DE2025810B2

DE2025810B2 - Verfahren zur Isolierung doppelstrangiger Ribonucleinsäure und diese Verbindung enthaltendes Arzneipräparat

Info

Publication number: DE2025810B2
Application number: DE2025810A
Authority: DE
Inventors: N Ishida; M Kikuchi
Original assignee: ISHIDA NAKAO SENDAI (JAPAN)
Current assignee: ISHIDA NAKAO SENDAI (JAPAN)
Priority date: 1969-05-26
Filing date: 1970-05-26
Publication date: 1980-06-26
Also published as: DE2025810C3; FR2051558B1; DE2025810A1; CA932284A; ZA703501B; BE750918A; GB1303506A; FR2051558A1; NL7007521A; SE376170B; NL148241B; US3907778A

Description

Aus der ja Danischen Patentveröffentlichung Nr. 29002/1968 ist bekannt, daß aus bestimmten Hefen und aus einigen Bakterien extrahierte Nucleinsäure sowie Desoxynucleinsäure (DNS) aus Kalbsthymus bei Virusinfektionen wirksam sind, indem sie ais »Induktoren« gegen Viren resistenzerzeugende Substanzen, sogenannte »Interferone«, induzieren.

Aus der FR-MD 4269 ist ein Arzneimittel auf der Basis von Nucleinsäuren nicht-viralen Ursprungs zur Bekämpfung von Virusinfektionen der Atemwege bekannt Diese Nucleinsäuren sollen aus irgendeiner Quelle«, z. B. aus Hefe, Thymus, Bakterien, Pflanzen und Sperma isolierbat sein.

Aus der GB-PS 1046770 ist ',s bekannt, teilweise depolymerisierte, therapeutisch einsetzbare Polynucleotide, z. B. aus dem Mycel von Ur tago, zu gewinnen.

Gemäß G.P. Lampson und Mitarbeiter in Proceed. Natl. Acad. Sei. Band 58 (1967), Seiten 782 bis 789, wird die Iiiterferoninduktion von doppelstrangiger Ribonucleinsäure hervorgerufen, während einstrangige Ribonucleinsäuren und Desoxyribonucleinsäuren, Nucleoside und Nucleotide diese Fähigkeit nicht besitzen.

Doppelstrangige RNS wird jedoch — außer bei Viren und Phagen — nur sehr selten befunden.

Aufgabe der Erfindung war es, neue Interferoninduktoren für die Prophylaxe und Therapie von Virusinfektionen bei Menschen und Tieren zu entwickeln. Dabei wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Sporen und Mycel von Cortinellus Shiitake, in denen das Auftreten von doppeltstrangiger RNS überhaupt nicht erwartet wurde, eine Substanz enthalten, die bei Tieren die Entwicklung von Influenza, Pocken, New-Castle-Krankheit und vielen anderen Viruserkrankungen verhindern kann. Diese Substanz wurde als doppelstrangige RNS identifiziert.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Isolierung doppelstrangiger Ribonudeinsäure (RNS) aus Sporen und dem Mycel von Pilzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sporen und Mycel von Cortinellus Shiitake einsetzt, die doppelstrangige RNS nach üblichen Methoden anreichert und gebenenfalls mittels Säulenchromatographie reinigt.

Die Erfindung betrifft auch ein Arzneipräparat, das durch einen Gehalt an erfindungsgemäß isolierter doppelstrangigier RNS als Wirkstoff zur Induktion von Interferon gekennzeichnet ist.

Die erfindungsgemäß isolierte doppelstrangige RNS ist wenig toxisch und hemmt Virusinfektionen mit hoher Reproduzierbarkeit, ohne Hinweis viruzider Aktivität. Die resistenzerzeugende Wirkung dieser RNS gegen Virusinfektionen ist am stärksten, wenn die Substanz den Tieren vor der Vwusmfektion verabreicht wird. Demgemäß ist es angebracht, die erfindungsgemäß isolierte RNS als Prophylaktikum gegen Virusinfektionen zu verwenden. Sie kann jedoch auch in wirksemer Weise für therapeutische Zwecke eingesetzt werden.

Die Untersuchungen haben ergeben, daß der Wirkungsmecbanismus auf der Bildung von für den einzelnen Körper spezifischem Interferon beruht

ο Die durch Impfung erworbene Immunität ist bekanntlich nur spezifisch auf ein bestimmtes Antigen wirksam. Deshalb kann die Impfung gegen Rhino-Virus, Adeno-Virus oder Entero-Viren, die Multiantigenizität aufweisen, praktisch nicht für alle Arten von Antigenen durchgeführt werden. Außerdem ist das Virusantigen nicht immer das überlegene Immunitätsagens. Dazu kommt, daß beträchtliche Zeit erforderlich ist den Antikörpertiter nach der Impfung zu steigern, wobei während dieser Zeit keine therapeutische Wirkung zu erwarten ist

Im Gegensatz dazu kann die erfindungsgemäß aus Sporen oder dem Mycel von Cortinellus Shiitake isolierte doppelstrangige RNS bei Verabreichung in Form der extrahierten Rohsubstanz eine Substanz mit starker Hemmwirkung gegen Virusinfektionen bei Tieren in der kurze ρ Zeit von 1 bis 2 Stunden induzieren. Dazu kommt daß die erfindungsgemäß isolierte RNS sehr stabil ist Außerdem ist die mit dieser doppelstrangigen RNS erzeugte Resistenz nicht virusspezifisch, was sie von Vaccinen usiterscheidet sondern sie zeigt einen beachtlichen Wirkungsgrad gegen alle Virusinfektionen.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Sporen und das Mycel von Cortinellus Shiitake

gesammelt oder künstlich gezüchtet und anschließend zerkleinert Aus der zerkleinerten Masse erhält man leicht die die doppelstrangige RNS enthaltende Rohsubstanz nach üblichen Verfahren, z. B. Extrahieren mit Phenol oder Salzlösungen (vgl. z. B. »Ulimanns Enzyklopädie der technischen Chemie«, 3. Auflage,

4» Band 13, Seiten 32 bis 33; »Nature«, Band 177 [1956], Seite 702).

Die Rohsubstanz kann unmittelbar als Wirkstoff zur Induktion von Interferon verwendet werden. Wünscht man jedoch, den wirksamen Bestandteil aus dieser

Rohstubstänz zu gewinnen, so kann man durch übliche Säulenchromatographie die die doppelstrangige RNS enthaltene Fraktion abtrennen.

So kann man z. R. reine doppelstrangige RNS unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose mit Hilfe eines Puffergradienten erhalten.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

1 g Sporen oder Mycel von Cortinellus Shiitake wird mit Hilfe von Seesand oder einem hochtourigen Mixer mit Scherwirkung zerkleinert. Dann werden 30 ml LiCI-Tris-ihydroxymethylJ-aminomethan-MyClz- Puffer, der 0,2% Athylen-diamintetraessigsäure enthält, und anschließend 30 ml wassergesättigtes Phenol zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten in Wasser heftigt weilergerührt und dann 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Die Phasen werden getrennt, der Interferoninduktor ist in der wäßrigen Phase enthalten, die dreimal mit 60 ml wassergesättigtem Phenol gewaschen ·>■> wird. Dann werden 75 ml Äther zugesetzt. In in 24 ml dieser wäßrigen Phase wird zur Entfernung des Äthers Stickstoff eingeleitet. Dann werden 125 ml kaltes Äthanol zugesetzt. Die Lösung wird 18 Stunden bei 4°C

stehengelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet Man erhält 32 mg eines weißen Pulvers,

Das UV-Absorptionsspektrum dieser Substanz, die bei 260 um stark absorbiert, spricht für Ribonucleinsäu» Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt

re.

Versuch IA

40 Mäuse von dd-Stamm mit je 11 bis 13 g Gewicht werden als Kontrollgruppe intranasal mit 5 LD_W des ι ο Schweine-Influenza-Virus A infiziert

Einer zweiten, ebenso behandelten Testgruppe werden zwei verschiedene Dosen der in Beispiel 1 erhaltenen Rohsubstanz verabreicht.

Die Kontrollgruppe erhält zur Bestimmung der Oberlebensdauer und der Oberlebensrate 1-Adamantylamin-HCL

Sowohl die RNS-Fraktion als auch 1-Adamantylamin werden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst und intraperitoneal in 13 einzelnen Dosen, nämlich 1 Stunde vor der Virusinfektion, gleichzeitig mit der 'nfekticn, 1,3,6 Stunden nach der Infektion und zweimal täglich an den folgenden 4 Tagen, verabreicht

Tabelle I	Anzahl	Durchschnitt	Über-
Behandlung	der	liche Über	iebens-
	Tiere	lebensdauer	rate
		aage)	(%>
	40	9,11	7,5
Kontrollgruppe
RNS-Fraktion	21	13,30	71,4
8 mg/kg	10	12,10	50,0
4 mg/kg
Adamantylamin-HCl	10	9,60	20,0
8 mg/kg

Der in der vorstehenden Tabelle i und in den nachfolgenden Tabellen Il bis IV verwendete Begriff »Oberlebensrate« ist wie folgt definiert:

_M, ,. Anzahl der überlebenden Mause am 14.Tag ,„_,.„.. Überlebensrate = — r-r-j—— ■.—-— ^- · 100(%). Gesamtanzahl der Mause in der Gruppe

Wie aus Tabelle I hervorgeht zeigen die mit der erfindungsgemäß isolierten RNS-Fraktion behandelten Tiere eine merkliche Steigerung der Überlebensrate im Vergleich zu der nicht behandelten Kontrollgruppe.

Versuch I₁B

Die in Beispiel I erhaltene rohe Substanz wird in Dosen von 8 mg/kg und 4 mg/kg intraperitoneal an Mäuse verabreicht 1 Stunde später werden sie mit 5 LD50 von Schweine-lnfluenza-Virus A infiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II	Anzahl	Durchschnill-	Über-
Behandlung	der	liche Über	lebens-
	Tiere	lebensdauer	ratc
		(Tage)	(%)
	22	8,6	0
Kontrollgruppe
RNS-Fraktion	11	12,1	54,0
8 mg/kg	Il	10,9	36,0
4 mg/kg
Adamantylamin-HCl	10	9,3	10,0
8 mg/kg

Wie aus Tabelle Il zu entnehmen ist, ist die Substanz bei einmaliger Verabreichung vor der Virusinfektion ebenso wirksam, wie bei vorhergehender und gleichzeitiger Verabreichung (vgl. Versuch I₁A). Dieses Ergebnis zeigt, daß die Substanz die Resistenz gegen Virusinfektion induziert.

Die LD50 bei der Maus liegt bei intraperitonealer Verabreichung oberhalb 500 mg/kg.

Versuch l.C

Das in Beispiel 1 erhaltene Pulver wird bei einer Salzkonzentration von 0,01 m und 0,3 m auf seine Enzymempfindlichkeit untersucht Zu der Salzlösung werden 0,05 Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer,

der 0,001 m Äthylendiamintetraessigsäure und 20 μg/ml bzw. 1,0 μg/ml RNase enthält gegeben. Der Puffer einer dritten Gruppe enthält alle genannten Substanzen, jedoch keine RNS. Die wäßrige Lösung wird 30 Minuten bei 37° C inkubiert. Dann wird die im Puffer verbliebene hemmende Wirkung gegen Virusinfektionen unter Verwendung von primären Zellkulturen aus Kaninchennieren untersucht Dazu werden primäre Zellkulturen von Kaninchenniere 24 Stunden mit den hergestellten Lösungen vorbehandelt. Die Zellen werden zweimal ire Nährmedium gewaschen und mit dem Virus der vesikulären Stomatitis entsprechend einer Gewebskultur-Infektionsdosis (TCD) von 100 TCDso/ral infiziert. Nach 24stündiger Züchtung wird mikroskopisch die Hemmwirkung des RNS-Pulvers auf

ν-, die Virusinfektioneir geprüft. Die Ergebnis;« sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Aus der Tabelle ist ersichtlich:

1. Die Aktivität bleibt praktisch unverändert, wenn die Extrakt-lnnaltsstoffe mit RNase unter solchen

w) Bedingungen, die eine Zersetzung nur der einstrangigen RNS bewirken, behandelt werden.

2. Die Aktivität geht vollständig verloren, wenn die Extrakt-Inhaltsstoffe mit RNase unter solchen Bedingungen, d'r eine Zersetzung sämtlicher RNS

(V) (einstrangig und cloppelstrangig) bewirken, benan-

delt werden.

Die Ergebnisse zeigen somit, daß die erfindungsgemäß isolierte Substanz dopDelstranEige RNS ist.

Tabelle III

SaI/-konicniration

RNiisc

(ig/ml)

RNS

{ig/ml)

Restliche llemniwirkung gegen
Virusinfektion*)

20,0

1,0

0
20,0

1,0

20,0
0,1
0

">n η

1000

50
100
100

100

tf in

*) Maximale Verdünnung des Überstandes, bei der die Hemmwirkung noch auftritt.

Versuch I₁D

4,5 ml einer Cäsiumsulfatlösung der Dichte 1,617 und 1 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers werden mit 0,5 ml 0,05 m Tris-(hydroxymethyl)-arninomethan-HCl-Puffer, der in 0,1 m NaCl und 0,001 m Äthylendiamintetraessigsäure enthält, vermischt. Die Lösung wird in ein 5 ml fassendes Gefäß aus Nitrocellulose gebracht und 108 Studen bie 40 000 UpM in einer präparativen Ultrazentrifuge unter Verwendung des »swing out«-Rotors zentrifugiert.

Nach dem Zentrifugieren wird am Boden des Nitrocellulosegefäßes mit einer Nadel ein Loch gestochen. Jeweils 4 Tropfen werden in Reagenzgläsern zur Messung der Dichte der jeweiligen Fraktion aufgefangen. Jede Fraktion wird mit 0,05 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, der 0,1 m NaCl und 0,005 m Athylendiamintetraessigsäure enthält, verdünnt, die Absorption wird bei 260 nm gemessen. Das Ergebnis ist in F i g. 1 wiedergegeben. Von jeder Fraktion wird wie in Versuch I₁C die Hemmwirkung auf Virusinfektionen untersucht

Der Gipfel der infektionshemmenden Aktivität tritt in der Fraktion mit der Dichte 1,61 (Fraktion Nr. 20) auf, bei der man im allgemeinen doppelstrangige Ribonucleinsäure erhält

Versuch 1 ,E

Die erfindungsgemäß isolierte RNS wird Kaninchen von etwa 2 kg Gewicht in die Ohrvene verabreicht Nach 2 Stunden wird aus der Ohrvene Blut entnommen, das 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert wird.

Eine mit vernetzten! Dextren beschickte Säule (1,4 χ 120 cm) wird 4 Tage mit 0,005 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer, der 0,1 m NaQ und 0,01 m Athylendiamintetraessigsäure enthält, äquilibriert Auf diese Säule werden 1,5 ml des Kaninchenserums gegeben. Zur Elution wird der gleiche Puffer wie zur Äquilibrierung der Säule verwendet Mit einem Fraktionssammler werden 3,5 ml Fraktionen abgenommen, wobei gleichzeitig die Absorption bei 280 nm gemessen wird. Jede zweite Fraktion wird qualitativ und quantitativ gemäß Versuch I,C auf Interferon untersucht Das Ergebnis ist in Fig.2 wiedergegeben. Die Hemmwirkung gegen Virusinfektionen wird in der 16. Fraktion (zweiter Teil) beobachtet Der erste Teil (Fraktionen 12 bis 15) enthält Globulin (Molekulargewicht größer als 100 000) und der dritte Teil (Fraktionen 19 bis 25) Albumin (Molekulargewicht etwa 60 000). Der Verteilungskoeffizient Kd der Fraktion 16 beträgt bei j dieser Gelfiltration 0,43.

Das im Kaninchenserum durch die erfindungsgemäß isolierte RNS induzierte Interferon ist offensichtlich ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000 bis 80 000.

Beispiel 2

Ausreichend aktivierte Cellulose wird unter Stickstoffatmosphäre in eine Säule von 2,2 χ 24 cm gefüllt und mit 0,005 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer, der 0,1 m NaCI und 0,01 m Athylendiamintetraessigsäure enthält, äquilibriert. 10 mg des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers werden in 2 ml dieses

Puffers uplftst und auf Hie Säule aeaphen Die Säule wird

zuerst mit 160 ml dieses Puffers eluiert, dann wird die Salzkonzentration auf 1 m erhöht. Schließlich wird mit 3 m Natriumchloridlösung eluiert Die in F i g. 3 dargestellten Fraktionen werden gemäß Versuch l.C auf ihre Hemmwirkung gegen Virusinfektionen untersucht. Wie ersichtlich ist, sind die Fraktionen 130 bis 140 (3. Abschnitt) gegen die Virusinfektion wirksam.

Versuch 2,A

Die in Beispiel 2 erhaltene gereinigte Substanz wird an Mäusen, die mit 5 LD$o des Mengs-Virus infiziert jo wird, erprobt. Eine Lösung der Substanz wird 18 Stunden vor der Infektion in Dosen von 20,2 und 0,2 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Dosis
(mg/kg)

Überlebensrate

20	60
2	50
0,2	70

Selbst bei 0,2 mg/kg wird ein signifikanter Schutz festgestellt während alle mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Tiere sterben.

Versuch 2,B

so An mit 10 LD» des Pneumonie-Virus infizierte M' jse wird die gereinigte Substanz des Beispiels 2 18 Stunden vor der Infektion intranasal verabreicht Tabelle V gibt eine Zusammenfassung der dabei erhaltenen Werte wieder.

Tabelle V

Dosis
(mg/kg)

Überlebensrate

1,5	40
0,2	0
0,02	0
0,002	0

Bei einer Dosis von 1,5 mg/kg bei intranasaler Verabreichung erhält man eine Überlebensrate von 40%.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1, Verfahren zur Isolierung doppelstrangiger Ribonudeinsäure (RNS) aus Sporen und dem Mycel von Pilzen, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporen und Mycel von Cortinellus Shiitake einsetzt, die doppelstrangige RMS nach üblichen Methoden anreichert und gegebenenfalls mittels Säulenchromatographie reinigt
2. Arzneiräparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an doppelstrangiger RNS isoliert nach Anspruch 1 als Werkstoff zur Induktion von Interferon.