pBR322, do którego wklonowano promotor CMV i terminator transkrypcyjny BGH. Konstruktu V1 -NP użyto do immunizacji myszy i wywołania CTLi chroniących przed ekspozycjąheterologiczną. W szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, elementy VI połączono tworząc wektor ekspresyjny nazwany VIJ. Do VIJ klonowano gen wirusa grypy NP z A/PR/8/34. Wjeszcze innym wykonaniu, z V1J usunięto gen oporności na ampicylinę i zamieniono na gen oporności na neomecynę tworząc VI J-neo (Identyfikator Sekw. nr: 18; fig. 7), do którego wklonowano genNP wirusa grypy w celu zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem. W jeszcze innym wykonaniu, użyto wektora V1Jns, identycznego z V1J z wyjątkiem tego, że wytworzono unikalne miejsce restrykcyjne Sfil w pojedynczym miejscu KpnI w pozycji 2114 wektora V1J-neo. Występowanie miejsc Sfil w ludzkim genomowym DNA jest bardzo rzadkie (około 1 miejsce na 100000 zasad). Stąd, wektor ten pozwala dokładnie monitorować integrację wektora ekspresyjnego z DNA nosiciela, przez proste trawienie Sfil ekstrahowanego genomowego DNA. W dalszym ulepszeniu, użyto wektora oznaczonego V1R. W wektorze tym usunięto tyle niepotrzebnego DNA ile to jest możliwe, tworząc wysoce zwarty wektor. Wektor ten jest pochodną V1Jns i pokazany jest na figurze 36 (Identyfikator Sekw. nr 45). Wektor ten umożliwia użycie większych wstawek, zmniejszając problem niepożądanych sekwencji i polepszając pobieranie przez komórki gdy konstrukt kodujący swoiste białka wirusa grypy wprowadzony jest do otaczających tkanek. Na figurze 36, części V1Jneo (figura 7), które zostały usunięte przedstawiono jako przerwy, zaś wprowadzone sekwencje zaznaczone są wytłuszczonym drukiem, przy zachowaniu niezmienionej numeracji V1Jneo. Opisane modyfikacje wektora i opracowanie procedur

178 626 mogąbyć wykonane zgodnie z metodami znanymi znawcom dziedziny. Opisane szczególne produkty jednakże, uzyskane konwencjonalnymi środkami, są szczególnie użyteczne do komkretnych zastosowań do których zostały zaadaptowane.

Podczas gdy jedno z wykonań niniejszego wynalazku obejmuje gen NP wirusa grypy ze szczepu A/PR/8/34, bardziej korzystne wykonania obejmują użycie genu NP z bardziej współczesnego izolatu wirusa grypy. Jest to do wykonania przez przygotowanie kopii DNA genów wirusowych i klonowanie pojedynczych genów. Sekwencje wielu licznych szczepów wirusa grypy są obecnie dostępne powszechnie w GENBANK (około 509 sekwencji genów wirusa grypy typu A). Stąd, każdy z tych genów, klonowany z najnowszych izolatów Texas, Beijing czy Panama, które są szczepami zalecanymi przez Center for Disease Control jako uzyteczne w szczepionkach przeciwgrypowych, jest korzystny w niniejszym wynalazku (patrz FLU-IMMUNE® szczepionka wirusa grypy f-my Lederle, Physicians Desk Reference, 1993, str. 1232, triwalentna szczepionka oczyszczonego antygenu powierzchniowego wirusa grypy zawierająca białko hemaglutyniny z A/Texas/36/91, H1N1; A/Beijing/353/89, H3N2; B/Panama/45/90). W ceiu spójnej terminologii używana będzie następująca konwencja opisywania konstruktów DNA: „Nazwa wektora-szczep wirusa grypy-gen”. Stąd, konstrukt w którym gen NP ze szczepu A/PR/8/34 wklonowany jest do wektora ekspresyjnego V1Jneo, nazwano: „V1Jneo-PR-NP”. Oczywiście, wraz ze zmianą czynnika etiologicznego konkretny gen, optymalny do inkorporacji do środka farmaceutycznego może się zmienić. Jednakże, jak to pokazano poniżej, ponieważ wywołanajest odpowiedź limfocytów cytotoksycznych, które są zdolne do ochrony przed szczepami heterologicznymi, zmienność szczepujest mniej znacząca przy zastosowaniu szczepionek, będących przedmiotem wynalazku, w porównaniu ze szczepionkami opartymi na całym wirusie czy podjednostce polipeptydowej. Dodatkowo, ponieważ środek farmaceutyczny jest łatwy do modyfikowania przez wprowadzanie nowego genu, jest to dostosowanie łatwe do wykonania z użyciem standardowych technik biologii molekularnej.

Ponieważ sekwencja nukleoproteiny jest zakonserwowana wśród szczepów grypy, uzyskanajest ochrona przed następującąpóźniej ekspozycjąna zakaźny szczep wirusa grypy typu A, heterologicznego w stosunku do szczepu z którego sklonowano gen dla nukleoproteiny. Porównanie NP z licznych szczepów grypy typu A nie wykazało istotnych różnic w strukturze drugorzędowej [M.Gammelin i in., Virol. 170, 71, 1989] i bardzo nieliczne zmiany w sekwencji aminokwasowej [O.T. Gorman i in., J. Virol. 65, 3704, 1991], Przez okres około 50 lat, NP w szczepach ludzkich ewoluował w tempie 0,66 aminokwasu rocznie. Ponadto, wyniki pokazujące, że CTL swoiste dla A/HK/68 rozpoznają komórki docelowe poddane pulsowi syntetycznego peptyduNP (147-155) uzyskanego z sekwencji NP szczepu A/PR/8/34, wska^iyjąże epitop ulegający restrykcji H-2K^d pozostał nienaruszony przez okres 34 lat (patrz figura 2). Warte odnotowaniajest również to, że gdy gen koduje wirusowy antygen powierzchniowy, wywoływanajest znacząca odpowiedź humoralna (przeciwciał) dodatkowo do bardzo istotnej odpowiedzi limfocytów cytotoksycznych.

Wstrzyknięcie i.m. wektora ekspresyjnego DNA kodującego zakonserwowane, wewnętrzne białko grypy typu A, powoduje wytworzenie znaczącej ochronnej odporności przed następową ekspozycją na wirusa. W szczególności, wytwarzane są przeciwciała swoiste dla NP i pierwotne CTLe. Immunizacja przy użyciu DNA dla NP powoduje spadek mian wirusa w płucach, zahamowanie utraty wagi i zwiększenie przeżywalności w porównaniu z kontrolą. Ochronna odpowiedź odpomościowanie nie jest zależna od przeciwciał swoistych dla NP, jak to wykazano przez brak efektu samych przeciwciał anty-NP (patrz przykład 4) w zwalczaniu zakażenia wirusowego i zależy raczej od swoistej dla NP odporności komórkowej. Ponadto, wytworzyły się znaczne poziomy pierwotnych CTLi skierowanych przeciwko NP. Ochrona skierowana była przeciwko zakaźnemu szczepowi grypy typu A, który był heterologiczny w stosunku do szczepu, z którego sklonowano DNA. Dodatkowo, szczep, którego użyto do ekspozycji, powstał ponad trzy dziesięciolecia po szczepie A/PR/8/34, co wskazuje, ze odpowiedź odpornościowa skierowana przeciwko zakonserwowanym białkom może być efektywna mimo zmian antygenowych i dryfu antygenowego zmiennych białek powierzchniowych. Ponieważ każdy z produktów

178 626 genów wirusa grypy przejawia pewien stopień zakonserwowania, oraz ponieważ CTLe mogą być wywołane w odpowiedzi na wewnątrzkomórkową ekspresję i obróbkę MHC, możliwe jest do przewidzenia, że inne geny wirusa grypy mogą wzbudzić odpowiedź podobną do uzyskanej przy użyciu NP. Sposoby identyfikacji epitopów immunogenncyh są dobrze znane specjalistom [patrz przykładowo Shirai i in., J. Immunol. 148:1657-1667, 1992; Chopin i in., J. Immunol. \4Ί:5Ί5-5%3,1991; Calin-Laiu-ensi in., Vaccine 11:974-978,1993]. Tak więc, sklonowano wiele z tych genów, jak to pokazano przez sklonowanie i selekcjonowanie miejsc połączeń w wektorach ekspresyjnych (patrz niżej) tak, że konstrukty te są czynnikami profilaktycznymi w dostępnej postaci.

Tak więc, wynalazek dostarcza wektorów ekspresyjnych kodujących białka wirusa grypy jako immunogen. Szczepionka według wynalazku pozwala na wywoływanie międzyszczepowej odporności bez potrzeby użycia czynników samoreplikujących lub adjuwantów. Dodatkowo, immunizacja przy użyciu DNA posiada liczne zalety. Po pierwsze, takie podejście do immunizacji powinno być możliwe do zastosowania w stosunku do nowotworów jak i do czynników zakaźnych, ponieważ odpowiedź ze strony CTLi CD8+jest istotna dla obu procesów patofizjologicznych [K. Tanaka i in., Annu. Rev. Immunol. 6, 359 (1988)]. Stąd, wywołanie odpowiedzi odpornościowej przeciwko białkom kluczowym w transformacji nowotworowej może być efektywnym sposobem ochrony przed rakiem lub immunoterapią. Po drugie, wytworzenie wysokich mian przeciwciał przeciwko wyrażanym białkom po wstrzyknięciu białka wirusowego (NP) oraz DNA dla ludzkiego hormonu wzrostu [patrz przykładowo D.-c. Tang i in., Nature 356,152, 1992] wskazuje, że jest to łatwy i wysoce wydajny sposób wytwarzania szczepionek opartych na przeciwciałach, oddzielnie bądź w połączeniu ze szczepionkami opartymi na limfocytach T cytotoksycznych, skierowanych przeciwko zakonserwowanym antygenom.

Łatwość wytwarzania i oczyszczania konstruktów DNA stanowi zaletę w porównaniu z tradycyjnym oczyszczaniem białek, ułatwiając wytwarzanie szczepionek złożonych. Stąd, można przygotować wiele konstruktów kodujących, zmieszać je i podać razem. Na koniec, ponieważ po wstrzyknięciu DNA ekspresja białka utrzymuje się [H. Lin i in., Circulation 82,4138 (1991);

E. Hansen i in., FEBS Lett. 290,73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3,21 (1992); J.A. Wolff i in., Human. Mol. Genet. 1, 363 (1992)] trwałość pamięci limfocytów B i T może być zwiększona [D. Gray i P. Małzinger, J. Exp. Med. 174,969(1991); S. Oeheniin.,ibid. 176,1273 (1992)] przedłużając długotrwałą odporność humoralnąi komórkową.

Obecne ograniczenia licencjonowanych szczepionek przeciwgrypowych uwydatniają konieczność opracowania bardziej efektywnych środków zapobiegania zakażeniom i złagodzenia choroby. Dawne szczepionki zapewniały ograniczoną ochronę, były efektywne tylko wobec kilku wybranych szczepów wirusa i traciły swoje działanie po krótkim czasie. Stąd, obecne szczepionki muszą być modyfikowane do corocznych szczepień w celu zachowania swej efektywności. Wytworzenie polepszonej odpowiedzi CTL przeciwko białkom wewnętrznym powinno zapewnić znaczną, długotrwałą i międzyszczepową odporność, które nie zapewniają licencjonowane szczepionki.

Wykazano ekspresję białka przy użyciu konstruktów PNV u myszy, fretek i naczelnych przez wykrycie odpowiedzi odpornościowej gospodarza przeciwko antygenom wirusa grypy. Wstrzyknięcie myszom DNA kodującego NP wirusa grypy spowodowało zwiększoną przeżywalność, zmniejszone miana wirusa w płucach i zmniejszenie utraty wagi w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, w następstwie ekspozycji na podtypy wirusa grypy (zmienione antygenowo szczepy) różniące się DNA od wprowadzonego do konstruktów. Obserwowano również zmniejszone uwalnianie wirusa w następstwie ekspozycji na zmienione szczepy fretek immunizowanych DNA dla NP. Wyniki te wskazują, że ochrona przed znacznymi zmianami szczepów wirusa grypy wspomożona jest szczepionką DNA, zawierającą geny kodujące NP.

Odpowiedź odpornościowa na DNA wirusa grypy obserwowana była u myszy nawet przez sześć miesięcy po wstrzyknięciu, z utrzymywaniem się przeciwciał, aktywnością CTL i ochroną in vivo. Powtórne wstrzyknięcia DNA dalej zwiększająpezeżywalsość po ekspozycji

178 626 w 25 tygodni później przy użyciu szczepu wirusa grypy innego podtypu i wskazująna możliwość przypomnienia ochronnej odporności komórkowej.

Wyniki doświadczeń wskazują, że bezpośrednie wstrzyknięcie DNA zapewnia ulepszoną metodę ochrony ludzi przed zakażeniem wirusem grypy i chorobą. Warte odnotowania jest, że doświadczalną ochronę przez wstrzyknięcie DNA uzyskano przez szczepienie myszy i fretek, które nie miały dotąd kontaktu z grypą. Dorośli ludzie szczepieni DNA byliby już eksponowani na wirusa grypy. Osoby te powinny wykazywać jeszcze silniejszą odpowiedź odpornościową, prawdopodobnie o większej trawałości, w następstwie immunizacji konstruktami DNA.

Zakres dawek powinien być porównany z immunogennością w celu optymalizacji stosowanych stężeń. W doświadczeniach na małych ssakach, dawki rzędu 1 pg dNA dla NP indukowały przeciwciała i odpowiedź CTL. W osobnym doświadczeniu afrykańskim małpom zielonym, które dotąd nie miały kontaktu z antygenem, wstrzyknięto DNA kodujący NP wirusa grypy typu A. Trzy z trzech małp w każdej grupie odpowiedziały na szczepionki zawierające 10 pg lub Ϊ0ϋ pg każdego z pięciu konstruktów. W oparciu o to odkrycie możliwe do przewidzenia jest, że dawki 10, 50, 100 i 200 pg DNA są efektywne u ludzi.

Efektywność u ludzi wykazano na ochotnikach, którzy otrzymali przeciwgrypową szczepionkę DNA, po czym poddani zostali ekspozycji donosowej w celu zbadania efektywności szczepionki w stosunku do podobnych szczepów wirusa jak również szczepów wirusa grypy innych podtypów. Skład, dawkowanie i schemat podawania szczepionki oparty jest na poprzednich badaniach. Efektywność kliniczną wykazano przez określenie odsetka zakażeń, miary choroby i czasu trwania choroby. Dane kliniczne porównano z badaniami laboratoryjnymi odpowiedzi odpornościowej gospodarza i uwalniania wirusa w celu określenia czynników korelujących z ochroną.

Standardowe techniki biologii molekularnej przygotowywania i oczyszczania konstruktów DNA umożliwiają wykonanie środków farmaceutycznych opartych na DNA, będących przedmiotem wynalazku. O ile standardowe techniki biologii molekularnej są wystarczające do wytwarzania produktów niniejszego wynalazku, specyficzne konstrukty ujawnione tu zapewniają nowe środki lecznicze, które nieoczekiwanie wywołują odporność krzyżową, wynik dotychczas nieosiągalny przy zastosowaniu standardowych szczepionek opartych na inaktywowanym całym wirusie czy białku podjednostki.

Ilość DNA zdolnego do ekspresji wprowadzanego osobnikowi przyjmującemu szczepionkę zależy od siły promotorów transkrypcyjnych i translacyjnych użytych w konstrukcje DNA i od immunogenności ekspresjonowanego produktu genu. Ogólnie, podaje się domięśniowo immunologicznie i profilaktycznie efektywną dawkę rzędu 1 pg do 1 mg, najkorzystniej od około 10 pg do 300 pg. Możliwe jest również wstrzyknięcie podskórne, wprowadzenie przezskóme, oraz inne sposoby podawaniajak podanie dootrzewnowe, dożylnie czy w inhalacji. Możliwe jest również szczepienie przypominające.

DNA może być „nagi” tzn. nie związany z żadnym białkiem adjuwantem czy ińnymi czynnikami wpływającymi na układ odpornościowy biorcy. W tym przypadku DNA powinien znajdować się w fizjologicznie dopuszczalnym roztworze jak, przykładowo, roztwór fizjologiczny soli lub zbuforowany roztwór fizjologiczny soli. Alternatywnie, DNA może być związany z liposomami jak liposomy lecytynowe czy inne liposomy znane specjalistom jako mieszaniny DNA z liposomami (patrz przykładowo W09324640) lub DNA może być związany ze znanymi adiuwantami w celu wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej, jak białko czy inny nośnik. Czynniki wspomagaj ące pobieranie DNA przez komórki jak np. j ony wapnia, białka wirusowe czy inne czynniki wspomagające transfekcję mogą być również użyte z korzyścią. Czynniki te oznaczają głównie czynniki wspomagające transfekcję oraz farmaceutycznie dopuszczalne nośniki. W znaczeniu tu użytym określenie gen dotyczy segmentu kwasu nukleinowego kodującego osobny polipeptyd. Określenie środek farmaceutyczny i szczepionka używane są zamiennie w celu określenia kompozycji użytecznej w wywoływaniu odpowiedzi odpornościowej. Określenia konstrukt i plazmid używane są zamiennie. Określenie wektor używanejest w celu określenia DNA do którego mogą być klonowane geny do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

178 626

Sposób wywołania odpowiedzi odpornościowej in vivo u kręgowca, takiego jak ssak, w tym także człowiek, obejmuje: ’ ’

a) wyizolowanie genu,

b) połączenie genu z sekwencjami regulatorowymi w taki sposób, ze gen jest połączony operacyjnie z sekwencjami kontrolującymi, które po wprowadzeniu do żywej tkanki kierują zapoczątkowaniem transkrypcji i następnie translacją genu,

c) wprowadzenie genu do żywych tkanek, i

d) ewentualnie, wzmożenie odpowiedzi przy użyciu dodatkowego genu wirusa grypy.

Najkorzystniejsze zastosowanie wynalazku stanowi sposób ochrony przed heterologicznymi szczepami wirusa grypy. Uzyskiwane jest to przez podanie efektywnej immunologicznie ilości kwasu nukleinowego kodującego zakonserwowane epitopy wirusa grypy. Przykładowo, funkcję tę spełnia cały gen nukleoproteiny wirusa grypy, i uważa się, że sekwencje kodujące inne geny wirusa grypy oraz ich fragmenty kodujące zakonserwowane epitopy w obrębie tych genów powinny zapewnić odporność krzyżową..

Przykłady korzystnych konstruktów DNA kodujących białko wirusa grypy obejmują·

a) pnRSV-PR-NP,

b) V1-PR-NP,

c) V1-PR-NP, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 12,

d) V1-PR-PB1, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 13,

e) V1-PR-NS, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 14,

f) V1-PR-HA, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw-’. nr 15,

g) V1-PR-PB2, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 16,

h) V1-PR-M1, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 17,

i) V1neoBJ-NP, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 20, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 21,

j) V1 neo-TX-NP, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 24, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 25,

k) V1neo-PA-HA, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 26, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 27,

l) VIns-GA-HA (A/Georgia/03/93), wielkość konstruktu 6.56 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 46, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 47,

m) V1ns-TX-HA (A/Texas/3 6/91 ), wielkość konstruktu 6.5 6 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 48, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 49,

n) Vlns-PA-HA (B/Panama/45/90), wielkość konstruktu 6.61 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 50, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 51,

o) Vlns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), wielkość konstruktu 6.42 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 52, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 53,

p) V1ns-BJ-M1 (A/Beijing/353/89), wielkość konstruktu 5.62 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 54, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 55,

q) V1ns-PA-NP (B/Panama/45/90), wielkość konstruktu 6.54 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 56, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 57,

r) V1ns-PA-M1 (B/Panama/45/90), wielkość konstruktu 5.61 Kb, którego koniec 5' stanowi Identyfikator Sekw. nr 58, a koniec 3' stanowi Identyfikator Sekw. nr 59.

Poniższe przykłady dostarczono w celu dalszego zdefiniowania wynalazku, bez ograniczania wynalazku do specyficznych przykładów.

Przykładl. Przykład konstruktów DNA kodujących białka ludzkiego wirusa grypy. i) pnRSV-PR-NP: Gen NP z A/PR/8/34 wyizolowano z pAPR-501 [J.F. Young i in., „The

Origin ofPandemie Influenza Viruses”, W.G. Laver, wyd. (Elsevier Science Publishing Co., Inc.,

1983)] jako fragment EcoRI wielkości 1565 par zasad, końce wypełniono fragmentem Klenowa i wklonowano do traktowanego fragmentem Klenowa i fosfatazą miejsca Xbal w pRSV-BL.

pRSV-BL skonstruowano przez trawienie wektora pBL-CAT3 [B. Lucków i G. Schutz, Nuci.

Acids Res. 15,5490 (1987)] przy użyciu Xhol i Ncol w ceiu usunięcia sekwencji kodującej CAT

178 626 po czym wypełniono fragment Klenowa i religowano. Fragment zawierający promotor RSV wyizolowano jako fragment Ndel-Asp718 z pRshgmx [V. Giguere i in., Nature 330, 624 (1987)], wypełniono fragmentem klenowa i wklonowano w miejsce HindIII pośredniego wektora wytworzonego w sposób opisany powyżej (pBL-CAT pozbawiony sekwencji CAT).

ii) V1 -NP: Wektor ekspresyjny V1 skonstruowano z pCMVIE-AKIDHFR [Y. Whang i in., J. Virol. 61, 1796 (1987)]. Geny AKI i DHFR usunięto przez cięcie wektora EcoRI i religację. Wektor nie zawierał introna A w promotrze CMV, więc dodano go jako produkt PCR, w którym usunięto wewnętrzne miejsce SacI [wpozycji 1855 według numeracji B.S. Chapmana i in., Nuci. Acids Res. 19,3979(1991)] .Matry cąużytą do reakcji PCR był pCMVintA-Lux, wykonany przez ligację fragmentu Hindlll-Nhel z pCMV6al20 [patrz B.S. Chapman i in., ibid.] zawierający wzmacniacz/promotor hCMV-IEl i intron A, w miejsce HindIII i Xbal pBL3 tworząc pCMVntBL. Fragment genu lucyferazy, wielkości 1881 par zasad (Hindlll-Smal wypełniony fragmentem Klenowa) z RSV-Lux [J.R. de Wet i in., Mol. Cel. Biol. 7,725,1987] wklonowano w miejsce Sall wektora pCMVIntBL, wypełnione fragmentem klenowa i traktowane fosfatazą.

Użyto starterów obejmujących intron A: starter 5', Identyfikator Sekw. nr 5:

5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3'.

starter 3', Identyfikator Sekw. nr 6:

5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3'.

Startery użyte do usunięcia miejsca SacI: starter sensowny, Identyfikator Sekw. nr 7:

5'-GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. nr 8: 5'-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3'.

Fragment PCR cięto SacI i BgUI i wprowadzono do wektora ciętego tymi samymi enzymami. Gen NP wirusa grypy A (A/PR/8/34) wycięto z pAPR501 [J.F. Young i in., „The Origin of Pandemie Influenza Viruses”, W.G. Laver, wyd. (Elsevier Science Publishing Co., Inc., 1983)] jako fragment EcoRI wielkości 1565 par zasad i wypełniono. Wprowadzono go do VI w wypełnione miejsce Bglll tworząc V1 -NP. Plazmid namnożono w E. coli i oczyszczono metodąlizy alkalicznej [J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual” wyd. drugie {Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. Wirowany na gradiencie CsCl DNA precypitowano etanolem i rozpuszczono w 0,9% roztworze soli w stężeniu 2 mg/ml do wstrzyknięć.

Przykład2. Test limfocytów T cytotoksycznych w stosunku do ludzkiego wirusa grypy.

Limfocyty T cytotoksyczne pozyskano od myszy, które były immunizowane DNA i wyzdrowiały z zakażenia A/HK/68. Hodowle kontrolne uzyskano od myszy, którym wstrzyknięto DNA kontrolny oraz od myszy nienastrzykniętych niczym. Przygotowano zawiesinę jednokomórkową, erytrocyty usunięto przez lizę chlorkiem amonowym i hodowano splenocyty w RPMI 1640 z dodatkiem 10%o wołowej surowicy płodowej (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 pg/ml streptomycyny, 0,01 M HEPES (pH 7,5) oraz 2 mM L-glutaminy. Dodano równą liczbę autologicznych, napromieniowanych komórek stymulatorowych, poddanych działaniu przez 60 min. peptydowego epitopu ulegającego restrykcji H-2K^d NP 147-155 (Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Val, Identyfikator Sekw. nr 9) w stężeniu 10 pM lub zakażonych wirusem grypy A/PR/8/34 (H1N1) i 10 U/ml rekombinowanej ludzkiej IL-2 (Cellular Products, Buffalo, NY) po czym hodowano przez 7 dni w temp. 37°C w atmosferze 5% CO₂ i 100% względnej wilgotności. W pewnych doświadczeniach w miejsce autologicznych komórek stymulatorowych dodawano rhIL-2 (20 U/ml) i ConA (2 pg/ml). Aktywność cytotoksyczna limfocytów T oznaczana była z użyciem komórek P815 znakowanych przez 3 h przy użyciu 60 pCi 5¹Cr/ 10⁶ komórek i poddanych działaniu NP 147-155 jak to opisano wyżej, lub zakażonych wirusem grypy A/Victoria/73 (H3N2). Komórki docelowe kontrolne (znakowane komórki P815 bez peptydu czy wirusa) nie były niszczone. Komórki docelowe wysiewano w gęstości 1x10⁴ komórek/studzienkę w okrągłodennych płytkach 96-studzienkowych i inkubowano z komórkami efektorowymi przez 4 godziny w trzykrotnych powtórzeniach. Nadsącz (30 pl) pobierano z każdej ze stu20

178 626 dzienek i zliczano w liczniku scyntylacyjnym Betaplate (LKB-Wallac, Turku, Finland). Dla każdego preparatu komórek docelowych oznaczono zliczenia maksymalne, uwolnione przez dodanie 6M HCl i spontaniczne zliczenia uwolnione bez CTL. Procent lizy właściwej obliczono następująco:

[(doświadczałna-spontaniczna)/(maksymalna-spontaniczna)]x 100

Przykład 3. Wytwarzanie CTL I przeciwciał swoistych w stosunku do NP in vivo.

Myszom BALB/c wstrzykiwano w mięśnie czworogłowe obu łap cDNA plazmidowe kodujące nukleoproteinę A/PR/8/34 kierowaną przez promotor wirusa mięsaka Rousa lub wirusa cytomegalii.

Używano wektorów ekspresyjnych:

i) pnRSY-PRnp. patrz przykład 1;

ii) V1-NP, patrz przykład 1.

Używano samic myszy BALB/c, uzyskanych z Charles River Laboratories, Raleigh, NC. Myszy uzyskano w wieku 4-5 tygodni i wstępnie wstrzyknięto im DNA w wieku 5-6 tygodni. O ile nie zaznaczono inaczej, wstrzyknięcia DNA wykonywano w mięśnie czworogłowe obu łap, po 50 pl stearylnego roztworu soli zawierającego 100 pg DNA na łapę. Myszy otrzymywały 1,2 lub 3 zestawy wstrzyknięć w 3 tygodniowych odstępach. Kontrole negatywne pozostawały bez wstrzyknięć lub otrzymywały odpowiedni pusty wektor, pozbawiony wprowadzonego genu NP.

Obecność lub brak DNA plazmidowego zawierającego gen NP w mięśniach wybranych zwierząt analizowano przez PCR (fig. 1). DNA plazmidowy (DNA dla Np lub lucyferazy) stwierdzono w 44 na 48 badanych mięśni. U myszy, którym wstrzyknięto DNA dla lucyferazy, ekspresję białka wykazano aktywnością lucyferazy uzyskanąz ekstraktów mięśni, zgodnie z metodami znanymi znawcom dziedziny [J.A. Wolff i in., Science 247,1465 (1990); G. Ascardi i in., Nature352, 815 (1991); H. Lin i in., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis i in., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88,4138 (1991); E. Hansen i in., FEBS Lett. 290,73 (1991); S. Jiao i in., Hum. Gene Therapy 3,21 (1992); J.A. Wolff i in., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)].

Ekspresja NP w mięśniach po wstrzyknięciu DNA dla NP była poniżej granicy wykrywalności analizy met. Western biot (<1 ng) ale wykazywana produkcją swoistych dla NP przeciwciał (patrz fig. 2). Do zbadania powstawania CTL NP-swoistych pobierano śledziony 1-4 tygodni po immunizacj i po czym restymulowano splenocyty rekombinowaną, ludzką IL-2 z dodatkiem autologicznych splenocytów, które zakażono wirusem grypy A (A/PR/8/34) lub poddawano działaniu peptydowego epitopu nukleoproteiny, ulegającego restrykcji H-2Kd (reszty NP 147-155, patrz O.K. Rótzscke i in., Nature 348,252 (1990)). Splenocyty restymulowane zakażonymi wirusem lub poddanymi działaniu peptydu syngenicznymi komórkami zdolne były do zabijania komórek docelowych poddanych działaniu epitopu nukleoproteiny (fig. 3A). Wskazuje to, ze wstrzyknięcie i.m. DNA dlaNP wywołuje odpowiedni peptydpochodzący zNP wpołączeniu z MHC klasy I do indukcji swoistej odpowiedzi CTL. CTLe te zdolne są do rozpoznawania i niszczenia komórek docelowych zakażonych wirusem (fig. 3B) lub komórek docelowych poddanych działaniu peptydowego epitopu nukleoproteiny, ulegającego restrykcji H-2kd, oraz komórek docelowych zakażonych wirusem. Pokazuje to ich swoistość jak również ich zdolność do wykrywania epitopu produkowanego w zakażonych komórkach.

Bardziej surowym pomiarem immunogenności szczepionki DNA NP było badanie pierwotnej odpowiedzi CTL. Splenocyty pobrane od myszy, którym wstrzyknięto DNA dlaNP, aktywowane były przez ekspozycję na ConA i IL-2, ale nie były poddawane restymulacji in vitrokomórkami ekspresjonującymi antygen przed badaniem ich zdolności do zabijania odpowiednich celów. Splenocyty od myszy immunizowanych DNA dlaNP, po aktywacji ConA i IL-2 in vitro bez restymulacji antygenowo-swoistej, niszczyły zarówno poddane działaniu epitopujak i zakażone wirusem komórki docelowe (fig. 3C i D). Aktywność lityczna restymulowanychjak i aktywowanych splenocytów wypadała zadowalająco w porównaniu z podobnie traktowanymi splenocytami uzyskanymi od myszy, którezostały uprzednio zakażone wirusem grypy A/HK/68, zjadliwym szczepem H3N2, zaadaptowanym do myszy, powstałym w 34 lata po A/PR/8/34 (H1N1). Stąd, wstrzyknięcie DNA dla Np powoduje powstanie CTL swoistych dla epitopu

178 626 nukleoproteiny i zdolnych do wykrycia antygenu poddanego naturalnej obróbce (tzn. mogących zabijać komórki zakażone wirusem). CTL NP-swoiste wywołano również u transgenicznych myszy C3H i B6 ekspresjonujących ludzki HLA-A2.

CTL NP-swoiste wykryto w śledzionach myszy BALB/c, którym wstrzyknięto zaledwie 1 dawkę rzędu 1 pg DNA dla NP (najniższa badana dawka) (tabela 3-IV):

Tabela 3-IV

Odpowiedź CTL u myszy po pojedynczym wstrzyknięciu DNA dla NP

Szczepionka	Dawka (pg)	% lizy swoistej	sd
DNA dla NP	400	52.5	10.7
	400	80.4	10.3
DNA dla NP	200	75.6	5.4
	200	44.6	4.4
DNA dla NP	100	76.7	2.9
	100	35.6	8.9
DNA dla NP	50	62.9	0.6
	50	76,7	7.4
DNA dla NP	10	83.2	10.1
	10	37.7	25
DNA dla NP	1	44.2	0.3
	1	13	2
DNA kontrolny	100	4.9	1
grypa		79 3	8.3

Tabela 3-IV: Samicom myszy BALB/c (4-6 tygodni) wstrzyknięto pojedynczą dawkę DNA dla NP A/PR/34 (V1JNP) lub kontrolny dNa (V1J) z zaznaczonej dawce. Dla porównania myszy zakazono wirusem grypy A/PR/34. CTLe pobrano po 8 tygodniach, restymulowano in vitro synergicznymi splenocytami poddanymi działaniu peptydu NP i badano w stosunku do komórek P815 poddanych działaniu peptydu NP w stosunku komórek efektorowych do docelowych równym 50:1. Dane przedstawiono jako % lizy swoistej dla pojedynczych, reprezentatywnych myszy.

Obserwacja przez czas dłuższy wykazała, że myszy które otrzymały 1 dawkę L pg DNA dla NP utrzymywały CTL swoiste dla NP przez co najmniej 4.5 miesiąca (najdłuższy badany okres). Wielkość odpowiedzi CTL o wstrzyknięciu DNA porównywana była z wywołaną zakażeniem wirusem grypy. Jednakże, odnotować należy, że analiza CTL po restymulacji antygenem in vitro niejest ilościowa. Stąd, opracowywanyjest obecnie test rozcieńczeń granicznych w celu bardziej ilościowego określenia poziomów CTL swoistych dla NP u myszy. U myszy, które otrzymały trzy dawki po 100 pg DNA dla NP, odpowiedź CTL wykryto po przynajmniej 6 miesiącach od immunizacji (figura 19). Stąd, PNV przeciwko grypie posiada zdolność wywoływania długotrwałej odpowiedzi ze strony CTL skierowanej przeciwko zakonserwowanym antygenom wirusa grypy.

Wstrzyknięcie myszom DNA dla NP powoduje produkcję wysokich mian przeciwciał IgG anty-NP (fig. 2). Uważa się, że wywołanie wysokich zmian przeciwciał IgG wymaga pomocy limfocytówT cD4+ (P. Vieira i K. Rajewsky, Int. Immunol. 2,487 (1990); J.J. Donnelly i in., J. Immunol. 145, 3071 (1990)). Pokazuje to, że NP ekspresjonowany z plazmidu in situ poddawany był obróbce do prezentacji przez zarówno MHC klasy I i klasy II.

178 626

Przykład 4. Ochrona myszy przed ekspozycjana zakaźny szczep ludzkiego wirusa grypy.

Rolę przeciwciał anty NP w ochronnej odporności przeciwko grypie wykazano przez dwa podejścia: pierwsze, oznaczono miana wirusa w płucach w doświadczeniu polegającym na biernym przeniesieniu. Samicom myszy BALB/c, w wieku <10 tygodni, podano dootrzewnowo 0,5 ml pulowanej surowicy (rozcieńczonej w 2 ml PBS) od myszy, którym podano trzy dawki po 200 μ DNA dla NP. Myszom kontrolnym podano równą objętość pulowanej normalnej surowicy mysiej, lub surowicy pulowanej od myszy, które wyzdrowiały z zakażenia A/HK/68, również w 2 ml PBS. Dawka surowicy odpornościowej przeciwko A/HK/68 została dobrana tak by miano ELISA przeciwciał anty-NP było równe z mianem surowicy pulowanej myszy nastrzykniętych DNA dla NP. Myszy poddano ekspozycji bez znieczulenia przy użyciu 10⁴ TCID50 A/HK/68 dwie godziny po wstrzyknięciu surowicy, po czym dalsze wstrzyknięcia takiej samej objętości surowicy wykonywane były trzy dni później. Myszy zabijano 6 i 7 dni po zakażeniu i oznaczano miana wirusa w płucach w TCID50nami takjóik to opisano przez Moran [J. Immunol. 146,321,191].

Myszom, które nie miały dotąd kontaktu z antygenem, podawano surowicę anty-NP, uzyskaną od mo surowicę anty-NP, uzyskaną od myszy, którym wstrzyknięto DNA dla NP a następnie poddano ekspozycji na wirusa A/HK/68. Ekspozycję na wirusa wykonano przy użyciu zaadaptowanego do myszy szczepu A/HK/68 i utrzymywano następnie przez pasaże in vivo na myszach (Dr. I. Mbawuike, doniesienie prywatne). Roztworem wyjściowym wirusa był homogenat płuc zakażonych myszy a jego miano zakaźne wynosiło 5x10⁸ TCID50/ml komórek MDCK. Do oznaczeń mian wirusa w płucach i badania utraty wagi ekspozycję na wirusa wykonywano przez wkroplenie donosowe 20 zawierających 104 TCID50 do nozdrzy, bez znieczulenia, co prowadziło do postępującego zakazenia płuc wirusem ale nie zabijało myszy BALB/c [Yetter R.A. i in., Infect. Immunity 29, 654,1980], W doświadczeniach nad przezywalnością, myszy poddawano ekspozycji przez wkroplenie donosowe 20 μl zawierających 10² 5 TCIDjo do nozdrzy, w pełnej narkozie z użyciem ketaminy i ksylazyny; zakażenie znieczulonych myszy tą dawką powoduje raptowne zakażenie płuc co powoduje śmierć 90-100% nieimmunizowanych myszy [J.L. Schulman i E.D. Kilboume, J. Exp. Med. 118,257,1963; G.H. Scott i R.J. Sydiskis, Infect. Immunity 14,696,1974; R.A. Yetter i in., Infect. Immunity 29,654, 1980], Miana wirusa w płucach oznaczano przez miareczkowanie na komórkach MDCK (uzyskanych z ATCC, Rockville, MD) w płytkach 96-studzienkowych jak to opisano przez Moran i in., [ibid.].

Nie obserwowano zmniejszenia mian wirusa w płucach myszy, które otrzymały surowicę anty-NP(6.3±0.2; średnia±SEM; n=4) w porównaniu z myszami kontrolnymi, które otrzymały normalną surowicę (6.1±0.3; średnia±SEM; n=4) Jako kontrolę pozytywną pobrano surowice od myszy zakazonych A/HK/68 i przeniesiono biernie na cztery myszy, które uprzednio nie miały kontaktu z antygenem. Po ekspozycji na wirusa A/HK/68 nie stwierdzono zakażenia w ich płucach, co wskazywało, że surowica przeciwko całemu wirusowi chroniła całkowicie przed homologicznym wirusem. Po drugie, myszy, które uprzednio nie miały kontaktu z antygenem immunizowano oczyszczonym NP (5 μg/łapę, trzykrotnie w ciągu 6 tygodni) przez wstrzyknięcie i.m. Myszy te wytworzyły wysokie miana przeciwciał NP-swoistych ale nie wytworzyły NP-swoistych CTL i nie były chronione przed letalną dawką wirusa. Stąd, w przeciwieństwie do neutralizującego wpływu przeciwciał przeciwko całemu wirusowi, krążące przeciwciała anty-NP nie zapewniają odporności ochronnej u myszy.

Badano efektywność ochronnąin vivo iniekcji DNA dla NP, w celu stwierdzenia czy odpowiedź odpornościowa komórkowa była funkcjonalnie istotna. Bezpośrednią metodą zmierzenia efektywności odpowiedzi odpornościowej była zdolność myszy uprzednio immunizowanych DNA dla NP do oczyszczenia z postępującego, subletalnego zakazenia płuc heterologicznym szczepem wirusa grypy (A/HK/68; H3N2). Ekspozycję na wirusa przeprowadzono jak to opisano wyżej. U myszy immunizowanych DNA dla NP stwierdzono 7 dnia miana wirusa w płucach o trzy rzędy wielkości nizsze (1.0±1.0; średnia±SEM; n=4) niż u myszy kontrolnych, które nie były immunizowane (4.1±0.3; średnia±SEM; n=4) czy immunizowanych pustym wektorem

178 626 immunizowane (4.5±0.0; średnia±SEM; n-4)/ W rzeczywistości trzy spośród czterech immunizowanych myszy miały niewykry walne miana wirusa w płucach, podczas gdy żadne ze zwierząt kontrolnych nie oczyściło się z wirusa w tym czasie. Znaczna różnica w mianach wirusa w płucach widoczna w tym doświadczeniu i sześciu innych pokazuje, że odpowiedź odpornościowa przyspiesza usuwanie wirusa. Brak efektu ochronnego'kontroli pustego wektora potwierdza, że DNA sam przez się niejest odpowiedzialny za odpowiedź odpornościową. Ponadto, ponieważ wirus, na który eksponowano myszy, A/HK/68 (zakaźny, zaadaptowany do myszy szczep H3N2) był heterologiczny w stosunku do A/PR8/34 (H1N1), z którego sklonowano gen NP, odporność była ewidentnie heterotypowa.

Jako miarę wywołanej przez wirusa chorobowości, śledzono utratę wagi u myszy zakażonych subtelnie wirusem grypy A/HK/68 w następstwie immunizacji DNA dla NP (fig. 4). Myszy nienastrzyknięte i nastrzyknięte pustym wektorem służyły jako kontrola. Myszy immunizowane DNA dla NP przejawiały po zakażeniu wirusem grypy A mniejszą utratę wagi i szybszy powrót do ich wagi z przed ekspozycji, w porównaniu z myszami kontrolnymi.

Zakażenie donosowe całkowicie znieczulonych myszy wirusem grypy A, powoduje raptowną, rozprzestrzenioną replikację w płucach i śmierć w 6-8 dni po zakażeniu jeżeli zakażenie niejest kontrolowane (R.A. Yetter i in., Infect. Immunity 29,654 (1980)). Przeżywalność myszy poddanych ekspozycji tym sposobem odzwierciedla ich zdolność do ograniczenia ciężkości ostrego zakażenia płuc. Badano zdolność myszy do przeżycia ekspozycji na dwa różne szczepy wirusa grypy A/HK/68 (patrz fig. 5) i A/PR/8/34. Myszy uprzednio immunizowane DNA dla NP wykazywały 90% odsetek przeżywalności w porównaniu z 0% w grupie, która otrzymała pusty wektor i 20% w nienastrzykniętej niczym kontroli (fig. 5). We w sumie 14 doświadczeniach myszy immunizowane DNA dla NP wykazywały przynajmniej 50% większy odsetek przezywalności w porównaniu z kontrolą. Stąd, zdolność wywołanej DNA dla NP odpowiedzi odpornościowej, do efektywnego przyspieszenia zdrowienia i osłabienia choroby spowodowanej przez wirusa różnych szczepów powstałych w 34 lata później, wspiera przesłankę kierowania odpowiedzi limfocytów T cy to toksycznych na zakonserwowane białka.

Przykład 5. Izolacja genów z izolatów wirusa grypy

W depozycie ATCC znajduje się wiele z dawnych szczepów wirusa grypy („1990 Catalogue of Animal Viruses & Antisera, Chlamydiae % Rickettsiae”, wydanie 6, wymierna 20 szczepów wirusa grypy typu A i 14 szczepów wirusa grypy typu B).

A. Szczepy wirusowe i oczyszczanie:

Szczepy wirusa grypy występujące w obecnej szczepionce na sezon zachorowań 1992 uzyskano od Dr. Nancy J. Cox z Division of Viral and Rickettsial piseases, Centers of Disease Control, Atlanta, GA. Były to szczepy: (1) A/Beijing/353/89 (H3N2); (2) A/Texas/36/91 (H1N1): (3) B/Panama/45/90 i (4) A/Georgia/03/93.

Wszystkie wirusy hodowano przez pasazowanie na kurzych 9-11-dniowych embrionach jaj kurzych (z wyjątkiem A/Georgia, hodowanego na komórkach MDCK), (100-200 na preparat wirusa) i oczyszczano zmodyfikowaną metodą opisaną przez Massicota i in., (Virology 101, 242-249 (1980)). Pokrótce, zawiesinę wirusa klarowano przez odwirowanie przy 8000 rpm (wirówka Sorvall RC5C, rotor GS-3) a następnie zawirowywano przy 18000 rpm przez 2 godziny w rotorze Type 19 f-my Beckman. Peletkę wirusa zawieszano w STE (0.1 M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA) i wirowano przy 4000 rpm przez 10 minut, (wirówka Hermie Z360K) w celu usunięcia agregatów. 2 ml nadsączu nakładano na nieciągły gradient sacharozy składający się z 2 ml sacharozy 60% przykrytej 7 ml sacharozy 30% zbuforowanej STE i wirowano przy 36000 rpm (rotor SW-40, Beckman) przez 90 minut. Prążek zawierający wirusa zbierano na styku faz, rozcieńczano 10-krotnie w STE i żwirowy wano przy 30000 rpm przez 2 godziny (rotor Ti45, Beckman). Paletkę wirusa zamrażano w -70°C.

178 626

B. Ekstrakcja wirusowego RNA i synteza cDNA:

Wirusowe RNA oczyszczano z zamrożonego wirusa przez ekstrakcję izotiocyjańiańem guanidyny przy użyciu zestawu dostępnego w handlu (Stratagene, La Jolla, CA) wykorzystującego metodę Chomczynskiego i Sacchi (Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987)). Dwuniciowe cDNA wykonano z wirusowego RNA przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do syntezy cDNA (Pharmacia) zgodnie z instrukcją producenta z kilkoma modyfikacjami. Pierwszą nić cDNA zapoczątkowano przy użyciu syntetycznego oligodezoksynukleotydu 5'-AGCAAAAGCAGG-3', Identyfikator Sekw. Nr 30, komplementarnego do zakonserwowanej sekwencji umiejscowionej w końcu 3' wirusowego RNA wszystkich genów szczepu A. Sekwencja tajest wspólna dla wszystkich wirusowych RNA typu A i dlatego zapewnia metodę klonowania wszystkich genów wirusów grypy typu A. Po syntezie pierwszej i drugiej nici cDNA reakcję poddano ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform i precypitacji etanolem zamiast kontynuować według przepisu dołączonego do zestawu. cDNA o tępych końcach były bezpośrednio ligowane do wektorów VI Jneo lub V1Jns, które uprzednio trawiono enzymem restrykcyjnym Bg 1II, wypełniano końce polimeraząDNA T4 i traktowano cielęcąjelitowąfosfataząalkaliczną.

W celu poszukiwania określonych genów wirusowych pełnej długości użyto syntetycznych oligodezoksynukleotydów, które zaprojektowano by były komplementarne do końca 3'trańslacyjńej ramki odczytu danego genu wirusowego. Próbki, które wydawały się reprezentować geny pełnej długości mapowaniem restrykcyjnym i oznaczaniem długości elektroforezą na żelu agarozowym, potwierdzano sekwencjonowaniem metodą didezoksynukleotydów, miej sc połączenia genu wirusowego z wektorem V1 Jneo. Sekwencj a obu połączeń dla każdego z genów klonowanych z tych wirusów podana jest poniżej w przykładzie 8.

Podobnej strategii użyto do klonowania cDNA z obu wirusów wymienionych powyżej z wyjątkiem B/Panama/45/90, który nie posiadał wspólnej sekwencji na końcach RNA, w celu zapoczątkowania syntezy pierwszej nici cDNA użyto tu mieszaniny oligodezoksynukleotydów. Były to startery:

(1) 5-AGCAGAAGCGGAGC-3', Identyfikator Sekw. Nr 31 ; dla PB 1 i PB2;

(2) 5'-AGCAGAAAGCAGAGCA-3', Identyfikator Sekw. Nr 19; dlaNS i HA;

(3) 5'-AGCAGAAGCACGCAC-3', Identyfikator Sekw. Nr 22; dla M i (4) 5'-AGCAGAAGCACAGCA-3', Identyfikator Sekw. Nr 23; dla NP.

Dla genów klonowanych przez PCR, tępo zakończonych cDNA użyto bezpośrednio w reakcjach PCR jako matryca DNA. Startery użyte do klonowania 6 genów wirusa grypy uzyskanego przez PCR przedstawiono poniżej:

1. Gen HA z A/Georgia'O3/93 starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 33:

5'-GGTACAACCATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 34: 5'-CCACATAGATCTTCAAATGCAAATGTTGCA^CCTAATG-^3'.

2. Gen HA z A/Texas/36/91 starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 35: y-GGT,^(^^CCATGAAAGCAAAACTACTAGTCCT^G^TTATG-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 36:

5'-CCACATTCAGATGCATATTCTACACTGCAAAG-3'.

3. Gen HA z B/Panama/45/90 starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 37:

5'-GGTACAACCATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATG-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 38: 5'-CCACATTTATAGACAGATGGAGCAAGAAACATTGTC-3'.

4. Gen M1 z A/Beijmg/353/89 starter sensowny, Identyfikator Sekw. nr 39.

5'-GGTACAAGATCTTCCATGCTTCTAACCGAGGTC-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 40:

178 626

5'-CCACATAGATCTTCACTTGAACCGTTGC.ATCTGC.AC-3'.

5. Gen NP z B/Panama/45/90 starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 41:

5'-GGTACAGGATCCACCATGTCCAACATGCiATATTGACGGC-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 42: 5'-CCACATGCATCC^TAATAATCGAGGTCATCATAATCCTC-3'.

6. Gen M1 z B/Panama/45/90 starter sensowny, Identyfikator Sekw. Nr 43:

5'-GGTACAGGATCCACCATCTCGCTGTTTGCAGACACAATTCCC-3' starter antysensowny, Identyfikator Sekw. Nr 44: 5'-CCACATCCATCCTTATAGGTA^ΠTTCΓΓCACAACAGCTG-3'.

Wszystkie klony genów wirusa grypy, zarówno cDNA jak i wytworzone PCR, potwierdzono przez sekwencjonowanie przez miejsce ligacji do genu i ekspresjonowano gen w transfekowanych komórkach RD. Ekspresję wykrywano metodą immunoblot.

Konstrukty NP i M1 szczepu A/H3N2 (wektory 4 i 5) wykonano z genów szczepu A/Beijing/353/89. Geny te wybrano z powodu oczekiwanego wysokiego poziomu zakonserwowania zarówno genu NP jak i M1 oraz z powodu ich dostępności.

Z poprzednich prac, szczególnie korzystna grupa 7 wektorów ekspresyjnych połączonych w szczepionkę, obejmowała:

1. VlJns-HA (A/Georgia/03/93) 6.56 Kb

2. VlJns-HA (A/Texas/36/91) 6.56 Kb

3. VlJns-HA (B/Panama/45/90) 6.61 Kb

4. VlJns-NP (A/Beijing/353/89) 6.42 Kb

5. VlJns-Ml (A/Beijing/353/89) 5.62 Kb

6. VlJns-NP (B/Panama/45/90) 6.54 Kb

7. VlJns-M1 (B/Panama/45/90) 5.61 Kb

Odpowiednie sekwencje połączeń tych genów w wektorach ekspresyjnych podane są poniżej. W ceiu potwierdzenia, czy sklonowano odpowiedni gen, należało sekwencjonować tylko niewielki fragment konstruktorów. Przez porównanie z podobnymi znanymi genami łatwo było potwierdzić, że dany gen jest genem NP, HA, Ml itp. Przykładowo, sekwencja genu HA A/Texas jest bardzo podobna do sekwencji genu HA z A/Kiev/59/79, którego sekwencja dostępnaj est z GENBANK pod numerem M3 83 53. Podobnie, dla sekwencj i HA z B/Panama, która jest bardzo podobna z sekwencją HA z B/England/222/82, którego sekwencja dostępna jest z GENBANK pod numerem M18384. W ten sposób, można potwierdzić tożsamość każdej sklonowanej sekwencji każdego z genów z każdego z ludzkich wirusów grypy. W każdym poniższym przypadku zarówno sekwencję z końca 5'jak i 3' potwierdzono w ceiu upewnienia się, że obecny jest kompletny gen. W każdym wypadku, wytłuszczone ATG pokazuje kodon startowy genu wirusa grypy, zaś wytłuszczona sekwencja w końcu 3' oznacza kodon stop:

1. V1Jns-HA (A/Georgia/03/93) 6.56 Kb

Sekwencja 5': Identyfikator Sekw. Nr 46)

TCACCGTCCITAGATC/GGTACAACCATG/AGGACTATCAITGCITTGAGCTACAITTrATGTCT

GGTTTTCGC

Sekwencja 3': (Identyfikator Sekw. Nr 47)

TCAT<^<^TTmTGT^TTTT^TGT^<TTmG<^T^C^CG^C^TT^C^/T^CATGTGG<^(^(^T^<^(^C?AAAAAGGCAACA riAGGTGCAACATTTGCATTTG-AA/GATCTATGTGGGATCTGCTGTGC

2. V1Jns-HA (A/Texas/36/91) 6.56 Kb

Sekwencja 5': Identyfikator Sekw, Nr 48) rTAGArC/TTAAGArTAAATG/AAAGrTACTAGTCCTGTTATGTTCA^TrACATGTAGATATTGA

Sekwencja 3': (Identyfikator Sekw. Nr 49)

CrGTrGGrTTrTTrGTCGCrGTTTTCAATGAGGTrTTGTATGTTrTGrAAT<TTTrGTTrGGA

TTTTGAATATGGArCrTAATGTTT/GATCTTGrTTTGGrr

178 626

3. V1Jns-HA (B/Panama/45/90 6.61 Kb

Sekwencja 5': (Identyfikator Sekw. Nr 50)

CCTTAGATC/GGTACAACCATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACATCCAACG

CAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTG

Sekwencja 3': Identyfikator Sekw. Nr 51)

TTGGCTGTAACATTGATGATAGCTATTrTTATrGTTTATATGGTCTCCAGAGACAATGTTTCTT

GCTCCATCTGTCTATAAATGTGG/GATCTGCTGTGCCTT

4. V1Jns-NP (A/Beijing/353/89) 6.42 Kb

Sekwencja 5': (Identyfikator Sekw Nr 52)

GTCCTTAGATC/CACCATGGCGTCCCAAGGCACCAAACGGTCTTATGAACAG_AT_GGAAACT

GATGGGGAACGCCAGAATGCAACT

Sekwencja 3': (Identyfikator Sekw. Nr 53)

GAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCCTCTTTTGACATGAGTAATGAAGGATCTTATTTCT

TCGGAGACAATGCAGAAGAGTACGACAATTAAG/GATCTGCTGTGCCT

5. V1Jns-M1 (A/Beijing/353/89) 5.62 Kb

Sekwencja 5': (Identyfikator Sekw. Nr 54)

CTTAGATC/CAGATCTACCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGT

TCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGGGAA

AAACACAGAT

Sekwencja 3': (Identyfikator Sekw. Nr 55)

GGGACTCATCCTAGCTCCAGTACTGGTCTAAAAGATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGACCTA

TCAGAAACGAATGiGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGAAGATCTATGTGG/GjATCTGCT

GTGCCTT

6. V1Jns-NP (B/Panama/45/90) 6.54 Kb

Sekwencja 5': ridentyfikator Sekw. Nr 56)

CTTAGATC/CACCATGTCCAACATGGATArrGACGGTATCAACACTGGGACAATTGACAAA

ACACCGGAAGAAATAACTTCT

Sekwencja 3': (idestyfikator Sekw. Nr 57)

GTTGAAATTCCAATDAAGCA GACCC ATCCCCAAATTCrrCTrrGGGAGGGACACAGCAGAGG ATTATGATGACCTCGAnATTAAG/GATCTGCTGTG

7. V1Jns-M1 (B/Panama/45/90) 5.61 Kb

Sekwencja 5': (Identyfikator Sekw. Nr 58)

CTTAGATC/CACCATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTTCATTGACAGAAG

ATGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTA

Sekwencja 3': (Identyfikator Sekw. Nr 59)

AGATCTCrrGGGGCAAGTCAAGAGAATGGGGAAGGAATTGCAAAGGATGTGATGGAAGTG

CTAAAGCAGAGCTCTATGGGAAATTCAGCTCTTGTGAAGAAATACCTATAAG/GATCTGCTGTG

Przykład 6. Wektor ekspresyjny V1J o identyfikatorze sekw. Nr 10:

Przyczyną stworzenia wektora V1J było usunięcie elementów promotora i terminatora transkrypcji z wektora V1, w celu umiejscowienia ich w lepiej określonym kontekście, stworzenia bardziej zwartego wektora i polepszenia uzyskiwania oczyszczonego plazmidu.

V1J uzyskano z wektorów VI (patrz przykład 1) i pUC18, dostępnych w handlu. VI trawiono enzymami restrykcyjnymi Sspl i EcoRI tworząc dwa fragmenty DNA. Mniejszy z fragmentów zawierający element promotora CMVintA i terminatora transkrypcji wołowego hormonu wzrostu (BÓH) kontrolujące ekspresję heterologicznych genów (Identyfikator Sekw. Nr 11), oczyszczono z żelu agarozowego do elektroforezy. Końce tego fragmentu DNA zostały wypełnione przy użyciu polimerazy DNA T4 w celu polepszenia jego ligacji do innego fragmentu DNA o „tępych końcach”.

Jako zrębu wektora ekspresyjnego użyto pUC 18. Jest on znany z produkowania znacznych ilości plazmidu, jest dobrze scharakteryzowany pod względem sekwencji i funkcji oraz posiada minimalną wielkość. Usunięto z niego cały operon lac, niepotrzebny dla celów wynalazku i mogący mieć negatywny wpływ na ilość produkowanego plazmidu i ekspresję heterologicznego genu, przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym Haell. Pozostały plazmid oczyszczono z żelu agarozowego do elektroforezy, wypełniono końce polimerazaDNA T4, traktowano

178 626 cielęcą fosfatazą alkaliczną jelitową i ligowano z elementem CMVintA/BGH opisanym powyżej. Uzyskano plazmidy przejawiające dwie możliwe orientacje elementów promotora w zrębie pUC. Jedna z nich dawała znacznie większąilość plazmidu w E. coli i została oznaczona V1J (Identyfikator Sekw. Nr 10). Strukturę tego wektora potwierdzono analizą sekwencji regionów połączeń a następnie wykazano, ze daje porównywalną lub wyższą ekspresję heterologicznych genów w porównaniu z V1.

Przykład 7. Konstrukty genów wirusa grypy w wektorze ekspresyjnym V1J.

Wiele z genów szczepu wirusa grypy A/PR/8/34 sklonowano do wektora ekspresyjnego V1J, który, jak to zaznaczono w przykładzie 4, daje poziomy ekspresji równe lub wyższe niz wektor VI. Sekwencje genu PR8 są znane i dostępne w bazie danych GENBANK. Każdy ze sklonowanych poniżej genów określono na żelu wielkość fragmentu klonowanego oraz dostarczono numer, pod którym jest umieszczony w GENBANK część sekwencji, z którą go porównywano. Metoda uzyskiwania tych genów ze szczepów wirusa, przykładowo z wirusa uzyskanego z ATCC (A/PR/8/34 jest oznaczony w ATCC jak VR-95, wiele innych szczepówjest również zdeponowanych w ATCC) opisana jest w przykładzie 5.

A. Wkl.onowanie Genów PR8 doVi^)f:

1. Gen NP

Gen NP sklonowano z pAPR501 (J. R Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman i M. Rosenberg (1983) w „Origins of Pandemie Influenza Viruses”, wyd. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Wycięto go przez cięcie pAPR501 przy użyciu EcoRI, fragment oczyszczono na żelu i wypełniono końce polimerazą GNA T4. Fragment wprowadzono do wektora V1J przeciętego Bg1ll i traktowanego polimerazą DNA T4. Klonowany fragment miał wielkość 1.6 Kb.

2. NS

Gen NS sklonowano z pAPR801 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman i M. Rosenberg (1983) w „Origins ofPandemie Influenza Viruses”, wyd. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Wycięto go przez cięcie pAPR801 przy użyciu EcoRI, fragment oczyszczono na żelu i wypełniono końce polimerazą DNA T4. Fragment wprowadzono do wektora VIJ przeciętego Bg1ll traktowanego polimerazą DNA T4. Klonowany fragment miał wielkość 0.9 Kb. (Kompletny region kodujący NS zawierający NSI i NS2).

3. HA

Gen HA sklonowano z pJZ102 (J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman i M. Rosenberg ( 1983) w „Origins ofPandemie Influenza Viruses”, wyd. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Wycięto go przez cięcie pJZ102 przy użyciu Hindlll, fragment oczyszczono na żelu i wypełniono końce polimerazą DNA T4. Fragment wprowadzono do wektora V1J przeciętego Bg1ll i traktowanego polimerazą DNA T4. Klonowany fragment miał wielkość 1.75 Kb.

4. PB1

Gen PB 1 sklonowano z pGEM1-PB 1 (miejsca połączeń 5' i 3' tych genów z wektorem sekwencjonowano w ceiu potwierdzenia tożsamości. Patrz J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves, P. Palese, A. Schatzman i M. Rosenberg (1983) w „Origins ofPandemie Influenza Viruses”, wyd. W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Wycięto go przez cięcie pGEMl-PBl przy użyciu Hindlll, fragment oczyszczono na żelu i wypełniono końce polimerazą DNA T4. Fragment wprowadzono do wektora V1J przeciętego Bg1ll i traktowanego polimerazą DNA T4. Klonowany fragment miał wielkość 2.3 Kb.

5. PB2

Gen PB2 sklonowano z pGEM 1-PB2 (miejsca połączeń 5' i 3' tych genów z wektorem sekwencjonowano w celu potwierdzenia tożsamości. Patrz J. F. Young, U. Desselberber, P. Graves,

P Palese, A. Schatzman i M. Rosenberg ( 1983) w „Origins ofPandemie Influenza Viruses”, wyd.

W. G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) str. 129-138). Wycięto go przez cięcie pGEM1-PB2 przy użyciu BamHI i oczyszczono fragment na żelu. Fragment o „lepkich końcach” wprowadzono do

178 626 wektora V1J przeciętego Bg1ll i traktowano polimerazą DNA T4. Klonowany fragment miał wielkość 2.3 Kb.

6. ML

Gen Ml wytworzono przez PCR z plazmidu p8901 MITE. Sekwencję M tego plazmidu wytworzono przez PCR z pAPR701 (J. F. Young, U. Desselberber, P Graves, P Palese, A Schatzman i M. Rosenberg (1983) w „Origins ofPandemic Influenza Viruses”, wyd. W. G. Laver, (Elseviei; Anstercdm) sir. 129-138), przy użyciu oligomerów 5'-GGTACAAGATCTACCATGCTTCTAACCGAGGTC-3', Identyfikator Sekw. Nr 3, jako starter „sensowny” i 5'-CCACATAGATCTTCACTTGAA CCGTTGCATCTGCAC-3' Identyfikator Sekw. Nr 4, jako starter „antysensowny”. Produkt PCR oczyszczony został na żelu i wprowadzony do wektora V1J przeciętego Bg1II. Klonowany fragment miał wielkość 0.7 Kb. Koniec aminowy kodowanego Ml kodowany jest w starterze „sensownym” pokazanym powyżej jako kodon „ATG” podczas gdy kodon stop translacji Ml kodowany jest przez odwrotność kodonu „TCA”, który w kierunku sensownym tworzy kodon stop „TGA”.

B. Konstrukty Ekspresyjne Gen Wirusa Grypy-V1J:

W każdym przypadku, pokazana jest sekwencja połączenia z regionem promotora na końcu 5' (CMVintA) w klonowanym genie. Sekwencje uzyskano przez sekwencjonowanie starterem CMVintA 5'- CTAACAGACTGTTCCTTTCCATG-3', o Identyfikatorze Sekw. Nr 28, sekwencjonującym sekwencję kodującą. Pozycję, w której występuje połączenie oznaczono przez co nie oznacza żadnej nieciągłości w sekwencji. Sposób przygotowania konstruktów podsumowany jest, po wszystkich sekwencjach, poniżej. Każda z zamieszczonych sekwencji przedstawia kompletny, dostępny i możliwy do ekspresji konstrukt określonego genu wirusa grypy.

Każdy z konstruktów transfekowano przejściowo do komórek RD (ATCC CCL136), ludzkiej linii komórkowej rhabdomyosarkomy w hodowli. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki zebrano, poddano lizie, i wykonano analizę met. western blot (z wyjątkiem konstruktu V1J-PR-HA, który był badany na myszach i wzbudził swoiste przeciwciała anty-HA zanim dokonano analizy western blot, co spowodowało, że test ten stał się niepotrzebny, ponieważ obserwowano ekspresję in vivo). Przeciwciała swoiste wobec białek PB1, PB2 i NS uzyskano od Stephena Inglisa z University of Cambridge, który używał oczyszczonych białek ekspresjonowanych jako białka fuzyjne w połączeniu z β-galaktozydaząw celu wytworzenia surowic poliklonalnych. Surowica poliklonalna anty-NP wytworzona została przez immunizację królików całym wirusem A/PR/8/34. Przeciwciało anty-M1 dostępnejest w handlu z f-my Biodesignjako surowica kozia przeciw-grypowa typu A, Nr kat. B65245G. W każdym przypadku, obserwowano białko o przewidywanej wielkości, potwierdzające ekspresję in vitro kodowanych białek wirusowych.

Nomenklatura tych konstruktów jest zgodna z następującą konwencją: „Nazwa wektora-szczep grypy-gen”. W każdym przypadku sekwencję sprawdzano ze znaną sekwencją z GENBANK dla sklonowanych i sekwencjonowanych sekwencji genów A/PR/8/34. Efektywność biologiczna każdego z konstruktów zademonstrowana jest jak w przykładzie 2, 3 i 4 powyżej:

Sekwencja połączenia 5' CMVintA i genów szczepu A/PR/8/34:

1. V1J-PR-NP, IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 12: GENEBANK Nr: M38279 5'GTCACCGTCCTTAGATC/AATrCCAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACA TCAAAATCATG

2. V1J-PR-PB1. IDENTYFIKATOR SEKW, Nr 13: GENEBANK Nr: J02151 SACCGTCCTTAGATC/AGCTrGGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGATGTCAATCCGA CCTTACTTTTCTTAAAAGTGCCAGCACAAAATGCTATAAGCACAACTTTCCC—ATAC

3. V1J-PR-NS. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 14; GENEBANK Nr: J02150 yGTCACCGTCCTTAGATC/AArrcCAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATCCAA ACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGA CCAAGAACTAGGTGAT . V1J-PR-HA. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 15: GENEBANK Nr: J02143 yTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATC/AGCTTGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAAC CAAAATGAAGGGAAACCTACTGGTCCTGTTAAGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACAC AATATGTATAGGGTACCATGCGAACAATTCAACC

178 626

5. Y1J-PR-PB2, IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 16: GENEBANK Nr: J02153 5T_TTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATC/CCGAATTCCAGCAAAAGCAGGTCAATTATATTCAA TATGGAAAGAATAAAAGAACTAAGAAATCTAATGTCGCAGTCTGCCACCCCGGAGATACT CACAAAAACCA^CCC^I^(3(j/^C^C/aATGGCCATAAT<^yAAGAAGT

6. Y1J-PR-M1. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 17: GENEBANK Nr: J02145 5'GTCACCCTCCIΊACATCT/ACCATGACTC'TTCTAACCGAGCTCGAAACCTACGTACTCICT ATCATCCCGTCAGCCCCCCICAAACCCGAGA'ICGCACACACACTTGAAGACTICACC GAAGA

Jak łączono fragmenty:

1. V1J-PR-NP: „tępy” Bglll (wektor) z „tępym” EcoRI (NP)

2. V1J-PR-PB1: „tępy” Bg1Il (wektor) z „tępym” Hidlll (PB1)

3. V1J-PR-NS: „tępy” Bgłll (wektor) z „tępym” EcoRI (NS)

4. V1J-PR-HA: „tępy” Bg1ll (wektor) z „tępym” Hindlll (HA)

5. V1J-PR-PB2: „lepki” Bg1II (wektor) z „lepkim” BamHI (PB2)

6. V1J-PR-M1: „lepki” BgH (wektor) z „lepkim” Bg1ll (Ml)

Ml uzyskano przez PCR, z użyciem p8901-MlTE jako matrycy i starterów, które dodawały miejsce Bg1ll na obu końcach i zaczynały się 3 zasady przed ATG i kończyły się też za kodonem stop dla M1 (TGA).

Przykład 8. Wektor ekspresyjny VI Jneoo Identyfikatorze sekw. Nr 18:

Ponieważ ampicylina nie może być stosowana w fermentatorach o dużej objętości, koniecznym było usunięcie genu amp', używanego do selekcji przy użyciu antybiotyków bakterii niosących V1J. Gen amp', ze zrębu pUC plazmidu V1J, usunięto przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Sspl i Eaml 1051. Pozostały plazmid oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, wypełniono końce polimerazą DNA T4, i traktowano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną. Dostępny w handlu gen kan', uzyskany z transpozonu 903 i zawarty w plazmidzie pUC4K, wycięto przez trawienie enzymem restrykcyjnym Pstl, oczyszczono przez elektroforezę na żelu agarozowym, wypełniono końce polimerazą DNA T4, i traktowano cielęcąjelitową fosfatazą alkaliczną. Fragment ten ligowano do szkieletu VIJ a uzyskane plazmidy o genie kan' w obu orientacjach oznaczono VI Jneo# 1 i 3. Każdy z tych plazmidów potwierdzono analizą trawieniem restrykcyjnym, sekwencjonowaniem DNA regionów połączeń i stwierdzono, że produkują podobne ilości plazmidu jak V1J. Ekspresja produktów genów heterologicznych, wektorów VłJneo, była również porównywalna do wektora V1J. Arbitralnie wybrano V1Jneo#3, oznaczony dalej jak V1 Jeno (Identyfikator Sekw. Nr 18), zawierający gen kan' w tej samej orientacji co gen amp' w V1J, jako konstrukt ekspresyjny.

Geny z każdego ze szczepów A/Beijing/353/89, A/Texas/36/91 i B/Panama/46/90 sklonowano do wektora=a V1 Jneo jako cDNA. W każdym przypadku sekwencje połączeń z końca 5' promotora (CMVintA) do klonowanego genu były sekwencjonowane z użyciem startera CMVintA: 5'CTAACAGACTGTTCCTTTCCATG3', Identyfikator Sekw. Nr 28, generującym sekwencję sekwencji kodującej. Jest ona ciągła z sekwencją kodującą terminator, której połączenie również pokazano. Sekwencję tą wygenerowano przy użyciu startera BGH: 5'GGAGTGGCACCTTCCAGG3', Identyfikator Sekw. Nr 29, który generował sekwencję nici nie kodującej. W każdym przypadku sekwencję sprawdzano w stosunku do znanych sekwencji z GENBANK sklonowanych i sekwencjonowanych genów z tego i innych izolatów wirusa. Pozycję, w której występuje połączenie oznaczono prrez co nie oznacza żadnej nieciągłości w sekwencji. W przypadku połączenia w V1Jneo-TX-HA żel sekwencyjny był ściśnięty i początkowa sekwencja była trudna do odczytania. Stąd, pierwsze 8 zasad połączenia oznaczono przez „N”. Nukleotydy te zostały potwierdzone i określone jako nukleotydy identyczne z dostępną sekwencją. Nomenklatura tych konstruktów jest zgodna z następującą konwencją: „Nazwa wektora-szczep grypy-gen”. Efektywność biologiczna każdego z konstruktów zademonstrowana jest jak w przykładach 2, 3 i 4, powyżej:

SEKWENCJA KOŃCA 5' POŁĄCZENIA CMVintA I GENÓW WIRUSA GRYPY I

KOŃCA 3' POŁĄCZENIA GENÓW WIRUSA GRYPY I TERMINATORA EKSPRESJI GBH,

RÓŻNYCH SZCZEPÓW GRYPY I BIAŁEK.

178 626

l. A/BEIJING/353/89

A. VU'nto-BJ-NP:

PROMOTOR. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 20:

5' TCACCGTCCTTAGATC/AAGCAGGGTTAATAATCACTCACTGAGTCACATCAAAATCATGG _CGTCCCjAAGGCA_CCAAACGGTCTTAT<^?AAC_JAGATGGAAACTGATGGG_GA_ACGCCAGATr

TERMINATOR. IDENTYFIKATOR SEKW, Nr 21:

5' GAGGGGCAAAC.AACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGCAGATATTTTTrccnAzY^ GTCGTAC

II. A/TEXAS/36/91

A. VI Jneo-TX-HA

PROMOTOR. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 24:

5' CCTTAGATC/GGAAAAAAAAaACAACAACCAAAATGAAAGCAAAACTACTAGTCC

TERMINATOR. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 25:

5' GCAGATC/CTTATAmCTGAAATTCTGGTCTCAGAT

m. B/PANAMA/46/90

A. V! Jneo-PA-HA

PROMOTOR. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 26: Pierwsze 1080 zasad tej sekwencji dostępne jest w GENBANK pod numerem M65171: sekwencja uzyskana poniżej jest identyczna ze znana sekwencja: sekwencja końa 3' Identyfikator Sekw. Nr 27 (poniżej) nie została do tej pory opisana

5'ACCGTCmAGACGCAGYAGCAGACCAJTTTCTAAOArCCACAAAATGAAGGCAATAATT GTACTACTCATGGTAGTAACATCCAACGCAGATCGAATCTGC

TERMINATOR. IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 27:

5' GGCACAGCAGATC/TTTCAATAACGTTTCTTTGTAATGGTAAC

Przykład 9.

Śródskórne wstrzyknięcie genów wirusa grypy:

Protokół śródskómego wprowadzania genów był taki sam jak dla wprowadzania domięśniowego: trzy wstrzyknięcia po 200 pg, co trzy tygodnie, plazmidu V1 -PR-NP. Śledziony pobrano do testu in vitro 55 dni po trzecim wstrzyknięciu i restymulowano nonapeptydowym epitopem nukleoproteiny 147-155, Identyfikator Sekw. Nr 9. Komórki docelowe (P815, mysia mastocytomy, syngeniczna z myszami BALB/c H-2^d), zakażono heterologicznym wirusem A/Victoria/73 i badano lizę swoistą przy użyciu splenocytówjako komórek efektorowych w stosunku efektorów do komórek docelowych w zakresie od 5:1 do 40:1. Kontrole negatywne przeprowadzono przez pomiar lizy komórek docelowych nie zakażonych wirusem grypy. Kontrole pozytywne przeprowadzono przez pomiar lizy komórek docelowych zakażonych wirusem grypy przez splenocyty od myszy, które otrzymały trzy wstrzyknięcia po 130 μg V1-PR-NP i przezyły zakażenie żywym wirusem grypy szczepu A/HK/68.

Wyniki: lizę swoistą uzyskano przy użyciu splenocytów od myszy, które otrzymały śródskóme wstrzyknięcie, przy wszystkich z użytych stosunkach efektorów do komórek docelowych. Nie obserwowano lizy gdy używano jako komórek efektorowych splenocytów uzyskanych od myszy nienastrzykniętych lub nastrzykniętych wektorem V1 bez wprowadzonego genu PR-NP. Dodatkowo, liza swoista uzyskana przy użyciu śródskómej drogi podania była porównywalna, przy wszystkich użytych stosunkach efektorów do komórek docelowych, do wyników uzyskanych przy użyciu podawania domięśniowego. Mierzono również miana wirusa w płucach u myszy otrzymuj ących wstrzyknięcia śródskóme i domięśniowe. Przy użyciu 5 myszy na grupę, 3 x 200 μg na dawkę, w odstępach trzytygodniowych i ekspozycji 3 tygodnie po ostatniej dawce uzyskano wyniki przedstawione poniżej:

178 626

Szczepionka	Sposób podania	Miano wirusa w płucach
dzień 5	dzień 7
V1-PR-NP	śródskórnie	5.2±0 2	4.14=1*
VI	śródskórnie	5.9±1	6.6±0.3
V1-PR-NP	domięśniowo	4.6±0.4	4.5±1.Γ
Nic	-	6.2±0.3	5.9±0.3

* Średni log miana ± SEM ** U jednej z myszy nie wykryto wirusa w ogóle.

Na koniec, badano odsetek przeżywalności przez dwadzieścia osiem dni. Dnia dwudziestego ósmego, spośród myszy, które otrzymały V1-PR-NP przeżyło 89%, które otrzymywały wstrzyknięcia i.m. i 50%, które otrzymywały wstrzyknięcia i.d. Nie przeżyła żadna spośród myszy otrzymujących sam wektor V1 i tylko 30% myszy nie traktowanych niczym. Doświadczenie to pokazuje, że DNA kodujący nukleoproteinę szczepu A/PR/8/34 był zdolny do indukowania CTL, które rozpoznawały nukleoproteinę heterologicznego szczepu A/Victoria/73, oraz ochronną odpowiedź odpornościową przeciwko heterologicznemu szczepowi A/HK/68.

Przykład 10. Szceepieni e naceelnych oolinukleotdeem

1. Przeciwciała przeciwko NP u rezusów: Rezusy (006 NP, 009 NP lub kontrola 101; 021) otrzymały wstrzyknięcia 1 mg/miejsce RSV-NP i.m. w trzy miejsca dnia 1. Wstrzyknięcia po 1 mg każdego z konstruktów RSV-LUX i CMV-int-LUX, konstruktorów ekspresjoenjącycC reporterowy gen lncyferacy świetlika, podano w tym samym czasie w różne miejsca. Zwierzętom podano ponowne wstrzyknięcie dnia 15 używając tej samej ilości DNA jak poprzednio oraz dodatkowo 1 mg pD5-CAT, konstruktu do ekspresji genu repertcrowege acetylotransferazy cCleramfenrkolowcj, każde w osobne miejsce. Miejsca w mięśniach, w które podano geny reporterowe pobrano drogą biopsji i badano na aktywność genów rcporterowycC. Surowicę pobierano 3, 5, 9, 11, 13 i 15 tygodni po pierwszym wstrzyknięciu. Pierwsza pozytywna próbka na przeciwciała anty-NP pobrana została w tygodniu 11 oraz również pozytywne próbki pobierano w tygodniach 13 i 15. Przeciwciała anty-NP oznaczano w teście ELISA. Wyniki pokazane są w figurze 9.

2. Przeciwciała hamujące Hemaglutynmę (HI) u rezusów: Małpom podano wstrzyknięcia

i.m. V1-PR-HA dnia 1. Dwa zwierzęta otrzymały po 1 mg, 100 pg lub 10 pg DNA w każdy z mięśni zzworogłowycC. Każde wstrzyknięcie podano w objętości 0.5 ml. Zwierzętom pobrano krew dnia 1 przed wstrzyknięciem. Wszystkim zwierzętom podano powtórnie DNA w dniu 15 i pobierano krew w odstępach 2-4 tygodniowych. Miana zahamowania Cemaglutyeiey (HI) w stosunku do A/PR/8/34 były pozytywne w 5 tygodni, 9 tygodni i 12 tygodni po pierwszym wstrzyknięciu DNA dla V1J-PR-HA. Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 10-1:

Tabela 10-1

Miana przeciwciał HI rezusów otrzymujących Y1J-PR-HA

REZUS#	DAWKA	MIANO PZECIWCIAŁ HI W TYGODNIU #
PRZED	3 TYG.	5 TYDZ.	9TYDZ.	12TYDZ.
88-010	1 mg	<10	<10	320	320	320
88-0200		<10	<10	<10	40	40

88-021	100 pg	<10	<10	<10	40	20
90-026		<10	<10	20	20	40

88-084	10 pg	<10	20	40	20	10
90-028		<10	<10	20	<10	<10

178 626

Przykład 11. Badania nad szczepionką polinukleotydową na fretkach.

1. Zapoczątkowano badania nad szczepieniem polinukleotydami fretek, w celu określenia, czy zwierzęta mogą być chronione przed zakażeniem wirusem grypy typu A przez immunizację genami kodującymi HA (białko powierzchniowe zdolne do indukowania szczepowo-swoistych przeciwciał neutralizujących), bądź białko wewnętrzne NP, NS1, PB1, M (uważane za indukujące odpowiedź odpornościową zależną od komórek, która jest szczepowo-niezależna). Zwierzętom wstrzyknięto DNA kodujący różne geny wirusa grypy w wektorze V1J tak jak to pokazano poniżej:

Tabela 11-1

Grapa	Konstrukt	Dawka	Liczba zwierząt immunizowanych	Ekspoz. H1N1	Ekspoz. H3N2
1	V1J-HA	1000 mg	16	8	8
2	V1J-NP	1000 mg	16	8	8
3	V1J-NP+NS1+PB1+M	2000 mg całk.	16	8	8
4	V1J-HA+ NP+NS1+PB1+PB2+M	2000 mg calk.	16	8	8
5	V1J-	1000 mg	16	8	8
6	nic	-	10	5	5
Całk. liczba zwierząt			90	45	45

2. W dniach 22 i 43 po immunizacji, pobierano surowice od zwierząt immunizowanych i badano w kierunku przeciwciał neutralizujących (zahamowanie hemaglutynacji - HI) i przeciwciał przeciwko nukleoproteinie (NP) testem ELISA. Zwierzętom podawano wstrzyknięcia DNA wywołującego przeciwciała przeciwko odpowiednim genom. Odzwierciedlająto figury 10,11 i 16.

3. Dnia 128, wybrane zwierzęta poddano ekspozycji na 1200 TCID5₀ wirusa grypy szczepu A/HK/68. Szczep ten jest heterologiczny do szczepu A/PR/8/34, który był źródłem sekwencji kodujących użytych do immunizacji i stąd ochrona świadczy o odporności opartej na zależnej od komórek, szczepowo-niezależnych mechanizmach odpornościowych. Jak to pokazano w dołączonej figurze 12, obserwowano istotne statystycznie zmniejszenie uwalniania wirusa w porównaniu z kontrolą u zwierząt immunizowanych DNA kodującym białka wewnętrzne, co potwierdza, że immunizacja polinukleotydami jest zdolna do wywołania odpowiedzi odpornościowej u fretek i, że taka odpowiedź jest ochronna.

4. Ekspozycję na homologiczny szczep A/PR/8/34 badano podobnie i wykazano podobnie efektywność ochronnąprzeciwciał neutralizujących wywołanych przez szczepienie polinukleotydami.

Przykład 12. Wytwarzanie V1Jns.

W celu polepszenia badania integracji dodano miejsce Sfil w V1Jneo. Dostępny w handlu łącznik Sfil, długości 13 par zasad (New England BioLabs), dodany został w miejscu KpnI, w sekwencji BGH wektora. V1Jneo linearyzowano przy użyciu KpnI, oczyszczono na żelu, wypełniono polimeraząDNA T4 i ligowano do posiadającego „tępe końce” łącznika Sfil. Przez mapowanie restrykcyjne wybrano izolaty klonalne i potwierdzono przez sekwencjonowanie przez łącznik. Nowy wektor oznaczono VIJns (figura 17). Ekspresja heterologicznych genów w V1Jns (z Sfil) była porównywalna z ekspresją tych samych genów w V1Jneo (z KpnI).

Przykład 13. Immunogenność

1. Odpowiedź odpornościowa humoralna

Wstrzyknięcie DNA kodującego HA, NP i M1 wirusa grypy, spowodowało humoralnąodpowiedź odpornościową u myszy, fretek oraz naczelnych (włączywszy afrykańskie małpy zielone i rezusy). Do tej pory wykazano, że PNV zawierające geny HA klonowane ze szczepów

178 626 wirusa grypy A/PR/34, B/Panama^, T/Beijińg/89, A/Texas/91, A/Hawaii/91 i A/Georgia/93 wywołuj ą przeciwciała.

a) Myszy: Wykryto testem ELISA przeciwciała przeciwko NP i Ml w surowicach myszy po wstrzyknięciu DNA. Znaczne miana przeciwciał (104-10⁶) wywołane zostały przez ilość rzędu 1 pg DNA dla NP (A/PR/34), podanego raz (najmniejsza dawka badana), narastając w ciągu dwóch tygodni po wstrzyknięciu (najwcześniejszy badany punkt czasowy) i nie zmniejszyły się przez co najmniej 6 miesięcy po wstrzyknięciu. Przeciwciała przeciwko NP nie są neutralizujące i nie uczestniczą w ochronie. Pokazują jednakże, ekspresję białka NP in vivo po wstrzyknięciu DNA. W przeciwieństwie do powyższego, przeciwciała przeciwko HA zapewniają odporność ochronną przeciwko homologicznym szczepom wirusa grypy. Wstrzyknięcie DNA dla HA sklonowanego ze szczepu A/PR/34 spowodowało produkcję przeciwciał neutralizujących, co mierzono in vitro, w teście zahamowania hemaglutynacji (HI). Miana HI >1280 stwierdzano u wielu myszy, którym podano trzy dawki po 100 pg DNA dla HA oraz obserwowano mierzalne miana u kilku zwierząt, które otrzymały zaledwie dwie dawki po 0.1 pg. Istniała zależność od dawki pomiędzy mianem HI i dawką DNA, jak również między mianem HI i liczbą wstrzyknięć (tabela 13-1):

Tabela 13-1

Wywoływanie odpowiedzi odpornościowej humoralnej u myszy (GMT HI)

Dawka (pg)	GMT HI
Liczba dawek
1	2	3
DNA dla HA (100)	75	106	260
DNA dla HA (10)	37	69	86
DNA dla HA (1)	<10*	13	24
DNA dla HA (0.1)	<10^b	<10*	<10*
DNA kontrolny (100) nienastrzyknięte	<10^b	<10b <1Qb	<10b

Tabela 13-1: Samicom myszy BALB/c (4-6 tygodni) wstrzyknięto DNA dla HA (VIJHA) w zaznaczonej dawce raz, dwa lub trzy razy w odstępach trzytygodniowych. Kontrole negatywne obejmowały myszy, którym podano kontrolny DNA składający się z wektora bez wstawki genu oraz myszy, którym nic nie podawano, i które nie miały dotąd kontaktu z antygenem. Próbki surowic pobierano w siedem tygodni po pierwszej dawce i badano na obecność przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI). Dane przedstawiono jako średnią geometryczną miana HI, gdzie n=10.

a niektóre ze zwierząt były pozytywne w badaniu na miana HI ^b wszystkie zwierzęta.

U każdej z badanych myszy obecność przeciwciał HI korelowała z ochronią w modelu ekspozycji na wirusa homologicznego. Odpowiedź przeciwciał HI u myszy, którym wstrzyknięto DnA dla HA (A/PR/34) pozostawała praktycznie niezmieniona przez co najmniej sześć miesięcy. Przeciwciała anty-HA, mierzone testem ELISA powstawały również u myszy pod wpływem DNA dla HA ze szczepów wirusa grypy A/Beijmg/89, B/Panama/90 i A/Texas/91.

W oparciu o doniesienia z literatury pokazujące mniejszą ekspresję genu reporterowego u starszych myszy po wstrzyknięciu DNA, badano wpływ wieku na odpowiedź odpomościowąhumoralną na HA. Ze względu na brak dostępności starych dziewiczych samic myszy, użyto starych myszy rodzicielskich w wieku około 10 miesięcy. Stare myszy rodzicielskie oraz 4-6 tygodniowe myszy dziewicze porównywano pod względem ich zdolności tworzenia przeciwciał przeciwko HA. Myszy starsze zdolne były do tworzenia przeciwciał przeciwko HA po

178 626 wstrzyknięciu DNA dla HA w dawce zaledwie 1 pg (najniższa dawka badana), ale o mianach nizszych niż myszy młodsze (Tabela 13-II).

Tabela 13-11

Wpływ wieku na odpowiedź odpornościową humoralną

Szczepionka	Dawka (pg)	GMT (4-6 tyg.)	GMT (10 m-cy)
DNA dla HA	100	1034	110
DNA dla HA	10	338	68
DNA dla HA	1	80	20
DNA kontrolny	100	<5’	<5‘
Nienastrzyknięte	-	<5’	<5’
Zakażone grypą	-	538	36

Tabela 13-1: Samicom myszy BALB/c (4-6 tygodniowe myszy dziewicze lub 10 m-cy stare myszy rodzicielskie) wstrzyknięto DNA dla HA szczepu A/PR/34 (V1JHA) w zaznaczonej dawce trzy razy w odstępach trzytygodniowych. Kontrole negatywne obejmowały myszy, którym podano kontrolny DNA (V1J) oraz myszy, którym nic nie podawano, i które nie miały dotąd kontaktu z antygenem. Dla porównania inne myszy zarażono subletalną dawką wirusa A/PR/34. Próbki surowic pobierano w dziewięć tygodni po pierwszej dawce i badano na obecność przeciwciał hamujących hemaglutynację (HI). Dane przedstawiono jako średnią geometryczną miana HI gdzie n=15.

^a wszystkie ze zwierząt były negatywne w badaniu na miana HI

Jednakże nie był to wynik dotyczący wyłącznie PNV a raczej zmniejszonej możliwości starych myszy do generowania odpowiedzi odpornościowej humoralnej w ogóle, ponieważ starsze myszy przejawiają również słabszą odpowiedź HI, w porównaniu z młodymi myszami, po zakażeniu żywym wirusem A/PR/34. W rzeczywistości, przeciwciała HI wydają się być mniej zaburzone u szczepionych DNA myszy starszych niż starszych myszy zakażonych wirusem grypy. Ponadto, stare myszy rodzicielskie, użyte w doświadczeniu były około 50% cięzsze w porównaniu z typowymi myszami dziewiczymi w tym samym wieku, co w oparciu o badania innych z użyciem diet ograniczaj ących kalorie może wywierać u myszy negatywny wpływ na odpowiedź odpornościową. Z tego oraz innych powodów odpowiedź odpornościowa u tych myszy może nie być reprezentatywna. Mimo tego, wiek (powyżej 10 miesięcy) nie wydaje się znacząco zmniejszać zdolności szczepienia polinukleotydami do wywoływania humoralnej odpowiedzi odpornościowej, nawet w dawkach rzędu 1 pg.

b) Fretki: Wywołano odpowiedź odpornościową humoralną u fretek, którym wstrzyknięto DNA dla HA ze szczepów wirusa grypy A/PR/34, A/Beijing/89, A/Hawaii/91 i A/Georgia/93. Przeciwciała HI przeciwko A/PR/34 i przeciwciała ELISA przeciwko HA z różnych szczepów wywołane zostały odpowiednim PNV, Stwierdzono, że w surowicach od fretek, którym wstrzyknięto DNA dla HA z A/Beijing/89, A/Hawaii/91 i A/Georgia/93 stwierdza się przeciwciała HI i przeciwciała neutralizujące, ponieważ zwierzęta te chronione były przed ekspozycjąna wirusa.

c) Naczelne: (Patrz wyżej, przykład 10). Rezusy immunizowano dwukrotnie przy użyciu DNA dla HA (A/PR/34) w dawkach 10,100 i 1000 pg na łapę. Miana HI do 320 stwierdzono u zwierząt, które otrzymały dawki 100 i 1000 pg oraz miano HI 80 u jednego z dwóch zwierząt, które otrzymały dawkę 10 pg. Jak dotąd, surowice badane były przez 13 miesięcy; miana HI nie opadały znacząco od 6-13 miesięcy (tablica 13-III):

178 626

Tabela 13-III

Wytwarzanie przeciwciał HI u Rezusów

Dawka (pg)	przed	1 m-c.	2 m-c.	5.5 m-ca.	13 m-cy.
2000	<10	640	160	160	80
2000	<10	40	20	20	20
200	<10	80	40	40	80
200	<10	80	40	40	20
20	<10	40	20	20	20
20	<10	<10	<10	<10	<10

Tabela 13-III: Rezusy (zarówno samce jak i samice) ważące od 4.3 do 8.8 kg otrzymały wstrzyknięcia DNA dla HA A/PR/34 (V1JHA) w ocelazcoeyzC dawkach w tygodniu 0 i 2. P’r^ć)t^kżi surowic pobierano w oznaczonym czasie po podaniu pierwszej dawki i badano na miano HI. Dane przedstawiają miana HI dla poszczególnych zwierząt.

U afrykańskich małp zielonych, którym wstrzyknięto kombinację PNV zawierającą 100 pg DNA (A/Bcijieg/89) badanie surowic 4-6 tygodni po pierwszej dawce wykazało GMT równe 29 (8 na 9 odpowiedzi). Przedstawia się to korzystnie w porównaniu z lizencjeeowaną szczepionką cawierającąpodjcdnostkę wirionu (GMT równe 16, 5/6 odpowiedzi) i licencjonowaną szczepionką zawierającą cały wirion (GMT równe 36, 6/6 odpowiedzi) w tym samym punkcie czasowym (figura 18). Obserwowano znaczny efekt dawki przypominającej, po drugiej immunizacji, u zwierząt otrzymujących dawkę 10 pg DNA dla HA (GMT równe 1.9 po pierwszej dawce i 199 po dwóch dawkach). Licencjonowana szczepionka zawierająca cały wirion przejawiała podobny efekt dawki przypominającej, podczas gdy miana HI wywołane przez podanie drugiej dawki szczepionki zawierającej podjedeosOkę wirionu były jedynie przejściowe. Do tej pory podobne poziomy przeciwciał HI oznaczane są od 18 tygodni u zwierząt immunizowaeyzh dawkami 10 pg oraz 100 pg DNA dla HA w porównaniu z najlepszą licencjonowaną szczepionką (cały wirion). Wyniki te pokazują, że PNV było przynajmniej tak efektywne w wywoływaniu przeciwciał neutralizujących jak szczepionka oparta na całym wirionie i lepsze niż szczepionka zawierająca podjednostkę wirionu. Szczepionki oparte na oczyszczonej poajedeesOcc nie były oznaczalnie immunogenne dla myszy; ale nie testowano ich na naczelnych. W tym doświadczeniu PNV zawierało 5-walentnąmicscaeinę DNA kodujących HA ze szczepów A/Beijing/89, B/Panama/90 i A/Texas/91 oraz NP i M1 z A/PR/34 tak by przypominało potencjalną szczepionkę. Badano również u tych zwierząt wywoływanie odpowiedzi odpornościowej humoralnej przeciwko innym składnikom szczepionki i wykryto przeciwciała przeciwko HA z B/Panama/90 i NP z A/PR/34. W osobnym doświadczeniu wywoływano zarówno HI jak i przeciwciała neutralizujące przeciwko HA z A/Texas/91, przez wstrzyknięcie dwóch dawek klonowanego przez PCR DNA dla HA.

2. Odpowiedź odpornościowa komórkowa. Patrz przykład 3, po wyżej.

3. Wywoływanie odpowiedzi odpornościowej

a) Odporność humoralna: Nie są wyjaśnione zjawiska prowadzące do wywoływania odpowiedzi odpornościowej humoralnej i komórkowej. By wywołać powstawanie przeciwciał (np. przeciwko Ha wirusa grypy), wydaje się, że komórki muszą ekspresjonować antygen na powierzchni błony komórkowej lub wydzielać do środowiska zcweątrckemórkowcge, Dodatkowo, transfekowane komórki powinny ekspresjonować HA o drngercędowej, trzeciorzędowej i czwartorzędowej strukturze podobnej do występującej w wirionie. W teście tworzenia rozetek, wykazano ekspresję powierzchniową HA w komórkach RD (rCabdomresarkoma, pochodzenia mioblastoidalnege) traesfckowaeycC przemijająco DNA dla HA. Erytrocyty aglutynowane na powierzchni komórek transfekowanych HA, ale nie traesfekowanycC pustym wektorem, wskazują, że HA była nie tylko ekspresjonowana na powierzchni ale również posiadała odpowiednią konformację do wiązania białek zawierających kwas sialowy.

178 626

b) Odporność komórkowa: wywoływanie odpowiedzi odpornościowej komórkowej (np. przeciwko NP wirusa grypy) wymaga obróbki proteolitycznej i prezentacji uzyskanych po niej peptydów w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I. Nie znana jest natura komórek prezentujących antygen, prowadzących do wywołania odpowiedzi odpornościowej po wstrzyknięciu DNA. Komórki mięśniowe ekspresjonująniski poziom MHC klasy I i, jak się uważa, nie ekspresjonująna swej powierzchni cząsteczek kostymulujących. Stąd, nie uważa się komórek mięśniowych za komórki prezentujące antygen. Jednakże, istnieją dowody sugerujące, że komórki mięśniowe biorą udział w wywoływaniu odpowiedzi odpornościowej po wstrzyknięciu i.m. DNA. Po pierwsze, ograniczone obserwacje tkanek zdolnych do internalizacji nagiego DNA plazmidowego, prowadzącej do ekspresji białka in situ pokazują, że wiele typów komórek ekspresjonuje geny reporterowe po bezpośrednim wstrzyknięciu plazmidu do tkanek, ale znacz nie mniej efektywnie niz komórki mięśniowe. Nie opisano kompletnej analizy pobierania DNA przez komórki niemięśniowe po wstrzyknięciu i.m., ale wydaje się, że jest ono jeszcze mniej efektywne. Po drugie, wykazano ekspresję genów reporterowych po wstrzyknięciu DNA i.m. w komórkach mięśni szkieletowych i serca u wielu różnych gatunków. Po trzecie, jakkolwiek odpowiedź CTL może być wywołana po wstrzyknięciu DNA innymi drogami (i.v. i i.d.), najlepszą ochronną odpowiedź odpornościową uzyskano po wstrzyknięciu DNA i.m. Po czwarte, mioblasty i miocyty mogąbyć rozpoznawane i niszczone przez CTL in vitro i niszczenie to może być wzmocnione przez uprzednie traktowanie interferonem-y, który zwiększa ekspresję MHC klasy I. Na koniec, przeszczepienie transfekowanych w sposób trwały mioblastów, ekspresjonujących NP, syngenicznym myszom, które nie miały dotąd kontaktu z antygenem, powoduje wywołanie ochronnej, komórkowej odpowiedzi odpornościowej in vivo (figura 20). Stąd, ekspresja antygenów przez komórki mięśniowejest wystarczająca do wywołania ochronnej odpowiedzi odpornościowej obserwowanej po wstrzyknięciu DNA. Ponadto, pobieranie i ekspresja DNA przez komórki niemięśniowe może nie być wymagana do wywołania ochronnej odporności. Z punktu widzenia polinukleotydów jako szczepionek może być korzystne ograniczenie pobierania DNA wyłącznie do komórek mięśniowych. Po pierwsze, miocyty są końcowo zróżnicowane i nie dzielą się. Może to być istotne dla zmniejszenia możliwości integracji plazmidowego DNA do DNA chromosomałnego i utrzymywania trwałej ekspresji antygenu, co mogłoby prowadzić do długotrwałej odpowiedzi odpornościowej. Po drugie, miocyty są wielkimi, wielojądrzastymi komórkami, które mogą się regenerować przez fuzję z mioblastami. Może to pomóc wyjaśnić dlaczego wstrzyknięcie DNA prowadzi do ekspresji białka, która może trwać przez długi czas bez śladów niszczenia komórek przez CTL.

Przykład 14. Badania nad ochroną

Immunizacja przy użyciu DNA kodującego antygeny wirusa grypy zapewnia ochronę przed śmiercią oraz chorobą, a także zmniejsza obciążenie wirusem w wielu różnych kombinacjach szczepów wirusa grypy, w dwóch szeroko uznanych modelach zakażenia grypą ludzką (myszy i fretek).

1. Heterologiczna (heterotypowa, grupowo-wspólna) ochrona nie jest zapewniana przez licencjonowaną szczepionkę opartą na zabitym wirusie, ale jest zapewniana przez szczepienie przy użyciu dNa w modelach zwierzęcych. Ochronę tą zademonstrowano, gdy zwierzętom laboratoryjnym wstrzyknięto DNA kodujący NP lub M1. Krzyżowa, komórkowa odpowiedź odpornościowa wywołana szczepieniem tymi DNA zapewniała odpowiedź ochronną.

a. Mvszy: Myszy BALB/c i C3H, którym wstrzyknięto i.m. DNA kodujący NP z A/PR/34 były chronione przed śmiercią i chorobą (ocenianą utratą wagi ciała) po ekspozycji przez zakażenie całych dróg oddechowych przy użyciu LD9 A/Hong Kong/68 (H3N2), szczepu heterotypowego (H3 wobec H1 A/PR/34). Figura 21 pokazuje przeżywalność myszy BALB/c immunizowanych trzykrotnie DNA dla NP (200 fg/dawkę) w trzytygodniowych odstępach i poddane ekspozycji trzy tygodnie po ostatniej immunizacji. Figura 22 pokazuje zahamowanie utraty wagi po ekspozycji u myszy immunizowanych w porównaniu z ciężką utratą-wagi doświadczaną przez myszy kontrolne. Figura 23 pokazuje zmniejszenie ilości wirusa w płucach siedem dni po ekspozycji górnych dróg oddechowych u myszy immunizowanych DNA dla NP

178 626 w porównaniu z myszami, którym podawano kontrolny, nie kodujący DNA. Myszy immunizowane DNa dla NP były całkowicie chronione przed śmiercią, wykazywały zmniejszoną utratę wagi i mniejsze ilości wirusa w płucach w porównaniu z myszami kontrolnymi. Ilość DNA dla NP potrzebna do ochrony myszy przez śmierciąi utratąwagi określono na <6.25 (ag na wstrzyknięcie gdy podawano trzy wstrzyknięcia DNA (figura 24). Stwierdzono, że ochrona wytwarzana przez immunizację DNA dla NP pozostaje nie zmieniona u myszy immunizowanych przez przynajmniej 3 miesiące. Poziom ochrony utrzymuje się przez 6 miesięcy, ale zmniejsza się nieznacznie pomiędzy 3 a 6 miesiącem po ostatniej immunizacji. Jednakże, ponowne szczepienie pojedynczą dawką DNA dla NP w 22 tygodniu, trzy tygodnie przed ekspozycją w 25 tygodniu, przywraca w pełni ochronę (figura 25). Stąd, immunizacja myszy DNA dla NP powoduje długotrwałą, możliwą do przypomnienia, ochronę heterołogiczną. Zdolność do wywołania odpowiedzi anamnestycznej pod wpływem powtórnego szczepienia tych zwierząt sugeruje, że pamięć immunologiczna została wywołana szczepieniem przy użyciu DNA dla NP.

b. Fretki: Fretki są powszechnie używanym modelem zakażenia wirusem grypy ludzkiej ponieważ sąpodatne na zakażenie szeroką gamą ludzkich izolatów wirusa grypy. Replikacja wirusa u fretek zachodzi głównie w nozdrzach i tchawicy i w znacznie mniejszej ilości w płucach, w przeciwieństwie do myszy, u których występuje ogromne obciążenie wirusem płuc. Zakażenie u fretek badane jest najłatwiej przez miareczkowanie wirusa w popłuczynach z nozdrzy. Fretki immunizowane DNA dla NP czy DNA dla M1, pojedynczo lub w połączeniu, ze szczepu niedawno uzyskanego od ludzi (A.Beijing.89, H3N2), wykazują znacznie zmniejszone uwalnianie wirusa w dniach 1-6 po ekspozycji na izolat krążący, A/Georgia/93 (H3N2) (figura 26). Ten izolat krążący wykazuje dryf antygenowy w stosunku do szczepu typu A/Beijing/89, tak, że licencjonowana szczepionka oparta na A/Beijing/89 zapewniała niewielką lub żadną ochronę ludzi przed chorobą wywoływaną przez A/Georgia/93. Fretki immunizowane DNA kodującym białka wewnętrzne A/PR/34 przejawiały znacznie zmniejszone uwalnianie wirusa z nozdrzy w dniach 5 i 6 po zakażeniu szczepem homotypowym, A/PR/34 (figura 27). Zmniejszenie uwalniania wirusa obserwowane było po ekspozycji na A/Georgia/93 i zarówno wczesnych jak i późnych punktach czasowych, podczas gdy po ekspozycji na A/PR/34 obserwowana była późna redukcja uwalniania wirusa; mogło to być spowodowane różnicą w zakaźności dla fretek pomiędzy oboma szczepami.

2. Homologiczna (homotypowa, typowo-specyficzna) ochrona wykazana została u zarówno myszy jak i fretek immunizowanych DNA dla HA.

a. Myszy: Myszy BALB/c immunizowane DNA dla HA (A/PR/34) były całkowicie chronione przed ekspozycją na LD₉₀ A/PR/34. U immunizowanych myszy nie obserwowano śmierci (figura 28) ani utraty więcej jak 5% wagi ciała (figura 29) po ekspozycji, podczas gdy 90-100% zwierząt kontrolnych padło i doświadczało ciężkiej utraty wagi ciała. Miareczkowanie dawki DNA dla HA niezbędnego do uzyskania ochrony pokazało, że trzy wstrzyknięcia po 1 pg DNA dla HA było wystarczające do uzyskania pełnej ochrony (figura 30).

b. Fretki: Fretki, które immunizowano DNA kodującym HA ze szczepu A/PR/34, przejawiały znacznie mniejsze uwalnianie wirusa w dniach 1-6 po ekspozycji homologicznej w porównaniu z fretkami, które otrzymały DNA kontrolny (figura 31). Podobnie, fretki, które immunizowano DNA dla HA z A/Georgia/93 przejawiały zmniejszone uwalnianie wirusa w dniach 1i 3-7 po zakażeniu homologicznym (figura 32). Obecne były przeciwciała HI przeciwko odpowiednim szczepom w surowicach od wszystkich immunizowanych fretek (patrz wyżej). Stąd, immunizacja DNA dla HA zapewnia ochronę homologiczną.

3. Kombinacje szczepionki: Zdolność DNA dla HA do zapewnienia lepszego zakresu ochrony po połączeniu z DNA dla NP i Ml badano na fretkach.

a. Zakres ochrony przed wariantami dryfu antygenowego: dryf antygenowy, który wystąpił pomiędzy szczepami A/Beijing/89 i A/Beijing/92 był wystarczający, by wielu ludzi immunizowanych licencjonowaną szczepionką zawierającą A/Beijing/89 nie było chronionych przed chorobą spowodowaną przez wariant A/Beijing/92. W Ameryce Północnej, choroba spowodowana była przez przypominające A/Beijing/92 izolaty krążące, przykładowo, A/Georgia/93.

178 626

Izolaty krążące w Ameryce Północnej są antygenowo podobne do szczepu typowego, A/Beijmg/89, ale różnią się położeniem geograficznym miejsca wyizolowania i ich historią pasażowania, ponieważ były pasażowane raczej na komórkach ssaków niż najajach kurzych. Jednak pod względem sekwencji aminokwasowej szczepy pochodne A/Beijmg/92 różniły się od szczepów A/Beijmg/89 tylko 11 mutacjami punktowymi (pozycje 133,135, 145, 156,157, 186, 190, 191 193,226 i 262) w regionie HA1. Stąd, badano czy połączenie homotypowej odpowiedzi odpornościowej wywołanej przez DNA dla HA z krzyżową odpowiedzią CMI wywołaną przez DNA dla NP i M1 zapewni wyzszy stopień ochrony przed wariantem wynikłym z dryfu antygenowego. Immunizacja fretek szczepionką licencjonowaną zawierającą szczep A/Beijing/89 lub przy użyciu DNA dla HA z A/Beijmg/89 lub izolatów krążących przypominających A/Bejing^ (A/Hawaii/1) powodowała zmniejszenie uwalniania wirusa po ekspozycji fretek na A/Georgia/93 (figura33). Fretki, które immunizowano połączeniem PNV zawierającym DNA dla NP, Ml i HA wykazywały znacząco niższe uwalnianie wirusa w porównaniu z fretkami immunizowanymi szczepionką licencjonowaną lub tylko DNA dla HA (figura 34). W przypadku DNA dla HA z A/Hawaii/91 połączonego z DNA dla NP i Ml powstała ochrona nie była znacząco różna od ochrony maksymalnej zapewnianej przez homologiczne DNA dla HA z A/Georgia/93 (figura 35). Stąd, połączenie DNA dla HA, NP i M1 powodowało polepszoną ochronę przed wariantem wynikłym z dryfu antygenowego w porównaniu z licencjonowaną szczepionką.

b. Wpływ historii pasażowania na antygen szczepionki: Fretki immunizowane szczepionką zawierającą sekwencję DNA dla HA uzyskaną z izolatu krążącego w Stanach Zjednoczonych utrzymywano na komórkach MDCK w hodowli (A/'Hawaii/91) wykazywały mniejsze uwalnianie wirusa (p=0.021 mierzone dwustronnym testem ANOVA), niż fretki, którym podawano licencjonowaną szczepionkę opartą na zbitym wirusie zawierającą szczep A/Beijmg/89 pasażowany na jajach kurzych, gdy poddano je ekspozycji na zdryfowany antygenowo szczep A/Georgia/93 (figura33). W przeciwieństwie, fretki, którym podawano DNA dlaHA A/Beijmg/89 nie uwalniały wirusa w sposób różny (p=0.058) od fretek, które otrzymały licencjonowaną szczepionkę zawierającą identyczny wirus, po ekspozycji na A/Georgia/93. Szczepy hodowane na jajach i komórkach ssaków różniły się dwiema mutacjami w obrębie regionu HA1 genu HA (pozycje 186 i 193), które obie zlokalizowane były w antygenowym miejscu B, blisko wierzchołka monomeru HA w regionie uważanym za ważny dla wiązania się HI i przeciwciał neutralizujących. W pewnych warunkach zdolność niektórych izolatów ludzkich wirusa grypy do wiązania erytrocytów (RBC) kurzychjest początkowo bardzo niska, ale zwiększa się stopniowo przez kolejne pasaże na jajach co sugeruje, że region wiążący receptora w HA może ulegać znaczącej selekcji przez wzrost na komórkach ptasich. Wpływ małych odmienności sekwencji na efektywność szczepionek przeciwgrypowych opartych na HA u zwierząt laboratoryjnych podkreśla wagę pozostawania, na ile to możliwe, blisko sekwencji wirusa dzikiego, w trakcie przygotowywania takich szczepionek.

c. Naczelne z wyłączeniem ludzi: Naczelne nie są powszechnie stosowane w modelach ekspozycji na wirusa grypy z powodu braku klinicznej odpowiedzi na chorobę. Jednakże, badano immunogenność połączeń szczepionek PNV u naczelnych w porównaniu z licencjonowaną szczepionką opartą na zabitym wirusie. Miana przeciwciał wywołane przez połączenie PNV, zawierające HA i geny białek wewnętrznych były przynajmniej równoważne do uzyskanych przy zastosowaniu licencjonowanego produktu w sensie mian przeciwciał HI i długotrwałości odpowiedzi (patrz wyżej). Afrykańskie małpy zielone immunizowane PNV odpowiadały na PNV HA kodujące wariant zdryfowany antygenowo, pokazując, że odpowiedź typowo-swoista na PNV może być wywołana u uprzednio immunizowanych osobników. Małpy immunizowane PNV odpowiadały również na następne immunizacje przy użyciu konwencjonalnej szczepionki opartej na zabitym wirusie.

4. Wnioski: Szczepionki polinukłeotydowe przeciwko grypie są efektywne w modelach zakażenia wirusem grypy zwierząt laboratoryjnych. Ochrona homologiczna może być osiągnięta przy użyciu wektorów DNA kodujących HA, najprawdopodobniej w mechanizmie immunologicznym analogicznym do wywoływanego przez białko HA używane w obecnych licencjono178 626 wanych szczepionkach przeciwko grypie. Ochrona heterologiczna może być osiągnięta przeciwko zarówno zmienionymjak również zdryfowanym antygenowo szczepom przez dołączenie DNA kodującego zakonserwowane białka wewnętrzne wirusa grypy. Połączenie tych podejść w pojedynczej immunizacji owocuje polepszoną ochroną przeciwko odmianom zdryfowanym antygenowo w porównaniu z obecnie licencjonowanymi szczepionkami w modelu z użyciem fretek.

Przykład 15. Wykonanie wektora V1R

W próbach ciągłego doskonalenia podstawowego wektora do szczepienia, wykonano pochodną V1Jns, którą oznaczono jako V1R. Powodem konstrukcji tego wektora było uzyskanie wektora szczepionki o minimalnych rozmiarach, tzn. bez niepotrzebnych sekwencji DNA, który zachowywałby ogólnie polepszoną charakterystykę ekspresji heterologicznych genów oraz dawałby znaczną ilość plazmidu, korzystniejszą niż V1J i V1Jns. Określono, na podstawie literatury jak również z doświadczeń, że (1) regiony w zrębie pUC obejmujące początek replikacji

E. coli mogą być usunięte bez wpływu na uzyskiwaną ilość plazmidu z bakterii, (2) region 3' genu kan', następujący po ramce odczytu kanamycyny może być usunięty jeżeli zostanie w zamian wprowadzony terminator bakteryjny i (3) -300 bp od połówki 3' terminatora BGH może być usunięte bez wpływu na jego funkcje regulacyjne (zaraz po oryginalnym miejscu restrykcyjnym KpnI w elemencie BGH).

V1R skonstruowano przy użyciu PCR syntetyzuj ąc trzy segmenty DNA z V1 Jns odpowiadające elementom promotora CMVintA/terminatora BGH, początku replikacji i elementowi oporności na kanamycynę. Przy użyciu oligomerów do PCR do końców każdego z elementów dodano unikalne dla segmentu miejsca restrykcyjne: Sspl i Xhol do CMVintA/BGH; EcoRV i BamHI do genu kari i Bell i Sali do orf. Wybrano te miejsca enzymatyczne ponieważ umożliwiały one kierowaną ligację każdego z uzyskanych przez PCR segmentów DNA z następową utratą każdego z miejsc: EcoRV i Sspl pozostawiły DNA o tępym końcu gotowe do ligacji podczas gdy BamHI i Bc1I pozostawiły końce komplementarne do Sali i Xhol. Po uzyskaniu tych segmentów przez PCR, każdy z segmentów trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi wskazanymi powyżej, a następnie ligowano w pojedynczej mieszaninie reakcyjnej wszystkie trzy segmenty DNA. Koniec 5' orf został zaprojektowany tak, że obejmował niezalezną sekwencję terminatora T2 rho, normalnie spotykaną w tym regionie tak, że powoduje terminację informacji dla genu oporności na kanamycynę. Ligowany produkt potwierdzono trawieniem restrykcyjnym (>8 enzymów) jak również sekwencjonowaniem miejsc połączeń. Uzyskiwanie dNa plazmidowego jak również ekspresja heterologicznych genów przez V1R wydawała się być podobna do V1 Jns. Uzyskane zmniejszenie wielkości wektora wyniosło 1346 bp (V1Jns=4.86 kb; V1R=3.52 kb), patrz figura 36, Identyfikator Sekw. Nr 45.

Sekwencje oligomerów do PCR użyte do syntetyzowania V1R (miejsca restrykcyjne podkreślono i podpisano w nawiasach po sekwencji):

(1) 5'GGTACAAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACG3' [Sspl] Identyfikator Sekw. Nr 60;

(2) 5'CCACATCTCGAGGAACCGGGTCAATTCTTCAGCACC3' [Xhol] Identyfikator Sekw. Nr 61; (dla segmentu CMVintA/BGH) (3) 5'GGTACAGAJATęGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATC3' [EcoRV] Identyfikator Sekw. Nr 62;

(4) 5'CCAC.ATGCjATCCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACC3' [BamHI] Identyfikator Sekw. Nr 63. (dla segmentu genu oporności na kanamycynę) (5) 5'GGTACATGATCACGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG3' [Bcll] Identyfikator Sekw. Nr 64;

(6) 5'CCACATGTCGACCCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGG3' [Sali] Identyfikator Sekw. Nr 32.

(dla początku replikacji E. Coli).

178 626

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Donnelly, John J.

Dwarki, Vivrani J.

Liu, Margaret A.

Montgomery, Donna L.

Parker, Suezanne E.

Shiver, John W.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Środki Farmaceutyczne Oparte na Kwasach Nukleinowych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 64 ' (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Merck & Co., Inc.

(B) ULICA: P.O. Box 2000 (C) MIASTO: Rahway (d) STAN: New Jersey (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD: 07065 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln rel.#1.0, ver. #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/032,383 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 18 MARCA 1993 (vii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/089,985 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 08 LIPCA 1993 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWISKO: Bencen, Gerard H (B) NUMER REJESTRACYJNY: 35,746 (C) NUMER SPRAWY: 18972Y (xi) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (908) 594-3901 (B) TELEFAX: (908) 594-4720 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (b) TYP: Kwas, nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1: GTGTGCACCTCAAGCTGG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2 (i) CHAIRAKTERYSTYKA SEKWENCJJ:

178 626 (A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 2: CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 3: GGTACAAGATCTACCATGCTTCTAACCGAGGTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 4: CCACATAGATCTTCACTTGAACCGTTGCATCTGCAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 5: CTATADAAGCAGAGCTCGTTTAG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DłUGOŚĆ: 30 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 6:

178 626

GΓACCAAACATCTAAGGACGGTCACTGCAG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 7:

CTATGTGTCTG/AAAA'GdACGCGGAGATTGCCCTCGCAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 8:

CTGCGACCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (b) TYP: Aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 9:

Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 10 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4432 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 10:

178 626

TCGCGCGTTT	CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA	60
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	GCCGGGAGCA	GACAAGGCCCG	TCAGGGCGCG	TCAGCGGGTG	120
TTGGCGGGTG	TCGGGCCTGC	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC	180
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAATACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACCT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300
TCCAACATTA	CCCCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTACT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
GGOGTCATTA	CTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	CGGTAAATGG	420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	CTGGACTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACGGTAAA	TGGCCCGCCT	GCCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	actttcctac	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGCGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780
CGTCAATGGG	agtttgtttt	GGCACCAAAA	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	GTCGTAACAA	840
CTCCGCCCCA	TTGACGCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAtGGTCT	ATATAAGCAG	900
AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	960
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTGGC	1080
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGOCTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	gctctttgcc	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCACCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGCTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC	GGCCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680

178 626

GGCAGAAGAA	GATGCACGCA	GCTGACTTCr	TCTGTTCTCA	TAAGACTCAG	AGCTAACTCC	1740
CGTTCCGGTG	CTGTTAACGG	TCGAGCCCAG	TGTAGTCTGA	GCACTACTCG	TT^G^GCCGC	1800
GCGCGCCACC	AGACATAATA	GCTCACACAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TCCCTCTTTT	18(30
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	τcΓ^ccτcτcc	οηχτΆΏττ;	CCAGCCATCT	GTTCTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACC^^AAG	GTCCCACTCC	CACTCTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCCCAT	TGTCTCACTA	GCTCTCATTC	TATTCTGGGG	GCTCCCGTGC	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTCCCAAC	ACAATAGCAG	GCATCCTGGG	GATCCCGTCG	2100
CCTCTATGGC	TACCCAGCTG	CTGAAGAATT		CTCCTGCCCC	AGAAACAACC	21t>0
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	CTCCACGCCC	CTCCTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCAT^GG	ACACTCATAG	CTCACCAGCC	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAACTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAACAGTCC	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GCCTATTAAC	TCCACAGGCA	GAGAAAATGC	CTCCAACATC	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGA-ATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TCACTCGCTC	2460
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGA(GCCCTA	TCAGCTCACT	CAAAGCCCCT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAG^-AA-AG	AACATOT^GAG	CAAAAGGCCA	^CAAAAG^CC	2580
AG^^^CGTA	AAAAG^CGC	σrτGcτcccc	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCT^^C^GAG	2640
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AACΓCACACC	TGGCCAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CA^^i^-TTC	CCCCTGGAAC		^σΓσΓϋσΐΌ	TTCCGACCCT	^CGCTTACC	2760
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CC:CTTCCGCA	ACCCTGGCCC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
AGG^J^TCTCA		G<GΓCCTTCCC	TCCAACCTCG	QCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	ACCGC^GCGC	CTTATCCCCT	AACTATCGTC	ΓTCACΓCCAA	CCCGGTAAGA	2940
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	CGTAACACGA	TTAGCAGAGC	GAGCTATCTA	3000
GGCGCTGCTA	CAGAt^TmCTT	GAAGTCCTCC	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AACCACACΓA	3060
TTTGGTATCT	GCCCTCTCCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGA-A	AAAGACΓTCC	TACCTCTTGA	3120
TCCGGCAAAC	AAAccAccgc	TCCTACCCGT	G<CrΓTTTTTC	TTTCCAAGCA	GCAGATTACG	3180
CGCAGAAAAA	AAGG^^T^ICrCA	AG^^GATC^¹	TTCATCTTTT	CTACGCGGTC	TCACGCTCAG	3240
TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGCA'ΓΓTTC	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGrrTT	AAATCAATCT	AAACTATATA	TCACTAAACT	3360
TGGTCTGACA	GTTACCAATO	CTTAATCAGT	GAG^.^^^TA	TCTCAGCGAT	CTCTCTATTT	3420
CGTTCATCCA	'ΙΆσΠΌΌσΐΌ	ACTCCCCCTC	CΓCΓACATAA	CTACGATACG	CGACCGCTTA	3480
CCATCTGGCC	CCAGTCCTCC	AATGATACCG	CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	3540

178 626

TCAGCAATAA	ACCAGCCAGC	CGGAAGGGCC	GAGCGCAGAA	GTGGTCCTGC	AACTTTATCC	3600
GCCTCCATCC	AGTCTATTAA	TTGTTGCCGG	GAAGCTAGAG	TAAGTAGTTC	GCCAGTTAAT	3660
agtttgcgca	ACGTTGTTGC	CATTGCTACA	GGCATCGTGG	TGTCACGCTC	GTCGTTTGCT	3720
ATGGCTTCAT	TCAGCTCCGG	TTCCCAACGA	TCAAGGCGAG	TTACATGATC	CCCCATGTTC	3780
TGCAAAAAAG	CGGTTAGCTC	CTTCGGTCCT	CCGATCGTTG	TCAGAAGTAA	GTTGGCCGCA	3840
GTGTTATCAC	TCATGGTTAT	GGCAGCACTG	CATAATTCTC	TTACTGTCAT	GCCATCCGTA	3900
AGATCGCTTTT	CTGTGACTGG	TGAGTACTCA	ACCAAGTCAT	TCTGAGAATA	GTGTATGCGG	3960
CGACCGAGTT	GCTCTTGCCC	GGCGTCAATA	CGGGATAATA	CCGCGCCACA	TAGCAGAACT	4020
TTAAAAGTGC	TCATCATTCG	AAAACCTTCT	TCGGGGCGAA	AACTCTCAAG	GATCTTACCG	4080
CTGTTGAGAT	CCAGTTCGAT	GTAACCCACT	CGTGCACCCA	ACTGATCTTC	AGCATCTTTT	4140
ACTTTCACCA	GCGTTTCTGG	GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA	4200
ATAAGGGCGA	CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC	4260
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	aatgtattta	GAAAAATAAA	4320
CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	CTGACGTCTA	AGAAACCATT	4380
ATTATCATGA	CATTAACCTA	TAAAAATAGG	CGTATCACGA	GGCCCTTTCG	TC	4432

(2) INi-ORMACJC A OIDENTYFIKATORA AEKW. Nr 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2196 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 11:

ATTCCCTATT	GGCCATTGCA	TACGTTGTAT	CCATATCATA	ATATGTACAT	TTATATTGGC	60
TCATGTCCAA	CATTACCGCC	ATGTTGACAT	TGATTATTGA	CTAGTTATTA	ATAGTAATCA	120
ATTACGGGGT	CATTAGTTCA	TAGCCCATAT	ATGGAGTTCC	CCCTTACATA	ACTTACGGTA	180
AATGCCCCGC	CTGGCTGACC	GCCCAACGAC	CCCCGCCCAT	TGACGTCAAT	AATGACGTAT	240
GTTCCCATAG	TAACGCCAAT	AGGGACCTTTC	CATTGACGTC	aatgggtgga	CTATTTACGG	300
TAAACTCCCC	ACTTGGCAGT	ACATCAAGTG	TATCATATGC	CAAGTACGCC	CCCTATTGAC	360
GTCAATGACG	GTAAATGGCC	CCCCTGGCAT	TATGCCCAGT	ACATGACCTT	ATGGGACTTT	420

178 626

CCTACTTGGC	AGTACATCTA	CGTATTAGTC	ATCGCTATTA	CCATGGTGAT	GCGGTTTTGG	480
CAGTACATCA	ATGGCCGTGG	ATAGCGCTTT	GACTCACGGG	gatttccaag	TCTCCACCCC	540
ATTGACGTCA	ATGGCACTTT	gttttggcac	CAAAATCAAC	GGGACTTTCC	aaaatgtcgt	600
AACAACTCCG	CCCCATTGAC	GCAAATGGGC	GGTAGGCGTG	TACGGTGGGA	GCTCTATATA	660
AGCAGAGCTC	GTTTAGTGAA	CCGTCAGATC	GCCTGGAGAC	GCCATCCACG	CTGTTTTCAC	720
CTCCATAGAA	GACACCGGGA	CCGATCCAGC	CTCCGCGGCC	GGGAACGGTG	CATTGGAACG	780
CGGATTCCCC	GTGCCAAGAG	TGACGTAAGT	ACCGCCTATA	GACTCTATAG	GCCCACCCCC	840
TTGGCTTCTT	ATGCATGCTA	TACTGTTTTT	GGCTTGGCGT	CTATACACCC	CCGCTTCCTC	900
ATGTTATAGG	TGATGCTATA	GCTTACCCTA	TAGGTGTGGG	TTATTGACCA	TTATTGACCA	960
CTCCCCTATT	GGTGACGATA	CTTTCCATTA	CTAATCCATA	ACATGGCTCT	TTGCCACAAC	1020
TCTCTTTATT	GGCTATATGC	CAATACACTG	TCCTTCAGAG	ACTGACACGG	ACTCTGTATT	1080
TTTACAGGAT	GGGCTCTCAT	TTATTATTTA	CAAATTCACA	TATACAACAC	CACCGTCCCC	1140
AGTGCCCGCA	GTTTTTATTA	AACATAACGT	GGGATCTCCA	CGCGAATCTC	GGCTACGTGT	1200
TCCGGACATG	GGCTCTTCTC	CGGTAGCGGC	GGACCTTCTA	CATCCGAGCC	CTGCTCCCAT	1260
CCCTCCAGCG	ACTCATGGTC	GCTCGGCAGC	TCCTTGCTCC	TAACAGTGGA	GGCCAGACTT	1320
AGGCACAGCA	CGATGCCCAC	CACCACCAGT	GTGCCGCACA	AGGCCGTGGC	GGTAGGGTAT	1380
GTGTCTGAAA	ATGAGCTCGG	GGAGCGGGCT	TGCACCGCTG	ACGCATTTGG	AAGACTTAAG	1440
GCAGCGGCAG	AAGAAGATGC	AGGCAGCTGA	GTTGTTGTGT	TCTGATAAGA	GTCAGAGGTA	1500
ACTCCCGTTG	CGGTGCTGTT	AACGGTGGAG	GGCAGTGTAG	TCTGAGCAGT	ACTCGTTGCT	1560
GCCGCGCGCG	CCACCAGACA	TAATAGCTGA	CAGACTAACA	GACTGTTCCT	TTCCATGGGT	1620
CTTTTCTGCA	GTCACCGTCC	TTAGATCTGC	TGTGCCTTCT	AGTTGCCAGC	catctgttgt	1680
TTGCCCCTCC	CCCGTGCCTT	CCTTGACCCT	GGAAGCTGCC	ACTCCCACTG	TCCTTTCCTA	1740
ATAAAATGAG	GAAATTGCAT	CGCATTGTCT	GACTAGGTGT	CATTCTATTC	TGGGGGGTGG	1800
GGTGGGGCAG	CACAGCAAGG	GGGAGGATTG	GGAAGACAAT	AGCAGGCATG	CTGGGGATGC	1860
GGTGGGCTCT	ATGGGTACCC	AGGTGCTGAA	GAATTGACCC	GCTTCCTCCT	GGGCCAGAAA	1920
GAAGCAGGCA	CATCCCCTTC	TCTGTGACAC	accctgtcca	CGCCCCTGGT	TCTTAGTTCC	1980
AGCCCCACTC	ATAGGACACT	CATAGCTCAG	GAGGCCCTCCG	CCTTCAATCC	CACCCGCTAA	2040
AGTACTTGGA	GCGGTCTCTC	CCTCCCTCAT	CAGCCCACCA	AACCAAACCT	AGCCTCCAAG	2100
AGTGGGAAGA	AATTAAAGCA	AGATAGGCTA	TTAAGTGCAG	AGGGAGAGAA	AATGCCTCCA	2160

ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC

2196

178 626 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SUK W. Nr 12 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 71 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 12: GTCACCGTCCrfAGATCAATTCCAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACAT CAAAATCATG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 117 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 13: ACCGTCCTT.AGATCAGCTTGGCAAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGArGTCAATCCGACC TTACTTTTCTTAA/^A^C^T^(^CJ^y^C^J^/^<^iAAA^j^C^(^TA^rAAGCACAAJ^m^J^J^J^TTATAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1^4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 136 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 14: GTCACCGTCCTTAGATCAATTCCAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATCCAAA CACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGAC CAAGAACTAGGTGAT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 15 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 152 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI; IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 15: TCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCAGCTTGGAGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCA AAATGAAGGCAAACCTACTGGTCCTGTTAAGTGCACTTGCAGCTGCAGATGCAGACACAA TATGTATAGGCTACCATGCGAACAATTCAACC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 16 (i) CJHAIRATTRYSTTYA SEKKWNCJJi (A) DŁUGOŚĆ: 162 pary zasad

178 626 (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 16: TTTTCTGCAGTCACCGTCCTTAGATCCCGAATTCCAGCAAAAGCAGGTCAATTATATTCAAT ATGGAAAGAATAAAGAACTAAGAAATCTAATGTCGCAGTCTGCCACCCCGGAGATACTCA CAAAAACCACCGTGGACCATATGGCCATAATCAAGAAGT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 122 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 17: GTCACCGTCCTTAGATCTACCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTACTCTCTAT CATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGAGTTGACGGAAGA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 18 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4864 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 18:

TCGCCCGTTT	CGGTGATGAC	CGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGA^l^A	60
CACCTTCTCT	GTAAGCGCAT	GCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	TCACCCCCTG	120
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTGG	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	G^AGATTGTA	CTGACACTGC	180
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	CCGTAAGGAG	AAAATACCGC	ATCAGATTGG	240
CTATTGGCCA	TTGCATACCT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	ΤΙ^ΟΟΓΟΑΤΌ	300
TCCAACATTA	CCGCCATGTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATACT	AATCAATTAC	360
GGGGTCATTA	CTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	OG^n^AAT^	420
CCCGCCTCGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CCTATCTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	CTGCACTATT	TACCGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACCTCAA	600
TGACGGTAAA	TGGCCCCCCT	GO^JATTATGC	CCAGTACATG	αοοττατθ^	actttcctac	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	CTGATCCCCT	TTTGCCAGTA	720
CATCAATCGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGCGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780

178 626

CGTCAATGGC AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA 840

CTCCCCCCCA TTGACGCAAA TGCCCGGTAG GCGTGTACGG TCGGAGCTCT ATATAAGCAG 900

AGCTCGTTTA CTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA 960

TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA CGGTGCATTG GWACCCGGAT 1020

TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGG¹' 1040

TTCTT^AT^GCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT 1140

ATAGGTGATG GTATAGCTTA GCCTAT^AGGT CTGGGTrATT GACCATTATT GACCAC-TCCC 1200

CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC ACAACTCTCT 1260

TTATT^GGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA CACGGACTCT G^jATTTTTAC 1320

AGGi^-TO^ICGT CTCATTTATT ATTTACAAAT TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC 1380

CCGCACTrTTT TATTAAACAT AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTC^GGGTA CGTCTTCCGG 1440

ACATGCGCTC TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC 1500

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA CTGGAGGCCA GACTTAGGCA 1560

CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC CTGGCGGTAG GGTATGTCTC 1620

TGAAAATGAG CTCCGGGA.GC GGCCTTGCAC CGCTGACGCA TTTCGAAGAC TTAAGCCAGC 1680

CCCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTCTTCT^GA TAAGAGTCAG AGCTAACTCC 174 0

CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA OCAGTACTCG TTGCTGCCGC 1800

GCGCGCCACC AGACATAATA CCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGfG^tCTTTT 1860

CTGCAGTCAC CGTCCTTAGA TCT^GCT^GT^GC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT GTTCTTTGCC 1920

CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA 1980

ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA GGTGTCATTC TATTC^^K^C^GG GGTGGGGTGG 204 0

GGCAGCACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG 2100

GCTCTAT^GGG TACCCAGGTG CTGAAGAATT GACCCGGTTC CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC 2160

AGOCACATCC CCTTCTCTGT GACACACCCT GTCCACGCCC CTGGTTCTTA GTTCCAGCCC 2220

CACTCATAGG ACACTCATAG CTCACGAGCG CTCCGCCTTC AATCCCACCC GCTAAAGTAC 2280

TTGGAGCGGT CTCTCCCTCC CTCATeAGCC CACCAAACCA AACCTAGCCT CCAAGAGTGG 2340

GAAGAAATTA AAGCAAGATA GGC’TATT^AAC TGCAGAGGGA GAGAAAATGC CTCCAACATG 24 00

TGAGGAAGTA ATGAGAGAAA TCATAGAATT TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG 2460

CCCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA 2520

TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC 2580

AGGAACCGTA AAAAGGCCGC GTTCCTGCCG TTTTTCCATA GCCTCCGCCC CCCTGACGAG 264 0

CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGACC TGCCGAAACC CGACACGACT ATAAAGATAC 2700

CAGGC<GTrTC CCCCTGGAAG CGCTCTCCTC TTCCGACCCT GCCGCTTACC 27 60

178 626

GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	cccttcggga	agcgtggcgc	tttctcaatg	ctcacgctgt	2820
AGCTATCTCA	gttcggtgta	GGTCGTTCGC	tccaagctgg	gctgtgtgca	cgaacccccc	2880
GTTCAGCCCG	accgctgcgc	cttatcccgt	aactatcgtc	ttgagtccaa	cccggtaaga	2940
cacgacttat	cgccactggc	agcactcact	ggtaacagga	ttagcagagc	gaogtatgta	3000
ggcgctgcta	CAGAGTTCTT	gaagtggtgg	cctaactacg	gctacactag	aaggacagta	3060
tttggtatct	GCGtCTCTGCT	gaagccagtt	accttcggaa	aaagagttgg	tagctcttga	3120
tccggcaaac	aaaccaccgc	tggtagcggt	GGU tII IIg	tttgcaagca	gcagattacg	3180
cgcagaaaaa	aaggatctca	agaagatcct	TTGATCTTTT	ctacggggtc	tgacgctcag	3240
tggaacgaaa	.actcacgtta	AGGGATTTTG	gtcatgagat	tatcaaaaac	gatcttcacc	3300
tagatccttt	taaattaaaa	ATGAACITTT	aaatcaatct	aaagtatata	tgagtaaact	3360
tggtctgaca--	gttaccaatg	cttaatcagt	gaggaccta	tctcagcgat	CTCTCTATTT	3420
cgttcatcca	tagttgcctg	actccggggg	GGGGGCGGCGC	tgaggtctgc	ctcgtgaaga	3480
agctcttgct	gactcatacc	aggcctgaat	cgccccatca	tccagccaga	aagtgaggga	3540
gccacggttg	atgagagctt	tgttgtaggt	GGACCACTTG	gtgattttga	acttttgctt	3600
tgccacggaa	CGGTCTGCGT	tgtcgggaag	atgcgtgatc	tgatccttca	actcagcaaa	3660
acttcgattt	attcaacaaa	GCCGCCGTCC	cgtcaagtca	gcgtaatgct	ctgccagtgt	3720
tacaaccaat	taaccaattc	tgattagaaa	aactcatcga	gcatcaaatg	aaactgcaat	3780
ttattcatat	caggattatc	aataccatat	ttttgaaaaa	GCCGTTTCTG	taatgaagga	3840
gaaaactcac	cgaggcactt	ccataggatg	gcaaig^ttcct	ggtatcggtg	TGCGATTCCG	3900
actcgtccaa	catcaataca	acctattaat	TTCCCCTCGT	caaaaataag	gttatcaagt	3960
GAGAAATCAc	catgagtgac	gactgaatcc	gctgagaatg	gcaaaagctt	ATGCATTTCT	4020
ttccagactt	gttcaacagg	ccagccatta	cgctcgtcat	caaaatcact	cgcatcaacc	4080
aaacccttat	TCATTCGTGA	ttgcgcctga	gcgagacgaa	atacgcgatc	«ctgttaaaa	4140
ggacaattac	aaacaggaat	cgaatgcaac	cggcgcagga	acactgccag	cgcatcaaca	4200
atattttcac	ctgaatcagg	atattcttct	aatacctgga	atgctctttt	CCCGGGGATC	4260
gcagtggtga	gtaaccatgc	atcatcagga	gtacggataa	aatgcttgat	ggtcggaaga	4320
ggcataaatt	ccgtcagcca	gtttagtctg	accatctcat	ctgtaacatc	attggcaacg	4380
ctacctttgc	catgtttcag	aaacaactct	GGCGCATCGG	gcttcccata	caatcgatag	4440
attgtcgcac	ctgattgccc	gacattatcg	cgagcccatt	tatacccata	taaatcagca	4500
tccatgttgg	aatttaatcg	cggcctcgag	caagaccttt	cccgttgaat	atggctcata	4560
acaccccttg	tattactgtt	tatgtaagca	GACACTTTTA	ttgttcatga	tgatatattt	4620

178 626

TTATCTTCTC	CAATCTAACA	TCAGAGATTT	TGAGACACAA	CGTGGCTTTC	CCCCCCCCCC	4680
CATTATTGAA	GCATTTATCA	CGCTTATTGT	CTCATGAGCG	(GATACATATT	TGAATGTATT	4740
TAGAAAAATA	AACAAATAGG	GGTTCCGCGC	ACATTTCCCC	GAAAAGTGCC	ACCTGACGTC	4800
TAAGAAACCA	TTATTATCAT	GACATTAACC	TATAAAAATA	GGCGTATCAC	GAGGCCCTTT	4860
CGTC						4864

(2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATOIRA SEKW. Nr 11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 19: AGCAGAAAGCAGAGCA (2) INFORMACJA DO SEKW. Nr 20 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 119 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 20: TCACCGT^CCITAG^ATCAAGCAGG^G^ITAATAATC.ACTC.ACTGAGTGACATCAAAATCATGGC GTCCCAAGGCACC AAACGGTCnATGAACAGATGGAACTGATGGGGAACGCCAGATT (2) INFORMACCA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 21 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 67 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 21: GAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGCAGATA'nTTn'CCTrAATTG TCGTAC (2) INFORMACJA DO IIDENTYF.IKATORA SEKW. Nr 22 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (Dj TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 22:

AGCAGAAGCACGCAC

178 626 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 23 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 23: accagaaccacacca (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 24 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 24: CCTTAC/ArCGGAAATAAAAACAACAACCAAAATGAA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 25 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 25: GCAGATCCTTATATrrCTGAAATTCTGGTCTCAGAT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 26 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 102 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 26: ACCGTCCTTAGATCCAGAAGCAGAGCATTTTCTAATATCCACAAAATGAAGGCAATAArrGT ACTACTCATGGTAGTAACATCCAACGCAGATCGAATCTGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 27 (i) CEHARACTERYSTYIKA SEKWENCJE (A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie

178 626 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 27: GGCACAGCAGATCTTTCAATAACGTTTCTTTGTAATGGTAAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 28 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 28: CTAACAGACTGTTCCTTTCCATG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 29 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW Nr 29: GGAGTGGCACCTTCCAGG3 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 30 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 30: AGCAAAAGCAGG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW Nr 31 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Pojedyncza (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 31: AGCAGAAGCGGAGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 32 (i) CHAIRAKTERYSTYIKA SEKWENCJE (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad

178 626 (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 32: CCACATCTCCACCCCTAAAAAGGCCCCCTTCCTCC3 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 33 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 33: CCTACAACCATGAAGACTATCATΓGCTTTCACC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3-4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 34: CCACATACATCTTCAAATCCAAATCTTCCACCTAATC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 35 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 35: CCTACAACCATCAAACCAAAACTACTACTCCTCTTATC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 36 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 36: CCACATTCACATCCATATTCTACACTCCAAAC

178 626 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 37 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGlA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA; nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 37: GGTACAACCATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW Nr 38 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGlA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW Nr 38: CCACATTTATAGACAGATGGAGCAAGAAACATTGTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 39 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGlA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 39: GGTACAAGATCTACCATGCTTCTAACCGAGGTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 40 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGlA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 40: CCACATAGATCTTCACTTGAACCGTTGCATCTGCAC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 41 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGlA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie

178 626 (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 41: GGTACAGGATCCACCAIGICCAACATGGATATIGACGGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Ni* 42 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 42: CCACATGGATCCTTAAIAATCGAGGTCAICATAATCCTC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 43 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 43: GGTACAGGATCCACCATGTCGCTGTTTGGAGACACAATTGCC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 44 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (d) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 44: CCACATGGATCC'ΠATAGGTATTΓCΓΓCACAAGAGC'IG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 45 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3553 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Podwójna (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI; IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 45:

GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG TATCCATATC ATAATATGTA CATTTATATT

GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA.

120

178 626

TCAATTACGG	GGTCATTAGT	TCATAGCCCA	TATATGGAGT	TCCGCGTTAC	ATAACTTACG	180
GTAAATGGCC	CGCCTGGCTG	ACCGCCCAAC	GACCCCCGCC	CATTGACGTC	AATAATGACG	240
TATCTTCCCA	TAGTAACGCC	AATAGGGACT	TTCCATTGAC	GTCAATGGGT	GGACTATTTA	300
CGGTAAACTG	CCCACTTGGC	AGTACATCAA	GTGTATCATA	TGCCAAGTAC	GCCCCCTATT	360
GACGTCAATG	ACGGTAAATG	GCCCGCCTGG	CATTATGCCC	AGTACATGAC	CTTATGGGAC	420
TTTCCTACTT	GGCAGTACAT	CTACGTATTA	GTCATCGCTA	TTACCATGGT	GATGCGCTTT	480
TGGCAGTACA	TCAATGGGCG	TGGATAGCGG	TTTGACTCAC	GGGGATTTCC	AAGTCTCCAC	540
CCCATTGACG	TCAATGGGAG	TTTGTTTTGG	CACCAAAATC	AACGGGACTT	TCCAAAATGT-	600
CGTAACAACT	CCGCCCCATT	GACGCAAATG	GGCGGTAGGC	CTGTACGGTG	GGACGGTCTAT	660
ATAAGCAGAG	CTCGTTTAGT	GAACCGTCAG	ATCGCCTGGA	GACGCCATCC	ACGCTGTTTT	720
GACCTCCATA	GAAGACACCG	GGACCGATCC	AGCCTCCGCG	GCCGGGAACG	GTGCATTGGA	780
ACGCGGATTC	CCCGTGCCAA	GAGTGACGTA	AGTACCGCCT	ATAGAGTCTA	TAGGCCCACC	840
CCCTTGGCTT	CTTATGCATG	CTATACTCTT	TTTGGCTTGG	GCTCTATACA	CCCCCGCTTC	900
CTCATGTTAT	AGGTGATGGT	ATAGCTTAGC	CTATAGGTGT	GGGTTATTGA	CCATTATTGA	960
CCACTCCCCT	ATTGGTGACG	ATACTTTCCA	TTACTAATCC	ATAACATGGC	TCTTTGCCAC	1020
AACTCTCTTT	ATTGGCTATA	TGCCAATACA	CTGTCCTTCA	GAGACTGACA	CGGACTCTGT	1080
atttttacag	GATGGGCTCT	CATTTATTAT	TTACAAATTC	ACATATACAA	CACCACCGTC	1140
CCCAGTGCCC	GCAGTTTTTA	TTAAACATGC	TAACGTGGGA	TCTCCACGCG	AATCTCGGGT	1200
ACCTGTTCCG	GACATGGGCT	CTTCTCCGGT	AGCGGCGGAG	CTTCTACATC	CGAGrCCTGC	1260
TCCCATCCCT	CCAGCGACTC	ATGGTCGCTC	GGOAGCTCCT	TGCTCCTAAC	AGTGGAGGCC	1320
AGACTTAGGC	ACAGCACGAT	GCCCACCACC	ACCAGTGTGC	CGCACAAGGC	CGTGGCGGTA	1380
GGGTATGTGT	CTGAAAATGA	GCTCGGGGAG	CGGOCTTGCA	CCGCTGACGC	ATTTGGAAGA	1440
CTTAAGGCAG	CGGCAGAAGA	AGATGCAGGC	AGCTGAGTTG	TTGTGTTCTG	ATAAGAGTCA	1500
GAGGTAACTC	CCGTTGCGGT	GCTGTTAACG	GTGGAGGGCA	GTGTAGTCTG	AGCAGTACTC	1560
GTTGCTGCCG	CGCGCGCCAC	CAGACATAAT	AGCTGACAGA	CTAACAGACT	GTTCCTTTCC	1620
ATGCCTCTTT	TCTGCAGTCA	CCGTCCTTAG	ATCTGCTGTG	CCTTCTAGTT	GCCAGCCATC	1680
TGTTGTTTGC	CCCTCCCCCG	TGCCTTCCTT	GACCCTGGAA	GGTGCCACTC	CCACTGTCCT	1740
TTCCTAATAA	AATGAGGAAA	TTGCATCGCA	TTGTCTGACT	AGGTCTCATT	CTATTCTGGG	1800
GGGTGGGGTG	GGGCAGCACA	GCAAGGGGGA	GGATTGGGAA	GACAATAGCA	GGCATGCTGG	1860
GGATGCGGTG	GGCTCTATGG	GTACGGCCGC	AGCGGCCGTA	CCCAGGTGCT	GAAGAATTGA	1920
CCCGGTTCCT	CGACCCGTAA	AAAGGCCGCG	TTGCTGGCGT	TTTTCCATAG	GCTCCGCCCC	1980

178 626

CCTCACGAGC	ATCACAAAAA	TCGACGCTGA	ACTCAGAGCT	G^iCGA^J^CCC	GACAGGACTA	2040
TAAAGATACC	AGGCCTTTTCC	CCCTCGAACC	TCCCTCGTCC	GcτcrccrGT	rCCCACCCTG	2100
CCCCTTACCG	GATACCTGTC	CGCcmCTC	CCTT’CCCGAA	GCCTGGCGCT	TTCTCAAT'GC	2160
rcACGcrcτA	GCTATCrCAG	TTCGCTGTAG	CTCOTCGCT	ccAACcrc;cc	CTGTGTGCAC	2220
GAACCCCCCG	rr·cACcccGA	CCCCTGCGCC	TTATCCGGTA	ACTATccrcr	rGACrCCAAC	2260
CCGGTAAGAC	ACGACTTATC	GCCACTGGCA	CCAGCCACrG	GrAACACGA'T	TAGCAGAGCG	2340
AGGTArGrAG	GCGCTGCTAC	AGAGTTCTTG	AACTGCTGGC	OWACTA-CGG	CTACACTAGC	2400
TGAAGGACAG	rArττΌσrAr	CTGCGCTCTG	CTOA^GCCAG		AAAAAGACTT	2460
GσrAG<crc·rr	GATCCGGCAA	ACAAACCACC	GCTGGTACCG	GrG<crττττr	rGrτrΌCAAc	2520
CAGCAGATTA	CGCGCAGAAA	AAAAGCATCT	CAAGAAGATC	cτΓTcArcτr	•nCTACGTGA	2580
TCCCGTAATG	CTCTGCCAGT	GTTACAACCA	ATTAACCAAT		AAAACTCATC	2640
GAGCATCAAA	rGAAACrGCA	AτrτΆTτcAr	ATCAGGATTA	KAATACCAT	ATmTGAAA	2700
AAGCCGTTTC	rCTAATΌAAG	GAGAAAACTC	ACCGAGGCAG	'rTCCATACGA	rGGCAAGATC	2760
CT'GGrAr·CGG	T'C:TCCGATTC	CGACTCGTCC	AACATCAATA	CAACCTATrA	ATnCCCCTC	2820
GTCAAAAATA	AGGTTATCAA	GTGAGAAATC	ACCATGAGTG	ACGACIGAAT	CCGGTGAGAA	2880
TGGCAAAAGC	rτA^,τGCAτrτ	CTTTCCAGAC	TTGTTCAACA	GGCCAGCCAT	TACGcrccrc	2940
ATCAAAATCA	CTCGCATCAA	ccAAAccσrr	ATTCATTCGT	GATTGCGCCT	GAGCGAGACG	3000
AAATACGCGA	rCGCTGrTAA	AAGGACAATT	ACAAACAGGA	ATCCAArGCA	ACCGGCGCAG	3060
GAACACrCCC	AGCGCArCAA	CAATATTTTC	ACCTGAATCA	GGATAnCTT	CrAATACCrG	3120
GAA^ΓrGcrG'τr	ITCZrcGGGGA	rcGCAGrGGr	GACTAACCAT	GCATCATCAG	CA<GrACGGAT	3180
AAAA‘TGCTT'G	ATCCTCGGAA	GAGGCATAAA	1TCCGTCAGC	CAGTTTAGTC	rGACCA'τcrc	3240
ATCTGTAACA	rcA.rr'GGCAA	cccτAccτττ	GCCATGTn^,C	AGAAACAACT	CTCGCGCATC	3300
GCOCTTCCCA	TAC^AATCGAT	AGATTGTCGC	ACCTGA'TTGC	CCGACATTAT	CGCGAGCCCA	3360
TTTATACCCA	TATAAATCAG	CATCCATGTT	GGAATτrAAr	CGCCGCCTCG	AGCAAGACGT	3420
ttcccgttga	ArAIGGCTCA	TAACACCCCT	TGTArτAcr’c	TTTATCTAAG	CAGACACTTT	3480
rA’ΓTGτr'CAT	GATGATATAT	TTTTATCT'T^G	TGCAArGrAA	CArCACACAr	nTGAGACAC	3540

AACGrGGCrT TCC

3553

178 626 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 46 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 72 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 46: TCACCGTCCTTAGATCGGTACAACCATGAAGACTATCATTGCTITGAGCTACATTTTATGTCT GGTTTTCGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 47 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 111 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 47: TCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGCCAAAAAGGCAA CATTAGGTGCAACA TTTGCATTTGAAGATCTATGTGGGATCTGCTGTGC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 48 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 63 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTECZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 48: TTAGATCGGAACATGAAAGCAAAAlCTACTAGTCCTGTTATGTGCATTTACAGCTACATATGCA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 49 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 102 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 49: CTGGTGCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTGTGGATGTGTTCTAATGGGTCTTTGCA GTGTGAA.TATGCATCTGAATGTGGGATCTGCTGTGCCTT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 50 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJE (A) DŁUGOŚĆ: 108 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie

178 626 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 50: _CCTTAGATCGGTACAACCATGAAGGCAATAA.TTGTACTACTCATGGTAGT_AACATCCAACGCAGATCGAA.TCTGCACTGGGATAACATCTTCAAACTCACCTCATGTG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 51 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 102 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 51: TTGGCTGTAA.CATTGATGATA.GCTATTTTTA.TrGTTTA.TATGGTCTCC.AG.AGACAATGTTTCTT GCTCCATCTGTCTATAAATGTGGGATCTGCTGTGCCTT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Ni- 52 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 84 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 52: GTCCTTAGArCCACC.ATl^i^^iCGTCCCAAGGCACCAAACGG^TC^lTATGAACAGATGGAAACTG ATGGGGAACGCCAGAATGCAACT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 53 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 108 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 53: GAAAAGGCAACGAACCCGATCGTGCCCTC'nTTGACATGA.GTAATGAAGGATCTTATTTCT TCGGAGACAATGCAGAAGAGTACGACAATTAAGGATCTGCTGTGCCT (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 54 (i) OHARA^TT^^^S^^YKA SEKWNCJIi (A) DŁUGOŚĆ: 132 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 54:

178 626

CTTAGATCCAGATCTACCATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT_CTCTAT_CGT

TCCATCAGGCCCCCTCAAAGCCGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCTGGGAA

AAACACAGAT (2) INF01RMACCA DO IDENTAYTKATOIRA SEKW. Nr 55 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 129 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 55: GGGACTCArCCTAGCTCCAGTACTGGTCTAAAAGATGATCTTCrTGAAAATTTGCAGACCrA rCAGAAACGAATGGGGGrGCAGATGCAACGGTTCAAGrGAAGATCTArGTGGGATCrGCr GTGCCTT (2) INFOIRMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 56 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 81 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 56: CrTAGATCCACCArGTCCAACArGGArA'TrGACGGTATCCAACACTGGGACAATTGACAAAA CACCGGAAGAAATAACTTCT (2) INFOIRMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 55 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 96 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 57: GTTGAAATTCCAATrAAGCAGACCATCCCCAA'rTΓC'TTCTTTGGGAGGGACACAGCAGAGG ATTΛTGΛTGACCrCGArTA'TTAAGGATCTGCTGrG (2) INFOIRMACCA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 58 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 96 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 58: CrrAGATCCACCATGTCGCrGrTTGGAGACACAArTGCCTACCTGCT'TTCA'TrGACAGAAGA TGGAGAAGGCAAAGCAGAACTAGCAGAAAAATTA (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKACJI SEKW. Nr 59

178 626 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 123 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 59: AGATCICΊTGGGGCAAGICAAGAGAATGGGGAAGGAAΊTGCAAAGGAIGIGAIGG_AAGIG CTAAAGCAGAGCTCIAIGGGAAAITCAGCICITGIGAAGAAATACCTATAAGGATCTG_CIG_I'G (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nit 60 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 60: GGIACAAAIATIGGCIATTGGCCATIGCAIACG (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 61 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 61: CCACAICICGAGGAACCGGGICAATIC'ΠCAGCACC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 62 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 62: GGTACAGAIATCGGAAAAGCCACGTTGTGTCICAAAAIC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 63 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie

178 626 (iv) ANTYSENS: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 63: CCACATGGATCCGTAATCCTCTGCCAGTGTTACAACC (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 64 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 39 par zasad (b) TYP: Kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: Obie (D) TOPOLOGIA: Obie (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: nie (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 64: GGTACATGATCACGTAGAAAAGAICAAAGGAICTICITG

178 626 <r>

>

ŚREDNI LOG MIANA W TEŚCIE ELISA

WEEKS

TYGODNIE

FIG.2

178 626 % LIZY SWOISTEJ * LIZY SWOISTEJ % SPECIFIC LYSIS % SPECIFIC LYSIS

FIG.3A FIG.3C

178 626

FIG.4

FIG.5 o

178 626

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG

GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG

101 TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG

151 CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA

201 CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG CTATTGGCCA

251 TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG

301 TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT

351 AATCAATTAC GGGCTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT

401 ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG

451 CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA

501 CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG

551 GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA

601 TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG

651 ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG

701 GTGATGCGGT TTTGGCAGTA CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC

751 ACGGGG ATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT

801 GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA

851 TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG

901 AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT

951 TTGACCTCCA TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA

1001 CGGTGCATTG GAACGCGGAT TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC

1051 CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC TTCTTATGCA TGCTATACTG

1101 TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT ATAGGTGATG

1151 GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC

1201 CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC

FIG. 6A

178 626

ACAACTCTCT TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTGA

CACGGACTCT GTATJJ MAC AGG ATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT

TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC CCGCAGTTTT TATTAAACAT

AACGTGGGAT CTCCACGCG A ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG ACATGGGCTC

TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA

GACTTAGGCA CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC

GTGGCGGTAG GGTATGTGTC TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC

CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC GGCAGAAGAA GATGCAGGCA

GCTGAGTTGTTGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC CGTTGCGGTG

CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC

GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA

TGGGTCTTTT CTGCAGTCAC CGTCCTTAG ATCTGCTGTG CCTTCTAGTT

GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA

GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA

TTGTCTGAGT AGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTG GGGCAGCACA

GCAAGGGGGA GGATTGGG AA GAC AAT A GCA GGCATGCTGG GGATGCGGTG

GGCTCTATGG GTACCCAGGT GCTGAAGAAT TGACCCGGTT CCTCCTGGGC

CAGAAAGAAG CAGGCACATC CCCTTCTCTG TGACACACCC TGTCCACGCC

CCTGCTTCTT AGTTCCAGCC CCACICATAG GACACTCATA GCTCAGGAGG

GCTCCGCCTT CAATCCCACC CGCTAAAGTA CTTGGAGCGG TCTCTCCCTC

CCTCATCAGC CCACCAAACC AAACCTAGCC TCCAAGAGTG GGAAGAAATT

AAAGCAAGAT AGGCTATTAA GTGCAGAGGG AGAGAAAATG CCTCCAACAT

GTG AGG AAGT AATG AG AG AA ATCATAG AAT TTCTTCCGCT TCCTCGCTCA

CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC

FJG.6B

178 626

2501 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa

2551 GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG

2601 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA

2651 AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA

2701 CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCG ACCC

2751 TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG

2801 CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG

2851 CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG

2901 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA

2951 TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT

3001 AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA

3051 G AAGG ACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TG AAGCCAGT TACCTTCGG A

3101 AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG

3151 TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAG ATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC

3201 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA

3251 AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC

3301 CTAGATCCTT ΤΓΑΑΑΤΓΑΑΑ AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT

3351 ATG AGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCITAATCAG TG AGGCACCT

3401 ATCTCAGCG A TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT G ACTCCCCGT

3451 CGTGTAG ATA ACTACGATAC GGGAGGGCIT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG

3501 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA

3551 AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC

3601 CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT

3651 CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG

3701 GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG

FIG. 6C

178 626

ATCAAGGCGA GTT AC ATG AT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT

CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA

CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT

AAGATGCTTT TCTGTG ACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAG AAT

AGTGTATGCG GCG ACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT

ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC

TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA

TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTG ATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC

AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG

AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT

ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT

G AATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG

AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT

ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTC

FI6.6D

178 626

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG

GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG

TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG

CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA

CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGATTGG CTATTGGCCA

TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACATTTATA TTGGCTCATG

TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGTTATTAATAGT

AATCAATTAC GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT

ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG

CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA

CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG

GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA

TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG

ACTTTCCTAC TTGGGAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG

GTGATGCGGTTTTGGCAGTA CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC

ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT

GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA

TTG ACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGG AGGTCT ATATAAGCAG

AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT

TTGACCTCCA TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA

CGGTGCATTG G AACGCGG AT TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC

CTATAGAGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC TTCTTATGCA TGCTATACTG

TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT ATAGGTGATG

GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC

FIG. 7A

178 626

CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTaCTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC

ACAACTCTCT TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTG A

CACGGACTCT GTATTTTTAC AGGATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT

TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC CCGCAGTTTT TATTAAACAT

AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG ACATGGGCTC

TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA

GACTTAGGCA CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC

GTGGCGGTAG GGTATGTGTC TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC

CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC GGCAGAAGAA GATGCAGGCA

GCTG AGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC CGTTGCGGTG

CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC

GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA

TGGGTCTTTT CTGCAGTCAC CGTCCTTAG ATCTGCTGTG CCTTCTAGTT

GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA

GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA

TTGTCTGAGT AGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTG GGGCAGCACA

GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA GGCATGCTGG GGATGCGGTG

GGCTCTATGG GTACCCAGGT GCTGAAG AAT TGACCCGGTT CCTCCTGGGC

CAGAAAGAAG CAGGCACATC CCCTTCTCTG TGACACACCC TGTCCACGCC

CCTGGTTCTT AGTTCCAGCC CCACTCATAG GACACTCATA GCTCAGGAGG

GCTCCGCCTT CAATCCCACC CGCTAAAGTA CTTGGAGCGG TCTCTCCCTC

CCTCATCAGC CCACCAAACC AAACCTAGCC TCCAAGAGTG GGAAGAAATT

AAAGCAAGAT AGGCTATTAA GTGCAGAGGG AGAGAAAATG CCTCCAACAT GTG AGGAAGT AATGAGAGAA ATCATAG AAT TTCTTCCGCT TCCTCGCTCą

FIG. 7B

178 626

2451 CTG ACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC

2501 TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA

2551 GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG

2601 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA

2651 AATCG ACGCT CAAGTCAG AG GTGGCG AAAC CCGACAGG AC TATAAAG ATA

2701 CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC

2751 TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG

2801 CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG

2851 CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG

2901 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA

2951 TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT

3001 AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TG AAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA

3051 GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TG AAG CC AGT TACCTTCGGA

3101 AAAAGAGTTG GTAGCTCITG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG

3151 TGGTTTTTTr GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC

3201 AAG AAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTG ACGCTCA GTGG AACG AA

3251 AACTC ACGTT AAGGG ATTTT GGTCATG AG A TTATC AAAAA GG ATCTTCAC

3301 CTAG ATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT

3351 ATG AGTAAAC TTGGTCTG AC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT

3401 ATCTCAGCG A TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCGGGG

3451 GGGGGGGGCG CTGAGGTCTG CCTCGTGAAG AAGGTGTTGC TGACTCATAC

3501 CAGGCCTGAA TCGCCCCATC ATCCAGCCAG AAAGTGAGGG AGCCACGGTT

3551 G ATG AG AGCT TTGTTGTAGG TGG ACCAGTT GGTGATTTTG AACTTTTGCT

3601 TTGCCACGGA ACGGTCTGCG TTGTCGGGAA GATGCGTGAT CTGATCCTTC 3651 AACTCAGCAA AAGTTCGATT TATTCAACAA AGCCGCCGTC CCGTCAAGTC

FIG. 7C

178 626

AGCGTAATGC TCTGCCAGTG TTACAACCAA TTAACCAATT CTG ATT AG AA

AAACTCATCG AGCATCAAAT GAAACTGCAATTTATTCATA TC AGG ATT AT

CAATACCATA TTTTTGAAAA AGCCGTTTCT GTAATGAAGG AGAAAACTCA

CCGAGOCAGT TCCATAGG AT GGCAAGATCC TGGTATCGGT CTGCGATTCC

G ACTCGTCCA ACATCAATAC AA CCT ATT AA TTTCCCCTCG TCAAAAATAA

GGTTATCAAG TGAGAAATCA CCATGAGTGA CGACTGAATC CGGTGAGAAT

GGCAAAAGCT TATGCATTTC TTTCCAGACT TGTTCAACAG GCCAGCCATT

ACGCTCGTCA TCAAAATCAC TCGCATCAAC CAAACCGTTA TTCATTCGTG

ATTGCGCCTG AGCGAGACGA AATACGCGAT CGCTGTTAAA AGGACAATTA

CAAACAGGAA TCGAATGCAA CCGGCGCAGG AACACTGCCA GCGCATCAAC

AATATTTTCA CCTGAATCAG GATATTCTTC TAATACCTGG AATGCTGTTT

TCCCGGGGAT CGCAGTGGTG AGTAACCATG CATCATCAGG AGTACGGATA

AAATGCTTGA TGGTCGGAAG AGGCATAAAT TCCGTCAGCC AGTTTAGTCT

GACCATCTCA TCTGTAACAT CATTGGCAAC GCTACCTTTG CCATGTTTCA

GAAACAACTC TGGCGCATCG GGCTTCCCAT ACAATCGATA GATTGTCGCA

CCTGATTGCC CGACATTATC GCGAGCCCAT TTATACCCAT ATAAATCAGC

ATCCATGTTG GAATTTAATC GCGGCCTCGA GCAAGACGTT TCCCGTTGAA

TATGGCTCAT AACACCCCTT GTATTACTGT TTATGTAAGC AGACAGTTTT

ATTGTTCATG ATGATATATT TTTATCTTGT GCAATGTAAC ATCAGAG ATT

TTGAGACACA ACGTGGCTTT CCCCCCCCCC CCATTATTGA AGCATTTATC

AGGGTTATTG TCTCATG AGC GGATACATAT TTG AATGTAT TTAG AAAAAT

AAACAAATAG GGGTTCCGCG CACATTTCCC CGAAAAGTGC CACCTGACGT

CTAAGAAACC ATTATTATCA TG ACATTAAC CTATAAAAAT AGGCGTATCA

CGAGGCCCTT TCGTC

FIG.7D

178 626

ATTGGCTATT GGCCATTGCA TACGTTGTAT CCATATCATA ATATGTACAT

TTATATTGGC TCATGTCCAA CATTACCGCC ATGTTGACAT TGATTATTGA

101 CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT

151 ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC

201 GCCCAACGAC CCCCGCCCATTGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG

251 TAACGCCAAT AGGGACTITC CATTGACGTC AATGGGTGG A GTATTTACGG

301 TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC

351 CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT

401 ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC

451 ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG

501 ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA

551 ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT

601 AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA

651 GGTCTATATA AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC

701 GCCATCCACG CTGTTTTGAC CTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC

751 CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG CGGATTCCCC GTGCCAAGAG

801 TGACGTAAGT ACCGCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC TTGGCTTCTT

851 ATGCATGCTA TACTGTTTTT GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC

901 ATGTTATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA

951 TTATTGACCA CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA

1001 ACATGGCTCT TTGCCACAAC TCTCTTTATT GGCTATATGC C AATACACTG

1051 TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT TTTACAGGAT GGGGTCTCAT

1101 ΤΤΑΤΓΑΤΤΤΑ CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC AGTGCCCGCA

1151 GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACGTGT

1201 TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GGAGCTTCTA CATCCG AGCC

FIG. 8A

178 626

1251 CTGCTCCCAT GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC

1301 TAACAGTGGA GGCCAGACTT AGGCACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT

1351 GTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG

1401 GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG GCAGCGGCAG

1451 AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA

1501 ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT

1551 ACTCGTTGCT GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA

1601 GACTGTTCCT TTCCATGGGT CITITCTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTG

1651 CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGTTG TTTGCCCCTC CCCCGTGCCT

1701 TCCTTGACCC TGGAAGGTGC CACTCCCACT GTCCTTTCCT AATAAAATGA

1751 GG AAATTGCA TCGCATTGTC TG AGTAGGTG TCATTCTATT CTGGGGGGTG

1801 GGGTGGGGCA GCACAGCAAG GGGGAGGATT GGGAAGACAA TAGCAGGCAT

1851 GCTGGGGATG CGGTGGGCTC TATGGGTACC CAGGTGCTGA AGAATTGACC

1901 CGGTTCCTCC TGGGCCAGAA AG AA GCA GGC ACATCCCCTT CTCTGTGACA

1951 CACCCTGTCC ACGCCCCTGG TTCTTAGTTC CAGCCCCACT CATAGGACAC

2001 TCATAGCTCA GGAGGGCTCC GCCTTCAATC CCACCCGCTA AAGTACTTGG

2051 AGCGGTCTCT CCCTCCCTCA TCAGCCCACC AAACCAAACC TAGCCTCCAA

2101 GAGTGGGAAG AAATTAAAGC AAGATAGGCT ATTAAGTGCA GAGGGAGAGA

2151 AAATGCCTCC AACATGTGAG GAAGTAATGA GAGAAATCAT AGAATTC

FIG.8B

178 626 ο ο u u *> -u c c ο ο 22 22

Ο CN Ο

S □

m

ΟΊ »

ο

Lu.

Ο

C>l

Noamia ogn ιν (Niw/ao^) χο^Λ

091·^:1 nruazoueTozoj Azjd

Noumia 09 tu iv (Niw/ao^) χο^

091si njUBZoaajozoj Azjd <s ω

w

N

Q >i

E4

178 626

MIANO PRZECIWCIAŁ HI Hl ANTIBODY TITER

FIG. 10

178 626 <

ca

100(H a

«ο φ

-P

1000.0 •ΧΣ3

SUJ

H

OQ_

N

Ł«

a.

Σ

O

10^

NP DNA NP + HA BLANK DNA DNA dla NP PUSTY DNA

FIG.11

HA DNA

DNA dla HA

178 626

ŚREDNI LOG ZARADNOŚCI POPŁUCZYN NOZDRZY + SEM ŚREDNI LOG ZAKAŹNOŚCI POPŁUCZYN NOZDRZY +SEM

LU

CZ) fc

COCKTAIL

MIESZANINA

V1JFIG.12A

SAUNĘ

3OL FI2

FIZJOLOGICZNA

SÓL FIZJOLOGICZNA .12B

178 626

Sali

FIG. 13

178 626

FIG.14A

ANT1GEN ^T¥P ANTYGENU ΤΥΡΕ

A/SINGAPORE 1957-1967

A/HONG KONG 1968

Singapur

FIG.14B

178 626

BIAŁKO WIRUSOWE V1RAL PROTEIN mRNA

CLASS l MHC

MHC Klasy I

INJECTEO DNA

WSTRZYKNIĘTY

CYTOTOXIC T CELL Limfocyt T cytotoksyczny

FIG.15

DNA

178 626 co <

X <0 rH

TJ z

Ω

0)

Φ iM (0 «Η

O α

«Η

Ό <

Ω <

X (0

TJ <

z o

<

zg ag z c o — id

o a:

£

co «5 ca t-l

M

Q £

α

CO o

CD M ·*) CM ·»— O

W3S + M3JJLL AUAIDUNI (00301

H3S + I0§0NZraVZ VNVIW (01)003

178 626

FIG17

178 626

Średnia geometryczna miana HI + SEM

Geometrie Mean HS Tiier ± SEM

f Week

Dose 1 Dose 2

Dawka 1 Dawka 2 Tydzień

FIG. I8

178 626

τ-,-,-1-,-,-_Γ

Ο 20 40 60 80 % Specific Lysis % Lizy swoistej

100

FIG. 19

178 626

Dni po ekspozycji

FIG. 21

178 626

ŚREDNI % WAG. POCZĄTKOWEJ + SEM

Mean % of Starting Weight ± SEM

Day Afier Infeciion DNI PO ZAKAŻENIU

FIG. 22

178 626

ŚREDNI LOG MIANA WIRUSA W PŁUCACH + SEM

MEAN LOG VIRAL LUNG TITER ± SEM

Bi

NP DNA CONTROL

DNA dla NP DATA

KONTROLNY DNA

NO

INJECTłON

BEZ WSTRZYKNIĘCIA

FIG.23

178 626

100 _Ί +ι +ι

DOSE (pg) dawka (p_g)

FIG.24

178 626

		N Ό >» •P\C	χβ
	*c	Φ	φ
	o	Od -H	Η
*c	•H	Od N	Ν
Φ	N	Ό	Ό
*4	Ό	O >.	>»
N	>>	β -P	-Ρ
Ό	«Ρ	0
>>		N Od	ΙΛ
4->	in $ CM >	U t· \o	od
\o	α £! z ™	«Ρ CL	CL
	> Z	Z
CL	0		φ
Z i	f s-~f	i ιη	<0»-1 °£
	tn 0	Cd	Cd
to	oj-P	ν-	£ c
_ ⁰³	α.	CL	0 0
CL	9-CC	2	O*
2	Z-'	2

«J

<u

U) c

OJ -H — Τζ>

•C u °

CU tn

Gta

LO

OJ o

Ll &ηδΐθΜ drsojo 5BIJ5U5 jo % idnjS T§en Partojfątezooj

178 626

<u

W)

C ra .c

U u

ej ra o.

U N Q

CD

C\J

O

L±Z

MS T J01LL I^BJ!A βθΊ ueeyy

H3S + EsnjTn euejm 3oq pupajg

178 626

Φ c

Ν

Ł>

4J

OH

C

Φ

O

3!

ο u

4J

eo to

- '«ί- CM ο

cn c

o .c

O ł_

Q) sr

T3

O >.

N

O

CU

3!

Φ

O

O.

>\ 'C ra 2

Q £

ΓC\1 o

Lu ras i J9I!± I^BJ!A “ΒΘΙΛΙ

N3S + esnjyn otre-rm afupaaę

178 626 % Przeżywalności % Survival

Day After Challenge

Dzień po ekspozycji

FIG. 28

178 626

Średni procent wagi początkowej

Mean percent of initial weighl

FIG. 29

Day affer infeciion

Dni po zakażeniu

178 626

- HA DNA (100, 10, 1 pg)

DNA dla HA

-<e s 8 >. z, c <-<

2 ί ° p

Φ

P ar c

>1 TJ M

O g(| o S -;= aJ ‘z c c «

- un r O o

CM un • ^O w po c

£. O ra ή ; x: ? LU O >>

N

O

JL_ °* a> S o-· φ ctf O a.

'^c >* 0) <0

N u a geAf/uns %

I0§0tnVAA?3ZHd %

178 626 o

c

Ν

U

-Ρ

Φ*

C φ

C0

CD

CM α>

ο>

C

J0)

ΧΖ

Ο φ

<

>

co

Ω

Ό

Ο >»

Μ

Ο a

α λ

φ ο

a φ

Ή

Ν

Ω

ΡΟ ο

Ll_

W3S + J£4LL ?bjią ueai/U

Has + esnapa ouerm spupajS

178 626 <

z

Q >»

C rd o

Ul +>

c <

X <0

Φ cn c

ro x

O

Ł_

Φ ¢:

<

CO

Ω

T3

O >»

N

O

CL.

CO

Φ

O

Λ 'C

Φ

N α

FIG. 32 ras T J®1!± l^BJ!A Boi ueeyy was + vsnaiA ynvih dot iNaaa§

178 626 □

ο.

α>

Ν co η

Ο *£ rC X Ch Ο

Τ3 C0 *Η Ο »-« ·Η C Ό «

ra ra

CM

β)

Ο)

C

0)

Το

JC

Τ3 ο

►>

Ν

Ο α

<α φ

ο

ο.

'C φ

>, Ν

C0 ο Ω

FIG. 33

TOS + J01!l IBJIA δοϊ oesgAj jjgg + esnjpn euBpm 3oq pupaj§

178 626

Control DNA DNA kontrolny

	\O
	Θ
	JS O
	O ^4
c	•«r
0	T3 5
	0
O	C >»
c	T-ł c
o	S 0^
Ό	O 5 >
O	a o\o
c	>>TJ Λ
Φ	N O 0
o	n
«Η	CL 0
I—ł	•
Λ	cloój:
CL	Φ oo o
Φ	N\ 0
N	0
0	N C «-
N	0 -Η 1
0	Tj
	H
«»“·»	r- φ j
cn
co
ra	Ή — t
c	Λ S
	S ¹
'ω	a i i
CO	x cn i
Ό a> ω c	___ co ·. cn ra ! .·=: C 1 ‘co :=* I
φ o	5 £ < (0 ®
L	X ~¹

+

o.

z

-d

X z

a a

+ o

n. s 2 A + o < ^vx S

to qy

- OJ

I-,-1---!---1---,---1---J- O to W 'tf CO CM -5- O p 00

0)

O)

C ω

«0 £

O u

ω

Sż <

Ό

O >»

N

O

o.

co φ

o

o.

'C €0 n α °

PO o

Ll.

W3S WLl 1^ ji a 6oi

H3S ♦ esnayn euejm 3oq rupaaj

178 626 α

ο

X	Ό
o	O X
-er	X O
T3	co
cfl	•
c	σ\ ł.
•H	C0\O
s	\ B
o	bfl O/—*
α	C >
>»	*4 O
N	το > X
U	«Κ co
O.	Φ !» «

<

χ <0

Ο

CM

Ο

Day After Challenge

Dzień po ekspozycji iAi3S + Ϊθ-ΠΛ βθΊ ^uaaIA3 wag + esna^Fi euBtui 3οτ rupajs

178 626

GATATTGG CTATTGGCCA

251 TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATGTACATTTATA TTGGCTCATG

301 TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT

351 AATCAATTAC GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT

401 ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG

451 CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA

501 CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG

551 GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA

601 TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG

651 ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG

701 GTGATGCGGT TTTGGCAGTA CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC

751 ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT

801 GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA

851 TTGACGCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG

901 AGCTCGTTTA GTGAACCGTC AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT

951 TTGACCTCCA TAGAAGACAC CGGGACCGAT CCAGCCTCCG CGGCCGGGAA

1001 CGGTGCATTG GAACGCGGAT TCCCCGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC

1051 CTATAG AGTC TATAGGCCCA CCCCCTTGGC TTCTTATGCA TGCTATACTG

1101 TTITIGGCTT GGGGTCTATA CACCCCCGCT TCCTCATGTT ATAGGTGATG

1151 GTATAGCTTA GCCTATAGGT GTGGGTTATT GACCATTATT GACCACTCCC

1201 CTATTGGTGA CGATACTTTC CATTACTAAT CCATAACATG GCTCTTTGCC

1251 ACAACTCTCT TTATTGGCTA TATGCCAATA CACTGTCCTT CAGAGACTG A

1301 CACGGACTCT GTATTTTTAC AGG ATGGGGT CTCATTTATT ATTTACAAAT

1351 TCACATATAC AACACCACCG TCCCCAGTGC CCGCAGTTTT TATTAAAC AT

FIG.36A

178 626

AACGTGGGAT CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG ACATGGGCTC

TTCTCCGGTA GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC

CAGCGACTCA TGGTCGCTCG GCAGCTCCTT GCTCCTAACA GTGGAGGCCA

GACTTAGGCA CAGCACGATG CCCACCACCA CCAGTGTGCC GCACAAGGCC

GTGGCGGTAG GGTATGTGTC TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC

CGCTGACGCA TTTGG AAG AC TTAAGGCAGC GGCAGAAGAA GATGCAGGCA

GCTGAGTTGTTGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC CGTTGCGGTG

CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC

GCGCGCCACC AGACATAATA GCTGACAGAC TAACAGACTG TTCCTTTCCA

TGGGTCTTTT CTGCAGTCAC CGTCCTTAG ATCTGCTGTG CCTTCTAGTT

GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA

GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA

TTGTCTGAGT AGGTGTC ATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTG GGGCAGCACA

GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA GGCATGCTGG GGATGCGGTG

GGCTCTATGG GTAC GGCCGCAGCGGCC GTACCCAGGT GCTGAAGAAT

TGACCCGGTT CCTCGACCCGT AAAAAGGCCG

CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA

AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCG AAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA

CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCG ACCC

TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG

CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG

CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG

CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA

TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT

AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA

FIG. 36 B

178 626

GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TG AAGCCAGT TACCTTCGGA

AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG

TGGTTTTTTTGTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC

AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGTGATCC CGTAATGC TCTGCCAGTG

TTACAACCAA TTAACCAATT CTG ATT AG AA

AAACTCATCG AGCATCAAAT GAAACTGCAA TTTATTCATA TCAGGATTAT

CAATACCATA TTTTTGAAAA AGCCGTTTCT GTAATGAAGG AGAAAACTCA

CCG AGGCAGT TCCATAGG AT GGCAAG ATCC TGGTATCGGT CTGCG ATTCC

GACTCGTCCA ACATCAATAC AACCTATTAA TTTCCCCTCG TCAAAAATAA

GGTTATCAAG TGAGAAATCA CCATGAGTGA CGACTGAATC CGGTGAGAAT

GGCAAAAGCT TATGCATTTC TTTCCAGACT TGTTCAACAG GCCAGCCATT

ACGCTCGTCA TCAAAATCAC TCGCATCAAC CAAACCGTTA TTCATTCGTG

ATTGCGCCTG AGCGAGACGA AATACGCGAT CGCTGTTAAA AGGACAATTA

CAAACAGGAA TCGAATGCAA CCGGCGCAGG AACACTGCCA GCGCATCAAC

AATATTTTCA CCTG AATCAG GATATTCTTC TAATACCTGG AATGCTGTTT

TCCCGGGGAT CGCAGTGGTG AGTAACCATG CATCATCAGG AGTACGGATA

AAATGCTTGA TGGTCGGAAG AGGCATAAATTCCGTCAGCC AGTTTAGTCT

GACCATCTCA TCTGTAACAT CATTGGCAAC GCTACCTTTG CCATGTTTCA

GAAACAACTC TGGCGCATCG GGCTTCCCAT ACAATCG ATA GATTGTCGCA

CCTGATTGCC CGACATTATC GCGAGCCCAT TTATACCCAT ATAAATCAGC

ATCCATGTTG GAATTTAATC GCGGCCTCGA GCAAGACGTT TCCCGTTGAA

TATGGCTCAT AACACCCCTT GTATTACTGT TTATGTAAGC AGACAGTTTT

ATTGTTCATG ATGATATATT TTTATCTTGT GCAATGTAAC ATCAGAGATT

TTGAGACACA ACGTGGCTTT CC

FIG.36C

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka polinukleotydowa, znamienna tym, że zawiera wektor plazmidowy DNA wybrany z grupy składającej się z pnRSV, VI, V1J, V1R, VI Jns i VI Jneo, który obejmuj e co naj mniej jeden element regulujący transkrypcję funkcjonalnie związany z sekwencjąnukleotydową kodującą nukleoproteinę wirusa grypy, oraz farmaceutycznie dopuszczalny bufor lub nośnik.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera jeden lub więcej konstruktów DNA wybranych spośród:

(a) pn RSV-PR-NP;

(b) V1J-PR-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencj a według Identyfikatora Sekw. nr 12;

(c) V1 Jneo-BJ-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 20, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 21;

(d) V1 Jneo-TX-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 24, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 25;

(e) VI Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), który jest konstruktem o wielkości 6,42 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 52, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 53;

(f) VlJns-PA-NP (B/Panama/45/90), który jest konstruktem wielkości 6,54 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 56, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 57.
3. Konstrukt DNA wybrany z grupy obejmującej:

(a) pn RSV-PR-NP;

(b) V1 J-PR-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 12;

(c) V1Jneo-BJ-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 20, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 21;

(d) V1 Jneo-TX-NP, którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 24, a koniec 3 stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 25;

(e) VI Jns-BJ-NP (A/Beijing/353/89), który jest konstruktem o wielkości 6,42 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 52, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 53;

(f) V1 Jns-PA-NP (B/Panama/45/90), który jest konstruktem o wielkości 6,54 kb i którego koniec 5' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 56, a koniec 3' stanowi sekwencja według Identyfikatora Sekw. nr 57.
4. Ekspresyjny wektor plazmidowy DNA, którym jest V1Jns o sekwencji przedstawionej na Identyfikatorze Sekw. nr 45 (fig. 36 i fig. 17).