BG100006A - Лечебни препарати на основата на нуклеинови киселини - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до нови лекарствени препарати за профилактика, които могат да осигурят имунна защита срещу инфекция с хомоложни и хетероложнищамове на грипния вирус. Те представляват днк структури, кодиращи генни продукти на грипния вирус, които могат да се експресират в животински тъкани след директно въвеждане чрез инжектиране или по друг начин. </P>

Description

1. Предмет на изобретението:

Това изобретение се отнася за получаването и използуването на нов Фармацевтичен продукт: нуклеинова киселина, която след директно въвеждане в жива тъкан на гръбначни животни индуцира получаването на имунни отговори, който спицифично разпознават човешки грипен вирне.

• · • · ii, Предшествуващо състояние на техниката;

Грипът е остро възпалително заболяване, което се причинява от инжекция на дихателните пътища с грипен А или В вирне. Грипни огнища избухват почти всяка година на много места по света под Формата на периодични епидемии или пандемии. Грипът може да причини значителни систематични симптоми, тежки заболявания (такива като вирусна пневмония), изискващи клинично лечение и усложнения, такива като вторична бактериална пневмония. Смята се, че неотдавнашни епидемии в САЩ са завършили с повече от 10 000 (до 40 00) смъртни случаи за една година и 5

000 - 10 000 смъртни случаи в неепидемични години. Най-добрата стратегия за предотвъртяване на заболяването и смъртността, свързани с грипа, е ваксинацията.

Разрешените за приложение ваксини се получават от вирус, култивиран в яйца и след това инактивиран и включват три вирусни щама (два А-щама и един В— щам). На разположение са три типа ваксини: цял вирус субвирион и пречистен повърхностен антиген. Само последните две се използуват при деца поради засилените възпалителни процеси в отговор на ваксинация с цял вирус. За деца на възраст под девет години са необходими две имунизации, докато за възрастните е достатъчна само една инжекция. В резултат на наблюденията обаче, че в някои стари пациенти след ваксинацията титърът на антителата може да падне до нива под защитните в растояние на месеци или по—малко, беше предположено [виж Medical Letter 32;Θ9-9Ο, Sept. 17, 1993], че на пациенти, ваксинирани рано през есента, е целесъобразно да се приложи втора доза през зимата или рано през пролетта. Тези ваксини се съставят отново всяка година, като се предсказва, кои от появилите се наскоро вирусни щамове ще циркулират клинично и като се преценява, кои нови вирулентни щамове се очаква да бъдат преобладаващи през настъпващия грипен сезон. Препоръчва се ежегодна реваксинация.

с

А. Разрешените за приложение ваксини имат следните ограничения:

1) Антигенни вариации, особена в А—грипните щамове, водят до появата на вируси, които не се неутрализират от антителата, образувани при предишната ваксина (или при предишната инфекция). Новите щамове възникват чрез точкови мутации (антигенен дрейФ) и чрез преустройство (антигенен шифт) на гените, кодиращи повърхностните гликопротеини (хемаглнтинин [НА] и невраминидаза), докато в същото време вътрешните белтъци на щамовете, претърпяли антигенен дрейф и антигенен шифт, остват силно консервативни. Имунизацията предизвиква хомоложен, щамспециФичен имунитет, опосредствуван от антителата, а не хетероложен групов имунитет (имунитет насочен срещу различни щамове в рамките на дадена група) на основата на клетъчноопосредствувания имунитет.

2) Дори ако преобладаващите, циркулиращи щамове на грипния вирус не претърпяват значителен шифт или дрейФ от едната до другата година, имунизация трябва да се провежда всяка година, тъй като титрите на антителата намаляват. Въпреки някои съобщения, че инхибиращите хемаглутинацията (HI) и неутрализиращите антитела персистират в продължение на месеци и години и след това постепенно намаляват, Надзорният Комитет по Имунизационните Кампании посочва намаляването на титрите на антителата в годината след ваксинацията като причина за ежегодната имунизация, дори когато липсва голям дрейФ или шифт. (HI — антителата инхибират способността на грипния вирус да аглнтинира червените кръвни клетки

Подобно на неутрализиращити антитела те са насочени придимно срещу

НА-антигени те.

Тестовете за провеждане, отколкото неьтрализационните тестове и поради това често се използуват като средство за определяне способността на антителата, получени срещу един грипен щам, да реагират с друг щам). Както беше споменато по-горе, Medical Letter смята, че определени, високорискови стари индивиди би трябвало да се ваксинират два пъти в един сезон поради краткоживущите защитни титри на антителата.

3) Е*ективността на ваксината е снбоптимална. Разработването на ваксината за следващия сезон почива върху прогнозата за бъдещите циркулиращи щамове (чрез събиране на проби от службите по епидемиологичния надзор в Азия), което е неточно и може да доведе до слабо съвпадение между щамовете, използувани за ваксината и тези, които действително циркулират в пространството. Нещо повече, както се случи през грипния сезон

1992-1993, последната състава на новият H3N2—щам (А/Пекин/92) се изяви клинично през еаза на грипния сезон. Това провокира промяна в ваксината за 1993—1994 г. поради слабата кръстосана реактивност на антителата, индицирани от по—раншния H3N2—шам (А/Пекин/89) продължи телното

А/Пекин/92) в резултат на антигенен ши*т. Поради време, обаче, необходимо за уточняването на състава и производството на разрешената за приложение ваксина, новият ваксинален щам не можа да се въведе през сезона 1992

1993, независимо от данните за слаба защита от страна на съществуващата ваксина и повишената вирулентност на новия циркулиращ H3N2—щам.

Дори когато има добро съвпадение между ваксината и циркулиращите щамове, разрешената за приложение ваксина предпазва от заболяване само около 707. от здравите деца и индивиди в млада възраст и 30-407. от по-крехките индивиди в напреднала възраст. Поради това, когато ваксиналните щамове съответствнват на циркулиращите щамове, като показател за е+ективността на ваксината се използуват други критерии. Тези критерии включват предпазване от тежко заболяване и вторични усложнения, което намира израз в отпадане на необходимостта от клинично лечение (за 707. от старите хора, живеещи вкъщи срещу

50-607. за старите хора живеещи в приюти) и предпазване от смърт (Θ07. от обитателите на старчески дамове) . За друго предимство на имунизацията се смята груповият имунитет, който ограничава разптостраняването на инжекцията в старческия дом.

В.

Характеристики на Една Идеална Универсална Противогрипна

Ваксина (Обекти на изобретението);

1) Създаване на групова (хетероложна) защита. Една универсална ваксина би трябвало да е в състояние да предпазва от различни щамове, в рамките на субтипа H3N2 например, и ако е възможно от отделни субтипове, напр., от H1N1 go H3N2

Това по всяка вероятност би се опосредствувало от цитотоксичните Т—лимфоцити (ЦТА), които разпознават антигени от вътрешните, консервативни вирусни белтъци, въпреки че роля биха могли да играят също и неутрализиращите антитела, насочени срещу консетвативни части от мембранно-свързаните белтъци.

2) Разширен обхват на отговора чрез антитяло. Тъй като се смята, че ЦТА играят роля във възстановяване от заболяването, може да • ·

се очаква, че една ваксина, която се базира изключително на отговор чрез ЦТА, би съкратила продължителността на заболяването (възможно до положение на превръщане на заболяването в субклинично), но не би предотвъртила заболяването напълно. Беше показано експериментално, че методът за получаване на текущата противогрипна ваксина чрез препосяване в яйца може да доведе до селекцията на вирусни субпопулации с изменена НА-антигенност. Като резултат, ефективността на ваксината би могла да спадне, тъй като е възможно антителата, образувани при ваксинацията, да не са напълно ефективни срещу преобладаващия циркулиращ щам. Ето защо е желателно да се създадат антитела, които биха имали поширок обхват на отговора в сравнение с прилаганата ваксина

Грипни ят сезон

1992-93 предостави един блестящ случай за изучаване ограниченията на прилаганата ваксина в този смисъл, че която включваше

А/Пекин/89, предизвикваше образуването на антитела със слаба кръстосана реактивност по-слаба защитна Функция) срещу новия щам А/Пекин/92, който беше също и по-вирулентен. И двата щама са Η3Ν2, т. е. от един и същи снбтип

По отношение на аминокиселинната последователност, обаче, родствените щамове на А/Пекин/92 се различаваха от щамовете, родствени с А/Пекин/89 само по точкови мутации (позиции 133, 135, 145, 156, 157, 186, 190,

191,

193, 226 и 262) в НА1-областта. Не се знае дали текущият производствен процес не е допринесъл за липсата на кръстосана реактивност, но очевидно е желателно да се разшири спектърът на отговора чрез антитяло.

3) По-голяма продължителност на отговорите чрез антитела. Една от групите, която е изложена на най-голям риск от заболяване и

смъртност в	резултат на грипна инфекция (старите хора) е
същевременно	и групата, в която защитните титри на антителата

могат да паднат прекалено бързо. Поради това, за да бъде ежегодната имунизация ефективна, една подобрена ваксина би трябвало да образува защитни титри от антитялото, които персистират по-дълго.

С. Полинуклеотидите като ваксина

Беше показано, че интрамускулното въвеждане на полинуклеотидни конструкции,

е., ДНК-плазмиди, коди ращи белтъци, води до образоването на клетки in situ..

Чрез използуване на кДНК-плазмиди, кодиращи вирусни белтъци, бяха предизвикани, както отговори чрез ЦТЛ, така и отговори чрез антитела, които осигуряват хомоложна и хетероложна защита срещу последващо заразяване, което ще рече защита съответно срещу хомоложен или хетероложен щам. Всеки един от тези типове имунни отговори предлага потенциално предимство пред съществуващи те стратегии за ваксинация. Използуването на ПНВ-и за получаването на антитела може да има за резултат по-голяма продължителност на отговорите чрез антитела, да обезпечи антиген, който може да притежава, както точната последователност на клинично циркулиращия щам на вируса, така и правилните посттранслационни моди*икации и конФормация на нативния белтък (в сравнение с рекомбинантния белтък)

Предизвикването на отговори чрез ЦТЛ по този начин предлага предимствата на кръстосана защита срещу щамовете без използуването на жив, потенциално патогенен вектор или на атенюиран вирус.

θ

D. Πредшествуващо състояние на техниката (продължение на описанието)

И така, едно голямо предизвикателство при разработването на противовирусни ваксини, такива като протмвогрипната, при които се образуват неутрализаращи антитела, представлява разнообразието на белтъците от вирусните обвивки на различните изолати или щамове при хората, така и

Тъй като цитотоксичните Т-лимфоцити, както при мишките, са в състояние да разпознават епи топи , произлизащи от консервативните вътрешни вирусни белтъци [J .W

Yewdel1 et al.,, Proc. Natl

Acad. Gci (1985) ;

A.R.M

Townsend, et al., Cell 44, 959 (1986);

A.J

McMichsel et al. ,

Gen. Virol. 67, 719 (1986); J. Bastin et al. , J

Med

165, 1508 (1987); A.R.M. Townsend and H

Bodmer, Annu. Rev.

Immunol. 7, 601 (1989)], и тъй като се смята, че те са важни за имунния противовирусен отговор [Y.-L. Lin and

В.A

Askonas, J. Exp. Med. 154,

225 (1981); I. Gardner et al.,

Eur

J. Immunol. 4, 68 (1974)’,

K.L. Yap and G.L. Ada, Nature

273,

238 (1978); A.J. McMichael al., New Engl. J. Med. 309, (1983); Р.М

Taylor and В.A

Askonas, Immunol. 58, 417 (1986)], усилията бяха насочени към разработването на ЦТЛваксини, които са в състояние да осигурят хетероложна зашита среща различни вирусни щамове

CD®* ЦТЛ-и убиват клетки , инжектирани с вирус, когато техните

Т-клетъчни рецептори разпознаят вирусни пептиди, свързани c молекулите от ГКТС (главен комплекс на тъканната съвместимост), клас I [R.M. Zinkernagel and Р.С. Diherty, ibid. 141, 1427 (1975); R.N. Germain, Nature 353, 605 (1991)]. Тези пептиди произлизат от ендогенно синтезирани вирусни белтъци, независимо от тяхната локализация и Функцията в рамките на вируса.

По този начин чрез разпознаване на епитопи от консервативни вирусни белтъци ЦТЛ-и могат да обезпечат кръстосана защита срещу различни щамове. Пептидите, които могат да се свържат с ГКТС, клас I, за разпознаване от ЦТЛ, произлизат от белтъци, които присъствнват или преминават през цитоплазмата или ендоплазматичния ретикулнм [J.W. Yewdell and J.R. Bennink, Science 244, 1072 (1989); A.R.M. Townsend et al., Nature 340,

443 (1989); J.G. Nuchtern et al., ibid. 339, 223 (1989)]. Поради това, най-общо, екзогенните белтъци, които пренинават през ендозамалния път на зреене (както в случая с антигените, представени от молекулите на ГКТС, клас II) не са ефективни за получаването на отговори чрез CD8 *ЦТЛ.

Най-много усилия за получаване на отговори чрез ЦТЛ бяха направени или като се използуваха реплициращи се вектори за синтеза на белтъчния антиген вътре в клетката [K.R. Bennink et al., ibid. 311, 578 (1984); J.R. Bennink and J.W. Yewdell, Curr.

Top. Microbiol. Immunol. 163, 153 (1990); C.K. Stover et al.,

Nature

351,

456 (1991); R. Schafer et al., J.Immunol. 149, 53 (1992);

C.S

Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89, 2679 (1992)] или пепт иди в цнтозола £F.R

Carbone and M.J. Bevan, J. Exp. Med

169, 603 (1989); K

Deres et al., Nature 342, 561 (1989); H

T akahashi et al., ibid. 344,

873 (1990); D.S. Collins et al., J.

Immunol

148, 3336 (1992);

М. J

Newman et al, ibid 148, 2357 (1992)]

И двата подхода имат ограничени я, които могат да попречат на използуването им

Ретровирусни те вектори имат ограничени я по отношение на големината и структурата на полипептидите, които могат да се експресират като слети белтъци, така че да се запази способността на рекомбинантния вирус да се реплицира [A.D

Miller, Curr. Top.

Microbiol. Immunol. 158, 1 (1992)]. Ефективността на векторите • · • ·

за ваксинация може да бъде компроментирана при последователни имунизации от имунни отговори срещу самите вектори CE.L. Cooney et al., Lancet 337, 561 (1991)]. Вирусните вектори и модифицираните патогени крият също така рискове, които могат да попречат на използуването им при хората [R.R. Redfield et al., New Engl. J. Med. 316, 673 (1907); L. Mascola et al., Arch. Intern. Med. 149, 1596 (1989)]. Освен това, селекцията на пептидните епитопи за представяне зависи от структурата на ГКТСантигените и поради това пептидните ваксини могат да имат

ограничена ефективност	вследствие	разнообразието	от ГКТС-
харлотипове в отворените	популации.
Benvenisty, N.,	and Reshef,	L. [PNAS 83,	9551-9555,

(1986)] показаха, че ДНК, преципитирана с CaCla и въведена в мишки интраперитонеално, интравенозно или интрамнскнлна, би могла да се експресира. Беше показано, че интрамнскнлното (i.m.) инжектиране на ДНК в мишки води до поемане на ДНК от мнскнлните клетки и експресия на белтъка, кодиран от ДНК [J.A. Wolff et al., Science 247, 1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352, 815 (1991)]. Беше показано, че плазмидите съществуват като епизоми и че не се реплицират. Впоследствие беше наблюдавана постоянна експресия след i.m. инжектиране в напречнонабраздени мнскчли на плъхове, риби и примати, и в сърдечен мускул на плъхове [Н. Lin et al., Circulation 82, 2217 (1990); R.N. Kitsis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88, 4138 (1991); E. Hansen et al., FEBS

Lett. 290, 73 (1991); A. Jiao et al., Hum. Gene Therapy 3, 21 (1992); J.A. Wolff et al., Human Mol. Genet. 1, 363 (1992)). 3a техниката на използуване на нуклеиновите киселини като терапевтични агенти беше съобщено в W090/11092 (4 октомври 1990), където за ваксинация на гръбначни са използувани ’голи полинуклеотиди.

» · • · • · ·

За цепеха на метода не е необходимо имунизацията да бъде интрамускулна. В тази връзка Tang et al., [Nature, 356,

152-154 не въвеждането на златни микроснаряди натовармни с ДНК кодираща говеждия растежен хормон (BGH) кожата на мишки, води до образуването на анти—BGH—антитела мишките

Furth et [Analytical Biochemistry, 205, 365-368, (1992)] показаха че за трансФекци я in vivo на кожна, мускулна, мастна и млечна тъкан на животни Би могъл да се използува струен инжектор.

Преглед на различни методи за въвеждане на нуклеинови киселини наскоро беше направен от Friedman, Т., [Science, 244,

1275-1281 (1989)]

Виж също Robinson et al,, резюмета на сатии.

представени на срещата през

1992 по Модерни Подходи за Нови

Ваксини , включващи Борба със

СПИН-а, Cold Spring Harbor, р92, където се твърди, че хт и XV прилагане на ДНК от птичи грипен в пилета обезпечава защита срещу смъртоносно заразяване този случай, обаче, не се посочва, кой ген от птичия грипен вирус е бил използуван. Освен това се говори само за Н7-спечиФични имунни отговори без изобщо да се споменава за индукция на кръстосана защита

Ето защо, това изобретение взема под внимание всеки един от известните методи за въвеждане на нуклеинови киселини в живи тъкани за индуциране експресията на белтъци. Това изобретение обезпеч ава метод за включване на вирусни белтъци в пътищата за процесинг на антигените с цел образуването на вирус-специФични

ЦТЛ-и така, това изобретение откликва на необходимостта от специфични терапевтични агенти, способни да предизвикат желаните профилактични имунни отговори срещн вирусните патогени какъвто е примерът с грипния вирус

От особена важност в този терапевтичен подход е способността да се индуцират Т—клетъчни

ИМУННИ отговори, които могат да предпазят от инфекция дори с вирусни щамове, хетероложни на щама, от който е бил получен гена за антигена. И така, това изобретение осигурява ДНК-констрнкции, кодиращи вирусни белтъци на човешкия грипен вирус: ннклеопротеин (NP), хемаглутинин (НА), невраминидаза ( NM) , матриксни белтъци (М) нестрнктнрни белтъци (NS), полимераза (РВ1 и РВ2=основни (базични) полимерази; РА=кисели полимерази) или някои от другите гени на грипния вирус, кодиращи продукти, които генерират специфични ЦТЛ—и.

Грипният вирус има геном от рибонуклеинова киселина (РНК), състоящ се от множество РНК-сегменти. Всяка РНК кодира

най-малко един генен продукт. NP-генният продукт

се свързва с

РНК и премества вирусната РНК в ядрото на инфектираната клетка.

Тази последователност е консервативна и показва	само около 77.
дивергенция в аминокиселинната последователност,	произлязла за
период от 50 години. Р-генните продукти (РВ1,	РВ2, РА) са

отговорни за синтезата на нови вирусни РНК-и. Тези гени са дори значително по—консервативни, отколкото NP-гена. НА прдстаелява големият генен продукт от вирусната обвивка. Той е по-слабо консервативен, отколкото NP. Той свързва клетъчен рецептор и поради това е инструмент за инициация на нови грипни инФекции. Главният отговор чрез неутрализиращи антитела е насочен срещу този генен продукт. Срещу този белтък е насочен също и съществен отговор чрез цитотоксични Т—лимфоцити. Прилаганите понастоящем ваксини срещу човешкия грипен вирус включват три щама на грипния вирус или техните НА-белтъци. В резултат на вариабилността в белтъчната последователност на НА в различните щамове, обаче, ваксината постоянно трябва да се прекроява съобразно щамовете, които са настоящите причинители на патологията.

НА обаче, има някои консервативни елементи които ако са правилно представени генерират ЦТА-и. Гениите продукти NS1 и N52 нямат напълно « · • · охарактеризирани Биологични Функции, но могат да са от значение за образуването на защитни ЦТЛ-отговори. И накрая, гениите продукти Ml и M2, които са малко по-консервативни, отколкото НА, индицират силен ЦТЛ-отговор. Ml-белтъкът е обилно представен вирусен генен продукт.

Ефективността на ДНК-ваксинацията за предпазване от следващо вирусно заразяване се демонстрира чрез имунизация с нереплицираща се плазмидна ДНК, кодираща един или повече от погоре споменатите вирусни белтъци. Това е целесъобразно, тъй като не е въвлечен инфекциозен агент, не се изисква сглобяване на вирусни частици и позволява селекцията на детерминанти. Освен това, тъй като последователността на нуклеопротеина и на някои от другите генни продукти е консервативна по отношение на различните щамове на грипа, това дава възможност за предпазване от следващо заразяване с вирулентен щам на грипния вирус, който е хомоложен или хетероложен на щама, от който е получен клонираният ген.

ОБОБЩЕНО ПРЕДСТАВЯНЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Нов тип профилактични Фармацевтични препарати представляват ДНК-конструкции, които могат да се експресират след директно въвеждане в животински тъкани чрез инжектиране или по друг начин. Те индицират цитотоксични Т—лимфоцити (ЦТЛ-и), специфични за вирусните антигени, които реагират срещу различни щамове на вируса, за разлика от антителата, които са главно щам— специфични. Образуването на такива ЦТА-и in vivo обикновено изисква ендогенна експресия на антигена, както това става в случай на вирусна инфекция. За образуване на вирусни антигени, които да се предоставят на имунната система, без значение дали пептидът ще се достави директно или ще се използува вирусен • · • · • · · вектор, в бедрения мнекнл на

BALB/с-мишки беше инжектирана плазмидна

ДНК, кодираща белтъци на човешкия грипен вирне

Това доведе до образуването на ЦТЛ-и, специфични за грипния вирне и до предпазване от следващо заразяване с хетероложен щам на грипния вирне, което се установява по намаляването на белодробните вирнени титри, потискане загубата на тегло повишената преживяемост

В маймуните Резне се образнваха високи титри на неутрализиращи антитела срещи хемаглутинина и антитела среши ннклеопротеина, а след хомоложно и хетероложно заразяване на порове бяха наблюдавани понижени назални титри на вируса

Ключовите наблюдения, имащи отношение към нашето изобретение, включват;

1) Демонстриране на ефективността. Хетероложна защита се наблюдава след имунизация с ннклеопротеинова (NP) ДНК, което се установява по повишената преживяемост, понижените белодробни титри на вируса и по инхибирането загубата на тегло в мишки, заразени с щам на грипния вирне, различен от щама, източник на

NP-гена. В този случай повърхностните белтъци на двата щама бяха твърде различни (H1N1 спрямо

H3N2) и щамът, използуван за заразяване, се беше появил години след изходния щам

Имунизацията на порове с NP-ДНК и матриксна (N1)—ДНК, поотделно, заедно или в комбинация

НА-ДНК, доведе до предпазване (понижено назално отделяне на вирнса) от заразяване претърпял дрейф (клиничен изолат)

Защитата срещу щама , претърпял дрейф (Джорджия/93), посредством ДНК-коктейла (NP- и

Ml—ДНК, кодираща белтъците на Пекин/89 и НА-ДНК, кодираща НА на

Пекин/89 или на

Хавай/91) беше забележимо по-голяма, отколкото защитата посредством лицензираната ваксина (съдържаща

Пекин/89)

Коктейлът , съдържащ НА-ДНК от Хавай/91 изглеждаше малко по• » • · ефективен, отколкото коктейлът, съдържащ НА-ДНК от Пекин/В9.

Защитата, наблюдавана с коктейла, съдържащ НА-ДНК от Хавай/91, беше идентична със защитата, наблюдавана с хомоложната НА-ДНК (Джорджия/93), докато защитата посредством коктейла с НА-ДНК от

Пекин/89 беше различна от хомоложната защита, въпреки че този коктейл все още беше значително по-добър от лицензирания продукт

HI-антитела се образоваха във всички изследвани видове, маймуни.

2) Персистениия.

В изследвания с

ДНК, кодираща ген-свидетел, присъствието на

ДНК и белтъчната експресия персистираха наймалко 1,5 години (най-продължителното време, тестирано в мишки;

Wolff et al , Human Mol

Genet., 1992). И така, ако гениите продукти на грипния вирус също се експресират постоянно, то получаващи ят се имунен отговор също би продължил да съществува.

За антителата и ЦТЛ (Yankauckas et al., DNA & Cell

Biol .,

1993) , както и за хомоложния защитен имунитет (данни на MRL), образувани при инжектиране с ДНК на грипния вирус, беше показано, че персистират в мишки в продължение на една година.

Беше показано, че антителата персистират в маймуните Резне в продължение на най-малко една година. ЦТА-отговорите и хетероложната защита (повишена преживяемост) продължават до 6 месеца (най-продължителната времева точка, определена досега).

Настъпваше слабо понижаване в степента на хетероложна защита, но тя подлежеше на усилване.

3) Обхват на дозата. Бяха проведени изследвания върху дозировката в маймнни Резне, които показват, че 100 мкг НА-ДНК, давана два пъти, водеше до образуването на високи титри от HI16 антителата, които петрсистираха в продължение на една година.

Г енери рането на защита (повешена преживяемост след хетероложно заразяване) в мишки беше наблюдавано с ниски дози мкг (давани три пъти) и с единична инжекция от 200 мкг, но най-общо, увеличаването броя на инжекциите (до 3) подобряваше степента на защита

Изследвания върху примати показаха, че 2 инжекции от 10 или 100 мкг ДНК, кодираща 3 НА-и,

NP и N1 (последната, кодираща гени на

H3N2 Пекин/В9) имаха за резултат титри на HI-антителата, твърде сходни с тези, които се генерират от лицензираната ваксина

Важно е да се напомни, всички изследвани животни са наивни ( Т .е неболеднвали от грип и неимннизирани с противогрипна ваксина), докато при целната клинична популация (възрастните индивиди) е била с грипния вирне .

(Повтаряме, че на деца под Ч години се правят 2 инжекции от лицензираната ваксина.)

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ПРИЛОЖЕНИТЕ ФИГУРИ

Фиг

1. Установяване на NP-плазмидна

ДНК в мнекнл чрез ПВР (полимеразна верижна реакция). Мишки бяха инжектирани три пъти на интервали от по три седмици с RSV-NP-ДНК или с празен вектор (100 мкг/крайник) в двата бедрени мускула на BALB/c— мишки, последвано от инжектиране с грип

Мускулите бяха отстранени седмици след последната инжекция и веднага замразени в течен азот

След това те бяха стрити лизиращ бн*ер (25 мМ Трис-Н^.Р0 рНВ, 2 мМ транс-1:2 диаминоциклохексан-тетраоцетна киселина (ЦДТА), 2мМ ДТТ, 10Z глицерол, 17. Тритон Х-100) в MIKRODISMEMBRATOR™ (В. Braun

Instruments)

Високомолекулна

ДНК беше е к с т ра х и р ан а <*енол/хлороформ и утаена с етанол. 2а установяване наличието на

NP-плазмидна ДНК в мускул бяха проведени 40 цикъла на ПВРреакция (ПВР беше проведен съгласно инструкциите към набора реагенти на Perkin Elmer Cetus GENEAMPT™) . Чрез използуване на сенз (значещ) олигонуклеотид, дълъг 1Θ бази, който започва синтезата в промоторната област (GTGTGCACCTCAAGCTGG, SEQ.ID:!:) и на антисенз-праймер от 5'-частта на включената NPпоследователност, дълъг 23 бази (CCCTTTGAGAATGTTGCACATTC, SEQ. ID:2:), беше получен ПВР-продукт от 772 базови двойки (виж върха на стрелката), който покрива CMV—промотора и по-голямата част от

5'-края на включения NP-ген.

Продуктът от

772 бд в отбрани гелове, празен проби, оцветени вектор инжектирани с етидиев с NP-ДНК, бромид, но (600L) . Означенията над се не вижда на агарозни и в котролата с всяка пътека посочват идентификационния номер на мишката и ляв или десен крайник.

Фиг. 2. Образуване на NP—антитела в мишки, инжектирани с NP—ДНК. Мишки бяха инжектирани със 100 мкг Ol-NP-ДНК във всеки крайник на 0-ва, 3-та и 6-та седмица. Кръв беше вземана на 0-ва, 2-ра , 5-та и θ-ма седмица. Наличието на анти-NP IgG в серума беше определено чрез ELISA (ензимно-свързан имуносорбентен анализ, елайза) (J.J. Donnelly et al., J. Immunol. 145, 3071 (1990)) c използуване на NP, пречистен от клетки на насекоми, трансФектирани с бакнловирусен експресионен вектор. Резултатите са представени граФично като зависимост на средния logi_OELISAтитър±БЕМ (п=10) от времето след първото инжектиране на NP-ДНК. Мишките, имунизирани с празен вектор, не образуваха детектирнеми NP-антитела.

Фиг. 3. Процент спициФичен лизис на ЦТА—и, получени от мишки, имунизирани с ДНК, определен чрез теста по 4-часово

1Θ освобождаване на ^SiCr. Мишки бяха имунизирани с 400 мкг V1-NPДНК (плътни кръгчета) или с празен вектор (плътни квадратчета) и умъртвени

3-4 седмици по-късно. Негативни контролни ЦТЛ-и бяха получени от наивна

II мишка (отворени триъгълничета), а позитивни контроли от мишки, преболедували от инфекция с Α/ΗΚ/6Θ четири седмици преди това (плътни триъгълничета)

Гра*иките показват данни за представителни индивиди мишки. За всяка комбинация от условия бяха изследвани най-малко осем индивида. Панел А: Клетки от далак, рестимулирани с автоложни клетки от далак, пнлсирани с

ΝΡ147-155 и определени срещу Р815-клетки, пнлсирани с ΝΡ147-155.

Панел

В:

Клетки от далак, рестимулирани с автоложни клетки от далак,

ΝΡ147-155 и определени срещу Р815 прицелни клетки инфектирани с грипния вирус А/Виктория/73 (Η3Ν2) 6 часа преди прибавянето на ЦТЛ

Панел С

Клетки от далак, рестимулирани с Соп А и IL.-2 без дапълнителен антиген определени срещу ΡΘ15—клетки, пнлсирани с ΝΡ147—155. Панел D:

Мишки бяха инжектирани с 200 мкг на инжекция Vl-NP-ДНК или с празен

Далаците вектор три пъти на интервали от по три седмици бяха събирани 4 седмици след последната имунизация, клетките от далак бяха култивирани с

IL-2 и Соп

А 7 дни и ЦТЛ бяха определяни срещу

Р815-прицелни клетки, инфектирани с

А/Виктория/73

Фиг. 4. Загуба на маса (в грамове) и възстановяване на мишки, имунизирани с ДНК, след неанестезирано интраназално заразяване с

10*TCID_&o от Α/ΗΚ/6Θ

Мишки бяха имунизирани три пъти на 3седмични интервали с Ψ1-ΝΡ—ДНК, с или не бяха инжектирани

Мишките бяха заразени три седмици след последната имннизаци я

Теглата на групи от по мишки бяха определяни в момента на заразяването и ежедневно от четвъртия ден за мишките инжектирани с NP-ДНК (плътни кръгчета), за контролата с празния вектор (отворени триъгълничета) и за неинжектираните контроли (отворени кръгчета). Показани са средните тегла ± SEM. Мишките, инжектирани с NP-ДНК, показаха значително по-слаба загуба на тегло от β-мия до 13-ия ден, отколкото инжектираните с празен вектор (р!0,005) и неинжектираните мишки (р<0,01), както показа анализът чрез t-теста. Не беше забелязано достоверно различие между двете контроли (ρ=θ,0 съгласно tтеста.

Фиг. 5. Преживяемост на мишки, имунизирани с ДНК, след интраназално заразяване (под упойка) с 10^a-⁼TCIDeo от Α/ΗΚ/6Θ. Мишки, имунизирани три пъти на триседмични интервали с Vl-NP-ДНК (затворени кръгчета) или с празен вектор (отворени кръгчета) и неинжектирани контроли (отворени триъгълничета) бяха заразени три седмици след последната имунизация. Процентът преживяемост е показан за групи от по 9 или 10 мишки. Преживяемостта на мишките, инжектирани с

NP-ДНК беше значително по-голяма, от колкото на контролите (р=0,0004 съгласно анализа чрез Хиквадрат), докато между инжектираните с празен” вектор и неинжектираните мишки не беше наблюдавано статистически достоверно различие (р=0,17 съгласно Хи-квадратния

Фиг. Δ. Последователност на експресионния анализ) .

вектор V1J,

SEQ.IDs 10 s.

Фиг. 7. Последователност на експресионния вектор VIJneo,

SEQ.IDsl8;.

• · ·· ·· ·· ·· *··

Фиг.	8. Последователност на CMVintA-BGH промотор-терминаторната

последователност, SEQ.ID:11.

Фиг.	9. Маймунско анти-NP антитяло.
Фиг.	10. Инхибиране на хемаглутинацията в порове. Прекъснатата

линия показва минималния защитен титър на антитялото, а средната стойнст е отбелязана чрез кръгче, пресечено с линия.

Фиг .	11. IgG Анти-NP антитяло в порове след имунизация с ДНК.
Фиг.	12. Отделяне на грипен вирус в неимунизирани и имунизирани

с ДНК порове.

Фиг.	13. Диаграма на векторите pRSV-PR-NP и VI-NP. С X са

отбелязани включените кодиращи области.

Фиг.	14. Схема на грипните белтъци и щамове.
Фиг .	15. Схема на процесинга на инжектираната ДНК в клетката.
Фиг.	16. Устойчивост на порове към грип A/RP/8/34, индуциране
ч рез	имунизация с гени за НА и за белтъци от вътрешността на

вируса.

Фиг.	17. Схема на вектора VIJns.
Фиг.	18. Африкански зелени маймуни бяха инжектирани с коктейл от

ДНК-и, включваш НА-ДНК (А/Пекин/89, В/Панама/90, А/Тексас/91),

NP-ДНК (A/PR/34) и Ml-ДНК (A/PR/34). Всеки компонент съдържаше • *

или 10 мкг (плътни квадратчета) или 100 мкг (плътни кръгчета), приложени два пъти на интервал от шест седмици (виж стрелките). За сравнение, други животни бяха инжектирани с лииензирани ваксини, представлявщи субвирион (отвтрени квадратчета) и цял вирион (отворени кръгчета) с цялата доза, която се прилага при хората (45 мкг белтъчен еквивалент; 15 мкг за НА). Бяха събирани серумни проби на всеки две седмици в продължение на 18 седмици и бяха анализирани за HI-титър срещу НА на А/Пекин/89. Данните са представени като геометричен среден HI-титър ± SEM, където п=3.

Фиг. 19.	Женски BALB/с-мкшки (на 4-6 седмици) бяха инжектирани с
A/PR/34	NP-ДНК (200 мкг) три пъти на интервали от по три
седмици .	Отрицателните контроли включваха мишки, инжектирани с
котролна	ДНК (200 мкг), рекомбинантен NP-белтък (10 мкг) и

наивни, неинжектирани мишки. За сравнение бяха тестирани също така и мишки, инжектирани с грипния вирус А/МК/68. ЦТЛ бяха получени 6 месеца след първата доза, рестимнлирани in vitro със сингенни клетки от далак, инжектирани с вирус, и тестирани срещу

Р815-клетки, пулсирани с NP-белтък при съотношение е*ектор:мишина 10sl. Данните представят 7. специфичен лизис ±sd , където п=3.

Фиг. 20. СЗН/Не1Ч-мишки бяха инжектирани с нормални C₌C_i2миобласти (1 X 10⁷ клетки), рекомбинантен NP-белтък (2 мкг) или с миобласти, трансФекти рани с NP (1 X 10⁷ клетки). Това количества от NP-белтъка (2 мкг) беше достатъчно за получаване на отговори чрез антитела и беше еквивалентно на приблизително 100 пъти количеството NP-белтък, присъствуващо в трансплантираните миобласти, трансъектирни с NP. ЦТЛ бяха приготвени от тези мишки шест седмици след третирането и

рестимулирани in vitro със сингенни клетки ат далак, инфектирани с грипен вирне. За положителна контрола ЦТЛ Бяха приготвени от мишки, които Бяха инфектирани с грипния вирне Α/ΗΚ/6Θ. Като прицелни клетки Бяха използувани нетретирани (плътни колони), инфектирани е грипния вирне А/Виктория/73 (защриховани е десен наклон колони) и NP-трансФектирани миобласти (защриховани е ляв наклон колони) при съотношение еФектр:мишена 25:1. Данните са представени като 7. специфичен лизис ± sd, където п=3.

Фиг

Женски BALB/с-мишки на възраст четири седмици Бяха имунизирани интрамускулно с

200 мкг NP-ДНК три пъти на 3седмични интервали

Мишките

Бяха заразени три седмици след третата имунизация с

300 TCIDeo А/НК/68, приложени под упойка (тотално заразяване на дихателните пътища)

Пропорцията на оцелелите мишки (10 мишки/група) е представена графично като зависима от времето след заразяването

Фиг

Женски BALB/с-мишки на възраст четири седмици

Бяха имунизирани интрамускулно със

100 мкг NP-ДНК три пъти на 3седмични интервали

Мишките

Бяха заразени три седмици след третата имунизация с

300

TCIDso Α/ΗΚ/όΘ, приложени под упойка (тотално зараз яване на дихателните пътища)

Мишките Бяха претегляни ежедневно

Беше изчислявана пропорцията от първоначалното тегло за всяка оцеляла мишка

Средните проценти от първоначалното тегло са изразени графично

SEM като зависими от времето след заразяването

Фиг

Женски BALB/с-мишки на възраст четири седмици Бяха имунизирани интрамускулно със

100 мкг NP-ДНК три пъти на 3седмични интервали

Мишките

Бяха заразени три седмици след • ·

третата имунизация с 2000 TCID»o Α/ΗΚ/6Θ, приложени под упойка (заразяване на горните дихателни пътища). Мишките бяха умъртвени 7 дни след заразяването, белите им дробове бяха отстранени и хомогенизирани. Вирусните титри бяха определени чрез серийно титруване върху MDCK-клетки.

Фиг. 24. Женски BALB/с-мишки на възраст четири седмици бяха имунизирани интрамнскнлно с 6,25, 25, 100 или 200 мкг NP-ДНК три пъти на 3-седмични интервали. Мишките Бяха заразени три седмици след третата имунизация с 300 TCID»© Α/ΗΚ/6Θ, приложени под упойка (тотално заразяване на дихателните пътища). Пропорцията на оцелелите мишки (10 мишки/група) е представена гранично като зависима от времето след заразяването.

Фиг. 25. Женски BALB/с-мишки на възраст четири седмици бяха имунизирани i.m. три пъти на 3—седмични интервали с 200 мкг A/RP/43 NP-ДНК, контролна ДНК или псевдоинжектирани. След това мишките бяха заразени с 300 TCIDeo Α/ΗΚ/6Θ, приложени под упойка 6, 12 и 25 седмици след третата инжекция. Отбрани мишки бяха реимунизирани с 200 мкг NP-ДНК на 22-та седмица и след това заразени на 25-та седмица (усилване на имунния отговор). Средите тегла са показани като процент от първоначалното тотално тегло за всяка група. Показаното контролно тегло е средно от теглата на всички контролни групи от заразяванията на 6-та, 12—та и 25та седмица, общо 6 групи, инжектирани с контролна ДНК или псевдоинжектирани. Първоначално всяка група съдържаше 10 животни; след смъртта мишките бяха изключвани от по-нататъшен анализ • * • ♦

Фиг. 26. Възрастни (на възраст 22-28 седмици) мъжки порове бяха имунизирани i.m. с 1 мг ДНК, кодираща NP от

А/Пекин/89, 1 мг

ДНК, кодираща Ml от А/Пекин/89 или комбинирано с по 1 мг от всяка ДНК в дните или 42. Контролните порове бяха инжектирани в дните 0 и 42 с некодираща ДНК или с пълната доза от лицензираната противогрипна ваксина, представляваща цял вирус (съставена 92-93 г.), прилагана при харата (15 мкг/щам) и съдържаща А/Пекин/89. Поровете бяха заразени на 56-тия ден с

А/Джорджия/93. Отделянето на вирус в носни промивки беше определено, както е описано по-горе. Отделянето на виурс в дните

3-5 беше сравнено с това в порове, инжектирани с контролна ДНК чрез корелационен анализ на вариацията. Отделянето на вирус в поровете, инжектирани NP-ДНК,

М1-ДНК и ли

NP+M1-ДНК беше значително по-ниско (р<0,0001, 0,0016 и <0,0001, съответно), отколкото отделянето в контролните порове

Отделянето в порове, инжектирани с NP (данните не са представени) , Ml или NP+-M1 не се различаваше статистически достоветно от отделянето в порове, инжектирани с лицензираната ваксина (р=0,104, 0,533 и 0,145, съответно).

Имунизационната доза от мг беше избрана произволно;

изследвания върху обхвата на дозата бяха проведени в примати (като се изключват хората).

Фиг. 27. Групи от по 8 мъжки пора на възраст 22-25 седмици Бяха имунизирани интрамускнлно с контролна ДНК, Физиологичен разтвор или с ДНК, кодираща Белтъци на грипния вирус A/PR/8/34 в дните 0, 21 и 121 и Бяха заразени интраназално на 148-мия ден с 200 TCIDso от A/PR/8/34. Имунизираните животни Бяха инжектирани с 1 мг NP-ДНК или с 2 мг NP, NS1, РВ1, РВ2 и Ml ДНК комбинирано (400 мкг от всяка конструкция). Контролите Бяха инжектирани с 0,5 мл/крайник Физиологичен разтвор или 1 мг контролна ДНК. За целите на анализа групите, инжектирани с Физиологичен разтвор и с контролна ДНК бяха обединени (Контрола), както и групите, инжектирани само с NP—ДНК или в комбинацията и с гени за други вътрешни белтъци (Вътрешни). ГраФиките показват инфекциозните титри на назални промивки, изразени в TCIDeo/50 мкл за тотален обем на течността от назалните промивки 3 мл.

Неразреденат а течност от противите (най-ниското тестирано разреждане) беше приета за Is 10 разреждане на изходния назален секрет и на положителната неразредена проба беше придадена стойнст 1

Титрите над 1 log бяха определяни на основата на интерполацията

Reed -Muench за три повторения до получаване на 50Z крайна точка на инФекциозност. На проби, които бяха отрицателни при тестиране без разреждане, беше придадена стойност 0 log. Стойностите за р, показани на графиката, бяха изчислени за имунизираните порове спрямо контролите в посочените дни чрез

Т-теста. Стойностите на р за целите криви бяха изчислени чрез корелацйонен бяха <0,0001 за NP спрямо контролата <0,001 за комбинираните

ДНК-и спрямо контролата

Фмг. 28. Преживяемост на след това заразени с грипен вирне. Мишки бяха инжектирани i.m с 200 мкг

ДНК, кодираща НА от A/PR/34 или с контролна (некодираща) ДНК три пъти на интервали от по три седмици. Три седмици след последната имунизация дихателните пътища на мишките бяха изцяло заразени (чрез интраназално накапване под упойка) с

1000 TCID-,ο от

A/PR/34

Данните са изразени графично като 7.

преживяемост в зависимост от времето след заразяването (п=9 или 10 мишки на група).

2Ь

Фиг. 29. Загуба на тегла при мишки, имунизирани с ДНК и след това заразени с грипен виурс. Мишки бяха инжектирани i.nx. с 200 мкг ДНК, кодираща НА от A/PR/34 или с контролна (некодираща) ДНК три пъти на интервали от по три седмици. Три седмици след последната имунизация дихателните пътища на мишките бяха изцяло заразени (чрез интраназално накапване под упойка) от A/PR/34. Данните са изразени графично като с 1000 TCIDeo

7. от изходното тегло за всяко индивидуално животно, усреднено за всяка група, в зависимост от времето.

(Умрелите животни са изключени от средната стойност.)

Фиг. 30. Преживяемост на мишки, имунизирани с ДНК след това заразени с грипен вирус. Мишки бяха инжектирани

1, 10 или

100 мкг ДНК, кодираща НА от A/PR/34 или с контролна (некодираща)

ДНК три пъти на интервали от по три седмици. Три седмици след последната имунизация дихателните пътища на мишките бяха изцяло заразени (чрез интраназално накапване под упойка) с 1000 ТСЮво от A/PR/34. Данните са изразени гра*ично като 7. преживяемост в зависимост от времето след заразяването (п=9 или мишки на група).

Фиг. 31. Групи от по 8 мъжки пора на възраст 22—25 седмици бяха имннизи рани интрамаскнлно с контролна ДНК, Физиологичен разтвор или с ДНК, кодираща белтъци на грипния вирус A/PR/34 в дните 0, и 121 и бяха заразени интраназално на 148-мия ден с 200

TCID»o от

A/PR/8/34

Имунизираните животни бяха инжектирани с 1 мг НА-ДНК или с 2 мг НА, NP, NS1, РВ1, РВ2 и Ml ДНК комбинирано (по 330 мкг от всяка конструкция). Контролите бяха инжектирани с

0,5 мл/крайник

Физиологичен разтвор или 1 с мг контролна ДНК

За целите на анализа групите, инжектирани с Физиологичен разтвор и с контролна ДНК бяха обединени (Контрола), както и групите, инжектирани само с НА-ДНК или е комбинацията и с гени за други вътрешни белтъци (НА, НА+Вътрешни). Графиките показват инфекциозните титри на назални промивки, изразени в TCID_SO/50 мкл за тотален обем на течността от назалните промивки 3 мл. Неразредената течност от промивите (най-ниското тестирано разреждане) беше прието за 1:10 разреждане на изходния назален секрет и на положителната неразредена проба беше придадена стойнст 1 log. Титрите над 1 log бяха определяни на основата на интерполацията Reed-Muench за три повторения до получаване на 507. крайна точка на инФекциозност . На проби, които бяха отрицателни при тестиране без разреждане, беше придадена стойност 0 log. Стойностите на р за целите криви бяха изчислени чрез корелационен анализ на вариацията и бяха <0,0001 за НА спрямо контролата и <0,0001 за комбинираните

ДНК-и спрямо контролата.

Фиг. 32. Възрастни (на възраст

22—28 седмици) мъжки порове бяха имунизирани мг ДНК, кодираща НА от А/Джорджия/93 дните 0 и 42.

Контролните порове бяха инжектирани в дните 0 и с некодираща ДНК или с пълната доза, прилагана при харата ( 15 мкг/щам), от лицензираната противогрипна ваксина, представляваща цял вирус (съставена 92-93 г.) и съдържаща А/Пекин/89. Поровете бяха заразени на 56-тия ден с А/Джорджия/93. Отделянето на вирус в носни промивки беше определено, както е описано по-горе. Отделянето на виурс в дните 1-6 беше сравнено с това в порове, инжектирани с контролна ДНК чрез корелационен анализ на вариацията. Отделянето на вирус в порове, инжектирани с НА-ДНК, беше по-ниско, отколкото отделянето в контролните порове.

Разликата беше статистически достоверна (р<0,0001).

Фиг. 33. Възрастни (на възраст 22-28 седмици) мъжки порове бяха имунизирани

i.m. с 1 мг ДНК, кодираща НА от

А/Хавай/91 или от

А/Пекин/89 (данните не са представени), в дните 0 и 42

Контролните порове бяха инжектирани в дните 0 и 42 с некодираща

ДНК или с пълната доза, прилагана при харата (15 мкг/щам), от лицензираната противогрипна ваксина, представляваща цял вирус (съставена 92-93 заразени на 56-тия ден и съдържаща А/Пекин/89. Поровете бяха с А/Джорджия/93. Отделянето на вирус в носни промивки беше определено, както е описано по-горе.

Отделянето на виурс в дните 1-6 беше сравнено с това в порове, инжектирани с контролна ДНК чрез корелационен анализ на вариацията

Отделянето на вирус в поровете, инжектирани

А/Хавай/91-НА-ДНК беше по-ниско, контролните порове. Разликата беше (р<0,0001). Отделянето на вирус в отколкото отделянето статистически достоверна поровете, инжектирани с инжектирани с лицензирания продукт. Разликата беше статистически достоверна (р=0,021 за А/Хавай/91 НА-ДНК; корелационен ANOVAанализ за дните 1-6); разликата между отделянето в порове, инжектирани с А/Пекин/89 (данните не са представени) и с лицензирания продукт, не беше статистически достоверна (р=0,058; корелационен ANQVA—анализ за дните 1-6).

Фиг. 34. Възрастни (на възраст 22—28 седмици) мъжки порове бяха имунизирани i.m. с 1 мг ДНК, кодираща НА от А/Хавай/91 (виж Фигура 13), или с по 330 мкг ДНК-и, кодиращи НА от А/Хавай/91 и NP и Ml от А/Пекин/89, в дните 0 и 42. Контролните порове бяха инжектирани с некодираща ДНК или с пълната доза, прилагана при харата (15 мкг/щам), от лицензираната противогрипна ваксина, представляваща цял вирус (съставена 92-93 г.) и съдържаща

А/Пекин/89 в дните 0 и 42. Поровете бяха заразени на 56-тия ден с А/Джорджия/93. Отделянето на вирне в носни промивки беше определено, както е описано по—горе. Отделянето на винре в дните 1-6 беше сравнено с това в порове, инжектирани с контролна ДНК чрез корелационен анализ на вариацията. Отделянето на вирне в поровете, инжектирани с HA+NP+Ml-ДНК, беше по-ниско, отколкото отделянето в поровете, инжектирани с лицензираната ваксина или само с НА-ДНК. Разликите бяха статистически достоверни (р<0,0001 и р=0,0053, съответно)

Фиг. 35. Възрастни имунизирани (на възраст 22-28 седмици) мъжки порове бяха мг ДНК, кодираща НА от А/Джорджия/93 или с по 330 мкг

ДНК-и, кодиращи НА от А/Хавай/91 и NP И Ml от

А/Пекин/89, в дните 0 и 42. Контролните порове бяха инжектирани с некодираща ДНК или с пълната доза, прилагана при харата (15 мкг/щам), от лицензираната противогрипна ваксина, представляваща цял вирне (съставена 92-93 г.) и съдържаща А/Пекин/89, в дните 0 и 42. Поровете бяха заразени на 56-тия ден с А/Джорджия/93. Отделянето на вирне в носни промивки беше определено, както е описано по-горе. Отделянето на винре в дните 1-6 беше сравнено с това в порове, инжектирани с контролна ДНК чрез корелационен анализ на вариацията. Разликата межди отделянето на вирне в поровете, инжектирани с HA+NP+Ml-ДНК и с хомоложна НА-ДНК не беше статистически достоверна (р=0,064).

Фиг.36. Последователност на V1R

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Това изобретение обезпечава Фармацевтични препарати от нуклеинови киселини, които след директно въвеждане в животни, включващи гръбначни, такива като бозайници (включително и хора), индицират експресията на кодираните белтъци в животното

Имунната система на животното се активира към от ключване на защитен отговор, тъй като белтъкът е такъв, който нормално не се среща в животното, а само при патологични условия. Такива са белтъците, свързани с грипния вирус, например, но не само, грипния нуклеопротеин, невраминидаза, хемаглутинин, полимераза, матриксни или нестрнктнрни белтъци. Тъй като екзогенните белтъци се произвеждат от собствените тъкани на животното, експресираните белтъци се процесират и представят от главния комплекс на тъканната съвместимост, ГКТС

Това разпознаване е аналогично с това, което протича след същинска инфекция с родствения организъм

Резултатът, както е показано в тази пнбликаци я, представлява индуциране на имунен отговор, който предпазва от вирулентна инжекция

Това изобретение обезпечава нуклеинови киселини, кои т о при въвеждане в животински тъкани in vivo чрез инжектиране, инхалация или чрез аналогичен механизъм (виж ПРЕДШЕСТВУВАЩО

СЪСТОЯНИЕ НА

ТЕХНИКАТА по-горе) водят до експресия на генни продукти на човешкия грипен вирне. Така например, инжектирането на ДНК-конструкциите на това изобретение в мнекнли на мишки индицира експресията на кодираните генни продукти. По подобен начин това става в порове и в маймуните Резне. След последващо заразяване с вирулентен грипен вирус като се използуват дози, кои то по правило убиват контролните животни, животните, инжектирани с полиннклеотидната ваксина, показват много по-ниска заболеваемост и смъртност

По този начин това изобретение предлага ваксина, която може да се използува при хората за предпазване от инжекции с грипни вируси

Ние показахме, че ДНК-конструкции, кодиращи белтъци на грипния вирус, предизвикват защитни имунни отговори животни.

Както ще бъде описано с повече детайли по-дола имунни те отговори в животните включваха образуване на антитела и ЦТЛ в мишки, образуване на антитела в порове и примати и предпазване на мишки и порове от заразяване с хомоложни щамове на грипния вирус, претърпяли дрейф и шифт. Може би най-спорният резултат от имунизацията с

ДНК, кодираща вирусни белтъци, беше способността за предпазване от други снбтипове на вирнса. Това предполага, че прибав янето на ЦТЛ-индуциращ компонент към ваксината би спомогнало за отслабване влиянието на новите варианти, които възникват в междинния сезон или които остават непредвидени при ежегодното подбиране на щамовете за следващата година

От значение е, че имунизирането с кДНК-вектори, кодиращи НА-NP- и

Ml—ген, беше в състояние да предпзва порове от щамове на ви руса, претърпяли дрейФ, по-еа>ективно отколкото лицензираната ваксина.

Това оправдава използуването в ПНВ на конструкции, включващи гени , които кодират белтъци от вътрешността на вируса

В едно приложение ваксиналният продукт се състои, както от отделни ДНК—плазмиди, кодиращи например НА от трите найши рок о разпространени клинични щамове, представляващи вирусите

A/H1N1 (А/Тексас/91), A/H3N2 (А/Джорджия/93) и В (В/Панама/90), така и от ДНК-конструкции, кодиращи консервативните белтъци от вътрешността

NP и Ml (матрикс) на

А(Пекин/89; H3N2) и на Вщамове, за да се осигури групова защита срещу антигените, претърпяли дрейФ и шифт. НА-ДНК-ите Функционират като образуват

НА и водят до Формирането на неутрализиращи антитела с рещн НА.

Това е тип-специФична и разширява до известна степен обсега на предпазване от щама, претътпял дрейф, сравнение предпазването от ваксината на белтъчна основа, разрешена за приложение кои то

NP— и Ml-конструкциите водят до образуването на ЦТЛ, осигуряват кръстосана зашит а срещу щамовете, характеризираща се с потенциално по-ниски вирусни товари неинтегриран вид в мускулните клетки) се очаква да осигури повишена продължителност на защитата в сравнение с прилаганата ваксина.

Предвидените предимства пред разрешените за приложение ваксини включват: разширен обхват на зашитата в резултат на ЦТЛ отговорите ± разширен обхват на антитялото и повишена продължителност на защитата. ПНВ-подходът избягва необходимостта да се правят, селекционират и размножават щамове с преподреден генетичен материал, както това се прави за целите на прилаганата лицензирана ваксина, тъй като новата ДНК-констрнкция може да се направи много по—директно от клинично достъпните изолати.

В едно приложение на изобретението в експресионен вектор е клонирана последователност за нуклеопротеина (NP) на човешкия грипен вирус, получена от щама A/PR/8/34. Векторът съдържа промотор за транскрипция от РНК-полимераза и терминатор за транслация в края на NP-кодиращата последователност. В едно педпочетено приложение промоторът представлява дългият краен повтор (LTR) от вируса на Ранс-саркоматa (RSV), който е силен транскрипционен промотор. По-предпочитан промотор е промоторът на цитомегаловируса с последователността за интронА (CMV-intA). Предпочитан транскрипционен терминатор е терминатора на генът за говеждия растежен хормон (BGH). На практика се предпочита к омб инацията лекарствени я от CMVintA-BGH. За да послужи при приготвянето на препарат, се предпочита в експресионния вектор допълнително да се включи също и маркер за устойчивост към антибиотици. Могат да се използуват гени за ампицилинова устойчивост, гени за устойчивост към неомицин или веки дрнг маркер за устойчивост към антибиотици, който е приет във

Фармацевтиката. В предпочетено приложение на това изобретение генът за антебиотична устойчивост кодира генен продукт за устойчивост към неомицин. Освен това е целесъобразно векторът да съдържа начало за репликация и да е в голям брой копия, което при Ферментация в прокариотен организъм спомага за получаването

Фармацевтичния препарат

Тези преимущества предлага всеки един от многото прокариотни клониращи вектори, кои то могат да се закупят. В едно предпочетено приложение на това изобретение тези

Фннкционалности се предоставят от търговски достъпните вектори, известни като pUC. Желателно е от вектора да се отстранят несъществените

ДНК—поеледователности.

Т ака едно приложение на изобретението от pUC се отстраняват lacZ1 ас I—кодиращи те поеледователност и едно приложение се използува експресионни ят век тор pnRSV който като промотор се използува дългият краен повтор (LTR) на друго приложение се и зползувз

VI мутирал pBR322-eekтор, в който бяха клонирани

CMV-промоторът

BGH-транскрипционни ят терминатор. V1-NPконструкцията беше използувана за имунизация на мишки и индуциране на ЦТЛ—и, които предпазват от хетероложно заразяване.

В едно особено предпочитано приложение на това изобретение елементите на VI бяха комбинирани за получаване на експресионен вектор, наречен V1J. Във V1J се клонира ген на грипния вирус, такъв като ΝΡ-, РВ1-, NS1-, НА-, РВ2- или Ml-ген на A/PR/8/34. В едно следващо приложение генът за ампицилинова резистентност се отстранява от V1J и се заменя с ген за неомицинова резистентност, за да се получи на VIJ-neo (SEQ. ID:IB:, Фигура

7), в който беше клониран всеки един от поредицата различни гени на грипния вирне с цел използуването им в съгласие с това изобретение

В друго приложение пък векторът

VIJns, който е същият като

VIJ , с изключение на това рестрикционно място

S-fil в позиция

2114 на V1J—пео беше променено по генноинженерен път единично Kpnl-място.

Честотата, с която Sfi1-мястото се среща човешката геномна ДНК е много ниска (приблизително едно място на 100 000 бази). По такъв начи този вектор позволява да се подходи внимателно при интеграци ята на експресионния вектор в ДНК на гостоприеминика, просто чрез

Допълнително хидролиза на екстрахираната геномна ДНК с Sfil.

усъвършенствуваният вектор е V1R. От този вектор е отделено възможно най-голямото количество несъществена ДНК с цел получаване на високо компактен вектор. Този вектор е производен на VIJns и е показан на Фигура 36, (SEQ. ID.:45:). Той позволява да се използуват ио-големи инсерти при по—малко опасение от Факта, че се кодират нежелателни последователности и оптимизира приемането на ДНК от клетката при въвеждане на конструкцията, кодираща специфичните гени на грипния вирус в обкръжаващите тъкани. На Фигура 36, частите от VIJneo (Фигура 7), които са отделени, са показани като празнина, а включената последователност е с надебелен текст, като номерацията на VIJneo остава непроменена. Гореописаните процедури за разработване и модификация на векторите са проведени съгласно методите, известни на специалистите, работещи в тази област. Конкретинте продукти, обаче, които са описани, макар и получени чрез конвенционални методи, са специално приложими към конкретната цел, за която те са пригодени.

Въпреки че едно от приложенията на това изобретение включва грипния NP-ген, по-предпочитаните приложения включват

НА—ген,

РВ-ген, М-ген или NS—ген от по-неотдавнашни изолати на грипния вирне

Това се извършва чрез приготвяне на ДНК-копия на вирусните гени и клониране след това на индивидуалните гени

Последователностите за редица гени на многото щамове на грипния вирус сега са общодостъпни чрез ГЕННАТА БАНКА (GENBANK)(около

509 такива последователности за гени на грип А)

Така в това изобретение се предпочита всеки от тези гени, клонирани от неотдавнашните вирусни изолати Тексас , Пекин или

Панама, които са щамове препоръчвани от Центъта за Борба с

Болестта като желателни за противогрипните ваксини (виж FLU IMMUNE” грипна ваксина на Lederle, Physicians Desk

Reference, 1993, р!232 тривалентна ваксина от пречестен грипен повърхностен антиген съдържаща хемаглутининовия белтък от А/Тексас/ 36/91, H1N1

А/Пекин/353/89,

H3N2; и В/Панама/45/90) ?3а да се спази терминологията при описание на ДНК-конструкции те се следва следното правило

Наименование на вектора ген на грипния щам

По този начин конструкция , при която в експресионния вектор VIJneo е клониран NP-гена на A/PR/8/34, тнк е наречена

VIJneo-PR-NP

Естествено, тъй като етиологичният щам на ви руса се променя, може да се промени и прецизната структура на гена, който е оптимален за включване в лекарствения препарат.

Както е показано по-дола обаче, тъй като се индуцират отговори чрез цитотоксични лимфоцити, които са в състояние да предпазват от хетероложни щамове, за новите ваксини на това изобретение вариабилността на щамовете е по-малко критична, отколкото за ваксините на основата на цял вирус или в сравнение със енбединични те полипептидни ваксини

Освен това, тъй като лекарственият препарат се манипулира лесно в цел включване на новия ген, това е едно приспособление, което се прави с лекота чрез стандартните техники на молекулярната биология.

• ·

Последователността на нуклеопротеина е консервативна в различните грипни щамове, което се постига предпазване от последващо заразяване с вирулентен щам на грип А, който е хетероложен на щама, от кой то е бил клониран гена за нуклеопротеина. Сравнявания на NP от редица щамове на грип А не показа значителни различия във вторичната структура

СМ.

Gammelin et al., Virol

179, 71, 1989] и много малко изменения в аминокиселинната последователност [□

Gorman

Virol. 65, 3704,

1991]. За период от приблизително 50 години,

NP човешките щамове е еволюирал със скорост само 0 ,66 аминокиселинни замени на година. Нещо повече, нашите резултати, които показват, че ЦТЛ-и, специфични за А/НК/68, разпознават прицелни клетки , пнлси рани със синтетичен пептид ΝΡ (147-155), ни ято структура е изведена от последователността на

A/PR/8/34, посочват, че този

Η-ΣΚ⁰¹-специфичен

ЦТЛ-епи топ е запазил

Функционалната си цялост в продължение на 34 години виж Фигура

2)

Би трябвало да се отбележи също, че когато генът кодира вирусен повърхностен антиген, такъв като хемаглутинина или дори невраминидазата, се генерира знам и телен хнморален (ч рез антитяло) имунен отговор в допълнение към много важния отговор чрез цитотоксични лимфоци ти

Интрамускулното инжектиране на

ДНК—експресйонен вектор, , водеше кодиращ консервативен белтък от вътрешността на грип А до генерирането на значителен защитен имунитет срещи следващо заразяване с вирне. В частност се образуваха NP-специФИЧни антитела и първични ЦТД-и. Имунизирането с NP-ДНК водеше до понижаване на белодробните вирусни титри, потискане загнбата на тегло и повишена преживяемост в сравнение с контролите.

Защитният имунен отговор не беше опосредствнван от NP—специфични антитела, което беше видно от неспособността на NP-антителата сами (виж Пример 4) да се преборят с вирусната ин*екция и поради това вероятно беше резултат от NP-специФичен клетъчен имунитет. Нещо повече, образуваха се значителни количества първични ЦТЛ-и, насочени срещу NP. Защитата беше насочена срещу вирулентен щам на грип А, който беше хетероложен на щама, от който произлизаше клонираната ДНК. Освен това, инфекциозният щам се беше появил повече от три десетилетия след щама A/PR/8/34, което означава, че имунните отговори, насочени срещу консервативни белтъци, могат да бъдат ефективни въпреки антигенния шифт и дрейф на продукти на грипния вирне показва известна степен на консервативност и тъй като в отговор на вътреклетъчна експресия и ГКТС-процесинг могат да се образуват ЦТЛ-и, може да се предскаже, че и други гени на грипния вирус ще предизвикат отговори, аналогични на тези, постигнати с NP. Методи за идентифициране на имнногенните епитопи днес са добре известни [виж например Shirai et al., J. Immunol. 148:1657-1667, 1992; Choppin et al., J. Immunol. 147:575—583, 1991; Cal in—Laurens, et al., Vaccine 11:974-978, 1993]. И така, много от тези гени бяха клонирани, както се вижда от клонираните и секвенирани области на свързване в експресионния вектор (виж по-долн), по начин такъв, че тези констуркции да представляват профилактични агенти в достътна Форма.

Ето защо, това изобретение обезпечава експресионни вектори, кодиращи белтък на грипния вирне като имнноген. Изобретението разкрива способи за индуциране на кръстосан защитен имунитет срещу щамовете, без необходимостта от самореплициращи се агенти или адюванти. Освен това, имунизацията с ДНК разкрива редица дрнги предимства. Първо, този подход на ваксиниране би бил приложим при тнмори и инфекциозни агенти, тъй *

като CD8* Ц' процеса [К.

Поради това

ключов за

средство за

получаването

белтъци след

предизвикването трансформационния предпазване от на високи титри

-отговорът е важен

Tanaka et al., Annu на за тези два патоФизиологични

Rev. Immunol. 6, 359 (1988)] имунен отговор срещу белтък, процес, може да бъде ефективно рак и за имунотерапия

Второ, от антителата срещу експресираните инжектиране на вирусен белтък (NP или хемаглутинин) и на ДНК за човешкия растежен хормон [виж например D

Tang et al. , Nature

356, 152, 1992], означава, че това е лесен и високо ефективен начин за правенето на ваксини на основата на антитела, поотделно или в комбинация с ваксини на основата на цитотоксични

Т-лимфоцити, насочени срещу консервативни антигени

Лекотата, с която се получават и пречистват ДНКконструкции, удачно се сравнява с традиционното пречистване на белтъци, а това улеснява получаването на комбинирани ваксини

Така множество конструкции, например кодиращи

NP, НА,

Ml, РВ1,

NS1 или всеки друг от гените на грипния вирус, могат да бъдат приготвени, смесени приложени конбинирано. И накрая, тъй като след инжектирането на ДНК белтъчната експресия се запазва [Н

Lin et al

Circulation 82,

2217 (1990); R.N

Kitsis et al

Proc. Natl

Acad. Sci. (USA)

88, 4138 (1991); Е

Hansen et al

FEBS Lett

290, 73 (1991); S

Jiao et al., Hum.

Gene Therapy 3 (1992);

J.A. Wol-f-f et al

Human Mol . Genet

1, 363 (1992)] персистенцията на 0- и Т-клетъчната памет може

Gray and Р. Matzinger, J. Exp. Med. 174, 969 (1991); S

Oehen et al. , ibid. 176,

1273 (1992)], предизвиквайки чрез това дългоживнщ хнморален и клетъчно—опосредствуван имунитет

Сегашните ограничения на лицензирани те грипни ваксини подчертават необходимостта от разработването на по-еФективни способи за предпазване от инфекция и за потискане на заболяването. По-старите ваксини осигуряват ограничена защита, е*ективни са само срещу някои отделни щамове на вируса и губят своята ефективност след кратък период. Поради това, за да са ефективни, сега прилаганите ваксини трябва да се съставят наново всяка година. Образуването на подобрен ЦТЛ-отговор срешу вътрешните белтъци вероятно би довел до значително продължителен, кръстосано реагиращ имунитет, какъвто сега не се предизвиква от лицензираната ваксина.

Ние показахме белтъчна експресия от ПНВ-конструкции в мишки, порове и примати (без хората) чрез установяване в гостоприемника на имунен отговор, насочен срещу грипните антигени. Инжектирането на мишки с ДНК, кодираща грипния NP (ннклеопротеин) доведе до повишена преживяемост, понижени титри на вируса в белите дробове и до по-малка загуба на тегло в сравнение с контролните животни на грипния вирус (щамове претъ включени в ДНК-конструкциите. понижено назално отделяне на ви ДНК, след заразяването им с резултати посочват, че защитата (шифт), настъпило в грипните ваксина, която включва гени, , след заразяване със снотипове рпяли шифт), различни от тези,

Ние наблюдавахме също така руси в порове, инжектирани с NPщамове, претърпяли шифт. Тези срещу голямо генно преустройство щамове, се подпомага от ДНК— кодиращи NP. Инжектирането на експериментални животни с НА-ДНК след заразяването им с вирусни щамове, претътпяли точкови мутации (дрейф), имаше за резултат по-значително понижаване на вирусното отделяне (в носния секрет). Прибавянето на ДНК, кодираща белтък от вътрешността на вируса, леко повишаваше степента на защита, наблюдавана след инжектиране само на НА-ДНК.

Имунният отговор срещу грипната ДНК беше проследяван в мишки в продължение на шест месеца след инжектирането.

които включваха по 10 мкг или по 100 мкг от всяка от петте конструкции. На основата на тези резултати може да се предскаже, че дози от 10, 50, 100 и

200 мкг

ДНК ще са ефикасни при хората

Предпазването от инфекция чрез лицензирана, инакт иви рана и мукозата, насочени срещу НА, но не корелира с отговорите чрез антитела към вътрешните грипни белтъци. Поради това НА трябва да бъде включен в разработката на противогрипната ДНК-ваксина. Имунният отговор към NP, обаче, усилва отговора чрез антитела към

НА, а вътрешните грипни белтъци предизвикват ЦТА-отговор кой то реагира кръстосано с антигенно различни щамове на грипа беше отбелязано по-горе, експериментите с животни показаха също подобрена имуногенност и защита, случай че инжекциите включваха ДНК-конструкции, кодиращи както вътрешни белтъци, така и НА

Включвнето на ДНК-конструкции, кодиращи вътрешни белтъци, вероятно ще повиши ефективността на

ДНК-ваксината при хора. Тъй като дозировачните нива по всяка вероятност ще зависят от взаимодействията на тези компоненти едно рутинно тестиране ще позволи на специалистите да опрделят количеството ДНК, необходимо за направата на ваксина, представляваща смес от НА-,

NP- и М1-ДНК-констркнкции. Отговорът на гостоприемника към всеки от тези компоненти може да се измери поотделно, като се сравняват ти три те на инхибиране на хемаглутинацията (HI), неутрализирането на

НА—компонент и те и ЦТА-отговорите, насочени срещу Ml- и 1ЧР-епи топи те . Резултатите се сравняват с отговорите ч рез антитела, които се получават след инжектиране на коне т рукци и, които експресират само

НА

Тези изследвания позволяват да реакцията към се направи оценка на възможността за усилване на ваксина, съдържаща ДНК, кодираща както НА, така и вътрешни белтъци.

• ·

Проследявани бяха показателите персистенция на антителата,

ЦТ А-акт ивност и in νϊ νο защита. Повторното инжектиране на ДНК допълни телно повишаваше седмица с грипен щам от друг субтип и указваше на възможност за усилване на защитния клетъчно-опосредствуван имуни тет. Беше документирана също така и персистениция на антитела в Африкански зелени маймуни в продължение на най-малко една година след две инжектирания на НА-ДНК и в продължение на най-малко девет месеца след единично инжектиране на НА-ДНК

Резултатите от тези експерименти с животни посочват, ме директното инжектиране на ДНК предлага един по-добър метод за предпазване на хора от грипна инжекция и заболяване. Трябва да се отбележи, че експерименталната защита чрез инжектиране на ДНК беше получена, като бяха ваксинирани мишки и порове, които до този момент не са били инжектирани с грипен вирус. Възрастните хора, които ще се ваксинирант с ДНК, преди това ще са

Боледували от грип. След имунизация с ДНК-конструкции тези лица ще покажат дори по-силен имунен отговор, който е възможно да бъде и подългот раен

За да се оптимизират концентрациите, които да се използуват, различни дози бяха сравнявани за имуногеннос експерименти с малки бозайници отговори чрез антитела и чрез

ЦТА се индицираха с не повече от 1 мкг NP-ДНК. Имунизирането на маймуни

Резус с дози 100 и

1000 мкг НА-ДНК (A/PR/08/34) показа отговор чрез антитяло в 2 от животни, докато едно от две животни отговаряше на единична инжекция от 10 мкг. В отделни експерименти наивни Африкански

Зелени маймуни бяха инжектирани със смес от пет различни ДНК-конструкции, кодиращи НА от три вирусни субтипа, както и ДНК, кодираща NP и Ml от грипен А— вирус. Три от три маймуни във всяка група отговаряха на ваксини , • ·

Ефективността при хората се демонстрира чрез доброволци, които се инжектират с грипна

ДНК-ваксина, след което се заразяват интраназално, за да се определи ефективността на ваксината срещу сходни вирусни щамове, както среща грипни щамове от различен снбтип

Съставът, дозировката и схемата на приложение се основават на гореописаните изследвания

Клиничната ефективност заболяванията и продължителността на заболяването

Клиничните резултати се сравняват с лабораторната оценка за имунния отговор в гостоприемника и за отделянето на вирус в носния секрет, за да се определят подходящите маркери, които корелират със защитата.

Стандартните техники на молекулярната биология за приготвяне и пречистване на ДНК-конструкции правят възможно приготвянето на лечебните препарати на това изобретение, съдържащи ДНК. Тъй като стандартните техники на молекулярната биология са достатъчни за получаването на продуктите на това изобретение, специфичните конструкции, които са представени тук, обезпечават нови лекарствени препарати, които изненадващо предизвикват кръстосана защита срещу щамовете резултат непостижим преди това чрез стандартните ваксини от инак т иви ран цял вирус или от белтъчни субединици.

Количеството експресируема ДНК, предназначено за въвеждане в реципиента на ваксината, ще зависи от силата на транскрипционните и транслационните промотори, използувани в ДНК-констуркциите и от имуногенността на експресирания генен продукт.

Най-общо, директно в мускулната тъкан се прилага имунологично или профилактично ефективна доза от около 1 мкг до 1 мг, като се предпочитат от около 10 мкг до 300 мкг. Предвиждат се също и подкожно инжектиране, интрадермално въвеждане, ® · · · · · · ‘ *

·.· ··' ··* ··· вкарване през кожата чрез втриване, както и други начини на

приложение

като интраперитонеално, интравенозно или въвеждане

чрез инхалация. Предвижда се също така и провеждането на

подсилващи

ваксини ции.

ДНК може да бъде “гола, което означава неасоциирана с никакви Белтъци, адюванти или други агенти, които въздействуват върху имунната система на реципиента. В този случай е желателно ДНК да Бъде в разтвор, съвместим с човешката физиология, такъв като, но не само, стерилен Физиологичен разтвор или стерилен

Буфери ран

Физиологичен разтовр. Като алтернатива ДНК може да

бъда асоциирана с липозоми, такива като лектинови липозоми или други известни липозоми под Формата на ДНК-липозомна смес (виж за пример W009324640) или ДНК може да бъде асоциирана с адювант , за който е известно че усилва имунните отговори, такъв като

белтък или

друг носител. Подходящо е да се използуват също така

и агенти, които подпомагат приемането на ДНК от клетката, такива като, но не само, калциеви йони, вирусни белтъци и други агенти,

улесняващи	трансФекцията. Най-общо тези агенти се означават като
улесняващи	трансФекцията агенти и като Фармацевтично приемливи
носители.	Така, както е използуван тук, терминът ген се отнася

за сегмент нуклеинова киселина, който кодира дискретен полипептид. Термините лекарствен (лечебен) препарат и ваксина се използуват взаимозаменяемо за означаване на препарати, приложими за индуциране на имунни отговори. Термините конструкция и плазмид се използуват взаимозаменяемо. Терминът вектор се

използава

за означаване на ДНК, в която могат да се клонират

гени за ползиване съгласно метода на това изобретение.

Едно приложение на това изобретение съответно представлява метод за използуване на гени на грипния вирус с цел • · • · хемаглнтининовия ген на изолоата на човешкия грипен вирне

В/Панама/46/90 специфични приложения на това изобретение ДНКконстнркцията кодира ген на грипния вирне при което ДНКконструкцията е в състояние да се експресира след въвеждане в животински тъкани in viva и да предизвиква имунен отговор срещу експресирания продукт на кодирания грипен ген. Освен това, настоящото изобретение очевидно предвижда и комбинации, включващи такива конструкции с полиннклеотиди, кодиращи други антигени, неродствени с грипния вирус. Примерите за ДНК конструкции, кодиращи предпочитани грипни гени, включват:

а)	pnRSV-PR-NP
Ь)	Vl-PR-NP
с)	V1J—PR—NP, 5'-краят на конто e SEQ. ID:12:,
d)	V1J-PR-PB1, 5'-краят на която е SEQ. ID:13:,
е)	V1J-PR—NS, 5'-краят на която е SEQ. ID:14:,
f)	V1J-PR-HA, 5'-краят на която е SEQ. ID:15:,
д)	V1J-PR-PB2 5'-краят на която е SEQ. ID:16:,
h)	V1J-PR-M1, 5'-краят на която е SEQ. ID:17:,
i)	Vlneo—BJ—NP, 5—краят на която е SEQ . ID:2O: и 3 —
	краят на която е SEQ. Ю:21:,
J )	Vlneo-TX-NP, 5'-краят на която е SEQ. ID:24: и 3'-
	краят на която е SEQ. 10:25:,
к)	Vlneo—РА-НА, 5'-краят на която е SEQ. ID:26: и 3'-
	краят на която е SEQ. Ю:27:,
1 )	VIJns-GA-HA (А/Джоружия/03/93), големина на
	конструкцията 6,56 Кб, 5'-краят на която е
	SEQ. Ю:46: и 3'-краят на която е SEQ. Ю:47:,
m )	VIJns-TX-HA (А/Тексас/36/91), големина на

• * * · · конструкцията 6,56 КБ, 5'-краят на която е

SEQ. ID:48: и 3'-краят на която е SEQ. ID:49:

VIJns-PA-HA (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 6,61 Кб,

5'-краят на която е

SEQ. ID:50: и 3'-краят на която е SEQ. ID:51:

VUns-Βΰ— IMP (А/Пекин/353/89), големина на конструкцията 6,42 Кб, 5'-краят на която е

SEQ. ID:52: и 3'-краят на която е SEQ. ID:53:

ρ)

VlJns-BJ-Ml (А/Пекин/353/89), големина на конструкцията 5,62 Кб ,

5'-краят на която е

SEQ. ID:54: и 3'-краят на която е SEQ. ID:55:

q)

VIJns-PA-NP (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 6,54 Кб,

5'-краят на която е

r)

SEQ. ID:56: и 3'-краят на която е SEQ. ID:57t

VIJns-PA-Ml (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 5,61 Кб,

5'-краят на която е

Следващи те дефиниране на и 3'-краят примери изобретението на която е SEQ.

са приведени за допълнително , без то да се ограничава до специФиките на тези примери.

• · ·

• · · · • · · · « · · ·· · · • · · • · · ·

ПРИМЕРНО ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ПРИМЕР 1

ПРИГОТВЯНЕ НА ДНК-КОНСТРУКЦИИ, КОДИРАЩИ БЕЛТЪЦИ НА ЧОВЕШКИЯ ГРИПЕН ВИРУС

i) pnRSV-PR—NP: Генът A/PR/8/34 Беше изолиран от pAPR—501 [J.F. Young et al., in The Origin of Pandemic Influence Viruses. W.G. Laver, Ed. (Elsevier Science Puboishing Co., Inc., 1983)] като EcoRI-Фрагмент от 1565 базови двойки, запълнен с Klenow и клониран в Xabl-мястото на pRSV-BL, запълнено с Klenow и обработено с ФосФатаза. pRSV—BL беше конструиран като най-напред векторът pBL-САТЗ [В. Luckow and G. Schutz, Nuc. Acids Res. 15, 5490 (1987)] беше хидролизиран c Xho I и Neo I за отстраняване на CAT-кодиращата последователност, запълнен с Klenow и самолигиран. RSV—промоторният Фрагмент Беше изолиран като Nde I и АБр718-Фрагмент от pRshgrnx [V. Giguere et al., Nature 330, 6224 (1987)], запълнен c Klenow и клониран в Hind 11 I-мястото на междинния вектор, получен по-горе (pBL-CAT, несъдържащ САТпоследователността).

ii) 01—NP: Експресионният вектор VI беше конструиран от pCMVIEAKI-DHFR [Y. Whang et al., J. Virol. 61 1796 (1987)]. AKI- и

DHFR-гените бяха отстранени чрез срязване на вектора с EcoR I и самолиги ране.

Този вектор не съдържа интронА в CMV-промотора, който беше добавен като ПВР-Фрагмент с делетирано вътрешно Sac

I-място [в позиция

1855 съгласно номерацията в В.S. Chapman еt al., Nuc. Acids Res.

За ПВР-реакции те беше използувана матрицата pCMVintA-Lux, получена чрез лигиране на

Hindi II/Nhel Фрагмент от pCMV6a!20 [виж B.S. Chapman et al.,

Spring Harbor Laboratory Press, 1989)J. ДНК от ивицата на CsClградиент беше утаена с етанол и ресуспендирана в 0,97.

Физиологичен разтвор до концентрация 2 мг/мл за инжектиране.

ПРИМЕР 2

ТЕСТ ЗА ЦИТОТОКСИЧНИ Т-АИМФОЦИТИ CPEUIH ЧОВЕШКИЯ ГРИПЕН ВИРНС

Цитотоксични Т-лимфоцити бяха получени от мишки, които бяха имунизирани с ДНК или които Бяха преболедували от инфекция с Α/ΗΚ/6Θ. Контролни култури бяха получени от мишки, които бяха инжектирани с контролна ДНК или от неинжектирани мишки. Бяха приготвени суспензии от единични клетки, червените кръвни клетки

Бяха отстранени чрез лизис с амониев хлорид и клетките от далак бяха култивирани в RPMI 1640, допълнена c

107. Фетален Говежди

Серум (9rC=FBS),

100 Е/мл пеницилин, 100 мкг/мл стрептомицин

0,01

М HEPES (pH

7,5) и 2 мМ 1—глутамин. Равен

Брой хомоложни, облъчени стимулаторни клетки, пулсирани мин с Н-2К=»специфичния епитоп NP147-155 (Thr, Tyr, Gin, Arg

Thr

Arg, Ala,

Leu, Vai, SEQ. ID:9:) в концентрация 10 мкМ или бяха инжектирани с грип A/PR/S/34 (H1N1), бяха прибавени 10 Е/мл рекомбинантен човешки IL-2 (интерлевкин 2) (Cellular Products, Buffalo, NY) и културите бяха отглеждани 7 дни на 37°С при 57. СО^· и 1007. влажност. В отделни експерименти на мястото на автоложните стимулаторни клетки бяха добавени rhIL-2 (20 Е/мл) и Con А (2 мкг/мл). ЕФекторната активност на цитотоксичните Т-лимфоцити

Беше определена чрез Р815-клетки, белязани 3 часа с 60 мкКи ^=хСг/10* клетки и пулсирани, както по-горе с NP147—155 или инфектирани с грип А/Виктория/73 (H3N2). Контролните прицелни клетки (Белязани Р815-клетки Без пептид или вирус) не Бяха лизирани. Прицелните клетки Бяха посяти в 96-ямкови платета с кръгло дъно по 1 х ΙΟ·** клетки/ямка и инкубирани с еФектори за 4 часа в три повторения. Надстоящата течност (30 мкл) от всяка ямка беше отделена и преброена в сцинтилационен брояч Bet.apl.ate (LKB—Wallac, Turku, Finland). При всяко приготвяне на прицелните клетки бяха определяни максималните импулси, отделени при добавянето на 6 М НС1 и спонтанните импулси, освободени Без ЦТА. Процентът специфичен лизис беше изчисляван като [(експериментално - спонтанно)/(максимално - спонтанно)X100.

ПРИМЕР 3

ОБРАЗОВАНЕ НА (ЧР-СПЕЦИФИЧНИ ЦТА-и И АНТИТЕЛА IN VIVO

BALB/с-мишки бяха инжектирани в бедрения мускул и на двата крайника с плазмидна кДНК, кодираща A/PR/B/34-нуклеопротеина, транскрибиран или под проморора на вируса на Раус-саркомата или под промотора на цитомегаловируса.

Бяха използувани експресионните вектори:

i) pnRSV-PR-NP, виж Пример 1:

ii) V.1-NP, виж Пример 1.

Използуваните животни Бяха женс к и

BALB/с-мишки, получени от

Charles River

Laboratories,

Raleigh, (МС. Мишките бяха получени на 4-5-седмична възраст и първоначално Бяха инжектирани с ДНК на

5-Д-седмична възраст.

Ако специално не е отбелязано, инжектирането на ДНК беше проведено в Бедрените мускули на двата крайника, като всеки крайник Беше инжектиран с 50 мкл стерилен

Физиологичен разтвор, съдържащ 1ОО мкг ДНК. На мишките Бяха проведени 1, или 3 серии от инжекции на 3—седмични интервали.

Негативните контролни животни не Бяха инжектирани или Бяха инжектирани със съответния празен” вектор, несъдържащ иначе включения NP-ген.

Наличието или отсъствието на NP-плазмидна ДНК в мускалите на отбрани животни беше анализирано чрез ПВР (Фиг. 1).

Плазмидна ДНК (NP—ДНК или луциФеразна ДНК) беше установена в 44 от 48 тестирани инжектирани мускули

В мишки, инжектирани с луциФеразна ДНК, белтъчната експресия беше демонстрирана чрез луциФеразната активност, получена в мускулни екстракти, съгласно методи, известни в тази област [J.A. Wolff et al., Science 247,

1465 (1990); G. Ascadi et al., Nature 352,

Н. Lin et al., Circulation 82

2217 (1990); R.N

Kitsis et al. ,

Proc .

Natl

Acad

Sci. (USA)

08, 4138 (1991); Е

Hansen et al

FEBS

Lett. 290, (1991);

S. Jiao et al , Hum

Gene Therapy 3, 21 (1990); J.A

Wolff et al., Human Mol

Genet

1, 363 (1992)j

Експресията на

NP в мнскнлите след инжектиране на NP-ДНК беше под границата за детекция чрез имуноблот—анализ но беше показана чрез образуването на NP-специФични ант и тела (виж Фиг. 2). За анализ на образуването на NP-специФични ЦТЛ далаците бяха отстранявани 1-4 седмици след имунизацията и клетките от далак бяха рестимулирани с рекомбинантен човешки IL2 плюс автоложни клетки от далак, които бяха или инфектирани с грип A (A/PR/8/34) или пулсирани с нуклеопротеинов

Н-2К*специфичен пептиден епи топ (NP-остатъци

147-155 виж

0.К.Rotzscke et al., Nature 348, 252 (1990)). Клетки от далак, pec т имули рани със сингвнни клетки, инфектирани с вирус или пулсирани с епитоп, бяха способни да убиват прицелни клетки, пулсирани с нуклеопротеиновия епитоп

Това означава, че i инжек т и ране на NP-ДНК водеше до образуването на съответния NPпроизводен пептид във връзка с

ГКТС, клас I индукция на специфичния

ЦТЛ-отговор

Тези

ЦТЛ-и бяха в състояние да разпознават и лизират прицелни клетки, инфектирани с вирне, (Фиг. ЗВ), или прицелни клетки, пнлсирани е нуклеопротеинов пепдтиден Н—2К^с1—специфичен епитоп и прицелни клетки, инфектирани с вирне. Това показва както тяханата специфичност, така и тяхната способност да детектират епитопи, които естествено се образнват в инфектираните клетки.

По-строго измерване на имнногенността на NP-ДНКактивирани чрез въздействие е Con А и IL-2, но не претърпяваха in vitro рестимнлиране с клетки, експресиращи антиген, преди да бъде тестирана тяхната способност да убиват съответните прицелни клетки. Когато спленоцити от мишки, имунизирани с NP-ДНК, се активират с Con А и IL-2 без антиген-специфична реетимнлация, те лизират прицелни клетки, пнлсирани с епитоп, както и прицелни клетки, инфектирани с вирне (Фиг ЗС и D). Тази литична активност и на рестимнлираните и на активираните клетки от далак, удачно се сравнява с тази на спленоцити, обработени по подобен начин и получени от мишки, които предварително са били инфектирани с грип А/НК/68, вирулентен, адаптиран в мишки H3N2-ujaM, който е възникнал 34 години след A/PR/8/34 (Hi.Nl). И така, инжектирането на NP-ДНК водеше до образуването на ЦТЛ, които бяха специфични за наклеопротеиновия епитоп и които бяха способни да идентифицират естествено процесирания антиген (например, биха могли да убиват клетки, инфектирани с вирус). NP-специФични ЦТЛ бяха образувани също и в СЗН- и Вб-трансгенни мишки, експресиращи човешки HLA-A2.

NP-ЦТЛ бяха установени в далаци на BALB/с-мишки, инжектирани с не повече от една доза от 1 мкг NP-ДНК (найниската тестирана доза) (Таблица 3-IV):

Таблица 3—IV

ЦТА-ОТГОВОРИ	1 В МИШКИ	САЕД ИНЖЕКТИРАНЕ НА ЕДИНИЧНА ДОЗА NP-ДНК
инокнлнм	доза	7. специфичен		sd
	(мкг )	лизис	(стандартно	отклонение)
NP-ДНК	400	52,5		10,7
	400	80,4		10,3
NP-ДНК	200	75,6		5,4
	200	44,6		4,4
NP-ДНК	100	76,7		2,9
	100	35,6		8,9
NP-ДНК	50	62,9		0,6
	50	76,7		7,4
NP-ДНК	10	83,2		10,1
	10	37,7		2,5
NP-ДНК	1	44,2		0,3
	1	13		2
Контролна ДНК	100	4,9		1
Г рипен вирус		79,9		8,3

Таблица 3—IV: Женски BALB/c—мишки (4-6-седмични) бяха

инжектирани	с единична доза A/PR/34 NP-ДНК (V1JNP) или с
посочената	доза контролна ДНК (V1J). За сравнение, мишки бяха
инжек т и рани	с грипния вирне A/PR/34. ЦТ А бяха получени след 8

седмици, рестимнлирани in vitro със сингенни клетки от далак,

пулсирани с

NP-пептид и определени срещн ΡΘ15—клетки, пнлсирани

с NP-пептид при съотношение е*ектор:прицелни клетки 50:1.

Данните са представени като 7. специфичен лизис за представителни индивиди мишки.

Следващите	експерименти показаха, че мишки, които бяга
инжектирани	с 1 доза от 1 мкг NP-ДНК, съхраняваха NP-ДНК за най-
малко 4,5	месеца (най-късната тестиране времева точка).

Порядъците на ЦТЛ-отговори те след инжектиране на ДНК бяха сравними с тези в мишки, инжектирани с грип. Би трябвало да се отбележи, че анализът на ЦТЛ след рестимулиране с антиген in vitro не е строго количествен. Поради това понастоящем ние разработваме тестове на лимитиращите разреждания, за да определим по-количествено нивата на NP-специФИЧни ЦТЛ в мишки. В мишки, които бяха инжектирани с 3 дози от по 100 мкг NP-ДНК, бяха установени ЦТЛ-отговори най-малко Ь месеца след имунизацията (Фигура 19). Ето защо, една грипна ПНВаксина притежава потенциала да генерира дългоживущи ЦТЛ-отговори срещи консервативните грипни антигени.

Инжектирането на мишки с

NP-ДНК водеше до образуването на високи титри от анти-NP IgG (Фиг.2)

Смята се, че образуването на висок титър IgG-антитела в мишки изисква CD4+ Т487 (1990); J.J. Donnelly et al., J. Immunol. 145, 3071 (1990)). Това показва, че NP, експресиран от плазмид in situ беше процесиран за представяне от двата класа - клас I и к-лас II на

ГКТС.

ПРИМЕР 4

ЗАЩИТА НА МИШКИ СЛЕД ЗАРАЗЯВАНЕ С ВИРУЛЕНТЕН ЧОВЕШКИ ГРИПЕН

ВИРУС:

Ролята на NP-антителата в защитния имунитет към грипа е показана чрез два подхода: Първо, белодробните винрсни титри бяха определени в експеримент по пасивен пренос. Женски BALB/cмишки на възраст > 10 седмици бяха инжектирани интраперитонеално с 0,5 мл обединен серум (разреден с 2,0 мл PBS) от мишки, които бяха инжектирани три пъти с по

200 мкг NP-ДНК

Контролни мишки бяха и нжек т и ран и с равен обем серум, събран от нормални мишк и или с обединен сернн от мишки, които бяха преболедували от ин*екция с Α/ΗΚ/6Θ, също в

2,0 мл PBS. Дозата от Α/ΗΚ/6Θ—имунния серум беше така подбрана, че ELISA-титърът на анти-NP антитялото в мего беше равен на титъра в обединения серум от мишките, инжектирани с

NP-ДНК

Неанестезирани мишки бяха заразени на сляпо с IO* ТСЮво от А/НК/68 2 часа след инжектирането на дни по-късно беше направена допънителна инжекция серума, като

с равен	обем серум.	Мишките бяха	умъртвени	би 7 дни	след
инфекцията	и белодроб	ните титри	на	вируса в	TCIDeo на мл	бяха
определени	, както е	описано от	Morgan [J.	Immunol. 146,	321 ,

1991].

В наивни мишки беше влят анти-NP антисерум, получен от мишки, които бяха инжектирани с NP-ДНК и след това заразени с А/НК/68. Вирусните заразявания бяха извършвани с щам А/НК/68, адаптиран в мишки и впоследствие съхраняван чрез пасиране in vivo в мишки (Dr. I. Mbawuike, лична кореспонденция). Вирусният концентрат за инфекция, който се използуваше, представляваше хомогенат на бели дробове от инфектирани мишки и имаше инфекциозен титър 5x10® ТСЮво/мл, тестиран върху MDCK—клетки.

За определяния на белодробните вирусни т и т ри за изследвани я върху загубата на тегло, заразяванията с вирус бяха извършвани насляпо чрез интраназално накапване на мкл съдържащи 10^А носовете на неанестезирани мишки което води до прогресивно инфектиране на белите дробове с вирус, но не е летално за

BALB/с-мишки

С Yetter

R.A

Infect

Immuni ty

29, 654, 1980]. В експериментите по заразявани чрез накапване на 20 мкл, преживяемост мишките бяха съдържащи 10⁼-^sTCID_eo, в носовете под пълна упойка с кетамин и ксилазин; инфекцията на *

«г анестезирани мишки с тази доза причинява бърза белодробна инжекция, която е летална за 90-1007.

от неимннизирани те мишк и [J.L.

Schulman and E.D. Kilbourne, J

Exp. Med. 118, 257,

1963;

G.H

Scott snd

R. J

Sydiskis, Infect

Immunity 14, 696

1976;

R.A

Yetter et <з2. ,

Infect

Immunity

29, 654,

1980]

Белодробните вирусни титри бяха определени ч рез сери й но титруване върху MDCK-клетки (получени от ATCC, Rockville, MD) в

96-ямкови платета, както е описано от Moran et al., [ibid]

Не беше наблюдавана редукция на белодробните вирусни ти три в мишки, които бяха инжектирани с анти—NP антисерум (6,3 средна стойност ± SEM;

п=4) в сравнение с контролните мишки, които Бяха инжектирани с нормален серум (6,1 ± 0,3;

средна стойност ±

SEM; п=4). За положителна контрола беше събран серум от мишки, инжектирани с

Α/ΗΚ/6Θ, и пренесен пасивна в четири мишки

След заразяване с Α/ΗΚ/6Θ не се установяваше инжекция в техните бели дробове, което означаваше, че този серум срещу цял вирус беше напълно предпазващ от заразяване хомоложни я вирус

Второ, наивни мишки бяха имунизирани пречистен

NP (5 мкг/крайник в продължение на период от седмици) ч рез

i.m.-инжектиране

Тези мишки образуваха висок титър

NP—специфични антитела, но не образуваха

НП-специФични ЦТЛ-и и не бяха защитени от леталната доза на вируса. Ето защо, за разли ка на антителата срещу цял вирус, циркулиращите анти-NP IgG не жормират защитен имунитет в мишките

Защитната ежективност in vivo на NP-ДНК инжекциите беше оценена, за да се определи , дали клетъчно-опосредствуваният имунен отговор е Функционално значим. Едно директно измерение на ефективността на имунния отговор беше способността на мишките, имунизирани предварително с NP-ДНК да отстранят прогресивната, сублетална белодробна инфекция с хетероложен щам на грипа (А/НК/68;

H3N2)

Заразяванията с вирус бяха извършени, както е описано по-горе

Мишки, имунизирани с NP-ДНК, след заразяването имаха белодробни вирусни титри, които на 7-ия ден бяха три порядъка по-ниски (1,0 ±1,0; средна стойност ±

SEM; п=4) отколкото тези на контролните мишки, които не бяха имунизирани (4,1 ± 0,3; средна стойност ±

SEM; п=4) или кои то бяха имунизирани с празен вектор (4,5 ± 0,0; средна стойинст ± SEM;

Фактически три от четири имунизирани мишки имаха недетектируеми нива на вируса в белите дробове, докато нито една от контролите в този момент не се беше преборила с вируса

Същественото различие в белодробните вирусни титри, наблюдавано в този експеримент и в шест други показва, че имунният отговор ускорява унищожаването на вируса

Липсата на ефект с контролата от празен вектор, потвърждава, че ДНК сама по себе си не е отговорна за имунния отговор. Нещо повече, тъй като заразяващият щам на вируса, А/НК/68 (вирулентен H3N2—щам, адаптиран в мишки) беше хетероложен на щама A/PR/8/34 (H1N1) , от който беше клониран NP-гена, имунитетът очевидно беше хетеротипен.

Като мярка за индицираното от вируса заболяване беше отчитана загубата на маса в мишки, кои то бяха инфектирани сублетално с грип

Α/ΗΚ/6Θ след имунизация с

NP-ДНК (Фиг. 4)

Като контроли бяха и зползувани неинжекти рани мишки или мишки, инжектирани с празен вектор

Мишките , имунизирани с NP-ДНК, на тегло по-бързо възвръщане на първоначалното тегло след инфекция грип А в сравнение контролните мишки.

Интраназалната инфекция на общоанестезираните мишк и грип А предизвиква бърза прогресираща репликация на вируса белите дробове и смърт за 6 до 8 дни ако инфекцията не се овладее (R.A. Yetter et al.. Infect

Immunity 29, 645 (1980))

Преживяването на заразените по този начин мишки отразява тяхната способност да ограничат тежестта на една вкатна белодробна инфекция. Изследвана беше способността на мишките да преживяват заразяване с два различни грипни щама,

Α/ΗΚ/6Θ (виж

Фиг . 5) и

A/PR/34 степен на

Мишките, предварително имунизирани с NP-ДНК, показаха преживяемост 907. в сравнение с мишките, инжектирани а празен вектор

07.

и с неинжектираните контролни животни

207.

(Фиг

5)

В общо такива експеримента преживяемостта на мишк и те, инжекти рани с NP-ДНК, беше поне 507.

по-висока от тази на контролите така , способността на имунния отговор, индициран с NP-ДНК, потисне заболяването, предизвикано от друг вирусен щам, възникнал години по-късно, подкрепя логичност та на постановката, да се използвва консервативен белтък за предизвикване на отговор чрез цитотоксични Т-лимфоцити.

ПРИМЕР 5

ИЗОЛИРАНЕ НА ГЕНИ ОТ ИЗОЛАТИ НА ГРИПНИЯ ВИРНС

Много от по-старите щамове на грипния вирус са депозирани в АТСС (каталогът на животински вируси и антисернми, хламидии и рикетсии, 6—то издание, 1990 г. наброява 20 щама грип А и 14 щама грип В).

А. Вирусни щамове_и пречистване;

Грипните щамове, включени във ваксината за текущия (1992) грипен сезон, бяха получени от Dr. Nancy J. Cox от Отдела за Вирусни и Рикетсийни болести, Център за борба с инфекциозните болести, (H3N2);

Атланта, Джорджия. Тези щамове са: (1) А/Пекин/353/89 (2) А/Тексас/36/91 (H1N1); (3) В/Панама/45/90; и (4)

А/Джорджия/03/93

Всички тези вируси бяха култивирани ч рез препосяване в 9до 11-дневни пилешки емброни (с изключение на щама А/Джорджия, който беше култивиран в MDCK-клетки), като за получаването на даден вирусен препарат се използуваха пилешки яйца. Вирусите бяха пречистени по модиФикация на метода, описан от Massicot et al. (Virology

1Ο1,

242-249 (1980)).

Накратко, вирусните суспензии бяха очистени от примеси чрез центрофугиране при

000 об/мин за часа в

Beckman-ротор, тип

19. Утаеният вирус се ресуспендираше в STE-буФер (0,1 М NaCl , 20 мМ Tris, pH 7,4, мМ ЕДТА) и центрофугираше 10 мин при

4000 об/мин за отстраняване на агрегатите (центрофуга Hermle Z

360 от надстоящата течност се надслояваха върху прекъснат захарозен градиент, състоящ се от 2 мл 60% захароза, надслоена със 7 мл

307. захароза, брФерирани със STE, и се центрофугираше минути при 36 000 об/мин (ротор SW-40, Beckman). Натрупаният в интерфазата вирус беше отделен, разреден десетократно със STE и утаен чрез центрофугиране часа при 30 000 об/мин (ротор Ti45, Beckman).

Утаеният вирус се замразяваше при -70°С.

В. Екстракция на виднснa РΗ К и синтеза на кДНК се пречистваше от замразения вирус чрез екстракция c гуанидин изотиоцианат при използуване на търговски набор (Stratagene, La

Joi 1 a ,

СА) по метода на Chomczynski и

Sacchi (Anal. Biochem. 162, (1987)). Двойноверижна комплементарна ДНК (кДНК) беше приготвена от вирусната РНК чрез използуване на търговски достъпен набор реагенти за синтеза на кДНК (Pharmacia) съгласно указанията на Фирмата-производител)) с някои модификации. Първата верига на кДНК беше синтезирана чрез • · * « използуване на олигодезоксирибоннклеот ида,

5'-AGCAAAAGCAGG-3',

SEQ

ID s 30 като праймер, който е комплементарен на една консерва!ивна последователност, разположена в

3'-края на вирусната PHK при всички гени на А-щама

Тази последователност е обща за всички РНКи на грипните вируси от тип А и следователно предоставя метод за клониране на който и да е ген на грипните на кДНК, търговския щам А. След синтезата вместо да се набор реагенти, на първата и на втората вериги продължи съгласно указанията към екстрахирани с Фенол/хлороФорм завършващи с тъпи краища, бяха векторите

VIJneo и ли продуктите на реакцията бяха и утени с етанол

Тези кДНКи, след това

VI Jns, кои то рестриктазата Вд111 , краищата им изравнени обработени с телешка

За подбиране синтетични директно лигирани във бяха разградени с Т4 ДНК полимераза чревна алкална ФОСФатаза на пълноразмерни вирусни гени използувахме олигодезоксирибонуклеотиди, чиято първична с трнк тура комплемент арна на

3'-края на бъде беше планирано да

транслационната отворена рамка з
ген. Проби ,	които	, по данните <
определянето	на	размера чрез 1
изглеждаше	че	преде т авляват
вериФицирани	чрез	секвениране по
на вирусния	ген ,	свързващи го <
последователности	за всеки ген,

с представени по-долу в Пример а четене на съответния вирусен от рестрикционното картиране и електрофореза в пълноразмерни дидезокси-метода вектора от агарозен гени , на двата бяха края

VIJneo. Свързващите клониран от тези виурси, са

Сходни стратегии бяха използувани за клониране на кДНКи всички посочени по-горе вируси изключение на

В/Панама/45/90, който няма общи последователности в двата края на вирусната РНК. В този случай като праймери за синтезата на

	• * • « «	* · ·	* * • ·	«« · ·· • ·	• · · «
				61
първата верига кДНК	беше	използувана
олиг	одезоксирибонвклеот иди	. Тези	праймери	са:
( 1)	5'	-AGCAGAAGCGGAGC-3',	SEQ.	ID:31:	за	РВ1	и РВ2;
(2)	5'	-AGCAGAAGCAGAGCA-3',	SEQ.	ID:19:	за	NS и	НА;
(3)	5'	-AGCAGAAGCACGCAC-3',	SEQ.	ID :22:	за	М; и
(4)	5'	-AGCAGAAGCACAGCA-3',	SEQ.	ID :23:	за	NP .

За гени, които бяха клони рани чрез ПВР, разтворът, съдържащ кДНК с подравнени краища, беше използуван директно като ДНК-матрица в полимеразната верижна реакция (ПВР). За клониране на шестте грипни гена чрез ПВР бяха използувани следните праймери:

1. НА-ген от А/Джорджия/03/93 сенз-праймер [праймер от смислената (значеща) верига в ДНК]:

SEQ. ID133:

5'-GGT АСА ACC ATG AAG ACT ATC ATT GCT TTG AGC-3' антисенз-праймер [праймер от веригата, комплементарна (противоположна) на сенз-веригата в ДНК];

SEQ . ID:34:

5' -CCA CAT AGA TCT TCA AAT GCA AAT GTT GCA CCT AAT G .___НА-ген от A/Tekcac/36/91 сенз-праймер; SEQ. ID:35:

5’-GGT ACA ACC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TG-3' антисенз-праймер: SEQ. ID:36:

5'-CCA CAT TCA GAT GCA TAT TCT ACA CTG CAA AG-3'

3. НА-ген одт В/Панама/45/90 сенз-праймер: SEQ. ID:37:

5'-GGT АСА ACC ATG AAG GCA АТА антесенз-праймер:SEQ. ID:38:

5'-CCA CAT TTA TAG АСА GAT GGA

4. Ml-ген от А/Пекин/353/89 сенз-праймер: SEQ. ID:39:

5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG CTT антесенз-праймер:SEQ. ID:40:

5’-CCA CAT AGA TCT TCA CTT GAA

5. NP-ген одт В/Панама/45/90 сенз-праймер: SEQ. ID:41:

5’-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TCC антесенз-праймер:SEQ. ID :42:

5'-CCA CAT GGA TCC TTA ATA ATC

6. Ml-ген одт В/Панама/45/9Ο сенз-праймер: SEQ. ID:43:

5'-GGT ACA GGA TCC ACC ATG TGC антесенз-праймер:SEQ. ID:44:

5'-CCA CAT GGA TCC TTA TAG GTA

ATT GTA CTA CTC ATG-3'

GCA AGA AAC ATT GTC-3'

CTA ACC GAG GTC-3'

CCG TTG CAT CTG CAC-3'

AAC ATG GAT ATT GAC GGC-3'

GAG GTC ATC ATA ATC CTC-3'

CTG TTT GGA GAC ACA ATT GCC-3'

TTT CTT CAC AAG AGC TG-3'

Всички клонирани гени на грипните вируси, получени било ч рез синтеза на кДНК или чрез ПВР, бяха верифицирани чрез секвениране местата на лигиране на гена с вектора, както и чрез експресия на гена в трансФектирани RD-клетки. Експресията се установяваше чрез имннодот.

Конструкциите NP и Ml, представителни за щама A/H3N2 (вектори 4 и 5), бяха направени от гени на А/Пекин/353/89. Тези гени бяха избрани поради очакваната висока степен на консервативност и за двата гена (NP и Ml), както и поради тяхната достъпност.

Въз основа на гореспоменат ите изследвания, за получаването на ваксина бяха комбинирани 7 експресионни вектора от особено предпочетена група, която включва:

1. VlJns-HA (А/Джорджи я/03/93) ·>

Кб

2. VIJns-HA (А/Тексас/36/91)

Кб

3. VIJns-HA (В/Панама/45/90)

Кб

4. VIJns-NP (А/Пекин/353/89)

6,42

Кб

5. VIJns-Ml (А/Пекин/353/89)

КБ

6. VlJns-NP (В/Панама/45/90)

Кб

7. VIJns-Ml (В/Панама/45/90)

Кб.

Съответните последователности за областите на свързване на тези гени експресионните вектори са дадени се докаже, че действително е клониран коректният ген, е нужно да бъдат секвенирани само малки части от конструкцията.

Чрез сравняване със сходни гени, чиято структура е позната, е лесно да се потвърди, че даденият

Например, последователността за НА-гена на щама A/Tekcac е много сходна със секвенцията на НА-гена на щама А/Киев/59/79, която секвенци я е на разположение в GENBANK nog ключов номер Μ3835Θ.

Същото с последователността за НА-гена на щама В/Панама, която много сходна с НА-секвенцията на щама

В/Англи я/222/82, която на разположение в GENBANK под ключов номер Μ183Θ4. По подобен начин може да се установи и потвърди идентичността на която да е клонирана последователност за даден ген от който и да е човешки грипен вирус. Във всички представени по-долу слнчаи присъствието на целия ген беше потвърдено както чрез 5' секвенцията, така и чрез 3'-секвенцията

При всеки случай, последователността ATG, означена с плътен шриФТ, показва старткодона на съответния ген на грипния вирус, а означеният с плътен шрифт триплет в 3'-областта представлява стоп-кодонът (TGA, респ. ТАА)

1.VIJns-HA (А/Джорджия/03/93)6,56 Кб

5'

Последователност: (SEQ. ID:46:) . TCA CCG ТСС ТТА

GAT C/GG TAC AAC CAT GAA

GAC TAT CAT TGC

ТТТ

GAG CTA CAT TTT ATG

TCT GGT TTT CGC.

3'

Последователност (SEQ. ID; 47·.) .TCA TGC

TTT

TTG

СТТ TGT GTT GTT TTG CTG

GGG TTC ATC ATG

TGG

GCC TGC CAA

AAA

GGC

AAC ATT AGG TGC AAC ATT TGC ATT TGA А/БА

TCT

ATG TGG GAT CTG CTG ТБС...

2. VlJns-HA (A/Tekcac/36/91) 6,56 Κδ:

5' Последователност; (SEQ. ΙΡ;48;)

...TTA GAT C/GG AAC ATG AAA GCA AAA CTA CTA GTC CTG TTA TGT GCA TTT ACA GCT ACA TAT GCA...

3' Последователност; (SEQ._____ID;49;)

...CTG GTG CTT TTG GTC TCC CTG GGG GCA ATC AGC TTC TGG ATG TGT TCT AAT GGG TCT TTG CAG TGT AGA ATA TGC ATC TGA ATG TGG /GAT TG CTG TGC CTT...

3. VIJns-HA (В/Панама/45/90) 6,61 Κδ :

5' Последователност; (SEQ. ID;50;)

...CCT TAG АТС/ GGT ACA ACC ATG AAGGCA ATA ATT GTA CTA CTC ATG GTA GTA ACA TCC AAC GCA GAT CGA ATC TGC ACT GGG ATA ACA TCT TCA AAC TCA CCT CAT GTG...

3J_ Последователност ;.....(SEQ. ID; 51; )

...TTG GCT GTA ACA TTG ATG ATA GCT ATT TTT ATT GTT TAT ATG GTC TCC AGA GAC AAT GTT TCT TGC TCC ATC TGT CTA TAA ATG TGG /GATB CTG CTG TGC CTT. . .

4. VIJns-NP (А/Пекин/353/89) 6,42 Κδ:

5' Последователност: (SEQ.__ID:52:)

...GTC CTT AGA TC/C ACC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGCCAG AAT GCA ACT. ..

3' Последователност ;__( SEQ .__ID;53;) • · όό

...GAA AAG GCA ACG AAC CCG ATC GTG CCC TCT TTT GAC ATG AGT AAT GAA GGA TCT TAT TTC TTC GGA GAC AAT GCA GAA GAG TAC GAC AAT TAA G/GA TCT GCT GTG CCT...

5. VIJns-Ml (А/Пекин/353/89) 5,62 Κδ:

5' Последователност:(SEQ,r

...CTT AGA ТС/С AGA TCT ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG TAT GTT CTC TCT ATC GTT CCA TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAA ATC GCG CAG AGA CTT GAA GAT GTC TTT GCT GGG AAA AAC ACA GAT...

'___Последователност :___( SEQ. ID;55:)

...GGG ACT CAT CCT AGC TCC AGT ACT GGT CTA AAA GAT GAT CTT CTT

GAA AAT TTG CAG ACC TAT CAG AAA CGA ATG GGG GTG CAG ATG CAA CGG

TTC AAG TGA AGA TCT ATG TGG/ GAT CTG CTG TGC CTT...

6. VlJns-NP (В/Панама/45/90) 6,54 Κδ:

5' Последователност; (SEQ.____ID;56;)

...CTT AGA TC/C ACC ATG TCC AAC ATG GAT ATT GAC GGT ATC AAC ACT GGG ACA ATT GAC AAA ACA CCG GAA GAA ATA ACT TCT. . .

3'Последователност; (SEQ. ID;57;)

...GTT GAA ATT CCA ATT AAG CAG ACC ATC CCC AAT TTC TTC TTT GGG AGG GAC ACA GCA GAG GAT TAT GAT GAC CTC GAT TAT TAA G/GA TCT GCT GTG...

7. VIJns-Ml (В/Панама/45/90) 5,61 Κδ;

5' Последователност; (SEQ._____ID;58:)

...СТТ AGA ТС/С АСС	ATG	TCG CTG ТТТ	GGA GAC	АСА	ATT	GCC	TAC	CTG
СТТ ТСА TTG АСА GAA	. GAT	GGA GAA GGC	AAA GCA	GAA	CTA	GCA	GAA	AAA
ТТА...
3' Последователност:	(SEQ. ID:59: )
...AGA ТСТ СТТ GGG	GCA	AGT CAA GAG	AAT GGG	GAA 1	GGA	ATT	GCA	AAG
GAT GTG ATG GAA GTG	СТА	AAG CAG AGC	TCT ATG	GGA	AAT	TCA	GCT	CTT
GTG AAG AAA ТАС СТА	ТАА	G/GA TCT GCT	GTG...
		ПРИМЕР 6
ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР	V1J ,	SEQ. ID:10:
Нашата цел	при	създаване <	на експресионния	вектор	V1J

беше да се отстранят от нашия вектор, VI, промоторът и последователностите за терминация на транскрипцията, с оглед да се създаде един по-компактен вектор и да се увеличи добивът от пречистен плазмид.

V1J е производен на векторите VI и на търговски достъпния плазмид pUCIG. VI беше обработен с рестрйкционните ензими SspI и EcoRI, при което се получават два Фрагмента ДНК. По-късият Фрагмент съдържа промотора на цитомегаловируса (CMVintA) и елементите за завършване на транскрипцията на гена за говеждия растежен хормон (BGH), които регулират експресията на хетероложни гени ( SEQ . ID:11:). Този Фрагмент беше пречистен от агарозен гел след електрофореза. След това краищата му бяха подравнени чрез използуване на Т4 ДНК полимераза с оглед да се улесни неговото лигиране към друг ДНК-Фрагмент с тъпи (подравнени) краища.

Плазмидът pUClQ Беше избран, за да Формира скелета на експресионния вектор. Известно е, че този плазмид дава висок

6Θ добив, охарактеризиран е добре по отношение на първична структура и Функция и е с малък размер.

Чрез частично смилане с реетрик тазата

Haell ние отстранихме от този вектор целия lac— оперон, който не беше необходим за нашите цели и можеше да попречи за получаването на плазмида и за експресията на хетероложни те гени

Фрагментът, съдържащ останалата част от плазмида беше пречистен от агароозен гел след електро*ареза, краищата му подравнени с

Т4 ДНК полимераза, обработен с телешка чревна алкална ФОСФатаза и лигиран към описания по—горе елемент

CMVintA/BGH

Получени бяха плазмиди с всяка една от двете възможни ориентации на промоторните елементи по отношение скелета на pUC

Единият от тези плазмиди даде много по-висок добив на

ДНК в Е. coli. Той Беше означен като V1J (SEQ.

ID:10:).

Структурата на този вектор брше верифицирана чрез секвенцйонен анализ на областите на свързване. След това беше показано, че съпоставено с VI, V1J дава сравнима или по-висока експресия на хетероложни гени

ПРИМЕР 7

КОНСТРУКЦИИ, ВКЛЮЧВАЩИ____ГЕНИ НА______ГРИПНИЯ ВИРУС__В ЕКСПРЕСИОННИЯ

ВЕКТОР V1J

Редица от гените на щама A/PR/8/34 на грипния вирус бяха клонирани в експресионния вектор V1J, в който, както е посочено в Пример 4, гените се експресират в количество, сравнимо или дори по-високо от това във вектора VI. Последователностите на

РИ8-гена са известни и са на разположение в базата данни на

GENBANK

За всеки от клонираните гени, представени по-долу, големината на клонирания беше проверена чрез електрофореза в гел. Даден е и ключовият номер на последователността в GENBANK, с която е сравнена частично определената първична структура. За метода на получаване на тези гени от съответните вирусни щамове, например от вирусен щам, получен от

АТСС (A/PR/8/34 е АТСС VR95; редица други щамове също са на депозит в АТСС), виж Пример

А. Субклониране на PR8-rени в VIJ

1. Ген NP

Г енът

NP беше снбклониран от pAPR501 (J.F

Young, U

Desselberber,

Gravfes, Р

Shatzman, and М

Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic Influenza

Viruses, ed

W.G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) рр. 129-138).

Той беше изрязан от pAPR501 чрез хидролиза с EcoRI,

Фрагментът беше изолиран и причистен чрез електрофореза в агарозен гел и подравнен с

T4 ДНК полимераза. Подравненият

Фрагмент беше включен във V1J след отварянето му с Вд111 и подравняване на краищата мн с

Т4 ДНК полимераза

Клонираният Фрагмент беше дълъг

1,6 килобази.

2. NS

Генът NS беше снбклониран от pAPR801 (d.F. Young, U.

Desselberber, P.

Gravies, P. Palese, A. Shatzman,

Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic

Influenza

Viruses , ed. W.G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) pp. 129-138).

Той беше изрязан от pAPR801 чрез хидролиза с EcoRI, Фрагментът беше изолиран и причистен чрез електрофореза в агарозен гел и подравнен с Т4 ДНК полимераза. Подравненият Фрагмент беше включен във V1J след отварянето му с Вд 111 и подравняване на краищата мн с Т4 ДНК полимераза. Клонираният Фрагмент беше дълъг 0,9 килобази (включва изцяло кодиращата област на NS, включително NS1 и NS2.

3- НА

Генът НА беше снбклониран от pJZ102 (J.F. Young, LI.

Desselberber, P. Gravfes, P. Palese, A. Shatzman, and M.

Rosenberg (1983), in The Origins of Pandemic

Influenza

Viruses , ed. W.G. Laver, (Elsevier, Amsterdam) pp. 129-138).

Той беше изрязан от pJZ102 чрез хидролиза с Hindlll, Фрагментът беше изолиран и причистен чрез, електрофореза в агарозен гел и подравнен с Т4 ДНК полимераза. Подравненият Фрагмент беше включен във V1J след отварянето мн с Вд111 и подравняване на краищата му с Т4 ДНК полимераза. Клонираният Фрагмент беше дълъг 1,75 килобази.

4. РВ1

Генът РВ1

Беше субклониран от pGeml—РВ1 (5'- и 3'връзките на гена с вектора бяха секвенирани, за да се потвърди тяхата идентичност

Виж J.F. Young, U. Desselberber,

Р. Gravies,

Р. Palese, A. Shatzman, and М. Rosenberg (1983), in

The Origins of Pandemic Influenza Viruses, ed. W.G. Laver,

Amsterdam) pp. 129-13Θ). Той беше изрязан от pGeml-PBl чрез хидролиза с Hindlll, Фрагментът беше изолиран и причистен чрез електрофореза в агарозен гел и подравнен с Т4

Подравненият Фрагмент беше включен във V1J след отварянето ми c

Вд111 и подравняване на краищата му с Т4

ДНК полимераза.

Клонираният Фрагмент беше дълъг 2,3 килобази ⁵· PB2

Генът РВ2 беше субклониран от pGeml—РВ2 (Свързващите краища т яхнат a идентичност

Виж 3.F. Young, U. Desselberber, Р.

Gravfes

Р. Palese, A. Shatzman, and M. Rosenberg (1983), in The

Origins of Pandemic

Influenza Viruses, ed

W.G.

Laver , (Elsevier

Amsterdam) рр. 129-138). Генът беше изрязан от pGemlРВ1 чрез хидролиза с BamH I. Фрагментът беше изолиран причистен чрез електрофореза в агарозен гел

Фрагментът лепливи краища беше включен във вектора V1J

Bglll. Клонираният Фрагмент беше дълъг 2,3 килобази.

ώ.

Ml

Генът Ml беше полачен чре:< ПВР от плазмида ρθ901 MITE.

M—последователността в този плазмид беше получена чрез ПВР от pAPR701 (J.F

Shatzman,

Influenza

129-138)

Young, U. Desselberber, Р. Gravfes, Р. Palese, A and М. Rosenberg

Viruses, ed. W.G

Като сенз-праймер

АСА AGA TCT ACC ATG CTT СТА (1983), in The Origins of Pandemic

Laver, (Elsevier, Amsterdam) pp брше използуван олигомерът 5'-GGT

ACC GAG GTC-3',

SEQ. ID:3:, а като антисенз—праймер беше използуван олигомерът

5'-CCA CAT AGA TCT

TCA CTT GAA CCG TTG CAT

CTG CAC-3',SEQ. ID :4

Фрагментът продукт на полимеразната верижна реакция беше пречистен чрез електро*ореза в агарозен гел, срязан c Bgl II и лигиран във вектора V1J , който беше отворен също с Вд1

II. Клонираният

Фрагмент беше дълъг

0,7 килобази. Амино-краят на М1-матриксния белтък се кодира от посочения по-горе сенз-праймер като кодон

ATG’’ , а стоп-кодонът за завършване на транслацията на

Ml се кодира от антисенз-праймера чрез последователността ТСА, която в смисловата верига по посока на четене представлява стопкодонът TGA

В. КОНСТРУКЦИИ ЗА ЕКСПРЕСИЯ НА ГРИПНИ ГЕНИ ВЪВ ВЕКТОРА VIJ:

При всеки от слнч аи те дадена свързващата последователност за

5'-промотораната облас т (CMVintA) на кони рани я ген

Тези последователности бяха получени чрез секвиниране на праймера: CMVintA праймер

5'-СТА

АСА GAC TGT ТСС

TTT CCA TG-3', SEQ

ID:28:, който генерира секвенцията на кодиращата последователност. Мястото на свързване е означено с наклонена черта , което не изразява някаква реална прекъснатост на последователността.

Методът за получаване на тези конструкции е изложен по—долу в обобщен вид, след описанието на всички последователности. Всяка представена последователност представлява цялостна, достъпна и способна да се експресира ДНК—констрнкция на съответния грипен ген .

Клетъчни култури от RD-клетки (ATCC CCLll'.b), които представляват човешка рабдомиосаркомна клетъчна линия бяха преходно трансФекти рани с всяка от конструкциите. Четиридесет и осем часа след трансФекцията клетките бяха събрани, лизирани и подложени на инуноблот—анализ (Изключена беше конструкцията V1J

PR-НА, която беше тестиране на мишки и даде анти-НА специфични антитела преди имнноблот-анализа. По този начин бе избегната необходимостта от тестиране ч рез имуноболот, тъй като експресията (на

НА) беше установена in vivo). Антителата, специфични за белтъците РВ1, РВ2 и NS бяха предоставени от

Stephen Inglis от университета в Кеймбридж, който за да получи поликлонални антитела е използувал пречистени белтъци, експресирани като слети белтъци с 0—галактозидазата. Анти NP— поликлонален антисерум беше получен чрез имунизиране на зайци с цял виурс A/PR/8/34. Анти-М1 антитялото може да се закупи от Фирмата Biodesign и представлява кози антесерум срещу грип-А, каталожен номер B65245G. При всички случай беше наблюдаван белтък с очакваните размери, което потвърждаваше експресията in vitro на съответния кодиран грипен Белтък.

Номенклатурата на тези конструкции следва конвенцията: Вектор-наименование на грипния щам-ген. При всеки от случаите клонираната и секвенирана генна последователност на A/PR/8/34 беше сравнявана с известни последователности в GENBANK. Биологичната ефикасност на всяка от тези конструкции е представена, както по-горе в Примери 2, 3 и 4.

• · • ·

ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ ПО ПРОТЕЖЕНИЕ НА 5'-ВРЪЗКИТЕ НА CMVINTA И НА ГЕНИТЕ НА ГРИПНИЯ ВИРУС A/PR/8/34:

1. V1J-PR-NP, SEQ. ID:12:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:М38279

5' GTC ACC GTC СТТ AGA ТС/А ATT CCA GCA AAA GCA GGG TAG АТА АТС

CMVintA NP.___

ACT CAC TGA GTG АСА TCA AAA TCA TG

2. V1J-PR-PB1, SEQ. ID:13:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:302151

5' ACC GTC СТТ AGA ТС/А GCT TGG CAA AAG CAG GCA AAC CAT TTG ААТ

CMVintA РВ1....

GGA TGT CAA ТСС GAC СТТ ACT ТТТ СТТ AAA AGT GCC AGC АСА AAA IGC

TAT AAG CAC ААС ТТТ ССС ТТА ТАС

3. V1J-PR-NS, SEQ. ID:14:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:J02150

5' GTC ACC GTC СТТ AGA TC/A ATT CCA GCA AAA GCA GGG TGA CAA AAA

CMVintA NS....

CAT AAT GGA TCC AAA CAC TGT GTC AAG CTT TCA GGT AGA TTG СТТ TCT TTG GCA TGT CCG CAA ACG AGT TGC AGA CCA AGA ACT AGG TGA T...

4. V1J-PR-HA, SEQ. ID:15:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:JO2143

5' TCT GCA GTC ACC GTC СТТ AGA ТС/А GCT TGG AGC AAA AGC AGG GGA

CMVintA НА

AAA ТАА AAA CAA CCA AAA TGA AGG CAA АСС ТАС TGG ТСС TGT TAA GTG

CAC TTG CAG CTG CAG ATG CAG АСА CAA TAT GTA TAG GCT ACC ATG CGA

АСА ATT CAA CC.

• · ·

5. V1J-PR-PB2, SEQ.

ID:16:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:JO2153

5' TTT TCT GCA GTC ACC GTC CTT AGA 1C/C CGA ATT CCA GCA AAA GCA

CMVintA PB2....

GGT

CAA

TTA

TAT

TCA

ATA

TGG

AAA

GAA

TAA

AAG

AAC

TAA

GAA

ATC

TAA

TGT

CGC

AGT

CTG

CCA

CCC

CGG

AGA

TAC

TCA

CAA

AAA

CCA

CCG

TGG

ACC

ATA

TGG

CCA

TAA

TCA i

i)GA i

AGT. .

b. V1J-PR-M1, SEQ. 10:17:, ПОД КЛЮЧОВ НОМЕР В ГЕННАТА БАНКА #:J02145

5' GTC ACC GTC CTT AGA ТСТ/ ACC ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA

CMVintA Ml....

ACG TAC GTA CTC TCT ATC ATC CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GAG ATC

GCA CAG AGA CTT GAA GAG TTG ACG GAA GA...

Описание на начина, no	който са свързани Фрагментите:
1. V1J-PR-NP:	Bg111-Фрагмент c тъпи краища (вектор) към
EcoRI-Фрагмент	с тъпи краища (ген NP)
2. V1J-PR-PB1:	Bg11 Ι-Фрагмент с тъпи краища (вектор) към

HinDII I-Фрагмент c тъпи краища (ген PB1)

3. V1J-PR-NS:	Bg111-Фрагмент с тъпи краища (вектор) към
EcoRI-Фрагмент	с тъпи краища (ген NS1)
4. V1J-PR-HA:	Bg111-Фрагмент с тъпи краища (вектор) към

HinDI11-Фрагмент c тъпи краища (ген HA)

5. V1J-PR-PB2 към към

7Ь

Bg11 Ι-Фрагмент c лепливи

BamHI-Фрагмент с лепливи краища (ген

V1J-PR-M1: Bg111-Фрагмент с лепливи

Bg 111-Фрагмент

Ml Беше получен използуване на които прибавят които започват краища

РВ2) краища с тъпи краища (ген Ml) чрез полимеразна верижна р8901-М1ТЕ като матрица

BglII-място в двата края ( вектор ) (вектор) реакция при и праймери, на гена и

Бази преди ATG и завършват веднага след кодона за терминация на транслацията на

Ml (TGA)

ПРИМЕР 8

ЕКСПРЕСИОНЕН ВЕКТОР

VIJneo, SEQ. ΙΡϊΙΘ

Необходима беше от вектора да се отстрани генът за ампицилинова устойчивост (amp^r), който се използува за селекция ч рез антибиотици на бактери и, съдържащи V1J, тъй като ампицилинът не е подходящ за използуване в големи

Фермен тори.

беше хидролиза реетрикционните ензими Gypl и

Earnl

1051. Остатъкът in плазмида беше пречистен чрез електрофореза в агарозен гел, краищата му изравнени с Т4 ДНК полимераза и след това обработен с телешка чревна алкална ФОСФатаза. Търговски достъпният ген за към канамицин (кап¹), произхождащ от транспозон 903 и включен в плазмида pUC4K, беше изрязан от плазмида чрез рестрикционния ензим PstI, пречистен чрез електрофореза в агарозен

Фрагмент беше лигиран със скелетната част на V1J. Получени Бяха плазмиди съдържащи кап^г-гена в двете възможни ориентации, означени като VIJneo, #1 и #3

Всеки от тези плазмиди беше

потвърден чрез разграждане с рестрикционни ензими и секвениране на ДНК в свързващите области. Натановено беше, че се произвеждат колитества плазмид, сходни с тези на изходния плазмид V1J . Експресията на хетероложните гении продукти, кодирани от векторите VlJneo, беше също така съизмерима с тази на гените, кодирани от V1J. От двата вектора ние произволно избрахме V1J #3 и оттук нататък го означавме като VIJneo (SEQ. ID:18:). Той съдържа к an'-гена в същата ориентация, каквато е ориентацията на атр^-гена в експресионната конструкция V1J.

Гените на всеки от щамовете А/Пекин/353/89,

А/Тексас/36/91 и В/Панама/46/90 бяха клонирани във вектора

VIJneo като кДНКи. При всеки от случаите свързващите последователности, които започват в 5'-промоторната област (CMVintA) и продължават в клонирания ген, бяха секвенирани чрез използуване на праймера: CMVintA—праймер 5—СТА АСА GAC TGT ТСС

TTT CCA TG—3', кодиращата последователност. Последната граничи с последователността, кодираща терминатора, като връзката между тях също е показана. Кодиращата терминатора последователност беше получена чрез използуване на праймера: BGH праймер 5'-GGA GTG GCA ССТ ТСС AGG-3', SEQ. ID:29:, който направлява синтезата на некодиращата верига. При всеки от случаите последователността беше проверявана чрез сравняване с известни последователности в ГЕННАТА БАНКА (GENBANK), съдържаща клонирани и секвенирани гени на тези или други грипни изолати. Мястото, в което се осъществява свързването, е посочено със знака /, което не означава някаква прекъснатост в последователността. При секвениране на свързващата област в конструкцията VIJneo-TX-HA се получи компресия, което затрудни прочитането на началото на последователността. Поради това първите 8 бази на тази връзка са · s- · ♦ * · * ' ·««<*· ·· ·· ·*

7Θ означени като ”14. Тези ннклеотиди бяха уточнени и идентифицираните нуклеотиди са представени. Първият триплет ATG, който се появява във всяка последователност, представлява кодонът за начало на транслацията за съответния ген. Всяка показана последователност представлява пълна, достъпна и способна да се експресира ДНК-конструкция на посочения грипен ген. Номенклатурата следва конвенцията: Наименование на вектора-грипен щам-ген. Биологичната ефикасност на всяка от тези конструкции е представена по същия начин, както по-горе в Примери 2, 3 и 4:

ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ НА 5'-ВРЪЗКИТЕ НА CMVintA С ГРИПНИТЕ ГЕНИ и НА 3'-ВРЪЗКИТЕ НА ГРИПНИТЕ ГЕНИ С BGH-ТЕРМИНАТОРА В ЕКСПРЕСИОННИТЕ КОНСТРУКЦИИ ПРИ ИЗПОЛЗУВАНЕ НА РАЗЛИЧНИ ЩАМОВЕ ГРИПНИ ВИРУСИ И НА РАЗЛИЧНИ БЕЛТЪЦИ:

I. А/ПЕКИН/353/98

A. VlJneo-BJ-NPs

ПРОМОТОР, SEQ. ID:20:

5' TCA CCG TCC TTA GAT C/AA GCA GGG TTA ATA ATC ACT CAC TGA GTG

CMVintA NP....

ACA TCA AAA TC ATG GCG TCC CAA GGC ACC AAA CGG TCT TAT GAA CAG ATG GAA ACT GAT GGG GAA CGC CAG ATT

ТЕРМИНАТОР, SEQ. ID;21:

5'GAG GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA

GCA GAT/ATT TTT TCC TTA ATT GTC GTA C...

BGH NP... .

II. A/TEKCAC/36/91

A. VIJneo-TX-НА

ПРОМОТОР, SEQ. ID:24

5'

CCT TAG ATC /

GGA AAT AAA

AAC AAC

CAA

AAT GAA AGC AAA ACT ACT

CMVintA

HA

AGT CC

ТЕРМИНАТОР, SEQ

ID :25

5' GCA GAT С/ CT

TAT ATT TCT

GAA ATT

CTG

GTC

TCA GAT

BGH

HA

III. В/ПАНАМА/46/90

VIJneo-PA-HA

ΠΡ0Μ0Τ0Ρ,

SEG

ID:26 (Първите

1080 бази на т аз и последователност са на разположение в

GENBANK nog ключов номер

M65171; получената от нас, посочена по-долу последователност, е идентичана c известна последователност; 3'-последователността, представена по-долу, не е била съобщавана досега)

5'ACC GTC CTT AGA ТС/ C

AGA AGC AGA GCA TTT TCT AAT ATC CAC AAA

CMVintA

НА. .

ATG AAG GCA ATA ATT GTA СТА CTC ATG GTA GTA АСА TCC AAC GCA GAT

CGA ATC TGC

ТЕРМИНАТОР, SEQ. ID:27:

5' GGC АСА GCA GAT С/ ТТ TCA АТА ACG TTT СТТ TGT AAT GGT ААС...

BGH

НА • · « ·

ΘΟ

ПРИМЕР 9

Интрадермално инжектиране на грипни гени;

Протоколът за интрадериално въвеждане на гени е идентичен с този за интрамускулно въвеждане: три инжекции V1-PRΝΡ, всяка по 200 икг, през три седмици. Далаците бяха вземани за изследване in vitro 55 дни след третата инжекция и реетимали рани с нонапептидния нуклеопротеинов епитоп 147-155, SEQ. ID:9:.

Прицелните клетки (Р815-клетки, миша мастоцитома, сингенни с BALB/с-мишки 4-2=¹) бяха инжектирани с хетероложния вирус А/Виктория/73. Специфичен лизис беше предизвикан чрез използаване на клетки от далак като е*ектор при съотношение е*ектор:прицелни клетки вариращо межда 5:1 и 40:1. Заложени бяха негативни контроли чрез определяне лизиса на прицелни клетки, незаразени с грипен вирас. Позит измерване на лизиса на заразени предизвикан от клетки на далак, трикратно със 130 мкг Vl-PR—NP, жив грипен вирас А/НК/68.

Резултати: Специфичен ли вни контроли бяха заложени чрез с грипен вирус прицелни клетки, получени от мишка, инжектирана която е преживяла заразяване с ис беше получен при използуване на далачни клетки от интрадериално инжектирани мишки при всички съотношения е*ектор:мишена

Не беше наблюдаван специфичен лизис , когато като е*ектор бяха използувани далачни к ле т к и от неинжектирани мишки или от мишки, инжектирани с вектора VI, несъдържащ включен PR-NP—ген.

В допълнение, за всички съотношения е*ектор:прицелни клетки специфичният лизис беше съпоставим при интрадермално приложение с резултатите, получени при интрамускулно приложение. Определини бяха и титрите на грипния вирус в белите дробове на мишки, инжектирани интрадериално или интрамускулно. Резултатите при използуване по 5 мишки в група, инжектирани трикратно през 3 седмици с единична доза от 200 мкг и заразени три седмици след последната доза, бяха следните:

Ваксина

Начин на приложение

Титър в белите дробове на мишки*

	5—тн	ден	7—ми	ден
V1-PR-NP	интрадерпална	5,2 ±	0,2	4,1	±	1*
VI	интрадермално	5,9 ±	1	6,6	±	о,:
V1-PR-NR	нт рамне килно	4,6 ±	0,4	4,5	+	1,
неинжектирани		6,2 ±	0,3	5,9	±	0,:

* Среден логаритъм от титъра ± SEN.

**В една от мишките изобщо не беше открит вирне.

И накрая, процентът на преживяемост на мишките беше проследен до до 28-мия ден доживя ха

897.

от интрамнекнлни те реципиен т и

507. от интрадермалините реципиенти. Нито една от мишките, инжектирани с празния VI вектор не оцеля, а от нетретираните мишки преживяха само 307.. Този опит показва, че ДНК, кодираща ннклеопротеин от грипния щам A/PR/8/34 е способна да индицира ЦТЛ-и, които разпознават нуклеопротеина на хетероложния щам A/Виктория/73 и проявяват защитен имунен отговор срещи хетероложния щям А/НК/68.

ПРИМЕР 10

Полиннклеотидна ваксинация при примати:

1. Антитела срещи

NP в (006 NP, 009

NP или контрола

101

102) бяха инжектирани в първия ден интрамискнлно на три места с RSV-NP при доза 1 мг/място. В инт рамвскулно на три места с

RSV-NP при доза мг/място. В същото време на различни места беше инжектирана по мг ДНК от конструкциите

RSV-LUX и CMV-int-LUX като контроли за експресията на ген-свидетеля, кодиращ луциФераза от светулка.

Животните бяха инжектирани на 15-тия ден по на едно място със същото количество

ДНК, както преди, а също и с мг pD5-CAT конструкция за експресия на ген-свидетеля хлорам*ениколацет илтрансФераза.

Местата от мускула, съдържащи гените-свидетели, бяха взети за биопсия и изследвани за активност на ген-свидетеля. Взет беше серум 3, 5, 9, 11 и седмици след първата инжекция.

Първат а положителна проба за анти-NP антитела беше получена на 11—та седмица; позитивни бяха и и 15-та седмици

Анти—NP антителата бяха определени ч рез

ELISA.

2. Антитрела, инхибиращи хемаглутинациятa (HI) в маймуни

Резмс:

Маймуните бяха инжектирани интрамускнлно с V1J-PR—НА на първия ден. По 2 животни във всяка група бяха инжектирани с no 1 мг,

100 мкг или 10 мкг ДНК във всеки бедрен (четириглав) мускул.

Всяка инжекция беше с обем 0,5 мл. Преди първата инжекция от животните беше взета кръв. Всички животни бяха реинжекти рани с

ДНК на 15-тия ден и след това беше вземана кръв през 2до 4седмични интервали. Титрите, инхибиращи хемаглутинацията (HI ) , срещу щама A/PR/8/34 бяха позитивни на 5-та, 9—та и

12-та седмица след първата инжекция ДНК от конструкцията V1J-PR-HA.

Резултатите за представени по-долу в Таблица 10-1:

ТАБЛИЦА 10-1

ТИТЬР НА HI—АНТИТЕЛАТА В МАЙМУНИ РЕЗУС ИНЖЕКТИРАНИ С V1J-PR-HA ДНК
РЕЗНС #	ДОЗА	ТИТЪР	НА	HI-АНТИТЕЛАТА	В СЕДМИЦА	#
		ПРЕДИ		3-ТА	5-ТА	9-ТА	12-ТА
88-010	1 МГ	<10		<10	320	320	320
88-0200		<10		<10	<10	40	40

88-021	100 МКГ	<10	<10	<10	40	20
90-026		<10	<10	20	20	40

88-084	10 МКГ	<10	20	40	20	10
90-028		<10	<10	20	<10	<10

ПРИМЕР 11

Изследвания с полмннклеотидна ваксина при порове

1. Изследвания върху полинуклеотдната ваксинация при порове започна с цел да се определи дали животните могат да бъдат предпазени от заразяване с грип А чрез имунизация с гени, кодиращи Било НА (повърхностен белтък специ*ични неутрализиращи антитела), било вътрешността на вирусите NP, NS1, РВ1, М (като начин да се индуцира клетъчно—опосредствнван способен

да	индуцира	щам-
с	белтъци	OI
се	смята по	този
имунен отговор,

който да бъде щам-неспециФИчен). Животните бяха инжектирани с

ДНК, кодираща различните грипни гени в нашия вектор V1J, както следва:

ТАБЛИЦА 11-1

Г рупа	Конструкци я	Доза	Брой	имунизирани животни	Зараза с H1N1	Зараза с H3N2
1	V1J-HA	1000	МГ	16	* 8	8
2	V1J-NP	10000	мг	16	8	8
3	V1J+NP+NS1+	2000	мг	16	8	8
	РВ1+РВ2+М	общо
4	V1J-HA+NP+	2000	мг	16	8	8
	NS1+PB1+PB2+M	общо
5	V1J-	1000	мг	16	8	8
6	НЕ	НЕ		10	5	5
Общ брой
ЖИВОТНИ				90	45	45

2.

На 22-рия и на 43-тия след имунизацията от имунизираните животни беше взет серни, който беше изследван чрез

ELISA за неутрализиращи (инхибиращи хемаглутинацията — HI) антитела и за антитела срещу ннклеопротеина (NP) . Имунизираните с ДНК животни експресираха антитела срещу белтъчните продукти на съответните гени. Тези резултати за отразени на приложените Фигури 10, 11 и 16.

3. На 128-мия ден подбрани имунизирани животни бяха заразени с 1200 TCIDbo от грипния щам A/HK/6S. Този щам е хетероложен на щама A/PR/8/34, който беше източникът на кодиращите последователности, използувани за имунизацията, и следователно, наличието на предпазен еа>ект указва на имунитет, обусловен от клетъчно- опосредствнвани, щам-неспециФични механизми. Както е показано на приложената Фигура 12, в животните, имунизирани с ДНК, кодираща вътрешни белтъци, е налице статистически достоверно намаляване на назалното отделяне на вирус в сравнение с

контролите. Това потвърждава

Факта, че имунизацията с

не този отговор има предпазен

Θ5 е*ект .

4. По същия начин Беше тестиране и хомоложната инфекция с използуване на щама A/PR/B/34. Предпазната ефективност на неутрализиращите антитела, индуцирани чрез полинуклеотидна ваксинация, беше демонстрирана и в този случай.

ПРИМЕР

ПРОДУКЦИЯ НА VIJns

С цел да се улеснят изследванията върху включването на гени, към вектора

VIJneo беше прибавено едно Gfil-място.

Търговски достъпен Sfil-линкер от бд (New England Biolabs) беше прикачен към Kpnl-мясото в

BGH-последов ателнос т т а вектора. VIJneo

Беше линеаризиран с ΚρηΙ, пречистен ч рез електрофореза в агарозен гел, краищата мн бяха подравнени с Т4

ДНК полимераза и лигирани към StiI-линкера (също с тъпи краища).

Чрез рестрикционно картиране бяха подбрани отделни клонове и верифицирани чрез секвениране на линкера. Новият вектор беше означен VIJns (Фигура 17). Експресията на хетероложни гени във

VIJns (включващ SfiI-мястото) Беше съизмерима с експресията на същите гени във VIJneo (включващ Kpnl-мястото).

ПРИМЕР 13

ИМУНОГЕННОСТ

1. Хуморални имуннни отговори

Инжектирането на ДНК, кодираща белтъците на грипния вирус НА, NP и Ml предизвикваше хуморални имунни отговори при

мишки, порове и примати (включващи Африкански зелени маймуни и маймуни Резне). Досега беше доказано, че образуване на антитела предизвикват ПНВи (полиннклеотидни ваксини), съдържащи НА-гени, клонирани от следните щамове на грипния вирне: A/PR/34, В/Панама/90, А/Пекин/В9, А/Тексас/91, А/Хавай/91 и А/Джорджия/93.

а) Мишки: Антитела срещу NP и Ml бяха открити чрез ELISA в серуми от мишки след инжектиране на ДНК. Достатъчно високи титри на антитела (10*-10^ώ) бяха получени с минимални еднократно приложени дози от 1 мкг NP-ДНК (A/PR/34) (най-малката тестирана доза). Антителата се появяваха 2 седмици след инжекцията (найранният проверен срок) и титърът им не спадаше най-малко до 6 месеца след инжекцията. Тези ΝΡ—антитела не са неутрализиращи и не участвуват в протекцията. Те обаче демонстрират експресията in vivo на NP-белтък след инжектирането на ДНК. Тъкмо обратното, антителата срещу НА придават предпазен имунитет срещу хомоложиния щам на грипния вирус. Инжектирането на НА—ДНК, клонирана от щама A/PR/34 има за резултат производството на неутрализиращи антитела, установени in vitro чрез изследване на инхибирането на хемаглутинацията (HI). Титри на инхибиране на хемаглутинацията (HI-титри) >

1280 бяха измерени при редица мишки, инжектирани с три дози от по 100 мкг НА-ДНК. Доловими титри бяха наблюдавани в някои животни, инжектирани само с две минималин дози от по 0,1 мкг

Налице е зависимост ДОЗА—ОТГОВОР между HI-титъра и дозата

ДНК, както и между HI-титъра и броя на инжекциите (Таблица 13—1) • ·

	. · · • · · · *	’ ..* .....
	Θ7
ТАБЛИЦА 13-1
Предизвикване	на хуморални	имунни отговри	в мишки
	GMT /геомет	ричен среден титър/ HI
		Брой дози
доза (мкг)	1	2	3
НА-ДНК (100)	75	106	260
НА-ДНК (10)	37	69	86
НА-ДНК (1)	<10·	13	24
НА-ДНК (0,1)	<10*	<10·	<10·
Контролна ДНК (ЮО)	<10ь	<10*	<10ь
Неинжектирани		<10ь

Таблица 13-1s Женски мишки BALB/c (4-6-седмични) бяха инжектирани с посочените дози A/PR/34 НА-ДНК (V1JHA) еднократно, двукратно или трикратно през интервали от три седмици. Негативните контроли включваха мишки, инжектирани с контролна ДНК, представляваща вектора без включен ген (V1J), както и наивни, неинжектирани мишки. Проби от серум бяха взети седем седмици след първата доза и анализирани за присъствие на антитела, инхибиращи хемаглутинацията (ΗI-антитела). Данните са представени като геометричен среден HI-титър, където п=10.

• някои от тестираните мишки са позитивни за Н1-титър ^ь всички мишки

Във всяка тестирана мишка от модела хетероложно заразяване присъствието на HI-антитела корелираше със степента на протекция. Титърът на HI—антителата в мишки, инжектирани с НАДНК (A/PR/34) оставаше практически непроменен в продължение на поне 6 месеца. НА-антитела, определени чрез ELISA, Бяха получени също в мишки чрез използуване на НА-ДНК от щамове на грипния вирус А/Пекин/89, В/Панама/90 и А/Тексас/91.

Въз основа на съобщение в литературата, според което експресията на ген-свидетеля е по-ниска при инжектиране на ДНК в по-стари мишки, Беше проверен възрастовият е*ект върху хуморалния имунен отговор срещу НА. Поради невъзможност да се набавят стари девствени женски мишки, бяха използувани мишки на възраст около 10 месеца, преминали репродуктивния си период. Тези мишки бяха сравнени с млади 4-6-седмични девствени мишки по отношение на способността им да произвеждат антитела срещу НА. По-старите мишки бяха в състояние да образуват НА—антитела след инжектиране на ниски дози от 1 мкг НА-ДНК (най-ниската тестирана доза) макар и в по-нисък титър в сравнение с по-младите мишки (Таблица 13-11).

ТАБЛИЦА 13-11

Е*ек т	на възрастта	върху	хаморалните	имунни отговори
инокулум	доза (мкг)	4—6	GMT -седмични	GMT 10-месечни
НА-ДНК	100		1034	110
НА-ДНК	10		338	68
НА-ДНК	1		80	20
Контролна ДНК	100		<5-	<5-
Неинжектирани	-		<5*	<5-
Ин*ектирани с грип			538	36

Таблица 13-1 Is Женки мишки BALB/c (4-6-седмични девствени и 10месечни, преминали репродуктивна възраст) бяха инжектирани трикратно с A/PR/34 НА-ДНК (V1JHA) с посочените в таблицата дози през триседмични индтервали. Негативните контроли включваха мишки, инжектирани с контролна ДНК (V13) и наивни, неинжектирани мишки. За сравнение, други мишки бяха заразени със сублетална доза грипен вирус, щам A/PR/34. Проби от серума Бяха взети на 9—та седмица след първата доза и бяха анализирани за

HI-титър. Данните са представени като геометричен среден титър, където п=15 • HI-титърът при всички тестирани мишки е негативен

Този резултат, обаче, не се дължи на самата полинуклеотидна ваксина, а по-скоро на намалената способност на по-старите мишки да развиват хнморален имунен отговор, тъй като в сравнение с помладите мишки, по-старите проявяваха по-слаб HI-отговор и след заразяване с жив виурс A/PR/34. Действително изглеждаше, че HIантителата са по-слабо потиснати в ДНК-ваксинирани стари мишки, отколкото във възрастни мишки заразени с грипен вирус. Нещо повече, излезлите от репродуктивна активност мишки използувани в тези изследвания бяха около 50Z по-тежки от типичните нераждали мишки на същата възраст. Този *акт, а също и данни от изследвания на други автори върху калорично бедните диети при мишки показват, че именно повишеното тегло може да има вреден е*ект върха имунния отговор при тези животни. Поради тази и драги причини имунният отговор при тези мишки може да не е полинаклеотидната ваксинация да предизвиква хнморален имннен отговор, дори с такива малки дози като 1 мкг.

Ь) Порове: Хнморален иманен отговор беше получен при порове, инжектирани с НА-ДНК от следините щамове на грипния вирас: A/PR/34, А/Пекин/89, А/Хавай/91 и А/Джорджия/93. HIантитела среща A/PR/34 и EL ISA—анти тела срещу

НА от други щамове бяха предизвикани чреа подходяща полиннклеотидна ваксина.

«I »

Намерено беше, не серуми от порове, инжектирани с НА—ДНК от А/Пекин/89, А/Хавай/91 и А/Джорджия/93, съдържат HI-антитела и неутрализиращи антитела, тъй като тези животни бяха невъзприемчиви към вирусна ин*екция.

с) Примати: (невключващи хора, виж също Пример 10, погоре) Маймуни Резус бяха имунизирани двукратно с НА-ДНК (A/PR/34) с дози 10, 100 и 1000 мкг на крайник. HI-титри да 320 бяха измерени в животните, инжектирани с дози 100 или 1000 мкг, а една от двете маймуни, инжектирани с 10 мкг, показа Н1-титър

Засега са изследвани серуми до 13-тия месец; не беше намерено забележимо снижаване на HI-титрите от

6-тия до 13-тия месец (Таблица 13-III).

ТАБЛИЦА 13-1II

Образуване на HI-антитела в маймуни Резне

доза(мкг)	преди	1 месец	2 месеца	5,5 месеца	13 месеца
2000	<10	640	320	160	80
2000	<10	40	40	20	20
200	<10	80	40	40	80
200	<10	80	80	40	20
20	<10	40	20	20	20
20	<10	<10	<10	<10	<10

Таблица 13—Ills Маймуни Резне (както женски, така и мъжки) с тегло от 4,3 до 8,8 кг бяха инжектирани с A/PR/34 НА-ДНК (V1JHA) с посочените дози двукратно - на ннлева и втора седмица. Проби серум бяха взети на посочените в таблицата срокове след инжектирането на първата доза и бяха анализирани за HI—титър. Данните в таблицата представят HI-титрите за индивидуални животни.

В Африкански зелени маймуни, инжектирани с комбинирана полинуклеотидна ваксина, съдържаща

100 мкг НА—ДНК (А/Пекин/89), оценката на серуми до 6 седмици след първата доза показа GMT (среден геометричен титър)=29 (8/9 отговора). Тези резултати се съгласуват добре с имунните отговори срещу лицензираната субвирионна ваксина (GMT=16,5; 5/6 отговора), както и срещу лицензираната пълноценна субвирионна ваксина (GMT=36,6; 6/6 отговора), приложени в същата времева точка (Фигура 18). Изразен с т ималиращ еФект при втората имунизация беше наблюдаван в животни те, инжектирани с доза 10 мкг НА-ДНК (GMT=1,9 след първата доза и 199 след двете дози).

Подобен стимулиращ ефект проявяваше и лицензираната пълноценна вирионна ваксина, докато

HI-титрите, получени с втората доза субвирионна ваксина, бяха само преходни. Засега близки нива на

HI-антитела бяха измерени до 18 седмици в животните, имунизирани с дози, какото от по 10, така и от по 100 мкг НА-ДНК, като резултатите са сравними с тези , получени с най-добрата лицензирана ваксина (пълноценен вирион). Тези резултати показват, че полиннклеотидната ваксина е поне толкава е*ективна в генерирането на неутрализиращи антитела, колкото и пълноценната вирионна ваксина и е поефективна от субвирионната ваксина. Пречистени снбединични ваксини не бяха доловимо имнногенни при мишки. Поради това те не бяха тестирани върху примати. В това изследване ПНВ съдържаше 5компонентен коктейл от ДНКи, кодиращи НА в А/Пекин/89, В/Панама/90 и А/Тексас/91 и NP и Ml от A/PR/34. Ние тестирахме тези животни и по отношение получаването на хуморален имунен антитела срещу В/Панама/90 НА и срещу

A/PR/34 NP. В отделен експеримент, както HI-антитела, така и неутрализиращи антитела • · * ·

V - · β · · · · ⁸ * · ····· ·· ·· · · · · * срещу А/Тексас/91 Бяха индуцирани чрез инжекция на две дози НАДНК, клонирана чрез ПВР.

2. Клетъчно—опосредстваван имунитет

Виж Пример 3 по-горе.

3. Генериране на имунен отговор

а) Хуморален имунитет:

Процесите, водещи до хуморален или до клетъчно—опосредствуван имунен отговор след инжектиране на ДНК все още не са изяснени.

За да на неутрализиращи антитела (например срещу НА на грипния вирус) изглежда, че клетките трябва да ги експресират в плазмената мембрана или да ги секретират извънклетъчната среда. Освен това, трансФектпраните клетки трябва да експресират НА с вторична, третична и четвъртична структура, подобна на тази във ви риона.

едно изследване върху розетни те структури, експреси ята на НА върху клетъчната повърхност беше показано в

RD-клетки (раБдомиосаркомна клетъчна лини я миобластен произход) преходно трансФектирани с НА-ДНК. Червените кръвни клетки аглут инираха върху повърхността на клетките, трансФектирани с НА-ДНК, но не и върху псевдотранСФектирани клетки. Това показва, че НА не само се експресира върху клетъчната повърхност, но и съхранява правилната си конФормация за свързване с белтъците, съдържащи сиалова киселина.

Ь) Клетъчно—опосредствуван имунитет: Генерирането на клетъчно-опосредствуван имунен отговор (напр. срещу ΝΡ на грипния вирус) изисква протеолитично процесиране на белтъка и предоставяне на получените пептиди в резултат на протеолизата за свързване с белтъците от ГКТС, клас I. Все още не е известно естеството на клетката, предоставяща антитела, което води до генерирането на имунния отговор след инжектирането на ДНК.

Мускулните клетки експресират ниски нива от ГКТС и се счита, че те не експресират костимулиращи молекули по повърхността си.

Следователно, мускулните клетки общо взето не се смятат за доказателства указват, че мускулните клетки участвуват в генерирането на имунен отговор след i.m. инжектиране на ДНК. Първо, прегледът на тъканите, способни да неутрализират гола” плазмидна ДНК, водеща до експресия на Белтък in situ показа, че редица клетъчни типове могат да експресират гени-свидетели, когато плазмидът се инжектира директно в тъканта, но значително по-слабо активно, отколкото мускулните клетки. За пълен анализ

на приемането	на ДНК от немускулни клетки след i.m. инжектиране
досега не е	съобщавно, но изглежда, че приемането е дори по-
неефективно.	Второ, експресията на гени-свидетели след i.m.

инжектиране на ДНК е показано в скелетните и сърдечните мускулни клетки на много различни видове организми. Трето, макар че отговор чрез ЦТЛ може да се предизвика след инжектиране на ДНК по други начини (i.v. и i.d.), най-добрият предпазен имунен отговор при мишки се предизвиква след i.m. инжектиране на ДНК. Четвърто, миобластите и миоцитите могат да бъдат разпознати и лизирани от ЦТЛ in vitro и този лизиз може да се усили чрез предварително третиране с гама—интер*ерон, който регулира експресията на ГКТС, клас I. Най-сетне, трансплантацията на стабилно трансформираните, експресиращи NP миобласти, в наивни сингенни мишки води до генерирането на предпазен клетъчно— опосредствуван имунен отговор in vivo (Фигура 20). Следователно, експресията на антигени в мускулните клетки е достатъчно да индуцира предпазния имунен отговор, който наблюдаваме след инжектирането на ДНК. Нещо повече, приемането и експресията на

ДНК от мускулните клетки може да се окаже ненужно за генерирането на предпазния имунитет. От гледна точка на полинуклеотидите като ваксини, потенциално предимство би представлявало приемането на ДНК да се ограничи само до мускулните клетки. Първо, миоцитите са крайно диференцирани клетки и не се делят. Това би било от значение за снижаване на възможността плазмидната ДНК да се включи в хромозомната ДНК и за поддържане на една постоянна експресия на антигена, което би довело до дълготраен имунен отговор. Второ, миоцитите са големи многоядрени клетки, които могат да регенерират чрез сливане с миобласти. Това може да допринесе за обяснение на Факта, че инжектирането на ДНК води до белтъчна експресия, която би могла да продължи дълго време без признаци на цитолитична деструкция чрез ЦТЛ.

ПРИМЕР 14

Изследвания върху протектмвнмя еФект

Имунизирането с

ДНК, кодираща антигени на грипния вирус осигуряваше защита от смърт и Болест патологи я

Това Беше постигнато чрез комбинации от вирусни щамове при използуване модела на заразяване с човешки грип (на мишки и порове).

1. Хетероложна (хетеротипна, групова) протекци я не може да Бъде ефективно получена чрез лицензирани те мъртви ви русни ваксини, но можа да бъде постигната чрез ДНК-ваксинация в експериментални модели, включращи животни. Тази протекция беше показана, когато

ДНК, кодираща NP или Ml, Беше инжектирана в лабораторни животни. Кръстосаният клетъчно-опосредствнван имунен отговор (CMI), • · • · индициран чрез ваксинация тези ДНКи , водеше до защитен отговор

Мишки: BALB/c

СЗН мишки, инжектирани

i.m. с ДНК, кодираща NP от A/PR/34, бяха предпазени от смърт и заболяване (установено по намаляването на телесното тегло), предизвикано чрез тотална ин*екция на дихателните пътища с LD<»o на грипния щам А/Хонг Конг/68 (H3N2), който е хетеротипен щам (НЗ вместо Н1 при A/PR/34)

Фигура 21 показва преживяемостта на мишките

BALB/c, имунизирани трикратно с

NP—ДНК (200 мкг/доза) през триседмични интервали и заразени седмици след последната имунизация. Фигура показва потискането на спадането в теглото след заразяването на имунизираните мишки в сравнение с тежката загиБа на тегло контролните мишки

Фигура 23 показва намаляването на виремията в

Белите дробове дни след зараз яването на горните дихателни пътища на мишки, имунизирани с

NP-ДНК, в сравнение с мишки, т рет и рани контролна, некодираща

ДНК

Мишките, имунизирани с

NP-ДНК бяха напълно предпазени от смърт, показаха по-слаба загнба на тегло и по-слаба разпространение на вируса в белите дробове в сравнение с контролните мишки

Установено Беше, че количеството

NP-ДНК, необходимо да предпази тегло <6,25 мкг ДНК на доза при трикратно инжектиране на ДНК (Фигура

24). Намерено Беше, че протекцията, предизвикана от имунизацията с NP-ДНК, продължава в иминизирните мишки без съществена промяна най-малко 3 месеца. Нивото на протекция продължава и по-нататък, до 6 месеца, но намалява леко между 3-тия и

6-тия месец след последната имунизация

Обаче реваксинацията чрез еднократно инжектиране на

NP-ДНК на

22—та седмица, седмици преди зараз яването на

25-та седмица, напълно възстановяваше протекцията (Фигура 25). По такъв начин, имунизирането на мишки

NP-ДНК продуцираше дълготраеща, хетероложна протекция. Способността подлежаща на поддържане да се получи анамнестичен отговор след реваксинация на тези животни указва, че чрез имунизацията с

NP-ДНК се индицираше имунологичната памет.

Порове

Поровете са често използуван модел за ин*екции я човешки грип, тъй като те са възприемчиви към заразяване широк набор от изолати на грипен вирус. Вирусната репли каци я поровете протича предимно в носа и трахеята и в много по-малка степен в белите дробове, за разлика от мишките, при които вирусната инФекци я на дробовете е значителна

Инфекцията при поровете се проследява най-лесно чрез титруване на вируса в назални промивки. Порове, имунизирани с NP-ДНК или

М1-ДНК, поотделно или в комбинация, от наскоро изолиран човешки грипен щам (А/Пекин/89, H3N2) показваха значително намалено назално отделяне на вирус от

1-вия до 6-тия ден след заразяване с щама

А/Джорджия/93 (H3N2) (Фигура 26). Този теренен изолат прояваваше антигенен дрейФ (отдалечаване) от типовия щам

А/Пекин/89, така че лицензираната ваксина от щама Аг/Пекин/89 оказваше слаба или никаква протекция при хора срещу заболяване, предизвикано от щама А/Джорджия/93. Поровете, имунизирани с ДНК, кодираща вътрешните белтъци на A/PR/34, проявяваха значително намалено назално отделяне на вирус 5 или 6 дни след заразяване с хомотипния щам A/PR/34 (Фигура 27)

Редукция на вирусното отделяне беше установена след заразяване с А/Джорджия/93, както в ранни, така и в по-късни срокове, докато след заразяване с

A/PR/34 беше наблюдавано късно намаляване на вирусното отделяне

Това може да се дължи на разлика във вирулентността между двата щама по отношение на поровете.

• ·

2. Хомоложна (хомотипна, типово-специ*ична) протекция беше добре изразена, както при мишки, така и при порове, имунизирани с НАДНК

а. Мишки: BALB/c мишки, имунизирани с НА-ДНК (A/PR/34), бяха напълно защитени срещу заразяване с

LD<?o на A/PR/34. След заразяване при имунизираните мишки не настъпваше нито смърт (Фигура 28), нито повече от

57. загуба на тегло (Фигура 29), докато

90-1007. от контролните мишки умираха или показваха тежка загуба на тегло

Т и трнването на дозата НА-ДНК, нужна за да се

ПОЛУЧ и протекция показа че три инжекции с по мкг

НА-ДНК са достатъчни, за да се получи пълна защита (Фигура

30)

Ь. Порове: Поровете, които бяха имунизирани с ДНК, кодираща

НА от A/PR/34, показаха значително по-ниско назално отделяне на вирне от 1-вия до 6-тия ден след хомоложна вирусна и *ек ция, отколкото порове, третирани с контролна

ДНК (Фигура

31) .

Също така поровете които бяха имунизирани с НА-ДНК от щама

HI-антитела срещу съответните щамове присъствуваха в серумите на всички имунизирани порове (виж по-горе).

Следователно, имунизацията с НА-ДНК предизвикваше хомоложна протекция.

3. Комбинации от ваксини: Способността на НА-ДНК да обезпечи поширока защита, когато се комбинира a NP- или Ml—ДНК беше изследвана при порове.

а. Обхват на протекцията срещу варианти, претърпяли антигенен дрей* (точкови мутации): Антигенният дрейФ между щамовете А/Пекин/89 и А/Пекин/92 беше достатъчно голям, така че редица индивиди, имунизирани с лицензираната ваксина, съдържаща щама А/Пекин/89, не можеха да бъдат защитени срещу заболяване, причинено от варианта А/Пекин/92. В Северна Америка широко разпространени заболявания бяха причинени от теренни изолати, подобни на А/Пекин/92, например А/Джорджия/93.

Североамериканските теренни изолати са антигенно сходни с типовия щам А/Пекин/92, но се различават по геогра*ското място, откъдето са изолирани и по тяхната история на култивиране. Те са култивирани чрез пасиране в клетъчни кнлтчри от бозайници, а не в птичи яйца. По отношение на аминокиселинната последователност на НА, обаче, щамовете, подобни на А/Пекин/92 се различават от щамовете, подобни на А/Пекин/89 само по 11 точкови мутации в областта

НА1 (позиции 133, 135,

145, 156,

157,186, 190,

191,

193, 226

262)

Поради това опитахме да установим, дали комбинирането на хомотипните имунни отговори , индицирани от

НА—

ДНК с кръстосано реактивните

CMI-отговори, индицирани от NP- и

Ml—ДНК, не би допринесло за повишаване на защитата срещу този вариант, претърпял антигенен дрейж. Имунизирането на поровете с ли цензирана ваксина, съдържаща щама А/Пекин/89 или с НА-ДНК от

А/Пекин/89 или от теренен изолат, сходен на А/Пекин/89 (А/Хавай/91) водеше до намаляване на назалното вирусно отделяне при заразяване на поровете

Поровете, които бяха имунизирани с комбинирана ПНВ, съдържаща

NP-, М1и НА-ДНКи, показаха значително по-ниско вирусно отделяне, отколкото поровете, имунизирани с лицензирания продукт

ДНК с А/Пекин/89 NP- и М1-ДНКи, получената протекция не се различаваше съществено от максималната протекция, получена с хомоложната А/Джорджия/93 НА-ДНК (Фигура 35). Така че в сравнение с комбинираната ваксина, комбинирането на НА-, NP— и

Ml—ДНКи подобри протекцията среща един вариант, резултат на антигенен дрейФ.

Ь. Ефект на култивирането върха ваксиналния антиген: При заразяване с изменения чрез антигенен дрейФ щам А/Джорджия/93, поровете, които бяха имунизирани с ваксина, съставена от НА-ДНКпоследователност, получена от един US-теренен изолат (А/Хавай/91), култивиран in vitro в MDCK-клетки, показаха пониско назално отделяне на вирус (р=0,021 чрез ANOVA-анализ), отколкото поровете, имунизирани с лицензирана ваксина от убит виурс, съдържаща щама А/Пекин/89, пасиран през яйца (Фигура 33)

Прот ивоположно на това след зараз яване с А/Джорджия/93, поровете, третирани

НА-ДНК от

А/Пекин/89 не проявиха същес твено различно назално отделяне на вирус (р=0,058) в сравнение в поровете, третирани с лицензирана ваксина, съдържаща идентичен вирус

Щамовете, култивирани в яйца и в клетъчни култури от бозайници, се различават по две точкови мутации в областта НА1 на НА (позиции 186 и

193)

И двете мутации са разположени близо до горния край на мономера НА област, която се смята важна за свързването на HIантителата на неутрализиращите ан т и тела някои случаи способнос т т а на някои човешки грипни изолати да се свързват с пилешки еритроцити е първоначално много слаба, но се увеличава с поседователните пасажи в яйца. Това указва, че областта на НА, която се свързва с рецептора, може да претърпи съществена селекция при култивиране на вируса в птичи яйца. Ефектът на малки вариации в първичната структура върху ефикасността на противогрипни ваксини, приготвени на базата на НА при лабораторни животни, изтъква потенциалното значение на изискването, при приготвянето на такива ваксини да се придържаме

100 колкото е възможно по-близо до първичната структура на дивия тип вирне.

с. Примати: Приматите обикновено не се използуват като модели на грипна инжекция поради липсата при тези животни на клинична симптоматика. Обаче ние изследвахея при примати имуногенността на ПНВ-конбинирани ваксини като я сравнявахме с лицензирани те ваксини, съдържащи убити вируси. Титрите на антитела, получени чрез комбинираните ПНВ-ваксини, съдържащи гените на вътрешните белтъци бяха, най-малкото равностойни на титрите, получени с лицензирания продукт по отношение на HIтитъра и на продължителността на имунния отговор

Африкански зелени маймуни, имунизирани с ПНВ, (виж по-горе) дадоха имунен отговор спрямо НА-ПНВ от един антигенен вариант , резултат на антигенен дрейФ

Това показва, че типово—специфичен отговор спрямо ПНВ може да се предизвика в предварително имунизирани индивиди

Маймуни, имунизирани с

ПНВ, отговаряха също на последваща имунизация с конвенционална ваксина от убити вируси

Заключение: Полиниклеотидни ваксини срещу грип са е*икасни при модели на грипна инфекция в лабораторни животни

Хомоложна протекция може да се постигне кодиращ НА , най-вероятно чрез имунологичен механизъм, аналогичен на този, който се индуцира чрез НА—белтъка, използуван в конвенционалната лицензирана г рипна ваксина

Хетероложна протекция може да се получи срещу щамове изменени антигенно, било чрез точкови мутации , било чрез генни преустройства, като във ваксината се включи и

ДНК, кодираща консервативните вътрешни белтъци на грипния вирус експеримент лен модел при порове, комбинация от тези подходи дава при еднократна имунизация

« · ·

101 подобрена протекция среща антигенно изменените варианти на грипния вирне, в сравнение с понастоящем прилаганата конвенционална ваксина.

ПРИМЕР 15

Приготвяне на вектора V1R

В усилията си да оптимизираме нашия базов ваксинален вектор, ние приготвихме вектор, производен на VIJns, който беше означен V1R. Целта на тази векторна конструкция беше да се получи ваксинален вектор с минимални рзмери, т.е. без излишни

ДНК-последователности, който съхранява характеристиките на оптимизираната хетероложна генна експресия и високите плазмидни добиви, типични за V13 и VIJns. По литературни данни и чрез експерименти ние определихме, че: (1) областите във ваксиналните вектори, които са част от pUC-плазмида и съдържат началото за репликация на

Е. coll, могат да бъдат отст ранени без да се засегне добивът на плазмидаа; (2)

3'-областта на кап^г-гена след отворената рамка на четене може да се отстрани ако на нейно място се включи бактериален терминатор;

и (3) около

300 бд от

3'-половината на BGH-терминатора могат да се отстранят без да се засегне неговат а регулаторна <*>ункци я (разположени след оригиналното място за Крп! в елемента BGH)

V1R беше конструиран като чрез ПВР бяха синтезирани три

ДНК-сегмента от вектора VIJns, представляващи съответно CMVintAпромотор/ВБН-терминатор, начало за репликация и елементите за устойчивост към канамицин. Към всеки сегмент бяха прибавени уникални разпознаваеми места за рестрикционни ензими чрез използуване на ПВР-олигомери: SspI и Xhol за CMVintA/BGH; EcoRV и BamHI за кап^г-гена; и Be 11 и

Sall за ori (началото за репли каци я)

Избрани бяха разпознаваеми места за тези ензими,

102 тъй като те позволяват насочено лигиране на всеки от ДНК^- сегментите, получени чрез ПВР с последващо елиминиране на всяко от тези места: EcoRV и SspI дават ДНКи с тъпи краища, които са подходящи за лигиране, докато BamHI и Bell дават комплементарни припокриващи се краища, подобно на Sall и на Xhol

След получаване на тези сегменти чрез ПВР всеки Фрагмент беше след това лигирани в една обща реакционна смес, съдържаща всичките три ДНК-сегмента. Беше предвидено 5'—краят на началото за репли каци я да включва

Т2-ро—независима терминаторна последователност , която нормално присъствува в тази област, така че би могла да предостави информация за терминация на гена за канами цинова нстойчивост

Продуктът на лигазната реакция Беше доказан чрез разграждане с рестрикционни ензими ензима), както и чрез

ДНК-секвениране на областите на лигиране

Добиви те на плазмидна ДНК и хетероложната експресия на вирусните гени във вектора V1R се оказаха сходни с тези във вектора VIJns

Получената реална редукция на големината на вектора беше 1346 бд (VIJns

4,86 кб;

V1R =3,52 кб), виж Фигура

36, SEQ. ID :45

ПВР-олигомерни последователности, използувани за синтеза на V1R (местата за рестрикционните ензими са подчертани и показани в скоби след поеледвателността):

(1) 5'-GGT АСА AAT AAT GG CTA TTG GCC ATT GCA ТАС G-3' CSspIJ, SEQ. ID:60: , (2) 5'-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3'

CXhoI], SEQ. ID:61:

(за сегмента CMVintA/BGH)

103 (3) 5'-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC3'CEcoRV], SEQ. ID-.62:

(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT АСА ACC-3' [BamHI], SEQ. ID:63:

(за сегмента на гена за канапицинова устойчивост) (5) 5‘-GGT АСА TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC ТТС TTG-3' [Be 11], SEQ. ID:64: , (6) 5'—CCA CAT GTC GAC СС GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [Sall], SEQ. ID-.32:

(за началото на репликация на Е, со/1)

ПРЕДСТАВЯНЕ НА ПО^ДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ» Donnelly, John J Dwarki, Varavani J Liu, Margaret A Montgomery, Donna L Parker, Suezanne E Shiver, John W (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО» Лечебни препарати на основата на нуклеинови киселини (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ» 64 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ» (A) Адресат» Merck & Co., Inc.

(B) Улица» Р. 0. Box 2000 (C) Град» Rahway (D) Щат» New Jeresey (E) Държава» Съединени Американски Щати (F) Код» 07065 (v) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ (A) Тип среда» Флопи диск (B) Компютър» IBM РС-съвместим (C) Операционна система» PC-DOS/MS-DOS (D) Програмен проднкт» PatentIn Release 4 1.0,

Версия # 1,25 (vi) ТЕКУЩА ИНФОРМАЦИЯ ЗА ЗАЯВКАТА» (A) Номер на заявката» (B) Дата на подаване» (C) Класм*икация» (vii) ДАННИ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ» (A) Номер на заявката» US 08/032, 3Θ3 (B) Дата на подаване: 18 март 1993 (vii) ДАННИ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ» (A) Номер на заявката» US 08/089, 985 (B) Дата на подаване» 8 юли 1993 (viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ОПЪЛНОМОЩЕНОТО ЛИЦЕ/АГЕНТ» (A) Име» Bencen, Gerard Н (B) Регистрационен номер: 35, 746 (C) Номер на нказателя/регистъра» 18972Y (ix) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ» (A) Телефон» (908)594—3901 (B) Телефакс» (908)594-4720 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1» (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина» 18 базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» едоноверижна (D) Топология» линейна (ii) Молекнлен тип» кДНК

105 (iii) Хипотетична: He (iv) Антисенз: He (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:1:

GTGTGCACCT CAAGCTGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2» (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 23 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология» линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:2:

CCCTTTGAGA ATGTTGCACA ТТС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:3:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 33 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0:3»

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID Ν0»4» (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина» 36 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не

1В • · ·

106 (iv) Антисенз: Да (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:4:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGCAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:5:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 23 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:5:

CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:6:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 30 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: ДА (xi) Описание на-последователността: SEQ ID N0:6:

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGCAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:7:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 39 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едоноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не

107 (xi) Описание на последователността; SEQ ID N0:7»

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:8:

(i) Характеристика на последователността;

(A) Дължина; 39 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност; едоноверижна (D) Топология; линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Да (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0»8s

GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0»9» (i) Характеристика на последователността;

(А) Дължина; 9 аминокиселини (8) Тип» аминокиселина (C) Верижност» едоноверижна (D) Топология» линейна (ii) Молекулен тип: пептид (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (v) Тип на Фрагмента: вътрешен (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:9:

Thr Tyr Gin Arg Thr Arg Ala Leu Vai

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:10:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 4432 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (линейна и кръгова) (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична» Не

108 (iv) Антмсенз! He (xi) Описание на последователността! SEQ ID NOslOs

T03CGCGTTT	CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	GCAGCTCCCG	GAGACGGTCA
CAGCTTGTCT	CTAAGCGGAT	CCCGGGAGCA	GACAAGCCCG	TCAGGGCGCG	TCAGCGGGTG
TTGGCGGGTG	TCGGGGCTGG	CTTAACTATG	CGCCATCAGA	GCAGATTGTA	CTGACAGTGC	180
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAA.TACCGC	ATCAGATTGG	240
'iCTATTGGCCA	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG	300
TCCAACATTA	CCGCCATCTT	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC	360
GGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATGGA	GTTCCGCCTT	ACATAACTTA	CGGTAAATGG	420
CCCGCCTGGC	TGACCGCCCA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC	480
CATAGTAACG	CCAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC	540
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA	600
TGACGGTAAA	TGGCCCCCCT	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	ACTTTCCTAC	660
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACCATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA	720
CATCAATGGG	CGTGGATAGC	GGTTTGACTC	ACGGGGATTT	CCAAGTCTCC	ACCCCATTGA	780
CGTCAATGGG	AGTTTGTTTT	GGCACCAAAA	TCAACCGCAC	TTTCCAAAAT	CTCGTAACAA	840
CTCCGCCCCA	TTGACGCAAA	TGGGCGGTAG	GCGTGTACGG	TGGGAGGTCT	ATATAAGCAG	900
AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	960
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTGGC	1080
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGACGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATCAG	CTCGGGGAGC	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC	1680

• ·

109

GGCAGAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC f	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAGGGCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTCCTGCCGC	1800
GCGCGCCACC	ACACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGGGTCTTTT	1860
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACCCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
CCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	21t>0
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	CGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	2460
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC	CCCTGACGAG	2640
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	cgctctcctg	TTCCGACCCT	gccgcttacc	2760
GGATACCTGT	CCGCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
AGGTATCTCA	GTTCCGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	accgctGcgc	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	2940
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	accttcggaa	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	3180
CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACCCTCAG	3240
TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTGJATTT	3420
CGTTCATCCA	TAGTTCCCTG	ACTCCCCGTC	GTGTAGATAA	CTACGATACG	GGAGGGCTTA	3480
CCATCTGGCC	CCAGTCCTGC	AATGATACCG	CGAGACCCAC	GCTCACCGGC	TCCAGATTTA	3540

110

TCAGCAATAA ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC ААСТТТАТСС	3600
GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT	3660
AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT	.3720
ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG	3780
TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA	3840
GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG САТААТТСТС TTACTGTCAT GCCATCCGTA	3900
AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG	3960
CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT	4020
TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG	4080
CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT	4140
АСТТТСАССА GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA	4200
ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC АТАСТСТТСС ТТТТТСААТА TTATTGAAGC	4260
ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA	4320
CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT	4380
ATTATCATGA CATTAACCTA TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG ТС	4432
2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:11:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 2196 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна

(D) Топология: и	двете
(ϋ )	Молекулен тип:	кДНК
(iii) Хипотетична: Не
(iv)	Антисенз: He	'1 >
(xi)	Описание на последователността:	SEQ ID	N0:11
ATTGGCTATT	GGCCATTGCA	TACGTTGTAT	ССАТАТСАТА	ATATGTACAT	TTATATTGGC	60
TCATGTCCAA	CATTACCGCC	ATGTTGACAT	TGATTATTGA	CTAGTTATTA	ATAGTAATCA	120
ATTACGGGGT	CATTAGTTCA	TAGCCCATAT	ATGGAGTTCC	GCGTTACATA	ACTTACGGTA	180
AATGGCCCGC	CTGGCTGACC	GCCCAACGAC	CCCCGCCCAT	TGACGTCAAT	AATGACGTAT	240
GTTCCCATAG	TAACGCCAAT	AGGGACTTTC	CATTGACGTC	AATGGGTGGA	GTATTTACGG	300
TAAACTGCCC	ACTTGGCAGT	ACATCAAGTG	TATCATATGC	CAAGTACGCC	CCCTATTGAC	360
GTCAATGACG	GTAAATGGCC	CGCCTGGCAT	TATGCCCAGT	ACATGACCTT	ATGGGACTTT	420

Ill

CCTACTTGGC	AGTACATCTA	CGTATTAGTC	ATCGCTATTA	CCATGGTGAT	GCGGTTTTGG	480
CAGTACATCA	ATGGGCGTGG	ATAGCGGTTT	GACTCACGGG	GATTTCCAAG	TCTCCACCCC	540
ATTGACGTCA	ATCGGAGTTT	GTTTTGGCAC	CAAAATCAAC	GGGACTTTCC	aaaatgtcgt	600
AACAACTCCG	CCCCATTGAC' GCAAATGGGC	GGTAGGCGTG	TACQGTGGGA	GGTCTATATA	660
AGCAGAGCTC	CTTTAGTGAA	CCGTCAGATC	GCCTGGAGAC	GCCATCCACG	CTGTTTTGAC	720
CTCCATAGAA	GACACCGGGA	CCGATCCAGC	CTCCGCGGCC	GGGAACGGTG	CATTGGAACG	780
CGGATTCCCC	GTGCCAAGAG	TGACGTAAGT	ACCCCCTATA	GAGTCTATAG	GCCCACCCCC	840
TTGGCTTCTT	ATGCATGCT/y	TACTGTTTTT	GGCTTGGGGT	CTATACACCC	CCGCTTCCTC	900
ATGTTATAGG	TGATGGTATA	CCTTAGCCTA	TAGGTGTGGG	TTATTGACCA	TTATTGACCA	960
CTCCCCTATT	GGTGACGATA	CTTTCCATTA	CTAATCCATA	ACATGGCTCT	TTGCCACAAC	1020
TCTCTTTATT	GGCTATATGC	CAATACACTG	TCCTTCAGAG	ACTGACACGG	ACTCTGTATT	1080
TTTACAGGAT	GGGGTCTCAT	TTATTATTTA	CAAATTCACA	TATACAACAC	CACCGTCCCC	1140
AGTGCCCGCA	GTTTTTATTA	AACATAACGT	GGGATCTCCA	CGCGAATCTC	GGGTACGTGT	1200
TCCGGACATG	GGCTCTTCTC	CGGTAGCGGC	GGAGCTTCTA	CATCCGAGCC	CTGCTCCCAT	1260
GCCTCCAGCG	ACTCATGGTC	GCTCGGCAGC	TCCTTGCTCC	TAACAGTGGA	GGCCAGACTT	1320
AGGCACAGCA	CGATGCCCAC	CACCACCAGT	GTGCCGCACA	AGGCCGTGGC	GGTAGGGTAT	1380
GTGTCTGAAA	ATGAGCTCGG	GGAGCGGGCT	TGCACCGCTG	ACGCATTTGG	AACACTTAAG	1440
GCAGCGGCAG	AAGAAGATGC	AGGCAGCTGA	GTTGTTGTGT	TCTGATAAGA	GTCAGAGGTA	1500
ACTCCCGTTG	CGGTGCTGTT	AACGGTGGAG	GGCAGTGTAG	TCTGAGCAGT	ACTCGTTGCT	1560
GCCGCGCGCG	CCACCAGACA	TAATAGCTGA	CAGACTAACA	GACTGTTCCT	TTCCATGGGT	1620
CTTTTCTGCA	GTCACCGTCC	TTAGATCTGC	TGTGCCTTCT	AGTTGCCAGC	CATCTGTTGT	1680
TTGCCCCTCC	CCCGTGCCTT	CCTTGACCCT	GGAAGGTGCC	ACTCCCACTG	TCCTTTCCTA	1740
ATAAAATCAG	GAAATTGCAT	CGCATTGTCT	GAGTAGGTGT	CATTCTATTC	TGGGGGGTGG	1800
GGTGGGGCAG	CACAGCAAGG	GGGAGGATTG	GGAAGACAAT	AGCAGGCATG	CTGGGGATGC	1860
GGTGGGCTCT	ATGGGTACCC	AGGTGCTGAA	GAATTGACCC	GGTTCCTCCT	GGGCCAGAAA	1920
GAAGCAGGCA	CATCCCCTTC	TCTGTGACAC	ACCCTGTCCA	CGCCCCTGGT	TCTTAGTTCC	1980
AGCCCCACTC	ATAGGACACT	CATAGCTCAG	GAGGGCTCCG	CCTTCAATCC	CACCCGCTAA	2040
AGTACTTGGA	GCGGTCTCTC	CCTCCCTCAT	CAGCCCACCA	AACCAAACCT	AGCCTCCAAG	2100
AGTGGGAAGA	AATTAAAGCA	AGATAGGCTA	TTAAGTGCAG	AGGGAGAGAA	AATGCCTCCA	2160
ACATGTGAGG	AAGTAATGAG	AGAAATCATA	CAATTC			2196

112 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:12:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 71 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:12:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTAGA ТААТСАСТСА CTGAGTGACA TCAAAATCAT G (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:13:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 117 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:13:

ACCGTCCTTA GATCAGCTTG GCAAAAGCAG GCAAACCATT TGAATGGATG TCAATCCGAC СТТАСТТТТС TTAAAAGTGC CAGCACAAAA TGCTATAAGC АСААСТТТСС СТТАТАС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:14:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 136 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:14:

GTCACCGTCC TTAGATCAAT TCCAGCAAAA GCAGGGTGAC AAAAACATAA

100

117

113

TGGATCCAAA CACTGTGTCA AGCTTTCAGG TAGATTGCTT TCTTTGGCAT

GTCCGCAAAC GAGTTGCAGA CCAAGAACTA GGTGAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»15» (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 152 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не

100

136 (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0»15s

TCTGCAGTCA CCGTCCTTAG ATCAGCTTGG AGCAAAAGCA GGGGAAAATA

AAAACAACCA AAATGAAGGC AAACCTACTG GTCCTGTTAA GTGCACTTGC

AGCTGCAGAT GCAGACACAA TATGTATAGG CTACCATGCG AACAATTCAA CC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»16» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 162 Базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» двойноверижна (D) Топология; и двете (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не

100

152 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:16:

TTTTCTGCAG TCACCGTCCT TAGATCCCGA ATTCCAGCAA AAGCAGGTCA ATTATATTCA ATATGGAAAG AATAAAAGAA CTAAGAAATC TAATGTCGCA GTCTGCCACC CCGGAGATAC TCACAAAAAC CACCGTGGAC CATATGGCCA TAATCAAGAA GT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:17» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 122 Базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» двойноверижна (D) Топология» и двете (ii) Молекулен тип» кДНК

ЮО 150 162 • ·

114 (iii) Хипотетична» He (iv) Антисенз» He (xi) Описание на последователността» SEQ ID NO:17s

GTCACCGTCC TTAGATCTAC

CGTACTCTCT ATCATCCCGT

GACTTGAAGA GTTGACGGAA

CATGAGTCTT CTAACCGAGG

CAGGCCCCCT CAAAGOCGAG

GA

TCGAAACGTA	50
ATCGCACAGA	100

122 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»18» (i) Характеристика на последователността:

(А) Дължина» 4864 базови двойки <В) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID NOslGs

	TCGCGCCTTT CGGTGATGAC GCTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA	60
	CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG	120
20	TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAG\TTGTA CTGAGAGTGC	180
	ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAAACCGC ATCAGATTGG	240
	CTATTGGCCA TTGCATACGT TGTATCCATA TCATAATATG TACA .TTATA TTGGCTCATG	300
	TCCAACATTA CCGCCATGTT GACATTGATT ATTGACTAGT TATTAATAGT AATCAATTAC	360
25	GGGGTCATTA GTTCATAGCC CATATATGGA GTTCCGCGTT АСАТЛАСТТА CGGTAAATGG	420
	CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTATGTTCC	480
	CATAGTAACG CCAATAGGGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC	540
	TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA	600
	TGACGGTAAA TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC	660
30	TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA	720
	CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA	780
	CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA	840
	CTCCGCCCCA TTGACCCAAA TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TCGGAGGTCT ATATAAGCAG	900

AGCTCGTTTA	GTGAACCGTC	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTGACCTCCA	960
TAGAAGACAC	CGGGACCGAT	CCAGCCTCCG	CGGCCGGGAA	CGGTGCATTG	GAACGCGGAT	. 1020
TCCCCGTGCC	AAGAGTCACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA	CCCCCTTGGC	1080
TTCTTATGCA	TGCTATACTG	TTTTTGGCTT	GGCGTCTATA	CACCCCCGCT	TCCTCATGTT	1140
ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTATAGGT	GTGGGTTATT	GACCATTATT	GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	ACAACTCTCT	1260
TTATTGGCTA	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	atttacaaat	TCACATATAC	AACACCACCG	TCCCCAGTGC ,	1380
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG	1440
ACATGGGCTC	TTCTCCGGTA	GCGGCGGAGC	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT	CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA	1560
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG	GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCGGGGAGC r,,..	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC	TTAAGGCAGC,	1680
GGCAGAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG	AGGTAACTCC	1740
CGTTGCGGTG	CTGTTAACGG	TGGAGGGCAG	TGTAGTCTGA	GCAGTACTCG	TTGCTGCCGC	1800
GCGCGCCACC	AGACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA	TGGGTCTTTT	1860
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	TCTGCTGTGC	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT	GTTGTTTGCC	1920
CCTCCCCCGT	GCCTTCCTTG	ACCCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTCCTT	TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	CGTGTCATTC	TATTCTGGGG	GGTGGGGTGG	2040
GGCAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG	GATGCGGTGG	2100
GCTCTATGGG	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC	2160
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC	2280
TTGGAGCGGT	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACCAAACCA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC	TGACTCGCTG	2460
CGCTCGGTCG	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT	AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG AACATGTGAG	CAAAAGGCCA	GCAAAAGGCC	2580
AGGAACCGTA	AAAAGGCCGC	GTTGCTGGCG	TTTTTCCATA	GGCTCCCCCC	CCCTGACGAG	2640
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACC	CGACAGGACT	ATAAAGATAC	2700
CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCCCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT	GCCGCTTACC	2760

116

GGATACCTGT	CCCCCTTTCT	CCCTTCGGGA	AGCGTGGCGC	TTTCTCAATG	CTCACGCTGT	2820
AGGTATCTCA	GTTCGGTGTA	GGTCGTTCGC	TCCAAGCTGG	GCTGTGTGCA	CGAACCCCCC	2880
GTTCAGCCCG	ACCGCTGCGC	CTTATCCGGT	AACTATCGTC	TTGAGTCCAA	CCCGGTAAGA	'2940
CACGACTTAT	CGCCACTGGC	AGCAGCCACT	GGTAACAGGA	TTAGCAGAGC	GAGGTATGTA	3000
GGCGGTGCTA	CAGAGTTCTT	GAAGTGGTGG	CCTAACTACG	GCTACACTAG	AAGGACAGTA	3060
TTTGGTATCT	GCGCTCTGCT	GAAGCCAGTT	ACCTTCGGAA	AAAGAGTTGG	TAGCTCTTGA	3120
TCCGGCAAAC	AAACCACCGC	TGGTAGCGGT	GGTTTTTTTG	TTTGCAAGCA	GCAGATTACG	3180
CGCAGAAAAA	AAGGATCTCA	AGAAGATCCT	TTGATCTTTT	CTACGGGGTC	TGACGCTCAG	3240
TGGAACGAAA	ACTCACGTTA	AGGGATTTTG	GTCATGAGAT	TATCAAAAAG	GATCTTCACC	3300
TAGATCCTTT	TAAATTAAAA	ATGAAGTTTT	AAATCAATCT	AAAGTATATA	TGAGTAAACT	3360
TGGTCTGACA	GTTACCAATG	CTTAATCAGT	GAGGCACCTA	TCTCAGCGAT	CTGTCTATTT	3420
CGTTCATCCA	TAGTTGCCTG	ACTCCGGGGG	GGGGGGGCGC	TGAGGTCTGC	CTCGTGAAGA	3480
AGGTGTTGCT	GACTCATACC	AGGCCTGAAT	CGCCCCATCA	TCCAGCCAGA	AAGTGAGGGA	3540
GCCACGGTTG	ATGAGAGCTT	TGTTGTAGGT	GGACCAGTTG	GTGATTTTGA	ACTTTTCCTT	3600
TGCCACGGAA	CGGTCTGCGT	TGTCGGGAAG	ATGCGTGATC	TGATCCTTCA	ACTCAGCAAA	3660
AGTTCGATTT	ATTCAACAAA	GCCGCCGTCC	CGTCAAGTCA	CCGTAATGCT	CTGCCAGTGT	3720
TACAACCAAT	TAACCAATTC	TGATTAGAAA	AACTCATCGA	GCATCAAATG	AAACTGCAAT	3780
TTATTCATAT	CAGGATTATC	AATACCATAT	TTTTGAAAAA	GCCGTTTCTG	TAATGAAGGA	3840
GAAAACTCAC	CGAGGCAGTT	CCATAGGATG	GCAAGATCCT	GGTATCGGTC	TGCGATTCCG	3900
ACTCGTCCAA	CATCAATACA	ACCTATTAAT	TTCCCCTCGT	CAAAAATAAG	GTTATCAAGT	3960
GAGAAATCAC	CATGAGTGAC	GACTGAATCC	GGTGAGAATG	GCAAAAGCTT	ATGCATTTCT	4020
TTCCAGACTT	GTTCAACAGG	CCAGCCATTA	CGCTCGTCAT	CAAAATCACT	CGCATCAACC	4080
AAACCGTTAT	TCATTCGTGA	TTGCGCCTGA	GCGAGACGAA	ATACGCGATC	GCTGTTAAAA	4140
GGACAATTAC	AAACAGGAAT	CGAATGCAAC	CGGCGCAGGA	ACACTGCCAG	CGCATCAACA	4200
atattttcac	CTGAATCAGG	ATATTCTTCT	AATACCTGGA	ATGCTGTTTT	CCCGGGGATC	4260
GCAGTGGTGA	GTAACCATGC	ATCATCAGGA	GTACGGATAA	AATGCTTGAT	GCTCGGAAGA	4320
GGCATAAATT	CCGTCAGCCA	GTTTAGTCTG	ACCATCTCAT	CTGTAACATC	ATTGGCAACG	4380
CTACCTTTGC	CATGTTTCAG	AAACAACTCT	GGCGCATCGG	GCTTCCCATA	CAATCGATAG	4440
ATTGTCGCAC	CTGATTGCCC	GACATTATCG	CGAGCCCATT	TATACCCATA	TAAATCAGCA	4500
TCCATGTTGG	AATTTAATCG	CGGCCTCGAG	CAAGACGTTT	CCCGTTGAAT	ATGGCTCATA	4560
ACACCCCTTG	TATTACTGTT	TATGTAAGCA	GACAGTTTTA	TTGTTCATGA	TGATATATTT	4620

	• V • · ♦	w w · · · · , · · · * • и » · ♦ ·	• в * · * * » * ' • · · * *
TTATCTTGTG	CAATGTAACA	TCAGAGATTT	117 TGAGACACAA	CGTGGCTTTC	4670
СССССССССС	CATTATTGAA	GCATTTATCA	GGGTTATTGT	CTCATGAGCG	4720
GATACATATT	TGAATGTATT	TAGAAAAATA	AACAAATAGG	GGTTCCGCGC	4770
АСАТТТСССС	GAAAAGTGCC	ACCTGACGTC	TAAGAAACCA	ТТАТТАТСАТ	4820
GACATTAACC	ТАТАААААТА	GGCGTATCAC	GAGGCCCTTT	CGTC	4864
(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ	ID N0:19:

(i) Характеристика на последователността» (A) Дължина: 15 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:19:

AGCAGAAGCA GAGCA 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:20:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 119 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:20:

TCACCGTCCT TAGATCAAGC AGGGTTAATA ATCACTCACT GAGTGACATC

AAAATCATGG CGTCCCAAGG CACCAAACGG TCTTATGAAC AGATGGAAAC

TGATGGGGAA CGCCAGATT

100

119 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:21:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 67 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК

118 (iii) Хипотетична» He (iv) Антисенз» Да (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0121:

GAGGGGCAAA CAACAGATGG CTGGCAACTA GAAGGCACAG CAGATATTTT ТТССТТААТТ GTCGTAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»22» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 15 Базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология» линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0»22t

AGCAGAAGCA CGCAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID Ν0»23» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 15 Базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» едноверижна (D) Топология» линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0»23:

AGCAGAAGCA CAGCA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:24» (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина» 33 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК • ·

119 (iii) Хипотетична! He (iv) Антисенз: He (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:24:

CCTTAGATCG GAAATAAAAA CAACCAAAAT GAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:25:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 36 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Да (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:25:

GCAGATCCTT ATATTTCTGA AATTCTGGTC TCAGAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:26:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 102 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:26:

ACCGTCCTTA GATCCAGAAG CAGAGCATTT ТСТААТАТСС ACAAAATGAA GGCAATAATT GTACTACTCA TGGTAGTAAC ATCCAACGCA GATCGAATCT GC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:27:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 42 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК

102 • · • ·

120 (iii) Хипотетична: He (iv) Антисенз: Да (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:27:

GGCACAGCAG ATCTTTCAAT AACGTTTCTT TGTAATGGTA AC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:20:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 23 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID Ν0:2θ:

CTAACAGACT GTTCCTTTCC ATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:29:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 18 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Да (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:29:

GGAGTGGCAC CTTCCAGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:30:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 12 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не • · • ·

121 (iv) Антисенз: He (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:30:

AGCAAAAGCA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:31:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 14 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: едноверижна (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:31:

AGCAGAAGCGGAGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:32:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 35 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (едно- и двуверижна) (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:32:

CCACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:33:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 33 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не • · • · (xi) Описание на последователността; SEQ ID Ν0»33»

GGTACAACCA TGAAGACTAT CATTGCTTTG AGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»34» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 37 базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID N0:34»

CCACATAGAT CTTCAAATGC AAATGTTGCA CCTAATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID Ν0»35» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина: 3Θ базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология» линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична» Не (iv) Антисенз» Не (xi) Описание на последователността» SEQ ID NO»35s

GGTACAACCA TGAAAGCAAA ACTACTAGTC CTGTTATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO»36» (i) Характеристика на последователността» (A) Дължина» 32 базови двойки (B) Тип» нуклеинова киселина (C) Верижност» и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз» Не • · • ·

123 (xi) Описание на последователността; SEQ

ID N0:36;

CCACATTCAG ATGCATATTC

TACACTGCAA AG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:37:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 36 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не

GGTACAACCA TGAAGGCAAT

AATTGTACTA CTCATG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:38:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 36 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология; линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична; Не (iv) Антисенз: Не

ССАСАТТТАТ AGACAGATGG

AGCAAGAAAC ATTGTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:39:

(i) Характеристика на последователността;

(A) Дължина: 33 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността:

SEQ

ID N0:39:

124

GGTACAAGAT CTACCATGCT TCTAACCGAG GTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NOs40s (i) Характеристика на последователността!

(A) Дължина: 36 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична! Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:40:

CCACATAGAT CTTCACTTGA ACCGTTGCAT CTGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:41:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 39 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична! Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:41:

GGTACAGGAT CCACCATGTC CAACATGGAT ATTGACGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:42:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 39 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:42:

CCACATGGAT ССТТААТААТ CGAGGTCATC АТААТССТС • · • · '4 a . · · * · · * * · ' * ^β · · * ·· ·· ··· • * *· · · · ·

125 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID ΝΟ:43·.

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 42 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип» кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:43:

GGTACAGGAT CCACCATGTC GCTGTTTGGA GACACAATTG СС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:44:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 3Θ базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: линейна (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:44:

CCACATGGAT CCTTATAGGT АТТТСТТСАС AAGAGCTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:45:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 3553 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (ii) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:45:

GATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG ТАТССАТАТС ATAATATGTA

CATTTATATT GGCTCATGTC CAACATTACC GCCATGTTGA CATTGATTAT

100

TGACTAGTTA TTAATAGTAA

120 • · «

126

TCAATTACGG GTAAATGGCC TATGTTCCCA CGGTAAACTG GACGTCAATG TTTCCTACTT TGGCAGTACA CCCATTGACG CGTAACAACT ATAAGCAGAG GACCTCCATA ACGCGGATTC CCCTTGGCTT CTCATGTTAT CCACTCCCCT AACTCTCTTT ATTTTTACAG CCCAGTGCCC ACGTGTTCCG TCCCATGCCT AGACTTAGGC GGGTATGTGT CTTAAGGCAG GAGGTAACTC GTTGCTGCCG ATGGGTCTTT TGTTGTTTGC TTCCTAATAA GGGTGGCGTG GGATGCCGTG

GGTCATTAGT CCCCTGGCTG TAGTAACGCC CCCACTTGGC ACGGTAAATG GGCAGTACAT TCAATGGGCG TCAATGGGAG CCCCCCCATT CTCGTTTACT GAAGACACCG CCCGTGCCAA CTTATGCATG AGGTGATGGT ATTGGTGACG' ATTGGCTATA CATGGGGTCT GCAGTTTTTA GACATGGGCT CCAGCGACTC ACAGCACGAT CTGAAAATGA CGGCAGAAGA CCGTTGCGGT CGCGCGCCAC TCTGCAGTCA CCCTCCCCCG AATGAGGAAA CGGCAGCACA GGCTCTATGG

TCATAGCCCA ACCGCCCAAC AATAGGGACT AGTACATCAA GCCCGCCTGG CTACGTATTA TGGATAGCGG TTTGTTTTGG GACGCAAATG GAACCGTCAG GGACCGATCC GAGTGACGTA CTATACTGTT ATAGCTTAGC ATACTTTCCA TGCCAATACA CATTTATTAT TTAAACATGC CTTCTCCGGT ATGGTCGCTC GCCCACCACC GCTCGGGGAG AGATGCAGGC GCTGTTAACG CAGACATAAT CCGTCCTTAG TGCCTTCCTT TTGCATCGCA GCAAGGGGGA GTACGGCCGC

TATATGGAGT GACCCCCGCC TTCCATTGAC GTGTATCATA CATTATCCCC GTCATCGCTA TTTGACTCAC CACCAAAATC GGCGGTAGGC ATCGCCTGGA AGCCTCCGCG AGTACCGCCT TTTGGCTTGG CTATAGGTGT TTACTAATCC CTGTCCTTCA TTACAAATTC TAACGTGGGA AGCGGCGGAG GGCAGCTCCT ACCAGTGTGC CGGGCTTGCA AGCTGAGTTG GTGGAGGGCA AGCTGACAGA ATCTGCTGTG GACCCTGGAA TTGTCTGAGT GGATTGGGAA AGCGGCCGTA

TCCGCGTTAC CATTGACGTC GTCAATGGGT TGCCAAGTAC AGTACATGAC TTACCATGGT GGGGATTTCC AACGGGACTT GTGTACGGTG GACGCCATCC GCCGGGAACG ATAGAGTCTA GGTCTATACA GGGTTATTGA ATAACATGGC GAGACTGACA ACATATACAA TCTCCACGCG CTTCTACATC TGCTCCTAAC CGCACAAGGC CCGCTGACGC TTGTGTTCTG GTGTAGTCTG CTAACAGACT CCTTCTAGTT GGTGCCACTC AGGTGTCATT GACAATAGCA CCCAGGTGCT

ATAACTTACG . . aataatgacg. GGAGTATTTA GCCCCCTATT CTTATGGGAC., GATGCGGTTT, AAGTCTCCAC _v TCCAAAATGT GGAGGTCTAT ACGCTGTTTT· GTGCATTGGA.H TAGGCCCACC CCCCCGCTTC CCATTATTGA TCTTTGCCAC· CGGACTCTGT _; CACCACCGTC;,, AATCTCGGGT CGAGCCCTGC AGTGGAGGCC CGTGGCGGTA ATTTGGAAGA, ATAAGAGTCA AGCAGTACTC GTTCCTTTCC;

GCCAGCCATC CCACTGTCCT CTATTCTGGG GGCATGCTGG( GAAGAATTGA

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

CCCGGTTCCT CGACCCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT TTTTCCATAG GCTCCGCCCC 1980 • · • · » ·

127

CCTGACGAGC	атсасааааа	TCGACGCTCA	AGTCAGAGGT	GGCGAAACCC	gacaggacta ‘	2040
TAAAGATACC	AGGCGTTTCC	CCCTGGAAGC	TCCCTCGTGC	CCTCTCCTCT	r TCCGACCCTG ‘ 4	. 2100
CCGCTTACCG	GATACCTGTC	CGCCTTTCTC	CCTTCGGGAA	GCGTGGCGCT	TTCTCAATGC''	2160
TCACGCTGTA	CGTATCTCAG	TTCGGTGTAG	GTCGTTCGCT	CCAAGCTGGG	CTGTGTGCAC	2220
GAACCCCCCG	TTCAGCCCGA	CCCCTGCCCC	TTATCCGGTA	ACTATCGTCT	TGAGTCCAAC1‘	2280
CCGGTAAGAC	ACGACTTATC	GCCACTGGCA	GCAGCCACTG	GTAACAGGAT	TAGCAGAGCG'	2340
AGGTATGTAG	GCGGTCCTAC	AGAGTTCTTG	AAGTGGTCGC	CTAACTACGG	CTACACTAGC Г;	2400
TGAAGGACAG	TATTTGGTAT	CTGCGCTCTG	CTGAAGCCAG	TTACCTTCGG	aaaaagagtt'	2460
GGTAGCTCTT	GATCCGGCAA	ACAAACCACC	GCTGGTAGCG	gtggtttttt	TGTTTGCAAG	2520
CAGCAGATTA	CGCGCAGAAA	AAAAGGATCT	CAAGAAGATC	CTTTGATCTT	TTCTACGTGA	2580
TCCCGTAATG	CTCTGCCAGT	GTTACAACCA	ATTAACCAAT	TCTGATTAGA	AAAACTCATC	2640
GAGCATCAAA	TGAAACTGCA	ATTTATTCAT	ATCAGGATTA	TCAATACCAT	ATTTTTGAAA 1	2700
AAGCCGTTTC	TGTAATGAAG	GAGAAAACTC	ACCGAGGCAG	TTCCATAGGA	TGGCAAGATC '	2760
CTGGTATCGG	TCTGCGATTC	CGACTCGTCC	AACATCAATA	CAACCTATTA	ATTTCCCCTC ''	2820
GTCAAAAATA	AGGTTATCAA	GTGAGAAATC	ACCATGAGTG	ACGACTGAAT	CCGGTGAGAA	2880
TGGCAAAAGC	TTATGCATTT	CTTTCCAGAC	TTGTTCAACA	GGCCAGCCAT	TACGCTCGTC	2940
ATCAAAATCA	CTCGCATCAA	CCAAACCGTT	ATTCATTCGT	GATTGCGCCT	gagcgagacg’	3000
AAATACGCGA	TCGCTGTTAA	AAGGACAATT	ACAAACAGGA	ATCGAATGCA	ACCGGCGCAG	3060
GAACACTGCC	AGCGCATCAA	СААТАТТГТС	ACCTGAATCA	GGATATTCTT	CTAATACCTG'	3120
GAATGCTGTT	TTCCCGGGGA	TCGCAGTGGT	GAGTAACCAT	GCATCATCAG	GAGTACGGAT	3180
AAAATGCTTG	ATGGTCGGAA	GACGCATAAA	TTCCGTCAGC	CAGTTTAGTC	TGACCATCTC	3240
ATCTGTAACA	TCATTGGCAA	CGCTACCTTT	GCCATGTTTC	AGAAACAACT	CTGGCGCATC	3300
GGGCTTCCCA	TACAATCGAT	AGATTGTCGC	ACCTGATTGC	CCGACATTAT	CGCGAGCCCA	3360
TTTATACCCA	TATAAATCAG	CATCCATGTT	GGAATTTAAT	CGCGGCCTCG	AGCAAGACGT	3420
TTCCCGTTGA	ATATGGCTCA	TAACACCCCT	TGTATTACTG	TTTATGTAAG	CAGACAGTTT	3480
TATTGTTCAT	GATGATATAT	TTTTATCTTG	TGCAATGTAA	CATCAGAGAT	TTTGAGACAC	3540

AACGTGGCTT TCC

3553 ф* ·· ·· ·· ···

128 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:46:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 72 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:46:

TCACCGTCCT TAGATCGGTA CAACCATGAA GACTATCATT GCTTTGAGTC

ACATTTTATG TCTGGTTTTC GC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:47:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 111 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:47:

TCATGCTTTT TGCTTTGTGT TGTTTTGCTG GGGTTCATCA TGTGGGCCTG

CCAAAAAGGC AACATTAGGT GCAACATTTG CATTTGAAGA TCTATGTGGG

1ОО

ATCTGCTGTG С

111 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:48:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 63 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (0) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:48 • · • » • · ·

129

TTAGATCGGA ACATGAAAGC AAAACTACTA GTCCTGTTAT GTGCATTTAC

AGCTACATAT GCA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:49:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 102 базови двойки (B) Tuns нуклеинова киселина (C) Верижност: двойноверижна (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:49

CTGGTGCTTT TGGTCTCCCT GGGGGCAATC AGCTTCTGGA TGTGTTCTAA TGGGTCTTTG CAGTGTAGAA TATGCATCTG AATGTGGGAT CTGCTGTGCC ТТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:50:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 100 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не

102 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:50:

CCTTAGATCG GTACAACCAT GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGTAGT AACATCCAAC GCAGATCGAA TCTGCACTGG GATAACATCT ТСАААСТСАС CTCATGTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:51:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 102 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК

1ОО

108 (iii) Хипотетична: Не • · · ·

130 (iv) Антисенз: He (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:51:

TTGGCTGTAA CATTGATGAT AGCTATTTTT ATTGTTTATA TGGTCTCCAG

AGACAATGTT TCTTGCTCCA TCTGTCTATA AATGTGGGAT CTGCTGTGCC TT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:52:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 04 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина

102

(С) Вери жнос т:	и	двете
(D) Топология»	и	двете
(i) Молекулен тип:	кДНК
(iii) Хипотетична:	Не
(iv) Антисенз» Не

(xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:52:

GTCCTTAGAT CCACCATGGC GTCCCAAGGC ACCAAACGGT CTTATGAACA GATGGAAACT GATGGGGAAC GCCAGAATGC ААСТ (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:53:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 100 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:53:

GAAAAGGCAA CGAACCCGAT CGTGCCCTCT TTTGACATGA GTAATGAAGG АТСТТАТТТС TTCGGAGACA ATGCAGAAGA GTACGACAAT TAAGGATC CTGTGCCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:54:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 132 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност» и двете (D) Топология: и двете

Θ4

100

10В

131

(i) Молекулен тип; кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:54:

CTTAGATCCA	GATCTACCAT	GAGTCTTCTA	ACCGAGGTCG	AAACGTATGT	50
ТСТСТСТАТС	GTTCCATCAG	GCCCCCTCAA	AGCCGAAATC	GCGCAGAGAC	100
TTGAAGATGT	CTTTGCTGGG	AAAAACACAG	АТ		132

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:55:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 129 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:55:

GGGACTCATC CTAGCTCCAG TACTGGTCTA AAAGTAGATC TTCTTGAAAA50

TTTGCAGACC TATCAGAAAC GAATGGGGGT GCAGATGCAA CGGTTCAAGT100

GAAGATCTAT GTGGGATCTG CTGTGCCTT129 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:56:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: Θ1 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:56:

CTTAGATCCA CCATGTCCAA CATGGATATT GACGGTATCA ACACTGGGAC

AATTGACAAA ACACCGGAAG АААТААСТТС Т (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:57:

• ·

132 (A) (B) (C) (D) (i) Характеристика на последователността Дължина: 96 базови двойки Тип: нуклеинова киселина Верижност: и Топология: и двете двете (i)

Молекулен тип» кДНК (iii)

Хипотетична! Не (iv)

Антисенз: Не (xi )

Описание на последователността: SEQ ID N0:57:

GTTGAAATTC CAATTAAGCA

GACCATCCCC ААТТТСТТСТ TTGGGAGGGA

CACAGCAGAG GATTATGATG

ACCTCGATTA TTAAGGATCT GCTGTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEG

ID N0:58:

(A) (B) (C) (D) (i) Характеристика на последователността: Дължина: 96 базови двойки Тип: нуклеинова киселина Верижност: и Топология: и двете двете (i)

Молекулен тип:

кДНК ( iii)

Хипотетична: Не (iv)

Антисенз: Не ( xi)

Описание на последователността: SEQ ID N0:58

CTTAGATCCA CCATGTCGCT

GTTTGGAGAC ACAATTGCCT ACCTGCTTTC

ATTGACAGAA GATGGAGAAG

GCAAAGCAGA ACTAGCAGAA АААТТА (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ

ID N0:59:

(A) (B) (C) (D) (i) Характеристика на последователността Дължина: 123 базови двойки Тип: нуклеинова киселина Верижност: и Топология: и двете двете (i)

Молекулен тип:

кДНК (iii)

Хипотетична: Не (iv)

Антисенз: Не (xi)

Описание на последователността: SEQ ID N0:59

AGATCTCTTG GGGCAAGTCA

AGAGAATGGG GAAGGAATTG CAAAGGATGT

GATGGAAGTG CTAAAGCAGA GCTCTATGGG AAATTCAGCT CTTGTGAAGA

1ОО

133

AATACCTATA AGGATCTGCT GTG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:60:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 33 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не

123 (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:60:

GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:61:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 36 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:61:

CCACATCTCG AGGAACCGGG ТСААТТСТТС AGCACC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:62:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 38 базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:62:

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC ТСААААТС

134 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO:63s (i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 37 Вазови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:63:

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT ТАСААСС (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:64:

(i) Характеристика на последователността:

(A) Дължина: 39 Базови двойки (B) Тип: нуклеинова киселина (C) Верижност: и двете (D) Топология: и двете (i) Молекулен тип: кДНК (iii) Хипотетична: Не (iv) Антисенз: Не (xi) Описание на последователността: SEQ ID N0:64:

GGTACATGAT CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG

Claims (12)

1. ПАТЕНТНИ

   135 нуклеинова

   ». ··

   4 « -·

   ПРЕТЕНЦИИ

   ДНК-кострукци я , характеризираща се с това, че включва киселина, която кодира ген на грипен вирус, където споменатата ДНК-конструкция е способна да индуцира експресията на антигенен генен продукт на грипния вирус, който индуцира специфичен имунен отговор срещу грипния вирус след въвеждане на споменатата

   ДНК-конструкция в животински тъкани in vivo с последващо включване на ДНК-констрнкцията от клетките, кои то експреси рат кодирания грипен ген
2. 2. ДНК-конструкцията, съгласно претенция

   1, където генът на грипния вирус кодира гениите продукти на грипния вирус нуклеопротеин, хемаглутинин, полимераза, матриксен белтък или неструктурни белтъци

   Полинуклеотидна ваксина, характеризираща се с това, не включва ДНК-конструкция, която индуцира неутрализиращи антитела срещу човешки грипен вирус, специфични за грипния вирус ци тотоксични лимфоцити или защитни имунни отговори след въвеждане на споменатите ДНК-лекарствени препарати в животински тъкани in vivo, където животното гръбначно, полинуклеотидната ваксина кодира ген на грипния вирус, който се експресира след въвеждане тъкани те на споменатото гръбначно животно in να уо

   Полинуклеотидната ваксина, съгласно претенция 3, която съдържа ДНК-конструкция, селекционирана от една или повече от следните конструкции:

   а) pnRSV-PR-NP,

   Ь)

   V1-PR-NP,

   с)

   V1J-PR-NP,

   5'-краят на която е SEQ. ID:12

   d)

   V1J-PR-PB1 , 5'-краят на която е SEQ. ID:13 • · · • *

   136

   e) V1J-PR—NS, 5'-краят на която е SEQ. ID:14:,

   f) V1J-PR-HA, 5'-краят на която е SEQ. ID:15:,

   g) V1J-PR—РВ2, 5'-краят на която е SEQ. 10:16:,

   h) V1J-PR—Ml, 5'-краят на която е SEQ. ID:17:,

   ί) VIJneo-BJ-NP, 5'-краят на която е SEQ. ID:20: И 3' -к раят на която е SEQ. ID:21:, 1) VIJneo-BJ-NP, 5'-краят на която е SEQ. ID:20: Μ 3' — к раят на която е SEQ. ID:21:, J) VIJneo—TX-NP, 5'-краят на която е SEQ. ID:24: и 3' — к раят на която е SEQ. ID:25:, к) VIJneo-PA-HA, 5'-краят на която е SEQ. ID-.26: и 3'

   -краят на която е SEQ. ID:27:,

   1) VIJns-GA-HA (А/Джорджия/03/93), големина на конструкцията 6,56 КБ

   5'-краят на която е SEQ.ID:46: и
3. 3'-краят на която е SEQ. ID:47:,

   м) VIJns—ТХ—НА (А/Тексас/36/91), големина на
4. 5'-краят на която е SEQ.

   ID:48 и

   3'-краят на която е SEQ. ID:49,

   n) VlJns-PA-HA (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 6,61 КБ, 5'-краят на която е SEQ

   ID:50: и

   3’-краят на която е SEQ. ID:51:,

   о) VIJns—BJ—NP (А/Пекин/353/89), големина на

   З-краят на която е SEQ. 10:53:,

   р) VIJns-BJ-Ml (А/Пекин/353/89), големина на конструкцията 5,62 КБ, 5'-краят на която е SEQ

   ID:54: и

   3'-краят на която е SEQ. ID:55:,

   q) VIJns-PA-NP (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 6,54 КБ, 5'—краят на която е SEQ

   ID:56: и

   З-краят на която е SEQ. ID:57:

   137

   r) VIJns—PA—Ml (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 5,61 КБ

   5'-краят на която е SEQ. ID:58: и

   3'-краят на която е SEQ. ID:59:.

   5. Еспресионният вектор V1J, SEQ. ID:10:.
5. 6. Еспресионният вектор VIJ-neo, SEQ. ID:18:.
6. 7. Метод за предпзаване от заразяване с човешки грипен вирне, който се характеризира с това, че включва имунизация с профилактично ефективно количество ДНК, съгласно претенция 1.
7. 8. Метод за предпзаване срещи заразяване с човешки грипен вирне, който се характеризира с това, че включва имунизация с профилактично ефективно количество ДНК, съгласно претенция 3.

   9. Метод за предпзаване срещу заразяване с човешки грипен вирус, който се характеризира с това, че включва

   имунизация с профилактично ефективно количество ДНК, съгласно претенция 4.
8. 10. Методът, съгласно претенция 7, който се характеризира с това, че включва директно приложение на ДНК в тъканта in vi vo

   Методът съгласно претенция 10, където ДНК се прилага или като гола

   ДНК във физиологично приемлив разтвор Без носител, или като смес от

   ДНК и липозоми, или като смес с адювант или с агент , улесняващ трансФекцията

   Метод за използуване на ген на грипния вирне , за да се инднцира имунен отговор in vivo, който се характеризира с това, че включва

   а) изолиране на гена

   Ь) свързване на гена с регулаторни последователности така, че генът да е оперативно присъединен към контролни • * » » • · ·
9. 13S последователности, които, когато се внесат жива тъкан, направляват инициацията на транскрипцията последващата транслация на гена и

   с) въвеждане на гена в жива тъкан още

   13. Метод, съгласно претенция 12, който се характеризира с това, че включва усилване на индицирани я имннен отговор чрез многократно въвеждане на ген на грипния вирис

   Метдът, съгласно претенция 12, където генът на грипни я вирис кодира никлеопротеин, хемаглнтинин, матри ксен

   Белтък, нес т ри к т и рен

   Белтък или полимеразен генен продикт на човешк и грипен вирис

   Метод, съгласно претенция 14, където генът на човешкия грипен вирис кодира никлеопротеин, базична полимераза!, нест риктирен белтък!, хемаглнтинин.

   матриксен Белтък! или

   Базична полимераза2 на един или повече от изолатите на човешкия грипен вирис

   A/PR/8/34,

   A/Пекин/353/89,

   А/Тексас/36/91,

   А/Джорджия/03/93 и В/Паиама/45/90.

   Метод за индуциране на иминен отговор с рещи зарзаяване или заболяване , причинено от щамове на грипния вирис, който се характеризира с това, че включва въвеждане в гръбначни (животни) на нуклеинова киселина, която кодира консервативен епитоп на грипния вирус, специфичен за един първоначален щам на грипния индицирани ят иминени отговор предпазва не само от заболяване и зарзяване с първоначалния щам на грипния вирне, но предпазва също и от заболяване или заразяване с щамове, които са различни от споменатия първоначален щам.
10. 17. Методът, съгласно всяка от претенциите 7-16, където организнът, който се третира съгласно метода, е човек
11. 18. ДНК

    a) pnRSV-PR-NP • · • · · · · ·

    139

    b) Vl-PR-NP, с) V1J-PR-NP, 5'-краят на която e SEQ. ID:12:, d) V1J-PR-PB1 , 5'-краят на която е SEQ. ID:13:, е) V1J-PR-NS, 5'-краят на която е SEQ. ID:14:, f ) V1J-PR-HA, 5'-краят на която е SEQ. ID:15:, 9) V1J-PR-PB2 , 5'-краят на която е SEQ. ID :16:, h) V1J-PR-Ml, 5'-краят на която е SEQ. ID:17:, i) VIJneo—BJ- NP, 5'-краят на която е SEQ. ID:20:

    и

    -краят на която е SEQ. ID:21

    3'

    i) VIJneo-BJ-NP,

    5'-краят на която

    SEQ

    ID:20:

    3'

    -краят на която е SEQ. ID:21

    j) VIJneo—TX-NP,

    5'-краят на която

    SEQ.

    ID:24:

    3'

    -краят на която е SEQ. ID:25:,

    к) VIJneo-РА-НА,

    5'-краят на която

    SEQ

    ID:26:

    3'

    -краят на която е SEQ. ID :27:,

    1) VIJns—GA-HA (А/Джорджия/03/93), големина на конструкцията 6,56 Кб, 5'-краят на която е SEQ.

    ID:46: и

    3'—краят на която е SEQ. ID:47:

    и) Vldns-ТХ-НА (А/Тексас/36/91) , големина на

    5'-краят на която е SEQ.

    ID-.4B и

    3'-краят на която е SEQ. ID:49,

    п) VIJns-PA-HA (В/Панама/45/90) , големина на конструкцията 6,61 Кб,

    5'-краят на която е SEQ.

    3'-краят на която е SEQ. ID:51:

    о) VIJns-BJ-NP (А/Пекин/353/89) , големина на конструкцията 6,42 Кб,

    5'-краят на която е SEQ.

    3'-краят на която е SEQ. ID:53:

    р) VIJns—BJ-M1 (А/Пекин/353/89) , големина на конструкцията 5,62 Кб, 5'-краят на която е SEQ.

    ID:54:

    3'-краят на която е SEQ. ID:55:

    • · ·

    140

    q) VlJns-PA-NP (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 6,54 Κδ, 5-краят на която е SEQ. ID:56: и 3'-краят на която е SEQ. ID:57:,

    г) VIJns-PA-Ml (В/Панама/45/90), големина на конструкцията 5,61 Κδ, 5'-краят на която е SEQ . ID:5G: и 3'—краят на която е GEQ . ID:59:.

    Смес от конструкции на нуклеинови киселини, които кодират грипновирусни гени, както на тип А, така и на тип В човешки грипни вируси

    20. Сместа, съгласно претенция 19, характеризираща се с

    това, че включва конструкции на нуклеинови киселини кодират хемаглутининовия ген на най -малко три щаиа на вирус, нуклеопротеиновия ген на най —малко два щама на вирус и гена на матриксния белтък на най—ма лко два грипния вирус.

    грипни я грипни я щама на претенция , които

    Сместа, съгласно
12. 19, където споменатите гени на грипния вирус произхождат от

    H1N1-H2N2-, H3N2- и Вщамове на грипния вирус

    Сместа, съгласно претенция

    19 се характеризира това, че включва

    a) VIJns—GA-HA (А/Джорджия/03/93) , големина на конструкцията 6,56 Кб, 5'-краят на която е SEG

    ID: 46

    З'~краят на която е SEQ. ID:47:

    b) VIJns-TX-HA (А/Тексас/36/91) големина на конструкцията 6,56 Кб ,

    5'-краят на която е SEQ

    ID-.4G

    3'-краят на която е SEQ . ID:49,

    с) VIJns-PA-HA (В/Панама/45/90) големина на конструкцията 6,61 Кб, 5'-краят на която е SEQ

    3'-краят на която е SEQ. ID:51:

    • · • ·

    141 големина на конструкцията 6,42 КБ,

    5'-краят на която е SEQ

    ID: 52

    3'-краят на която е SEQ. ID:53

    е) VIJns-BJ-Ml (А/Пекин/353/89) големина на конструкцията 5,62 КБ, 5'-краят на която е SEQ

    ID: 54

    3'-краят на която е SEQ . ID:55 •f) VIJns-PA-NP (В/Панама/45/90) , големина на конструкцията 6,54 КБ, 5'-краят на която е SEQ

    ID:56

    3'-краят на която е SEQ. ID:57:

    g) VIJns-PA-Ml (В/Панама/45/90) , големина на конструкцията 5,61 КБ, 5'-краят на която е SEQ

    ID:58:

    3’-краят на която е SEQ. ID:59 вирне,

    23. Експресионни ят вектор VIJns 24 . Експресионни ят вектор V1JR, SEQ. IDs 45: . 25. Използуването на изолиран ген на чов оперативно свързан с една и ли повече

    регулаторни ешкия грипен срещу заразяване с човешки грипен вирне

    26. ДНК-констрнкция, която се характеризира с това, че включва грипновирнсен нчклеопротеиное ген, оперативно свързан с регнлаторана поседователност, при което ДНК-констрнкцията може да индицира имунен отговор, специфичен срещу грипния вирус, след въвеждане на ДНК-констрнкцията в животински клетки in vivo, a регулаторната последователност е различна от тази във вектори на основата на вируса на птичата левкоза и на fow1ροχ-вириса.

    27. ДНК-кострнкцията, съгласно претенция 1, селекционирана от:

    (а) плазмид рп RSV-PR-NP;

    (Ь) плазмид V1-PR-NP;

    • · • · • · · ·

    ... ·

    142

    (с) плазмид VIJneo-NJ-NP (d) плазиид VlJneo-TX-NP (е) плазмид VIJns-BJ-NP; (f ) плазмид VlJns-PA-NP

    и (В/Панама/45/90).

    2Θ.

    Инуногенна смес, харак тери зи раща се това, че включва

    29. Имуногенна смес, характеризираща се това, че включва

    30. Ваксина, характеризираща се с това, че включва

    ДНКкострукцията, съгласно претенция 26.

    31. Ваксина, характеризираща се с това, че включва

    ДНКкострукцията, съгласно претенция 27

    32.

    Метод за индуциране на имунен отговор, специфичен за грипния вирус, в индивид, който метод се характеризира с това, че индивидът се третира с ДНК-конструкцията, съгласно претенция

    26.

    грипния вирус, в индивид, който метод се характеризира с това, че индивидът се третира с ДНК-констрнкцията, съгласно претенция

    27.

    34. Метод за ваксинация на индивид, характеризиращ се с това, че индивидът се третира

    ДНК-конструкцията, съгласно претенция 26.

    35. Метод за ваксинация на индивид, характеризиращ се с това, че индивидът се третира

    ДНК-конструкцията, съгласно претенция 27.

    _l ОС CC CD o CM in io in

    _1 oc CC CO co xt CM CM CM 1П tn in