DE3901497A1

DE3901497A1 - Verfahren zur herstellung eines testsystems fuer aids-viren beeinflussende mittel

Info

Publication number: DE3901497A1
Application number: DE19893901497
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof Dr Hunsmann; Christiane Dr Stahl-Hennig
Original assignee: Deutsches Primatenzentrum GmbH
Current assignee: Deutsches Primatenzentrum GmbH
Priority date: 1989-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1990-07-26

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems für AIDS-beeinflussende Mittel und dessen Verwendung.

Im letzten Jahrzehnt hat sich die Immunschwäche-Krank heit AIDS epidemieartig auf der ganzen Welt ausgebrei tet. Verursacher dieser Krankheit sind Retroviren. Bis her konnte die sehr pathogene Art HIV-1, sowie die etwas weniger pathogene Art HIV-2 isoliert werden. Der Infektionsverlauf konnte weitgehend geklärt werden, ebenso wie der molekulare Aufbau der Viren. Bis heute ist es jedoch nicht gelungen, ein effektives Impfver fahren oder ein wirksames Arzneimittel, dessen Toxizi tät nicht zu hoch ist, zu finden.

Ein Problem dabei ist es, daß bisher kein geeignetes Tiermodell für die Krankheit gefunden wurde. Eine Infek tion zu Forschungszwecken am Menschen scheidet selbst verständlich aus. Daher wäre es wünschenswert, an einem, dem Menschen ähnlichen Organismus die Krankheit zu stu dieren, um wichtige Aufschlüsse über Verlauf und Beein flussung der Krankheit zu bekommen und Impf- und Arznei stoffe zu testen. Dabei stellten sich bisher jedoch sehr große Schwierigkeiten ein. Die meisten Tiere und insbe sondere Primaten, denen HIV-1 oder HIV-2 injiziert wird, entwickeln nicht die Krankheitssymptome. So wird in The Journal of Infectious Diseases, Vol. 156, Nr. 2 (1987), Seiten 406 bis 407 beschrieben, daß die Injektion von HIV-2 in Rhesusaffen nicht zu einer Infektion führte und daß anschließend an diese Injektion keine Antikör per nachweisbar waren. Auf der 4. Internationalen AIDS- Konferenz in Stockholm (12. bis 16. Juni 1988) wurde vorgetragen, daß es gelang, eine HIV-2-Infektion in Rhesusaffen zu erzeugen durch ein sehr aufwendiges Verfahren, wobei die verwendeten Viren durch in vitro Passage in verschiedenen Zellinien vorkonditioniert und dann den Affen, die durch Bluttransfusionen immunstimu liert worden waren, intracerebral und intravenös inji ziert wurden.

Es war nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver fahren zu finden, das in einfacher Weise eine AIDS-ähn liche Infektion hervorruft und mit dem ein Tiermodell zur Untersuchung von gegen AIDS gerichtete Mittel zur Verfügung gestellt werden kann.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems für AIDS-Viren beeinflus sende Mittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man Makaken mindestens einmal eine Injektion von HIV- 2ben verabreicht.

Überraschenderweise gelingt es durch Injektion des AIDS-Virus HIV-2ben schon nach einmaliger Injektion in Makaken, insbesondere Rhesusaffen und Javaner Makaken, eine Antikörperantwort hervorzurufen. Einige Wochen nach der Injektion konnten aus dem Blut der infizierten Tiere Viren isoliert werden, die identisch mit dem injizierten Virus waren. Dies zeigt, daß tatsächlich eine Infektion stattgefunden hat. Darüber hinaus zeigten sich bei einigen Tieren an verschiedenen Lokalisationen 16 Wochen nach der Infektion erste Zeichen einer AIDS- Erkrankung.

Erfindungsgemäß wird ein Tiermodell zum Testen von AIDS-Viren beeinflussenden Mitteln hergestellt, indem die Affen mindestens einmal eine HIV-2ben-Injektion erhalten. Es wurden bisher sieben verschiedene HIV-2-Iso late beschrieben, von denen sechs im Pasteur-Institut in Paris gefunden wurden, während das siebte, HIV-2ben, im Primatenzentrum in Göttingen isoliert wurde. Über raschenderweise lassen sich bei Verwendung des HIV-2ben- Isolates durch eine einmalige intravenöse Injektion von zellfreiem Virus ohne Vorkonditionierung der Tiere eine Infektion und erste Zeichen einer AIDS-Krankheit hervor rufen, während mit den übrigen HIV-2-Isolaten dies bisher nicht möglich war.

Die Injektion kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Bevorzugt wird die Injektion intravenös oder intrathe kal vorgenommen. Die Dosis liegt geeigneterweise im Bereich von 1-2×10⁶ cpm Reverse Transkriptase Einbauraten. Eine einmalige Injektion ist ausreichend, um die Tiere zu infizieren. Der Virus kann als zellfreies Präparat oder zellgebunden appliziert werden. Bevorzugt wird zellfreier, HIV-2ben-haltiger Zellkulturrückstand verwendet.

Besonders bevorzugt wird zur Injektion HIV-2ben, ECACC 87122301, verwendet.

Die so behandelten Tiere können zum Testen von AIDS- Viren beeinflussenden Mitteln eingesetzt werden. Unter AIDS-Viren beeinflussenden Mitteln werden sowohl Impf stoffe und die Immunisierung verbessernde Mittel als auch die Virusvermehrung negativ beeinflussende Sub stanzen und gegen AIDS-Viren wirkende Heilmittel ver standen. Beim Testen von Impfstoffen wird den Tieren zuerst der Impfstoff bzw. das die Immunisierung ver bessernde Mittel verabreicht und anschließend eine Injektion mit HIV-2ben vorgenommen. Wenn der Impfstoff bzw. das Immunisierungsverfahren erfolgreich ist, so darf anschließend keine HIV-2ben-Infektion nachweisbar sein. Der Erfolg und die Wirkungsweise der Immunisierung läßt sich auf diese Weise testen.

Ebenso kann die Wirkung von die Virusvermehrung negativ beeinflussenden Substanzen getestet werden, indem man entweder zuerst diese Substanzen verabreicht und an schließend mit HIV-2ben infiziert oder aber mit HIV-2ben infizierte Tiere anschließend mit den die Virusvermeh rung negativ beeinflussenden Substanzen behandelt und dann überprüft, wie sich die Viren unter diesen Bedin gungen entwickeln.

An den mit HIV-2ben infizierten Affen können Arzneimit tel getestet werden. Insbesondere kann untersucht werden, in welcher Weise die Arzneimittel auf die Viren und deren Vermehrung oder auf die durch die Viren hervorgerufenen Symptome wirken.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung von mit HIV-2ben infizierten Rhesusaffen als Testsystem für AIDS-Viren beeinflussende Mittel.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren erläutert.

Fig. 1 bis 4 zeigen Autoradiographien von Radioimmun präzipitation (RIPA) zum Nachweis von HIV-2 spezifischen Antikörpern aus den Seren der infizierten Makaken;

Fig. 5 zeigt eine Autoradiographie einer RIPA;

Fig. 6 bis 12 zeigen Abbildungen von Western blots zum Nachweis von HIV-2 spezifischen Antikörpern sowie zum Nachweis von Antikörpern gegen gp160, gp130, gp32, p24 und p17.

Die Fig. 1 bis 4 zeigen, daß bei allen untersuchten Tieren 2 bis 6 Wochen nach der Infektion Antikörper gegen das äußere Virushüllprotein gp160 entwickelt worden waren. Bei den Tieren 1606, 1607, 1631, 1609, 778 und 760 sind außerdem Antikörper gegen das Core protein p 24 zu erkennen.

In Fig. 5 sind die folgenden Spuren zu erkennen

Spur 1: markiertes Reisolat aus einem Tier, das von bekannten Antiseren präzipitiert wurde. Es reagiert mit homologem Antiserum aus dem Patienten, aus dem das Virus ursprünglich stammte.
Spur 2: negative Kontrolle
Spur 3: monospezifisches Antiserum gegen gp130 eines SIV, Bande bei gp 130
Spur 4: Prebleeding vom infizierten Tier, keine Bande gegen gp160 und p24
Spur 5: Serum des infizierten Tieres 12 Wochen nach Infektion, deutliche Banden gegen gp160, gp130, p24, d.h. Serokonversion
Spur 6: SIV-positives Serum von einer natürlich infizierten Meerkatze, Kreuzreaktion mit dem Reisolat
Spur 7: HIV-1 Positivserum, Kreuzreaktion mit dem Reisolat, jedoch nur mit p24
Spur 8: afrikanisches HIV-2 Positivserum, Reaktion mit gp160 und p24.

Diese Ergebnisse zeigen, daß es sich bei dem Reisolat aus dem Tier tatsächlich im HIV-2 handelt.

Beispiel 1

8 juvenile Rhesusaffen und 2 juvenile Javaneraffen, STLV-1, D-Typ, SIV und HIV-2 seronegativ wurden wie folgt behandelt: Die Tiere 1609, 1631, 760 und 778 erhielten eine Injektion von zellfreiem HIV-2ben mit einer Reverse Transcriptase(RF)-Einbaurate von 2×10⁶ cpm intravenös. Die Tiere 1606 und 1607 erhielten eine Injek tion von 1 ml zellfreiem HIV-2ben-haltigem Kulturrück stand mit einer RT-Einbaurate von 8×10⁵ cpm intrathekal. Die Tiere 1598 und 1599 erhielten eine Injektion von zellgebundenem HIV-2ben intravenös, wobei 1598 5×10⁶ autologe HIV-2ben infizierte Rhesusaffen Lymphozyten und 1599 1×10⁷ HIV-2ben infizierte Molt-4-Zellen erhielt.

Nach der Injektion wurde den Tieren alle zwei Wochen Blut entnommen und auf das Vorliegen von HIV-2ben sowie auf die Entwicklung von HIV-2ben spezifischen Antikörpern, insbesondere von Antikörpern gegen die viralen Proteine gp160, p17, p24 und gp32 untersucht. Die Untersuchungen erfolgten nach den in den folgenden Beispielen beschrie benen Verfahren. Die Ergebnisse sind der folgenden Ta belle 1 sowie den Fig. 1 bis 5 zu entnehmen:

Virusreisolierung aus HIV-2ben infizierten Rhesusaffen
Tier #
erfolgreiche Virusisolierung

Wochen nach Infektion
1597\|-
1598	-
1599	6
1600	-
1606	6
1607	6
1609	2/3
1631	2/3/8
760	7/10/12
778	7/10

8 der 10 Tiere serokonvertierten 2 bis 6 Wochen nach der Infektion. Alle seropositiven Tiere entwickelten 4 bis 6 Wochen nach Infektion Antikörper gegen das Glyco protein gp160. Bei den Tieren 1598, 1606, 1607, 1609, 1631 sowie 760 und 778 waren zusätzlich Antikörper gegen p24 nachweisbar. Bei 1598, 1607, 1631 und 778 konnten zusätzlich Antikörper gegen p17 nachgewiesen werden. Bei 4 der 8 seropositiven Affen waren im Western Blot Antikörper gegen gp32 zu sehen. 2 bis 12 Wochen nach der Infektion konnte aus dem Blut der infizierten Tiere HIV-2ben reisoliert werden. Ein Vergleich mit dem ursprünglich eingesetzten Präparat zeigte, daß die Viren identisch waren.

Beispiel 2 Virusisolierung

Aus den mit HIV-2ben infizierten Rhesusaffen wurde durch Kokultivierung von Rhesus- mit humanen Lymphozy ten der Virus reisoliert. Dazu wurden die Rhesuslympho zyten am ersten Tag der Kultivierung mit 1% Phytohämag glutinin (PHA) HA15 (Wellcome) stimuliert. 24 Stunden später erhielten sie 10% Interleukin2 (Lymphocult-T-LF, Biotest Diagnostics). Nach insgesamt 3 bis 4 Tagen wurden sie mit PHA vorstimulierten primären humanen peripheren Blutlymphozyten kokultiviert. Alle 2 bis 3 Tage erfolgte ein Mediumwechsel. Das Zellkulturmedium wurde dabei immer mit 10% Interleukin2 supplementiert.

Die Virusvermehrung wurde mit Hilfe des Reverse Trans kriptase Tests nachgewiesen, der einmal wöchentlich entsprechend den Standardmethoden (Hoffmann et al., 1985) durchgeführt wurde. Dabei wurden im Testansatz folgende Endkonzentrationen verwendet: 0,6% Triton- X-100, 25 mM Mg²⁺, 30 mM KCl. Als exogener Template Primer wurde 1 µg poly(rC)-oligo(dG) (Pharmacia) pro 50 µl Reaktionsansatz zugefügt. Die spezifische Aktivität von (³²P) dGTP betrug 3000 Ci/mmol (Amersham Buchler), im Reaktionsansatz ungefähr 6×10³ cpm/pmol. Die Reaktion der Reversen Transkriptase fand bei 42°C über 45 Minuten statt.

Beispiel 3

Die Serokonversion wurde mit 2 Methoden nachgewiesen.

a) Radioimmunopräzipitation

Hier wurde gereinigter Zellextrakt von mit HIV-2ben infizierten, mit ³⁵S-Cystein (Amershan, Buchler, Braun schweig) markierten Molt-4-Zellen mit dem 1 : 10 verdünn ten Serum der HIV-2ben infizierten Rhesusaffen 4 Stunden bei 4°C inkubiert. Dabei entstandene Antigen-Antikörper (Ag-Ak)-Komplexe wurden an Protein A-Sepharose (Parmacia) gebunden. Dazu wurde 1 µl Serum pro 1 µg Protein A-Sepha rose eingesetzt. Die Bindung erfolgte durch 30 Minuten Einwirken bei 4°C. Danach wurden nicht gebundene Antige ne ausgewaschen. Das Pellet wurde in reduzierendem Probenpuffer aufgenommen und die Immunkomplexe von der Protein A-Sepharose durch 3 Minuten langes Erhitzen auf 96°C abgetrennt und gespalten. Die mit Bromphenolblau gefärbten Überstände wurden auf 9 bis 16% Gradienten gel mit Hilfe der SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert. Anschließend wurden die Gele mit 7%iger Essigsäure gewaschen. Zur Verstärkung der radioaktiven Banden wurden die Gele mit Amplify (Amersham) behandelt und nach Trocknung bei -80°C gegen einen Röntgenfilm exponiert.

b) Western Blot

Die Serokonversion wurde durch Western Blot nachgewie sen. Als Virusantigen für den Western Blot wurde HIV-2rod aus dem Zellkulturüberstand von HIV-2rod infizierten Molt-4/Klon 8-Zellen verwendet. Für die Reinigung des Virus wurden Zellen und Zelltrümmer aus dem Überstand durch niedertourige Zentrifugation entfernt. Virusparti kel wurden bei 32 000 g für 2 Stunden pelletiert. Das Viruspellet wurde in isotonem Phosphatpuffer pH 7,2 (PBS) resuspendiert und erneut bei 45 000 g für 45 Minuten pelletiert. 250 bis 500 µg Antigen wurden mittels Gelelektrophorese auf einem 9 bis 16%igen SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteinbanden auf dem Gel wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulose (Schleicher und Schuell, 0,45 µm) über tragen. Der Transfer erfolgte über Nacht bei 4°C und einer konstanten Stromstärke von 250 mA. Danach wurde die Nitrozellulose mehrmals in PBS mit 0,3%igem Tween gewaschen, anschließend getrocknet, in Streifen geschnitten und bei -20°C bis zu 6 Monaten gelagert.

Für die eigentliche Immunreaktion wurden die Blotstrei fen für 30 Minuten mit 5% Magermilchpulver in PBS bei Zimmertemperatur abgesättigt. Antiseren aus den HIV-2ben infizierten Rhesusaffen wurden 1 : 2, 1 : 5 und 1 : 20 in PBS mit 0,2% NONIDET-P40 (Sigma) und 3% Magermilchpulver verdünnt und 2 Stunden bei 37°C auf der Taumelplatte mit den Blotstreifen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Streifen dreimal 10 Minuten in PBS mit 0,2% NP-40 und 3% Magermilchpulver gewaschen.

Anschließend erfolgte die Inkubation mit Ziege-Anti- Human IgG-Peroxidase-Konjugat (1 : 200 verdünnt) für 1 Stunde bei 37°C auf der Taumelplatte.

Daraufhin wurden die Streifen einmal in PBS mit 0,2% NP-40 für 10 Minuten und viermal mit PBS für je 10 Minuten gewaschen. Die Streifen wurden mit frisch angesetztem Substrat wie folgt entwickelt:

15 mg 4-Chloro-1 Naphtol (Merck)
3 ml Methanol
9 ml PBS
4 µl H₂O₂

Das Substrat wirkte so lange ein, bis die Banden deutlich zu sehen waren. Die Reaktion wurde durch Entfernen des Substrats und einmaliges Waschen mit Wasser gestoppt.

Die Ergebnisse sind den Fig. 4 und 5 zu entnehmen. Es wurde festgestellt, daß 4 der 8 seropositiven Tiere Antikörper gegen gp32 entwickelt hatten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems für AIDS-Viren beeinflussende Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß man Makaken, insbesondere Rhesus- und Javaner affen, mindestens einmal eine Injektion von HIV-2ben verabreicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Makaken zuerst mit einem Impfstoff gegen AIDS-Viren oder einem die Immunisierung verbessern den Mittel behandelt und anschließend HIV-2ben injiziert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Injektion HIV-2ben, ECACC 87122301, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man HIV-2ben einmal intravenös injiziert.

5. Verwendung von mit HIV-2ben infizierten Makaken als Testsystem für AIDS-Viren beeinflussende Mittel.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Testsystem für Impfstoffe, die Immunisierung ver bessernde Mittel, die Virusvermehrung negativ be einflussende Mittel und/oder Heilmittel einsetzt.