DE2025810A1

DE2025810A1 - Verfahren zur Gewinnung eines Interferoninduktors gegen Virusinfektionen

Info

Publication number: DE2025810A1
Application number: DE19702025810
Authority: DE
Inventors: N Ishida; M Kikuchi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1969-05-26
Filing date: 1970-05-26
Publication date: 1970-12-17
Also published as: ZA703501B; DE2025810C3; FR2051558B1; GB1303506A; NL7007521A; NL148241B; SE376170B; CA932284A; DE2025810B2; BE750918A; US3907778A; FR2051558A1

Description

Virusinfektionen"

Priorität: 26. Mai 1969, Japan, Nr. 40 404/69

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines neuen Interferoninduktors gegen Virusinfektionen.

Viruskrankheiten von Menschen und Tieren sind immer Infektionen und können innerhalb kurzer Zeit in einer Gegend oder auf der ganzen Welt pandemisch werden. Dies zeigte sich in der Vergangenheit bei weltweiten Epidemien, wie Influenza und Pocken. Diese Epidemien verursachten nicht nur große Verluste an Men-

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schenleben, sondern stellten auch, für die Menschheit einen ungeheueren sozialen und ökonomischen Schaden dar.

Andererseits führte der rasche Fortschritt in der Technik der Gewebekultur und der Virologie zu einer verstärkten weltweiten Forschung in der Prophylaxe und Therapie von Virusinfektionen. Bisher wurden jedoch keine praktisch verwendbaren Prophylaktika oder Therapeutika gegen Virusinfektionen, mit Ausnahme von Vaccinen, entwickelt. Aber auch die· Impfung ist noch mit vielen ungelösten Problemen in Bezug auf ihre Nebenwirkungen verbunden.

Durch die Untersuchung von Joel Warren et al. (Japan. Patentveröffentlichung

/ Nr. 29 002/1968) ist es bekannt, daß aus bestimmten Hefen

und aus einigen Bakterien extrahierte Nucleinsäure sowie DNS aus Kalbsthymus bei Virusinfektionen wirksam sind, da sie gegen Viren resistenzerzeugende Substanzen induzieren. Diese induzierend wirkenden Körper, die hier "Induktoren" genannt werden, induzieren resistenzerzeugende Substanzen, die "Interferone" genannt werden. Die Interferonarten und ihre Bildungsweisen sind verschieden. Der Unterschied wird auch durch die Art der Induktoren verursacht und dementsprechend sind auch ihre Wirkungen verschieden. Wenn sie aus Nichtvirus-Nucleinsäuren bestehen, können nur einige von ihnen als Induktor wirken. DNS aus Escherichia coli, DNS aus menschlichen Leukocyten oder RNS von Helazellen wirken überhaupt nicht. Auch der Versuch, die Wirkung von DNS aus Kalbsthymus durch eine Wiederholung des Experimentes zu bestätigen, schlug fehl.

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Man suchte deshalb nach wirksameren Induktoren und kürzerer Induktionsdauer. Bis jetzt weiß man jedoch nur wenig darüber, 'welche Art von Substanzen für diesen Zweck geeignet ist. Erst vor kurzem erörterten M. E. Hill.eman. et al. das grundlegende Prinzip und vertraten dabei die Ansicht, daß doppelstrangige

Ribonucleinsäure für die Interferonbildung verantwortlich sein könne; vgl. Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 58 (1967), Seite 782. Das Auftreten von doppe]strangiger RNS ist bisher nur

auf wenige Fälle beschränkt. Ihr Auftreten wird nur in Bakteriophagen für möglich gehalten, wobei RNS-Viren als Parasiten vorhanden sind.

Aufgabe-der Erfindung war es, Prophylaktika und Therapeutika gegen Virusinfektionen bei Menschen und Tieren zu entwickeln. Dabei wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Sporen und Mycelien einer Anzahl von Basidiomyceten, in denen das Auftreten von doppelstrangiger ENS überhaupt nicht erwartet wurde, eine Substanz enthalten, die bei Tieren eine Infektion durch Influenza, Pocken, New Castle-Krankheit und viele andere Viruserkrankungen verhindern kann und außerdem die Entwicklung der nachfolgenden Symptome unterbinden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Interferoninduktors, der dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sporen oder Mycelien von Basidiomyceten nach üblichen Metnocien zur Isolierung von Nucleinsäuren extrahiert und aus dem Extrakt den Interferoninduktor gewinnt.

Untersuchungen haben ergeben, daß dieser Interferoninduktor doppelstrangige RNS enthält und daß der Wirkungsmechanismus auf

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der Bildung von für den einzelnen Körper spezifischem Interferon beruht.

Die durch Impfung erworbene Immunität ist bekanntlich nur spezifisch auf ein bestimmtes Antigen wirksam. Deshalb kann die Impfung "gegen Rhino-Virus, Adeno-Virus oder Entero-Viren, die Multiantigenizität aufweisen, praktisch nicht für alle Arten von Antigenen durchgeführt werden. Außerdem ist das Virusantigen nicht immer das überlegene Immunitätsagens. Dazu kommt, daß beträchtliche Zeit erforderlich ist, den Antikörpertiter nach der Impfung zu steigern, wobei während dieser Zeit keine therapeutische Wirkung zu erwarten ist.

Im Gegensatz dazu kann die erfindungsgemäß aus Sporen oder Mycelien von Basidiomyceten isolierte Substanz bei Verabreichung in Dosen von 1 bis 8 mg/kg in Form der extrahierten Rohsubstanz eine Substanz mit starker Hemmwirkung gegen Virusinfektionen bei Tieren in der kurzen Zeit von 1 bis 2 Stunden induzieren. Dazu kommt, daß die erfindungsgemäß isolierte Substanz sehr stabil ist. Außerdem ist die mit dieser Substanz erzeugte Resistenz nicht virusspezifisch, was sie von Vaccinen unterscheidet, sondern sie zeigt einen beachtlichen Wirkungsgrad gegen alle Virusinfektionen.

Um die Substanz der Erfindung zu erhalten, werden Sporen und

Vorzug, v; ei se von Cortinellus. Shiitake, Mycelien von Basidiomyceten,/j;esannnelt oder künstlich gezüchtet und anschließend zerkleinert. Aus der zerkleinerten Hasse erhält man leicht die Rohsubstanz, die doppelstrangige RNS ent-

009851/2072 BADORiGfNAl

hält, nach üblichen Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäuren und RNS,
/z. B. Extraktion mit Phenol oder Salzlösungen; vergl. z. B.

TJllmanns Encyclopädie der technischen Chemie, J. Auflage, Bd.

13, Seite 32-33: Nature, Vol. 177 (1956^, Seite 702. Erfindungsgemäß kann die Extraktion auch mit einer Salzlösung und Phenol durchgeführt worden.

Die Rohsubstanz kann unmittelbar als Interferoninduktor verwendet werden. Wünscht man jedoch, den wirksamen Bestandteil aus dieser Rohsubstanz zu gewinnen, so wird durch normale Säulenchromatographie die Fraktion abgetrennt, die die doppelstrangige RNS enthält.

Z. B. ist es möglich, reine doppeistrangige RNS unter Verwendung von DEAE-Cellulose mit Hilfe eines Puffergradienten zu erhalten.

Aus folgenden Eigenschaften wurde geschlossen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Substanz doppelstrangige RNS als wirksamen Bestandteil enthält:

a) Verhalten bei der Chromatographie,

b)-Empfindlichkeit gegenüber RNase, wie nachstehend aus Beispiel 7 hervorgeht, und

c) Verhalten bei der Zentrifugation im Dichtegradienten, wie aus Beispiel 8 hervorgeht.

Beispiel 9 bestätigt den Bildungsprozeß und die Wirksamkeit des Interferons oder des durch die erfindungsgemäß isolierte" Substanz induzierten Stoffes, Beispiel 10 bezieht sich auf das

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-G-

Molekulargewicht dieser Substanz im Falle von Kaninchen, Beispiel 11 beschreibt die thermische Stabilität, Beispiel 12 befaßt sich mit dem isoelektrischen Punkt und Beispiel 1J bezieht sich auf die Artspezifität.

Die erfindungsgemäß isolierte Substanz ist vollkommen untoxisch und hemmt Virusihfektionen mit hoher Reproduzierbarkeit, ohne Hinweis viruzider Aktivität. Man hat festgestellt, daß die resistenzerzeugende Wirkung der Substanz gegen Virusinfektionen am stärksten ist, wenn die Substanz den Tieren vor der Virusinfektion verabreicht wird. Demgemäß ist es angebracht, die Substanz als Prophylaktikum gegen Virusinfektionen zu verwenden. Sie kann jedoch auch in wirksamer Weise für therapeutische Zwecke eingesetzt werden, wie aus den Beispielen hervorgeht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

1 g Sporen oder Mycelien von Cortinellus Shiitake wurde in ausreichender Weise mit Hilfe von Seesand oder einem hochtourigen Mixer mit Scherwirkung zerkleinert. Dann wurden 30 ml LTM-

(LT]VI=LlCl-Tri-(hydroxyrnothyl )-aminomethan-MgCl₂-^puf>fer) Puffernder 0,2 % EDTA enthielt, und anschließend 30 ml wassergesättigtes Phenol zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 Minuten in Wasser heftig weitergerührt. Die Suspension wurde 5 Minuten bei 3000 U.p.M. zentrifugiert und in eine wäßrige Schicht und eine Phenolschicht aufgetrennt. Der Interferoninduktor ist in der wäßrigen Phase enthalten, die dreimal mit 60 ml wasserge-

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sättigtem Phenol gewaschen wurde. Dann wurden 75 ml Äther zu-' gesetzt. In 24- ml dieser wäßrigen Phase wurde zur Entfernung des Äthers Stickstoff eingeleitet. Dann wurden 125 ^l kaltes Äthanol zugesetzt und die Lösung wurde 18 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 32 mg eines weißen Pulvers.

Bei Konzentrationen von weniger als 0,1 mg/kg hemmte dieses Pulver deutlich die Influenza-Virusinfektion. Es ist gegenüber Tieren praktisch ungiftig. Die LDr₀ bei der Maus liegt oberhalb 500 mg/kg.

Das UV-Absorptionsspektrum der Substanz ist in Fig. 1 gezeigt. Die Substanz absorbiert stark bei 260 mp., was für Ribonucleinsäure spricht.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 erhaltene Pulver wurde an DEAE-Cellulose chromatographiert. Ausreichend aktivierte Cellulose wurde unter Stickstoffatmosphäre in eine Säule von 2,2 χ 24 cm gefüllt. Dann wurde mit 0,005-m Tris-HCl-Puffer, der 0,1-m an NaCl und 0,01-m an EDTA war, äquilibriert. Dann wurden 10 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers in 2 ml des vorgenannten Puffers gelöst und auf die Säule gegeben. Anschließend wurden 160 ml dieses Puffers auf die Säule gegeben. Die Salzkonzentration wurde dann auf 1-m erhöht. Schließlich wurde mit 3-m Kochsalzlösung eluiert.

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Primäre Zellkultüren von Kaninchenniere wurden 24 Stunden mit den fünf Teilen, die aufgrund der Messung der Absorption bei 260 mp erhalten wurden, vorbehandelt. Die Zellen wurden dann zweimal im Nährmedium gewaschen. Dann wurde mit dem Virus der ve sikul euren Stomatitis bei 100 TCD 50/ml infiziert und nach 24-stündiger Züchtung wurde mikroskopisch die Hemmwirkung auf die Virusinfektion geprüft. Das in Fig. 2 wiedergegebene Ergebnis zeigt, daß die Hemmwirkung im dritten Teil mit den Fraktionen 130 - 140 enthalten ist. Die Lage dieser Fraktionen

läßt darauf schließen j daß die Substanz doppelstrangige ENS ist. TCD « Gewebekulturdosis.

Beispiel 3

40 Mäuse vom dd-Stamm mit je 11 - 13 6 Gewicht wurden als Kontrollgruppe intranasal mit Influenza-Virus infiziert.

Zwei verschiedene Dosen der in Beispiel 1 erhaltenen Rohsubstanz wurden der auf die gleiche Weise wie die Kontrollgruppe behandelten Testgruppe verabreicht.

Inzwischen wurde der positiven Kontrollgruppe zur Untersuchung der Dberlebensdauer und der Uberlebensrate Amantadine (1-Adamantylamin-NGl) verabreicht. Die KNS-Fraktion und Amantadine wurden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und intraperitoneal in 14 einzelnen Dosen, d. h. 1 Stunde vor der Virusinfektion, gleichzeitig mit der Infektion, 1, 3, 6 Stunden nach der Infektion und zweimal täglich an den folgenden 4 Tagen, verabreicht.

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Die Mäuse wurden mit/LD des Schweine-Influenza-Virus A intranasal infiziert. Das Ergebnis ist in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Behandlung

Anzahl der Tiere

Durchschnittliche Überlebensdauer (Tage)

Überlebensrate (%)

Kontrollgruppe	40	9,11	7,5
Substanz der Erfindung 8 mg/kg 4 mg/kg	21 10	13,30 12,10	70 52,4
Amantadine 8 mg/kg	10	9,60	14,2

Wie aus Tabelle I hervorgeht, zeigen die mit der Substanz der Erfindung behandelten Tiere eine bemerkenswerte Steigerung der Überlebensrate im Vergleich mit der nicht behandelten Kontrollgruppe.

Beispiel 4

Die in Beispiel 1 erhaltene rohe Substanz wurde in Dosen von 8 mg/kg und 4 mg/kg intraperitoneal an Mäuse verabreicht. 1 Stunde später wurden sie mit 5 -^BVq von Schweine-Influenza Virus A infiziert. Das Ergebnis ist in Tabelle II zusammenge faßt.

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	Anzahl der Tiere	Tabelle II	Überlebens- rate (%)
Behandlung	22	Durchschnittliche Üb erlebensdauer (Tage)	O
Kontrollgruppe		8,6
Substanz der
Erfindung	11		54,0.
8 mg/kg	11	12,1	36,0
4 mg/kg		10,9
Amantadine	10		10,0
8 mg/kg	9,3

Wie aus Tabelle II zu entnehmen ist, ist die Substanz bei einmaliger Verabreichung vor der Virusinfektion ebenso wirksam, . wie ε ".η Beispiel 3 der Fall ist. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Substanz die Resistenz gegen Virusinfektion induziert.

Beispiel *?

Die in Beispiel 2 erhaltene gereinigte Substanz wurde an Mäusen mit dem Mengs-Virus e'rprobt. Eine Lösung der Substanz wurde 18 Stunden vor der Infizierung in Dosen von 20,2 und 0,2 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Das Ergebnis ist in Tabelle III zusammengefaßt.

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Tabelle III
Dosis (mg/kg) Überlebensrate (%)

20 ' ⁶⁰

2 50

0,2 70

Selbst bei 0,2 mg/kg wurde ein signifikanter Schutz festgestellt, während alle mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Tiere starben.

Beispiel 6

Eine Untersuchung an mit Pneumonie-Virus infizierten Mäusen wurde mit der gleichen Substanz wie in Beispiel 5 durchgeführt. Die Substanz wurde den Mäusen 18 Stunden vor der Infizierung intranasal verabreicht. Tabelle IV gibt eine Zusammenfassung der dabei erhaltenen Werte wieder.

Tabelle IV
Dosis (mg/kg) Überlebensrate (%)

1,5 ■ 40

0,2 0

0,02 0

0,002 0

009851/20 7 2

Bei einer Dosis von 1,5 mg/kg bei intranasaler Verabreichung wurde 40 %-iges Überleben festgestellt.

Beispiel 7

Das in Beispiel 1 erhaltene Pulver wurde bei verschiedenen Salzkonzentrationen auf seine Enzymempfindlichkeit untersucht. Es wurde bei den Salzkonzentrationen 0,01-m und 0,3-m gearbeitet. Zu der Salzlösung wurden 0,05-m Tris-Puffer, der 0,001-m an EDTA war und 20 μg/ml bzw. 1,0 jug/ml KNase enthielt, gegeben. Der Puffer der dritten Gruppe 'enthielt nur RNase. Die wäßrige Lösung wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurde wie in Beispiel 2 die im Puffer verbliebene hemmende Wirkung gegen Virusinfektionen unter Verwendung von primären Zellkulturen aus Kaninchennieren untersucht. Das Ergebnis ist in Tabelle V zusammengefaßt.

Das Ergebnis von Tabelle V zeigt wie das Beispiel 2, daß die Substanz der Erfindung doppelstrangige ENS ist.

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Salzkonzentration
(m)

ENa se (fug/ml)

Tabelle V

Substanz der Erfindung (pg/ml)

*Hestliche Inhibitoraktivität gegen Virusinfektion

0,3

20,0

1,0

0
20,0

1,0

1000

50 100 100

0,01

20,0 1,0 0

20,0

1000

100

* angegeben durch den maximalen wirksamen Verdünnungsfaktor des Überstandes

Beispiel 8 .

4,5 ml einer Cäsiumsulfatlösung (Cs^SO^) der Dichte 1,617 und 1 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers wurden mit 0,5 ml 0,05-m Tris-HCl-Puffer, der 0,1-m an NaCl und 0,001-m an EDTA war, vermischt. Dann wurde die erhaltene Lösung in ein 5 ml fassendes Gefäß aus Nitrocellulose gebracht und 108 Stunden bei 40.000 U.p.M. in einer präparativen Ultrazentrifuge (Hitachi 55 P-2) unter Verwendung des "swing out"-Rotors zentrifugiert.

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Nach dem Zentrifugieren wurde am Boden des Nitrocellulosegefäßes mit einer Nadel ein Loch gestochen und j.eweils 4 Tropfen wurden in Reagenzgläsern zur Messung der Dichte der jeweiligen Fraktion aufgefangen. Dann wurde jede Fraktion mit 0,05-m Tris-Puffer, der 0,1-m an NaGl und 0,005-m an EDTA war, verdünnt und die Absorption bei 260 mp wurde gemessen. Dann wurde wie in Beispiel 2 die Hemmwirkung der Virusinfektion untersucht. Das Ergebnis ist in Fig. J wiedergegeben.

Wie daraus hervorgeht, tritt der Gipfel der infektionshemmenden Aktivität in der Fraktion mit der Dichte 1,61 (Fraktion Nr. 20) auf. Die Substanz, die man bei einer Dichte von etwa 1,61 erhält, ist im allgemeinen doppelstrangige Ribonucleinsäure. Deshalb wird angenommen, daß die Substanz der Erfindung doppel, .rangige Ribonucleinsäure ist.

Beispiel 9

4- Kaninchen von jeweils 2 kg Gewicht wurden jeweils Dosen von 1 mg pro Tier der Rohsubstanz der Erfindung in die Ohrvene injiziert. Bei dieser Testgruppe wurde die durch die Substanz der Erfindung induzierte Hemmwirkung auf Virusinfektion untersucht.

Einer aus 4 Kaninchen bestehenden positiven KontroIlgruppe wurden jeweils Dosen von 0,1 mg/Tier Inosinsäure-Cytidinsäure-Copolymer (PoIy-I-G) in die Ohrvene verabreicht. Außerdem wurde einer Kontrollgruppe von 4 Kaninchen physiologische Kochsalz-

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lösung verabreicht. ■

Jeder Gruppe wurde 2, 4 und 6 Stunden nach der Verabreichung aus der Ohrvene Blut entnommen. Das Blut wurde 5 Minuten bei 3OOO U.p.M. zur Abtrennung des Serums zentrifugiert. Die quantitative Bestimmung der im Kaninchenserum induzierten Hemmsubstanz gegen Virusinfektion wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt.

Das Ergebnis ist in Tabelle VI wiedergegeben. Aufgrund dieser Tabelle kann angenommen werden, daß die im Tierkörper durch die Substanz der Erfindung induzierte Resistenz gegen Virusinfektion auf dem Virushemmfaktor (Interferon) beruht.

Tabelle VI

Hemmwirkung gegen Virusinfektion Behandlung ^nach Verabreichung

2 Std. 4 Std. 6 Std. 8 Std.

Substanz der Erfindung

(0,5 mg/kg) 1600 400 400 200

PoIy-I-G

(positive Kontrollgruppe) 6400 3200 1600 400 Physiologische Kochsalzlösung (Kontrollgruppe) <10

Bemerkungen: Die angegebenen Zahlen geben die maximale Ver-

die dünnung des Serums an,/bei der Hemmwirkung gegen

Virusinfektion auftritt.

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- 16 Beispiel 10

Die folgende Untersuchung wurde an der durch die Substanz der Erfindung im Kaninchenserum induzierten Hemmsubstanz (Interferon) gegen Virusinfektion durchgeführt.

Dabei wurde die Substanz der Erfindung Kaninchen von etwa 2 kg Gewicht in die Ohrvene verabreicht und nach 2 Stunden wurde " aus der Ohrvene Blut entnommen. Das Blut wurde 5 Minuten bei 3OOO U.p.M. zentrifugiert.

Eine mit Sephadex G-100 beschickte Säule (1,4 χ 120 cm) wurde inzwischen 4 Tage mit O,OO5-m Tris-Puffer, der 0,1-m an NaGl und 0,01-m an EDTA war, äquilibriert. Auf diese Säule wurden 1,5 ml des vorgenannten Kaninchenserums gegeben. Zur Elution wurde der gleiche Puffer wie zur Äquilibrierung des Sephadex verwendet. Mit einem LKB-Fraktionssammler wurden 3,5 ml-Frakfc tionen abgenommen, wobei gleichzeitig die Absorption bei 280,mju gemessen wurde. Jede zweite Fraktion wurde der qualitativen und quantitativen Untersuchung auf die Hemmsubstanz gegen die Virusinfektion untersucht. Diese Untersuchungen wurden gemäß dem obenstehenden Beispiel 2 durchgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 4 wiedergegeben. Die Hemmwirkung gegen die Virusinfektion wurde in der 16. Fraktion (zweiter Teil) beobachtet«, Der erste Teil (Fraktionen 12 - 15) enthielt Globlulxnfraktionen (Molekulargewicht größer als 100.000) und der dritte Teil (Fraktionen 19 - 25) enthielt Albuininfrakt ionen (Molekulargewicht ca. 60.000). Außerdem betrug der K_d-Wert der Fraktion 16 bei

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- 17 —
dieser Gelfiltration 0,43. K^ = Verteilungskoeffizient.

Demgemäß kann angenommen werden, daß die im Kaninchenserum durch die Substanz der Erfindung induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektion ein Protein mit dem Molekulargewicht etwa 70.000 bis¹80.000 ist.

Beispiel 11

'; V i

Die durch die Substanz der Erfindung im Kaninchenserum induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektion gemäß Beispiel 3 und die im Kaninchenserum durch PoIy-I-C in der positiven Kontrollgruppe induzierte Substanz wurden 1 Stunde auf 56⁰C erhitzt.

Andere Gruppen wurden mit 1-n HCl auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und 1 Stunde bei 4⁰C stehen gelassen. Weitere Gruppen wurden mit Trypsin in einer Endkonzentration von 1000 jug/ml 3 Stunden bei 37°C behandelt.

Das in Beispiel 2 aufgeführte Verfahren zur Untersuchung der Hemmwirkung gegen Virusinfektion wurde durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle VII zusammengefaßt..

Es wird festgestellt, daß die im Kaninchenserum durch die Substanz der Erfindung induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektion beim 1-stündigen Erhitzen auf 56°^ stabil bleibt, Säurebehandlung beim pH-Wert 2,0 aushält und außerdem ein Protein ist, das von Trypsin angegriffen wird. Ihre Eigenschaften sind

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ähnlich denen der durch PoIy-I-C induzierten Hemmsubstanz. Es kann angenommen werden, daß die, durch Verabreichung der Substanz der Erfindung induzierte Substanz Interferon ist.

Tabelle VII

Hemmwirkung gegen Virusinfektion Behandlung (Verdünnungsfaktor des Serums)

Substanz der Erfindung PoIy-I-C

56⁰C, 1 Stunde Erhitzen 800 1600

pH-Wert 2,0, 1 Stunde, 4⁰C 800 1600

Tryps inbehandlung

(1000 pg/ml)., 37°0, 3 Stunden 100 1

Ohne Behandlung 1600 6400

Beispiel 12

Der isoelektrische Punkt der Hemmsubstanz gegen Virusinfektionen, die im Kaninchenserum durch die Substanz der Erfindung induziert wurde, wurde mit Hilfe der Elektrofokussierung gemessen. Dabei wurden 2 ml der durch die Gelfiltration an Sephadex G-100 nach Beispiel 10 erhaltenen, Interferon enthaltenden Fraktion mit Trägerampholyte vom pH-Wert 5-8 der LKB-Produkter AB in einer 110 ml-Säule 27 Stunden bei 700 Volt und 4 C der Elektrofokussierung unterzogen. Dann wurden mit Hilfe des Fraktionensammlers 2 ml-Fraktionen abgenommen, und der pH-Wert jeder Fraktion .wurde gemessen. Mit Hilfe eines Zellophanschlauches wurde Jede Fraktion gegen 0,005-m

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: ■ ■■-19 - .':. ■■■:

Puffer, der 0,1-m an NaGl und 0,01-m an EDTA war, 24 Stunden "bei 4⁰C dialysiert. Außerdem wurden die Fraktionen durch ein Milipor-Filter filtriert und dann nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren auf ihre Hemmwirkung gegen Virusinfektionen untersucht. Das Ergebnis ist in Fig. 5 wiedergegeben.

Wie daraus hervorgeht, kann man annehmen, daß die im Kaninchenserum gefundene Hemmsubstanz gegen Virusinfektionen ein Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 5?7 ist.

Beispiel 13

Zur Prüfung der biologischen Eigenschaften der Substanz der Erfindung wurden folgende Untersuchungen durchgeführt.

Zwanzig Kaninchen von jeweils 2 kg Gewicht, zwanzig Mäusen von jeweils etwa 20 g Gewicht und zwanzig Hühnern von jeweils 800 g Gewicht wurde intravenös die Substanz der Erfindung in einer Dosis von 500 mg/kg, 1 mg/kg bzw. 400 mg/kg verabreicht. Zwei Stunden nach der Verabreichung wurde aus dem Herzen des Tieres Blut entnommen und 5 Minuten bei 3000 U.p.M. zentrifugiert. Auf diese Weise erhielt man das Serum der drei Tierarten.

Andererseits wurden Primärkulturen von Kaninchennierenzellen, Mäuseembryozellen und Hühnerembryozellen 8 Stunden bei 37°C mit 100 mg/ml der Substanz der Erfindung behandelt. Danach wurden die Zellen ausreichend mit Hank'scher Lösung gewaschen und weitere 12 Stunden auf frischem Medium gezüchtet, um drei

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- 20 Arten von Zellkulturlösungen zu erhalten.

Die Hemmwirkung gegen Virusinfektionen wurde unter Verwendung von Primärkulturen von Kaninchennierenzellen, Mäuseembryoζeilen und Hühnerembryoζellen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 untersucht\ mit der Ausnahme, daß bei Mäuseembryozellen Kuhpockenvirus verwendet wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle VIII wiedergegeben.

Wie daraus hervorgeht, weist die im Kaninchen und seinen Primärkulturen von Nierenzellen durch die Substanz der Erfindung induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektionen nur in Primärkulturen von Kaninchennierenzöllen Resistenz gegen Virusinfektionen auf und zeigt keine Hemmwirkung gegen Virusinfektionen bei Mäuseembryo- und Hühnerembryozellen. In ähnlicher Weise weist die in der Maus und in ihren Embryozellen durch die Substanz der Erfindung induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektionen eine virusresistente Aktivität nur in Mäuseembryozellen aufΓ Demgemäß weist die Substanz der Erfindung- induzierte Hemmsubstanz gegen Virusinfektionen Artspezifität auf.

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Tabelle VIII

Virusheimwirkung (maximaler wirksamer Verdünnungsfaktor)

Tier oder Zelle ν- ■ \, Mäuse- Hühner-Kaninchen- - , ■ ■ ,
nierenzellen embryo- embryomerenzellen _zellen zellen

	Serum	1600 '	O	<1Q
Kaninchen			50
	Nährmedium	• 20		/10
	Serum	-£10	10	^10
Maus
	Nährmedium	4io	^,10

Patentansprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Interferoninduktors, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen oder Mycelien von Basidiomyceten nach üblichen Methoden zur Isolierung von Nucleinsäuren extrahiert und aus dem Extrakt den Interferoninduktor gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet . daß man die Extraktion mit Hilfe einer Salzlösung und bzw. oder von Phenol und Zentrifugieren durchführt.

J). Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das isolierte Rohprodukt chromatographisch reinigt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen oder Mycel von Cortinellus Shiitake verwendet.

5. Verwendung des Interferoninduktors nach Anspruch 1 bis 3 zur Herstellung von Arzneipräparaten für die Tier- und Humanmedizin.

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