DE69232962T3

DE69232962T3 - Influenzaimpfstoff der als synergistisches zusatzmittel influenzavirus-innenkörper enthält

Info

Publication number: DE69232962T3
Application number: DE69232962T
Authority: DE
Inventors: Catherine Moste-Deshairs; Bernard Meignier
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1991-01-24
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2012-01-25
Also published as: AU654699B2; IL100765A; FR2671974A1; WO1992013002A1; NZ241398A; EP0522138B1; DE69232962D1; IL100765A0; DE69232962T2; CA2078985C; EP0522138B2; ZA92510B; ATE234861T1; AU1248792A; FR2671974B1; EP0522138A1; CA2078985A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Impfzubereitung gegen Grippe.
Das Grippevirus besteht aus einer Lipoproteinhülle, die einen Nukleoproteinkern umgibt. Die Hülle enthält insbesondere zwei Glykoproteine, das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA). Der Kern ist eine komplexe Anordnung von viraler Ribonukleinsäure und mehreren sogenannten "internen" Proteinen (Polymerasen, Membranprotein (M) und Nukleoprotein (NP)).
Es ist bekannt, dass die anti-grippale Vakzination derzeit, selbst herkömmlich verabreicht, die Gesamtheit der Geimpften nicht vollständig schützt; siehe z.B. Murphy und Webster, in "Virology", 2. Ausgabe (Fields et al. Eds) 1091-1152 (1990), insbesondere Seite 1128.
Folglich ist es wünschenswert, die vorhandenen Vakzine zu verbessern.
Die derzeit verwendeten anti-grippalen Vakzine sind inaktivierte Vakzine; sie können aus vollständigen Virionen bestehen oder auch aus Virionen, die einer Behandlung mit fettlösenden Mitteln unterzogen werden ("getrennte" Vakzine, im Französischen auch "fraktionierte Vakzine" genannt), oder auch aus gereinigten Glykoproteinen (Vakzine "aus Untereinheiten"). Diese inaktivierten Vakzine schützen hauptsächlich, indem sie bei den Empfängern die Synthese von Antikörpern, die gegen Hämagglutinin gerichtet sind, anregen. Es ist bekannt, dass die Antigenentwicklung des Grippevirus durch Mutation hauptsächlich aus den Modifikationen von HA und NA resultiert, während die inneren Proteine wenig verändert wird. Daraus folgt, dass die derzeit verwendeten inaktivierten Vakzine nur wirksamen Schutz gegenüber den Stämmen verleihen, deren Oberflächenglykoproteine identisch oder von den Antigeneigenschaften her denen der Vakzin-Stämme sehr verwandt sind. Um ein ausreichendes Antigenspektrum zu erreichen, werden die Vakzine ausgehend von verschiedenen Virus- stämmen gewonnen; sie enthalten im allgemeinen 2 Stämme vom Typ A und einen Stamm vom Typ B. Um die Vakzin-Zubereitung der Antigenentwicklung der Grippeviren anzupassen, wird die Wahl der die Vakzine bestimmenden Stämme jährlich gemäß den Empfehlungen der WHO (World Health Organisation) und der FDA (Food and Drug Administration) überarbeitet, wobei diese Empfehlungen auf den Ergebnissen einer internationalen epidemiologischen Überwachung basieren. Es ist bekannt, dass die empfohlenen viralen Stämme insbesondere bei folgenden Organisationen bezogen werden können:

– NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, London, UK)
– WIC (World Influenza Center, London, UK)
– CDC (Center for Diseases Control, Atlanta, USA)
– CBER (Comity of Biological Evolution and Research, Washington, USA)

Man hat inzwischen herausgefunden, dass es möglich ist, eine Impfzubereitung mit synergistischer Wirkung zu erhalten, wenn man mit einem klassischen anti-grippalen Vakzin, vollständigen Virionen oder einem klassischen fraktionierten anti-grippalen Vakzin, den Kern eines Grippevirus oder eine aktive Fraktion des Kerns verbindet. Eine aktive Fraktion eines Kerns ist eine Fraktion, die, als Additiv bei einem klassischen anti-grippalen Vakzin verwendet, den Impfeffekt des Vakzins verbessert. Was hier unter dem Begriff "Verbesserung" verstanden wird, wird nachfolgend genauer erklärt.
Des Weiteren kann ein Schutz gegen Untereinheiten des in der Herstellung der Verbindungen des Vakzins (klassisches Vakzin + Kern oder Fraktion des Kerns) nicht verwendeten Virus erreicht werden.
Der Artikel von Webster et al., J. Immunol., Band 119, Nr. 6, 2073-2077 (1977) schlägt vor, um Abhilfe für die niedrige Wirksamkeit der Vakzine aus Untereinheiten während einer ersten Vakzination zu schaffen, sie an Vakzine mit vollständigem Virus zu binden, diese Bindung führt zu einer Erhöhung der Antikörper-Response. Somit beschreibt dieses Dokument die Verbindung zweier "klassischer" Vakzine, definiert wie in dem vorliegenden Anspruch.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Impfzubereitung gegen Grippe, enthaltend ein klassisches, antigrippales Vakzin, vollständige Virionen oder ein klassisches fraktioniertes anti-grippales Vakzin und enthaltend zusätzlich als Additiv isolierte Kern-Partikel von min destens einem Stamm des Grippevirus und/oder einer isolierten Fraktion des Kerns, wobei diese Zubereitung wie in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist.
Das klassische Vakzin, das den ersten Bestandteil der erfindungsgemäßen Impfzubereitung bildet, kann ein Vakzin mit vollständigen Virionen, oder ein getrenntes Vakzin sein. Es kann ausgehend von einem Virus, kultiviert in Embryonen aufweisenden Hühnereiern oder auf Zellen gewonnen werden.
Diese klassischen Vakzine können gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden, die z.B. von Murphy und Webster, oben genanntes Werk, in Erinnerung gerufen werden. Weitere Präzisionen werden nachfolgend gegeben.
Vakzin aus vollständigen Virionen: Es kann durch folgendes Verfahren hergestellt werden: Das Grippevirus, erhalten durch Kultur in Embryonen aufweisenden Hühnereiern oder durch Kultur auf Zellen, wird durch Ultrafiltration konzentriert, danach durch zonale Zentrifugation oder Chromatographie gereinigt. Es wird vor oder nach Reinigung inaktiviert, beispielsweise durch die Wirkung von Formol oder Betapropiolacton.
Getrenntes Vakzin: Es kann wie folgt hergestellt werden: Eine wässrige Suspension des gereinigten Virus, gewonnen wie oben beschrieben, inaktiviert oder nicht, wird unter Rühren durch Fettlösungsmittel wie z.B. Ethylether oder Chloroform, verbunden mit Detergentien, behandelt. Die Auflösung der Lipide aus der viralen Hülle führt dazu, die viralen Partikel zu fragmentieren. Man erhält die wässrige Phase, die das getrennte Vakzin enthält, hauptsächlich aus Hämagglutinin und Neuraminidase bestehend, ohne deren ursprüngliche Fettumgebung, ebenso wie aus dem Kern oder Abbauprodukten davon. Danach fährt man mit der Inaktivierung der rückständigen infektiösen Partikel fort, sofern nicht bereits geschehen. Man kann beispielsweise auf analoge Weise, wie in dem französischen Patent 2 201 079 (siehe insbesondere Beispiel 1) beschrieben, vorgehen.
Die klassischen Vakzine enthalten im Allgemeinen 10 bis 15 μg Hämagglutinin von jedem der Stämme, die in deren Zubereitung eingehen.
Das klassische anti-grippale Vakzin, das den ersten Bestandteil der erfindungsgemäßen Impfzubereitung bildet, kann aus einem Virus des Typs A, B oder C stammen oder zumindest aus zweien dieser drei Typen. Dasselbe gilt für den Kern oder für die Fraktion des Kerns.
Der Kern oder die Kernfraktion kann, ausgehend vom Virus desselben Stammes wie der erste Bestandteil der Zubereitung, hergestellt werden, oder ausgehend von verschiedenen Stämmen, die entweder einem unterschiedlichen Typ angehören können (oder auch im Fall von Typ A einem unterschiedlichen Untertyp) oder, im Inneren desselben Typs oder Untertyps, aus verschiedenen Isolaten oder aus unterschiedlichen Zusammensetzungen bestehen können.
Die Nomenklatur der Grippeviren und deren Klassifikation in Typen und Untertypen sind beispielsweise im WHO Bull. 58, 585-591 (1980) ebenso wie in Murphy und Webster, oben erwähntes Werk, beschrieben. Es ist insbesondere bekannt, dass der Typ A die Untertypen H1N1, H2N2 und H3N2 beinhaltet.
In der erfindungsgemäßen Zubereitung sind der erste und der zweite Bestandteil, d.h. das klassische Vakzin und das Additiv, in ein und demselben Behälter vereinigt.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann die ersten oder zweiten Bestandteile enthalten, vereinigt als Suspension in einem geeigneten flüssigen Träger.
Die beiden vereinigten Bestandteile der erfindungsgemäßen Impfzubereitung können auch in lyophilisierter Form vorliegen. Zum Zeitpunkt der Verwendung stellt man nunmehr die flüssige Zubereitung durch Vermengung mit einem gebräuchlichen flüssigen Träger wieder her.
Die erfindungsgemäße Zubereitung liegt im Allgemeinen in Form von Einheits-Vakzindosen vor, bestehend aus einer Vakzindosis des Gemischs aus beiden Bestandteilen.
Der zweite Bestandteil der erfindungsgemäßen Zubereitung (Kern) kann gemäß den bekannten Methoden gewonnen werden und insbesondere durch Behandlung des Grippevirus mit Hilfe einer Protease wie z.B. Bromelain. Eine derartige Behandlung ermöglicht es, die Hüllproteine von den Kern-Partikeln zu trennen; siehe z.B. Brand und Skehel, Nature, New Biology, Band 138, 14-147, 1978.
Man kann auch weitere Enzyme mit ähnlicher Wirkung wie die von Bromelain verwenden.
Der zweite Bestandteil der erfindungsgemäßen Impfzubereitung kann ebenso aus einer aktiven Fraktion des Kerns des Grippevirus bestehen, wobei diese Fraktion eine Protein- oder Lipoproteinfraktion ist, die mindestens ein aktives Protein des Kerns (insbesondere das Protein M), oder auch ein aktives Fragment dieses Proteins beinhaltet. Man bezeichnet mit dem Ausdruck "aktives Protein" oder "aktives Fragment" oder "aktive Fraktion" ein Protein oder ein Fragment dieses Proteins, oder eine Kernfraktion, die an dem durch das Vakzin induzierten Schutz teilhaben kann, wie z.B. die Kern-Partikel selbst. Die Fragmente oder aktiven Fraktionen können mit einfachen Routineversuchen bestimmt werden, indem man Fragmente oder Fraktionen gewinnt, die, in Verbindung mit dem ersten Bestandteil der Impfzubereitung, derjenigen, die mit dem ersten Bestandteil alleine (klassisches Vakzin) gewonnen wurde, einen höheren Schutz verleihen.
Man wird feststellen, dass das Protein NP alleine keine aktive Fraktion im gegebenen Sinn bei dem vorliegenden Anspruch darstellt. Die Verbindung (M + NP) bildet eine aktive Fraktion, wobei sie die Aktivität des Proteins M, das sie enthält, in deutlichem Maße besitzt.
Die Kernfraktionen, darin inbegriffen ein Kernprotein oder die Fragmente dieses Proteins, insbesondere ein Protein M können entweder durch Kultur des Virus und durch Extraktion, oder durch Verfahren der Gentechnologie, oder durch Peptidsynthese gemäß an sich bekannter Verfahren hergestellt werden.
Der zweite Bestandteil (Additiv) des erfindungsgemäßen Vakzins ist insbesondere ein Protein M oder Membranprotein, auch Matrixprotein genannt. Es ist bekannt, dass es zwei Matrixproteine gibt, die eine Rolle spielen im Gefüge des Virus während dessen Replikation: das Protein M1, das zur Struktur des Virus gehört, und das Protein M2, das im vollständigen Virus entdeckt wurde, aber von dem ein wichtiger Anteil nicht in das reife Virus integriert ist. In dem vorliegenden Anspruch bezeichnet der Ausdruck "Protein M" das Hauptmatrixprotein in dem vollständigen Virus, d.h. das Protein M1, ggf. im Gemisch mit weiteren Kernproteinen oder Kernfraktionen.
Eine Kernfraktion, die das Protein M beinhaltet und das Additiv zum Vakzin gemäß der Erfindung bilden kann, kann gemäß bekannter Techniken der Proteinseparation und Proteinreinigung hergestellt werden; man kann beispielsweise ein analoges Verfahren wie das von RUIGROK et al., Virology, 173, 311-316 (1989) beschrieben, verwenden.
Dieses Verfahren besteht hauptsächlich:

– aus der Behandlung einer Suspension des Kerns mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels, beispielsweise eines nicht ionischen oberflächenaktiven Mittels, bei einer ausreichenden Konzentration und einem ausreichend sauren pH-Wert, um die Abtrennung der Proteine M und NP im folgenden Schritt zu favorisieren,
– aus Unterwerfen der so behandelten Lösung einer Zentrifugation mit ausreichender Geschwindigkeit, damit sich das Protein NP und ggf. rückständige Kern-Partikel im Zentrifugationsniederschlag akkumulieren, wobei das Protein M im Überstand verbleibt,
– aus Abtrennen des Zentrifugationsniederschlags und Sammeln des Überstandes,
– und aus Konzentrieren, falls gewünscht, des Überstandes zum Erhalt einer Lösung (Kernfraktion), die ein Additiv für eine erfindungsgemäße Impfzubereitung bildet.

Das verwendete nicht ionische oberflächenaktive Mittel ist beispielsweise ein polyethoxyliertes Alkylphenol wie Triton X 100 (Rohm & Haas), ein polyethoxylierter Fettalkohol wie Brij 36 T (Sigma) oder ein Alkylosid wie Octyl-beta-D-glucopyranosid (oder Octylglucosid, vertrieben von Sigma).
Der die Abtrennung der Proteine M und NP während des Schritts der Zentrifugation favorisierende saure pH-Wert liegt beispielsweise bei ca. 4,8. Die Zentrifugation wird beispielsweise bei 85000 g 90 Minuten lang durchgeführt.
Der Schritt der endgültigen Konzentration des Überstandes kann insbesondere durch Ultrafiltration durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 10000 Dalton. Der Faktor der Konzentration, beispielsweise im Bereich von 10 bis 20, wird offensichtlich so ausgewählt, dass das Additiv in einer wirksamen Menge vorliegt, in einem mit der Verabreichung als Vakzin kompatiblen Volumen. Sofern erforderlich, kann man des Weiteren das Detergens beispielsweise durch Dialyse eliminieren.
Der auf diese Weise erhaltene, ggf. konzentrierte Überstand kann in einer ausreichenden Menge, um eine Verbesserung der Vakzination zu erhalten, als Additiv verwendet werden. Man kann die Menge dieses Additivs beispielsweise evaluieren, indem man sie auf die Menge des Proteins M, die sie enthält, rückbezieht.
Der Nachweis und die Dosierung des Protein M können beispielsweise mit Hilfe spezifischer Antikörper gemäß klassischer immunologischer Techniken durchgeführt werden, z.B. einem ELISA Test (enzyme linked immunosorbent assay), wie nachfolgend genauer beschrieben.
Die Kernfraktionen können ebenso entfettete Kern-Partikel sein, die durch sorgfältige Behandlung des Virus mit mindestens einem oberflächenaktiven Mittel, im Allgemeinen in schwacher Konzentration verwendet, beispielsweise nicht ionische oberflächenaktive Mittel (wie diejenigen, vertrieben unter der Bezeichnung NONIDET P40 oder TRITON X100) oder gewisse kationische oberflächenaktive Mittel (wie beispielsweise Hexadecyltrimethylammoniumbromid) gewonnen werden. Die geeigneten Konzentrationen können in jedem Fall durch Routineversuche bestimmt werden: Es handelt sich dabei um Konzentrationen, die den Kern in Form von Partikeln weiter bestehen lassen; siehe z.B. Bachmayer, Virology 69 511-588, 1976, und Rigg et al., J. Gen. Virol. 70, 2097-2109 (1989).
Die entfetteten Kerne können wiederum getrennt und/oder gereinigt werden gemäß gebräuchlicher Verfahren, insbesondere durch Zentrifugation.
Sofern das Additiv zum erfindungsgemäßen Vakzin in Form von Kern-Partikeln vorliegt, kann es sich folglich um Kern-Partikel handeln, die durch die Wirkung von Bromelain (oder ähnlichem) und/oder von entfetteten Kern-Partikeln erhalten wurden. In beiden Fällen handelt es sich um Partikel, die deutlich hämagglutinin- und neuraminidasefrei sind.
Die erfindungsgemäße Impfzubereitung kann bei Mensch und Tier, die Grippe bekommen können, verabreicht werden, insbesondere bei Pferde-, Schweine- und Vogelarten. Die Dosen der zu verabreichenden Zubereitung sind die für diese Art von Vakzin gebräuchlichen Dosen und können ggf. beim Tier im einzelnen Fall durch Routineversuche bestimmt werden.
Beispielsweise werden im Allgemeinen die Einheitsdosen für den ersten Bestandteil (klassisches Vakzin) durch ihren Gehalt an Hämagglutinin definiert. Sie entsprechen für jeden dieser 3 Typen von Vakzinen (Vakzin aus vollständigem Virion, Vakzin aus Untereinheiten und getrenntes Vakzin) im Allgemeinen 1-20 μg, insbesondere 5-20 μg, beispielsweise 10-15 μg Hämagglutinin von jedem der Impfstämme, die diese zusammensetzen.
Diese Mengen an Hämagglutinin können gemäß dem Verfahren der radialen Immunodiffusion gemessen werden, beschrieben von Wood et coll, Journal of Biological Standardization, 5, 237-247 (1977).
Die Menge des Additivs in der erfindungsgemäßen Impfzubereitung ist eine wirksame vorbestimmte Menge, die ausreicht, um bei der betroffenen tierischen An eine statistisch bedeutsame Verbesserung der Wirksamkeit der Vakzination hervorzurufen.
Die Menge des zu verwendenden Additivs mit einer Einheitsdosis des Vakzins ist beispielsweise eine Menge, die ausreicht, um statistisch eine Verbesserung von mindestens 5%, und insbesondere von mindestens 10% der Wirksamkeit der Vakzination zu erreichen, evaluiert nach mindestens einem bekannten Kriterium für die Wirksamkeit der Vakzination. Die Wirksamkeit der Vakzination kann beispielsweise durch epidemiologische Studien an mit einem klassischen antigrippalen Vakzin, vollständigen Virionen oder einem klassischen fraktionierten anti-grippalen Vakzin und mit einem klassischen antigrippalen Vakzin, vollständigen Virionen oder einem klassischen fraktionierten anti-grippalen Vakzin und Additiv geimpften Populationen und ggf. an nicht geimpften Populationen bestimmt werden. Die Kriterien für die Anerkennung der Wirksamkeit der Vakzination sind diejenigen, die gängigerweise von Spezialisten bei diesem Typ von Studien verwendet werden und insbesondere:

– die Anzahl der geimpften, von einer grippalen Erkrankung betroffenen Individuen im Verhältnis zur Gesamtzahl der geimpften Individuen in einer Region, in der sich tatsächlich eine Grippeepidemie entwickelt hat;
– oder die Schwere oder die Dauer der grippalen Erkrankung,
– oder die Zahl, die Schwere und die Dauer der Komplikationen,
– oder der Schutz gegen einen Untertyp, anders als der oder die Untertypen der Bestandteile des Vakzins (klassisches Vakzin + Additiv).
– oder auch die Verbesserung der Qualität des Vakzins kann evaluiert werden über eine bedeutsame Erhöhung der Immunresponse, geschätzt beispielsweise durch den Prozentsatz der serumumgewandelten Testpersonen, durch die Zahl der Antikörper, die gegen das Grippevirus oder dessen Bestandteile gerichtet ist oder auch durch Tests, die die Immunresponse des zellulären Typs beim Grippevirus oder bei dessen Bestandteilen messen.

Bei gewissen Arten, insbesondere bei Labortieren, oder Freiwilligen kann man ebenso die Wirksamkeit einer Vakzination gegenüber Versuchsinfektionen bestimmen.
Die Einheitsdosen für den zweiten Bestandteil (Additiv) können im Allgemeinen und insbesondere beim Menschen von 1 bis 100 μg, (besonders 2 bis 100 μg oder 5 bis 100 μg) und insbesondere von 2 bis 50 μg, beispielsweise von 5 bis 30 μg Kern-Partikel oder eine der verwendeten Kernfraktion äquivalente Menge enthalten, (d.h. eine Menge, die der Menge dieser in der Menge der Kern-Partikel enthaltenen Fraktion entspricht oder auch eine Menge dieser Fraktion mit derselben Wirkung in der Impfzubereitung wie diese Menge an Kernpartikeln, wobei diese Wirkung selbstverständlich in Relation zur Wirksamkeit des Vakzins gemäß mindestens einem der oben erwähnten Kriterien definiert ist).
Die angegebenen Kernmengen werden angegeben in Gesamtproteinmengen, gemessen beispielsweise gemäß dem Verfahren von Bradford, das im nachfolgenden experimentellen Teil erwähnt wird.
Die Mengenabmessung des Kerns kann durch Trennung der Partikel in Abhängigkeit ihrer Dichte und durch Vergleich mit einer Standardskala des Kerns durchgeführt werden.
Man kann auf analoge Weise für die entfetteten Kern-Partikel fortfahren, die im Gegensatz zu den durch Behandlung mit Bromelain erhaltenen Kern-Partikeln eine höhere Dichte als die des Virions besitzen.
Sofern das Additiv zumindest ein Protein M ist, oder eine Kernfraktion, beinhaltend Protein M, enthält die Einheitsdosis der Impfzubereitung vorzugsweise mindestens 3-5 μg und insbesondere zumindest 7-10 μg hinzugefügtes Protein M (d.h. über das ggf. bereits in dem klassi schen Vakzin vorhandene freie Protein M, insbesondere sofern es sich um ein getrenntes Vakzin handelt). Die Mengen an hinzugefügtem Protein M werden hier insbesondere mit Hilfe eines immunologischen Versuchs gemäß der ELISA Technik ermittelt. Die durch ELISA dosierten Mengen an Protein M werden durch Vergleich mit einem Standard des gereinigten Proteins M bestimmt (dosiert beispielsweise mit Hilfe des Verfahrens mit Bicinchonsäure). Man kann ebenso durch Vergleich mit dem Gehalt an Protein M eines gereinigten Grippevirus fortfahren, das der Wirkung eines Detergens unterzogen wurde, indem man zulässt, dass das Protein M 50 Gew.-% der gesamten Proteine des Virus ausmacht. Die ELISA Tests werden auf getesteten Präparaten oder auf Referenzpräparaten des Proteins M oder des Virus in einer Lösung durchgeführt, beinhaltend beispielsweise 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Die gesamten viralen Proteine werden durch jedes geeignete Verfahren dosiert, z.B. durch das Verfahren von Bradford, das im Versuchsteil erwähnt wird.
Es ist bekannt, dass die Vakzine aus vollständigen Virionen ebenso wie die Vakzine aus Untereinheiten praktisch Protein-M-frei sind (d.h. außerhalb der Partikel des Virus oder des Kerns). Die klassischen getrennten Vakzine enthalten gewisse Mengen an Protein M, wobei diese Mengen variabel sind und hauptsächlich von der verwendeten Herstellungstechnik abhängen.
Somit ist es mit dem Wissen der verwendeten Herstellungstechnik und somit der Mengen an freiem Protein M in Lösung, die normalerweise in der erhaltenen Zubereitung des Vakzins vorliegen, leicht, die Mengen an ggf. hinzugefügtem Protein M in einer gegebenen Impfzubereitung zu bestimmen.
Des Weiteren hat man in Versuchen festgestellt, dass das hinzugefügte Protein M im Allgemeinen eine Dichte (gemessen z.B. als Saccharosegradient) besitzt, die sich von derjenigen des bereits in der getrennten Impfzubereitung vorliegenden Protein Ms, unterscheidet.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann auf subkutanem oder intramuskulärem Wege, oder auch nasal oder oral, oder sogar in Form eines Aerosols verabreicht werden.
Dessen Verabreichung kann an die anderer Vakzine und/oder Adjuvantien gebunden sein.
Des Weiteren kann die Zubereitung während der Wiederholungsverabreichung, z.B. 1 bis 3 Monate nach einer ersten Vakzination verwendet werden.
Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung bei der Herstellung einer Impfzubereitung gegen Grippe, beinhaltend einen ersten Bestandteil entsprechend einem klassischen antigrippalen Vakzin mit vollständigen Virionen oder ein klassisches anti-grippales fraktioniertes Vakzin eines zweiten Bestandteils (Additiv), beinhaltend Kern-Partikel oder eine gereinigte Fraktion des Kerns von mindestens einem Grippevirus, wobei dieser erste und zweite Bestandteil wie oben definiert ist und in ein und demselben Behälter vorliegt, um eine Impfzubereitung mit synergistischer Wirkung zu erhalten.
Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung genauer dar, ohne sie jedoch einzuschränken.
BEISPIEL 1: Erhalt eines viralen gereinigten Kerns
Man hat den zusammengesetzten Stamm des Grippevirus NIB16(A/H1N1) verwendet, hervorgegangen aus der Kreuzung zwischen dem wilden Stamm A/Taiwan/1/86 (A/H1N1) und der Zusammensetzung X31 (A/H3N2), der wiederum durch Kreuzung des Stammes A/Aichi/2/68 (A/H3N2) mit dem Virus A/Puerto-Rico/8/34 (A/H1N1) erhalten wurde.
Der Stamm NIB16 kann bei NIBSC bezogen werden.
Die viralen Suspensionen wurden durch Multiplikation auf Embryonen aufweisenden Hühnereiern hergestellt, Konzentration durch Ultrafiltration und Reinigung auf Saccharosegradient, wie in der französischen Patentanmeldung Nr. 2 201 079 beschrieben.
Um den Kern zu extrahieren, unterzieht man das gereinigte Virus, das im Phosphatpuffer pH 7,4 (PBS-Puffer) suspendiert wurde, zwei oder drei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit Bromelain (Sigma) bei 37°C im 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,5, EDTA 1 mM, 50 mM Betamercaptoethanol. Für die erste Behandlung mit der Protease verwendet man die angepasste virale Suspension, um 2 mg Proteine pro ml Puffer zu enthalten, und man gibt 1 mg/ml Bromelain hinzu. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C und Verdünnung mit einer wässrigen 0,1 M NaCl-Lösung unterzieht man die Zubereitung einer Trennung durch Ultrazentrifugation bei 120 000 g, 90 min lang, bei +4°C. Für die zweite und ggf. dritte Behandlung wird die Inkuba tion unter Verwendung von 2 mg/ml (Endkonzentration) Bromelain 16 Stunden lang durchgeführt. Die Behandlungen mit Zentrifugation sind dieselben wie bei der ersten Behandlung, und die Niederschläge werden im PBS-Puffer aufgenommen.
Man unterzieht die erhaltene Kernlösung einer Reinigung mit isopyknischer Ultrazentrifugation auf einem linearen 20-60% (p/p) Saccharosegradienten im PBS-Puffer bei 100 000 g, 16 Stunden lang, bei +4°C. Die Fraktionen, die den viralen Kern enthalten, werden mit dem PBS-Puffer auf 1/3 verdünnt, danach einer Ultrazentrifugation bei 120 000 g, 90 min lang, bei + 4°C unterzogen. Der Zentrifugationsniederschlag wird vom PBS-Puffer, pH 7,4, plus 0,01% Natriumazid, aufgenommen. Die Lösung kann durch Gefrieren bei mindestens 20°C konserviert werden.
Die so erhaltene Zubereitung des gereinigten Kerns weist folgende Charakteristika auf:

– der Anteil an Hämagglutinin im Vergleich zu den Gesamtproteinen liegt maximal bei 4%, dieser Anteil wird durch Elektrophorese im Polyacrylamidgel (Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970) oder durch ELISA Technik evaluiert;
– Hämagglutinin-Wirkung: unterhalb von 0,01% von der des Ausgangsvirus (Evaluierung durch Hämagglutinierung gemäß dem Verfahren beschrieben von Palmer et al., Advanced laboratory technicals for immunological diagnostic U.S Dept Hlth Ed. Welfare, P.H.S. Atlanta, Immunology ser. n° 6, Procedwal guide Pan 2, hemagglutination inhibition test, 1975, 25-62).

Das Endvakzin wird durch Verdünnung im PBS-Puffer, wie in Beispiel 2 nachfolgend angegeben, hergestellt.
BEISPIEL 2: Herstellung des Vakzins und pharmakologische Studie
Als ersten Bestandteil der Impfzubereitung verwendet man ein getrenntes und inaktiviertes monovalentes Vakzin, erhalten mit dem Stamm NIB16.
Das Hämagglutinin NIB16 ist analog zu dem des Stammes A/Singapur/6/86 (A/H1N1).
Dieses getrennte Vakzin wurde durch Behandlung des Virus mit einem Gemisch aus Polysorbat 80 und Ether gemäß dem in dem französischen Patent 2 201 079 (Beispiel 1) beschriebenen Verfahren hergestellt.
Der zweite Bestandteil (Kern) wurde gemäß dem in Beispiel 1 oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Das monovalente Vakzin und der Kern wurden verdünnt und im PBS-Puffer gemischt, um in einem Volumen von 0,5 ml die Verbindungen und Dosen, die nachfolgend in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, zu ergeben. Die so erhaltene Zubereitung wurde sechs Wochen alten OF1-Mäusen (IFFA-CREDO France) auf subkutanem Wege injiziert.
Die Dosen des verwendeten getrennten Vakzins und des Kerns werden in μg der Gesamtproteine ausgedrückt, bestimmt durch eine kolorimetrische Proteindosierung, durch Vergleich zu einer Standardskala von Rinder-Serumalbumin, gemäß dem Verfahren beschrieben von Bradford (Anal. Biochem, 1976, 72, 248-354) mit Hilfe des Kit Bio-rad.
Einen Monat nach der Vakzination hat man die Mäuse mit dem Stamm des Grippevirus A/Wilson Smith/33 (A/H1N1), erhalten beim Centre Mondial de la Grippe in London, infiziert. Dieser Stamm wurde für virulente Nachweise ausgewählt, da er für nicht immunisierte Mäuse letal ist. Er wurde auf nasalem Wege verabreicht in einer Menge von 20 50% letalen Dosen (DL50), in 30 μl pro Maus unter Anästhesie. Die Mäuse wurden daraufhin täglich 3 Wochen lang beobachtet.
Die Ergebnisse bezüglich des aufgezeichneten Überlebens in den verschiedenen Versuchsgruppen wurden in den Tabellen 1 und 2 gesammelt. In den Versuchen der Tabelle 1 hat keine Referenzmaus (nicht vakziniert) überlebt. Der verabreichte virale Kern allein hatte im besten Fall nur eine eingeschränkte schützende Wirkung (10 bis 20%), und das injizierte getrennte Vakzin allein schützt nur 30-50% der Mäuse. Man sieht, dass mehrere der Verbindungen aus getrenntem Vakzin und Kern zu einem synergistischen Schutz führen, ausgehend von Konzentrationen von 3 μg von getrenntem Vakzin verbunden mit 90 μg Kern oder auch 10 μg getrenntem Vakzin verbunden mit 10 μg Kern.
Die Erhöhung der Überlebensrate, erreicht durch die Verbindung von getrenntem Vakzin und Kern, ist statistisch bedeutsam. Die Ergebnisse wurden einer Varianzanalyse unterzogen (Test F von FISCHER-SNEDECOR), die aufzeigte, dass die Zugabe des Kerns eine statistisch bedeutsame synergistische Wirkung (p = 0,027) auf das Überleben der vakzinierten Mäuse hat. Der Versuch wurde wiederholt, indem der Mengenbereich des getesteten Kerns in Verbindung mit getrenntem Vakzin reduziert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Man sieht anhand der Ergebnisse der Tabelle 2, dass das Hinzufügen zum Vakzin von 3 μg Kern oder mehr systematisch den Prozentsatz der Mäuse erhöht, die bei dem Versuch überleben (Synergie des Schutzes äußerst bedeutsam: p Test F = 0,009).
TABELLE 1
TABELLE 2
BEISPIEL 3: Nachweis und Quantifizierung des Kerns des Grippevirus
Die erfindungsgemäßen Grippevakzine können, in variablen Mengen je nach deren Herstellungsart, den grippalen Kern (entfettet oder nicht) und vollständige Virionen oder Proteinuntereinheiten enthalten.
Das Verfahren, das ausgewählt wurde, um den Kern zu dosieren, verwendet den Unterschied in der Dichte dieser Elemente, herausgestellt durch isopyknische Zentrifugation im linearen Saccharosegradienten (Brand und Skehel, oben zitierter Artikel).
Dafür werden die zu analysierenden Muster in Ultrazentrifugationsröhrchen auf die Oberfläche eines vorgeformten Saccharosegradienten gelegt. Im vorliegenden Fall hat man 14 ml-Rohre mit 12 ml Gradient 20-60% (p/p im PBS) verwendet. Die abgesetzte Vakzindosis hat ein Volumen von 1 ml.
Die Muster werden sodann der Ultrazentrifugation 16 Stunden lang bei 100 000 g (bei +4°C) unterzogen, danach wird der Inhalt des Rohres von der Oberfläche zum Boden in 14 Aliquots fraktioniert. Während der Fraktionierung wird die optische Dichte fortlaufend bei 254 nm gemessen.
Man erhält ein Diagramm, bei dem jeder Peak einer Population von Partikeln der bestimmten Dichte entspricht. Die Vorrichtung ermöglicht es, die Beziehung zwischen der Position eines Peaks in der Grafik und der Fraktion, in der sie sich befindet, zu lokalisieren. Mit der Messung im Abbe-Refraktometer kann man den Prozentsatz an Saccharose jeder Fraktion erkennen, von der aus die Umrechnungstabellen (Handbook of chemistry and physics, 68. Ausgabe, Ed. R.C. Weast, CRC Press Inc.) die offensichtliche Dichte der Partikel angeben. Auf charakteristische Weise liegt die Dichte des viralen Kerns (erhalten gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1) bei 1,15-1,16 g/cm³ und diejenige des Virus bei 1,19-1,20 g/cm³; dies entspricht Saccharosekonzentrationen von 35-37% bzw. 42-44%.
Die Ergebnisse der Analyse der Dichte einer Standardskala des Kerns sind in 1 dargestellt.
In den Grafiken der 1 hat man auf der Abszisse die Nummern der Fraktionen (und die entsprechenden Saccharosekonzentrationen) angegeben, und auf den Ordinaten die optische Dichte (DO) als willkürliche Einheit dargestellt. Die Bedingungen für die Aufzeichnung (Material ISCO) sind die folgenden:
Länge der Nachweiswelle 254 nm, Sensibilität 0,2 der DO (volle Skala), Sammelrate: 3 ml/cm.
Die in 1 dargestellten Grafiken wurden gewonnen, indem man die zunehmenden Mengen des Kerns in Lösung in dem PBS-Puffer testete. Man stellt fest, dass die von den Peaks begrenzte Oberfläche proportional zur Menge des Kerns ist. Man kann eine Korrelation aufstellen, die es daraufhin ermöglicht, das Verfahren für die Dosierungen anzuwenden.
Um zu bestätigen, dass der beobachtete Peak für eine Saccharosekonzentration von 35-37% zum viralen Kern gehört, kann man (nach einer Denaturierungsbehandlung des Musters mit SDS bei 2%, bei 90°C, 3 min lang) die Elektrophorese im Polyacrylamidgel (Laemmli, bereits zitierter Artikel) anwenden, die, nach Färbung mit Silber, das Vorhandensein der Kernproteine NP und M zeigt.
Man hat in 2 die mit drei verschiedenen Vakzinen erhaltenen Diagramme dargestellt: ein Vakzin mit vollständigen Virionen, vertrieben unter der Marke Vaccin Grippal Ronchese (VGR), zwei mit verschiedenen Techniken getrennte Vakzine, vertrieben unter den Marken VAXIGRIP und MUTAGRIP, wobei diese Diagramme gemäß den gleichen Prinzipien und den gleichen Aufzeichnungsbedingungen erstellt wurden, wie die in 1 dargestellten. 2 ermöglicht einen Vergleich der Profile der Grippevakzine (eine Dosis) vor (a) und nach (b) Zugabe von 10 μg viralen Kerns. In 2 entsprechen die Grafiken 1 dem Vakzin mit vollständigen Virionen und die Grafiken 2 und 3 den getrennten Vakzinen (Vaxigrip bzw. Mutagrip). Die Profile variieren von einem Vakzin zum anderen, aber alle sind ohne Kern.
Die Zugabe des Kerns (10 μg/Dosis) (Grafiken 1b, 2b, 3b) kann man deutlich identifizieren durch das Auftauchen eines neuen Peaks in den Fraktionen, die Saccharose von 36-37% enthalten.
Beispiel 4
Herstellung einer Kernfraktion beinhaltend ein Matrixprotein (Protein M); Versuch zur Vakzination und zur Dosierung.

**Die bibliographischen Angaben, die in diesem Beispiel dargestellt sind, sind am Ende des Beispiels zusammengestellt.

Diese Fraktion wird, ausgehend vom gereinigten viralen Kern, gemäß einer von RUIGROK et coll. (1989) angepassten Technik extrahiert. Der Kern wird in einem auf pH 4,8 eingestellten PBS-Puffer mit Hilfe einer 0,25 M-Zitronensäure-Lösung suspendiert. In diesem Stadium kann man einen Proteaseinhibitor, wie z.B. TLCK (Sigma, Lösung bei 1 mg/ml im 50 mM Acetatpuffer, pH-Wert 5), hinzufügen, um einen späteren Abbau des Proteins M zu verhindern. Der Kern wird daraufhin einer Detergensbehandlung mit einer Mutterlösung aus Lubrol (Brij 36 T, Sigma) bei 10% unterzogen, wobei die Endkonzentrationen des Kerns, des Lubrol und ggf. des TLCK entsprechend auf 0,1 mg/ml, 0,5% und 50 μg/ml zurückgebracht werden, durch Zugabe des auf pH 4,8 eingestellten PBS-Puffers mit Hilfe von Salzsäure 1,24 N. Das Gemisch wird durch leichtes Rühren bei Umgebungstemperatur 1 min lang homogenisiert, danach einer Ultrazentrifugation bei 85 000 g, 90 min lang, bei +4°C unterzogen. Der Zentrifugationsniederschlag enthaltend das Nukleoprotein (NP) wird wieder im PBS-Puffer, pH 7,4, suspendiert, während der Überstand, der das Protein M enthält, durch Ultrafiltration 10 bis 20-fach konzentriert wird (Amicon-Zelle, Membran mit Ausschlussgrenze von 10 000 Dalton). Die Proteine werden bei –20°C gelagert. Sie werden mit Hilfe von Bicinchonsäure dosiert (Smith, Krohn et al., 1985), mit Hilfe des Kit Micro BCA von Pierce. Ihre Reinheit wird routinemäßig durch Elektrophorese in Polyacrylamidgel bei 12,5% nach einer Färbung auf Coomassie-Blau (Phast system, Pharmacia) kontrolliert. Keine Verunreinigung ist sichtbar, was das Matrixprotein betrifft, was auf einen Reinheitsgrad von mindestens 90% hinweist.
Schutztest an der Maus
Gruppen von BALB/c-Mäusen (Herkunft: IFFA-Credo, France), 6 Wochen alt, wurden mit Zubereitungen von Vaxigrip (monovalent A/H1N1 NIB16) mit Protein M oder mit Verbindungen von Vaxigrip und Protein M immunisiert (siehe verwendete Dosen in den Tabellen der Ergebnisse). Die verschiedenen Zubereitungen wurden subkutan in 0,5 ml, ohne Adjuvans und in einer einzigen Injektion verabreicht. Die Mäuse wurden 4 bis 5 Wochen nach der Immunisierung mit 5 50% letalen Dosen (DL50) des überimpften Stammes A/H1N1 A/WS/33 unter 30 μl intranasal, bei Vollnarkose der Tiere mit einem Gemisch aus Ketamin-Xylazin getestet. Die Ergebnisse werden als Überlebenstabelle der Mäuse drei Wochen nach dem virulenten Test dargestellt.
Die beiden dargestellten Tabellen entsprechen zwei Versuchsreihen, die mit derselben Zubereitung von Protein M des Virus NIB16 durchgeführt wurden. Sie zeigen, dass die Verbindung Vaxigrip (monovalent NIB16) – Zubereitung mit Matrixprotein einen verbesserten Schutz verleiht.
Rufen wir uns in Erinnerung, dass die Dosen des Vakzins, des Kerns und der Proteine hier in μg der bestimmten Gesamtproteine ausgedrückt sind, für das Vakzin und den Kern durch die Technik von Bradford (1976), und für das Protein M durch die Dosierung mit Bicinchonsäure (Smith, Krohn et al., 1985, Angabe wie oben zitiert). TABELLE 3 Nb der überlebenden Mäuse/Nb der getesteten Mäuse (10 ohne gegenteilige Angaben)
TABELLE 4 Nb der überlebenden Mäuse/10 getestete Mäuse

– Die Mäuse können ebenso immunisiert werden, wenn man Impfzubereitungen mit vollständigen Virionen verwendet. Die oben dargestellte Tabelle stellt das Überleben von BALB/c-Mäusen dar, die im Alter von 6 Wochen mit Zubereitungen des trivalenten Vakzins VGR mit vollständigen Virionen (Vaccin Grippal Ronchese de la saison 1990-1991) immunisiert wurden. Die Dosis des verwendeten trivalenten Vakzins liegt bei ca.5 μg Hämagglutinin des Virus NIB16 pro Maus: sie wurde durch radiale Immunodiffusion gemäß der Technik von Wood et coll., bereits oben erwähnt, quantifiziert und entspricht der gegenwärtigen Menge in 10 μg Gesamtproteinen des zuvor verwendeten monovalenten Vaxigrip NIB16. Die Ergebnisse zeigen, dass die verbesserte Schutzwirkung durch Zugabe der Zubereitung mit Protein M auch bei einem Vakzin mit vollständigem Virion zu beobachten ist:

TABELLE 5
Dosierung des Proteins M mit ELISA
- Wirkprinzip:
Die verwendete Technik ist ein nicht-kompetitiver Test ELISA Sandwich, adaptiert von Bucher, Kharitonenkov et al., (1987), Donofrio, Coonrod et al., (1986) und Hjerten, Sparrman et al., (1988). Sie besteht darin, das Protein M der zu dosierenden Muster (z.B. Grippevirus, Vakzin, Kern, gereinigte Proteine) mit Hilfe von vorher auf Mikrotiterplatten adsorbierten spezifischen Immunoglobulinen M zu fangen; das Vorhandensein des Proteins wird daraufhin dank einer Abfolge von Schritten evaluiert, die zu einer kolorimetrischen Reaktion führen, proportional zur Menge des vorliegenden Antigens.
– Verwendete immunologische Reagenzien:

• Anti Protein M Gesamtimmunoglobuline des Grippevirus: diese spezifischen Immunoglobuline wurden ausgehend vom Serum hyperimmunisierter Kaninchen durch 3 Injektionen gewonnen bzw. aus 100, 75 und 75 μg Protein M hergestellt, wie vorher beschrieben; diese Injektionen wurden mit einem Monat Abstand auf intramuskulärem Wege durchgeführt, zusammen mit dem Adjuvans von Freund (vollständiges Adjuvans für die erste Injektion und unvollständig für die weiteren Injektionen). Die Gesamtimmunoglobuline wurden daraufhin auf Ammoniumsulfat bei 35% Sättigung ausgefällt.
• Im Handel vertriebene monoklonale Protein M spezifische Antikörper der Maus (Serotec)
• Immunoglobuline der Ziege, Anti-Immunoglobuline der Maus, gekoppelt an Peroxidase (Jackson ImniunoResearch).

– Lösungen:

• Dilutionspuffer, bestehend aus PBS, pH 7,2, unter Zugabe von 0,05% Tween 20 und 5% Magermilchpulver (Régilait).
• Waschlösung für Platten, bestehend aus PBS-Puffer unter Zugabe von 0,05% Tween 20.

– Verfahren:
Es wird auf Mikrotiterplatten (Nunc) durchgeführt.
Jeder Reaktant wird in einem Volumen von 100 μg pro Vertiefung hinzugefügt; ausgehend vom Schritt der Sättigung und bis zu dem der Entwicklung unterlaufen die Platten systematisch 4 aufeinander folgende Spülungen mit Hilfe der Waschlösung.
Die Gesamtimmunoglobuline des Kaninchen Anti-Protein M werden bei einer Konzentration von 1 μg/ml im 50 mM Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,6, abgesetzt und eine Nacht lang bei +4 °C inkubiert.
Daraufhin wird ein Sättigungsschritt der Vertiefungen 1 Stunde lang bei 37°C mit Hilfe des Dilutionspuffers durchgeführt.
Die zu dosierenden Muster werden daraufhin in dem zugegebenen Dilutionspuffer bei 0,1% SDS in Form von Dilutionen mit dem Quotienten 2 abgesetzt.
Nach einem Kontakt von 2 Stunden bei 37°C wird der monoklonale Protein M spezifische Antikörper der Maus, verdünnt auf 1/1000 in dem zugegebenen Dilutionspuffer bei 0,1% SDS, hinzugefigt, und man lässt ihn 1 Stunde lang bei 37°C inkubieren.
Die Fixierung der monoklonalen Anti-M Antikörper auf das Protein wird durch Zugabe von mit Peroxidase markierten Anti-Immunoglobulin-Antikörpern der Maus, verdünnt auf 1/1000 im Dilutionspuffer, aufgezeigt.
Nach 1 Stunde bei 37°C und nach einer letzten Serie von Waschungen der Platten, wird die Reaktion durch Zugabe der 20 mM Zitrat-Pufferlösung, pH 5,6, beinhaltend Natriumperborat, Substrat der Peroxidase (Sigma), unter Zugabe von oPD (Orthophenylendiamindichlorhydrat, Sigma), verwendet in einer Konzentration von 0,4 mg/ml, offenbart. Die Reaktion wird nach einer Inkubation von 20 Min. bei Umgebungstemperatur durch Zugabe von 50 μl Schwefelsäure 4N gestoppt. Das Ablesen der Reaktion wird mit Hilfe eines Platten-Lesegeräts ELISA (MR 5000 Dynatech) durchgeführt, das die Absorption des Reaktionsmilieus in den Vertiefungen bei einer Wellenlänge von 490 nm misst.
**Bibliogrraphische Angaben:

– Bachmayer, H (1975). "Selective solubilization of hemagglutinin and neuraminidase from influenza viruses" Intervirolo 5, 260-272.
– Bradford, M.M. (1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding". Anal. Biochem 72, 248-254.
– Bucher, D.J. Kharitonenkov, LG., Wajeed-Khan, M., Palo, A., Holloway D. and Mikhail A. (1987). "Detection of influenza viruses through selective adsorption and detection of the M protein antigen". J. of Immunol. Methods 96, 77-85.
– Donofrio, J.C., Coonrod, J.D., Karathanasis, V. und Coelingh, K.V.W. (1986). "Electroelution for purification of influenza A matrix protein for use in immunoassay". J. of Immunol. Methods 13, 107-120.
– Hjerten, S., Sparrman, M. und Liao, J. (1988). "Purification of membrane proteins in SDS and subsequent renaturation". Biochim. Biophys, Acta, 939, 476-484.
– Jennings, R., Smith, T.L., Spencer, R.C., Mellersh, A.M., Edey, D., Fenton, P., et al. (1984). "Inactivated influenza virus vaccines in man: a comparative study of subunit and split vaccines using two methods for assessment of antibody responses". Vaccine, 2, 75-80.
– Ruigrok, R.W.H., Calder, L.J. and Wharton, S.T.A. (1989). "Electron Microscopy of the influenza Virus Submembranal Structure". Virology, 173, 311-316.
– Smith, P.K., Krohn, R.L, Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., et al. (1985). "Measurement of protein using bicinchonic acid". Anal. Biochem., 150, 76-85.

Beispiel 5
Verbesserung des Schutzes gegen einen Untertyp des Grippevirus durch Verwendung eines Vakzins aus verschiedenen Untertypen unter Zugabe von Kern.
Gruppen von männlichen, 6 Wochen alten OF1-Mäusen wurden mit Zubereitungen von monovalentem Vaxigrip A/H3N2 × 97 mit dem Kern des Virus A/H3N2 × 97 oder durch die Verbindungen von Vaxigrip und Kern immunisiert. Die verschiedenen Zubereitungen wurden subkutan in einem Volumen von 0,5 ml, ohne Adjuvans und in einer einzigen Injektion verabreicht. Die Mäuse wurden 5 Wochen nach der Immunisierung mit einer Dosis, entsprechend 20 50% letalen Dosen (DL50) des überimpften Stammes A/H1N1 A/WS/33, in einem Volumen von 30 μl auf intranasalem Wege, unter Vollnarkose der Tiere, durch ein Gemisch aus Ketamin-Yylazin getestet.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
TABELLE 6
Wie erwartet, verleiht das Vakzin A/H3N2 X97 keinen Schutz gegenüber einem Test mit Virus A/H1N1. Es ist jedoch ein überraschender Synergieeffekt des Schutzes zu beobachten, wenn das Vakzin mit dem Kern verbunden ist.

Claims

Impfzubereitung gegen Grippe, enthaltend ein Gemisch, bestehend aus einem ersten und einem zweiten Bestandteil, wobei der Erste aus einem klassischen antigrippalen Vaccin mit vollständigen Virionen besteht und der zweite Bestandteil ein Additiv mit synergistischer Wirkung darstellt, ausgewählt unter isolierten Kern-Partikeln, die aus mindestens einem Stamm des Grippevirus stammen, einer isolierten Fraktion des Kerns, enthaltend das Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren, einem Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren und einem Fragment mit synergistischer Wirkung des Proteins M mindestens eines Stammes von Grippeviren.
Impfzubereitung gegen Grippe, enthaltend ein Gemisch, bestehend aus einem ersten und einem zweiten Bestandteil, wobei der Erste aus einem fraktionierten, klassischen antigrippalen Vaccin besteht und der zweite Bestandteil ein Additiv mit synergistischer Wirkung darstellt, ausgewählt unter isolierten Kern-Partikeln, die aus mindestens einem Stamm des Grippevirus stammen, einer isolierten Fraktion des Kerns, enthaltend das Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren, einem Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren und einem Fragment mit synergistischer Wirkung des Proteins M mindestens eines Stammes von Grippeviren.
Zubereitung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Additiv den Kern umfasst, erhalten nach Elimination von Hüllproteinen durch Behandlung eines Grippevirus mit Hilfe einer Protease.
Zubereitung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease das Bromelain ist.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Additiv eine isolierte Fraktion des Kerns des Grippevirus umfasst, enthaltend das Protein M, oder ein Fragment des Proteins M mit synergistischer Wirkung.
Zubereitung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Additiv entfettete Kern-Partikel umfasst.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Additiv den Kern umfasst, erhalten durch schonende Behandlung eines Grippevirus mit Hilfe mindestens eines oberflächenaktiven Mittels, anschließende Abtrennung des Kerns gemäß üblicher Verfahren.
Zubereitung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kernfraktion durch ein Verfahren erhalten werden kann, bestehend aus – der Behandlung einer Suspension des Kerns mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels, beispielsweise eines nicht ionischen Detergens, bei einer ausreichenden Konzentration und einem ausreichend sauren pH-Wert, um die Abtrennung der Proteine M und NP im folgenden Schritt zu favorisieren, – Unterwerfen der so behandelten Lösung unter eine Zentrifugation mit ausreichender Geschwindigkeit, damit sich das Protein NP und ggf. rückständige Kern-Partikel im Zentrifugationsniederschlag akkumulieren, wobei das Protein M im Überstand verbleibt, – Abtrennen des Zentrifugationsniederschlags und Sammeln des Überstandes, – und Konzentrieren, falls gewünscht, des Überstandes zum Erhalt einer Lösung, welche die Kernfraktion darstellt.
Zubereitung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist unter den polyethoxylierten Alkylphenolen, den polyethoxylierten Fettalkoholen und den Alkylosiden.
Zubereitung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kernfraktion das Protein M darstellt.
Zubereitung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Einheitsdosis vorliegt, enthaltend eine wirksame Menge des Additivs.
Zubereitung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Additiv 1 bis 100 μg Kern oder einer äquivalenten Menge der Kernfraktion enthält.
Zubereitung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Additiv 2 bis 100 μg Kern oder eine äquivalente Menge der Kernfraktion enthält.
Zubereitung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Additiv 5 bis 100 μg Kern oder eine äquivalente Menge der Kernfraktion enthält.
Zubereitung gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Additiv mindestens 3-5 μg an Protein M enthält.
Zubereitung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Additiv mindestens 7-10 μg an Protein M enthält.
Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Bestandteil als klassisches Vaccin 1 bis 20 μg Hemagglutinin eines der Impfstämme enthält, die diesen zusammensetzen.
Verwendung bei der Herstellung einer Impfzubereitung gegen Grippe, enthaltend einen ersten Bestandteil, entsprechend einem klassischen antigrippalen Vaccin aus vollständigen Virionen, und einen zweiten Bestandteil, ein Gemisch mit dem Ersten bildend, um eine Impfzubereitung mit synergistischer Wirkung zu erhalten, wobei es sich bei dem zweiten Bestandteil um ein Additiv mit synergistischer Wirkung handelt, ausgewählt unter: isolierten Kern-Partikeln, hervorgehend aus mindestens einem Stamm des Grippevirus, einer isolierten Fraktion des Kerns, enthaltend das Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren, einem Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren und einem Fragment des Proteins M mit synergistischer Wirkung von mindestens einem Stamm von Grippeviren.
Verwendung bei der Herstellung einer Impfzubereitung gegen Grippe, enthaltend einen ersten Bestandteil, entsprechend einem fraktionierten, klassischen antigrippalen Vaccin, und einen zweiten Bestandteil, ein Gemisch mit dem Ersten bildend, um eine Impfzubereitung mit synergistischer Wirkung zu erhalten, wobei es sich bei dem zweiten Bestandteil um ein Additiv mit synergistischer Wirkung handelt, ausgewählt unter: isolierten Kern-Partikeln, hervorgehend aus mindestens einem Stamm des Grippevirus, einer isolierten Fraktion des Kerns, enthaltend das Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren, einem Protein M mindestens eines Stammes von Grippeviren und einem Fragment des Proteins M mit synergistischer Wirkung von mindestens einem Stamm von Grippeviren.
Verwendung gemäß dem vorstehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das klassische Vaccin und/oder das Additiv wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert sind.