BRPI0706913A2

BRPI0706913A2 - vacina com base em levedura para induzir uma reação imune

Info

Publication number: BRPI0706913A2
Application number: BRPI0706913-8A
Authority: BR
Inventors: Richard C Duke; Alex Franzusoff; Aurelia Haller; Thomas H King; Yingnian Lu; Viictoria Kelley Hodson
Original assignee: Globeimmune Inc
Priority date: 2006-02-02
Filing date: 2007-02-02
Publication date: 2011-04-12
Also published as: AU2007212076B2; CN104826102A; CN101405026A; JP5198290B2; US20100196411A1; IL193196A0; IN2014DN08830A; MX2008009929A; IL232518A0; EP1988919A4; US20080003239A1; JP2009528987A; EP2468296A3; KR20140029551A; JP2013075899A; SG10201402236VA; IL193196A; US7736642B2; CN101405026B; WO2007092792A3

Abstract

VACINA COM BASE EM LEVEDURA PARA INDUZIR UMA REAçãO IMUNE, a invenção fornecida no presente refere-se às vacinas que podem ser adaptadas para atingir uma resposta imune desejada. Algumas composições aqui fornecidas são usadas para preferencialmente obter uma resposta imune humoral, enquanto outras composições são úteis parapreferencialmente obter uma resposta mediada por célula. As combinações das composições de vacina também são úteis para obter ambos os tipos de respostas e/ou para modular o tipo de resposta imune obtidas. A invenção também fornece os métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo ao administrar as composições reveladas no presente. Essas respostas imunes são úteis para proteger um indivíduo de diversos tipos de doenças, infecções e condições indesejáveis.

Description

"VACINA COM BASE EM LEVEDURA PARAINDUZIR UMA REAÇÃO IMUNE".

Campo da Invenção

A presente invenção geralmente refere-se àsvacinas com base em levedura que podem trazer à tona diversostipos de reações imunes protetores e terapêuticas, incluindorespostas imunes medidas por célula e/ou humoral. Ascomposições incluindo tais vacinas com base em levedura emétodos para usar tais vacinas, incluindo em combinação comoutros tipos de vacinas, são revelados no presente. Uma variedadede composições e métodos para vacinar um animal contra ainfecção de influenza e para tratar ou prevenir a infecção deinfluenza em um animal, também são revelados.

Histórico da Invenção As vacinas são uma das medidas de mais

custo compensador disponíveis na indústria de cuidado com asaúde, para a prevenção e tratamento de doença. Permanece,entretanto, uma necessidade urgente para desenvolver as vacinasseguras e eficazes e adjuvantes para uma variedade de doenças, incluindo aquelas provocadas por ou associadas à infecção poragentes patogênicos, cânceres, defeitos genéticos e outrosdistúrbios do sistema imune. As publicações sobre vacinas, porexemplo, Rabinovich e outros, Ciência 265, 1401-1404 (1994),declaram que ainda existe uma necessidade para vacinas seguras e estáveis ao calor que podem ser administradas oralmente e quesomente precisam ser administradas algumas vezes,preferivelmente no início da vida. São também preferidas as vacinasde combinação que podem proteger os indivíduos de mais de umadoença, bem como vacinas que não exigem um adjuvante e quepodem extrair imunidade mediada por célula, humoral e da mucosa.Até agora, muitas poucas, se houver, vacinas atendem essescritérios.

Os patógenos neutralizados ou atenuadossão freqüentemente usados em vacinas convencionais, eespecificamente em vacinas contra infecções virais. Por exemplo,dois tipos de vacinas de influenza estão atualmente em uso. Avacina mais convencional é uma vacina desativada (contendo ovírus neutralizado) que é fornecida através de injeção, tipicamenteno braço. Uma segunda vacina, denominada a vacina de gripe porspray nasal (por vezes denominada LAIV para Vacina de InfluenzaAtenuada Viva), foi aprovada em 2003 e contém os vírus vivosatenuados (enfraquecidos), administrada por pulverização nasal.

Conforme estabelecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS),os vírus de influenza tipo AeB são causas comuns das doençasrespiratórias agudas. Embora ambos os tipos de vírus podemprovocar epidemias de morbidade e mortalidade consideráveis, asinfecções de influenza B são freqüentemente limitadas a surtoslocalizados, enquanto que os vírus de influenza A são as causasprincipais de epidemias maiores, incluindo pandemias mundiais. Ovírus de influenza é um membro da família de vírus Ortomixo, epossui uma ampla variação de hospedeiro, incluindo humanos,cavalos, cães, pássaros e porcos. É um vírus envelopado de RNAde senso negativo, produzido em 8 segmentos de RNA codificando10 proteínas virais. O vírus duplica-se no núcleo de uma célulahospedeira infectada. O vírus de influenza é mais perigoso para osmais jovens e mais velhos, ou indivíduos imunocomprometidos. Ovírus pode ser propagado em alta concentração em ovos degalinha, que servem como veículo para a geração do vírus para aprodução das vacinas de influenza.

Os vírus de influenza A são submetidos àsalterações freqüentes em seus antígenos de superfície, enquantoque os vírus de influenza tipo B alteram-se com menos freqüência.

A imunidade após a infecção por uma cepa não pode protegertotalmente contra as variantes antigênicas subseqüentes. Comoconseqüência, as novas vacinas contra influenza devem serprojetadas a cada ano para combinar com as cepas em circulaçãoque têm a maior probabilidade de provocar a próxima epidemia.Portanto, a OMS anualmente coleta os dados com base emfiscalização das cepas de influenza mais prevalecentes circulandoentre as pessoas e realiza recomendações para a composição davacina de influenza. Atualmente, as vacinas incluem dois subtiposdo vírus de influenza A e um vírus de influenza B na vacina. Avacina tipicamente protege aproximadamente 50% - 80% de adultossaudáveis contra a doença clínica.

As vacinas de sub-unidade, cujodesenvolvimento foi possível através de tecnologia de DNArecombinante, têm sido frustradas até agora, conforme exibemsomente a "immunogenicidade" limitada. Um exemplo é o testeclínico recente de diversas vacinas de sub-unidade de HIV (vírus daimunodeficiência humana), que foi interrompido não somente devidoà eficácia limitada das vacinas, porém, também devido, em algunscasos, os indivíduos imunizados demonstraram progressãoacelerada da doença, quando foram subseqüentemente expostosao HIV; vide, por exemplo, Cohen, Ciência 264:1839 (1994); eCohen, Ciência 264: 660 (1994). Uma desvantagem das vacinas desub-unidade, bem como, das vacinas de vírus neutralizado e vírusvivo recombinante, é que enquanto aparentam estimular uma fortereação imune humoral, elas deixam de extrair a imunidade mediadapor célula protetora. Uma conclusão principal na ConferênciaInternacional de 1994 da AIDS foi que permanece uma necessidadepara uma resposta mediada por célula T citotóxica para impedir oureduzir, a contaminação do HIV1 que até agora está deficiente emvacinas na clínica. Além disso, as vacinas de HIV testadas atéagora deixaram de extrair a imunidade nas superfícies da mucosaem que a infecção primária do HIV ocorre.

Além do mais, os únicos adjuvantesaprovados para uso nos Estados Unidos são os sais de alumínio,hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, nenhum dos quaisestimula a imunidade mediada por célula. Além disso, asformulações do sal de alumínio não podem ser congeladas ouliofilizadas, e tais adjuvantes não são eficazes com todos osantígenos.

As células de levedura foram usadas naprodução das vacinas de proteína de sub-unidade, incluindoalgumas daquelas testadas nos testes de vacina do HIV acimamencionados. A levedura também foi alimentada aos animais antesda imunização para tentar preparar a resposta imune de uma formanão específica (isto é, para estimular a fagocitose, bem como, aprodução do complemento e interferon). Os resultados foramambíguos, e tais protocolos não geraram a imunidade mediada porcélula protetora; vide, por exemplo, Fattal-German e outros, Pad.Biol. Dev. 77: 115-120 (1992) e Bizzini e outros, Imunol. Microbiol.FEMS 2: 155-167 (1990).

Os estudos anteriores demonstraram opotencial para usar levedura S. cerevisiae recombinante como umavacina e vetor de imunoterapia. Vide, p.ex., Patente Norte-Americana N0S 5,830,463 e 7,083,787, bem como, a Publicação dePatente Norte-Americana N0S 2004-0156858 A1 e 2006-0110755A1. Esses produtos imunoterapêuticos com base em levedura foramdemonstrados para extrair as reações imunes que são capazes deneutralizar as células alvo expressando uma variedade deantígenos virais e cancerígenos in vivo, em uma variedade deespécies animais, e fazendo isso em um modo mediado por CTLCD8+ específico de antígeno. Vide também Stubbs.e outros, Med.A/aí. 7:625-629 (2001) e Lu e outros Pesquisa de Câncer 64:5084-5088 (2004). Mais especificamente, outros estudos demonstraramque o Saccharomyces eerevisiae é avidamente fagocitado por ediretamente ativa as células dendríticas que então apresentam asproteínas associadas à levedura para células CD4+ e CD8+ T deuma forma altamente eficiente. Vide, p.ex., Stubbs e outros, Med.de Natureza 5:625-629 (2001) e Patente Norte-Americana N07,083,787.

Além de ser capaz de interagir diretamentecom as células dendríticas, a levedura possui uma variedade deoutras características que as tornam uma plataforma ideal paraimunoterapia. Primeiro, os antígenos múltiplos podem serplanejados para expressão dentro de uma única cepa de levedura(vide, p.ex., Pichuantes e outros, "Expressão de produtos do geneheterólogo em levedura." Em Engenharia de Proteína - Princípios ePrática, pp. 129-162, J. L. Cleland e C. S. Craik, eds., Wiley-Liss,Nova York (1996). Essas formulações compartilham muitasvantagens com as vacinas de DNA, incluindo a facilidade deconstrução e a capacidade de direcionar em antígenos múltiplos.Diferente das vacinas de DNA, as formulações imunoterapêuticascom base em levedura não exigem a purificação extensiva pararemover os contaminantes potencialmente tóxicos. A U.S. Food andDrug Administration (FDA) [Agência Norte-Americana para Drogase Alimentos] projetou a levedura como GRAS (ReconhecidaGeralmente como Segura). Como tal, a preocupação sobretoxicidade e segurança que existe com outros vetores de vacinanão se aplica aos veículos de administração com base em levedura.

Apesar de todos os esforços existentes paraproduzir vacinas eficazes, ainda permanece uma necessidade paraas composições de vacina que sejam eficientes na estimulação deuma variedade de respostas imunes. Com relação às vacinas deinfluenza, as taxas de doenças entre crianças, idosos edeterminados grupos de alto risco ainda são significativas, e nospaíses em desenvolvimento, a vacinação pode ser esporádica ounão existente. Nos países industrializados, a produção de vacina deinfluenza suficiente para acomodar a população receptora éobstruída pelos problemas de produção, altas despesas e o tempoexigido para produzir a vacina usando as tecnologias atuais. Alémdisso, as ameaças de novas cepas virais e a possibilidade depandemia futura aumentaram o interesse em vacinas de influenzamais eficazes e eficientemente produzidas. Portanto, existe umanecessidade na técnica para vacinas melhoradas que fornecemproteção de longa duração e eficaz contra uma variedade de cepasde influenza, e que podem ser produzidas rápida e seguramentepara uso em humanos e outros animais. Entretanto, essaspreocupações e necessidades não são exclusivas para vacinas deinfluenza, porém se estendem aos outros tipos de vacinas, incluindovacinas direcionadas a outros vírus e outros agentes infecciosos.

De fato, muitos patógenos, incluindobactérias e parasitas, infeccionam indivíduos em etapas,apresentando um subconjunto diferente de antígenos para osistema imune para tratar em cada etapa. Além disso, muitospatógenos desenvolveram uma série de estratégias que permiteque o patógeno "esconda-se" de ou de outro modo fuja do sistemaimune. Finalmente, assim como os vírus descritos acima, muitospatógenos desenvolvem-se e produzem mutações nos antígenos,especificamente aqueles expressos ou localizados em suasuperfície, e também é possível serem infeccionados por múltiplasespécies ou cepas de patógenos ao mesmo tempo, todos os quaiscomplicam as estratégias de vacinação. Como exemplo, a infecçãocom o parasita que provoca a malária (p.ex., Plasmodiumfalciparum ou Plasmodium vivax) inicialmente entra no corpo comoum esporozoíta através da corrente sangüínea em decorrência deuma mordida por um mosquito infectado, porém então rapidamenteinfecciona as células do fígado em que o esporozoíta submete-seàs alterações radicais para tornar-se um merozoíta. O merozoíta éliberado da célula do fígado e rapidamente infecciona as hemácias,em que o parasita multiplica-se, diferencia-se e continua ainfeccionar outras células. Conseqüentemente, uma vacina idealseria capaz de preparar o sistema imune para reconhecer e destruirtodas as etapas do parasita, seja no sangue, no fígado ou nashemácias. Entretanto, a maioria das vacinas é incapaz de impedirou erradicar toda a infecção, porém, ao invés disso, estãoenfocadas na limitação da capacidade do patógeno para provocar adoença ou ser tóxica à um indivíduo, enquanto outras etapas dociclo de vida e infecção inerte permanecem não tratadas.

Portanto, para combater a pandemia dedoença infecciosa ou doença provocada por outros agentes, édesejável ter a capacidade de controlar ou influenciar o tipo dereação imune extraída, tais como através de preferencialmenteinduzir uma resposta imune mediada por célula (p.ex., geração decélulas T citotóxicas (CTLs)), preferencialmente extrair uma reaçãohumoral (p.ex., uma resposta de anticorpo), ou extrair ambos ostipos de reações imunes, dependendo da doença ou condiçãosendo prevenida ou tratada, e/ou o status imune de um indivíduocom relação a um antígeno ou patógeno específico em determinadoponto no tempo. Além disso, seria útil fornecer composições quepodem estimular uma resposta imune eficaz com poucasadministrações, e que também são eficazes na estimulação derespostas imunes com exposição a baixos níveis de antígeno (queeconomiza dose).

Sumário da Invenção

A invenção aqui descrita fornece ascomposições e métodos para tratar das necessidades acimadescritas. Os produtos imunoterapêuticos (p.ex., vacinas) com baseem uma tecnologia de plataforma de vacina com base em levedurasão simples para produzir, não são neutralizados por respostasimunes de hospedeiro, podem ser administrados repetidamentepara impulsionar as respostas imunes específicas de antígeno, enão exigem uma abordagem específica de paciente para afabricação.

Uma configuração da invenção refere-se auma vacina. Em um aspecto, a vacina inclui: (a) um primeiro veículode levedura compreendendo pelo menos um antígeno intracelularheterólogo; e (b) um segundo veículo de levedura compreendendopelo menos um antígeno extracelular heterólogo. Em um aspecto, avacina inclui: (a) um primeiro veículo de levedura compreendendopelo menos um antígeno intracelular heterólogo e pelo menos umantígeno extracelular heterólogo; e (b) um segundo veículo delevedura compreendendo pelo menos um antígeno intracelularheterólogo ou pelo menos um antígeno extracelular heterólogo. Emoutro aspecto, a vacina inclui: (a) um veículo de leveduracompreendendo pelo menos um antígeno intracelular heterólogo epelo menos um antígeno extracelular heterólogo; e (b) umacomposição com base em não levedura compreendendo pelomenos um antígeno compreendido pelo veículo de levedura de (a)ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença, em que acomposição com base em não levedura é selecionada a partir deuma vacina de DNA, uma vacina de sub-unidade de proteína, e umpatógeno neutralizado ou desativado.

Na configuração acima da invenção, oveículo de levedura de (a) pode ser formulado para liberação pelamesma via ou via diferente de administração do que a composiçãocom base em não levedura de (b). Em um aspecto, o antígenointracelular é um antígeno que é expresso internamente por umpatógeno. Em um aspecto, o antígeno extracelular é um antígenoque é estruturalmente conservado entre os patógenos do mesmotipo. Em outro aspecto, o antígeno extracelular é um antígeno que éexpresso na superfície de um patógeno. Em um aspecto, o antígenoextracelular é um antígeno que é estruturalmente variável entre ospatógenos do mesmo tipo. Em um aspecto, o antígeno é de umpatógeno infeccioso.

Outra configuração da invenção refere-se auma vacina contendo pelo menos um antígeno de influenza. Em umaspecto, a vacina inclui (a) um veículo de levedura; e (b) umaproteína de fusão do vírus de influenza que é expressa por oufornecida pelo veículo de levedura, a proteína de fusão do vírus deinfluenza compreendendo pelo menos uma porção de uma proteínade influenza selecionada a partir de: uma proteína de matriz deinfluenza (M1) e uma proteína de canal de íon de influenza (M2).Em um aspecto, a vacina inclui (a) um primeiro veículo de leveduraque expressa a proteína de fusão de vírus de influenzacompreendendo pelo menos uma porção de uma proteína deinfluenza selecionada a partir de: uma proteína de matriz deinfluenza (M1), uma proteína de canal de íon de influenza (M2) euma proteína de nucleocapsídeo (NP); e (b) pelo menos um veículode levedura adicional que expressa uma proteína de fusão do vírusde influenza compreendendo pelo menos uma porção de umaproteína de influenza selecionada a partir de: uma proteína dehemaglutinina (HA) e uma proteína de neuraminidase (NA). Em umaspecto, a vacina inclui (a) um veículo de levedura; e (b) umaproteína de fusão de vírus de influenza que é expressa ou fornecidapelo veículo de levedura, a proteína de fusão de vírus de influenzacompreendendo pelo menos uma porção de pelo menos umaproteína de influenza selecionada a partir de: uma proteína dematriz de influenza (M1), uma proteína de canal de íon de influenza(M2) e uma proteína de nucleocapsídeo (NP); e pelo menos umaporção de pelo menos uma segunda proteína de influenzaselecionada a partir de: uma proteína de hemaglutinina (HA) e umaproteína de neuraminidase (NA). Em outro aspecto, a vacina inclui(a) um veículo de levedura; (b) uma primeira proteína de fusão devírus de influenza que é expressa por ou fornecida pelo veículo delevedura, a primeira proteína de fusão de vírus de influenzacompreendendo pelo menos uma porção de pelo menos umaproteína de influenza selecionada a partir de: uma proteína dematriz de influenza (M1), uma proteína de canal de íon de influenza(Μ2) e uma proteína de nucleocapsídeo (NP); e (c) uma segundaproteína de fusão de vírus de influenza que é expressa pelo veículode levedura, a segunda proteína de fusão de vírus de influenzacompreendendo pelo menos uma porção de pelo menos umaproteína de influenza selecionada a partir de: uma proteína dehemaglutinina (HA) e uma proteína de neuraminidase (NA). E aindaem outro aspecto, a vacina inclui (a) um veículo de levedura; e (b)pelo menos uma porção de pelo menos uma primeira proteína devírus de influenza selecionada a partir de: uma proteína de matrizde influenza (M1), uma proteína de canal de íon de influenza (M2) euma proteína de nucleocapsídeo (NP); e (c) pelo menos umaporção de pelo menos uma segunda proteína de influenzaselecionada a partir de: uma proteína de hemaglutinina (HA) e umaproteína de neuraminidase (NA).

Na configuração acima, em um aspecto, aproteína de HA é selecionada a partir de: H1, H2, H3, H4, H5, H6,H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e H16. Em um aspecto,a proteína de HA é selecionada a partir de: H1, H2 e H3. Em umaspecto, a proteína de HA é H5. Em um aspecto, a proteína de NAé selecionada a partir de: N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 e N9. Emum aspecto, a proteína de NA é selecionada a partir de: N1 e N2.Em um aspecto, a proteína de M1 é intracelular com relação aoveículo de levedura. Em um aspecto, a proteína de M2 éintracelular, extracelular, ou ambas, com relação ao veículo delevedura. Em um aspecto, a proteína de M2 é M2e. Em um aspecto,a proteína de NP é intracelular com relação ao veículo de levedura.Em um aspecto, a proteína de HA ou a proteína de NA sãoextracelulares com relação ao veículo de levedura. Nesse aspecto,a proteína de NA também pode ser intracelular com relação aoveículo de levedura.

Na configuração acima, em um aspecto, aproteína de fusão de vírus de influenza compreende em seu términoN, a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N0: 1(MADEAP). Em um aspecto, a proteína de fusão de vírus deinfluenza compreende em seu término N ou término C pelo menosuma porção de uma proteína de Aga2 ou uma proteína de Cwp2suficiente para direcionar a proteína de fusão à parede celular doveículo de levedura.

Outra configuração da invenção inclui umavacina incluindo: (a) um veículo de levedura; e (b) uma proteína defusão de vírus de influenza compreendendo um antígeno de M1 queé expresso como uma única proteína de fusão intracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo na SEQ ID N04.

Outra configuração da invenção inclui umavacina incluindo: (a) um veículo de levedura; e (b) uma proteína defusão de vírus de influenza compreendendo um antígeno de H1 queé expresso como uma única proteína de fusão intracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada a partir de: SEQ ID N0: 6 eSEQ ID N0: 20.

Ainda, outra configuração da invenção incluiuma vacina incluindo (a) um veículo de levedura; e (b) uma proteínade fusão de vírus de influenza compreendendo um antígeno de H1que é expresso como uma única proteína de fusão extracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada a partir de: SEQ ID N°: 10,SEQ ID N0: 26, SEQ ID N0: 28 e SEQ ID N0: 36.Outra configuração da invenção refere-se auma vacina incluindo (a) um veículo de levedura; e (b) uma proteínade fusão de vírus de influenza compreendendo um antígeno de H5que é expresso como uma única proteína de fusão extracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada a partir de: SEQ ID N0: 14,SEQ ID N0: 22 e SEQ ID N0: 24.

Ainda, outra configuração refere-se a umavacina compreendendo (a) um veículo de levedura; e (b) umaproteína de fusão de vírus de influenza compreendendo umantígeno de M1, um antígeno de N1 e quatro antígenos de M2e,que são expressos como uma única proteína de fusão intracelularpelo veículo de levedura, a proteína de fusão consistindo na SEQ IDN0: 16.

Outra configuração da invenção refere-se auma vacina compreendendo (a) um veículo de levedura; e (b) umaproteína de fusão de vírus de influenza compreendendo umantígeno de N1 e dois antígenos de M2e que são expressos comouma única proteína de fusão intracelular pelo veículo de levedura, aproteína de fusão consistindo na SEQ ID N0: 18.

Outra configuração da invenção refere-se auma vacina compreendendo (a) um veículo de levedura; e (b) umaproteína de fusão de vírus de influenza compreendendo umantígeno de H3 e um antígeno de N2 que são expressos como umaúnica proteína de fusão extracelular pelo veículo de levedura.

Em quaisquer das configurações acima, emum aspecto, a expressão da proteína de fusão está sob o controlede um promotor induzível. Em um aspecto de quaisquer dasconfigurações acima, o promotor é selecionado a partir de CUP1 eTEF2.

Em um aspecto de quaisquer dasconfigurações acima, o veículo de levedura é selecionado a partirde uma levedura inteira, esferoplasto de levedura, citoplasto delevedura, uma levedura seca, um preparo de parede celular delevedura, e um extrato de membrana de levedura subcelular ou suafração. Em um aspecto de quaisquer das configurações acima, umacélula de levedura ou esferoplasto de levedura usado para prepararo veículo de levedura foi transformada com uma molécula de ácidonucléico recombinante codificando a proteína de fusão, de modoque a proteína de fusão é expressada pela célula de levedura ouesferoplasto de levedura. Em um aspecto de quaisquer dasconfigurações acima, a célula de levedura ou esferoplasto delevedura que expressa a proteína de fusão é usado para produzirum veículo de levedura compreendendo um citoplasto de levedura,uma levedura seca, um preparo da parede celular de levedura ouum extrato de membrana de levedura subcelular ou sua fração. Emum aspecto de quaisquer das configurações acima, o veículo delevedura é de uma levedura não patogênica. Em um aspecto dasconfigurações acima, o veículo de levedura é de uma leveduraselecionada a partir de: Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Kluveromyces, Hansenula, Candida e Pichia. Em um aspecto dequaisquer das configurações acima, Saccharomyces é S.cerevisiae.

Em um aspecto de quaisquer dasconfigurações acima, a vacina ainda compreende uma céluladendrítica, em que a célula dendrítica foi carregada de formaintracelular com o veículo de levedura.

Em um aspecto de quaisquer dasconfigurações acima, a vacina ainda compreende pelo menos ummodificador de resposta biológica.

Outra configuração da invenção refere-se aouso de quaisquer das vacinas aqui descritas no preparo de umaformulação para extrair uma reação imune específica de antígeno.

Ainda, outra configuração da invençãorefere-se ao uso de quaisquer das vacinas aqui descritas nopreparo de uma formulação para proteger um animal contra ainfecção de influenza.

Outra configuração da invenção refere-se aouso de quaisquer das vacinas aqui descritas no preparo de umaformulação para extrair uma reação imune mediada por célula,específica de antígeno, contra um antígeno de influenza.

Ainda, outra configuração da invençãorefere-se ao uso de quaisquer das vacinas aqui descritas nopreparo de uma formulação para tratar ou prevenir uma doença oucondição.

Outra configuração da invenção refere-se aouso de quaisquer das vacinas aqui descritas no preparo de umaformulação para imunizar uma população de indivíduos em riscopara tornarem-se infectados com influenza.

Outra configuração da invenção refere-se aouso de quaisquer das vacinas aqui descritas no preparo de umaformulação para tratar uma população de indivíduos que estãoinfectados com influenza.

Outra configuração da invenção refere-se aum método para produzir quaisquer das vacinas com base emlevedura (vacinas compreendendo um veículo de levedura) aquidescritas, compreendendo a cultura do veículo de levedura navacina em um pH superior a pH 5,5.

Ainda, outra configuração da invençãorefere-se a um método para produzir uma vacina de influenza,compreendendo a transfecção de um veículo de levedura com umaproteína de fusão de antígeno de influenza, em que a proteína defusão de antígeno de influenza compreende pelo menos umaporção de uma proteína de vírus de influenza selecionada a partirde: uma proteína de matriz de influenza (M1), uma proteína decanal de íon de influenza (M2) e uma proteína de nucleocapsídeo(NP) do vírus de influenza, uma proteína de hemaglutinina (HA) euma proteína de neuraminidase (NA). Em um aspecto, o métodoinclui a cultura do veículo de levedura em um pH superior a pH 5,5.Os aspectos adicionais incluem, carregamento de um veículo delevedura com uma proteína de vírus de influenza, misturandojuntamente um antígeno de vírus de influenza e o referido veículode levedura, anexando fisicamente um antígeno de vírus deinfluenza a um veículo de levedura, formulação do referido veículode levedura transformado para administração em um indivíduo porinjeção, ou formulação do referido veículo de levedura transformadopara administração em um indivíduo através de administraçãointranasal.

Outra configuração da invenção refere-se aum método para proteger um animal contra a infecção de influenza.O método inclui a administração a um animal que foi infeccionadocom influenza ou estiver em risco de ser infectado com a influenza,quaisquer das vacinas aqui descritas compreendendo um antígenode influenza, em que a administração da vacina ao animal reduz ouprevine a infecção de influenza ou pelo menos um sintomaresultante da infecção de influenza no animal.Ainda, outra configuração da invençãorefere-se a um método para extrair uma reação imune específica deantígeno contra um antígeno de influenza, compreendendo aadministração a um animal das vacinas aqui descritascompreendendo um antígeno de influenza.

Outra configuração da invenção refere-se aum método para extrair uma reação imune específica de antígenocontra um antígeno de influenza em uma população de indivíduosque foram infectados com a influenza, compreendendo aadministração à população de indivíduos de quaisquer das vacinasaqui descritas compreendendo um antígeno de influenza.

Outra configuração da invenção refere-se aum método para imunizar contra influenza uma população deindivíduos que está em risco de tornar-se infectada com a influenza,compreendendo a administração à população de indivíduos dequaisquer das vacinas aqui descritas compreendendo um antígenode influenza. Em um aspecto, a vacina é administrada para prepararo sistema imune antes de reforçá-lo com uma vacina diferente deinfluenza.

Ainda, outra configuração da invençãorefere-se a um método para imunizar um indivíduo contra umadoença ou condição, compreendendo: (a) administração de umaprimeira vacina a um indivíduo, em que a vacina compreende umveículo de levedura compreendendo pelo menos um antígenointracelular heterólogo, em que o antígeno é associado com adoença ou condição; e (b) administração de uma segunda vacina aoindivíduo pelo menos 2 semanas após a administração de (a), emque a segunda vacina compreende um veículo de leveduracompreendendo um antígeno heterólogo extracelular, ou umantígeno que é tanto extracelular quanto intracelular. Em umaspecto, o veículo de levedura na primeira vacina tambémcompreende pelo menos um antígeno extracelular. Nesse aspecto,o antígeno pode ser o mesmo antígeno ou um antígeno diferente doque o antígeno intracelular.

Outra configuração da invenção refere-se aum método para imunizar um indivíduo contra uma doença oucondição, compreendendo: (a) administração de uma primeiravacina à um indivíduo, em que a vacina compreende um veículo delevedura compreendendo pelo menos um antígeno intracelularheterólogo de forma intracelular e pelo menos um antígenoextracelular heterólogo, em que os antígenos são associados com adoença ou condição; e (b) administração de uma segunda vacina aoindivíduo junto com ou subseqüente à administração de (a), em quea segunda vacina é selecionada a partir de: (i) um veículo delevedura que expressa ou fornece pelo menos um dos antígenosheterólogos usados na etapa (a) ou um antígeno do mesmopatógeno ou doença, em que o antígeno é extracelular com relaçãoà levedura, ou tanto intracelular quanto extracelular; (ii) umamembrana de levedura ou parede celular contendo pelo menos umdos antígenos heterólogos usados na etapa (a) ou um antígeno domesmo patógeno ou doença; (iii) um veículo de levedura na mesclacom pelo menos um dos antígenos heterólogos usados na etapa (a)ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença; (iv) uma vacina deDNA codificando pelo menos um dos antígenos usados na etapa (a)ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença; (v) uma vacina desubunidade de proteína compreendendo pelo menos um dosantígenos usados na etapa (a) ou um antígeno do mesmo patógenoou doença ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença; e (vi)um patógeno neutralizado ou desativado compreendendo pelomenos um dos antígenos heterólogos usados na etapa (a). Em umaspecto, o antígeno intracelular é o mesmo antígeno que o antígenoextracelular. Em um aspecto, o antígeno intracelular é diferente doantígeno extracelular. Em um aspecto, o antígeno intracelular é umantígeno que é expresso internamente por um patógeno. Em umaspecto, o antígeno extracelular é um antígeno que éestruturalmente conservado entre os patógenos do mesmo tipo. Emum aspecto, o antígeno extracelular é um antígeno que é expressona superfície de um patógeno. Em um aspecto, o antígenoextracelular é um antígeno que é estruturalmente variável entre ospatógenos do mesmo tipo. Em um aspecto, o antígeno é de umpatógeno infeccioso.

Outra configuração da invenção refere-se aum kit para o preparo de uma formulação para extrair uma reaçãoimune mediada por célula, uma resposta imune humoral, ou umacombinação disso em um indivíduo, o kit compreendendo umapluralidade de veículos de levedura, em que cada um dos veículosde levedura compreende pelo menos um antígeno heterólogointracelular ou pelo menos um antígeno heterólogo extracelular, einstruções para uso dos veículos de levedura para preparar aformulação. Em um aspecto, os veículos de levedura expressam osantígenos. Em um aspecto, o kit também inclui pelo menos umacomposição adicional selecionada a partir de: (a) uma membranade levedura ou partícula de parede celular contendo pelo menos umdos antígenos heterólogos ou um antígeno do mesmo patógeno oudoença; (b) um veículo de levedura na mescla com pelo menos umdos antígenos heterólogos ou um antígeno do mesmo patógeno oudoença; (c) uma vacina de DNA codificando pelo menos um dosantígenos ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença; (d) umavacina de sub-unidade de proteína compreendendo pelo menos umdos antígenos ou um antígeno do mesmo patógeno ou doença ouum antígeno do mesmo patógeno ou doença; e/ou (e) um patógenoneutralizado ou desativado compreendendo pelo menos um dosantígenos heterólogos. Em um aspecto, o antígeno intracelular é umantígeno que é expresso internamente por um patógeno. Em umaspecto, o antígeno extracelular é um antígeno que éestruturalmente conservado entre os patógenos do mesmo tipo. Emum aspecto, o antígeno extracelular é um antígeno que é expressona superfície de um patógeno. Em um aspecto, o antígenoextracelular é um antígeno que é estruturalmente variável entre ospatógenos do mesmo tipo.

Breve Descrição das Figuras da Invenção

A Fig. 1 é um desenho esquemáticoilustrando um vírus de influenza e diversos de seus componentes.Alguns dos antígenos mais altamente conservados são circulados.

A Fig. 2 é uma imagem digital de um testeWestern blot mostrando a expressão intracelular da proteína dematriz de influenza 1 (M1, também denominado como MP ou MP1)na levedura.

As Figs. 3A e 3B mostram os resultados deum ensaio de CTL em que a imunização de camundongos com umveículo de levedura expressando a proteína de matriz de influenza(M1) de forma intracelular extraiu tanto a célula T citotóxica (CTL)específica de M1 (Fig. 3A) e específica de vírus de influenza (Fig.3B), neutralizando as células alvo infectadas de influenza.

A Fig. 4 é uma imagem digital de um testeWestern blot de Iisados de células de P815 infectados cominfluenza A/PR/8/34, ilustrando que as células P815 podem serinfectadas com o vírus de influenza e usadas com células alvo nosensaios de CTL.

A Fig. 5 mostra os resultados de um ensaiode proliferação de linfócito T em que a imunização do camundongocom um veículo de levedura expressando a proteína de matriz deinfluenza (M1 ou MP) de forma intracelular extraiu reação de célulaT específicas de M1.

A Fig. 6 mostra os resultados de um ensaiode proliferação de linfócito T em que a imunização do camundongocom um veículo de levedura expressando a proteína de matriz deinfluenza (M1) de forma intracelular extraiu reação de célula Tespecíficas de influenza.

A Fig. 7 é uma imagem digitalizada de umteste Western blot (superior) e desenho esquemático de umaconstrução de fusão (inferior), ilustrando a expressão intracelular dahemaglutinina de influenza (HA) fundida para Aga2 (Aga2-HA) nalevedura.

A Fig. 8 mostra os resultados dos ensaios deCTL em que a imunização do camundongo por duas diferentes viasde administração com um veículo de levedura expressando ahemaglutinina de influenza (HA) fundida para Aga2 (Aga2-HA) deforma intracelular extraiu as reações de CTL específicas de vírus.

A Fig. 9 mostra os resultados dos ensaios deproliferação de linfócito T em que a imunização do camundongo porduas diferentes vias de administração com um veículo de leveduraexpressando a hemaglutinina de influenza (HA) fundida para Aga2(Aga2-HA) de forma intracelular extraiu as reações de proliferaçãode linfócito T específica de vírus de influenza.A Fig. 10Α ilustra um esquema de construçãoTarmogen que permite a expressão e localização de qualquerantígeno alvo de interesse na superfície do veículo de levedura(painel superior). Os painéis inferiores mostram um Tarmogenespecífico, também conhecido como GI-8003, que é um veículo delevedura projetado para exibir de forma extracelular (exibição emsua superfície) a influenza A/PR/8/34 HA (H1) como uma proteínade fusão Aga2-HA. Uma imagem digitalizada de um teste Westernblot é mostrada que indica a expressão da proteína Aga2-HA.

A Fig. 10B ilustra as construções exemplaresem que os antígenos foram projetados para serem exibidos nasuperfície de levedura. Essa figura é um esquemático ilustrando osexemplos de como diversas proteínas de levedura podem serusadas como braços de espaçador.

A Fig. 11 ilustra o Tarmogen expressando aproteína de fusão mencionada na Fig. 10B como VK8, que expressaa proteína de HA de influenza na superfície da levedura via aproteína de parede celular 2 (cwp2), e mostra histogramas daexpressão de HA de superfície de levedura (Tarmogen tambémconhecido como GI-8000-S) a partir da análise citométrica de fluxode células intactas conforme comparado ao veículo de levedurasozinha (GI-1001 ou YVEC).

As Figs. 12A-12G mostram histogramas emque diversas abordagens (descritas acima e ilustradas na Fig. 10B)foram utilizadas para localizar a proteína de influenza de HA nasuperfície. A Fig. 12A mostra o controle de levedura (YEX) para asFigs. 12B e 12C. As Figs. 12B-12C ilustram a expressão pelo VK4(Fig. 12B) e TK75-15 (Fig. 12C) expressando os Tarmogens. A Fig.12D mostra o controle de levedura (YEX) para as Figs. 12E-12G. AsFigs. 12Ε e 12F mostram a expressão de HA VK8 por umalevedura, quando a levedura é glicosilada (Fig. 12E) e deglicosilada(Fig. 12F). A Fig. 12G mostra a expressão de HA na membrana deplasma de preparos de esferoplasto expressando Lu002.

As Figs. 13A e 13B são esquemáticos deconstruções para expressão de hemaglutinina de influenzaextracelular (Fig. 13B) e intracelular (Fig. 13A), que pode sercombinada com a expressão intracelular dos antígenos de influenzaconservados M1, NP e M2 (Fig. 13A).

As Figs. 14A e 14B mostram a preparaçãoda célula T (Fig. 14B) e produção de anticorpo (Fig. 14A) para trêsregimes usados (Fig. 14A). O regime A usa somente PBS(controle). O regime B usa PBS nos dias 0 e 28 para preparação e aproteína de ovalbumina solúvel (ova) foi usada para reforçar no dia56. O regime C usou o veículo de levedura expressando aovalbumina (OVAX) para preparação e a proteína de ovalbuminasolúvel foi usada para reforçar. A Fig. 14B mostra os resultados deum ensaio de ativação de célula T usando diversas quantidades deproteína de ovalbumina solúvel para o estimulo renovado in vitrodas células T colhidas dos camundongos imunizados por cada umdos três regimes acima descritos.

A Fig. 15 mostra os resultados dosexperimentos em que GI-2010, um Tarmogen expressando aproteína HIV Gag1 foi testado por sua capacidade de preparar umaresposta de anticorpo, comparado com a resposta humoralobservada após a infecção com vírus vivos de vacinas codificandonada (controle) ou a proteína HIV-Gag (vírus). As curvas salinas ede controle estão sob as linhas de GI-2010 e YVEC (isto é, aslinhas de GI-2010 e YVEC são sobrepostas nas linhas salinas e decontrole).

As Figs. 16A e 16B são desenhosesquemáticos mostrando as exigências para combinar a ativaçãode célula B e sinais derivados das respostas de célula T ajudantespara peptídeos derivados do antígeno em que as respostas deanticorpo são buscadas (o Sinal 1 é mostrado na Fig. 16A e o Sinal 2 é mostrado na Fig. 16B).

A Fig. 17 é uma imagem digitalizada de umteste de Western blot mostrando a expressão de superfície dacélula do domínio de HA1 de Influenza fundido para Aga2 (Aga2-HA1).

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção geralmente refere-se àscomposições e métodos para eficientemente extrair diversos tiposde reações imunes, incluindo respostas imunes mediadas porcélula, respostas imunes humorais e suas combinações. A invençãoé útil para extrair as reações imunes protetores e/ou terapêuticascontra uma ampla variedade de antígenos (incluindo patógenos), eas respostas podem ser otimizadas para preferencialmente extrair(ou garantir a extração de) uma resposta imune mediada porcélula, uma resposta imune humoral, ou tanto uma resposta imunemediada por célula quanto humoral. Além disso, as respostasimunes extraídas pelas vacinas e estratégias de vacina dainvenção podem ser otimizadas para fornecer uma resposta eficazcontra: patógenos que freqüentemente produzem mutações e/ouinfeccionam um indivíduo com múltiplas espécies ou cepas aomesmo tempo, patógenos que infeccionam ou existem emindivíduos em diferentes etapas do ciclo de vida, e patógenos queescapam do sistema imune por diversas ações, incluindo através deinfecção de células alvo. As respostas imunes extraídas pelapresente invenção são especificamente eficazes em cenários emque as respostas imunes humorais podem ser pelo menos de algummodo eficazes na limitação da capacidade do patógeno de provocara doença, porém onde o sistema imune, não obstante, deixa deprevenir ou detectar as formas alternativas do patógeno (mutantesou formas do ciclo de vida) e/ou infecção ou ocupação de umacélula hospedeira pelo patógeno, que pode então escapar ouorientar de forma errônea a resposta imune. A reação imuneextraída pelas vacinas e estratégias de vacina da invenção tambémpodem ser otimizadas para proteger ou tratar um indivíduo comuma doença ou condição, dependendo do tipo de resposta imuneque seria mais benéfica para uma doença ou condição específica, edependendo do status imune do paciente com relação adeterminado antígeno ou patógeno em determinado ponto notempo. Finalmente, as vacinas e estratégias de vacina da invençãopodem estimular uma resposta imune eficaz com poucasadministrações, e também são eficazes na estimulação dasrespostas imunes com exposições a baixos níveis de antígeno (queeconomiza dose).

A invenção fornece tanto as composiçõesquanto os métodos para extrair as reações imunes em umavariedade de antígenos que são úteis para fins de imunidadeterapêutica e/ou vacinação. Em um aspecto, a invenção fornece ascomposições que podem extrair tanto uma reação imune humorale uma reação imune mediada por célula e, em aspectos adicionais,fornece as composições e estratégias de vacina parapreferencialmente extrair ou preparar uma reação imune humoral,incluindo a preparação para uma produção de anticorpo específicode antígeno direcionada para um ou mais antígenos de interesse,ou para preferencialmente extrair ou preparar uma reação imunemediada por célula (celular), incluindo reações de célula Tcitotóxica. Ao preferencialmente extrair, significa que uma reaçãoimune pode ser impulsionada ou direcionada a um tipo específicode reação imune, principalmente com base em como o antígeno édisponibilizado ao sistema imune usando as vacinas com base emlevedura da invenção. As composições e estratégias de imunizaçãosão especificamente projetadas para fornecer a otimização dareação imune conforme acima descrito. A invenção também fornececomposições e métodos que podem otimizar ou complementar a"immunogenicidade" de ou imunização bem-sucedida usandovacinas com base em não levedura, tais como, vacinas de DNA.

Mais especificamente, a presente invenção édirecionada às melhorias na tecnologia de plataforma relacionadaaos produtos imunoterapêuticos com base em levedura conformedescritos nas Patentes Norte-Americanas N0S 5,830,463 e7,083,787 e nas Publicações de Patente Norte-Americanas N0S2004-0156858 A1 e 2006-0110755 A1, e fornece as novas vacinascom base em levedura para uso na extração de reações imunesprotetoras e/ou terapêuticas contra uma ampla variedade deantígenos (incluindo os patógenos). Em um aspecto, a presenteinvenção tira vantagem da capacidade de seletivamente projetar ascomposições de vacina com base em levedura para expressar oufornecer os antígenos de forma intracelular, de forma extracelular(p.ex., expressão de superfície de levedura), ou ambas, e paraselecionar diferentes antígenos e combinações de antígenos paraexpressão/localização intracelular e/ou extracelular, com afinalidade de manipular o tipo de resposta imune que sejapreferencialmente induzida contra antígeno(s) específico(s), etambém para manipular a capacidade da(s) resposta(s) imune(s)para imunizar mais efetivamente um indivíduo contra um antígenoou antígenos específicos, e para prevenir ou tratar maisefetivamente uma doença ou condição associada a um antígeno ouantígenos.

Por exemplo, em uma configuração, usandoa invenção aqui revelada, as composições e métodos são reveladosque fornecem uma abordagem de vacina "universal" protetoracruzada, para fornecer imunidade com maior duração, e de formaimportante a imunidade mediada por célula, contra um antígeno ouantígenos. Esse elemento da invenção tira vantagem do fato deque, com relação aos patógenos, por exemplo, determinadosantígenos são altamente conservados entre diferentes cepas ouespécies de patógenos. Além disso, determinadas células contra asquais uma resposta imune poderiam ser direcionadas, p.ex., célulasde tumor, também podem compartilhar antígenos conservadosespecíficos. Tais antígenos são freqüentemente expressosinternamente pelo patógeno ou célula (isto é, os antígenos exibidosna superfície de um patógeno ou célula têm a maior probabilidadede ser prontamente variados ou produzir mutação para escapar dadetecção imune e liberação, enquanto que, os antígenos que sãointernos ao patógeno ou célula têm a maior probabilidade de seremconservados de cepa à cepa, espécie à espécie, ou célula à célula).Tais antígenos conservados (os quais, se expressos internamentepor um patógeno, tais como, um vírus, também podem sergeralmente denominados como antígenos internos) fornecem umabase para uma vacina com base em levedura que é protetoracruzada e capaz de extrair uma reação imune mediada por célulaeficaz (celular) contra o antígeno (e, dessa forma, contra uma célulaque estiver infectada com ou ocupada pelo patógeno). Nesseaspecto, os antígenos conservados ou antígenos internos sãotipicamente expressos ou fornecidos de forma intracelular pelosveículos de levedura da invenção. Entretanto, a expressão dessestipos de antígenos não é limitada à expressão intracelular; osantígenos conservados ou internos também podem seralternativamente expressos ou fornecidos de forma extracelular (nasuperfície da levedura) pelos veículos de levedura da invenção,conforme abaixo discutido.

A expressão ou localização intracelular doantígeno por um veículo de levedura, de acordo com a presenteinvenção (p.ex., por expressão, por carregamento intracelular, ouqualquer outro método para fornecer um antígeno que estejacontido dentro de um ambiente intracelular da levedura) égeralmente útil para preferencialmente extrair uma reação imunemediada por célula contra qualquer antígeno, ou maisespecificamente, fornece o antígeno em um contexto em que umaresposta imune mediada por célula é prontamente extraída, emboraas reações imunes humorais também serão preparadas ouinduzidas por essa abordagem, especificamente se o antígeno, emsua forma naturalmente ocorrente, está ou estava disponibilizado aoambiente extracelular (isto é, através de infecção, doença ouimunização anterior). A expressão intracelular ou provisão deantígeno por um veículo de levedura é especificamente útil parapreparação ou vacinações iniciais com um antígeno, desde que, ofornecimento de uma forte resposta imune mediada por célula epreferivelmente a memória imunológica otimizará a capacidade deambos os braços humorais quanto os mediados por célula daresposta imune respondam aos encontros futuros com o antígeno(p.ex., através de reforço de imunizações, infecções ou doença). Aexpressão intracelular ou provisão de antígeno é útil para aextração de uma reação imune contra quaisquer antígenos,incluindo os antígenos conservados ou internos acima descritos, eos antígenos variáveis ou externos abaixo descritos.

Em outra configuração, as composições emétodos são fornecidos que são projetados para induzir umareação imune específica de cepa, espécie ou variante de antígeno.Por exemplo, essa abordagem imuniza um hospedeiro contra osantígenos mais específicos que podem ser associados com ummutante, cepa, espécies ou etapa do ciclo de vida específico de umpatógeno, ou uma variante específica de antígeno, conforme érealizado, por exemplo, em vacinas convencionais de vírusneutralizado que normalmente incluem três cepas viraisselecionadas representando três grupos virais com base nosantígenos de superfície. Em outras palavras, esse aspecto dainvenção tira vantagem adicional do fato de que muitos patógenose células expressam variações de proteínas (antígenos variáveis),especificamente na superfície de tais patógenos ou células (osantígenos de superfície também podem ser geralmentedenominados no presente como antígenos externos) que podem serusados para criar uma vacina com base em levedura que forneceuma imunização muito direcionada, ou mesmo uma imunizaçãosazonal, contra o antígeno ou patógeno. Em um aspecto dainvenção, tais antígenos são tipicamente expressos de formaextracelular (na superfície) pelos veículos de levedura da invenção.A expressão de antígenos variáveis ou externos não é limitada àexpressão extracelular ou provisão extracelular de antígenos noveículo de levedura; tais antígenos também podem ser oualternativamente ser expressos ou fornecidos de forma intracelularpelos veículos de levedura da invenção, conforme abaixo discutido.

A expressão extracelular ou de superfície ouprovisão de antígeno por um veículo de levedura, de acordo com apresente invenção1 (p.ex., através de expressão que resulta naexpressão de superfície ou deslocamento do antígeno à superfícieexterna do veículo de levedura, ao anexar um antígeno à superfícieexterna ou ao secretar o antígeno da levedura) preferencialmenteextrai uma reação imune humoral contra o antígeno, ou maisespecificamente, otimiza a extração de uma reação imune humoral,conforme comparado a quando o antígeno é expresso de formaintracelular pelo veículo de levedura, embora as respostas imunesmediadas por célula também serão preparadas ou extraídas poressa abordagem. De fato, uma vantagem de tal vacina é que, emcontraste com uma vacina convencional de vírus neutralizado,acimamencionada, por exemplo, que principalmente extrai uma reaçãode anticorpo de neutralização contra o vírus, a vacina da presenteinvenção pode extrair tanto uma resposta imune humoral quantouma mediada por célula contra esses antígenos de superfície. Aexpressão extracelular ou provisão de antígenos pelo veículo delevedura é útil para a extração de uma reação imune contraquaisquer antígenos, incluindo os antígenos conservados ouinternos e os antígenos variáveis ou externos acima descritos.

Entretanto, a expressão extracelular ou provisão do antígeno noveículo de levedura é especificamente útil para a extração de umareação imune contra os antígenos que o sistema imune é esperadopara encontrar no ambiente extracelular, tais como, antígenossolúveis, antígenos expressos por superfície de célula, ou antígenosexpressos por superfície de patógeno, visto que, odesenvolvimento de uma resposta imune humoral contra taisantígenos é desejável.

Em um aspecto, a presente invençãotambém combina as duas abordagens de vacina acima descritas(expressão intracelular e extracelular ou provisão do antígeno peloveículo de levedura) para fornecer novas vacinas poderosas queefetivamente extraem tanto a imunidade mediada por célula quantohumoral, que pode ser projetada para fornecer tanto a imunidadeprotetora cruzada e imunidade mais específica contra uma varianteespecífica de antígeno ou espécie de patógeno, cepa ou mutante.Por exemplo, com menção à infecção viral, tais como, infecção deinfluenza, a abordagem de vacina de combinação extrai uma reaçãoimune poderosa contra a infecção viral de influenza de uma forma"universal" protetora cruzada, junto com uma abordagem deantígeno específica de cepa viral. Essa abordagem extrairá tantouma reação imune mediada por célula quanto uma humoral contra ovírus de influenza e, em uma configuração preferida da invenção, ofaz de uma forma protetora cruzada e específica da cepa viral.

Nessa configuração da invenção, as vacinaspodem ser projetadas em qualquer número de modos. Por exemplo,em um aspecto, o(s) antígeno(s) conservado(s) de um patógeno(p.ex., um antígeno interno viral) pode(m) ser expresso(s) oufornecido(s) de forma intracelular por um veículo de levedura, e osantígenos variáveis do patógeno (p.ex., um antígeno de superfícieviral) podem ser expressos ou fornecidos de forma extracelular peloveículo de levedura. A imunização usando tais veículos de leveduraextrairá tanto a reação imune mediada por célula quanto a humoralcontra o vírus, e assim o faz de uma forma protetora cruzada eespecífica de cepa viral. O indivíduo imunizado com uma vacinacontendo tal veículo de levedura terá uma forte imunidade mediadapor célula contra o(s) antígeno(s) conservado(s) e forte imunidadehumoral contra os antígenos variáveis, embora ambos os tipos derespostas imunes serão preparados contra ambos os tipos deantígenos. Será aparente para aqueles com habilidade na técnicacomo esse primeiro exemplo pode ser modificado para melhorar oumodificar a resposta imune contra o vírus. Por exemplo, tanto osantígenos conservados, quanto os antígenos variáveis podem serexpressos ou fornecidos de forma intracelular pela levedura, e osantígenos variáveis podem ser expressos ou fornecidos de formaextracelular pela levedura, para garantir uma melhor resposta imunemediada por célula (que é importante para a preparação das futurasrespostas mediadas por célula e humorais) contra ambos os tiposde antígenos, e para fornecer imunidade humoral mais eficazimediatamente contra os antígenos variáveis (p.ex., vide Fig. 16 e adiscussão no presente).

Nas configurações de combinação aquidescritas, o veículo de levedura que expressa ou fornece osantígenos de forma extracelular (na superfície de veículo delevedura) pode ser o mesmo ou um diferente veículo de levedura doque o veículo de levedura que expressa ou fornece o(s) antígeno(s)de forma intracelular. Além disso, as diferentes combinações deantígenos intracelular e/ou antígenos extracelular podem serexpressas sobre diferentes veículos de levedura, e os veículospodem ser usados separadamente ou em conjunto, dependendo davacinação que é desejada. De modo geral, quando os antígenossão fornecidos por dois ou mais diferentes veículos de levedura(isto é, conforme oposto para expressar ou fornecer todos osantígenos em um veículo de levedura), os veículos de levedurapodem ser combinados (misturados) para administração como umaúnica vacina (p.ex., uma única injeção ou outro tipo de dosagem),ou diferentes veículos de levedura podem ser administradosseqüencialmente. A administração seqüencial pode ser separadapor qualquer período adequado de tempo, incluindo pequenosincrementos de tempo (segundos ou minutos) e incrementos maislongos de tempo (dias, semanas, meses ou mesmo anos). Ainvenção contempla que, nessas configurações, qualquercombinação de antígenos que, em uma configuração preferida,inclui pelo menos um antígeno intracelular e pelo menos umantígeno extracelular pode ser usada, e esses antígenos podem serfornecidos usando qualquer combinação de veículos de levedura(incluindo um único veículo de levedura) que expressam oufornecem tais antígenos.

As abordagens de vacina acima descritapodem de forma correspondente ser modificadas pela combinaçãoou administração seqüencial (p.ex., uma estratégia depreparação/reforço) de diferentes vacinas com base em leveduraem que as diferentes combinações de antígenos, incluindodiferentes combinações de antígenos extracelulares e/ou antígenosintracelulares e, em alguns aspectos, diferentes combinações deantígenos conservados e/ou variáveis, são fornecidos. Além disso,os veículos de levedura aqui descritos podem ser combinados comoutros tipos de vacinas, sejam simultaneamente ouseqüencialmente (p.ex., em um protocolo de preparação e reforço)para ainda direcionar a resposta imune e para fornecer a proteçãootimizada contra infecção e doença. Em uma configuração, umavacina com base em levedura da invenção que fornece pelo menosa imunidade mediada por célula e, em um aspecto, ambas asimunidades mediadas por célula e humorais, tais como pelaexpressão ou fornecimento de antígenos tanto de forma intracelularquanto extracelular, é usada para preparar uma resposta imunecontra um antígeno específico, conjunto de antígenos ou patógeno.

Os reforços de imunização são então fornecidos pela liberação deuma vacina convencional, tais como uma vacina de DNA, umavacina de sub-unidade de proteína, ou um patógeno neutralizado oudesativado, ou por outra vacina com base em levedura (incluindouma vacina de partícula de parede celular ou membrana) ou umacombinação de uma levedura e preparos convencionais de antígenoou mesmo a levedura sozinha (p.ex., nesses dois últimos cenários,onde a levedura está atuando primariamente como um adjuvante).Em tais estratégias de "preparação-reforço", uma forte respostamediada por célula extraída em decorrência da primeira imunização(preparação) melhora a eficácia de reforços subseqüentes e, emalgumas configurações, pode realmente fornecer os efeitossinérgicos, especificamente quando a vacina de reforço é um tipodiferente de vacina do que a vacina de preparação e/ou contémdiferentes antígenos conforme comparado com a vacina depreparação.

Ao preparar a resposta imune usando asvacinas com base em levedura e métodos da invenção, tanto amemória imunológica mediada por célula quanto humoral é gerada(isto é, as células de memória B e as células T que seletivamentereconhecem os antígenos de interesse são geradas). Comoresultado, mediante a exposição subseqüente ao antígeno, p.ex.,através de reforços de vacinação, doença ou infecção, o sistemaimune responderá mais rapidamente e mais eficazmente eprincipalmente com relação aos reforços de vacinação, as dosesmais baixas de antígeno podem ser usadas nos reforços dasvacinas com base em não levedura (vide, por exemplo, Exemplo 2 eFigs. 14 e -16). Além disso, os veículos de levedura podem operarem sinergia com as vacinas com base em não levedura, de modoque as respostas imunes são otimizadas pela abordagemcombinatória, tais como, ao combinar as vacinas de DNA comvacinas com base em levedura. Como tal, as vacinas podemprecisar ser administradas somente uma vez e/ou em umaquantidade inferior para eficácia. Como tal, as vacinas podemprecisar ser administradas somente uma vez e/ou em umaquantidade menor para eficácia. Essas qualidades com economiade dose são desejáveis quando as vacinas com base em nãolevedura estão em baixo suprimento ou ao combater um agente queameaça a saúde pública, desde que se torna difícil imunizar oindivíduo mais de uma vez, especialmente nas circunstâncias deimunização em massa.

As composições e métodos da invençãotambém incluem as vacinas em que um veículo de levedura nãoexpressa de forma necessária e recombinante ou de outro modo,fornece o(s) antígeno(s) de interesse, porém, ao invés disso, sãousadas como um adjuvante para otimizar a resposta imune de umantígeno que é fornecido separadamente (p.ex., como qualquervacina convencional, incluindo as vacinas de DNA1 vacinas deproteína de sub-unidade, patógenos neutralizados ou desativados,vacinas de célula dendrítica, etc.) ou no contexto de um indivíduoque já transporta o antígeno em quantidades suficientes para extrairuma reação imune mediante a administração do veículo de leveduranão transportando antígeno, tais como, um indivíduo que estejaatualmente infectado com um patógeno, um indivíduo que tenhasofrido uma mutação em uma proteína celular ou, de outro modo,expressa ou transporte um antígeno ao qual o sistema imune não étolerante ou contra o qual a tolerância pode ser interrompida. Essaabordagem pode ser combinada com uma imunização anterior ousubseqüente com um veículo de levedura que expressa ou forneceantígenos heterólogos intracelulares e/ou extracelulares, conformeacima discutido.

Certamente, existe uma grande flexibilidadeem como a vacina da presente invenção é projetada e usada. Porexemplo, uma vacina "universal" compreendendo um veículo delevedura que expressa ou é complexado com (isto é, associadocom, misturado com, contendo, fornecendo) determinadosantígenos, tais como, antígenos conservados, pode seradministrado em um indivíduo periodicamente, com a finalidade dedesenvolver uma imunidade protetora cruzada em um indivíduo.

Essa vacina pode então ser combinada, por exemplo, com base emuma vez ou periódica com veículos adicionais de leveduraexpressando ou complexados com outros antígenos, tais como,antígenos variáveis, por exemplo, para tratar uma cepa específicade vírus que seja conhecida como circulando em uma população deindivíduos. Os veículos de levedura expressando ou complexadoscom tais antígenos variáveis podem ser revezados, alternados ouselecionados anualmente ou em qualquer outra base preferida(p.ex., emergência, epidemia ou pandemia antecipada, ou conformede outro modo necessário) para direcionar os patógenos deinteresse e/ou a(s) cepa(s) de patógeno mais prevalecente(s)durante determinado período de tempo ou para uma regiãogeográfica específica. Outras configurações da invenção serãoaparentes em relação com a revelação aqui revelada.

Conforme acima discutido, a manipulação dotipo de expressão ou associação de um antígeno com um veículode levedura atinge um resultado imunológico específico, que podeser explorado conforme desejado para vacinas "adaptadas" ou"projetadas" para populações, indivíduos ou doenças, condições ouinfecções patogênicas específicas. No caso de expressãoextracelular ou provisão de um antígeno por um veículo delevedura, tanto a imunidade humoral quanto a mediada por célulasão extraídas, embora esse tipo de expressão ou provisão sejaespecificamente eficaz para a obtenção de imunidade humoral,conforme comparado à expressão intracelular ou provisão deantígenos pela levedura. Isso é principalmente devido ao antígenoser exposto diretamente às células B nesta configuração, permitindoque a ativação, proliferação, maturação e produção de anticorpo dacélula B ocorram mais efetivamente.

Mais especificamente, um antígeno expressoou fornecido na superfície de levedura (ou secretado pela levedura)pode ser reconhecido por um receptor de antígeno de célula B(BCR) expresso por uma célula B (linfócitos B). Mediante aaglutinação desse antígeno de superfície ao BCR1 a célula B entãointernaliza o veículo de levedura expressando o antígenoaglutinado, e os antígenos são processados e retornados àsuperfície da célula B na forma de peptídeos a partir do(s)antígeno(s) no complexo com receptores de classe Il do complexode histocompatibilidade principal (MHC). Esses complexos depeptídeo de MHC são aglutinados pelas células T "ajudantes"(p.ex., células T CD4+) que possuem receptores de célula T (TCR)que especificamente reconhecem os complexos específicos depeptídeo de MHC. As células T específicas de antígeno ativadasque reconhecem o complexo de peptídeo de MHC apresentadaspor uma célula B, por sua vez, fornecem a tal célula B "ajuda" naforma de sinais (p.ex., citocinas), fazendo com que a célula Bprolifere e sua progênie diferencie-se e amadureça nas células desecreção de anticorpo. As células T ajudantes podem ser ativadaspor contato da célula T com tal célula B que está apresentando ocomplexo de peptídeo de MHC, bem como através de contato como complexo de peptídeo de MHC apresentado por outras célulasapresentando antígeno, incluindo as células dendríticas emacrófagos. Além disso, devido aos veículos de levedura dainvenção serem avidamente fagocitados por e diretamente ativam arota de classe I de MHC das células apresentando antígeno, taiscomo, células dendríticas (além da rota de classe Il de MHC), umaresposta imune mediada por célula CD8+ também pode ser extraídaatravés de expressão extracelular ou provisão do antígeno, além deuma resposta mediada por célula CD4+. Dessa forma, tanto asrespostas imunes mediadas por célula quanto humorais sãoextraídas por expressão extracelular ou provisão do antígeno pelalevedura, e esse tipo de expressão é acreditado para ser maiseficaz de modo a extrair as respostas imunes humorais do queatravés de expressão intracelular ou provisão do antígeno. Asrespostas imunes humorais podem incluir a geração de anticorposde neutralização, que são úteis para a prevenção e tratamento dedoenças infecciosas e outras condições indesejáveis.

Os aspectos da ativação de célula Bresultando em resposta imune humoral são esquematicamentemostrados nas Figs. 16A e 16B. Com referência à Fig. 16A, para osinal 1 da ativação de célula Β, o antígeno pode ser fornecidoatravés de uma vacina com base em não levedura ou proteínasolúvel, ou através de expressão de levedura, exibição ou, de outromodo, contendo o antígeno alvo na superfície. Com referência àFig. 16B, o processamento intracelular do antígeno obtido pelascélulas B ativadas é apresentado via os receptores de classe 2 deMHC, que é reconhecido por e ativar as células T ajudantesespecíficas de antígeno. Os sinais e citocinas transmitidos pelascélulas T específicas de antígeno ativadas amadurecem asrespostas de célula B e reforça a produção de anticorpo. A leveduraexpressando de forma intracelular o antígeno alvo é muito eficazpara ativar e amplificar o número de células T ajudantes específicasde antígeno, conforme previamente descrito e conforme discutidoabaixo. A produção de anticorpo é mais efetivamente extraídaquando a ativação e proliferação da célula T ajudante precedem ousão concomitantes com a aglutinação da célula B do antígeno alvosolúvel.

Quando o antígeno é expresso ou fornecidode forma intracelular por um veículo de levedura, uma respostaimune mediada por célula (tanto as respostas de célula T CD4+quanto CD8+) é gerada pela apresentação dos antígenos através deambas as vias restritas de classe I de MHC e restritas de classe Ilde MHC das células apresentando antígeno, tais como célulasdendríticas e macrófagos, conforme previamente descrito (Vide,p.ex., Patentes Norte-Americanas N0S 5,830,463 e 7,083,787,Stubbs e outros., Med. Nat. 7:625-629 (2001) e Lu e outros,Pesquisa de Câncer 64:5084-5088 (2004)). As células T ativadaspor esse mecanismo também podem contribuir para a produção deanticorpo ao fornecer um sinal às células B que encontraram oantígeno alvo através de uma abordagem diferente, tais como, umavacina com base em não levedura, ou através de exposição naturala um patógeno ou doença, por exemplo. Os resultadosexperimentais demonstrando esse conceito são mostrados nasFigs. 14 e 15.

Diversos aspectos da invenção serão melhorentendidos através dos exemplos específicos das vacinas deinfluenza aqui reveladas, embora a invenção não seja limitada a taisvacinas. De fato, considerando as informações aqui fornecidas,aquele com habilidade na técnica será prontamente capaz deextrapolar as estratégias de vacina descritas para o vírus deinfluenza aos outros patógenos e para protocolos de imunização emque o antígeno alvo é uma proteína celular, através do uso demanipulação da expressão de antígeno extracelular e/ouintracelular, ou provisão por veículos de levedura de acordo com ainvenção, a manipulação da expressão ou provisão dos antígenosconservados e variáveis (ou antígenos internos e externos), e amanipulação dos métodos de preparação e reforço aqui descritos.

Em uma configuração, a invençãogeralmente refere-se às novas composições e métodos paravacinação de um animal contra um vírus de influenza e paratratamento ou prevenção da infecção de influenza em um animal. Ainvenção inclui o uso de uma vacina com base em levedura ou umacombinação de vacinas com base em levedura, incluindo pelomenos um veículo de levedura e pelo menos um antígeno deinfluenza que é selecionado para extrair uma reação imune contraa infecção de influenza em um animal. Especificamente nasconfigurações preferidas, a invenção inclui o uso de umacombinação de antígenos de influenza na vacina com base emlevedura, em que a combinação de antígenos fornece a proteçãocruzada contra uma variedade de cepas virais de influenza, bemcomo a proteção específica contra cepas virais específicas. Ainvenção especificamente fornece as novas vacinas com base emlevedura para uso na proteção contra a infecção viral de influenzausando uma abordagem de vacina "universal" protetora cruzada,sozinha ou em conjunto com uma abordagem de antígenoespecífico de cepa viral. Essa abordagem obterá tanto a reaçãoimune mediada por célula quanto a humoral contra o vírus deinfluenza, preferivelmente o faz para tanto de uma forma protetoracruzada e específica da cepa viral.

Em um primeiro aspecto dessa configuração,a presente invenção tira vantagem do fato de que determinadasproteínas expressas internamente pelo vírus de influenza sãoaltamente conservadas entre as cepas virais. Esses antígenos(mencionados no presente como proteínas virais internas) fornecemuma base para uma vacina com base em levedura que é protetoracruzada e capaz de extrair uma reação imune mediada por célulaeficaz contra a proteína viral (e, dessa forma, uma célula infectadapor vírus de influenza). Em outro aspecto dessa configuração, apresente invenção ainda tira vantagem do fato de que as cepasvirais de influenza expressam variações das proteínas de superfície(mencionadas no presente como proteínas virais externas) quepodem ser usadas para criar uma vacina com base em leveduraque imuniza um hospedeiro contra as cepas virais mais específicas,conforme é realizado nas vacinas convencionais de vírusneutralizado que tipicamente incluem três cepas viraisselecionadas, representando três grupos virais com base nosantígenos de superfície. Entretanto, em contraste com essasvacinas convencionais de vírus neutralizado, que principalmenteobtém uma reação de anticorpo de neutralização contra o vírus, avacina da presente invenção pode obter tanto uma reação imunemediada por célula e humoral contra esses antígenos de superfícievirais. Além do mais, a presente invenção combina essas duasvacinas nos aspectos preferidos para fornecer uma nova poderosavacina de influenza que obtém tanto a imunidade protetora cruzadae específica de cepa viral, incluindo ambas as imunidadesmediadas por célula e humorais.

Técnicas Gerais

A prática da presente invenção empregará,exceto se de outro modo indicado, as técnicas convencionais dabiologia molecular (incluindo as técnicas recombinantes),microbiologia, biologia celular, bioquímica, química de ácidonucléico e imunologia, que são bem conhecidas por aqueles comhabilidade na técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente naliteratura, tais como, Métodos de Enzimologia, Vol. 194, Guthrie eoutros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biologia eatividades de leveduras, Skinner, e outros, eds., Academic Press(1980); Métodos em genética de levedura : um manual de cursolaboratorial, Rose e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990); A Levedura Saccharomyces: Ciclo Celular e BiologiaCelular, Pringle outros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997); A Levedura Saccharomyces: Expressão de Gene, Jones eoutros, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); ALevedura Saccharomyces: Dinâmica do Genoma, Síntese daProteína e Energética, Broach e outros, eds., Cold Spring HarborLaboratory Press (1992); Clonagem Molecular: Um Manual deLaboratório, segunda edição (Sambrook e outros, 1989) eClonagem Molecular: Um Manual de Laboratório, terceira edição(Sambrook e Russel1 2001), (conjuntamente denominados nopresente como "Sambrook"); Protocolos Atuais na BiologiaMolecular (F.M. Ausubel e outros, eds., 1987, incluindocomplementos até 2001); PCR: A Reação em Cadeia dePolimerase (Mullis e outros, eds., 1994); Harlow e Lane (1988)Anticorpos, Um Manual de Laboratório, Cold Spring HarborPublications, Nova York; Harlow e Lane (1999) UtilizandoAnticorpos: Um Manual de Laboratório, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamentedenominados no presente como "Harlow e Lane"), Beaucage eoutros, eds., Protocolos Atuais na Química do Ácido Nucléico, JohnWiley & Sons, Inc., Nova York, 2000); Toxicologia de Casarett eDoull, A Ciência Básica de Venenos, C. Klaassen1 ed., 6o edição(2001), e Vacinas, S. Plotkin e W. Orenstein, eds., 3o edição (1999).

Definições Gerais

Uma "resposta imune humoral" refere-segeralmente à produção de anticorpo, e a todos os processos queacompanham a produção de anticorpo, incluindo, mas não limitadoà, ativação de linfócito B (célula B), maturação de afinidade,diferenciação em células do plasma e geração de célula B dememória, formação de central germinal e comutação de isotipo, eativação de célula ajudante T, sinalização e produção de citocina,bem como as funções de executor dos anticorpos, que incluem aneutralização, ativação de complemento clássico e opsonização.

Uma resposta imune "mediada por célula"(que pode ser usada de forma permutável em qualquer lugar nopresente com o termo resposta imune "celular") refere-segeralmente à resposta a um antígeno de células imunes, incluindolinfócitos T (incluindo linfócitos T citotóxicos (CTL)), célulasdendríticas, macrófagos e células assassinas naturais, e para todosos processos que acompanham tais respostas, incluindo, mas nãolimitadas à, ativação e proliferação dessas células, funções doexecutor de CTL, produção de citocina que influencia a função deoutras células envolvidas nas respostas imunes adaptativas erespostas imunes inatas, e geração de célula T de memória.

De acordo com a presente invenção, o termo"extracelular", conforme é aqui aplicado, para a provisão de umantígeno de forma extracelular (ou a provisão de um antígenoextracelular) com relação a um veículo de levedura, significa que oantígeno é extracelular ao (na superfície de ou fora de) veículo delevedura, que pode ser atingido por qualquer número de métodos.

Por exemplo, um antígeno é extracelular com relação ao veículo delevedura, se o antígeno for expresso pelo veículo de levedura(p.ex., através de produção recombinante), de modo que oantígeno, ou uma porção do mesmo, é exibido em (localizado em,contido em, localizado em) a superfície externa do veículo delevedura (p.ex., a parede celular para levedura total e intacta, ou amembrana de plasma para esferoplastos de levedura, e traçoscitoplastos de levedura e levedura seca). O antígeno pode, porexemplo, ser expresso no ER da levedura e então deslocado àsuperfície da levedura, embora, de modo geral, com relação àprodução de antígeno recombinante, a referência à "expressão" nasuperfície de um veículo de levedura ou extracelular ao veículo delevedura tem a intenção de abranger todo o processo da produçãode antígeno, a partir da transcrição, através da tradução, através dedirecionamento e administração ou deslocamento do antígeno aoseu destino final no veículo de levedura. O termo "expressão"também pode ser genericamente usado de forma mutável com otermo "provisão" e pode mais genericamente abranger qualquermodo de fornecer um antígeno na superfície de um veículo delevedura (isto é, a associação através de outros métodos éabrangida). Por exemplo, um antígeno também é extracelular comrelação ao veículo de levedura se for anexado à superfície externada levedura, tais como, através de ligação covalente ou nãocovalente (isto é, não necessariamente expressa de formarecombinante pela levedura). Um antígeno também é extracelularcom relação ao veículo de levedura, se for simplesmente em umamistura com a levedura (uma mescla, combinada, umacomposição). Um antígeno também é extracelular com relação aoveículo de levedura se for secretado pela levedura.

De acordo com a presente invenção, o termo"intracelular", conforme é aplicado na presente para a provisão deum antígeno de forma intracelular (ou a provisão de um antígenointracelular) com relação a um veículo de levedura, significa que oantígeno é contido dentro do ambiente intracelular do veículo delevedura, que pode ser atingido através de qualquer número demétodos. Por exemplo, um antígeno é intracelular com relação aoveículo de levedura, se o antígeno for expresso pelo veículo delevedura (p.ex., através de produção recombinante) e pelo menosalgum do antígeno que é produzido permanece dentro da levedura(isto é, não é deslocado para ou liberado para a superfície doveículo de levedura, ou ainda não foi liberado ou deslocado àsuperfície do veículo de levedura). O ambiente intracelular doveículo de levedura pode incluir, porém, não limitado à, citosol, ER,membranas internas e vesículas secretórias que ainda nãoatravessaram à superfície de célula. Um antígeno também éintracelular com relação ao veículo de levedura se for carregado nalevedura (p.ex., através de qualquer método adequado detransporte, incluindo, eletroporação, bombardeio de partícula, micro-injeção, transfecção de lipossoma, adsorção, infecção e fusão deprotoplasto).

De acordo com a presente invenção, o usogeral do presente do termo "antígeno", refere-se: a qualquer porçãode uma proteína (peptídeo, proteína parcial, proteína decomprimento total), em que a proteína é naturalmente ocorrente ousinteticamente derivada, a uma composição celular (célula total,lisado de célula ou células rompidas), a um organismo (organismototal, Iisado ou células rompidas) ou a um carboidrato (tal comoaquele expresso nas células cancerígenas), ou outra molécula, ouuma porção dos mesmos. Um antígeno obtém uma reação imuneespecífico de antígeno (p.ex., uma resposta imune humoral e/oumediada por célula) contra os mesmos antígenos ou antígenossemelhantes que são encontrados dentro das células e tecidos deum indivíduo ao qual o antígeno é administrado. Alternativamente,um antígeno pode atuar como um imunológico.

Ao referir-se à estimulação de uma reaçãoimune, o termo "antígeno" pode ser usado de forma mutável com otermo "immunogerí', -à saberos agentes que podem ser usadospara provocar a resposta imune do corpo, como vacinas; antígenos-Um "immunogen", conforme aqui usado, descreve um antígenoque induz uma resposta imune humoral e/ou mediada por célula(isto é, é antigênica), de modo que a administração do "immunogen"a um animal (p.ex., via uma vacina da presente invenção) montauma resposta imune específica de antígeno contra os mesmosantígenos ou antígenos semelhantes que são encontrados dentrodos tecidos do animal.Um imunológico é usado para descrever umantígeno que é fornecido na forma, quantidade ou via deadministração, de modo que existe uma reação imune reduzida oualterada ao antígeno, e preferivelmente de forma substancialnão sensível, energia, ou outra desativação, ou exclusão dascélulas do sistema imune em resposta ao contato com oimunológico ou uma célula expressando ou apresentando talimunológico.

Um "antígeno de vacinação" pode ser um"immunogen" ou um imunológico, porém é um antígeno usado emuma vacina, em que uma resposta biológica (extração de umareação imune, tolerância) deve ser obtida contra o antígeno devacinação.

Um "domínio imunogênico" de determinadoantígeno pode ser qualquer porção, fragmento ou epítopo de umantígeno, (p.ex., um fragmento de peptídeo, sub-unidade, umepítopo de anticorpo ou outro epítopo de conformação) que contémpelo menos um epítopo que atua como um "immunogen" quandoadministrado a um animal. Por exemplo, uma única proteína podeconter múltiplos domínios imunogênicos diferentes. Os domíniosimunogênicos não precisam ser seqüências lineares dentro de umaproteína, tal como no caso de uma resposta imune humoral.

Um epítopo é aqui definido como um únicolocal imunogênico dentro de determinado antígeno que é suficientepara obter uma reação imune, ou um único local toleragênico dentrode determinado antígeno que é suficiente para suprimir, excluir ouconsiderar desativada uma resposta imune. Aqueles com habilidadena técnica reconhecerão que os epítopos de célula T são diferentesem tamanho e composição dos epítopos de célula B, e que osepítopos apresentados através da via de MHC de Classe I diferemdos epítopos apresentados através da via de MHC de Classe II. Osepítopos podem ser epítopos de seqüência linear ou deconformação (regiões aglutinantes conservadas). Um antígenopode ser tão pequeno quanto um único epítopo, ou maiores, e podeincluir múltiplos epítopos. Como tal, o tamanho de um antígenopode ser tão pequeno quanto cerca de 5-12 aminoácidos (p.ex., umpeptídeo) e tão largo quanto: uma proteína de comprimento total,incluindo um multímetro e proteínas de fusão, proteínas quiméricas,células totais, microorganismos totais, ou porções dos mesmos(p.ex., Iisados de células totais ou extratos de microorganismos).Além disso, os antígenos podem incluir os carboidratos, que podemser carregados em um veículo de levedura ou em uma composiçãoda invenção. Será apreciado que, em algumas configurações (istoé, quando o antígeno é expresso pelo veículo de levedura a partirde uma molécula de ácido nucléico recombinante), o antígeno éuma proteína, proteína de fusão, proteína quimérica, ou fragmentoda mesma, ao invés de uma célula total ou microorganismo. Asproteínas preferidas de fusão de influenza da invenção são aquidescritas.

"Vacinação" ou "imunização" refere-se àretirada (indução) de uma resposta imune contra um antígeno,porção imunogênica ou toleragênica do mesmo, como resultado daadministração do antígeno, sozinha ou em conjunto com umadjuvante. A vacinação preferivelmente resulta em um efeitoprotetor ou terapêutico, em que a exposição subseqüente aoantígeno (ou uma fonte do antígeno) obtém uma reação imunecontra o antígeno (ou fonte) que reduz ou previne uma doença oucondição no animal. O conceito de vacinação é bem conhecido natécnica. A resposta imune que é obtida por administração de umacomposição (vacina) da presente invenção pode ser qualqueralteração detectável em qualquer faceta da resposta imune (p.ex.,resposta mediada por célula, resposta humoral, produção decitocina), conforme comparado na ausência de administração dacomposição.

Um Tarmogen (antígeno moleculardirecionado) geralmente refere-se a um veículo de leveduraexpressando um ou mais antígenos heterólogos de formaextracelular (em sua superfície), de forma intracelular (de formainterna e citosólica) ou tanto de forma extracelular quantointracelular. Os Tarmogens foram geralmente descritos na técnica.Vide, p.ex., Patente Norte-Americana N0 5,830,463.

Em uma configuração da presente invenção,quaisquer das seqüências de aminoácidos aqui descritas podem serproduzidas com a partir de pelo menos um, e até cerca de 20,aminoácidos heterólogos adicionais flanqueando cada uma dasextremidades de terminal C e/ou N da seqüência de aminoácidoespecificada. A proteína ou polipeptídio resultante pode sermencionado como "consistindo essencialmente de" da seqüência deaminoácido especificada. Conforme acima discutido, de acordo coma presente invenção, os aminoácidos heterólogos são umaseqüência de aminoácidos que não são naturalmente encontrados(isto é, não encontrados na natureza, in vivo) flanqueando aseqüência de aminoácido especificada, ou que não sãorelacionados à função da seqüência de aminoácido especificada, ouque não seriam codificados pelos nucleotídeos que flanqueiam aseqüência de ácido nucléico naturalmente ocorrente codificando aseqüência de aminoácido especificada, conforme ocorre no gene,se tais nucleotídeos na seqüência naturalmente ocorrente fossemtraduzidos usando a utilização de códon padrão para o organismo apartir do qual determinada seqüência de aminoácido é derivado. Deforma semelhante, a expressão "consistindo essencialmente de",quando usada com referência a uma seqüência de ácido nucléicono presente, refere-se a uma seqüência de ácido nucléicocodificando uma seqüência de aminoácido especificada que podeser flanqueada a partir de pelo menos um, e até tantos quantoscerca de 60, nucleotídeos heterólogos adicionais em cadaextremidade de 5' e/ou 3' da seqüência de ácido nucléicocodificando a seqüência de aminoácido especificada. Osnucleotídeos heterólogos não são naturalmente encontrados (isto é,não encontrados na natureza, in vivo) flanqueando a seqüência deácido nucléico codificando a seqüência de aminoácido especificadaconforme ocorre no gene natural ou não codifica uma proteína queconcede qualquer função adicional à proteína ou alterações nafunção da proteína com a seqüência de aminoácido especificada.

De acordo com a presente invenção, os"aminoácidos heterólogos" são uma seqüência de aminoácidos quenão são naturalmente encontrados (isto é, não encontrados nanatureza, in vivo) flanqueando a seqüência de aminoácidoespecificada, ou que não são relacionados à função da seqüênciade aminoácido especificada, ou que não seriam codificados pelosnucleotídeos que flanqueiam a seqüência de ácido nucléiconaturalmente ocorrente codificando a seqüência de aminoácidoespecificada conforme ocorre no gene, se tais nucleotídeos naseqüência naturalmente ocorrente fossem traduzidos usando autilização de códon padrão para o organismo a partir do qual aseqüência de aminoácido é derivada. Portanto, pelo menos doisresíduos de aminoácidos que são heterólogos ao antígeno deinfluenza são quaisquer dois resíduos de aminoácido que não sãonaturalmente encontrados flanqueando o antígeno de influenza.

De acordo com a presente invenção, areferência a uma proteína "heteróloga" ou antígeno "heterólogo",incluindo uma proteína de fusão heteróloga, com relação a umveículo de levedura da invenção, significa que a proteína ouantígeno não é uma proteína ou antígeno que é naturalmenteexpresso pela levedura, embora uma proteína de fusão possaincluir as seqüências de levedura ou proteínas ou porções dasmesmas que são naturalmente expressas pela levedura (p.ex., umaproteína de Aga conforme aqui descrito). Por exemplo, umaproteína de fusão de uma proteína de hemaglutinina de influenza euma proteína de Aga de levedura são consideradas como umaproteína heteróloga com relação ao veículo de levedura para fins dapresente invenção, considerando que tal proteína de fusão não énaturalmente expressa por uma levedura.

De acordo com a presente invenção, aexpressão "seletivamente aglutina" refere-se à capacidade de umanticorpo, fragmento aglutinante de antígeno ou parceiro aglutinanteda presente invenção para preferencialmente aglutinar em proteínasespecificadas. Mais especificamente, a expressão "seletivamenteaglutina" refere-se à aglutinação específica de uma proteína à outra(p.ex., um anticorpo, fragmento do mesmo, ou parceiro aglutinantea um antígeno), em que o nível de aglutinação, conforme medidopor qualquer ensaio padrão (p.ex., um imunoensaio), éestatisticamente mais alto de forma significativa do que o controlede histórico para o ensaio. Por exemplo, ao realizar umimunoensaio, os controles tipicamente incluem um reservatório/tubode reação que contém o anticorpo ou fragmento aglutinante deantígeno sozinho (isto é, na ausência do antígeno), em que umaquantidade de reatividade (p.ex., aglutinação não específica aoreservatório) pelo anticorpo ou fragmento aglutinante de antígenodo mesmo, na ausência do antígeno é considerada como histórico.

A aglutinação pode ser medida usando uma variedade de métodospadrão na técnica, incluindo imunoensaios de enzima (p.ex., ELISA,ensaios de "immunoblof, etc.).

Um "indivíduo" é um vertebrado,preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano. Osmamíferos incluem, mas não estão limitados à, animais de criação,animais de esporte, animais de estimação, primatas, camundongose ratos. O termo "indivíduo" pode ser usado de forma mutável com otermo "animal", "sujeito" ou "paciente".

A referência a uma proteína isolada oupolipeptídio na presente invenção inclui as proteínas decomprimento total, proteínas de fusão ou qualquer fragmento,domínio, epítopo de conformação ou homólogo de tais proteínas.

Mais especificamente, uma proteína isolada, de acordo com apresente invenção, é uma proteína (incluindo um polipeptídio oupeptídeo) que foi removida de seu ambiente natural (ou seja, que foisujeito à manipulação humana) e pode incluir as proteínaspurificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínasproduzidas de forma recombinante e proteínas sinteticamenteproduzidas, por exemplo. Como tal, "isolado" não reflete a extensãoem que a proteína foi purificada. Preferivelmente, uma proteínaisolada da presente invenção é produzida de forma recombinante.

De acordo com a presente invenção, os termos "modificação" e"mutação" podem ser usados de forma mutável, especificamentecom relação às modificações/mutações à seqüência de aminoácidode proteínas ou porções da mesma (ou seqüências de ácidonucléico) aqui descritas.

Conforme aqui usado, o termo "homólogo" éusado para referir-se a uma proteína ou peptídeo que difere de umaproteína ou peptídeo naturalmente ocorrente (ou seja, a proteína de"protótipo" ou "tipo selvagem") por modificações menores à proteínaou peptídeo naturalmente ocorrente, porém que mantém a proteínabásica e estrutura de cadeia lateral da forma naturalmenteocorrente. Tais alterações incluem, porém não estão limitadas à:alterações em uma ou poucas cadeias laterais de aminoácido;alterações de um ou poucos aminoácidos, incluindo exclusões(p.ex., uma versão truncada da proteína ou peptídeo), inserçõese/ou substituições; alterações na estereoquímica de um ou poucosátomos; e/ou derivatizações menores, incluindo, mas não limitadasà: metilação, glicosilação, fosforilação, acetilação, miristoilação,prenilação, palmitação, amidação e/ou adição de glicosilfosfatidilinositol. Um homólogo pode ter propriedades otimizadas,diminuídas ou substancialmente semelhantes conforme comparadoà proteína ou peptídeo naturalmente ocorrente. Um homólogo podeincluir um agonista de uma proteína ou uma antagonista de umaproteína. Os homólogos podem ser produzidos usando técnicasconhecidas na técnica para a produção de proteínas, incluindo, masnão limitadas à, modificações diretas à proteína isolada,naturalmente ocorrente, síntese direta de proteína ou modificaçõesà seqüência de ácido nucléico codificando a proteína usando, porexemplo, técnicas de DNA clássicas ou recombinantes para efetuara mutagênese aleatória ou direcionada.

Um homólogo de determinada proteína podecompreender, consistir essencialmente em, ou consistir em, umaseqüência de aminoácido que seja pelo menos em cerca de 45%,ou pelo menos em cerca de 50%, ou pelo menos em cerca de 55%,ou pelo menos em cerca de 60%, ou pelo menos em cerca de 65%,ou pelo menos em cerca de 70%, ou pelo menos em cerca de 75%,ou pelo menos em cerca de 80%, ou pelo menos em cerca de 85%,ou pelo menos em cerca de 90%, ou pelo menos em cerca de 95%idêntica, ou pelo menos em cerca de 95% idêntica, ou pelo menosem cerca de 96% idêntica, ou pelo menos em cerca de 97%idêntica, ou pelo menos em cerca de 98% idêntica, ou pelo menosem cerca de 99% idêntica (ou qualquer identidade de percentagementre 45% e 99%, em incrementos de número inteiro total), àseqüência de aminoácido da proteína de referência. Em umaconfiguração, o homólogo compreende, consiste essencialmenteem, ou consiste em, uma seqüência de aminoácido que é menor doque 100% idêntica, menos do que cerca de 99% idêntica, menos doque cerca de 98% idêntica, menos do que cerca de 97% idêntica,menos do que cerca de 96% idêntica, menos do que cerca de 95%idêntica, e assim por diante, em incrementos de 1%, para menos doque cerca de 70% idêntica à seqüência de aminoácido naturalmenteocorrente da proteína de referência.

Conforme aqui usado, exceto se de outromodo especificado, a referência a uma identidade de (%)percentagem refere-se a uma avaliação de homologia que érealizada usando: (1) uma pesquisa de homologia BLAST BásicaBLAST 2.0 usando blastp para pesquisas de aminoácido e blastnpara pesquisas de ácido nucléico com parâmetros 'default' padrão,em que a seqüência de consulta é filtrada para regiões de baixacomplexidade por default (descrito em Altschul, S.F., Madden, T.L.,Schàãffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J.(1997) "BLAST E PSI-BLAST Lacunado: uma nova geração deprogramas de pesquisa de banco de dados de proteína". Pesquisade Ácido Nucléico, 25:3389-3402, aqui incorporada por referênciaem sua totalidade); (2) um alinhamento BLAST 2 (usando osparâmetros abaixo descritos); (3) e/ou PSI-BLAST com parâmetrospadrão (BLAST Reiterado De Posição Especifica. É observado quedevido a algumas diferenças nos parâmetros padrão entre BLASTBásico BLAST 2.0 e BLAST 2, duas seqüências específicaspoderiam ser reconhecidas como tendo homologia significativausando o programa BLAST 2, enquanto que, uma pesquisarealizada em BLAST Básico BLAST 2.0 usando uma dasseqüências como a seqüência de questão não pode identificar asegunda seqüência em combinações principais. Além disso, PSI-BLAST fornece uma versão automatizada e fácil de usar de umapesquisa de "perfil", que é um modo delicado para visualizar oshomólogos de seqüência. O programa primeiro realiza umapesquisa de banco de dados BLAST lacunada. O programa PSI-BLAST usa as informações de quaisquer alinhamentos significativosretornados para construir uma matriz de escore específica deposição, que substitui a seqüência de questão para o próximo ciclode pesquisa de banco de dados. Portanto, deve ser entendido que aidentidade de porcentagem pode ser determinada ao usar qualquerum desses programas.

Duas seqüências específicas podem seralinhadas à outra usando a seqüência BLAST 2 conforme descritoem Tatusova e Madden (1999) "Seqüências Blast 2 - uma novaferramenta para comparar a proteína e seqüências de nucleotídeo",FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, aqui incorporada por referênciaem sua totalidade. O alinhamento de seqüência BLAST 2 érealizado em blastp ou blastn usando o algoritmo BLAST 2.0 pararealizar uma pesquisa BLAST Lacunada (BLAST 2.0) entre as duasseqüências, permitindo a introdução de lacunas (exclusões einserções) no alinhamento resultante. Para fins de clareza nopresente, um alinhamento de seqüência BLAST 2 é realizadousando os parâmetros default padrão conforme segue.

Para blastn. usando matriz 0 BLOSUM62:

Recompensa para combinação = 1Penalidade para má combinação =-2

Penalidades de lacuna aberta (5) e lacuna de extensão (2)lacuna x_ declive (50) espera (10) filtro (ligado) de tamanho depalavra (11)

Para blastp. usando matriz 0 BLOSUM62:

Penalidades de lacuna aberta (11) e lacuna de extensão (1)lacuna x_ declive (50) espera (10) filtro (ligado) de tamanho depalavra (3).

Uma molécula isolada de ácido nucléico éuma molécula de ácido nucléico que foi removida de seu ambientenatural (isto é, que estava sujeita à manipulação humana), seuambiente natural sendo o genoma ou cromossomo em que amolécula de ácido nucléico é encontrada na natureza. Como tal,"isolado" não necessariamente reflete a extensão em que amolécula de ácido nucléico foi purificada, porém indica que amolécula não inclui um genoma inteiro ou um cromossomo inteiroem que a molécula de ácido nucléico é encontrada na natureza.

Uma molécula de ácido nucléico isolado pode incluir um gene. Umamolécula isolada de ácido nucléico que inclui um gene não é umfragmento de um cromossomo que inclui tal gene, porém, ao invésdisso, inclui a região de codificação e regiões regulatóriasassociadas com o gene, porém nenhum genes adicionais quesejam naturalmente encontrados no mesmo cromossomo. Umamolécula de ácido nucléico isolado também pode incluir umaseqüência especificada de ácido nucléico, flanqueada por (ou seja,na extremidade 5' e/ou 3' da seqüência) ácidos nucléicos adicionaisque não flanqueiam normalmente a seqüência de ácido nucléicoespecificada na natureza (isto é, seqüências heterólogas). Amolécula de ácido nucléico isolada, pode incluir DNA, RNA (p.ex.,mRNA), ou derivativos de DNA ou RNA (p.ex., cDNA). Embora aexpressão "molécula de ácido nucléico" principalmente refere-se àmolécula de ácido nucléico física e a expressão "seqüência deácido nucléico" principalmente refere-se à seqüência denucleotídeos na molécula de ácido nucléico, as duas expressõespodem ser usadas de forma mutável, especialmente com relação auma molécula de ácido nucléico, ou uma seqüência de ácidonucléico, sendo capaz de codificar uma proteína ou domínio de umaproteína.

Uma molécula de ácido nucléicorecombinante é uma molécula que pode incluir pelo menos um dequalquer seqüência de ácido nucléico codificando qualquer uma oumais proteínas aqui descritas, operativamente ligadas a pelo menosuma de qualquer seqüência de controle de transcrição capaz deefetivamente regular a expressão da(s) molécula(s) de ácidonucléico na célula a ser transfectada. Embora a expressão"molécula de ácido nucléico" principalmente refere-se à molécula deácido nucléico física e a expressão "seqüência de ácido nucléico"principalmente refere-se à seqüência de nucleotídeos na moléculade ácido nucléico, as duas expressões podem ser usadas de formamutável, especialmente com relação a uma molécula de ácidonucléico, ou uma seqüência de ácido nucléico, sendo capaz decodificar uma proteína. Além disso, a expressão "molécularecombinante" principalmente refere-se a uma molécula de ácidonucléico operativamente ligada a uma seqüência de controle detranscrição, porém pode ser usada de forma mutável com aexpressão "molécula de ácido nucléico" que é administrada a umanimal.

Uma molécula de ácido nucléicorecombinante inclui um vetor recombinante, que é qualquerseqüência de ácido nucléico, tipicamente uma seqüênciaheteróloga, que é operativamente ligada à molécula de ácidonucléico isolada codificando uma proteína de fusão da presenteinvenção, que é capaz de permitir a produção recombinante daproteína de fusão, e que é capaz de liberar a molécula de ácidonucléico em uma célula hospedeira de acordo com a presenteinvenção. Tal vetor pode conter as seqüências de ácido nucléicoque não são naturalmente encontradas adjacentes às moléculas deácido nucléico isoladas a serem inseridas no vetor. O vetor pode serRNA ou DNA, seja procariótico ou eucariótico, e preferivelmente napresente invenção, um vírus ou plasmídio. Os vetoresrecombinantes podem ser usados na clonagem, seqüenciamentoe/ou, de outro modo, manipulação das moléculas de ácido nucléico,e podem ser usados na liberação de tais moléculas (p.ex., como emuma vacina de DNA ou uma vacina com base em vetor viral). Osvetores recombinantes são preferivelmente usados na expressãodas moléculas de ácido nucléico, e também podem serdenominados como vetores de expressão. Os vetoresrecombinantes preferidos são capazes de serem expressos em umacélula hospedeira transfectada.

Em uma molécula recombinante da presenteinvenção, as moléculas de ácido nucléico são operativamenteligadas aos vetores de expressão contendo seqüênciasregulatórias, tais como, seqüências de controle de transcrição,seqüências de controle de tradução, origens de replicação e outrasseqüências regulatórias que são compatíveis com a célulahospedeira e que controlam a expressão das moléculas de ácidonucléico da presente invenção. Especificamente, as moléculasrecombinantes da presente invenção incluem as moléculas de ácidonucléico que são operativamente ligadas a uma ou mais seqüênciasde controle de expressão. A expressão "operativamente ligado"refere-se à ligação de uma molécula de ácido nucléico a umaseqüência de controle de expressão de forma que a molécula éexpressa quando transfectada (isto é, transformada, convertida outransfectada) em uma célula hospedeira.

De acordo com a presente invenção, o termo"transfecção" é usado para referir-se a qualquer método através doqual uma molécula exógena de ácido nucléico (isto é, uma moléculade ácido nucléico recombinante) pode ser inserida em uma célula.

O termo "transformação" pode ser usado de forma mutável com otermo "transfecção" quando tal termo é usado para referir-se àintrodução das moléculas de ácido nucléico em células microbianas,tais como, algas, bactérias e levedura. Nos sistemas microbianos, otermo "transformação" é usado para descrever uma alteraçãoherdada devido à aquisição dos ácidos nucléicos exógenos pelomicroorganismo e é essencialmente sinônimo ao termo"transfecção." Portanto, as técnicas de transfecção incluem, porémnão estão limitadas à, transformação, tratamento químico dascélulas, bombardeio de partícula, eletroporação, micro-injeção,transfecção de Iipossoma1 adsorção, infecção e fusão deprotoplasto.

Vacinas e Composições da Invenção

As configurações da presente invençãoreferem-se a uma composição (vacina) que pode ser usada em ummétodo de modo a obter uma reação imune mediada por célulae/ou humoral contra um antígeno ou antígenos, e em umaconfiguração preferida, para proteger um animal de uma doença oucondição (incluindo uma infecção por um patógeno) ou para aliviarpelo menos um sintoma resultante da doença ou condição. Ascomposições geralmente incluem: (a) um veículo de levedura; e (b)um antígeno heterólogo expresso por, associado com, oucombinado com o veículo de levedura. As outras composiçõespodem incluem um veículo de levedura combinado com umantígeno heterólogo fornecido na forma de outra composição devacina, tal como uma vacina de DNA1 uma vacina de sub-unidadede proteína, ou um patógeno neutralizado ou desativado. Quando oveículo de levedura expressa um ou mais antígenos, os antígenossão expressos ou fornecidos de forma intracelular, de formaextracelular, ou ambos, em qualquer combinação. Em determinadasconfigurações, os antígenos são fornecidos como proteínas defusão que são projetadas para estabilizar a expressão da proteínaheteróloga no veículo de levedura, impedir modificação pós-translacional da proteína heteróloga expressa, e/ou pode, emalgumas configurações, fazer com que a proteína de fusão sejaexpressa na (incluindo deslocada à) superfície do veículo delevedura (expressão extracelular). As proteínas de fusão tambémfornecem uma ampla resposta imune mediada por célula e, emalgumas configurações, uma resposta imune humoral, epreferivelmente expressam mais de um antígeno diferente, e/ou sãocombinadas com outros veículos de levedura expressandodiferente(s) antígeno(s). Essas proteínas de fusão são maistipicamente expressadas como proteínas recombinantes peloveículo de levedura (p.ex., através de uma levedura intacta ouesferoplasto de levedura, que pode opcionalmente ser aindaprocessado a um citoplasto de levedura, levedura seca, oumembrana de levedura ou extrato de parede celular ou fração oupartícula do mesmo), embora seja uma configuração da invençãoque uma ou mais tais proteínas de fusão poderiam ser carregadasem um veículo de levedura (p.ex., como proteínas) ou, de outromodo, complexadas ou misturadas com um veículo de leveduraconforme aqui descrito, para formar uma vacina da presenteinvenção.

Veículos de Levedura

Em quaisquer das composições (p.ex.,vacinas) da presente invenção, os seguintes aspectos referem-seao veículo de levedura estão incluídos na invenção. De acordo coma presente invenção, um veículo de levedura é qualquer célula delevedura (p.ex., uma célula total ou intacta) ou um derivativo damesma (vide abaixo) que pode ser usada em conjunto com um oumais antígenos em uma vacina ou composição terapêutica dainvenção, ou como um adjuvante. O veículo de levedura pode,portanto, incluir, porém não está limitado à, um microorganismo delevedura intacto vivo (isto é, uma célula de levedura com todos osseus componentes, incluindo a parede celular), um microorganismode levedura intacto neutralizado (inativo), ou derivativos dosmesmos, incluindo: um esferoplasto de levedura (isto é, uma célulade levedura sem uma parede celular), um citoplasto de levedura (isto é, uma célula de levedura sem uma parede celular e núcleo),um traço de levedura (isto é, uma célula de levedura sem umaparede celular, núcleo e citoplasma), um extração de membrana delevedura subcelular ou fração do mesmo (também denominadocomo uma partícula da membrana de levedura e anteriormente comuma partícula de levedura subcelular), ou um preparo de paredecelular de levedura.

Os esferoplastos de levedura sãotipicamente produzidos por digestão enzimática de parede celularda levedura. Tal método é descrito, por exemplo, em Franzusoff eoutros, 1991, Enzimol. Metod. 194, 662-674., aqui incorporado porreferência em sua totalidade.

Os citoplastos de leveduras são tipicamenteproduzidos por enucleação das células de levedura. Tal método édescrito, por exemplo, em Coon, 1978, Monogr. Inst. Câncer Natl.48, 45-55, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Os traços de levedura são tipicamenteproduzidos ao vedar novamente uma célula permeabilizada oulisada, e pode, porém não precisa, conter pelo menos algumas dasorganelas de tal célula. Tal método é descrito, por exemplo, emFranzusoffe outros, 1983, Quím. Biol. J. 258, 3608-3614 e Busseye outros,, 1979, Ata Biofis. Bioquím. 553, 185-196, cada um dosquais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Uma partícula de membrana de levedura(extrato de membrana de levedura subcelular ou fração do mesmo)refere-se a uma membrana de levedura que é deficiente de umnúcleo natural ou citoplasma. A partícula pode ser de qualquertamanho, incluindo tamanhos diferenciados, de uma membrananatural de levedura para micro-partículas produzidas por sonicaçãoou outros métodos de rompimento de membrana conhecidos poraqueles com habilidade na técnica, após a nova vedação. Ummétodo para produzir os extratos de membrana de levedurasubcelular é descrito, por exemplo, em Franzusoff e outros, 1991,Enzimol. Metod. 194, 662-674. Uma pessoa também pode usarfrações das partículas de membrana de levedura que contêm asporções de membrana de levedura e, quando o antígeno foiexpressado de forma recombinante pela levedura antes do preparodas partículas de membrana de levedura, o antígeno de interesse.

Os antígenos podem ser transportados dentro da membrana, nasuperfície da membrana, ou combinações das mesmas (isto é, oantígeno pode estar tanto dentro quanto fora da membrana e/outranspondo a membrana da partícula de membrana de levedura).Em uma configuração, uma partícula de membrana de levedura éuma partícula de membrana de levedura recombinante, que podeser uma membrana de levedura intacta, rompida, ou rompida enovamente vedada que inclui pelo menos um antígeno desejado nasuperfície da membrana ou pelo menos parcialmente embutida coma membrana.

Um exemplo de um preparo de paredecelular da levedura é as paredes celulares isoladas da leveduratransportando um antígeno em sua superfície ou pelo menosparcialmente fixadas na parede celular, de modo que o preparo daparede celular da levedura, quando administrado em um animal,estimula uma resposta imune desejada (p.ex., protetora) contra oagente infeccioso.

Qualquer cepa de levedura pode ser usadapara produzir um veículo de levedura da presente invenção. Asleveduras são microorganismos unicelulares que pertencem a umadas três classes: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti.Uma consideração principal para a seleção de um tipo de levedurapara uso como um modulador imune é a patogenicidade dalevedura. Em uma configuração, a levedura é uma cepa nãopatogênica, tal como, Saccharomyces cerevisiae. A seleção de umacepa de levedura não patogênica é realizada para minimizarquaisquer efeitos adversos ao indivíduo a quem o veículo delevedura é administrado. Entretanto, a levedura patogênica podeser usada se a patogenicidade da levedura pode ser negada porquaisquer meios conhecidos por aquele com habilidade na técnica(p.ex., cepas mutantes). Enquanto as cepas de levedurapatogênica, ou mutantes não-patogênicos das mesmas, foramusadas no passado como adjuvantes ou como modificações deresposta biológica, e podem ser usadas em conformidade com apresente invenção, as cepas de levedura não-patogênica sãopreferidas.

Os gêneros preferidos de cepas de leveduraincluem Saccharomyces, Candida (que pode ser patogênica),Cryptocoeeus, Hansenula1 Kluyveromyees, Pichia, Rhodotorula,Schizosaccharomyces e Yarrowia, com Saccharomyces, Candida,Hansenula, Pichia e Schizosaccharomyces, sendo mais preferidas,e com Saccharomyces sendo especificamente preferida. Asespécies preferidas das cepas de levedura incluem Saccharomycescerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida aibicans,Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii,Cryptococcus neoformans, Hansenula anômala, Hansenulapolymorpha, Kluyveromyees fragilis, Kluyveromyees lactis,Kluyveromyees marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorularubra, Schizosaccharomyces pombe, e Yarrowia lipolytica. Éapreciado que um número dessas espécies inclui uma variedade desubespécies, tipos e subtipos, etc. que tem a intenção para seremincluídos nas espécies acima mencionadas. As espécies delevedura mais preferidas incluem S. cerevisiae, C. albicans, H.polymorpha, P. pastoris e S. pombe. A S. cerevisiae éespecificamente preferida devido a ser relativamente fácil demanipular e sendo "Geralmente Reconhecida como Segura" ou"GRAS" para uso como aditivos alimentares (GRAS, Regraproposta pela FDA 62FR18938, 17 de abril de 1997). Umaconfiguração da presente invenção é uma cepa de levedura que écapaz de replicar os plasmídios à um número de cópiaespecificamente alto, tal como, uma cepa cir° de S. cerevisiae. Acepa de S. cerevisiae é tal cepa que é capaz de suportar os vetoresde expressão que permitem que um ou mais antígenos alvo e/ouproteínas de fusão de antígeno sejam expressos em altos níveis.

Além disso, quaisquer cepas de levedura mutante podem serusadas na presente invenção, incluindo aquelas que exibemmodificações reduzidas pós-translacionais dos antígenos alvoexpressos, tais como, mutações nas enzimas que estendem aglicosilação ligada por N.

Em uma configuração, um veículo delevedura preferido da presente invenção é capaz de fundir-se com otipo de célula ao qual o veículo de levedura e antígeno está sendoadministrado, tal como, uma célula dendrítica ou macrófago, assimefetuando especificamente a administração eficiente do veículo delevedura, e em muitas configurações, o(s) antígeno(s), ao tipo decélula. Conforme aqui usado, a fusão de um veículo de leveduracom um tipo de célula direcionada refere-se à capacidade damembrana de célula de levedura, ou partícula da mesma, de fundir-se com a membrana do tipo de célula direcionada (p.ex., céluladendrítica ou macrófago), levando à formação de sincício.Conforme aqui usado, um sincício é uma massa multinucleada deprotoplasma produzido pela fusão de células. Um número deproteínas de superfície viral (incluindo aqueles vírus deimunodeficiência, tais como, HIV, vírus de influenza, vírus dapoliomelite e adenovírus) e outros fusogens (tais como aquelesenvolvidos nas fusões entre os óvulos e esperma) foramdemonstrados como capazes para efetuar a fusão entre duasmembranas (isto é, entre membranas de célula viral e mamífera ouentre membranas de célula mamífera). Por exemplo, um veículo delevedura que produz um antígeno heterólogo de HIV gp120/gp41em sua superfície é capaz de fundir-se com um linfócito T CD4+. Éobservado, entretanto, que a incorporação de uma metadedirecionada no veículo de levedura, enquanto possa ser desejávelsob algumas circunstâncias, não é necessário. No caso dosveículos de levedura que expressam os antígenos de formaextracelular, isso pode ser uma vantagem adicional dos veículos delevedura da presente invenção. Foi anteriormente demonstrado queos veículos de levedura da presente invenção são prontamenteobtidos pelas células dendríticas (bem como outras células, taiscomo macrófagos).

Os métodos para produzir os veículos delevedura e expressar, combinar ou associar os veículos de leveduracom os antígenos são abaixo descritos.

Antígenos

Os antígenos contemplados para uso nestainvenção incluem qualquer antígeno contra o qual é desejado paraobter uma resposta imune. Por exemplo, os antígenos podemincluir, porém não estão limitados à, quaisquer antígenosassociados à um patógeno, incluindo antígenos virais, antígenos defungo, antígenos bacterianos, antígenos de helminto, antígenosparasíticos, antígenos de ectoparasita, antígenos de protozoário, ouantígenos de qualquer outro agente infeccioso. Os antígenostambém podem incluir quaisquer antígenos associado a umadoença ou condição específica, seja de fontes patogênicas oucelulares, incluindo, porém não limitados à, antígenos de câncer,antígenos associados à uma doença auto-imune (p.ex., antígenosde diabetes), antígenos de alergia (alérgenos), moléculas de célulamamífera abrigando um ou mais aminoácidos de mutação,proteínas normalmente expressadas de forma pré- ou neonatal porcélulas mamíferas, proteínas cuja expressão é induzida porinserção de um agente epidemiológico (p.ex., vírus), proteínas cujaexpressão é induzida por deslocamento de gene, e proteínas cujaexpressão é induzida por mutação das seqüências regulatórias.Esses antígenos podem ser antígenos nativos ou antígenosgeneticamente projetados que foram modificados de alguma forma(p.ex., alteração de seqüência ou geração de uma proteína defusão). Será apreciado que, em algumas configurações (isto é,quando o antígeno for expresso pelo veículo de levedura a partir deuma molécula de ácido nucléico recombinante), o antígeno pode seruma proteína ou qualquer epítopo de domínio imunogênico damesma, uma proteína de fusão, ou uma proteína quimérica, aoinvés de um microorganismo inteiro de célula.

Outros antígenos preferidos para incluir nascomposições (vacinas) da presente invenção incluem os antígenosque são capazes de suprimir uma resposta imune indesejada ouprejudicial, tal como, sendo provocada, por exemplo, por alérgenos,antígenos auto-imunes, agentes inflamatórios, antígenos envolvidosem GVHD, determinados cânceres, antígenos de choque séptico, eantígenos envolvidos na rejeição de transplantação. Tais compostosincluem, porém não estão limitados à, anti-histamínicos,ciclosporina, corticosteróides, FK506, peptídeos correspondentesaos receptores de célula T envolvidos na produção de uma respostaimune prejudicial, Iigantes Fas (isto é, compostos que aglutinam aodomínio extracelular ou citosólico dos receptores Fas celulares,assim induzindo a apoptose), complexos adequados de MHCapresentados de tal forma de modo a efetuar a tolerização ouanergia, receptores de célula T, e antígenos auto-imunes,preferivelmente em combinação com um modificador de respostabiológica capaz de otimizar ou suprimir a imunidade mediada porcélula e/ou humoral.

Os antígenos de tumor (antígenos de câncer)úteis na presente invenção, podem incluir um antígeno de tumor, talcomo, uma proteína, glicoproteína ou carboidratos de superfície deuma célula de tumor, um epítopo de um antígeno de tumor, todauma célula de tumor, misturas de células de tumor, e porções dosmesmos (p.ex., lisados).

Em um aspecto, o antígeno é de vírus,incluindo, porém não limitado à, adenovírus, arenavírus, bunyavírus,coronavírus, vírus de coxsackie, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr, flavivírus, hepadnavírus, vírus da hepatite, vírus do herpes,vírus de influenza, lentivírus, vírus do sarampo, vírus da caxumba,myxovírus, vírus oncogênicos, ortomixovírus, vírus de papiloma,papovavírus, vírus de parainfluenza, paramyxovírus, parvovírus,picornavírus, vírus da varíola, vírus da raiva, vírus sincicialrespiratório, reovírus, rhabdovírus, vírus da rubéola, togavírus evírus da varicela. Outros vírus incluem vírus linfotrópicos T1 taiscomo, vírus linfotrópicos de célula T humana (HTLVs, tais comoHTLV-I e HTLV-II), vírus da leucemia bovina (BLVS) e vírus daleucemia felina (FLVs). Os lentivírus incluiriam, porém não estãolimitadas à, vírus de imunodeficiência humana (HIV, incluindo HIV-1ou HIV-2), símio (SIV), felino (FIV) e canino (CIV).

Em outro aspecto, o antígeno é de umagente infeccioso de um gênero selecionado de: Aspergillus,Bordatella, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus,Dirofilaria, Escherichia, Francisella, Gonococcus, Histoplasma,Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis,Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia1 Salmonella,Shigeiia1 Staphyiococcus, Streptococcus, Toxopiasma1Vibriocholerae Yersinia. Em um aspecto, o agente infeccioso éselecionado de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax.

Em um aspecto, o antígeno é de umabactéria de uma família selecionada a partir de: Enterobacteriaceae,Micrococcaceae, Vibrionaeeae, Pasteurellaeeae,Mycopiasmataeeae e Riekettsiaeeae. Em um aspecto, a bactéria éum gênero selecionado a partir de: Pseudomonas Bordetella1Mycobaeterium1 Vibrio1 Bacillus1 Salmonella1 Franeisella1Staphyiococcus, Streptococcus; Escherichia1 Enterococcus,Pasteurella1 e Yersinia. Em um aspecto, a bactéria é de umaespécie selecionada de: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonasmallei, Pseudomonas pseudomallei, Bordetetta pertussis,Mycobaeterium tuberculosis, Mycobacterium Ieprae1 Francisellatularensis, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Salmonella enteric,Yersinia pestis, Escherichia coli e Bordetella bronchiseptica.De acordo com a presente invenção, umantígeno adequado para uso na presente composição ou vacinapode incluir dois ou mais domínios imunogênicos ou epítopos domesmo antígeno, dois ou mais domínios imunogênicos deantígenos, ou epítopos da mesma célula, tecido ou organismo, oudois ou mais diferentes antígenos, domínios imunogênicos, ouepítopos de diferentes células, tecidos ou organismos.

Conforme acima discutido, as proteínas defusão usadas nas vacinas e composições da invenção incluem pelomenos um antígeno de influenza para vacinar um animal. Acomposição ou vacina pode incluir um, dois, poucos, diversos ouuma pluralidade de antígenos de influenza, incluindo um ou maisdomínios imunogênicos de um ou mais antígenos de influenza,conforme desejado.

Quando os antígenos dos patógenos sãousados, tais como, o vírus de influenza, aquele com habilidade natécnica pode maximizar a eficácia a longo prazo da vacinacompreendendo o veículo de levedura expressando os antígenosde patógeno, ao selecionar os antígenos das regiões do genoma depatógeno que são altamente conservados em diferentes cepas dopatógeno. Além disso, ao selecionar os antígenos das regiões dopatógeno que são variáveis, tais como antígenos que diferem decepa a cepa ou podem sofrer mutações a cada estação ou em umaregião geográfica, por exemplo, a capacidade da vacina de tratarepidemia específica é maximizada. Esse aspecto da invenção foidiscutido em detalhes acima.

Em um aspecto, o patógeno é um vírus deinfluenza. Nesse aspecto, os antígenos conservados ouinternamente expressados incluem: a proteína de matriz (M1), canalde íon (M2) antígeno, antígeno de nucleocapsídeo (NP), antígenode polimerase PB1 (PB1), antígeno de polimerase (PB2), eantígeno de polimerase PA (PA). Os antígenos variáveis eexternamente expressados incluem antígenos de hemaglutinina(HA) (qualquer um ou mais subtipos) e antígenos de neuraminidase(NA) (qualquer um ou mais subtipos), bem como a porçãoextracelular de M2, denominada M2e. Esses antígenos podem serselecionados conforme acima descrito para uso em uma novaestratégia de vacina de acordo com a invenção.

Em um aspecto, o patógeno é um vírus dahepatite, tais como, o vírus da hepatite C (HCV). Nesse aspecto, osantígenos conservados ou internamente expressados incluemproteína de Núcleo de HCV1 NS2, NS3, NS4, NS5 de HCV. Osantígenos variáveis ou externamente expressos incluem E1 e E2 deHCV (proteínas de envelope). Esses antígenos podem serselecionados conforme acima descrito para uso em uma novaestratégia de vacina de acordo com a invenção.

Em um aspecto, o patógeno é um vírus dahepatite, tais como, vírus da hepatite B (HBV). Nesse aspecto, osantígenos conservados ou internamente expressados incluem:HbcAg de antígeno de núcleo e HbeAg de antígeno. Os antígenosvariáveis ou externamente expressados incluem HbsAg (vírion de42 nM e partícula de 22 nM). Esses antígenos podem serselecionados conforme acima descrito para uso em uma novaestratégia de vacina de acordo com a invenção.

Em um aspecto, o patógeno é um vírus daimunodeficiência, tal como, vírus da imunodeficiência humana(HIV). Nesse aspecto, os antígenos conservados ou internamenteexpressados incluem: Vif, Vpr, Nef, p7, nucleocapsídeo. Osantígenos variáveis ou externamente expressados incluem gp120 egp41. Esses antígenos podem ser selecionados conforme acimadescrito para uso em uma nova estratégia de vacina de acordo coma invenção.

Em algumas configurações, o antígeno éuma proteína de fusão. Em um aspecto da invenção, a proteína defusão pode incluir dois ou mais antígenos. Em um aspecto, aproteína de fusão pode incluir dois ou mais domínios imunogênicosou dois ou mais epítopos de um ou mais antígenos (p.ex., umaseqüência de M1 de influenza e uma seqüência de HA deinfluenza). Tal vacina pode fornecer a imunização específica deantígeno em uma ampla variação de pacientes. Por exemplo, umaproteína de fusão de domínio útil na presente invenção pode termúltiplos domínios, caracterizada pelo fato de que cada domínioconsiste em um peptídeo de uma proteína específica, o peptídeoconsistindo em pelo menos 4 resíduos de aminoácido flanqueandoqualquer lado de e incluindo um aminoácido de mutação que éencontrado na proteína, caracterizado pelo fato de que a mutação éassociada a uma doença ou condição específica (p.ex., infecção deinfluenza por uma cepa específica).

Em uma configuração, as proteínas de fusãoque são usadas como um componente da vacina com base emlevedura da presente invenção, são produzidas usando construçõesque são especificamente úteis para a expressão dos antígenosheterólogos na levedura. Tipicamente, a proteína(s) ou peptídeo(s)desejado(s) antigênico(s) é(são) fundido(s) em sua extremidade determinal de amino a : (a) um peptídeo sintético específico queestabiliza a expressão da proteína de fusão no veículo de leveduraou impede a modificação pós-translacional da proteína de fusãoexpressa (tais peptídeos são descritos em detalhes, por exemplo,na Publicação de Patente Norte-Americana N0 2004-0156858 A1,publicada em 12 de agosto de 2004, aqui incorporada por referênciaem sua totalidade); (b) pelo menos uma porção de uma proteína delevedura endógena, caracterizada pelo fato de que o parceiro defusão fornece significativamente a estabilidade otimizada daexpressão da proteína na levedura e/ou impede a modificação pós-translacional das proteínas pelas células de levedura (tais proteínastambém são descritas em detalhes, por exemplo, na Publicação dePatente Norte-Americana N0 2004-0156858 A1, supra); e/ou (c)pelo menos uma porção de uma proteína de levedura que faz comque a proteína de fusão seja expressada na superfície da levedura(p.ex., uma proteína Aga, descrita aqui em mais detalhes).

Da mesma forma, os peptídeos ou proteínasde fusão podem fornecer um epítopo que pode ser projetado paraser reconhecido por um agente de seleção, tal como, um anticorpo,e não aparentam impactar negativamente a resposta imune contra oantígeno de vacinação na construção. Tais agentes são úteis para aidentificação, seleção e purificação das proteínas úteis na invenção.

Além disso a presente invenção inclui o usode peptídeos que são fundidos ao terminal C da construçãocodificando o antígeno, especificamente para uso na seleção eidentificação da proteína. Tais peptídeos incluem, porém não estãolimitados à, qualquer peptídeo sintético ou natural, tal como, umamarca de peptídeo (p.ex., 6X His) ou qualquer outra marca curta deepítopo. Os peptídeos ligados ao terminal C de um antígeno deacordo com a invenção podem ser usados com ou sem a adiçãodos peptídeos de terminal N acima discutidos.

Uma construção de fusão útil na presenteinvenção é uma proteína de fusão que inclui: (a) pelo menos umantígeno (incluindo os domínios imunogênicos e epítopos de umantígeno de comprimento total, bem como diversas proteínas defusão e múltiplas construções de antígeno conforme descrito emqualquer local no presente); e (b) um peptídeo sintético.

Em uma configuração, o peptídeo sintético éligado ao terminal N do antígeno de influenza, o peptídeoconsistindo em pelo menos dois resíduos de aminoácido que sãoheterólogos ao antígeno de influenza, caracterizado pelo fato deque o peptídeo estabiliza a expressão da proteína de fusão noveículo de levedura ou impede a modificação pós-translacional daproteína de fusão expressada. O peptídeo sintético e porção determinal N do antígeno juntos formam uma proteína de fusão quepossui as seguintes exigências: (1) o resíduo de aminoácido naposição um da proteína de fusão é a metionina (isto é, o primeiroaminoácido no peptídeo sintético é uma metionina); (2) o resíduo deaminoácido na posição dois da proteína de fusão não é uma glicinaou uma prolina (isto é, o segundo aminoácido no peptídeo sintéticonão é uma glicina ou uma prolina); (3) nenhum dos resíduos deaminoácido nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma metionina(isto é, os aminoácidos nas posições 2-6, sejam partes do peptídeosintético ou da proteína, se o peptídeo sintético for mais curto doque 6 aminoácidos, não incluem uma metionina); e (4) nenhum dosaminoácidos nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma Iisina ouuma arginina (isto é, os aminoácidos nas posições 2-6, sejampartes do peptídeo sintético ou da proteína, se o peptídeo sintéticofor mais curto do que 5 aminoácidos, não incluem uma Iisina ouuma arginina). O peptídeo sintético pode ser tão curto quanto doisaminoácidos, porém é mais preferivelmente pelo menos 2-6aminoácidos (incluindo 3, 4, 5 aminoácidos), e pode ser mais longodo que 6 aminoácidos, em números inteiros, até cerca de 200aminoácidos, 300 aminoácidos, 400 aminoácidos, 500 aminoácidosou mais.

Em uma configuração, uma proteína defusão compreende uma seqüência de aminoácido de M-X2-X3-X4-X5-X6, em que M é metionina; em que X2 é qualquer aminoácido,exceto a glicina, prolina, Iisina ou arginina; em que X3 é qualqueraminoácido, exceto metionina, Iisina ou arginina; em que X4 équalquer aminoácido, exceto metionina, Iisina ou arginina; em queX5 é qualquer aminoácido, exceto metionina, Iisina ou arginina; e emque X6 é qualquer aminoácido, exceto metionina, Iisina ou arginina.Em uma configuração, o resíduo de X6 é uma prolina. Umaseqüência sintética exemplar que otimiza a estabilidade daexpressão de um antígeno de influenza em uma célula de levedurae/ou impede a modificação pós-translacional da proteína nalevedura inclui a seqüência M-A-D-E-A-P (SEQ ID N0:1). Aseqüência MADEAP pode ser usada com outros antígenos além doantígeno de influenza. Além disso, para a estabilidade otimizada doproduto de expressão, esse parceiro de fusão não aparece para terimpacto negativamente na resposta imune contra o antígeno devacinação na construção. Além disso, os peptídeos sintéticos defusão podem ser projetados para fornecer um epítopo que pode serreconhecido por um agente de seleção, tal como um anticorpo.

Em outra configuração da invenção, osácidos nucléicos que codificam o local de início de conversão de umpeptídeo sintético usado na invenção são A-C-C-A-T-G-G, emconformidade com as regras de seqüência de conversão de Kozak,em que ATG nessa seqüência é o local inicial de conversão ecodifica a metionina de M-A-D-E-A-P (SEQ ID N0:1). Deve serentendido que diversas configurações da invenção conformedescritas no presente também podem ser combinadas. Porexemplo, em um aspecto da invenção, quando o peptídeo sintéticoé MA-D-E-A-P (SEQ ID N°:1), os ácidos nucléicos codificando olocal de início para esse peptídeo pode ser A-C-C-A-T-G-G.Diversas outras combinações das configurações da invenção serãoaparentes para aqueles com habilidade na técnica.

Em um aspecto da invenção, o veículo delevedura é manipulado de modo que o antígeno é expressado oufornecido através da liberação ou deslocamento de um produto deantígeno expressado parcialmente ou totalmente, na superfície doveículo de levedura (expressão extracelular). Um método pararealizar esse aspecto da invenção é o de usar um braço espaçadorpara posicionar um ou mais antígenos na superfície do veículo delevedura. Um modo para usar um braço espaçador é o de criar umaproteína de fusão do(s) antígeno(s) de interesse com uma proteínaque direciona o(s) antígeno(s) de interesse à parede celular dalevedura. Por exemplo, uma proteína que pode ser usada é umaproteína de levedura (p.ex., proteína de parede celular 2 (cwp2),proteína de Aga2, Pir4 ou Flo1) que permite que o(s) antígeno(s)seja(m) direcionado(s) à parede celular da levedura, de modo que oantígeno esteja localizado na superfície da levedura. As proteínas,exceto as proteínas de levedura, podem ser usadas para o braçoespaçador; entretanto, para qualquer proteína de braço espaçador,é mais desejável fazer com que a resposta imunogênica sejadirecionada contra o antígeno alvo, ao invés da proteína de braçoespaçador. Como tal, se as outras proteínas forem usadas para obraço espaçador, então a proteína de braço espaçador que é usadanão deve gerar tal grande resposta imune à própria proteína dobraço espaçador, de modo que a resposta imune ao(s) antígeno(s)alvo é devastada . Aquele com habilidade na técnica almejaria umapequena resposta imune à proteína do braço espaçador com relação à resposta imune para o(s) antígeno(s) alvo. Qualquermétodo conhecido para determinar a magnitude das respostasimunes pode ser usado (p.ex., produção de anticorpo, ensaioslíticos, etc.) e são prontamente conhecidos para aquele comhabilidade na técnica.

Outro método para posicionar o(s)antígeno(s) alvo a ser(em) exposto(s) na superfície de levedura é ode usar as seqüências de sinal, tais como, glicosilfosfatidil inositol(GPI) para ancorar o alvo à parede celular da levedura.Alternativamente, o posicionamento pode ser realizado ao ligar asseqüências de sinal que direcionam o(s) antígeno(s) de interesseem uma rota secretora via deslocamento no retículo endoplasmático(ER), de modo que o antígeno aglutina-se a uma proteína que éaglutinada à parede celular (p.ex., cwp).

Em um aspecto, a proteína do braçoespaçador é uma proteína de levedura. A proteína de levedura podeconsistir em entre cerca de dois e cerca de 800 aminoácidos deuma proteína de levedura. Em uma configuração, a proteína delevedura é cerca de 10 a 700 aminoácidos. Em outra configuração,a proteína de levedura é cerca de 40 a 600 aminoácidos. As outrasconfigurações da invenção incluem a proteína de levedura sendopelo menos 250 aminoácidos, pelo menos 300 aminoácidos, pelomenos 350 aminoácidos, pelo menos 400 aminoácidos, pelo menos450 aminoácidos, pelo menos 500 aminoácidos, pelo menos 550aminoácidos, pelo menos 600 aminoácidos ou pelo menos 650aminoácidos. Em uma configuração, a proteína de levedura é depelo menos 450 aminoácidos em comprimento.

Em outra configuração, a proteína delevedura estabiliza a expressão da proteína de fusão no veículo delevedura, previne a modificação pós-translacional da proteína defusão expressada, e/ou direciona a proteína de fusão a umcompartimento específico na levedura (p.ex., a ser expressa nasuperfície da célula de levedura). Para liberação na rota secretorada levedura, as proteínas exemplares de levedura para usarincluem, porém não estão limitas à: Aga (incluindo, porém nãoestão limitas à, Agal e/ou Aga2); SUC2 (invertase de levedura);seqüência líder de sinal de fator alfa; CPY; Cwp2p para sualocalização e retenção na parede celular; genes BUD paralocalização no botão da célula de levedura durante a etapa inicial daformação de célula-filha; Flolp; Pir2p; e Pir4p.

Em outro aspecto da invenção, outrasseqüências podem ser usadas para direcionar, reter e/ou estabilizara proteína para outras partes do veículo de levedura, por exemplo,no citosol ou mitocôndria. Os exemplos da proteína de leveduraadequada que podem ser usados para quaisquer das configuraçõesacima incluem, porém não estão limitas à, SEC7; fosfoenolpiruvatocarboxiquinase PCK1, fosfogliceroquinase PGK e produtos de genede triose-fosfato isomerase TPI para sua expressão reprimível nalocalização citosólica e de glicose; as proteínas de choque térmicoSSA1, SSA3, SSA4, SSC1, cuja expressão é induzida e cujasproteínas são mais termoestáveis mediante a exposição das célulasao tratamento térmico; a proteína mitocondrial CYC1 paraimportação à mitocôndria; ACT1.

Para preparar uma resposta imune humoralefetiva, o antígeno alvo deve ser expressado ou fornecido emalguma parte na superfície de levedura (ou secretado pelalevedura). Conforme mostrado nas Figs. 10A e 10B, Fig. 11, e Fig.13B, e os Exemplos, as múltiplas variações são possíveis paraexpressar ou fornecer um antígeno na superfície da célula delevedura. Aquele com habilidade na técnica apreciará que outrascombinações de proteínas de levedura podem ser usadas paraposicionar um ou mais antígenos de interesse na superfície.

Aquele com habilidade na técnica podeotimizar a expressão ou provisão de um antígeno na superfície deum veículo de levedura de diversos modos. Um modo é o demonitorar e/ou controlar a expressão da superfície do antígeno. Ummétodo possível para atingir isso é o de otimizar os níveis deexpressão do antígeno de modo a fornecer o impacto máximo. Comalguns antígenos, muita expressão do antígeno é tóxica para alevedura ou alternativamente, para as células imunes e sistemaimune do indivíduo. Em outros casos, muita pouca expressão desuperfície pode provocar preparação do sistema imune a ser sub-ideal devido à falta da interação de antígeno com as células B.

Aquele com habilidade na técnica pode monitorar a expressão doantígeno ao usar as técnicas bem-conhecidas, tal como, citometriade fluxo (p.ex., FACS) e correlacionar o nível de expressão com aviabilidade da célula.

Outro método para otimizar a expressão dasuperfície do antígeno ou provisão é o de cuidadosamenteselecionar os braços espaçadores a partir do parceiro de fusão daparede celular. Embora os exemplos das proteínas de levedura quepodem ser usados como braços espaçadores sejam fornecidos infrae também demonstrados na Fig. 10B, o tamanho do(s) braço(s)espaçador(s) pode afetar quanto do antígeno é exposto paraaglutinação na superfície da levedura. Dessa forma, dependendoem qual(is) antígeno(s) está(ão) sendo usado(s), aquele comhabilidade na técnica selecionará um braço espaçador que efetue oespaçamento apropriado para o antígeno na superfície da levedura.Em uma configuração, o braço espaçador é uma proteína delevedura de pelo menos 450 aminoácidos.

Outra consideração para otimizar aexpressão de superfície de antígeno é se a combinação deantígeno e braço espaçador deve ser expressado como ummonômero (p.ex., HA-cwp2 conforme mostrado na Fig. 11) ou comoum dímero ou como um trímero {p.ex., HA-aga2p trimérico mais HAsecretado solúvel), ou ainda mais unidades conectadas juntas. Esseuso de monômeros, dímeros, trímeros, etc. permite o espaçamentoou enovelamento apropriado do antígeno, de modo que algumaparte, se não toda, do antígeno seja exibida na superfície do veículode levedura de uma forma que o torna mais imunogênicos, se, porexemplo, a forma multimérica adota uma conformação exigida parainduzir uma classe específica de anticorpos, p.ex., neutralizandoanticorpos.

Aquele com habilidade na técnica podeotimizar o desempenho do veículo de levedura (com e sem aexpressão do antígeno heterólogo), tanto na superfície do veículode levedura quanto no citosol, ao cultivar as células de levedura emum nível de pH que é superior a 5,5 (quer dizer, pH neutro). O usodo pH neutro auxilia para otimizar a acessibilidade do antígeno eapresentação de superfície, permite que a parede celular dalevedura esteja em um estado mais flexível, e acionar as célulasimunes aglutinando-se à levedura para gerar uma resposta imuneotimizada incluindo citocinas benéficas de secreção (p.ex., INF-gama) e respostas otimizadas de ativação.

Outro método que aquele com habilidade natécnica pode usar para otimizar os veículos de levedura parapreparar as respostas de anticorpo é o de controlar a quantidade deglicosilação da levedura. A quantia de glicosilação de levedura podeafetar a "immunogenicidade e antigenicidade" do antígeno expressona superfície, considerando que,as metades de açúcar tendem aserem volumosas. Como tal, ao praticar a invenção, a existênciadas metades de açúcar na superfície da levedura e seu impacto noespaço tridimensional em volta do(s) antígeno(s) alvo devem serconsiderados. Qualquer método pode ser usado para reduzir aquantia de glicosilação da levedura. Por exemplo, uma pessoapoderia usar uma cepa mutante de levedura que foi selecionadapara ter baixa glicosilação (p.ex., mutantes mnnl, och1 e mnn9), ouuma pessoa poderia eliminar por mutação as seqüências deaceitador de glicosilação no antígeno alvo. Alternativamente, umapessoa poderia usar uma levedura com padrões abreviados deglicosilação, p.ex., Pichia. Um exemplo dos efeitos de glicosilaçãono antígeno de superfície é fornecido no Exemplo 5.

Outra consideração com relação à provisãodo antígeno na superfície de uma levedura é como a levedura édesativada e seus efeitos potenciais sobre como isso afeta aantigenicidade do antígeno expresso na superfície. A desativaçãotérmica da levedura é um modo padrão de desativar a levedura,entretanto, a desativação térmica possui o potencial para alterar aestrutura secundária, terciária ou quaternária do antígeno alvo. Se adesativação térmica for usada, então aquele com habilidade natécnica deve precaver-se para monitorar as alterações estruturaisdo antígeno alvo através de métodos padrão conhecidos na técnica.Alternativamente, outros métodos para desativar a levedura podemser usados, tais como, métodos químicos, elétricos, radioativos ouUV. Vide, por exemplo, a metodologia revelada nos livros de culturade levedura padrão, tal como, Métodos de Enzimologia1 Vol. 194,Cold Spring Harbor Publishing (1990). Quaisquer das estratégias deotimização usadas devem considerar a estrutura secundária,terciária ou quaternária do antígeno alvo e preservar tal estrutura demodo a otimizar sua "immunogenicidade".

Outro aspecto específico das construções deproteína de fusão da presente invenção que é semelhante àsconfigurações acima, e que pode incluir as limitações dasconfigurações acima (embora isto não seja exigido), inclui umavacina compreendendo um peptídeo ligado ao terminal C doantígeno de influenza, o peptídeo consistindo em pelo menos doisresíduos de aminoácido que são heterólogos ao antígeno deinfluenza, caracterizado pelo fato de que o peptídeo estabiliza aexpressão da proteína de fusão no veículo de levedura ou previne amodificação pós-translacional da proteína de fusão expressa. Emum aspecto exemplar da invenção, o peptídeo compreende umaseqüência de aminoácido de E-D (Glu-Asp). Tal seqüência trabalhapara agir contra a hidrofobicidade.

Em uma configuração, uma vacina dapresente invenção pode compreender um peptídeo ligado aoterminal C do antígeno de influenza, caracterizado pelo fato de queo peptídeo permite para o reconhecimento da proteína de fusão porum anticorpo direcionado contra o peptídeo. Em um aspecto, opeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido de G-G-G-H-H-H-H-H-H (SEQ ID N°:2). Essa configuração pode ser usadasozinha ou em conjunto com outros aspectos das proteínas defusão acima descritas.

Em uma configuração, a proteína delevedura/peptídeos, braços espaçadores, ou peptídeo sintéticousado nas proteínas de fusão no presente, compreende um epítopode anticorpo para identificação e purificação da proteína de fusão.Os anticorpos já podem estar disponíveis que seletivamenteaglutinam-se a um antígeno endógeno ou podem ser prontamentegerados. Finalmente, se for desejado direcionar uma proteína auma localização celular específica (p.ex., na rota secretora, namitocôndria, no núcleo), então a construção pode usar os sinaisendógenos para a proteína de levedura para certificar-se de que omaquinário celular seja otimizado para tal sistema de liberação. Taissinais foram descritos em alguns detalhes acima. Preferivelmente,um anticorpo está disponível ou é produzido que seletivamenteaglutina-se ao parceiro de fusão.

Produção dos Veículos de Levedura.Tarmogens e Composições (Vacinas) da Invenção

De acordo com a presente invenção, o termo"complexo do veículo de levedura-antígeno" ou "complexo delevedura-antígeno" é usado genericamente para descrever qualquerassociação de um veículo de levedura com um antígeno. Talassociação inclui a expressão do antígeno pela levedura (umalevedura recombinante), introdução de um antígeno em umalevedura, anexação física do antígeno à levedura, e mistura dalevedura e antígeno juntos, tais como, em um tampão ou outrasolução ou formulação. Esses tipos de complexos são descritos emdetalhes abaixo.

Em uma configuração, uma célula delevedura usada para preparar o veículo de levedura é transfectadacom uma molécula heteróloga de ácido nucléico codificando oantígeno de modo que o antígeno é expresso pela célula delevedura. Tal levedura também é mencionada no presente comouma levedura recombinante ou um veículo de levedurarecombinante. A célula de levedura pode então ser carregada nacélula dendrítica como uma célula intacta, ou a célula de levedurapode ser neutralizada, ou pode ser derivatizada tal como através deformação de esferoplasto de leveduras, citoplastos, secos,partículas subcelulares, quaisquer dos quais é seguido pelocarregamento do derivativo na célula dendrítica. Os esferoplasto deleveduras também podem ser diretamente transfectados com umamolécula recombinante de ácido nucléico (p.ex., o esferoplasto éproduzido a partir de uma levedura inteira, e então transfectado)com a finalidade de produzir um esferoplasto recombinante queexpressa um antígeno.

Em um aspecto, uma célula de levedura ouesferoplasto de levedura usado para preparar o veículo de leveduraé transfectado com uma molécula recombinante de ácido nucléicocodificando o(s) antígeno(s), de modo que o antígeno é expressadode forma recombinante pela célula de levedura ou esferoplasto delevedura. Nesse aspecto, uma célula de levedura ou esferoplastode levedura que expressa de forma recombinante o(s) antígeno(s) éusado para produzir um veículo de levedura compreendendo umcitoplasto de levedura, uma levedura seca, ou uma partícula demembrana de levedura ou partícula da parede celular da levedura,ou fração da mesma.

De modo geral, o veículo de levedura e o(s)antígeno(s) podem ser associados por qualquer técnica aquidescrita. Em um aspecto, o veículo de levedura foi carregado deforma intracelular com o(s) antígeno(s). Em outro aspecto, o(s)antígeno(s) foi(foram) anexado(s) de forma covalente ou nãocovalente ao veículo de levedura. Em ainda outro aspecto, o veículode levedura e o(s) antígeno(s) foi(foram) associado(s) por mistura.

Em outro aspecto, e na configuração preferida, o(s) antígeno(s)é(são) expressado(s) de forma recombinante pelo veículo delevedura ou pela célula de levedura ou esferoplasto de levedura apartir do qual o veículo de levedura foi derivado.

Um número preferido de antígenos a seremproduzidos por um veículo de levedura da presente invenção équalquer número de antígenos que podem ser razoavelmenteproduzidos por um veículo de levedura, e tipicamente varia de pelomenos um para pelo menos cerca de 6 ou mais, de cerca de 2 acerca de 6 antígenos heterólogos sendo mais preferidos.

A expressão de um antígeno em um veículode levedura da presente invenção é realizada usando as técnicasconhecidas para aqueles com habilidade na técnica. Brevemente,uma molécula de ácido nucléico codificando pelo menos umantígeno desejado é inserida em um vetor de expressão de talforma que a molécula de ácido nucléico seja operativamente ligadaa uma seqüência de controle de transcrição com a finalidade de sercapaz de efetuar a expressão constitutiva ou regulada da moléculade ácido nucléico, quando transformada em uma célula hospedeirade levedura. As moléculas de ácido nucléico codificando um oumais antígenos podem ser um ou mais vetores de expressãooperativamente ligados a uma ou mais seqüências de controle deexpressão. Especificamente, as importantes seqüências de controlede expressão são aqueles que controlam a iniciação de transcrição,tais como, seqüências de ativação de promotor e a montante.Qualquer promotor adequado de levedura pode ser usado napresente invenção e uma variedade de tais promotores é conhecidapara aqueles com habilidade na técnica. Os promotores preferidospara expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem, porém nãoestão limitadas à, promotores de genes codificando as seguintesproteínas de levedura: alcóol-desidrogenase I (ADH1) ou Il (ADH2),CUP1, fosfoglicerato quinase (PGK)1 triose-fosfato isomerase (TPI),fator prolongamento translacional EF-1 alfa (TEF2), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; também denominado como TDH3,para triose-fosfato desidrogenase), galactoquinase (GAL1),galactose-1-fosfato uridil-transferase (GAL7), UDP-galactoseepimerase (GAL10), citocromo C1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) efosfatase ácida (PH05), com promotores híbridos, tais como,promotores ADH2/GAPDH e CYC1/GAL10 sendo mais preferidos, eo promotor ADH2/GAPDH, que é induzido quando asconcentrações de glicose na célula estão baixas (p.ex., cerca de 0,1a cerca de 0,2 por cento), bem como, o promotor CUP1 e opromotor TEF2, sendo ainda mais preferidos. Da mesma forma, umnúmero de seqüências de ativação a montante (UASs), tambémdenominado como realçadores, são conhecidos. As seqüências deativação a montante preferidas para expressão em Saccharomycescerevisiae incluem, porém não estão limitadas à, as UASs de genescodificando as seguintes proteínas: PCK1, TPI, TDH3, CYC1,ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 e GAL10, bem como, outrasUASs ativadas pelo produto de gene GAL4, com a UAS de ADH2sendo especificamente preferida. Considerando que, a UAS deADH2 é ativada pelo produto de gene ADR1, é preferível expressarem excesso o gene ADR1 quando um gene heterólogo éoperativamente ligado à UAS de ADH2. As seqüências preferidasde término de transcrição para expressão em Saccharomycescerevisiae incluem as seqüências de término do fator-α, GAPDH1 egenes CYC1.

As seqüências preferidas de controle detranscrição para expressar os genes em levedura metilotróficaincluem as regiões de controle de transcrição dos genes codificandoálcool oxidase e formiato desidrogenase.

As questões de otimização e métodos paraexpressão extracelular dos antígenos pela levedura foramdiscutidos em detalhes aqui anteriormente.

A transfecção de uma molécula de ácidonucléico em uma célula de levedura, de acordo com a presenteinvenção pode ser realizada por qualquer método através do qualuma molécula de ácido nucléico administrada na célula e inclui,porém não está limitada à, difusão, transporte ativo, sonicação embanho, eletroporação, micro-injeção, transfecção de lipossoma,adsorção e fusão de protoplasto. As moléculas de ácido nucléicotransfectadas podem ser integradas em um cromossomo delevedura ou mantidas em vetores extracromossomais usando astécnicas conhecidas para aqueles com habilidade na técnica. Osexemplos de veículos de levedura transportando tais moléculas deácido nucléico são revelados em detalhes no presente. Conformeacima discutido, os preparos de citoplasto de levedura, leveduraseca, e partícula de membrana de leveduras ou parede celulartambém podem ser produzidos de forma recombinante aotransfectar os microorganismos de levedura intactos ouesferoplastos de levedura com as moléculas desejadas de ácidonucléico, produzindo o antígeno no mesmo, e então aindamanipular os microorganismos ou esferoplastos usando as técnicasconhecidas por aqueles com habilidade na técnica para produzir ocitoplasto, levedura seca, ou membrana subcelular do extrato delevedura ou frações das mesmas contendo os antígenos desejados.

As condições efetivas para a produção deveículos de levedura recombinantes e expressão do antígeno peloveículo de levedura incluem um meio efetivo em que uma cepa delevedura pode ser cultivada. Um meio efetivo é tipicamente um meioaquoso compreendendo carboidrato assimilável, nitrogênio e fontesde fosfato, bem como sais, minerais, metais e outros nutrientesapropriados, tais como, vitaminas e fatores de crescimento. O meiopode compreender os nutrientes de complexo ou pode ser um meiomínimo definido. As cepas de levedura da presente invençãopodem ser cultivadas em uma variedade de recipientes, incluindo,porém não limitadas à, biorreatores, frascos de Erlenmeyer, tubosde teste, pratos de micro-titulação, e placas de Petri. A cultivação érealizada em uma temperatura, pH e teor de oxigênio apropriadospara a cepa de levedura. Tais condições de cultivação são bemdentro da perícia daquele com habilidade na técnica (vide, porexemplo, Guthrie e outros (eds.), 1991, Métodos em Enzimologia,vol. 194, Academic Press, ,San Diego).

Em alguns aspectos da invenção, eespecificamente quando for desejado ter a expressão suficiente dasuperfície ou provisão de um antígeno nas configurações em que aindução de uma resposta imune humoral é desejada, as levedurassão cultivadas em um meio mantido em um nível de pH de pelomenos 5.5, isto é, o pH do meio de cultura não é permitido para cairabaixo do pH 5.5. Em outros aspectos, a levedura é cultivada emum nível de pH mantido em cerca de 5.5. Em outros aspectos, alevedura é cultivada em um nível de pH mantido em cerca de 5.6,5.7, 5.8 ou 5.9. Em outro aspecto, a levedura é cultivada em umnível de pH mantido em cerca de 6. Em outro aspecto, a levedura écultivada em um nível de pH mantido em cerca de 6.5. Em outrosaspectos, a levedura é cultivada em um nível de pH mantido emcerca de 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 ou 7.0. Em outrosaspectos, a levedura é cultivada em um nível de pH mantido emcerca de 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, ou 8.0. O nívelde pH é importante na cultivação da levedura. Aquele comhabilidade na técnica apreciará que o processo de cultivação incluinão somente o início da cultura de levedura, porém também amanutenção da cultura. Conforme a cultivação de levedura éconhecida para tornar-se acidífera (isto é, diminuição do pH) com otempo, cuidado deve ser tomado para monitorar o nível de pHdurante o processo de cultivação. As culturas de célula de leveduraem que, o nível de pH do meio cai abaixo de 6 ainda sãocontempladas dentro do escopo da invenção, contanto que o pH domeio seja colocado em pelo menos 5.5 em algum ponto durante oprocesso de cultivação. Como tal, quanto maior o tempo que alevedura for cultivada em um meio que seja pelo menos de pH 5.5ou acima, melhores os resultados serão em termos de obter alevedura com as características desejáveis.

O uso de um pH neutro na cultivação dalevedura promove diversos efeitos biológicos que sãocaracterísticas desejáveis para usar a levedura como veículos paraimunomodulação. Em um aspecto, a cultivação da levedura em pHneutro permite o bom crescimento da levedura sem qualquer efeitonegativo sobre o tempo de geração da célula (p.ex., redução dotempo de duplicação). A levedura pode continuar a crescer em altasdensidades sem perder sua flexibilidade da parede celular. Emoutro aspecto, o uso de um pH neutro permite a produção dalevedura com paredes celulares flexíveis e/ou levedura que sãosensíveis às enzimas digestivas da parede celular (p.ex.,glucanase) em todas as densidades de colheita. Essaparticularidade é desejável, pois a levedura com paredes celularesflexíveis podem exibir respostas imunes exclusivas, tais como, aopromover a secreção de citocinas (p.ex., interferon-y (IFN-γ)) nascélulas que hospedam a levedura. Além disso, a maioracessibilidade aos antígenos localizados na parede celular éproporcionada por tais métodos de cultura. Em outro aspecto, o usodo pH neutro para alguns antígenos, tais como, o antígeno HA deinfluenza, permite a liberação de HA aglutinado de dissulfetoatravés do tratamento com ditiotreitol (DTT) que não é possívelquando a levedura expressando HA é cultivada em meio com pHinferior (p.ex., pH 5). Finalmente, em outro aspecto, as células queproduzem as citocinas de tipo Th1, quando expostas a (p.ex., porfagocitose ou outra carga) levedura cultivada usando asmetodologias de pH neutro, expressam a produção aumentada detais citocinas de tipo Th1, incluindo, porém não limitadas à, IFN-γ,interleucina-12 (IL-12), e IL-2.

Conforme aqui usado, o uso geral do termo"pH neutro" refere-se a uma variação de pH entre cerca de pH 5.5 ecerca de pH 8, preferivelmente entre cerca de pH 6 e cerca 8.Aquele com habilidade na técnica apreciará que as flutuaçõesmenores (p.ex., décimos ou centésimos) podem ocorrer ao medircom um medidor de pH. Como tal, o uso do pH neutro para cultivarcélulas de levedura significa que as células de levedura sãocultivadas em pH neutro para a maioria do tempo em que elas estãoem cultivo.

Em uma configuração da presente invenção,como uma alternativa para expressão de um antígeno de formarecombinante no veículo de levedura, um veículo de levedura écarregado de forma intracelular com a proteína ou antígeno depeptídeo, ou com carboidratos ou outras moléculas que atuamcomo um antígeno. Subseqüentemente, o veículo de levedura, queagora contém o antígeno de forma intracelular, pode seradministrado ao paciente ou carregado em um portador tal comouma célula dendrítica (abaixo descrito). Conforme aqui usado, umpeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido de menos doque ou igual a cerca de 30-50 aminoácidos, enquanto uma proteínacompreende uma seqüência de aminoácido de mais de cerca de30-50 aminoácidos; as proteínas podem ser multiméricas. Aproteína ou peptídeo útil como um antígeno pode ser tão pequenocomo um epítopo de célula T ( isto é, maior do que 5 aminoácidosem comprimento) e qualquer tamanho adequado maior do queaquele que compreende múltiplos epítopos, fragmentos de proteína,proteínas de comprimento total, proteínas quiméricas ou proteínasde fusão. Os peptídeos e proteínas podem ser derivatizados tantonatural ou sinteticamente; tais modificações podem incluir, porémnão estão limitadas à, glicosilação, fosforilação, acetilação,miristilação, prenilação, palmitoilação, amidação e/ou adição deglicerofosfatidil inositol. Os peptídeos e proteínas podem serinseridos diretamente nos veículos de levedura da presenteinvenção através de técnicas conhecidas por aqueles comhabilidade na técnica, tais como, por difusão, transporte ativo, fusãode lipossoma, eletroporação, fagocitose, ciclos de congelamento-descongelamento e sonicação em banho. Os veículos de leveduraque podem ser diretamente carregados com peptídeos, proteínas,carboidratos ou outras moléculas, incluem levedura intacta, bemcomo, esferoplastos, leveduras secas, ou citoplastos, que podemser carregados com antígenos após a produção, porém antes docarregamento nas células dendríticas. Alternativamente, a leveduraintacta pode ser carregada com o antígeno, e então osesferoplastos, leveduras secas, citoplastos ou partículassubcelulares podem ser preparados a partir disso. Qualquer númerode antígenos pode ser carregado em um veículo de levedura nessaconfiguração, de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou qualquer número inteiroaté centenas ou milhares de antígenos, tais como, seria fornecidopelo carregamento de um microorganismo, através docarregamento de uma célula de tumor mamífera, ou porção damesma, por exemplo.

Em outra configuração da presente invenção,um antígeno é fisicamente anexado ao veículo de levedura. Aanexação física do antígeno ao veículo de levedura pode serrealizada por qualquer método adequado na técnica, incluindométodos de associação covalentes e não covalentes que incluem,porém não estão limitadas à, ligação cruzada quimicamente doantígeno à superfície externa do veículo de levedura ou ligaçãobiologicamente do antígeno à superfície externa do veículo delevedura, tal como, ao usar um anticorpo ou outro parceiroaglutinante. A ligação cruzada química pode ser atingida, porexemplo, através de métodos incluindo acoplamento glutaraldeído,marcação de fotoafinidade, tratamento com carbodiimidas,tratamento com produtos químicos capazes de ligar as aglutinaçõesde dissulfeto, e tratamento com outros produtos químicos de ligaçãocruzada padrão na técnica. Alternativamente, um produto químicopode estar em contato com o veículo de levedura que altera a cargada camada dupla de lipídio da membrana de levedura ou acomposição da parede celular, de modo que a superfície externa dalevedura é mais provável para fundir ou aglutinar-se aos antígenoscom características específicas de carga. Os agentes dedirecionamento, tais como, anticorpos, peptídeos aglutinantes,receptores solúveis e outros Iigantes também podem serincorporados em um antígeno como uma proteína de fusão ou, deoutro modo, associados com um antígeno para aglutinação doantígeno ao veículo de levedura.

Em ainda outra configuração, o veículo delevedura e o antígeno são associados a cada outro por ummecanismo aglutinante mais passivo, não-específico ou nãocovalente, tal como, ao misturar gentilmente o veículo de levedura eo antígeno junto em um tampão ou outra formulação adequada(p.ex., mescla).

Em uma configuração da invenção, o veículode levedura e o antígeno são carregados de forma intracelular emum portador, tal como uma célula dendrítica ou macrófago, paraformar a composição terapêutica ou vacina da presente invenção.Alternativamente, um antígeno da invenção (isto é, uma proteína defusão de influenza da invenção) pode ser carregado em uma céluladendrítica na ausência do veículo de levedura.

Diversas formas em que o carregamento deambos os componentes podem ser realizados são discutidas emdetalhes abaixo. Conforme aqui usado, o termo "carregado" ederivativos do mesmo referem-se à inserção, introdução ou entradade um componente (p.ex., o veículo de levedura e/ou antígeno) emuma célula (p.ex., uma célula dendrítica). Para carregar umcomponente de forma intracelular refere-se à inserção ouintrodução do componente a um compartimento intracelular dacélula (p.ex., através da membrana de plasma e, no mínimo, nocitoplasma, um fagossomo, um lisossomo, ou algum espaçointracelular da célula). Para carregar um componente em umacélula, refere-se a qualquer técnica através da qual o componente éforçado para entrar a célula (p.ex., por eletroporação) ou é colocadoem um ambiente (p.ex., em contato com ou próximo a uma célula),em que o componente será substancialmente provável de entrar nacélula através de algum processo (p.ex., fagocitose). As técnicas decarregamento incluem, porém, não estão limitadas à, difusão,transporte ativo, fusão de lipossoma, eletroporação, fagocitose esonicação em banho. Em uma configuração preferida, osmecanismos passivos para carregamento de uma célula dendríticacom o veículo de levedura e/ou antígeno são usados, taismecanismos passivos incluindo a fagocitose do veículo de levedurae/ou antígeno por uma célula dendrítica.

Em uma configuração, a levedura intacta(com ou sem a expressão dos antígenos heterólogos) pode sertriturada ou processada de uma forma para produzir os preparos deparede celular da levedura, partículas de membrana de levedura oufragmentos de levedura (isto é, não intactas) e os fragmentos delevedura podem, em algumas configurações, ser fornecidos com ouadministrados com outras composições que incluem os antígenos(p.ex., vacinas de DNA, vacinas de subunidade de proteína,patógenos neutralizados ou desativados) para otimizar a respostaimune. Por exemplo, o tratamento enzimático, tratamento químicoou força física (p.ex., cisalhamento mecânico ou sonicação) podeser usado para dissolver a levedura em partes que são usadascomo um adjuvante.

Em uma configuração da presente invenção,uma composição ou vacina também pode incluir os compostos demodificador de resposta biológica, ou a capacidade de produzir taismodificadores (isto é, através de transfecção do veículo de leveduracom as moléculas de ácido nucléico codificando tais modificações),embora tais modificações não sejam necessárias para atingir umaresposta imune robusta de acordo com a invenção. Por exemplo,um veículo de levedura pode ser transfectado com ou carregadocom pelo menos um antígeno e pelo menos um composto demodificador de resposta biológica, ou uma vacina ou composição dainvenção pode ser administrada em conjunto com pelo menos ummodificador de resposta biológica. Os modificadores de respostabiológica incluem os compostos que podem modular as respostasimunes, que podem ser denominados como compostosimunomodulatórios. Determinados modificadores de respostabiológica podem estimular uma resposta imune protetora, enquantoque, outras podem suprimir uma resposta imune prejudicial.Determinados modificadores de resposta biológicapreferencialmente otimizam uma resposta imune mediada porcélula, enquanto que outras preferencialmente otimizam umaresposta imune humoral (isto é, pode estimular uma resposta imuneem que existe um nível aumentado de mediada por célulacomparado à imunidade humoral, ou vice-versa.). Existe um númerode técnicas conhecidas por aqueles com habilidade na técnica, paramedir a estimulação ou supressão das respostas imunes, bemcomo para diferenciar as respostas imunes mediadas por célula dasrespostas imunes humorais.

Os modificadores adequados de respostabiológica incluem citocinas, hormônios, derivativos lipídicos,pequenas drogas de molécula e outros moduladores decrescimento, tais como, porém não limitada à, interleucina 2 (IL-2),interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12),fator de crescimento semelhante à insulina interferon gama (IFN-gama) I (IGF-I), transformando esteróides beta fator de crescimento(TGF-β), prostaglandinas e leucotrienos. A capacidade de umveículo de levedura para expressar (isto é, produzir), epossivelmente secretar, IL-2, IL-12 e/ou IFN-gamapreferencialmente aprimora a imunidade mediada por célula,enquanto que, a capacidade de um veículo de levedura paraexpressar, e possivelmente secretar, IL-4, IL-5 e/ou IL-10preferencialmente aprimora a imunidade humoral. Outrosmodificadores adequados de resposta biológica incluem, porém nãoestão limitadas à, anticorpo anti-CTLA-4 (p.ex., para liberar ascélulas T anérgicas); co-estimuladores de célula T (p.ex., anti-CD137, anti-CD28, anti-CD40); alemtuzumab (p.ex., CamPath®),denileukin diftitox (p.ex., ONTAK®), anti-CD4, anti-CD25, anti-PD-1,anti-PD-L1, anti-PD-L2 ou agentes que bloqueiam FOXP3 (p.ex.,para ab-rogar a atividade/neutralizar as células T regulatóriasCD4+/CD25+); Iigante de Flt3, imiquimod (Aldara™), GM-CSF,sargramostim (Leukine®), agonistas de receptor semelhante a sino(TLR)-7, ou agonistas de TLR-9 (p.ex., agentes que aumentam onúmero de, ou aumentam o estado de ativação, das céluladendríticas, macrófagos e outras células apresentando antígenoprofissional). Tais modificadores de resposta biológica são bemconhecidos na técnica e estão publicamente disponíveis.

As composições e vacinas terapêuticas dainvenção podem ainda incluir quaisquer outros compostos que sãoúteis para proteger um indivíduo de uma doença ou condiçãoespecífica, I incluindo uma infecção por um patógeno, ou quaisquercompostos que tratam ou melhoram qualquer sintoma de talinfecção.

Conforme aqui usado, um portador

farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer substância ouveículo adequado para administrar uma vacina de levedura dapresente invenção em um local adequado in vivo ou ex vivo. Talportador pode incluir, porém não está limitado à, um adjuvante, umexcipiente ou qualquer outro tipo de portador ou veículo deliberação.

De acordo com a presente invenção, osadjuvantes são tipicamente substâncias que geralmente aprimorama resposta imune de um animal para um antígeno específico. Osadjuvantes adequados incluem, porém não estão limitados à,adjuvante de Freund; outros componentes de parede celularbacterianos; sais com base em alumínio; sais com base em cálcio;sílica; polinucleotídeos; toxóides; proteínas séricas; proteínas derevestimento viral; outros preparos derivados bacterianos; interferongama; adjuvantes de copolímero de bloco, tais como, adjuvanteHunter1S Titermax (CytRx™, Inc. Norcross, GA); adjuvantes Ribi(disponíveis da Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); esaponinas e seus derivativos, tais como Quil A (disponíveis daSuperfos Biosector A/S, Dinamarca). Os adjuvantes não sãoexigidos na vacina de levedura da presente invenção, porém seuuso não é excluído.

Os portadores são tipicamente compostosque aumentam a meia-vida de uma composição terapêutica noanimal tratado. Os portadores adequados incluem, porém não estãolimitados à, formulações de liberação controlada poliméricas,implantes biodegradáveis, lipossomas, óleos, ésteres e glicóis.

As composições e vacinas da presenteinvenção também podem conter um ou mais excipientesfarmaceuticamente aceitáveis. Conforme aqui usado, um excipientefarmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer substânciaadequada para liberar uma composição útil em um método dapresente invenção em um local adequado in vivo ou ex vivo. Osexcipientes farmaceuticamente aceitáveis preferidos são capazesde manter uma composição (p.ex., um veículo de levedura ou céluladendrítica compreendendo o veículo de levedura) em uma formaque, mediante a chegada da composição em uma célula, tecido oulocal alvo no corpo, a composição é capaz de extrair uma respostaimune no local alvo (observando-se que o local alvo pode sersistêmico). Os excipientes adequados da presente invençãoincluem os excipientes ou formulários que transportam, porém nãoespecificamente direcionam a vacina a um lugar (também aquidenominado como portadores não-direcionadores). Os exemplosdos excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém, nãoestão limitados à, água, salina, salina tampão fosfatada, solução deRinger, solução de dextrose, soluções contendo soro, solução deHank, outras soluções aquosas fisiologicamente balanceadas,óleos, ésteres e glicóis. Os portadores aquosos podem contersubstâncias adequadas auxiliares para aproximar as condiçõesfisiológicas do destinatário, por exemplo, ao aprimorar aestabilidade química e isotonicidade. As substâncias auxiliarestambém podem incluir conservantes. Os estabilizadores, tais como,trealose, glicina, sorbitol, Iactose ou glutamato monossódico (MSG),podem ser adicionadas para estabilizar a formulação de vacinacontra uma variedade de condições, tais como, variações detemperatura ou um processo de congelamento-secagem. Ascomposições também podem incluir um fluido de suspensão, talcomo, água estéril ou salina (preferivelmente tampão).

Os veículos de levedura podem serformulados em composições da presente invenção, incluindopreparos a serem administrados à um paciente diretamente ouprimeiro carregados em um portador, tal como, uma céluladendrítica, usando um número de técnicas conhecidas para aquelescom habilidade na técnica. Por exemplo, os veículos de levedurapodem ser secados por liofilização, que é uma configuraçãopreferida.

Antes da administração ou carregamento emuma célula dendrítica, ou outro tipo de administração com umantígeno, os veículos de levedura também podem ser misturadoscom um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, asformulações podem ser novamente suspensas ou diluídas em umdiluente adequado, tal como, água estéril, salina, salina tampãoisotônica (p.ex., tampão fosfatado para pH fisiológico), ou outrodiluente adequado. A liofilização (congelamento-secagem) é umaopção favorecida. As formulações compreendendo os veículos delevedura também podem ser preparadas ao empacotar a leveduraem um bolo ou bloco, conforme é feito para a levedura usada nasoperações de cozimento ou fermentação.

Kits da Invenção

A invenção contempla kits compreendendoqualquer uma ou mais das vacinas da invenção, e/ou qualquer umou mais dos Tarmogens ou veículos de levedura da invenção,sozinho ou em combinação com os antígenos e preparos deantígeno aqui descritos. Está incluída nos kits da invenção estãoqualquer combinação de antígenos intracelular e extracelular parauso em qualquer tipo de vacina e, especificamente, em um veículode vacina com base em levedura ou estratégia de vacina dainvenção. Por exemplo, quaisquer das proteínas de fusão aquidescritas, ou preparações de proteína que fornecem antígenosintracelulares e extracelulares conforme aqui descritos podem serfornecidos no kit. Os antígenos podem ser fornecidos em qualquerforma, incluindo expressos ou, de outro modo, fornecidos com umveículo de levedura (como um Tarmogen), em uma vacina de DNA,como um preparo de proteína, incluindo uma preparação deproteína de fusão, ou como um patógeno neutralizado oudesativado. Qualquer forma adequada de antígenos está abrangida.Também estão incluídos o antígeno múltiplo ou preparações deantígeno, caracterizado pelo fato de que, cada antígeno éexpressado por, ou, de outro modo fornecido (p.ex., em complexocom) um diferente veículo de levedura. Por exemplo, cada veículode levedura pode expressar ou, de outro modo, fornecer umdiferente antígeno a partir de um patógeno específico, de modo queuma pessoa pode selecionar uma combinação preferida deantígenos (p.ex., conservados ou internos e/ou variáveis ouexternos) e uma estratégia preferida de vacina (p.ex., preparar comantígenos conservados ou internos e impulsionar com antígenosvariáveis ou externos) para administração em um indivíduo oupopulação de indivíduos. Em um aspecto, esse kit podeadicionalmente incluir os preparos de antígeno a serem usados emuma estratégia de vacina de preparação ou estimulação, sozinho ouem combinação com um Tarmogen incluído no kit (a seradministrado simultânea ou seqüencialmente, em estratégias depreparação/estimulação e semelhantes, conforme aqui descrito). Oskits também podem incluir os veículos de levedura que nãoexpressam ou fornecem antígenos, para uso como um adjuvanteconforme aqui descrito. Um conjunto de instruções para uso podeser incluído com qualquer kit da invenção. Os reagentes de culturapara os veículos de levedura também podem ser incluídos. Ascélulas de levedura podem ser congeladas para iniciar uma cultura,ou anteriormente cultivadas para antígenos expressos, e entãocongelados para empacotar como parte do kit, ou fornecidasliofilizadas.

Métodos da Invenção

Uma configuração da presente invençãorefere-se a um método para extrair uma resposta imune, incluindouma resposta imune mediada por célula, uma resposta imunehumoral, e/ou combinações das mesmas. Outra configuração dainvenção refere-se a um método para proteger um animal contrauma condição ou doença (incluindo prevenção e/ou tratamentoterapêutico da condição ou doença), incluindo uma infecção por umpatógeno (p.ex., infecção por um vírus de influenza) ou uma doençaresultante do mesmo. O método inclui a etapa para administrar emum animal que possui ou está ao risco de desenvolver a doença oucondição (incluindo infecção de patógeno), uma vacina oucomposição da presente invenção conforme aqui descrito, parareduzir ou prevenir a doença ou condição, incluindo prevenção dainfecção ou redução em pelo menos um sintoma resultante dainfecção no animal. O método da presente invençãopreferencialmente extrai uma resposta imune específica deantígeno mediada por célula contra pelo menos um antígeno em umanimal, pelo menos na primeira administração de uma vacinacompreendendo o antígeno em um indivíduo. As estratégiasdetalhadas para adaptar uma resposta imune para um patógeno oudoença específica, e o status imune de um indivíduo a quem avacina deve ser administrada foram acima descritos e são aquiexemplificados. Aquele com habilidade na técnica será prontamentecapaz de usar as diferentes combinações de antígenos, tipos deexpressão ou provisão de antígenos, composições de vacina, eprotocolos de vacina conforme aqui descrito, para atingir a respostaimune desejada.

Nas configurações acima, a vacina oucomposição inclui: (a) um primeiro veículo de levedura; e (b)qualquer um ou mais antígenos aqui descritos (expressados por,transportados por, complexados com, associado a, secretados pore/ou misturados com o veículo de levedura). A vacina pode incluiros veículos adicionais de levedura que expressam, transportam,secretam ou são misturados, associados ou complexados comdiferentes antígenos conforme acima descrito. As combinaçõespreferidas dos antígenos a serem expressas por, transportadas por,secretadas por, ou misturadas, associadas ou complexadas comum veículo de levedura da invenção, e as combinações preferidasdos veículos de levedura a serem combinadas ou administradasseqüencialmente, foram descritas em detalhes acima.

Em uma configuração, a vacina inclui pelomenos um antígeno que é expressado ou fornecido de formaintracelular pela levedura. Em uma configuração, a vacina incluipelo menos um antígeno que é expressado ou fornecido de formaintracelular pela levedura e pelo menos um antígeno que éexpressado ou fornecido de forma intracelular pela levedura. Em umaspecto dessa configuração, os antígenos intracelulares eextracelulares são o mesmo antígeno, e em outro aspecto, eles sãodiferentes antígenos. Em uma configuração, os antígenosexpressados ou fornecidos de forma intracelular pela leveduraincluem pelo menos um antígeno que é um antígeno conservado ouque é expressado internamente por um patógeno. Em umaconfiguração, os antígenos expressados ou fornecidos de formaextracelular pela levedura incluem pelo menos um antígeno que éum antígeno variável ou que é expressado externamente (nasuperfície) por um patógeno. Em outra configuração, tais antígenosvariáveis ou externos também são expressos ou fornecidos deforma intracelular pela levedura.

Em uma configuração da invenção, a vacinainclui pelo menos um antígeno que é expressado ou fornecido deforma intracelular pela levedura e pelo menos um antígeno que éexpressado ou fornecido de forma extracelular pela levedura, e avacina é usada para preparar o sistema imune contra o(s)antígeno(s). Ao preparar significa que a vacina é a primeiraadministração da vacina em um indivíduo, de modo que o indivíduonão foi anteriormente imunizado usando o antígeno ou acombinação de antígeno. Dessa forma, o sistema imune é"preparado" para responder mais rápida e eficientemente paraencontros subseqüentes com o antígeno (p.ex., através de vacinasde estimulação ou por encontro com o antígeno natural, porexemplo, como resultado da infecção com o patógeno).

Em uma configuração, a vacina inclui pelomenos um antígeno que é expressado ou fornecido de formaintracelular pela levedura, ou pelo menos um antígeno que éexpressado ou fornecido de forma extracelular pela levedura, ouambos o(s) antígeno(s) que é(são) expressado(s) ou fornecido(s) deforma intracelular pela levedura e (uns) antígeno(s) que é (são)expressados ou fornecido(s) de forma extracelular pela levedura, ea vacina é administrada como uma vacina de estimulação (isto é,subseqüente a uma imunização de preparação inicial da primeiraimunização com o antígeno ou antígenos).

Em uma configuração, a expressão de umúnico antígeno pode ser desejável nos casos em que o antígeno éaltamente conservado e não provável para sofrer mutações. Emoutras configurações, a expressão ou provisão de múltiplosantígenos é desejável para respostas protetoras cruzadas de umescopo mais amplo do que atingível ao direcionar um únicoantígeno. Tais respostas protetores cruzadas são úteis para ageração de vacinas universais, que podem ser combinadas comvacinas de geração de anticorpo, conforme acima discutido, parafornecer um amplo espectro das respostas imunes protetoras. Odirecionamento de antígenos universais pode ser aplicado em umregime de economia de dose devido ao mecanismo de proteção serdiferente do que aquele sendo obtido com as vacinas que geramanticorpo.

Em outras configurações, a vacina deestimulação é de um tipo diferente (p.ex., uma vacina com base emnão-levedura (p.ex., subunidade de proteína, DNA, patógenoneutralizado/desativado) ou uma vacina com base em levedura queusa um tipo diferente de veículo de levedura, tal como, partículas demembrana de levedura ou parede celular ou levedura que sãousadas como um adjuvante com a proteína, DNA ou vacinas depatógeno desativado/neutralizado. Mais especificamente, em umaconfiguração da presente invenção, a vacina ou composição dainvenção conforme aqui descrita pode ser administrada em umprotocolo que inclui a administração de uma ou mais vacinas oucomposições de imunoterapia, incluindo qualquer vacinaconvencional com base em não-levedura ou composição. Porexemplo, tais outras vacinas ou composições de imunoterapiapodem incluir qualquer outra composição contendo antígeno,codificando antígeno ou expressando antígeno, tais como, umavacina de DNA1 vacina de patógeno neutralizado ou desativado ouuma vacina de subunidade de proteína (p.ex., um preparo deantígeno purificado). A vacina com base em levedura da invenção épreferivelmente usada para preparar uma resposta imune específicade antígeno, incluindo pelo menos uma forte mediada por célula, eem uma configuração, tanto uma resposta imune mediada porcélula quanto uma humoral, e a vacina com base em não leveduraou forma alternada da vacina com base em levedura épreferivelmente usada para estimular a resposta imune (mediadapor célula e/ou humoral). Alternativamente, podem existir casos emque a vacina com base em levedura da presente invenção éadministrada para estimular a resposta imune de um indivíduo a umantígeno ou antígenos que foram administrados anteriormente emuma vacina de levedura sem base.

Em um aspecto, a levedura que nãoexpressa ou, de outro modo, contém ou fornece os antígenosheterólogos pode ser usada como um adjuvante em conjunção comum ou mais antígenos de interesse. Em uma configuração, alevedura que não expressa ou, de outro modo, contém ou fornece oantígeno heterólogo é usada contemporaneamente com as vacinascom base em não levedura (p.ex., vacinas de DNA) para aprimorara resposta imune da vacina de DNA. Em uma alternativa, alevedura expressando ou fornecendo os antígenos heterólogos(seja na superfície ou internamente, ou ambos) é usada emconjunto com outros tipos de vacinas para aprimorar a respostaimune. Em outra alternativa, a levedura que não expressa ou, deoutro modo, contém ou fornece o antígeno heterólogo éadministrada em um indivíduo sozinha (isto é, o antígeno exógenonão é administrado). Nesse aspecto da invenção, o indivíduo jácarrega o antígeno em quantidades suficientes para obter umaresposta imune mediante a administração do veículo de leveduranão transportando o antígeno, tal como um indivíduo que estáatualmente infectado com um patógeno, um indivíduo que tenhasofrido uma mutação em uma proteína celular ou, de outro modo,expressa ou transporta um antígeno ao qual o sistema imune nãoseja tolerante ou contra o qual a tolerância pode ser quebrada.

Não é necessário que os antígenosheterólogos no veículo de levedura sejam idênticos ao antígenousado na vacina com base em não levedura, com a finalidadedeobter uma resposta imune protetora. A seleção de antígenospode ser tal que dois antígenos compartilham similaridade deseqüência, possuem epítopos compartilhados, ou podem serdiferentes antígenos em um patógeno alvo. Em um aspecto, osantígenos são selecionados para a vacina com base em levedura ecom base em não-levedura para obter respostas imunessuplementares ou complementares. Isso é obviamente preferívelem uma situação em que a resposta imune ao antígeno heterólogodo veículo de levedura seja antagonística à resposta imune doantígeno na vacina com base em não levedura.

O método para uso da composiçãoterapêutica ou vacina da presente invenção preferível mente obtémuma resposta imune em um animal, de modo que o animal sejaprotegido da doença ou condição (incluindo infecção), ou desintomas resultantes da doença ou condição (incluindo infecção).Conforme aqui usado, a expressão "protegido de uma doença"refere-se à redução dos sintomas da doença; reduzindo aocorrência da doença, e/ou reduzindo da gravidade da doença. Aproteção de um animal pode referir-se à capacidade de umacomposição da presente invenção, quando administrada em umanimal, de evitar a ocorrência de uma doença e/ou para curar oualiviar os sintomas, sinais ou motivos da doença. Como tal, paraproteger um animal de uma doença inclui a prevenção daocorrência de doença (tratamento profilático ou vacina profilática) etratamento de um animal que possui uma doença ou que estásofrendo os sintomas iniciais de uma doença (tratamentoterapêutico ou uma vacina terapêutica). Especificamente, aproteção de um animal de uma doença é realizada ao obter umaresposta imune no animal ao induzir uma resposta imune benéficaou protetora que pode, em algumas instâncias adicionalmentesuprimir (p.ex., reduzir, inibir ou bloquear) uma resposta imunedemasiadamente ativa ou prejudicial. O termo "doença" refere-se aqualquer desvio da saúde normal de um animal e inclui um estadoem que os sintomas da doença estão presentes, bem como, ascondições em que um desvio (p.ex., infecção) ocorreu, porém ossintomas ainda não se manifestaram.

Em uma configuração, quaisquer das vacinasda presente invenção são administradas em um indivíduo, ou àuma população de indivíduos, que foram infectados, com umpatógeno, tal como um vírus de influenza. Em outra configuração,quaisquer das vacinas da presente invenção são administradas emum indivíduo, ou à uma população de indivíduos, que está no riscode ser infectada com tal patógeno. Tais indivíduos podem incluir aspopulações identificadas como os riscos mais altos para infecção deinfluenza do que, por exemplo, a população normal ou total dosindivíduos. Tais indivíduos também podem incluir as populaçõesque são selecionadas para uma vacina específica da presenteinvenção devido às cepas esperadas de patógeno (p.ex., cepasvirais) na localização geográfica da população. Tais populaçõespodem ser definidas por qualquer parâmetro adequado. Em outraconfiguração, quaisquer das vacinas da presente invenção sãoadministradas em qualquer indivíduo, ou a qualquer população deindivíduos, independentemente de seu status conhecido ouprognosticado de infecção ou suscetibilidade de ficar infectado comum patógeno específico.

Mais especificamente, uma vacina conformeaqui descrita, quando administrada em um animal pelo método dapresente invenção, preferivelmente produz um resultado que podeincluir o alívio da infecção de patógeno (p.ex., redução de pelomenos um sintoma ou manifestação clínica da infecção), eliminaçãoda infecção ou redução no tempo para eliminar a infecção,prevenção da infecção e/ou sintomas com relação a isso, eestimulação da imunidade da célula de executor contra a infecção,bem como, a imunidade humoral. Além disso, a vacinapreferivelmente prepara o sistema imune para evitar ou reduzir todaa infecção pelo patógeno, incluindo todas as formas, cepas oumutantes de ciclo de vida do patógeno, sejam livres na circulaçãoou nas células ou tecidos de um indivíduo. A vacina tambémpreferivelmente confere a imunidade com longa duração contra opatógeno, ou pelo menos uma unidade universal ou protetoracruzada, de modo que as infecções futuras por novas cepas oumutantes sejam prontamente prevenidas e/ou eliminadas.

A presente invenção inclui a administraçãode uma composição ou vacina da invenção em um animal. Oprocesso de administração pode ser realizado ex vivo ou in vivo.Através da administração ex vivo, refere-se à realização de parte daetapa regulatória fora do paciente, tal como administração de umacomposição da presente invenção em uma população de células(célula dendríticas) removidas de um paciente sob condições demodo que um veículo de levedura e antígeno sejam carregados nacélula, e retornando as células ao paciente. A composiçãoterapêutica da presente invenção pode ser retornada a um paciente,ou administrada em um paciente, por qualquer modo adequado deadministração.

A administração de uma vacina oucomposição, sozinha ou em combinação com um portador deacordo com a presente invenção, é tipicamente sistêmica ou damucosa. As vias preferidas de administração serão aparentes paraaqueles com habilidade na técnica. Os métodos preferidos deadministração incluem, porém não estão limitadas à, administraçãointravenosa, administração intraperitoneal, administraçãointramuscular, administração intranodal, administraçãointracoronária, administração intra-arterial (p.ex., em uma artériacarótida), administração subcutânea, administração transdérmica,administração intratraqueal, administração subcutânea,administração intra-articular, administração intraventricular, inalação(p.ex., aerossol), administração intracraniana, intra-espinhal, intra-ocular, aural, intra-nasal, oral, administração pulmonar,impregnação de um cateter e injeção direta em um tecido.

As vias especificamente preferidas deadministração incluem: intravenosa, intraperitoneal, subcutânea,intradérmica, intranodal, intramuscular, transdérmica, inalada, intra-nasal, oral, intra-ocular, intra-articular, intracraniana, e intra-espinhal. A administração parenteral pode incluir via intradérmica,intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar,intravenosa, subcutânea, cateter atrial e cateter venal. Aadministração aural pode incluir gotas auriculares, administraçãointra-nasal pode incluir gotas nasais ou injeção intra-nasal, e aadministração intra-ocular pode incluir as gotas oculares. Aadministração por aerossol (inalação) também pode ser realizadausando os métodos padrão na técnica (vide, por exemplo, Striblinge outros, Cient. Acad. Nac. Proc. EUA 189:11277-11281, 1992, queé aqui incorporado por referência em sua totalidade). Por exemplo,em uma configuração, uma composição ou vacina da invençãopode ser formulada em uma composição adequada paraadministração nebulizada usando um nebulizador ou dispositivoadequado de inalação. A administração oral pode incluir os sólidose os líquidos que podem ser ingeridos através da boca, e é útil nodesenvolvimento de imunidade da mucosa e, considerando que, ascomposições compreendendo os veículos de levedura podem serfacilmente preparadas para administração oral, por exemplo, comocomprimidos ou cápsulas, bem como, sendo formuladas emprodutos de bebidas e alimentos.

As outras vias de administração quemodulam a imunidade da mucosa são especificamente úteis notratamento de infecções virais e infecções por outros patógenos.Tais vias incluem a via bronquial, intradérmica, intramuscular, intra-nasal, outra inalatória, retal, subcutânea, tópica, transdérmica,vaginal e uretral.Em uma configuração de quaisquer dosmétodos acima identificados, a vacina é administrada ao tratorespiratório. Em outra configuração, a vacina é administrada poruma via parenteral de administração. Em ainda outra configuração,a vacina ainda compreende as células dendríticas ou macrófagos,em que um veículo ou veículos de levedura (referindo-se àscombinações preferidas acima descritas) expressando a(s)proteína(s) de fusão é(são) administrado(s) às célula dendríticas oumacrófagos ex vivo e em que a célula dendrítica ou macrófagocontendo o(s) veículo(s) de levedura expressando o(s) antígeno(s)é(são) administrado(s) ao animal. Em um aspecto dessaconfiguração, a célula dendrítica ou o veículo de levedura foiadicionalmente carregado com sem antígeno. Em um aspecto, umavacina com base em levedura é administrada no mesmo local emum indivíduo conforme outra vacina com base em levedura ou umavacina com base em não-levedura. Em outro aspecto, uma vacinacom base em levedura é administrada em um local diferente em umindivíduo como outra vacina com base em levedura ou uma vacinacom base em não-levedura. Em um aspecto, a vacina éadministrada como uma vacina terapêutica. Em outro aspecto, avacina é administrada como uma vacina profilática.

De acordo com a presente invenção, umprotocolo efetivo de administração (., isto é, administração de umavacina ou composição terapêutica de uma forma eficaz)compreende os parâmetros adequados de dose e modos deadministração que resultam na indução de uma resposta imune emum animal que possui uma doença ou condição, ou que está norisco de contrair uma doença ou condição, preferivelmente de modoque o animal esteja protegido da doença. Os parâmetros eficazesde dose podem ser determinados usando os métodos padrão natécnica para uma doença específica. Tais métodos incluem, porexemplo, determinação das taxas de sobrevivência, efeitoscolaterais (i.e., toxicidade) e progressão ou regressão da doença.

Em conformidade com a presente invenção,um tamanho adequado de dose única é uma dose que é capaz deinduzir uma resposta imune específica de antígeno em um animalquando administrada uma ou mais vezes em um período adequadode tempo. As doses podem variar dependendo da doença oucondição sendo tratada. Por exemplo, em uma configuração, umaúnica dose de um veículo de levedura da presente invenção é decerca de 1 χ 105 para cerca de 5 χ 107 de equivalentes da célula delevedura por peso corporal de quilograma do organismo sendoadministrado a composição. Em uma configuração preferida, ascélulas de levedura, por dose, não são ajustadas por peso doorganismo. Nessa configuração, uma única dose de um veículo delevedura da presente invenção é de cerca de 1 χ 104 a cerca de 1 χ109 de células de levedura, por dose. A quantia do veículo delevedura que é usada em uma única dose pode ser entre cerca de0.0001 unidades de levedura (YU) para cerca de 10.000 YU (1 YU =107 de levedura). Em uma configuração, a quantia do veículo delevedura usado é cerca de 0,001 YU a cerca de 1000 YU. Emoutras configurações, a quantia do veículo de levedura usada écerca de 0.1 YU a cerca de 100 YU. Em outras configurações, aquantia do veículo de levedura usado é cerca de 0,1 YU a cerca de10 YU. Em uma configuração, uma única dose de um veículo delevedura da presente invenção é de cerca de 0,1 YU (1 χ 106 decélulas) a cerca de 100 YU (1 χ 109 de células) por dose (isto é, pororganismo), incluindo qualquer dose interina, em incrementos de0,1 χ 106 de células (isto é, 1.1 χ 10®, 1.2 χ 1061 1.3 χ 106...). Essavariação de doses pode ser efetivamente usada em qualquerorganismo de qualquer tamanho, incluindo camundongos, macacos,humanos, etc.

Quando a vacina é administrada através decarregamento do veículo de levedura e antígeno nas célulasdendríticas, uma única dose preferida de uma vacina da presenteinvenção é de cerca de 0.5 χ 106 a cerca de 40 χ 106 de céluladendríticas por indivíduo por administração. Preferivelmente, umaúnica dose é de cerca de 1 χ 106 a cerca de 20 χ 106 céluladendríticas, por indivíduo, e mais preferivelmente de cerca de 1 χ106 a cerca de 10 χ 106 de células dendríticas, por indivíduo.

Os "Estimuladores" ou "estimulações" deuma composição terapêutica são preferivelmente administradosquando a resposta imune contra o antígeno foi enfraquecida ounecessária para fornecer uma resposta imune ou induzir umaresposta de memória contra um antígeno ou antígeno(s)específico(s). Os estimuladores podem ser administrados em cercade 2 semanas para diversos anos após a administração original. Emuma configuração, um cronograma de administração é um em quecerca de 1 χ 105 a cerca de 5 χ 107 dos equivalentes de célula delevedura de uma composição por peso corporal em kg doorganismo é administrado de cerca de uma a cerca de 4 vezes emum período de tempo de cerca de 1 mês à cerca de 6 meses.

Em uma configuração da presente invenção,uma primeira vacina, compreendendo uma dose do veículo delevedura ou veículos e um ou mais antígenos conforme descrito emdetalhes acima, e em um aspecto, preferivelmente compreendendouma dose do veículo de levedura ou veículos e um ou maisantígenos intracelulares, sozinhos ou em combinação com um oumais antígenos extracelulares, é administrado em um indivíduo oupopulação de indivíduos. No caso da influenza, a vacinapreferivelmente compreende pelo menos um ou mais antígenosinternos de influenza. Essa vacina pode ser administrada emqualquer base de período adequada ao(s) indivíduo(s) conformenecessário para manter ou induzir a imunidade mediada por célulacontra os antígenos e, quando um antígeno é extracelular, paramanter ou induzir a imunidade humoral contra os antígenos. Nocaso de um patógeno, tal como influenza, a vacina preferivelmentemantém ou induz pelo menos a imunidade mediada por célulacontra uma ou mais cepas virais de influenza. Por exemplo, avacina pode ser administrada com estimuladores, ou com baseanual ou bianual, a cada diversos anos, ou como de outro modonecessário. Conforme acima discutido, essa configuração dainvenção pode ser usada como uma vacina universal, protetoracruzada e pode fornecer imunidade com longa duração contradiversos tipos de infecções de patógeno do que as vacinasconvencionais.

Em uma configuração adicional, umasegunda vacina, compreendendo uma dose do veículo de leveduraou veículos e um ou mais antígenos (o mesmo ou diferente do queé incluído na primeira vacina acima), e preferivelmentecompreendendo uma dose do veículo de levedura ou veículos e umou mais antígenos extracelulares sozinhos ou junto com um ou maisantígenos intracelulares, é administrada ao mesmo indivíduo oupopulação de indivíduos conforme recebida a primeira vacinaacima. Essa segunda vacina pode ser administrada junto com aprimeira vacina (p.ex., como uma única vacina compreendendo umacombinação de diferentes veículos de levedura) ou separadamenteda primeira vacina. No último cenário, a segunda vacina pode seradministrada seqüencialmente com, porém contemporaneamentecom, a primeira vacina (p.ex., no caso da administração separadapor segundos, minutos ou horas) ou em um cronograma diferenteao da a primeira vacina, com a finalidade de manipular a respostaimune induzida por diversas vacinas. Por exemplo, a primeiravacina poderia ser administrada uma vez ao ano ou em incrementosmais longos, se possível, com o objetivo de induzir uma respostaimune universal, protetora cruzada mediada por célula e, seaplicável, com base no projeto de vacina, uma resposta imunehumoral. A segunda vacina também poderia ser administrada umavez ao ano ou conforme necessário (isto é, com base em uma vez,mais do que uma vez ao ano, ou conforme relevante, umaestratégia de imunização) para tempestivamente imunizar umapopulação contra a(s) cepa(s) mais prevalecente(s) de patógeno napopulação naquele momento, ou conforme necessário paracontrolar ou prevenir uma epidemia ou pandemia de infecção pelopatógeno. Essa estratégia, conforme se aplica às vacinas deinfluenza, é descrita especificamente em detalhes no presente,porém a invenção não é limitada às vacinas de influenza. Conformeacima discutido, a estratégia de vacina da presente invenção podeser projetada para fornecer a imunidade protetora cruzada eespecífica de mutante/cepa de patógeno, incluindo tanto imunidademediada por célula quanto humoral, que é acreditado para forneceruma imunização mais flexível e eficaz contra os patógenos queforam anteriormente descritos. Essa estratégia é prontamenteadaptada para antígenos celulares, tais como antígenos expressospor células de tumor, por exemplo.No método da presente invenção, as vacinase composições terapêuticas podem ser administradas ao animal(sujeito, indivíduo, paciente), incluindo qualquer vertebrado, eespecificamente qualquer membro da classe de Vertebrados,Mamíferos, incluindo, sem limitação, primatas, roedores, animaisde criação/gado e animais domésticos. Os animais de criação/gadoincluem mamíferos a serem consumidos ou que produzem produtosúteis (p.ex., carneiro para produção de lã). Os mamíferos preferidospara proteger incluem humanos, cães, gatos, camundongos, ratos,cabras, carneiro, gados, cavalos e porcos, com ser humanoespecificamente preferidos.

Primeiro e Segundo Usos Médicos

A invenção também contempla o uso dequaisquer dos veículos de levedura expressando ou fornecendoo(s) antígeno(s) extracelular(es) e/ou intracelular(es) (Tarmogens),combinações de antígenos extracelulares e intracelulares, proteínasde fusão, veículos de levedura como adjuvantes, e/ou preparos deantígeno aqui descritos, e/ou quaisquer combinações dos mesmospara o preparo de uma formulação ou medicamento para qualqueruso e, especificamente, para o tratamento ou prevenção de umadoença ou condição, incluindo infecção por um patógeno, câncer,doença autoimune, etc. As formulações ou medicamentos podemser formulados para qualquer tipo de administração, incluindocombinações de vias de administração (p.ex., intra-nasal e/ouparenteral). As formulações ou medicamentos podem serpreparados para qualquer tipo de protocolo de administraçãoconforme aqui descrito. Em um aspecto, as formulações oumedicamentos são para induzir uma resposta imune específica deantígeno (mediada por célula e/ou humoral), para proteger umanimal contra infecção de influenza, para tratar ou prevenir umadoença ou condição, para imunizar uma população de indivíduos norisco de tornar-se infectada com um patógeno, tal como vírus deinfluenza, para tratar uma população de indivíduos que estáinfectada com um patógeno, tal como vírus de influenza, ou paraproteger um animal contra infecção de patógeno, incluindo vírus deinfluenza.

Composições de Influenza e Vacinas

Diversos aspectos da invenção conformedirecionada a qualquer antígeno e descritos acima serão ilustradose exemplificados por uma discussão detalhada da aplicação dosconceitos e configurações da invenção ao vírus de influenza ecomposição e métodos para induzir uma resposta imune contra ovírus de influenza. A invenção não é limitada ao vírus de influenzacomo um antígeno ou fonte de antígenos.

Os presentes inventores desenvolveram asvacinas com base em levedura e métodos para uso da.mesma quecompreende os veículos de levedura e uma ou mais proteínas defusão do vírus de influenza. Tais veículos de levedura queexpressam ou são de, outro modo, complexados com um ou maisantígenos de influenza podem ser usados sozinhos ou combinadoscom um ou mais veículos adicionais de levedura que expressam ousão de, outro modo, complexados com uma ou mais proteínasadicionais de fusão do vírus de influenza, ou o veículo de levedurapode ser combinado com outras formas de antígeno de influenza,incluindo qualquer vacina com base em não-levedura (p.ex., vacinade DNA, vacina de subunidade de proteína, ou vírus de influenzaneutralizado ou desativado).

Em uma configuração, a vacina inclui umveículo de levedura que expressa ou fornece um ou mais antígenosinternos de influenza selecionados a partir da proteína de matriz(M1), antígeno de canal de íon (M2), antígeno de nucleocapsídeo(NP), antígeno de polimerase PB1 (PB1), antígeno de polimerase(PB2), e antígeno de polimerase PA (PA). Em outra configuração, avacina inclui um veículo de levedura que expressa um ou maisantígenos externos de influenza selecionados a partir dos antígenosde hemaglutinina (HA) (qualquer um ou mais subtipos) e antígenosde neuraminidase (NA) (qualquer um ou mais subtipos). Osantígenos internos são tipicamente expressos de forma intracelularpela levedura. Os antígenos externos de influenza são tipicamenteexpressos ou fornecidos na superfície da levedura (antígenosextracelulares) e também podem ser expressos ou fornecidos deforma intracelular pela levedura. Em algumas configurações, ambosos tipos de provisão do(s) antígeno(s) (intracelular e extracelular)são preferidos. Em uma configuração especificamente preferida,a(s) proteína(s) externa(s) de influenza é(são) selecionada(s) pararepresentar o tipo ou grupos de vírus circulando de forma maisproeminentemente entre as espécies de animal (p.ex., humanos)em determinado período de tempo (p.ex., em um ano), ou é(são)selecionada(s) para responder uma erupção potencial, suspeitadaou antecipada de influenza de um tipo específico, incluindo umaepidemia ou pandemia de influenza.

As configurações preferidas adicionais eespecificamente da invenção referem-se às vacinas que tiramvantagem da combinação do uso de ambos os antígenos deinfluenza internos e externos. Nessa configuração, a vacina incluium veículo de levedura que expressa ou fornece pelo menos umantígeno interno de influenza selecionado a partir da proteína dematriz (M1), de canal de íon (M2), antígeno de nucleocapsídeo (NP)antígeno de polimerase PB1 (PB1), antígeno de polimerase (PB2) eantígeno de polimerase PA (PA). O uso de combinações dessasproteínas também é abrangido pela presente invenção. O antígenointerno de influenza é preferivelmente expressado de formaintracelular pela levedura, embora o antígeno também pode serfornecido de forma extracelular. A vacina também inclui a expressãoou provisão por um veículo de levedura de pelo menos um antígenoexterno de influenza selecionado a partir dos antígenos dehemaglutinina (HA) (qualquer um ou mais subtipos) e antígenos deneuraminidase (NA) (qualquer um ou mais subtipos). Os antígenosexternos de influenza são expressos ou fornecidos na superfície dalevedura (extracelular) e também podem ser expressados oufornecidos de forma intracelular pela levedura. Em algumasconfigurações, ambos os tipos de expressão ou provisão deantígeno são preferidos para os antígenos externos de influenza.

As seqüências de ácido nucléico eaminoácido para proteínas de diversas cepas de vírus de influenzasão conhecidas. Por exemplo, as seqüências para H1N1 da cepado vírus de influenza A/PR/8/34 são publicadas conforme os N0S deAcessão de Banco de Dados de NCBI M38279 (seqüência denucleotídeo no presente como SEQ ID N0: 29, que codifica a SEQID N°:30) e NC_002019 (seqüência de nucleotídeo aquirepresentada como SEQ ID N°:31, que codifica a SEQ ID N°:32). Asseqüências para cepa de influenza aviária A/Vietnã/1203/04, porexemplo, também são conhecidas. Por exemplo, o nucleotídeocodificando H5N1 de A/Vietnã/1203/04 (p.exN0 de Acessão deBanco de Dados de NCBI AY818135) é aqui representado comoSEQ ID N°:33, que codifica a SEQ ID N°:34. Será entendido que,embora as seqüências específicas aqui descritas sejam derivadasdas seqüências conhecidas ou relatadas para essas cepas, aquelecom habilidade na técnica pode prontamente escolher umadiferente cepa ou seqüência relatada para a mesma cepa e usá-lana presente invenção da mesma forma conforme descrita para asseqüências reveladas. Uma pessoa pode prontamente alinhar asseqüências usando quaisquer de uma variedade de programas desoftware de seqüência e identificar as seqüências correspondentespara a proteína aqui descrito em outras cepas ou seqüências viraisrelatadas. É ainda observado que as seqüências de nucleotídeo eaminoácido podem diferir levemente entre diversas cepas ourelatórios de seqüências nos bancos de dados públicos. Taisdiferentes menores não são esperadas para significativamenteimpactar sobre a capacidade de induzir uma resposta imune deacordo com a invenção. A invenção não é limitada às seqüênciasaqui descritas. Nessa configuração, o veículo de levedura queexpressa ou fornece o(s) antígeno(s) externo(s) de influenza podeser o mesmo ou um diferente veículo de levedura ao do veículo delevedura que expressa ou fornece o(s) antígeno(s) interno(s) deinfluenza. Além disso, as diferentes combinações de antígenosinternos de influenza e/ou antígenos externos de influenza podemser expressados ou fornecidos em diferentes veículos de levedura,e os veículos podem ser usados separadamente ou conjuntamente,dependendo da vacinação que é desejada. De modo geral, quandoos antígenos de influenza são fornecidos por dois ou maisdiferentes veículos de levedura (isto é, conforme oposto aofornecimento de todos os antígenos de influenza em um veículo delevedura), os veículos de levedura podem ser combinados(misturados) para administração como uma única vacina (p.ex.,uma única injeção ou outro tipo de dosagem) ou os diferentesveículos de levedura podem ser administrados seqüencialmente. Aadministração seqüencial pode ser separada por qualquer períodode tempo adequado, incluindo pequenos incrementos de tempo(segundos ou minutos) e incrementos mais longos de tempo (dias,semanas, meses ou até mesmo anos). A invenção contempla que,nessas configurações, qualquer combinação das proteínas deinfluenza que incluem pelo menos uma proteína interna de influenzae pelo menos uma proteína externa de influenza podem ser usadas,e essas proteínas podem ser fornecidas usando qualquercombinação dos veículos de levedura (incluindo um único veículode levedura) que expressa ou são, de outro modo, complexada comtais proteínas.

Existe grande flexibilidade em como a vacinada presente invenção é projetada e usada. Por exemplo, umavacina "universal" compreendendo um veículo de levedura quefornece os antígenos internos de influenza pode ser administradaem um indivíduo periodicamente, com a finalidade de desenvolveruma imunidade protetora cruzada em um indivíduo que é mediadapor célula. Essa vacina pode então ser combinada, por exemplo,em uma base única ou periódica com os veículos adicionais delevedura fornecendo os antígenos externos de influenza. Osveículos de levedura fornecendo os antígenos externos de influenzapodem ser revezados, alternados ou selecionados anualmente ouem qualquer outra base preferida (p.ex., emergência ou epidemiaou pandemia antecipada, ou conforme de outro modo necessário)para direcionar as cepas de vírus de interesse e/ou a(s) cepa(s)viral(is) mais prevalecente(s) durante determinado período detempo ou para uma região geográfica específica. As outrasconfigurações da invenção serão aparentes considerando arevelação aqui fornecida.

Em ainda outra configuração da invenção,um veículo de levedura expressando ou fornecendo um ou maisantígenos internos (sozinhos ou em combinação com um ou maisantígenos externos) podem ser administrados como uma vacina depreparação, a ser seguido por estimuladores de vacinas adicionaiscom base em levedura ou por estimuladores de outros preparos deantígeno interno e/ou externo, incluindo, porém não limitados à,preparos de proteína de influenza parcialmente purificados oupreparos purificados, Iisados de veículos de levedura queexpressam as proteínas de influenza, as vacinas de influenza deDNA, vírus neutralizado (ou desativado), ou combinações dosveículos de levedura (fornecendo ou não fornecendo os antígenosheterólogos) e vacinas com base em não levedura. É observadoque devido às vacinas com base em levedura da presente invençãoserem extremamente eficazes na obtenção de uma resposta imune,as vacinas de eliminação não são prováveis para seremnecessitadas, embora sejam incluídas em uma configuração dapresente invenção.

As proteínas de influenza M1, M2 e NP sãoproteínas internas expressas por influenza e exibem um alto graude conservação de seqüência entre as cepas do vírus de influenza,tornando-as excelentes alvos para imunoterapia. A administraçãode vacina da presente invenção aumenta a resposta de célula TCD4+ e CD8+ específica de influenza, e é esperada para resultarem uma redução da carga viral e, finalmente, aprimorar a liberaçãoviral nos indivíduos infectados por influenza. Quando combinadocom os antígenos externos de influenza (p.ex., HA, M2e (o peptídeoexterno da proteína M2) e/ou antígenos de NA) no formato combase em levedura, a vacina ainda aumenta a imunidade mediadapor célula e humoral específica de influenza para fornecer umaplataforma de vacinação que inclui uma abordagem de vacinaçãoprotetora cruzada (via os antígenos internos), com efeitos potenciaisde longa duração, bem como uma abordagem específica de cepa(via os antígenos externos), que pode ser adaptada para tratar dasnecessidades atuais de vacina. Além do mais, a vacina da presenteinvenção não é com base em óvulo, permitindo que a vacina sejausada em uma ampla variação de destinatários do que a vacinaconvencional de influenza. A vacina também é esperada para sermais eficiente e rapidamente produzida conforme comparado àsatuais vacinas de influenza. Finalmente, conforme acima discutido,a flexibilidade na projeção da vacina que é fornecida pela presenteinvenção, em termos da capacidade de estabelecer a imunidadeuniversal enquanto também direciona os subtipos de vírus deacordo com a necessidade, é uma melhoria significativa sobre asvacinas convencionais de influenza.

Uma configuração da presente invençãorefere-se a uma composição (vacina) que pode ser usada em ummétodo para proteger um animal contra a infecção de influenza oupara aliviar pelo menos um sintoma resultante da infecção deinfluenza. A vacina compreende: (a) um veículo de levedura; e (b)uma proteína de fusão heteróloga de influenza expressada oufornecida pelo veículo de levedura. Conforme acima discutido, ainvenção inclui diversas proteínas diferentes de influenza de fusãopara uso como antígenos nas vacinas da invenção. Essas proteínasde fusão são projetadas para estabilizar a expressão da proteínaheteróloga no veículo de levedura, prevenir a modificação pós-translacional da proteína heteróloga expressada, e/ou podem, emalgumas configurações, fazer com que a proteína de fusão a serexpressada na superfície do veículo de levedura. As proteínas defusão também fornecerem uma ampla resposta imune mediada porcélula e, em algumas configurações, uma resposta imune humoral,e preferivelmente expressa ou fornece mais do que um diferenteantígeno de influenza, e/ou são combinadas com outros veículos delevedura expressando ou fornecendo diferente(s) antígeno(s) deinfluenza. Preferivelmente, a combinação dos antígenos inclui pelomenos um antígeno interno de influenza e pelo menos um antígenoexterno de influenza. Essas proteínas de fusão são maistipicamente expressadas ou fornecidas como proteínasrecombinantes pelo veículo de levedura (p.ex., por uma leveduraintacta ou esferoplasto de levedura, que pode opcionalmente serainda processada para um citoplasto de leveduram, levedura secaou extrato de membrana de levedura ou fração do mesmo), emboraseja uma configuração da invenção que um ou mais de taisproteínas de fusão poderiam ser carregadas em um veículo delevedura (p.ex., as proteínas) ou, de outro modo, complexadas oumisturadas com um veículo de levedura conforme aqui descrito paraformar uma vacina da presente invenção.

Conforme acima discutido, as proteínas defusão usadas nas vacinas e composições da invenção incluem pelomenos um antígeno de influenza para vacinação de um animal. Acomposição ou vacina pode incluir, uma, duas, diversas ou umapluralidade de antígenos de influenza, incluindo um ou maisdomínios imunogênicos de um ou mais antígenos de influenza,conforme desejado. Por exemplo, qualquer proteína de fusão aquidescrita pode incluir pelo menos uma porção de qualquer uma oumais de proteínas internas de influenza selecionadas a partir de:proteína de matriz de influenza (M1), proteína de canal de íon deinfluenza (M2) ou proteína de nucleocapsídeo de influenza (NP),antígeno de polimerase PB1 (PB1), antígeno de polimerase (PB2),e antígeno de polimerase PA (PA) e/ou uma ou mais proteínasexternas de influenza selecionadas a partir de: hemaglutinina deinfluenza (HA) ou neuraminidase de influenza (NA).

De acordo com a presente invenção, aexpressão "proteína interna de influenza" refere-se a uma proteínaexpressada por um vírus de influenza (qualquer tipo ou cepa) queesteja totalmente, ou na maior parte, contida dentro da partícula devírus no núcleo do vírus ou membrana de proteína de matriz. Taisproteínas são tipicamente altamente conservadas entre os tipos ecepas virais, e podem ser abundantemente produzidas pelo vírus.

Uma "proteína externa de influenza", conforme aqui descrito, refere-se a uma proteína expressa por um vírus de influenza (qualquer tipoou cepa) que se estende através da membrana de lipídio e é namaior parte expressada na superfície de partícula do vírus (p.ex., éuma proteína de superfície viral). Tais proteínas podem serreconhecidas por anticorpos e são, portanto, úteis para induzir umaresposta imune humoral contra um vírus. É observado que aproteína de canal de íon de influenza (M2), enquanto principalmenteestando contida dentro do vírus de influenza, possui um pequenodomínio extracelular (conhecido na técnica como M2e) que éexpressado na superfície do vírus de influenza. Portanto, para osfins desta invenção, a proteína M2, embora seja geralmenteconsiderada como uma proteína interna de influenza na medida emque é capaz de ser reconhecida por um anticorpo quandoexpressada por um vírus de influenza ou por uma célula queexpressa ou exibe pelo menos o domínio extracelular em suasuperfície, também pode ser considerada como uma proteínaexterna de influenza.

Em uma configuração da invenção, a porçãodo antígeno de influenza da vacina é produzida como uma proteínade fusão compreendendo dois ou mais antígenos. Em um aspecto,a proteína de fusão pode incluir dois ou mais domíniosimunogênicos ou dois ou mais epítopos de um ou mais antígenos(p.ex., uma seqüência M1 de influenza e uma seqüência HA deinfluenza). Tal vacina pode fornecer a imunização específica deantígeno em uma ampla variação de pacientes. Por exemplo, umamúltipla proteína de fusão de domínio útil na presente invençãopode ter múltiplos domínios, caracterizada pelo fato de que cadadomínio consiste em um peptídeo de uma proteína específica, opeptídeo consistindo em pelo menos 4 resíduos de aminoácidoflanqueando qualquer lado e incluindo um aminoácido de mutaçãoque seja encontrado na proteína, caracterizada pelo fato de que amutação é associada a uma doença ou condição específica (p.ex.,infecção de influenza por uma cepa específica).

O ácido nucléico e seqüência de aminoácidopara genes de influenza e as poli-proteínas codificadas para tanto apartir de uma variedade de tipos, subtipos e cepas de influenza sãoconhecidos na técnica. Portanto, usando a orientação aquifornecida e a referência aos antígenos exemplares específicos deinfluenza, aquele com habilidade na técnica prontamente serácapaz de produzir e usar uma variedade de proteínas de fusão combase em influenza de qualquer cepa de influenza nas composiçõese vacinas da presente invenção.

Na presente invenção, os presentesinventores geraram a nova imunoterapia de levedura recombinantepara uso na prevenção ou inibição do vírus de infecção deinfluenza. Um da imunoterapia de levedura expressa a proteína dematriz de influenza (M1) como uma proteína de fusão sob o controlede um promotor induzível. A análise por Immunoblot de célula devacina de levedura usando os anticorpos contra uma marcação dehistidina demonstrou que a levedura recombinante expressou aproteína. A injeção da vacina de levedura expressando M1 emcamundongos BALB/c resultou na indução de um ajudante potenteespecífico de antígeno M1 e respostas imunes de célula Tcitotóxica, conforme demonstrado pela proliferação de linfócito eensaios de citotoxidade. Outra imunoterapia de levedura expressa aproteína de antígeno de hemaglutinina (HA) de forma intracelular eoutra imunoterapia de levedura fornece a proteína de antígeno dehemaglutinina (HA) de forma extracelular. Algumas imunoterapiasfornecem os antígenos sob o controle de promotores constitutivos.Outras vacinas de levedura abrangidas pela presente invençãoserão discutidas em detalhes abaixo.

Em um aspecto da invenção, o antígeno deinfluenza é a proteína interna de influenza, proteína de matriz (M1).Em um aspecto da invenção, o antígeno de influenza consisteessencialmente em aminoácidos 2 a 252 da proteína M1 deinfluenza. M1 é aproximadamente uma proteína 27 kD de influenzaque forma a membrana de proteína de matriz no vírus de influenza(vide Fig. 1). M1 é uma proteína estrutural, e está envolvida namontagem viral e exportação nuclear da ribonucleoproteína (RNP)ao citoplasma. M1 é uma proteína altamente conservada entre osvírus de influenza e é uma proteína viral abundante,compreendendo aproximadamente 47% da proteína total de vírus.Qualquer proteína M1 ou porção da mesma é contemplada parauso na presente invenção, bem como quaisquer mutantes ouvariantes de quaisquer tais proteínas M1.

O Exemplo 1 descreve o uso da proteína dematriz (M1 ou MP) proteína interna de influenza para produzir umavacina ou componente exemplar da vacina da presente invenção(iisto é, a referência a um componente sendo na medida em que oveículo de levedura seja combinado com outros veículos delevedura expressando diferentes proteínas ou ainda transformadopara expressar proteínas adicionais de influenza conforme aquidescrito). Nessa configuração, uma levedura (p.ex., Saccharomycescerevisiae W303a) foi projetada para expressar uma proteína defusão M1 de influenza derivada do vírus de influenza A/PR/8/34 sobo controle do promotor induzível por cobre, CUP1. A proteína defusão é um único polipeptídio com a seqüência de aminoácido deSEQ ID N°:4, que é codificada por uma seqüência de ácido nucléicorepresentada pela SEQ ID N°:3.

Em outro aspecto da invenção, o antígeno deinfluenza é a proteína externa de influenza hemaglutinina (HA). Emum aspecto da invenção, o antígeno de influenza consisteessencialmente em aminoácidos 2 a 530 da proteína HA deinfluenza, que inclui a seqüência de sinal direcionando ER determinal N de HA, porém exclui os resíduos de terminal C 36 de HA,assim, eliminando sua âncora de membrana de terminal C e caudacitoplásmica. Em outro aspecto, o antígeno de influenza consisteessencialmente em aminoácidos 17 a 342 da proteína HA deinfluenza, que exclui a seqüência de sinal direcionando ER determinal C do aminoácido 16 de HA e exclui os resíduos de terminalC 36 de HA, compreendendo sua âncora de membrana de terminalC e cauda citoplásmica. HA é uma proteína de membrana integralque é expressada na superfície da partícula viral de influenza (videFig. 1). A hemaglutinina é responsável pela célula hospedeiraaglutinando via os resíduos do ácido siálico das proteínasreceptoras glicosadas nas superfícies de célula alvo, bem comofusão subseqüente das membranas virais e hospedeiras noendossomo após o vírus ser obtido por endocitose. HA contém pelomenos quatro locais antigênicos principais, e somente uma únicasubstituição de aminoácido dentro de uma dessas quatro regiõespode resultar na capacidade do vírus de escapar a vigilância imunee espalhar no mundo a cada ano. Três proteínas HA distintas foramencontradas nas infecções humanas, denominadas como H1, H2 eH3; 13 outras foram encontradas em vírus de influenza de animal,incluindo H5, encontrada no vírus de influenza aviária. Qualquerproteína HA ou porções da mesma são contempladas para uso napresente invenção, bem como quaisquer mutantes ou variantes dequaisquer tais proteínas HA. Em uma configuração, um veículo delevedura da invenção expressando uma proteína HA expressa maisdo que uma proteína HA (p.ex., H1, H2, etc.) ou é combinada emuma vacina com um veículo de levedura que expressa uma proteínadiferente HA (p.ex., um veículo expressa H1 e um veículo expressaH2 ou outra proteína HA).

O Exemplo 2 descreve o uso de umaproteína externa de influenza de hemaglutinina (HA) para produziroutra vacina ou componente exemplar de uma vacina da presenteinvenção. Nessa configuração, uma levedura (p.ex.,Saccharomyces cerevisiae W303a) foi projetada para expressaruma proteína de fusão sob o controle do promotor TEF2. A proteínade fusão compreendendo o antígeno HA de influenza (H1) derivadodo vírus de influenza A/PR/8/34 é um único polipeptídiocompreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°:6, que écodificada por uma seqüência de ácido nucléico aqui representadapela SEQ ID N°:5.

O Exemplo 2 também descreve o uso deoutra proteína externa de influenza de hemaglutinina (HA), nessecaso, o HA H5 da cepa de influenza aviária, para produzir outravacina ou componente exemplar de uma vacina da presenteinvenção. Nessa configuração, uma levedura (p.ex.,Saccharomyces cerevisiae W303a) foi projetada para expressaruma proteína de fusão.

A proteína de fusão compreendendo oantígeno HA de influenza (H5) derivado do vírus de influenzaA/Vietnã/1203/04 é um único polipeptídio compreendendo asseqüência de aminoácido da SEQ ID N°:20, que é codificada poruma seqüência de ácido nucléico aqui representada pela SEQ IDN°:19.

Ambas as proteínas de fusão acima descritasforam projetadas para fornecer a expressão intracelular da proteínaHA de fusão pela levedura. Brevemente, essas proteínas de fusãocontêm as seqüências de sinal de terminal N para ambos Aga2 eHA. A seqüência de sinal de Aga2 direciona a fusão paradeslocamento em ER1 porém a seqüência de sinal de HA atua comouma transferência de interrupção. Devido a isso, a proteína defusão não chega à rota secretora. Torna-se uma proteína demembrana integral cuja porção de HA permanece no lado citosólicoda membrana plasmática.

O Exemplo 3 descreve o uso de umaproteína externa de influenza de hemaglutinina (HA) para produzirainda outra vacina ou componente exemplar de uma vacina dapresente invenção. Nessa configuração, uma levedura (p.ex.,Saccharomyces cerevisiae W303α) foi projetada para expressaruma proteína de fusão sob o controle do promotor TEF2. Essaproteína de fusão foi projetada para fornecer a expressãoextracelular da porção do terminal N do antígeno HA (H1),denominado como HA1, derivado do vírus de influenza A/PR/8/34pela levedura. Essa proteína, quando expressada em células quetambém expressam Agalp, localiza a parede celular externa dacélula de levedura, porém também é contida de forma intracelular. Aproteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácido daSEQ ID №: 10, que é codificada pela seqüência de ácido nucléicoaqui representada pela SEQ ID №:9.

Em outro aspecto da invenção, o antígeno deinfluenza é a proteína externa de influenza, neuraminidase (NA), eem outra configuração, uma porção imunogênica de NA écontemplada. NA é uma proteína de membrana integral que éexpressada na superfície da partícula viral de influenza (vide Fig. 1).A neuraminidase digere o ácido siálico (ácido neuramínico), que amaioria das células têm em sua superfície. Considerando que, oácido siálico é parte do receptor de vírus, quando o vírus aglutina-seà célula, ele será internalizado (passará por endocitose).Tardiamente na infecção, o ácido siálico será removido dasuperfície de célula infectada pela neuraminidase, tornando maisfácil aos vírions de progênie difundirem-se para longe, assim quesaem da célula.

A neuraminidase também está envolvida napenetração da camada de muco no trato respiratório. Duasproteínas NA distintas foram encontradas nas infecções humanas,denominadas como N1 e N2; 7 outras foram encontradas no vírusde influenza de animal. Qualquer proteína NA ou porção da mesmaé contemplada para uso na presente invenção, bem comoquaisquer mutantes ou variações de quaisquer tais proteínas NA.

Na configuração preferida, um veículo de levedura da invençãoexpressando uma proteína NA1 expressa mais do que uma proteínaNA (p.ex., N1, N2, etc.) ou é combinada em uma vacina com umveículo de levedura que expressa uma diferente proteína NA {p.ex.,um veículo expressa NA e um veículo expressa NA ou outraproteína NA).

Em ainda outro aspecto da invenção, oantígeno de influenza usado em uma vacina da invenção é aproteína interna ou externa de influenza, proteína de canal de íon(M2). Em um aspecto da invenção, o antígeno de influenza consisteessencialmente na porção extracelular da proteína M2 de influenza,também conhecida como M2e. Em um aspecto, M2e é fundida aoterminal-C de uma proteína NP de influenza, ou uma porção damesma. Essa proteína (M2e) pode ser projetada para expressãointracelular (citosólica). Em outra configuração, M2e é fundida émuma proteína da parede celular (p.ex., Aga2) para expressão nasuperfície extracelular da levedura. M2 é uma proteína de matriz eem uma proteína de membrana integral que estende a membranade proteína de matriz e bicamada de lipídio e é expressada nasuperfície da partícula viral (vide Fig. 1). M2 é um canal de íon quepermite os prótons entrarem nas partículas do vírus durante aretirada de enovelamento de vírions nos endossomas, e tambémmodula o pH da rede de trans-GoIgi nas células infectadas porvírus. M2 é um homo-oligômero dos resíduos 97 com um únicodomínio de transmembrana (TM)1 cujos resíduos abrangem a regiãode poro do canal. A forma biologicamente ativa do canal é umhomotetrâmero. De acordo com a presente invenção, a porção daproteína M2 que expressou internamente no vírus ( isto é, tambémconhecido como domínio extracelular de M2) pode ser denominadano presente como M2e. M2e é conhecido como sendo altamenteconservada entre os vírus de influenza do tipo A. Conforme acimadiscutido, em uma configuração da invenção, uma porção daproteína M2 compreendendo principalmente ou exclusivamenteM2e é expressada por um veículo de levedura. Nessa configuração,a proteína M2 é considerada como uma proteína externa deinfluenza. Em outras configurações, quando as porções demembrana de proteína de matriz da proteína M2 são expressadas,a proteína M2 pode ser considerada como uma proteína interna deinfluenza. Qualquer proteína M2 ou porção da mesma écontemplada para uso na presente invenção, bem como quaisquermutantes ou variantes de quaisquer tais proteínas M2.

Em outro aspecto da invenção, o antígeno deinfluenza usados em uma vacina da invenção é a proteína internade influenza, proteína de nucleocapsídeo (NP), tambémdenominado como nucleoproteína. Em um aspecto da invenção, oantígeno de influenza consiste essencialmente em uma porção daproteína NP de influenza que expressa no citosol da levedura e queé imunogênica. NP é uma proteína que está localizada dentro dacasca formada pela membrana de proteína de matriz (vide Fig. 1). Afunção primária de NP é o de encapsular o genoma do vírus paraformar uma ribonucleoproteína (RNP) para fins de transcrição,replicação e empacotamento de RNA, porém a NP também realizaoutras funções essenciais por todo o ciclo de vida viral. A NP éresponsável pela classificação da influenza em tipos A, B e C,porém é ainda altamente conservada, mesmo entre os tipos virais, eespecificamente entre os tipos AeB. Qualquer proteína NP ouporção da mesma é contemplada para uso na presente invenção,bem como, quaisquer mutantes ou variantes de quaisquer taisproteínas NP. Em uma configuração preferida, um veículo delevedura da invenção expressando uma proteína NP expressa maisdo que uma proteína NP (p.ex., NP de influenza tipo A e NP dainfluenza tipo B) ou é combinada em uma vacina com um veículo delevedura que expressa uma diferente proteína NP (p.ex., um veículoexpressa NP da influenza tipo A e um veículo expressa NP dainfluenza tipo B).

O Exemplo 4 descreve o uso de umaproteína externa de influenza de hemaglutinina (HA) para produzirainda outra vacina ou componente exemplar de uma vacina dapresente invenção. Nessa configuração, uma levedura {p.ex.,Saccharomyces eerevisiae) foi projetada para expressar umaproteína de fusão sob o controle do promotor TEF2. Essa proteínade fusão foi projetada para fornecer a expressão extracelular doantígeno HA (H5) derivado da cepa do vírus de influenzaA/Vietnã/1203/04 pela levedura. Essa proteína, quando expressadanas células que também expressam Agalp, localiza a paredecelular externa da célula de levedura. A proteína de fusãocompreende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°.14, que écodificada pela seqüência de ácido nucléico aqui representada pelaSEQ ID N0: 13.

O Exemplo 5 descreve a engenharia dediversas proteínas de fusão contendo HA que foram expressadaspelos veículos de levedura da invenção, e que ilustram diversasconstruções para a expressão de superfície, incluindo em umesferoplasto de levedura, e que ainda ilustra o efeito da glicosilaçãona expressão de superfície.

Uma proteína de fusão, denotada TK75-15, éa proteína de fusão aqui mencionada pela SEQ ID N0: 36, que écodificada pela SEQ ID N°:35, e ilustra a construção de umaproteína de fusão com a seqüência HA colocada no terminal C àseqüência Aga2. Essa proteína, quando expressada nas células delevedura que também expressam Agalp (nesse caso, acionadapelo promotor CUP1), localiza a parede celular externa da célula delevedura, bem como ao citosol, conforme mostrado na Fig. 10B(esquerda superior).

O Exemplo 5 também descreve uma proteínade fusão denotada VK4, mostrada esquematicamente na Fig. 10B(direita superior), foi projetada para localizar a proteína HA deinfluenza (H1) à parede celular usando a seqüência Aga2, acionadapelo promotor TEF2. Nessa construção, a proteína foi construídacom a seqüência HA colocada no terminal-N à seqüência Aga2.Essa proteína, quando expressada em uma levedura Mat tambémexpressa Agalp nativo (nesse caso, seu promotor nativo), localiza aparede celular externa da célula de levedura, e está tambémpresente de forma intracelular. A proteína de fusão compreendeuma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°:26, que é codificadapela seqüência de ácido nucléico aqui representada pela SEQ IDN°:25.

O Exemplo 5 também descreve uma proteína

de fusão denotada VK11, que é análoga a VK4 acima, exceto que aproteína de fusão foi projetada para localizar a proteína HA deinfluenza H5 à parede celular usando a seqüência Aga2, acionadapelo promotor TEF2. Nessa construção, a proteína também foiconstruída com a seqüência HA colocada no terminal-N àseqüência Aga2. A proteína de fusão compreende uma seqüênciade aminoácido da SEQ ID N°:22, que é codificada pela seqüênciade ácido nucléico aqui representada pela SEQ ID N°:21.

O Exemplo 5 também descreve uma proteínade fusão denotada VK8, demonstrada esquematicamente na Fig.10B (esquerda inferior), foi projetada para localizar a proteína deinfluenza HA (H1) à parede celular usando a seqüência Cwp2,acionada pelo promotor TEF2. Nessa construção, a proteínatambém foi construída com a seqüência HA colocada no terminal-Nà seqüência Cwp2. Essa proteína localiza a parede celular externada célula de levedura, e também está presente de formaintracelular. A proteína de fusão compreende uma seqüência deaminoácido da SEQ ID N°:28, que é codificada pela seqüência deácido nucléico aqui representada pela SEQ ID N°:27.

O Exemplo 5 também descreve uma proteínade fusão denotada VK12, que é análoga a VK8 acima, exceto que aproteína de fusão foi projetada para localizar a proteína HA deinfluenza H5 à parede celular usando a seqüência Cwp2, acionadapelo promotor TEF2. Nessa construção, a proteína também foiconstruída com a seqüência HA colocada no terminal-N àseqüência Cwp2. A proteína de fusão compreende uma seqüênciade aminoácido da SEQ ID N°:24, que é codificada pela seqüênciade ácido nucléico aqui representada pela SEQ ID N°:23.

O Exemplo 5 também descreve uma proteínade fusão denotada Lu002, mostrada esquematicamente na Fig. 10B(direita inferior), foi projetada com o sinal de fator α endógeno eseqüência líder para expressar a proteína HA de influenza com odomínio de transmembrana intacto na membrana plasmática de umesferoplasto de levedura, acionada pelo promotor TEF2. Essaproteína, a partir do qual o sinal de fator α e seqüência líder énaturalmente passada por clivagem no Golgi, localiza para amembrana plasmática do esferoplasto de levedura, e também estápresente de forma intracelular. O uso do sinal de fator α endógeno eseqüência líder para direcionar as proteínas estranhas na rotasecretora de levedura foi anteriormente descrito (p.ex., vide PatenteNorte-Americana N0 5,413,914; ou Franzusoff e outros, J. Quím.Biol. 270, 3154-3159 (1995)).

O Exemplo 6 descreve o uso de diversasproteínas internas de influenza para produzir ainda outro Tarmogenou componente exemplar de um Tarmogen da presente invenção.Nessa configuração, uma levedura (p.ex., Saccharomycescerevisiae) foi projetada para expressar uma proteína de fusão sobo controle do promotor TEF2. Essa proteína de fusão foi projetadapara fornecer a expressão intracelular do antígeno M1 e antígenoNP derivados do vírus de influenza A/PR/8/34 e antígeno M2e,incluindo os antígenos M2e derivados da cepa do vírus de influenzaA/PR/8/34 e cepa do vírus de influenza A/Vietnã/1203/04 pelalevedura. Essa vacina com base em levedura da invenção é útilpara a indução da imunidade protetora cruzada contra os antígenosque são conservados por todas as cepas de influenza. A proteínade fusão compreende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N0:16, que é codificada pela seqüência de ácido nucléico aquirepresentada pela SEQ ID N°:15.

O Exemplo 7 descreve o uso de diversasproteínas internas de influenza para produzir ainda outro Tarmogenou componente exemplar de um Tarmogen da presente invenção.Nessa configuração, a uma levedura (p.ex., Saccharomycescerevisiae) foi projetada para expressar a proteína de fusão sob ocontrole do promotor TEF2. Essa proteína de fusão foi projetadapara fornecer a expressão intracelular do antígeno NP derivado dovírus de influenza A/PR/8/34 e antígeno M2e derivado do vírus deinfluenza A/PR/8/34. Essa vacina com base em levedura dainvenção é útil para a indução da imunidade protetora cruzadacontra os antígenos que são conservados por todas as cepas deinfluenza. A proteína de fusão compreende uma seqüência deaminoácido da SEQ ID N°:18, que é codificada pela seqüência deácido nucléico aqui representada pela SEQ ID N°:17.

Em uma configuração da presente invenção,quaisquer dos vírus de antígeno de influenza acima descrito sãoexpressados em um veículo de levedura da invenção com pelomenos um outro vírus de antígeno de influenza. Preferivelmente1ambos os antígenos internos de influenza (p.exM1, M2 ou NP)são expressados juntos com um antígeno externo de influenza(p.ex., HA, NA1 ou M2e). Os antígenos de influenza podem serexpressados usando as mesmas ou diferentes construções. Osantígenos externos de influenza podem ser fornecidos de formaextracelular pela levedura e/ou de forma intracelular.

As combinações preferidas dos antígenos aserem expressos pelo veículo de levedura incluem, porém nãoestão limitadas à: M1 e HA; M1 e NA; M1, HA e NA; NP e HA; NP eNA; NP, HA e NA; M2 e HA; M2 e NA; M2 e M1; M2, HA e NA; e Ml,M2 e NA. Em quaisquer dessas combinações que incluem M2, o M2pode ser M2 ou M2e de comprimento integral, ou qualquer porçãode M2 que pode ser expressada ou fornecida na levedura e éimunogênico. De forma semelhante, as outras proteínas podem serexpressadas como qualquer forma, porção ou variante aquidescrito. Nessas combinações, qualquer um ou mais subtipos dasproteínas podem ser expressados ou fornecidos, e especificamente,qualquer um ou mais subtipos de HA ou NA.

Em outra configuração da invenção,quaisquer dos veículos de levedura acima descritos expressando oufornecendo um ou mais antígenos de influenza ou combinações detais antígenos são combinados com um veículo de leveduraexpressando ou fornecendo um ou mais diferentes antígenos oucombinações de antígenos para formar a vacina de levedura.Alternativamente, quaisquer dos veículos de levedura acimadescritos expressando ou fornecendo um ou mais antígenos deinfluenza podem ser administrados seqüencialmente com umveículo de levedura expressando um ou mais diferentes antígenosou combinações de antígenos. Preferivelmente, um veículo delevedura expressando ou fornecendo um ou mais antígenosinternos de influenza é combinado com ou administradoseqüencialmente com um veículo de levedura expressando oufornecendo um ou mais antígenos externos de influenza. Ascombinações preferidas dos veículos de levedura incluem, porém,não estão limitadas à, veículos de levedura expressando oufornecendo M1 administrados conjunta ou seqüencialmente com osveículos de levedura expressando ou fornecendo HA, NA, oucombinações dos mesmos (incluindo um ou mais subtipos dessesantígenos); os veículos de levedura expressando ou fornecendo NPadministrados juntos ou seqüencialmente com os veículos delevedura expressando ou fornecendo HA, NA, ou combinações dosmesmos (incluindo um ou mais subtipos desses antígenos); e osveículos de levedura expressando ou fornecendo M2 administradosjuntos ou seqüencialmente com os veículos de leveduraexpressando ou fornecendo HA, NA, ou combinações dos mesmos(incluindo um ou mais subtipos desses antígenos). Em outraconfiguração, os veículos de levedura expressando ou fornecendoquaisquer dois ou mais de M1, NP e/ou M2 podem seradministrados juntos ou seqüencialmente com os veículos delevedura expressando ou fornecendo HA, NA, ou combinações dosmesmos (incluindo um ou mais subtipos desses antígenos).

Proteínas de Fusão Isoladas, Moléculas deÁcido Nucléico e Células

Outra configuração da presente invençãoinclui uma proteína isolada, compreendendo qualquer proteína defusão isolada compreendendo um(s) antígeno(s) de influenzaconforme aqui descrito. Também incluídas na presente invençãoestão as moléculas isoladas de ácido nucléico codificandoquaisquer tais proteínas, molécula de ácidos nucléicosrecombinante compreendendo seqüências de ácido nucléicocodificando tais proteínas, e células e vetores, incluindo vetoresvirais, que contêm ou são transfectados/transformados com taismoléculas de ácido nucléico ou moléculas recombinantes de ácidonucléico.

As proteínas de fusão preferidas de acordocom a presente invenção incluem quaisquer das proteínas de fusãoaqui descritas. As proteínas de fusão exemplares abrangidas pelapresente invenção incluem aquelas proteínas de fusãocompreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindoem, uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de SEQ IDN°:4, SEQ ID N°:6, SEQ ID N0: 10, SEQ ID N0: 14, SEQ ID N°:16,SEQ ID N°:18,: SEQ ID N°:20, SEQ ID N°:22, SEQ ID N°:24, SEQID N°:26, SEQ ID N°:28, e SEQ ID N°:36. Outras seqüências deproteína de fusão serão aparentes para aqueles com habilidade natécnica, considerando a orientação aqui fornecida, já que diversasseqüências de proteína de influenza são bem-conhecidas natécnica.

A presente invenção também inclui quaisquermoléculas de ácido nucléico compreendendo, consistindoessencialmente em, ou consistindo em, uma seqüência de ácidonucléico codificando quaisquer proteínas de fusão aqui descritas.

As células hospedeiras adequadas paratransfectar com uma molécula recombinante de ácido nucléico deacordo com a presente invenção incluem qualquer célula que podeser transfectada ou transformada, incluindo qualquer célula animal,de inseto, bacteriana, de fungo (incluindo levedura). Em umaconfiguração, a célula hospedeira é uma célula animal que foitransfectada com e expressa a proteína de fusão da presenteinvenção. Tal célula é exemplificada na seção de Exemplos e é útil,por exemplo, para avaliar as respostas de célula T específicas deantígeno que são induzidas por uma vacina ou composição dapresente invenção. Outras vacinas ou composições direcionadascontra um antígeno de influenza também podem testar tais célulastransfectadas.

Os seguintes resultados experimentais sãofornecidos para fins de ilustração e não têm a intenção de limitar oescopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1

O seguinte exemplo descreve a engenhariade GI-8001 (também geralmente denominada em algumas figurascomo GI-8000), uma vacina de levedura proteína de fusão M1 deinfluenza da presente invenção.

Saccharomyces cerevisiae foi projetada paraexpressar uma proteína de fusão M1 de influenza sob o controle dopromotor induzível por cobre, CUP1. A proteína de fusão é umúnico polipeptídio com os seguintes elementos de seqüênciafundidos na estrutura do terminal-N ao C (a seqüência deaminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N°:4): 1) a seqüência MADEAP (SEQ ID N0:1) paraconceder a resistência à degradação proteassomal (posições 1 a 6da SEQ ID N°:4); 2) aminoácidos 2 até 252 da proteína M1(posições 7 a 257 da SEQ ID N°:4): 3) um espaçador de triglicinaintroduzido para separar a proteína M1 de uma marcação dehistidina (posições 258 a 260 da SEQ ID N°:4): e 4) uma marcaçãode hexahistidina de terminal C (posições 261 a 266 da SEQ IDN°:4). Uma seqüência de ácido nucléico codificando a proteína defusão da SEQ ID N°:2 é aqui representada pela SEQ ID N0: 1.Nessa vacina exemplar com base em levedura, o gene M1 foiclonado a partir das células de cultura infectada por influenzaA/PR/8/34/H1N1 por RT-PCR, e a seqüência de aminoácidocodificada é uma combinação exata à seqüência de aminoácidoteórica M1 dessa cepa/genótipo.

O crescimento e indução da levedura(Saccharomyces cerevisiae W303) expressando a proteína de fusãoM1 de influenza foi realizado no meio ULDM. O pH desse meio nãofoi ajustado para as condições de pH neutro conforme aqui descrito( isto é, condições regulares de crescimento de levedura foramusadas). A expressão da proteína de fusão M1 de influenza foiinduzida em 0.2 YU/ml com 0.375 mM de sulfato de cobre. Asleveduras foram colhidas na etapa semi-exponencial e neutralizadapor calor. A expressão da proteína de fusão M1 foi confirmada poranálise de Western blot de Iisados a partir da levedura induzida porcobre, desativada por calor GI-8001 (vide Fig. 2). Os anticorposmonoclonais especificam a marcação de histidina foram usadospara detecção de proteína.

Uma receita padrão para o meio ULDM

segue:

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Os camundongos fêmeas BALB/c foraminjetados com 3 doses semanas de PBS sozinho, ou 1 YU ou 10 YUda vacina GI-8001 com base em levedura expressando M1(denotada "1YU M1" e "10YU M1", respectivamente, nas Figs. 3A e3B). Os camundongos foram sacrificados 16 dias após receber aúltima dose. Os ensaios de estimulação in vitro foram conduzidosusando a levedura expressando M1-como um alvo (IVS-M1) ouusando vírus da gripe atenuado como um alvo (IVS-flu) para avaliaras respostas de CTL e proliferação de linfócito, e sobrenadantesforam coletados para análise de citocina. As células de tumor P815foram transfectadas com as proteínas de fusão M1 de influenza ouinfectadas com influenza como células alvo nesses ensaios. Osresultados dos ensaios CTL são demonstrados na Fig. 3. Osresultados demonstram que a vacinação dos camundongos com avacina GI-8001 induz respostas CTL específicas de antígeno (M1 evírus de influenza).

A Fig. 4 mostra um Western blot de Iisadosdas células P815 infectadas com influenza A/PR/8/34. HA éidentificada no sobrenadante, ilustrando que as células P815 podemser infectadas com o vírus de influenza e usadas como células alvonos ensaios aqui descritos.

As Figs. 5 e 6 mostram os resultados dosensaios de proliferação de linfócito. Na Fig. 5, o antígeno deestimulação era Iisado da levedura expressando a proteína de fusãoM1 (levedura MP). Na Fig. 6, o antígeno de estimulação neutralizouinfluenza (A/PR8). Os resultados demonstram que GI-8001 (Gl-8000, Levedura expressando M1) induzem as respostas deproliferação específicas de levedura.

Exemplo 2

O seguinte exemplo descreve a engenhariade duas vacinas com base em levedura da presente invenção queexpressa hemaglutinina (HA) de forma intracelular, usando HA H1(também denominada em qualquer local no presente como GI-8002ou GI-8000-I), e uma segunda usando HA H5 (também denominadacomo GI-8102).

HA-H1 para Expressão Intracelular

Uma Saccharomyces eerevisiae foi projetadapara expressar uma proteína de fusão HA (H1 ou HA1) de formaintracelular sob o controle do promotor de fator de alongamento detranscrição 2, TEF2 (vide Fig. 7, inferior). A proteína de fusãocompreendendo o antígeno HA de influenza é um único polipeptídiocom os seguintes elementos de seqüência fundidos na estrutura doterminal N ao C (a seqüência de aminoácido da proteína de fusãosendo aqui representada pela SEQ ID N°:6): 1) a seqüência deproteína Aga2 S. cerevisiae de comprimento total (posições 1 a 87da SEQ ID N°:6), incluindo sua seqüência de sinal natural dedirecionamento de ER de aminoácido 18 (posições 1 a 18 da SEQID N°:6): 2) aminoácidos 2 a 530 da proteína HA de influenza(posições 88 a 616 da SEQ ID N°:6), que inclui a seqüência de sinalde direcionamento de ER de terminal-N de HA (posições 88 a 105da SEQ ID N°:6), porém exclui os resíduos de terminal-C 36 de HA1assim eliminando sua âncora de membrana de terminal C e caudacitoplásmica; 3) um espaçador de triglicina para separar o corpo daproteína HA da marcação de histidina (posições 617 a 619 da SEQID N°:6); e 4) uma marcação de hexahistidina de terminal C(posições 620 a 625 da SEQ ID N°:6). Uma seqüência de ácidonucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N°:6 é aquirepresentada pela SEQ ID N°:5. Essa proteína de fusão e oTarmogen expressando-a pode ser denominada Aga2-HA GI-8000ou GI-8002.

Nessa vacina exemplar com base emlevedura, o gene HA foi clonado a partir das células de culturainfectadas por influenza A/PR/8/34/H1N1, e a seqüência codificadade aminoácido não é uma combinação exata à seqüência deaminoácido HA teórica dessa cepa/genótipo. Um alinhamento dasseqüências reais e teóricas é mostrado na Tabela 1 (vide Exemplo 2).

Tabela 1. Alinhamento da proteína HATeórica a partir de A/PR/8/34/H1N1 (SEQ ID N°:7) com a região realde proteína HA clonada no presente (seqüência de sinal de HAexcluída) (SEQ ID N°:8).<table>table see original document page 147</column></row><table>

A levedura abrigando o plasmídioTEF2::Aga2-HA foi cultivada para etapa semi-exponencial em UDM.

As condições de crescimento usando esse meio não foramajustadas para condições de pH neutro. As células foram lavadas eneutralizadas por calor, e a proteína total foi extraída a partir dascélulas. A expressão da proteína HA de fusão foi confirmada poranálise Western blot de Iisados a partir de levedura desativada porcalor expressando a proteína (Fig. 7). Os testes de Western blot daproteína total sondados com sua marcação mAb (Fig. 7, direita) ouum mAb específico de HA (não mostrado) indica que a proteínaAga2-HA acumula-se em altos níveis na levedura.

Uma receita padrão para meio UDM segue:

<table>table see original document page 147</column></row><table>

Os Camundongos fêmeas BALB/c, comidade de 5-10 semanas, foram administrados com PBS1 0,5 YUAga2-HA GI-8000 (GI-8002) ou 5 YU Aga2-HA GI-8000 (GI-8002),através de administração subcutânea (100 μΙ) ou intra-nasal (50pL), uma vez por semana por três semanas. Os camundongosforam sacrificados duas semanas após a terceira dose. O soro foicoletado após a terceira dose. O soro foi coletado para análise eensaios de estimulação in vitro foram realizados nos esplenócitospara avaliar as respostas CTL (usando células de tumor P815rotuladas 51Cr que foram infectadas de um dia para o outro com ovírus da gripe A/PR/8/34) e proliferação de linfócito. Para os ensaiosde proliferação, os esplenócitos foram cultivados por cinco dias comAga2-HA GI-8000 (GI-8002) ou vírus de influenza desativado porUV A/PR8. O soro também foi coletado para análise de anticorpo.

A Fig. 8 mostra os resultados dos ensaiosCTL1 e a Fig. 9 mostra os resultados dos ensaios de proliferação delinfócito. Os resultados mostram a Aga2-HA GI-8000 induz asrespostas CTL específicas do vírus de influenza. A administraçãopela via subcutânea induziu uma resposta CTL mais robusta do quea administração intra-nasal como um todo. Entretanto, aadministração intra-nasal de baixa dose induziu altos níveis derespostas CTL. Os ensaios de proliferação mostraram que ambasas vias de administração induziram a proliferação de linfócitoespecífica de influenza, embora a via intra-nasal de administraçãoapresentou baixos níveis de respostas de proliferação conformecomparado à administração subcutânea.

O Tarmogen expressando HA como umantígeno intracelular descrito acima também foi avaliado por suacapacidade de induzir uma resposta humoral como um adjuvante.Especificamente, duas doses de antígeno (HA de A/PR/8/34) foramfornecidas no dia 0 e dia 21 com ou sem adjuvante (adjuvantesendo o Tarmogen GI-8000-I descrito neste exemplo) ou Alum. Atitulação de anticorpo neutralizando HA foi medida por 3 semanasapós a segunda dose do antígeno. A Tabela 2 mostra os resultadosdesse experimento. Os dados demonstraram que o GI-8000-Ipossui capacidade excelente para atuar como um adjuvante para asrespostas de célula B. De fato, funciona tão bem ou melhor do quea proteína purificada sem ou com alum adicionado como umadjuvante. Como tal, uma dosagem inferior da vacina com base emnão-levedura pode ser usada para obter a mesma eficácia nageração da resposta de anticorpo (isto é, com economia de dose).

<table>table see original document page 149</column></row><table>

O Tarmogen expressando HA como umantígeno intracelular descrito acima também foi avaliado por suacapacidade de preparar uma resposta imune contra influenza. Apreparação foi realizada com vírions suficientes de A/PR/8/34desativado para fornecer 10 yg de HA. Cinco YU de GI-8000-Iforam usados. Um estimulador foi fornecido em cerca de 1 mêsdepois. As titulações de Hl (inibição neutralizando HA) forammedidas no outro mês. O desafio foi realizado ao mesmo tempo emque as titulações de Hl foram medidas. A titulação de vírus foimedida 5 dias depois. A Tabela 3 mostra os resultados quando oGI-8000-I foi usado para preparar contra a gripe.<table>table see original document page 150</column></row><table>

Usando esse tipo de Tarmogen, as células Tcontra múltiplos antígenos foram geradas nas células infectadas porgripe. O benefício para induzir uma resposta imune contra múltiplosantígenos é que permite as respostas protetoras cruzadas e permitea expressão de Tarmogen de múltiplos antígenos para atuar comouma vacina universal. Ao gerar uma resposta imune eficaz, essetipo de vacina pode ser econômica de dose (ou seja, menosdosagem necessária para eficácia) conforme comparado com asvacinas convencionais para gripe aviária ou sazonal.

HA H5 para Expressão IntracelularUma Saccharomyces cerevisiae foi projetadapara expressar uma proteína de fusão HA (H5) de forma intracelular(também denominada no presente como GI8102). A proteína defusão compreendendo o antígeno H5 de influenza é um únicopolipeptídio com os seguintes elementos de seqüência fundidos naestrutura do terminal N ao C (a seqüência de aminoácido daproteína de fusão sendo aqui representada pela SEQ ID N°:20): 1) ocomprimento total da seqüência de proteína Aga2 de S. cerevisiae(posições 1 a 87 da SEQ ID N°:20), incluindo sua seqüência desinal de direcionamento de ER de aminoácido natural 18 (posições1 a 18 da SEQ ID N°:20): 2) uma seqüência de sinal dedirecionamento de ER de terminal N correspondente aos resíduos 1a 16 de HA-H1 (posições 88 a 105 da SEQ ID N°:20): 3) HA H5 dacepa de gripe aviária A/Vietnã/1203/2004 (posições 106 a 620 daSEQ ID N°:20); que exclui os resíduos de terminal C 36 de HA1assim eliminando sua âncora de membrana de terminal C e caudacitoplásmica, e; 4) uma marcação de hexahistidina de terminal C(posições 621 a 626 da SEQ ID N°:20). Uma seqüência de ácidonucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N°:20 é aquirepresentada pela SEQ ID N°:19.

Exemplo 3

O seguinte exemplo descreve a engenhariade outra proteína HA de fusão, aqui mencionada como HA1 emuma vacina de levedura (que pode ser genericamente aquidenominada como GI-8000-S) da presente invenção.

Essa proteína de fusão foi projetada parafornecer expressão extracelular, bem como expressão intracelular,da proteína HA de fusão pela levedura. A proteína de fusãocompreendendo a porção de terminal N do antígeno HA deinfluenza (HA1) é um único polipeptídio com os seguinteselementos de seqüência fundidos na estrutura do terminal N ao C (aseqüência de aminoácido da proteína de fusão sendo aquirepresentada pela SEQ ID N0: 10): 1) o comprimento total daseqüência de proteína Aga2 de S. cerevisiae (posições 1 a 89 daSEQ ID N°:10) incluindo sua seqüência de sinal de direcionamentode ER de aminoácido natural 18 (posições 1 a 18 da SEQ ID N0:10):2) aminoácidos 17 a 342 da proteína HA de influenza (posições 90a 415 da SEQ ID N°:10), que exclui a seqüência de sinal dedirecionamento de ER de terminal N de aminoácido 16 de HA eexclui os resíduos 36 de terminal C de HA compreendendo suaâncora de membrana de terminal C e cauda citoplásmica; 3) umespaçador de triglicina (posições 416 a 418 da SEQ ID N°:10) paraseparar o corpo da proteína HA1 da marcação de histidina; e 4)uma marcação de hexahistidina de terminal C (posições 419 a 424da SEQ ID N0:10). Essa proteína, quando expressada nas célulasque também expressam Agalp, localizada a parede celular externada célula de levedura (Vide Fig. 10A para uma ilustraçãoesquemática da expressão extracelular usando essa técnica). Aproteína também será expressada de forma intracelular. Umaseqüência de ácido nucléico codificando a proteína de fusão daSEQ ID N°: 10 é aqui representada pela SEQ ID N°:9.

Nessa vacina exemplar com base emlevedura, o gene HA foi clonado a partir estoque de óvulo dainfluenza A/PR/8/34/H1N1 e a seqüência codificada de aminoácidonão é uma combinação exata à seqüência de aminoácido HAteórica dessa cepa/genótipo. Um alinhamento das seqüências reaise teóricas é mostrado na Tabela 4. Existem 10 más combinaçõesde aminoácido entre as duas seqüências.

Tabela 4. Alinhamento da região de HA1teórica (SEQ ID N°:11) com seqüência real de HA1 que foi aquiclonada (SEQ ID N°:12).<table>table see original document page 153</column></row><table>

A expressão da proteína de fusão foiconfirmada por análise Western blot de Iisados a partir da leveduradesativada por calor induzida por cobre (vide Fig. 17). Após aindução por cobre em UDM1 sob condições regulares (não pHneutro) para induzir a síntese de Aga1, constitutivamente o Aga2-HA1 expressado foi liberado do Agal na superfície celular dascélulas vivas com 50 mM DTT e o eluato DTT foi tratado comenzimas de glicosidase PNGase F ou ENDO-h por 1h. As reaçõesforam analisadas para teor de Aga-HAI por Western blot (Fig. 17).Tanto a expressão intracelular quanto a de superfície celular HA1foram observadas.

Exemplo 4

O seguinte exemplo descreve a engenhariade outra proteína HA de fusão vacina de levedura da presenteinvenção.

Outro veículo de levedura foi projetado paraexpressar a proteína de hemaglutinina (HA), H5, da cepa de gripeaviária A/Vietnã/1203/2004 (H5-N1), como uma proteína da célulade superfície da levedura (extracelular), também denominada comoTK88 (Aga2-H5 HA), que também estará localizada de formaintracelular. Com referência novamente ao painel superior da Fig.10A, a construção para expressão de superfície é exemplificada. Aproteína de fusão compreendendo o antígeno HA de influenza (H5)é um único polipeptídio com os seguintes elementos de seqüênciafundidos em estrutura do terminal N ao C (a seqüência deaminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N0: 14): 1) o comprimento total da seqüência de proteínaAga2 de S. cerevisiae (aminoácidos 1 a 87 da SEQ ID N0: 14),incluindo sua seqüência de sinal de direcionamento de ER deaminoácido natural 18; 2) aminoácidos 2 a 530 da proteína HA deinfluenza H5 (posições 88 a 616 da SEQ ID N0:14), que faltava aseqüência de sinal de direcionamento de ER de terminal N de HA etambém excluiu os resíduos de terminal 36 C de HA1 assimeliminando sua âncora de membrana de terminal C e caudacitoplásmica; 3) um espaçador de triglicina para separar o corpo daproteína HA da marcação de histidina (posições 617 a 619 da SEQID N°:14); e 4) uma marcação de hexahistidina de terminal C(posições 620 a 625 da SEQ ID N°:14). Essa proteína, quandoexpressada nas células também expressa Agalp, localiza a paredecelular externa da célula de levedura, bem como o citosol e ER.Uma seqüência de ácido nucléico codificando a proteína de fusãoda SEQ ID N°:14 é aqui representada pela SEQ ID N°:13.

Esse Tarmogen foi expressado usandoambas as condições de pH neutro aqui descritas e sob condiçõesnormais de crescimento da levedura. Quando expressado usandoas condições de pH neutro, a proteína de fusão é detectada naparede celular (superfície). As condições de pH neutro aumentam aeficiência da expressão das proteínas e melhoram a capacidade dedetectar a presença da proteína na superfície devido aos efeitos depH na parede celular e a capacidade de anticorpos específicos deHA para detectar a proteína expressa de superfície.

Exemplo 5

O seguinte exemplo descreve a produção deconstruções adicionais em que os antígenos foram projetados paraserem direcionados à superfície da levedura (construçõesextracelulares).

Os Tarmogens adicionais foram projetadospara expressar a proteína de hemaglutinina (HA), da influenza comouma proteína de célula de superfície da levedura (extracelular). Asproteínas também são expresssadas de forma intracelular nalevedura. Com referência novamente ao painel superior da Fig. 10A,a construção para expressão de superfície é exemplificada.

A Fig. 10B esquematicamente ilustradiversas construções específicas para expressão de superfície doantígeno e mostra como as diversas proteínas de levedura podemser usadas como braços espaçadores. Enquanto as construçõesforam usadas para expressar influenza HA1 qualquer proteínapoderia ser expressada usando esses métodos e construções.

Proteína de Fusão Aoa2-HA H1 (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada TK75-15,mostrada esquematicamente na Fig. 10B (esquerda superior), foiprojetada para expressar a proteína HA de influenza na paredecelular usando a seqüência Aga2, acionada pelo promotor TEF2.

Nessa construção, a proteína foi construída com o terminal C deseqüência HA à seqüência Aga2. Essa proteína, quandoexpressada nas células que também expressam Agalp (nessecaso, acionada pelo promotor CUP1), localiza a parede celularexterna da célula de levedura, bem como o citosol, conformemostrado na Fig. 10B (esquerda superior). A proteína de fusãocompreendendo o antígeno HA de influenza é um único polipeptídiocom os seguintes elementos de seqüência fundidos em estrutura doterminal N ao C (a seqüência de aminoácido da proteína de fusãosendo aqui representada pela SEQ ID N°:36): 1) o comprimentototal da seqüência de proteína Aga2 de S. cerevisiae (posições 1 a87 da SEQ ID N°:36), incluindo sua seqüência de sinal dedirecionamento de ER de aminoácido natural 18 (posições 1 a 18da SEQ ID N°:36; 2) um espaçador para separar Aga2 do corpo deHA (posições 88 e 89); 3) proteína HA de influenza faltando suaseqüência de sinal (posições 90 a 600 da SEQ ID N°:36), e faltandoresíduos 36 terminal C-de HA1 assim eliminando sua âncora demembrana de terminal C e cauda citoplásmica; 4) uni espaçador detriglicina para separar o corpo da proteína HA da marcação dehistidina (posições 601-603 da SEQ ID N°:36); e 5) uma marcaçãode hexahistidina de terminal C (posições 604-609 da SEQ IDN°:36). Uma seqüência de ácido nucléico codificando a proteína defusão da SEQ ID N°:36 é aqui representada pela SEQ ID NO 35.Essa proteína de fusão e o Tarmogen expressando-a podem serdenominados como 75-15.

Proteína de Fusão HA H1-Aaa2 (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada VK4,mostrada esquematicamente na Fig. 10B (direita superior), foiprojetada para expressar a proteína HA de influenza na paredecelular usando a seqüência Aga2, acionada pelo promotor TEF2.Nessa construção, a proteína foi construída com o terminal-N deseqüência HA à seqüência Aga2. Essa proteína, quandoexpressada na levedura que também expressa o Agalp nativo(nesse caso, seu promotor nativo), localiza a parede celular externada célula de levedura, e também está presente de formaintracelular. A proteína de fusão compreendendo o antígeno HA deinfluenza (H1) é um único polipeptídio com os seguintes elementosde seqüência fundidos em estrutura do terminal-N ao C (aseqüência de aminoácido da proteína de fusão sendo aquirepresentada pela SEQ ID N°:26): 1) a seqüência de sinal dedirecionamento de ER Aga2 (aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID N°:26):2); 2) HA H1 de A/PR/8/34, faltando sua seqüência de sinal edomínio de transmembrana de terminal-C (posições 20 a 533 daSEQ ID N°:26); 3) um espaçador para separar o corpo da proteínaHA da marcação de histidina (posições 534 a 535 da SEQ IDN°:26); 4) uma marcação de hexahistidina (posições 536 a 541 daSEQ ID N°:26); 5) um local de clivagem de enteroquinase (posições542 a 548 da SEQ ID N°:26; 6) Aga2 faltando sua seqüência desinal (posições 549 a 614 da SEQ ID N°:26. Uma seqüência deácido nucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N°:26 éaqui representada pela SEQ ID N°:25.

Proteína de Fusão HA H5-Aaa2 (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada VK11,semelhante a VK4 acima descrita, exceto que inclui a proteína HAH5 da influenza aviária (A/Vietnam/1203/04), foi projetada paraexpressar a proteína de influenza HA H5 na parede celular usandoa seqüência Aga2. Nessa construção, a proteína foi construída como terminal-N para a seqüência HA à seqüência Aga2. Essa proteína,quando expressada na levedura, localiza a parede celular externada célula de levedura, e também está presente de formaintracelular. A proteína de fusão compreendendo o antígeno HA deinfluenza (H5) é um único polipeptídio com os seguintes elementosde seqüência fundidos na estrutura do terminal-N ao C (a seqüênciade aminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N°:22): 1) a seqüência de sinal de direcionamento de ER deAga2 (aminoácidos 1 a 19 da SEQ ID N°:22); 2) HA H5 deA/Vietnã/1203/04, faltando sua seqüência de sinal e domínio detransmembrana de terminal C (posições 20 a 536 da SEQ IDN°:22); 3) uma marcação de hexahistidina (posições 537 a 542 daSEQ ID N°:22); 4) um local de clivagem de enteroquinase (posições543 a 548 da SEQ ID N°:22; 5) Aga2 faltando sua seqüência desinal (posições 549 a 616 da SEQ ID N°:22. Uma seqüência deácido nucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N°:22 éaqui representada pela SEQ ID N°:21

Proteína de Fusão HA H1-Cwd2 (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada VK8,mostrada esquematicamente na Fig. 10B (esquerda inferior), foiprojetada para expressar a proteína HA de influenza na paredecelular usando a seqüência Cwp2, acionada pelo promotor TEF2.Essa proteína localiza a parede celular externa da célula delevedura, e também está presente de forma intracelular. A proteínade fusão compreendendo o antígeno HA de influenza (H1) é umúnico polipeptídio com os seguintes elementos de seqüênciafundidos na estrutura do terminal-N ao C (a seqüência deaminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N°:28): 1) a seqüência de sinal de invertase Suc2(aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID N°:28); 2) H1 HA de A/PR/8/34,faltando sua seqüência de sinal e domínio de transmembrana determinal-C (posições 22 a 535 da SEQ ID N°:28); 3) um espaçadorpara separar o corpo de proteína HA da marcação de histidina(posições 536 a 537 da SEQ ID N°:28); 4) uma marcação dehexahistidina (posições 538 a 543 da SEQ ID N°:28); 5) um local declivagem de enteroquinase (posições 544 a 549 da SEQ ID N°:28;6) Cwp2 faltando sua seqüência de sinal (posições 550 a 617 daSEQ ID N°:28. Uma seqüência de ácido nucléico codificando aproteína de fusão da SEQ ID N°:28 é aqui representada pela SEQID N°:27.

Proteína de fusão HÁ H5-Cwp2 (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada VK12,semelhante a VK8 acima descrita, exceto que inclui a proteína HAH5 da influenza aviária (A/Vietnã/1203/04), foi projetada paraexpressar a proteína de influenza HA H5 na parede celular usandoa seqüência Cwp2. Essa proteína localiza a parede celular externada célula de levedura, e também está presente de formaintracelular. A proteína de fusão compreendendo o antígeno HA deinfluenza (H5) é um único polipeptídio com os seguintes elementosde seqüência fundidos na estrutura de terminal-N ao C (a seqüênciade aminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N°:24): 1) a seqüência de sinal de invertase de Suc2(aminoácidos 1 a 21 da SEQ ID N°:24); 2) HA H5 daA/Vietnã/1203/04, faltando sua seqüência de sinal e domínio detransmembrana de terminal-C (posições 22 a 536 da SEQ IDN°:24); 3) um espaçador para separar o corpo da proteína HA damarcação de histidina (posições 537 a 538 da SEQ ID N°:24); 4)uma marcação de hexahistidina (posições 539 a 544 da SEQ IDN°:24); 5) um local de clivagem de enteroquinase (posições 545 a550 da SEQ ID N°:24); 6) Cwp2 faltando sua seqüência de sinal(posições 551 a 618 da SEQ ID N°:24. Uma seqüência de ácidonucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N°:24 é aquirepresentada pela SEQ ID N°:23.

Proteína de Fusão HA para Expressão deEsferoplasto (Superfície)

Uma proteína de fusão denotada Lu002,mostrada esquematicamente na Fig. 10B (direita inferior), foiprojetada para expressar a proteína HA de influenza com o domíniode transmembrana intacto na membrana plasmática de umesferoplasto de levedura, acionada pelo promotor TEF2. Essaproteína localiza a membrana plasmática do esferoplasto delevedura, e também está presente de forma intracelular.

A Fig. 11 ilustra outro Tarmogenexpressando a proteína de fusão acima mencionada como VK8 queexpressa a proteína HA de influenza na superfície da levedura via aproteína de parede celular 2 (cwp2). Os histogramas da expressãode superfície da levedura HA a partir da análise citométrica de fluxosão mostrados no canto direito inferior. Os histogramas indicam queessa construção específica expressa HA muito bem em sua célulasuperfície conforme comparado ao veículo de levedura sozinho (Gl-1001 ou YVEC).

As Figs. 12A-12G mostram os histogramasem que diversas abordagens (descritas acima e ilustradas na Fig.10B) foram utilizadas para expressar a proteína HA de influenza nasuperfície de veículos de levedura. Esses experimentos foram todosconduzidos sob condições normais de crescimento de levedura (istoé, condições de pH neutro não foram usadas). As Figs. 12A-12Cilustram a expressão pelos Tarmogens expressando VK4 e TK75-15, que usam o braço espaçador ou aglutinador Aga2, fundidos emduas diferentes orientações conforme acima discutido. A Fig. 12Amostra a expressão pela levedura (YEX) de controle (nãotransformada). A Fig. 12B mostra a expressão de YK4, e a Fig. 12Cmostra a expressão de TK75-15. As Figs. 12D-12G mostra outrasconfigurações possíveis para expressão de superfície de HA. A Fig.12D é novamente o controle de levedura (YEX). As Figs. 12E e 12Fmostram o Tarmogen expressando VK8, que usa Cwp2 como umbraço espaçador para expressão de HA. Essas figuras tambémilustram os efeitos para modular a glicosilação da levedura naexpressão da proteína. O Tarmogen expressando VK8 deglicosilado(Fig. 12F) melhorou a expressão de superfície de HA conformecomparado ao Tarmogen expressando VK8 glicosilado (Fig. 12E).Finalmente, a Fig. 12G mostra a expressão de HA pelo Tarmogenexpressando Lu002, que é um esferoplasto expressando HA namembrana plasmática.

Esses resultados demonstram que umavariedade de construções podem ser usadas para expressar deforma bem sucedida os antígenos na superfície (de formaextracelular) dos veículos de levedura da invenção.

Exemplo 6

O seguinte exemplo descreve a engenhariade outra vacina de levedura de proteína de fusão da influenza dapresente invenção, em que as combinações das proteínas deinfluenza são expressas de forma intracelular pelo veículo delevedura.

Um Tarmogen foi projetado para expressaras seqüências de proteína de matriz (M1), proteína denucleocapsídeo (NP) e proteína de canal de íon extracelular (M2e)como uma proteína intracelular de fusão sob o controle do promotorTEF2 (vide Fig. 13A, em que a expressão dessa proteína de fusão éilustrada junto com a expressão de uma segunda construção de HAno mesmo plasmídio). As seqüências de M1 e NP (N1) foramderivadas da cepa de influenza A/PR/8/34. A 4xM2e representaduas copies da seqüência M2e da cepa de influenza A/PR/8/34 eduas cópias da seqüência M2e da cepa de influenzaA/Vietnã/1203/2004. A proteína de fusão compreendendo a proteínaM1-N1-4x-M2e é um único polipeptídio com os seguintes elementosde seqüência fundidos em estrutura do terminal N ao C (aseqüência de aminoácido da proteína de fusão sendo aquirepresentada pela SEQ ID N0:16): 1) a seqüência MADEAP (SEQID N°:1) para conceder a resistência à degradação proteassomal(posições 1 a 6 da SEQ ID N°:16); 2) proteína de influenzaA/PR/8/34 M1 (posições 7 a 260 da SEQ ID N°:16); 3) umespaçador para separar a proteína M1 da proteína NP (posições261 a 262 da SEQ ID N°:16); 4) proteína NP de influenza A/PR/8/34(posições 263 a 760 da SEQ ID N0:16; 5) um espaçador paraseparar a proteína NP das proteínas M2e (posições 761 a 762 daSEQ ID N°:16); 6) uma primeira proteína M2e (extracelular) daproteína M2 de influenza A/PR/8/34 (posições 763 a 787 da SEQ IDN0:16); 7) uma segunda proteína M2e (extracelular) da proteína M2de influenza A/Vietnã /1203/2004 (posições 788 a 811 da SEQ IDN0:16); 8) um espaçador para separar a segunda proteína M2e daterceira proteína M2e (posições 812 a 813 da SEQ ID N°:16); 9)uma terceira proteína M2e (extracelular) da proteína M2 deinfluenza A/PR/8/34 (posições 814 a 838 da SEQ ID N0:16); 10)uma quarta proteína M2e consistindo em proteína (extracelular) daproteína M2 de influenza A/Vietnã /1203/2004 (posições 839 a 862da SEQ ID N°:16); e 11) uma marcação de hexahistidina de terminalC (posições 864 a 869 da SEQ ID N0: 16). Uma seqüência de ácidonucléico codificando a proteína de fusão da SEQ ID N0:16 é aquirepresentada pela SEQ ID N0:15.

Com referência à Fig. 13A e Fig. 13B, umailustração esquemática do uso de um Tarmogen expressando aproteína de fusão M1-NP-4xM2e (SEQ ID N0:16) em conjunto comuma construção adicional é mostrada. Especificamente, a proteínade fusão representada pela SEQ ID N0:16 também foi produzida emum único plasmídio que também contém uma segunda construçãocodificando um proteína HA sob o controle do promotor CUP1. Aexpressão desse plasmídio resulta na expressão intracelular daproteína M1-NP-4xM2e de fusão e proteína HA. A expressão de HAtambém pode ser realizada via o uso de uma segunda construçãoindependente. Os Tarmogens adicionais a serem produzidosincluem o uso da construção ilustrada na Fig. 13B (correspondenteà construção de VK8 acima descrita), que provoca a expressão daproteína HA extracelular (superfície). Essa proteína de fusão podeser expressada no mesmo Tarmogen com a proteína M1-N1-4x-M2e de fusão acima descrita, sozinha ou em combinação com aconstrução de HA internamente expressada acima descrita. UmTarmogen separado expressando a proteína de fusão VK8 (HA desuperfície) também poderia ser fornecido em uma vacina junto como Tarmogen expressando a proteína M1-N1-4x-M2e de fusão acimadescrita, sozinho ou em combinação com o HA internamenteexpressado. Uma vantagem para fornecer as proteínas separadasde fusão para expressão intracelular e extracelular é a de garantirque o antígeno suficiente esteja disponível para as respostas deambas as células B e captação pelo antígeno apresentando ascélulas, tais como, células dendríticas para respostas imunesmediadas por célula.Exemplo 7

O seguinte exemplo descreve a engenhariade outra vacina de levedura de proteína de fusão de influenza dapresente invenção, em que as combinações de proteínas deinfluenza são expressadas de forma intracelular pelo veículo delevedura.

Um Tarmogen foi produzido que expressauma proteína NP-2xM2e de fusão e um Tarmogen foi produzido queexpressa uma proteína NP-4xM2e de fusão.

A proteína NP-4xM2e de fusão é construídada mesma forma que a proteína M1-N1-4x-M2e de fusão descritano Exemplo 6 e representada pela SEQ ID N0:16, exceto que aporção de M1 da construção não é incluída.

Na proteína NP-2xM2e de fusão, o NP (N1) e2 cópias da seqüência M2e são todas da cepa de influenzaA/PR/8/34. A proteína de fusão compreendendo a proteína N1-2xM2e é um único polipeptídio com os seguintes elementos deseqüência fundidos na estrutura do terminal N ao C (a seqüência deaminoácido da proteína de fusão sendo aqui representada pelaSEQ ID N°:18): 1) a seqüência MADEAP (SEQ ID N0:1) paraconceder a resistência à degradação proteassomal (posições 1 a 6da SEQ ID N°:18); 2) proteína NP de influenza A/PR/8/34 (posições7 a 503 da SEQ ID N0:18; 3) um espaçador para separar a proteínaNP das proteínas M2e (posições 504 a 505 da SEQ ID N0:18); 4)uma primeira proteína M2e (extracelular) da proteína M2 deinfluenza A/PR/8/34 (posições 506 a 530 da SEQ ID N0: 18); 5) umespaçador para separar a primeira proteína M2e da segundaproteína M2e (posição 531 da SEQ ID N°:18); 6) uma segundaproteína M2e (extracelular) da proteína M2 de influenza A/PR/8/34(posições 532 a 555 da SEQ ID N0: 18); e 7) um espaçador detriglicina imediatamente seguido por uma marcação dehexahistidina de terminal C (posições 556 a 564 da SEQ ID N0: 18).Uma seqüência de ácido nucléico codificando a proteína de fusãoda SEQ ID N°:18 é aqui representada pela SEQ ID N°:17.

Essa proteína de fusão, expressada em umveículo de levedura para produzir um Tarmogen, é expressa deforma intracelular, e pode ser combinada com a expressão deoutras construções (isto é, uma estratégia de expressão desuperfície de HA ou interna de HA conforme discutida no Exemplo 6acima.

Exemplo 8

O seguinte exemplo demonstra que aimunização de um Tarmogen expressando HA de influenza comouma proteína extracelular prepara uma resposta imune humoral.

Nesse exemplo, a única dose de GI-8000-S,que expressa HA na célula de superfície da levedura como umaproteína de fusão com Cwp2 (vide Fig. 10B, VK8), foi administradaaos camundongos de forma subcutânea, ou os camundongos foraminfectados com uma baixa dose do vírus da gripe vivo de formaintravenosa. Uma semana após a imunização, as titulações de Hlforam medidas.

Outro grupo de camundongos receberam 5YU de GI-8000-S. Uma semana após a imunização, as titulações deHl foram medidas. Os resultados desse estudo são demonstradosna Tabela 5. Os dados demonstram que uma única dose da vacinade GI-8000-S é capaz de induzir a resposta de anticorponeutralizando HA sem a adição da proteína purificada solúvel, ousem a adição de uma vacina com base em não levedura.Tabela 5 GI-8000-S induz anticorpo de HA

<table>table see original document page 166</column></row><table>

Exemplo 9

Os Tarmogens expressando diversosantígenos de interesse foram usados para preparar a produção deanticorpo. Conforme infra discutido, a invenção aqui reveladafornece os métodos para induzir as respostas imunes humorais, queincluem respostas de anticorpo.

Um estudo foi realizado com GI-2001(HIVAX-1), que produz a proteína de envelope HIV-1 gp160 comouma proteína de membrana de célula de levedura integral(Franzusoff e outros, Quím. Biol. J. 270, 3154-3159 (1995)). Asanálises de Western blot do soro de camundongos que foraminjetados semanalmente por três semanas com 2 χ 107 (2 YU) dascepas de YVEC ou HIVAX-1 administradas como célula intactasvivas de levedura ou como esferoplastos foram realizadas comoIisados da levedura intacta ou esferoplastos. O Western blotdemonstrou que os camundongos produziram anticorpos para umavariedade de proteínas derivadas de levedura e que o padrão deanticorpos obtidos era dependente de se os camundongos foraminjetados com levedura intacta ou esferoplastos. Os soros decamundongos imunizados com esferoplastos H1VAX-1, porém nãolevedura intacta HIVAX-1 ou levedura YVEC ou esferoplastos,apareceram como contendo anticorpos específicos para gp160.

Sem ser obrigado pela teoria, esse achado foi provável devido àexpressão do gp160 em HIVAX-1 como uma proteína de membranaintegral, de modo que não exposta às células B na superfície dalevedura intacta, porém seria exposta na superfície externa dosesferoplastos.

Em contraste aos resultados obtidos comHIVAX-1, os soros de camundongos vacinados com OVAX1 umTarmogen produzindo ovalbumina de galinha demonstrou astitulações do anticorpo anti-OVA. Esse resultado apareceu comosendo devido ao fato de que a ovalbumina de galinha ser secretadapredominantemente no espaço periplasmático na cepa de leveduraOVAX e que alguma proteína solúvel é liberada através dasparedes celulares da levedura intacta. Dessa forma, a localizaçãode um antígeno heterólogo dentro da vacina recombinante combase em levedura apareceu para determinar se o anticorpo foiproduzido.

Para ainda investigar a capacidade dalevedura OVAX de induzir os anticorpos anti-OVA, os camundongosBALB/c foram vacinados uma vez ao mês por dois meses com osantígenos mostrados na tabela abaixo. Um mês após a segundavacinação, os camundongos foram vacinados com ovalbumina degalinha solúvel (sem adjuvante adicionado). Os camundongos quenão foram vacinados com PBS não construíram uma resposta deanticorpo anti-OVA após o único desafio com OVA solúvel no dia56. Em contraste, os camundongos que foram vacinados duasvezes com 2 χ 107 (2 YU) de levedura OVAX construíram umaresposta de anticorpo anti-OVA de alta titulação após estimular comOVA solúvel sem adjuvante adicionado. Esse estudo mostra queum efeito de economia de antígeno é atingido com Tarmogens demodo que as altas titulações dos anticorpos anti-OVA foramobservadas nos camundongos que foram imunizados com OVAXantes de estimular com OVA solúvel (um exemplo de uma vacinacom base em não levedura) ou co-administrados com OVAX eOVA-AIum antes de estimular com OVA solúvel, especialmenteapós uma única dose de OVAX mais OVA-Alum. As Figs. 14A e14B também ilustram os resultados para experimentossemelhantes.

Tabela 6 OVAX prepara uma resposta deanticorpo.

<table>table see original document page 168</column></row><table>

Com referência às Figs. 14A e 14B, osresultados da preparação de célula T (Fig. 14B) e produção deanticorpo (Fig. 14A) para três regimes usados são mostrados. NaFig. 14A, o Regime A (controle), em que somente PBS foiadministrado, mostra que nenhuma titulação de anticorpo específicade ovalbumina foi detectada quando o PBS foi usado paraestimular. No Regime B1 PBS foi administrado nos dias O e 28 parapreparação, e quando a proteína de ovalbumina solúvel (ova) foiusada para estimular no dia 56, nenhuma titulação de anticorpoespecífica de ovalbumina foi detectada até o dia 65. No Regime C,um veículo de levedura expressando ovalbumina (OVAX) foi usadopara preparar, e quando a proteína de ovalbumina solúvel foi usadapara estimular, uma rápida geração de altas titulações de anticorpofoi observada. A Fig. 14B mostra os resultados de um ensaio deativação da célula T usando diversas quantias da proteína deovalbumina solúvel para a nova estimulação in vitro das células Tcolhidas dos camundongos imunizados por cada um dos trêsregimes acima descritos. O Regime C foi eficaz para induzir asrespostas imunes mediadas por célula.

Exemplo 10

O seguinte exemplo demonstra que umTarmogen de produção de Gag prepara as células T ajudantesespecíficas de antígeno.

A finalidade do seguinte exemplo era a deaveriguar a capacidade de GI-2010, um Tarmogen produzindo aproteína HIV-1 Gag como uma proteína citoplásmica, para prepararas células T ajudantes específicas de antígeno para a produção deanticorpo. Os grupos de 5 camundongos BALB/c foram injetadoscom salina, 2 YU YVEC ou 2 YU GI-2010 (de forma subcutânea nosdias 0, 7, e 21) ou com 1 χ 107 pfu de controle MVA ou 1 χ 107 deMVA-UGD (vírus de Ancara de Vacina Modificada recombinantecodificando HIV-1 Gag; de forma intraperitoneal nos dias 0 e 21)..Os camundongos imunizados com salina ou levedura foramsubseqüentemente injetados com 5 μg de proteína p24 Gagrecombinante em salina (sem adjuvante) no dia 28. As titulações deanticorpo Anti-p24 Gag foram determinadas por ELISA dasamostras séricas de rato isoladas por todo o estudo. Os resultados,mostrados na Fig. 15, mostram que os camundongos que foramimunizados com GI-2010 não desenvolveram o anticorpo específicode p24 detectável, exceto se fossem estimulados com proteína Gagsolúvel. Conforme os anticorpos não foram produzidos porcamundongos injetados com salina ou YVEC1 esses dados indicamque o GI-2010 prepara as células T ajudantes nos camundongosvacinados para estimular as respostas de célula B obtidas pelaproteína Gag solúvel sem adjuvante.

Esse exemplo mostra que os Tarmogenspodem induzir as células T ajudantes para a produção de anticorpoe que a localização do antígeno dentro da levedura tem um papelimportante na quantia de anticorpo que é produzida. Por exemplo,os estudos indicam que a levedura expressando HBsAg como umaproteína da célula de superfície da levedura induz anticorpos anti-HBsAg. Vide, p.ex., M.P. e outros Vacina, 14(5):383-8 (1996).

Exemplo 11

O seguinte exemplo demonstra que umavacina com base em levedura da invenção possui um efeito deadjuvante quando mesclada com um preparo de antígeno com baseem não levedura.

Nesse experimento, GI-8002, um Tarmogenproduzindo HA A/PR/8/34 como uma proteína citoplásmica foiusado (vide Exemplo 2). Brevemente, os camundongos BALB/c (5por grupo) foram imunizados de forma subcutânea nos dias 1 e 22com 5 YU (5 χ 107) de células de levedura GI-8002 sozinho, com 1µg ou 10 µg do vírus de influenza desativado por BPL (A/PR/8/34)sozinho, ou com 5 YU de GI-15 8002 mais a quantia indicada dovírus de influenza desativado por BPL.

O soro foi coletado 4 semanas após asegunda dose, e os ensaios de Hl foram realizados para determinara presença dos anticorpos de neutralização.

Os resultados desse experimento mostramque a levedura possui um efeito adjuvante quando simplesmentemesclada com o vírus desativado por BPL para indução dosanticorpos de neutralização.

Tabela 7<table>table see original document page 171</column></row><table>

* Ν.D. = não determinado devido aosproblemas técnicos com sangramento retro-orbital.

A revelação de todas as patentes, pedidosde patentes e publicações aqui mencionados é ora incorporada porreferência em sua totalidade para todos os fins.

Referências

1. Kiyosawa e outros, Hepatoloaia 12 (1990):671 -675.

2. Tong e outros, NEJM 332 (1995):1463-1466.

3. Yano e outros,, Hematologia 23 (1996): 1334-1340.

4. Gordon e outros,, Hepatoloqia 28 (1998) 2:562-567.

5. Di Bisceglie e outros,, Hepatoloqia 14 (1991):969-974.

6. Koretze outros,, Med Intern An 119 (1993):110-115.

7. Mattson e outros,, Fígado 13 (1993):274~276.

8. Tremolada e outros,, Hepat. J 16 (1992):273-281.

9. Fattovich e outros,, Gastroenteroloaia 112 (1997):463-472.

10. Serfaty e outros, Hepatoloaia 27 (1998^:1435-1440.

11. Armstrong e outros,, Hepatologia 31 (2000):777-82.12. Shiratori e outros,, Anais de Medicina Interna. 142(2005): 105-114.

13. Yoshida e outros,, Grupo de Estudo IHIT (Inibição deHepatocarcinogênese por Terapia de lnterferon). Med Intern An 131(1999): 174-81.

14. Okanoue e outros,, Grupo de estudo de terapia dehepatite viral. Hepat. J. 30 (1999):653-9.

15. Shoukry e outros,, Microbiol. Rev. Anual 58 (2004):391-424.

16. Stubbs e outros, Med. Nat. 7 (2001):625-629.

17. Lu e outros,, Pesquisa de Câncer 64 (2004):5084-5088.

18. Haller. e outros,, Resumo, "Um novo produtoimunoterapêutico com base em levedura para infecção de vírus dahepatite C crônica". Reunião de AASLD. 4-5 de Março de 2005,Chicago1IL

19. Mondelli e outros,, Jornal de Hepatoloaia 31 (1999):65-70.

20. Dav e outros,. Jornal de Viroloaia (2002^:12584-12595.

21. Lauer e Walker, Jornal de Medicina da Nova Inglaterra345 (2001) 1:41-52.

22. Grakoui e outros,, Relatório de Maq. de Ciência 342(2003).

23. Yewdell e outros,, lmunol. Adv. 73 (1999); 1 -77.

24. Shoukry e outros,, O Jornal da Medicina Experimental197 (2003): 1645-1655.

25. Matzinqer. Ciência 296 (2002):301-305.

26. Falo e outros,, Med Nat. 1 (1995):649-53.

27. Kikuchi e outros,, Imunofarm. Int. 2 (2002):1503-1508.

28. Tada e outros,, Imunol. Microbiol. 46 (2002):503-512.29. Pichuantes e outros,, "Expressão dos produtos de geneheterólogo em levedura. In Engenharia de Proteína - Princípios ePrática. J. L. Cleland e C. S. Craik, editores." Wilev-Liss, New York(1996):129-162.

30. Underhill, Imunol. J. Eur. 33 (2003): 1767-1775.

31. Ozinsky e outros,, Ci. Acad. Nat. Proc. U S A. 97(2000): 13766-13771.

32. Akira e outros,, Imunol. Nat. 2 (2001 ):675-680.

33. Medzhitov e outros,, Ciência 296 (2002):298-300.

34. Gantner e outros, Med. Exp. J. 197 (2003):1107-1117.

35. Huang e outros,, Ciência. 294 (2001 ):870-875.

36. Savolainen e outros,, Alergia 53 (1998):506-512.

37. Mari e outros,, Alergia Exp. Clín. 33 (2003):1429-1438.

38. Kortekangas-Savolainen e outros,, Alergia Exp. Clín. 24(1994):836-842.

39. Belchi-Hernandez e outros,, Imunol. Clín. de Alergia 97(1996):131 34.

40. Dentico e outros., Epidemiol. J. Eur. 8 (1992):650-655.

41. Joossens e outros,, Gastroenterologia 122 (2002):1242-7.

42. Sandborn e outros,, Pis, de Intestino Inflamatório 7(2001): 192-201.

43. Ponton e outros,, Micologia Méd. 38 (2000):225-236.

44. Wheeler e outros,, Ci. Acad. Nat. Proc. U S A. 100(2003):2766-2770.

45. Haller e outros,, Vacina 25 (2007): 1452-1463

Pedido Provisório Norte-Americano N0 deSérie 60/765.025, depositado em 2 de fevereiro de 2006

Enquanto diversas configurações dapresente invenção foram descritas em detalhes, é aparente que asmodificações e adaptações dessas configurações ocorrerão paraaqueles com habilidade na técnica. Deve ser expressamenteentendido, entretanto, que tais modificações e adaptações estãodentro do escopo da presente invenção, conforme estabelecidosnas seguintes reivindicações.

Claims

1. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura; e b) uma proteína defusão do vírus de influenza que é expressado pelo veículo delevedura, a proteína de fusão do vírus de influenza, compreendendopelo menos uma porção de uma proteína de influenza selecionadaa partir do grupo consistindo em: uma proteína de matriz deinfluenza (M1) e uma proteína do canal de íon da influenza (M2).[Reivindicação Original 10]

2. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um primeiro veículo de levedura que expressa umaproteína de fusão do vírus de influenza compreendendo pelo menosuma porção de uma proteína de influenza selecionada a partir dogrupo consistindo em: uma proteína de matriz de influenza (M1),uma proteína do canal de íon da influenza (M2) e uma proteína denucleocapsídeo (NP); e b) pelo menos um veículo de leveduraadicional que expressa uma proteína de fusão do vírus de influenza,compreendendo pelo menos uma porção de uma proteína deinfluenza selecionada a partir do grupo consistindo em: umaproteína de hemaglutinina (HA) e uma proteína de neuraminidase(NA). [Reivindicação Original 11]

3. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura; e b) uma proteína defusão do vírus de influenza que é expressado pelo veículo delevedura, a proteína de fusão do vírus de influenza compreendendopelo menos uma porção de pelo menos uma primeira proteína deinfluenza selecionada a partir do grupo consistindo em: umaproteína de matriz de influenza (M1), uma proteína do canal de íonda influenza (M2) e uma proteína de nucleocapsídeo (NP); e pelomenos uma porção de pelo menos uma segunda proteína deinfluenza selecionada a partir do grupo consistindo em: umaproteína de hemaglutinina (HA) e uma proteína de neuraminidase(NA). [Reivindicação Original 12]

4. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura; b) uma primeira proteínade fusão do vírus de influenza que é expressado pelo veículo delevedura, a primeira proteína de fusão do vírus de influenzacompreendendo pelo menos uma porção de pelo menos umaproteína de influenza selecionada a partir do grupo consistindo em:uma proteína de matriz de influenza (M1), uma proteína do canal deíon da influenza (M2) e uma proteína de nucleocapsídeo (NP); e c)uma segunda proteína de fusão do vírus de influenza que éexpressa pelo veículo de levedura, a segunda proteína de fusão dovírus de influenza compreendendo pelo menos uma porção de pelomenos uma proteína de influenza selecionada a partir do grupoconsistindo em: uma proteína de hemaglutinina (HA) e uma proteínade neuraminidase (NA). [Reivindicação Original 13]

5. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura; e b) pelo menos umaporção de pelo menos uma primeira proteína do vírus de influenzaselecionada a partir do grupo consistindo em: uma proteína dematriz de influenza (M1), uma proteína do canal de íon da influenza(M2) e uma proteína de nucleocapsídeo (NP); e c) pelo menos umaporção de pelo menos uma segunda proteína de influenzaselecionada a partir do grupo consistindo em: uma proteína dehemaglutinina (HA) e uma proteína de neuraminidase (NA).[Reivindicação Original 14]

6. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína HAé selecionada a partir do grupo consistindo em: H1, H2, H3, H4, H5,H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e H16.[Reivindicação Original 15]

7. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína NAé selecionada a partir do grupo consistindo em: N1, N2, N3, N4, N5,N6, N7, N8 e N9. [Reivindicação Original 18]

8. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína M1é intracelular com relação ao veículo de levedura. [ReivindicaçãoOriginal 20]

9. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína M2é intracelular, extracelular, ou tanto intracelular quanto extracelularcom relação ao veículo de levedura. [Reivindicação Original 21]

10. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína M2é M2e. [Reivindicação Original 22]

11. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteínaNP é intracelular com relação ao veículo de levedura.[Reivindicação Original 23]

12. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína HAou a proteína NA é extracelular com relação ao veículo de levedura.[Reivindicação Original 24]

13. "A VACINA" da Reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que a proteína HA ou proteína NA étambém intracelular com relação ao veículo de levedura.[Reivindicação Original 25]

14. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a proteína defusão do vírus de influenza compreende em seu terminal N aseqüência de aminoácido representada por SEQ ID N0:1(MADEAP). [Reivindicação Original 26]

15. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura; e b) uma proteína defusão do vírus de influenza selecionada a partir do grupoconsistindo em: i) uma proteína de fusão compreendendo umantígeno M1 que é expressado como uma única proteína de fusãointracelular pelo veículo de levedura, a proteína de fusãoconsistindo na SEQ ID N°:4. ii) uma proteína de fusãocompreendendo um antígeno H1 que é expressado como umaúnica intracelular proteína de fusão pelo veículo de levedura, aproteína de fusão consistindo em uma seqüência de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo em: SEQ ID N°:6 e SEQID N°:20; iii) uma proteína de fusão compreendendo um antígenoH1 que é expresso como uma única proteína de fusão extracelularpelo veículo de levedura, a proteína de fusão consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindoem: SEQ ID N0: 10, SEQ ID N°:26, SEQ ID N°:28 e SEQ ID N°:36;iv) uma proteína de fusão compreendendo um antígeno H5 que éexpressado como uma única proteína de fusão extracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo em umaseqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindoem: SEQ ID N°:14, SEQ ID N°:22 e SEQ ID N°:24; v) uma proteínade fusão compreendendo um antígeno M1, um antígeno N1 equatro antígenos M2e que são expressados como uma únicaproteína de fusão intracelular pelo veículo de levedura, a proteínade fusão consistindo na SEQ ID N0: 16; vi) uma proteína de fusãocompreendendo um antígeno N1 e dois antígenos M2e que sãoexpressados como uma única proteína de fusão intracelular peloveículo de levedura, a proteína de fusão consistindo na SEQ ID N0:18; e vii) uma proteína de fusão compreendendo um antígeno H3 eum antígeno N2 que são expressados como uma única proteína defusão extracelular pelo veículo de levedura. [ReivindicaçõesOriginais 29-35]

16. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um primeiro veículo de levedura compreendendopelo menos um antígeno intracelular heterólogo; e; b) um segundoveículo de levedura compreendendo pelo menos um antígenoextracelular heterólogo. [Reivindicação Original 1]

17. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um primeiro veículo de levedura compreendendopelo menos um antígeno intracelular heterólogo e pelo menos umantígeno extracelular heterólogo; e b) um segundo veículo delevedura compreendendo pelo menos um antígeno intracelularheterólogo ou pelo menos um antígeno extracelular heterólogo.[Reivindicação Original 2]

18. "UMA VACINA", caracterizada porcompreender: a) um veículo de levedura compreendendo pelomenos um antígeno intracelular heterólogo e pelo menos umantígeno extracelular heterólogo; e b) uma composição com baseem não-levedura compreendendo pelo menos um antígenocompreendido pelo veículo de levedura de (a) ou um antígeno domesmo patógeno ou doença, caracterizada pelo fato de que, acomposição com base em não-levedura é selecionada a partir dogrupo consistindo em uma vacina de DNA, uma vacina de sub-unidade de proteína, e um patógeno neutralizado ou desativado.[Reivindicação Original 3]

19. "A VACINA" da Reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que o veículo de levedura de (a) éformulado para liberação por uma via diferente de administração doque a composição com base em não-levedura de (b).[Reivindicação Original 4]

20. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o antígenointracelular é um antígeno que é expresso internamente por umpatógeno. [Reivindicação Original 5]

21. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o antígenoextracelular é um antígeno que é estruturalmente conservado entreos patógenos do mesmo tipo. [Reivindicação Original 6]

22. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o antígenoextracelular é um antígeno que é expressado na superfície de umpatógeno. [Reivindicação Original 7]

23. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o antígenoextracelular é um antígeno que é estruturalmente variável entre ospatógenos do mesmo tipo. [Reivindicação Original 8]

24. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que o antígenoé de um patógeno infeccioso. [Reivindicação Original 9]

25. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que pelo menosuma de uma das proteínas ou antígenos é uma proteína de fusãocompreendendo pelo menos uma porção de uma proteína suficientepara direcionar uma proteína de fusão à parede celular do veículode levedura. [Reivindicações Originais 27 e 28; página deespecificação 44, linhas 21-30, com relação a tais proteínas sendoassociadas com qualquer anilgeno]

26. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que a expressãodo antígeno está sob o controle de um promotor induzível.[Reivindicação Original 36]

27. "A VACINA" da Reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o promotor é selecionado a partir dogrupo consistindo em CUP1 e TEF2. [Reivindicação Original 37]

28. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que o veículo delevedura é selecionado a partir do grupo consistindo em umalevedura inteira, um esferoplasto de levedura, um citoplasto delevedura, um preparo de parede celular de levedura, e um extratode membrana de levedura sub-celular ou fração do mesmo.[Reivindicação Original 38]

29. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o veículo delevedura é de uma levedura não-patogênica. [Reivindicação Original 41]

30. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 28, caracterizada pelo fato de que o veículo delevedura é de uma levedura selecionada a partir do grupoconsistindo em: Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Kluveromyces, Hansenula, Candida e Pichia. [ReivindicaçãoOriginal 42]

31. "A VACINA" da Reivindicação 30,caracterizada pelo fato de que a Saccharomyces é a S. cerevisiae.[Reivindicação Original 43]

32. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 31, caracterizada pelo fato de que a vacinaainda compreende uma célula dendrítica, caracterizada pelo fato deque a célula dendrítica foi carregada de forma intracelular com oveículo de levedura. [Reivindicação Original 44]

33. "A VACINA" de qualquer uma dasReivindicações 1 a 32, caracterizada pelo fato de aindacompreender pelo menos um modificador de resposta biológica.[Reivindicação Original 45]

34. O USO DA VACINA" de qualquer umadas Reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo uso no preparo deuma formulação para obter uma resposta imune específica deantígeno. [Reivindicação Original 46]

35. O USO DA VACINA" de qualquer umadas Reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo uso no preparo deuma formulação para tratar ou prevenir uma doença ou condição.[Reivindicação Original 49]

36. O USO DA VACINA" de qualquer umadas Reivindicações 1 a 15 ou 25 a 33, caracterizada pelo uso nopreparo de uma formulação para induzir uma resposta imuneespecífica de antígeno, mediada por célula, contra um antígeno deinfluenza. [Reivindicação Original 48]

37. O USO DA VACINA" de qualquer umadas Reivindicações 1 a 15 ou 25 a 33, caracterizada pelo uso emuma formulação para proteger um animal contra infecção deinfluenza. [Reivindicação Original 47]

38. "O USO DA VACINA" de qualquer umadas Reivindicações 1 a 15 ou 25 a 33, caracterizada pelo uso nopreparo de uma formulação para imunizar uma população deindivíduos no risco para tornar-se infectada com influenza, ou paratratar uma população de indivíduos que está infectada cominfluenza. [Reivindicação Original 50 e 51]

39. "UM MÉTODO" para produzir umacomposição de modo a obter uma resposta imune mediada porcélula e/ou humoral contra um ou mais antígenos, caracterizadopor compreender: a) transfecção de uma célula de levedura ouesferoplasto de levedura com uma molécula de ácido nucléicocodificando um antígeno ou domínio imunogênico do mesmo,caracterizada pelo fato de que o antígeno ou domínio imunogênicodo mesmo é expresso de forma intracelular pelo veículo delevedura, e transfecção adicional da célula de levedura com umamolécula de ácido nucléico heteróloga codificando uma proteína defusão compreendendo um antígeno ou domínio imunogênico domesmo, caracterizada pelo fato de que uma proteína de fusão aindacompreende uma proteína que direciona o antígeno ou domínioimunogênico do mesmo à parede celular do veículo de levedura; eb) preparo da composição ao preparar o veículo de levedura a partirda célula de levedura, [especificação: página 18, linhas 14-19;página 19, linhas 10-13; página 27, linhas 24-29; página 35, linhas- 1-3 e 11-22; página 41, linhas 21-30; e página 49, linhas 4-19]

40. "UM KIT" para obter uma respostaimune mediada por célula, uma resposta imune humoral, ou umacombinação das mesmas em um indivíduo, o kit compreendendouma pluralidade de veículos de levedura, caracterizada pelo fatode que cada um dos veículos de levedura compreende pelo menosum antígeno intracelular heterólogo ou pelo menos um antígenoextracelular heterólogo, e instruções para uso dos veículos delevedura para preparar a formulação. [Reivindicação Original 85]